CN115089611A - 一种cd146+或cd146-脐带间充质干细胞亚群在制备防治脓毒症的产品中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种CD146+或CD146‑脐带间充质干细胞亚群在制备防治脓毒症的产品中的应用，属于生物药物技术领域。本发明提供了一种CD146+或CD146‑脐带间充质干细胞亚群在制备防治脓毒症的产品中的应用，经验证，CD146+/‑UC‑MSCs治疗组均能改善脓毒症小鼠各器官的病理损伤，CD146+/‑UC‑MSCs治疗组均能改善脓毒症小鼠CD4、CD8及CD4/8的紊乱，能够在早期提高巨噬细胞的吞噬效率，降低M1型和M2型巨噬细胞水平，降低促炎因子IL1β和IL6的水平，提高抑炎因子IL10的水平。表明CD146+UC‑MSCs和CD146‑UC‑MSCs能有效改善脓毒症。
Description
技术领域
本发明属于生物药物技术领域，尤其涉及一种CD146+或CD146-脐带间充质干细胞亚群在制备防治脓毒症的产品中的应用。
背景技术
脐带间充质干细胞(UC-MSCs)是指存在于新生儿脐带组织中的一种多功能干细胞，具有较高的分化潜能，可向多个方向进行分化，能分化成许多种组织细胞，在骨、软骨、肌肉、肌腱、韧带、神经、肝、内皮和心肌等组织工程方面具有广阔的临床应用前景。脐带间充质干细胞是一组异质性的亚群，它们表达不同的表面标记物，并具有不同的生物学特征。因此，从不同来源分离和鉴定MSCs亚群，以评估其潜力和确定其对疾病的治疗功能，将是干细胞精准治疗的方向。
利用新的干细胞抗原如SSEA4、CD146、Podoplanin等能够进一步界定MSCs亚群。CD146，又称黑色素瘤细胞粘附分子(MCAM)，是一种膜糖蛋白，是免疫球蛋白基因超家族的成员。CD146高表达于血管内皮细胞、平滑肌细胞和周细胞等，并在血管内皮细胞活动和血管生成中发挥重要作用。并不是所有的脐带间充质干细胞都表达CD146。CD146+脐带间充质干细胞(CD146阳性脐带间充质干细胞，CD146+UC-MSCs)和CD146-脐带间充质干细胞(CD146阴性脐带间充质干细胞，CD146-UC-MSCs)是两个不同的亚群。
脓毒症(sepsis)是由细菌等病原微生物侵入机体引起的全身炎症反应综合征。除全身炎症反应综合征和原发感染病灶的表现外，重症患者还常有器官灌注不足的表现。大体包括既往的败血症和脓毒血症。目前还未有关于特定表面标记物的脐带间充质干细胞亚群在治疗脓毒症的报道，更未有CD146+脐带间充质干细胞和CD146-脐带间充质干细胞两个亚群在治疗脓毒症方面的报道。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种CD146+或CD146-脐带间充质干细胞亚群在制备防治脓毒症的产品中的应用。
为了实现上述发明目的，本发明提供了以下技术方案：
本发明提供了一种CD146+或CD146-脐带间充质干细胞亚群在制备防治脓毒症的产品中的应用。
优选的，所述产品包括药物、试剂盒和试剂。
优选的，所述CD146+或CD146-脐带间充质干细胞亚群通过调控免疫能力发挥防治脓毒症的作用。
优选的，所述调控免疫能力包括调节T细胞水平、巨噬细胞水平和炎症因子水平。
优选的，所述调节T细胞水平包括提高调节性T细胞亚群水平和降低辅助性T细胞亚群水平。
优选的，所述辅助性T细胞亚群包括Th1、Th17亚群。
优选的，所述调节巨噬细胞水平包括提高巨噬细胞吞噬能力和调节巨噬细胞分型。
优选的，所述调节巨噬细胞分型包括降低M1型和M2型巨噬细胞水平。
优选的，所述调节炎症因子水平包括降低促炎因子IL1β和IL6的水平，提高抑炎因子IL10的水平。
本发明还提供了一种CD146+或CD146-脐带间充质干细胞亚群在制备提高脓毒症患者免疫调节能力的产品中的应用。
本发明的有益效果：
本发明比较了CD146+UC-MSCs和CD146-UC-MSCs对于T细胞亚群和巨噬细胞的影响，比较了CD146+UC-MSCs和CD146-UC-MSCs对于脓毒症小鼠模型肺、肝、脾脏形态变化的影响，以及对于脓毒症小鼠模型外周血T细胞亚群、巨噬细胞和炎症因子水平的影响，结果表明CD146+/-UC-MSCs治疗组均能改善脓毒症小鼠各器官的病理损伤，CD146+/-UC-MSCs治疗组均能改善脓毒症小鼠CD4、CD8及CD4/8的紊乱，能够在早期提高巨噬细胞的吞噬效率，降低M1型和M2型巨噬细胞水平，降低促炎因子IL1β和IL6的水平，提高抑炎因子IL10的水平。可见CD146+UC-MSCs和CD146-UC-MSCs能有效改善脓毒症。
附图说明
图1为CD146+/-UC-MSCs对PBMC中Treg和Th1、Th17亚群的影响，其中a为CD146+/-UC-MSCs对PBMC中Treg亚群的影响，b为CD146+/-UC-MSCs对PBMC中Th1、Th17亚群的影响，n＝3，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001；
图2为CD146+/-UC-MSCs对巨噬细胞吞噬功能的影响，n＝3，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001；
图3为CD146+/-UC-MSCs对LPS诱导的巨噬细胞M1/M2型转化的影响，n＝3，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001；
图4为CD146+/-UC-MSCs对脓毒症小鼠腹腔巨噬细胞吞噬功能和亚群的影响，其中a为流式细胞术检测F4/80+细胞中OVA-FITC+细胞，b为流式细胞术检测CD11b和Ly6C标记腹腔巨噬细胞中的单核细胞，c为CD146+/-UC-MSCs对腹腔巨噬细胞中影响的统计结果；n＝3，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001；
图5为CD146+/-UC-MSCs对脓毒症小鼠的治疗作用，其中a为不同组别小鼠肺、肝、脾的HE染色结果，b和c为流式细胞术检测不同组别小鼠外周血CD3、CD4和CD8结果，n＝4，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001；
图6为CD146+/-UC-MSCs对脓毒症小鼠炎症因子水平的影响。
具体实施方式
本发明提供了一种CD146+或CD146-脐带间充质干细胞亚群在制备防治脓毒症的产品中的应用。
在本发明中，所述产品优选的包括药物、试剂盒和试剂。当所述产品为药物时，所述药物优选的还包括药学上可接受的辅料，本发明对于辅料的具体种类没有特殊限定，根据药物剂型而定即可。
在本发明中，所述CD146+或CD146-脐带间充质干细胞亚群优选的通过调控免疫能力发挥防治脓毒症的作用，所述调控免疫能力优选的包括调节T细胞水平、巨噬细胞水平和炎症因子水平。在本发明中，所述调节T细胞水平优选的包括提高调节性T细胞亚群水平和降低辅助性T细胞亚群水平，所述辅助性T细胞亚群优选的包括Th1、Th17亚群。所述调节巨噬细胞水平优选的包括提高巨噬细胞吞噬能力和调节巨噬细胞分型，所述调节巨噬细胞分型优选的包括降低M1型和M2型巨噬细胞水平。所述调节炎症因子水平优选的包括降低促炎因子IL1β和IL6的水平，提高抑炎因子IL10的水平。在本发明中，所述调节炎症因子水平优选的还包括对TNFα、IFNγ和CXCL1的影响，虽然本发明中CD146+或CD146-脐带间充质干细胞亚群均具有免疫调节能力，但是CD146+/-在免疫调节方面具有一定差异，如CD146+脐带间充质干细胞组与LPS组IFNγ的变化相似，146-脐带间充质干细胞组IFNγ的水平一直较低；在12h时，CD146+脐带间充质干细胞组CXCL1的水平最高，24h恢复到较低水平，而LPS组CXCL1的含量维持在较高水平。
本发明还提供了一种CD146+或CD146-脐带间充质干细胞亚群在制备提高脓毒症患者免疫调节能力的产品中的应用。在本发明中，所述产品优选的包括药物。
下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
下述实施例中，如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1
CD146+/-UC-MSCs对PBMC中Treg和Th1、Th17亚群的影响
人外周血单个核细胞(PBMC)的分离：肝素抗凝的健康人外周血，加入PBS，按1：1稀释血液。取淋巴细胞分离液5mL于15mL灭菌离心管中待用，注意离心管壁上不应挂有淋巴细胞分离液。吸取稀释血液，在离分层液上方1cm处，沿试管壁徐徐加入，使稀释血液重叠于分层液上，并与分离液形成明显界面。室温，2000rpm离心20min，离心加速度和降速度设为最慢。离心完成后，液体分三层。吸取中间呈白膜状的单个核细胞层，尽量全部吸出单个核细胞。加5倍以上体积的PBS，多次吹打，洗2次，每次1500rpm离心10min，获得PBMC。
CD146+/-UC-MSCs的分选：先提前配制好分选细胞所用的buffer，称取BSA和EDTA试剂，配制成含0.5％BSA、2mM EDTA的PBS混合液，并置于超声波清洗仪中减少气泡，放在4℃冰箱保存。UC-MSCs消化后尽量吹散成单细胞悬液，计数。若有细胞团块，使用Pre-Separation Filters进行过滤。消化离心后弃上清，再用20mlPBS重悬清洗细胞，300g10min离心，弃上清。每107个细胞加入60uL分选buffer，加入20uL Fc受体抑制剂混匀，再加入20uL CD146偶联分选磁珠。混匀，4℃避光孵浴30min。每107个细胞加入1mL buffer，300g10min离心，弃上清。加500uL buffer重悬细胞。先用500uL buffer润洗分选柱，将细胞悬液吸出至分选装置上的LS柱子上，3ml buffer清洗装细胞的50ml离心管，洗液加入分选柱，LS分选柱共用3ml buffer洗3次，注意分选柱中液体快滤完再加入buffer，不能太快也不能干了，避免产生气泡。静置等过滤完毕，滤液为CD146-细胞，细胞计数。加入3ml buffer，立即从装置上卸下分选柱，用注射器加压将buffer排出于50ml离心管中，此步骤可得到CD146+细胞。再用2ml buffer冲洗分选柱1次。CD146+和CD146-细胞进行计数，1200r 10min离心，弃掉上清。
为了得到更高的纯度，CD146-细胞将用LD柱子进行第二次分选，500uL buffer润洗LD分选柱，将用buffer重悬的CD146-细胞加入分选柱，3ml buffer清洗装细胞的50ml离心管，洗液加入分选柱，静置等过滤完毕，滤液为CD146-细胞，细胞计数。
在6孔板中每孔接种2×105个CD146+/-UC-MSCs，2ml培养基(10％FBS+αMEM)。培养6h贴壁后，每孔加入1×106个PBMC细胞。
调节性T细胞(Treg)的检测：①分别在CD146+/-UC-MSCs+PBMC共培养的孔中和未添加UC-MSCs的PBMC孔中加入PHA作为试验组和阳性对照组，分别记为CD146+组、CD146-组和PBMC+PHA(PHA)组，共培养2天。以未添加UC-MSCs和PHA的PBMC作为空白对照(CON，PBMC)组②收集PBMC细胞于流式管中，离心，PBS重悬。加入2μL LIVE/DEADTM Fixable Green DeadCell染料、5μl Anti-Human CD4，PC-5.5和5μl Anti-Human CD25，APC。涡旋震荡混匀，室温避光孵育30min。每管加入2ml 1×FCM Lysing Solution工作液，涡旋震荡混匀，室温避光孵育15min。室温400g离心5min，弃去上清。每管加入2ml 1×Flow Cytometry StainingBuffer，涡旋震荡混匀。室温400g离心5min，弃去上清。每管加入1ml 1×Fixation/Permeabilization工作液，涡旋震荡混匀。室温避光孵育1h。无需洗涤，每管加入2ml 1×Permeabilization Buffer。室温400g离心5min，弃去上清。用100μl 1×PermeabilizationBuffer重悬沉淀。通常洗涤后残留的液体量就已足够。细胞悬液中加入2μl正常大鼠血清进行阻断，室温避光孵育15min。无需洗涤，加入5μlAnti-Human Foxp3，PE。震荡混匀，室温避光孵育至少30min。每管加入2ml 1×Permeabilization Buffer，室温400g离心5min，弃去上清。每管加入500μl 1×Flow Cytometry Staining Buffer重悬，上机检测CD4+CD25+Foxp3+的比例。
辅助性T细胞(Th1、Th17)的检测：①分别在CD146+/-UC-MSCs+PBMC共培养的孔中和未添加UC-MSCs的PBMC孔中加入CD3/CD28激活剂作为试验组和对照组，分别记为CD146+组、CD146-组和PBMC组，共培养3天。②收集PBMC细胞于流式管中，加入CellActivationCocktail，放入培养箱培养6h。③离心，PBS重悬。加入2μl LIVE/DEADTM Fixable GreenDead Cell染料、5μlAnti-Human CD4，PC-5.5。涡旋震荡混匀，室温避光孵育30min。加入100μl MEDIUM A，室温孵育15min。加入3ml流式染色缓冲液(5％FBS的PBS)，400g离心5min，弃上清，涡旋振荡，使残留的液体重悬细胞沉淀。加入100μl MEDIUM B和5μlAnti-HumanIL17A，APC、5μlAnti-Human IFN-γ，PE。涡旋振荡，避光孵育30min。加入3ml流式染色缓冲液，400g离心5min，弃上清。加入0.5ml流式染色缓冲液，上机检测CD4+IL17A+IFNγ+的比例。
结果如图1所示，由图1a可以看出，与PBMC+PHA组相比，CD146+/-MSC共培养组均能提高PHA刺激的PBMC中Treg细胞亚群比例，CD146+MSC组中Treg比例极显著高于其他组(P<0.0001)。由图1b可以看出，与经过CellActivation Cocktail刺激的PBMC组相比，CD146+/-MSC共培养组均能减少Th1、Th17细胞亚群比例，CD146-MSC组能显著降低Th1比例(P<0.05)，CD146+MSC组能显著降低Th17的比例(P<0.05)，CD146+MSC组与CD146-MSC组之间无显著差异。
实施例2
CD146+/-UC-MSCs对巨噬细胞吞噬功能的影响
raw264.7细胞的培养：在含有10％FBS的DMEM高糖培养基中培养raw264.7细胞，不加双抗。
Raji细胞碎片的制作：raji细胞培养条件为1640培养基+10％FBS+1％双抗。用DMSO溶解CFSE染料配成5mM的储存液，使用之前用PBS稀释成5uM的工作液，将raji制成2×106个/mL的细胞悬液。取500uL细胞悬液和500uLCFSE工作液混合，放入37℃培养箱中染色10min，加入5ml全培养基中止染色，室温静置10min，加入PBS，1200rpm离心5min，再次加入PBS，清洗两次。使用完全培养基重悬细胞，放入培养箱中30min使细胞排出多余的染料。PBS清洗一次，1ml PBS重悬细胞，放入液氮中，再放在室温慢慢融化，反复三次。通过反复冻融将raji细胞破裂制成细胞碎片。
使用Transwell共培养体系，raw264.7铺在下层，2×105个/孔，待贴壁后，加入2×105个raji细胞制备的细胞碎片，同时加入上层小室，上层小室种植2×105个CD146+/-UC-MSCs，以不添加脐带间充质干细胞的组别为空白对照组(CON)。在30min、1h、2h消化raw264.7细胞，并收集上清，离心，PBS清洗一次。标记anti-mouse F4/80抗体，室温避光孵育15min，清洗上流式检测。
巨噬细胞中加入CFSE标记的细胞碎片，通过F4/80+CFSE+识别吞噬了细胞碎片的RAW264.7细胞，结果如图2所示：在30min时，CD146+组细胞吞噬率高于LPS组和CD146-组，在1h时CD146+组细胞吞噬率显著高于CD146-组(P＝0.031)，在2h时，三组之间的吞噬率基本在相同的水平。
实施例3
CD146+/-UC-MSCs对LPS诱导的巨噬细胞M1/M2型转化的影响
将raw264.7巨噬细胞种植于Transwell 12孔板中，待汇合度达到约60％～70％时进行处理，一般过夜培养。分为LPS组、CD146+UC-MSCs组和CD146-UC-MSCs组。加入2ml含200ng/ml LPS的全培养基刺激4h，PSB清洗3次，添加新的培养基，加入提前12h种植的CD146+/-UC-MSCs Transwell上层小室，分别在培养48h、72h消化每组细胞中的一孔。收集细胞流式检测各组巨噬细胞M1/M2型比例。另外收集各组培养的上清进行细胞因子检测实验。
流式检测巨噬细胞CD86和CD206表达情况：在5ml的流式管中加入100uL含1×106个细胞的悬液以及5uL CD86抗体，室温避光孵育20min；不洗涤直接加入100uL MEDIUMA，室温孵育15min；加入3mL含5％FBS的PBS，350g离心5min，弃上清，涡旋振荡，使残留的液体重悬细胞沉淀；加入100μl MEDIUM B和5uL胞内抗体CD206；涡旋振荡1-2s，室温避光进行孵育20min；加入3ml含5％FBS的PBS，350g离心5min，弃上清。加入0.5ml PBS，上机检测。
CD146+/-UC-MSCs与经过LPS刺激4h后的巨噬细胞RAW264.7在Transwell中共培养48h和72h，通过流式细胞术检测LPS组及共培养组中M1型巨噬细胞膜上标记物CD86和M2型巨噬细胞胞内标记物CD206的表达。结果如图3所示，与LPS组相比，CD146+/-MSC均能降低CD86的表达，一定程度上降低CD206的表达，但无显著性差异。
实施例4
小鼠脓毒症模型的构建和治疗：选用10周龄C57BL/6雄性小鼠，体重在25g左右，温度24℃，湿度60％，12h光照/12h黑暗，自由饮水进食。预先配制1.25mg/mL的LPS溶液，按照10mg/kg的剂量进行腹腔注射，注射200uL。CD146+/-UC-MSCs浓度为1×106个/ml，尾静脉注射100uL。实验分为4组，每组12只小鼠。对照组：腹腔注射PBS+尾静脉注射PBS；LPS组：腹腔注射LPS+尾静脉注射PBS；CD146+UC-MSCs组：腹腔注射LPS+尾静脉注射CD146+UC-MSCs；CD146-UC-MSCs组：腹腔注射LPS+尾静脉注射CD146-UC-MSCs；在腹腔注射LPS 1h后，尾静脉注射CD146+/-UC-MSCs。于12h和24h各组分别处死6只小鼠。
在12h和24h分离脓毒症小鼠的腹腔巨噬细胞：脱颈处死，剃掉腹部皮毛，固定于解剖板上，腹部向上固定小鼠；用眼科镊提起小鼠下腹部位的皮肤，用眼科剪沿腹中线剪开一小口，并剪掉一部分皮肤，完全暴露腹膜，此时可以清晰地看到内脏；用眼科镊提起腹膜，用5ml注射器向腹膜腔注射预冷的RPMIl640培养液3mL，针尖朝向腹膜，避免戳破腹腔脏器造成出血；用手指轻柔捏小鼠腹部两侧2min左右，倾斜小鼠，将腹腔内液体集中于一侧，用注射器向回抽出腹腔内的液体于预冷的流式管中，抽液时注意不要吸到器官造成堵塞；再次用5mL注射器向腹膜腔注射预冷的RPMIl640培养液2m L，再次吸出。将所有抽出的液体1000rpm离心5min，PBS清洗一次。分成两份，一份用来检测巨噬细胞比例，另外一份用来检测巨噬细胞的吞噬功能。
加入100uL PBS重悬细胞，加入7AAD、F4/80-APC、CD11b-FITC、Ly-6C-PE。
脓毒症小鼠腹腔巨噬细胞的吞噬功能检测：取上述制备好的巨噬细胞，加入1ml含90％1640+10％血清的培养基，加入FITC标记鸡卵白蛋白(FITC-OVA)，终浓度为100ug/ml，放入37℃培养箱培养1h，4℃，1500rpm离心5min，终止吞噬作用，100uLPBS重悬，加入F4/80-APC抗体，室温避光孵育15min，PBS清洗一次，500uLPBS重悬，流式细胞仪检测F4/80+中OVA-FITC阳性细胞的比例(吞噬入细胞内鸡卵白蛋白的荧光强度)。结果如图4a所示。12h，CD146+治疗组小鼠腹腔巨噬细胞的吞噬能力要优于CD146-治疗组和LPS组，24h时各组吞噬OVA蛋白的比例相当，CD146+UC-MSCs能在早期提高巨噬细胞的吞噬效率，这与实施例2所述体外实验的结果一致。
脓毒症小鼠腹腔巨噬细胞亚群的检测：CD11b+Ly6Chi代表炎症性巨噬细胞，CD11b+Ly6Clo代表修复性巨噬细胞，结果如图4b和图4c所示。检测腹腔中CD11b+Ly6C+单核细胞的比例发现在12h，CD146+UC-MSCs治疗组能显著降低腹腔中单核细胞的比例。分析CD11b+Ly6Chi和CD11b+Ly6Clo两者的比值发现，CD146+/-UC-MSCs治疗组均能降低CD11b+Ly6Chi/CD11b+Ly6Clo，且在24h，CD146+UC-MSCs组与LPS之间具有显著性差异。
实施例5
小鼠脓毒症模型的构建和治疗方法同实施例4。于24h处死小鼠。
对各组小鼠进行解剖，通过HE染色方法观察各组小鼠肺、肝、脾脏的形态变化。结果如图5a所示，与对照组相比：LPS组肺泡壁显著变厚水肿，肝窦扩张、出血，肺和肝都有有大量炎症细胞浸润，脾脏白髓和红髓分界模糊、淋巴细胞分布混乱。CD146+/-UC-MSCs治疗组均能改善LPS造成的小鼠各器官的病理损伤，CD146+组的器官病理形态要稍优于CD146-组。
小鼠外周血CD3、CD4、CD8比例检测
分别取各组小鼠50uL肝素钠抗凝全血，加入150uL索莱宝红细胞裂解液；4℃放置15min，其间轻轻涡旋混匀两次，红细胞裂解后，溶液应该是清亮透明的；4℃，450g离心10min以沉淀白细胞，小心吸弃上清液。向白细胞沉淀中加入两倍体积的红细胞裂解液，轻轻涡旋充分重悬白细胞。如起始血液为1ml，则加入2ml的红细胞裂解液。4℃，450g离心10min沉淀白细胞，小心并彻底吸去上清液。PBS清洗一次，加入CD3、CD4、CD8抗体的预混液，并制备CD3、CD4、CD8的单染管及空白管。避光孵育20min，流式细胞仪检测CD3、CD4、CD8比例。
结果如图5b和图5c所示。CD146+/-UC-MSCs治疗组均能改善LPS造成的小鼠CD4、CD8及CD4/8的紊乱。与LPS组相比，CD146+/-UC-MSCs治疗组显著降低了CD4的比例，显著提高了CD8比例，显著降低了CD4/CD8的比值。CD146+/-UC-MSCs治疗组CD4/CD8的比值与正常组相近。
实施例6
小鼠脓毒症模型的构建和治疗方法同实施例4。收集小鼠注射LPS后12h和24h的血浆，检测IL1β、IL6、IL10、TNFα、IFNγ、CXCL1的含量，具体方法为利用Luminex技术检测小鼠血浆中炎症因子的含量：
试剂准备：从冰箱中取出试剂盒，室温平衡30min。准备标准品：标准品共4瓶进行稀释，稀释液为RD6-52，充分混匀后，室温静置15-20min，每种标准品中取100ul到同一个EP管里，并用RD6-52补足1ml体积，作为标准曲线最高浓度。依次做3倍稀释，7个标准品，1个空白。
Beads准备：充分混匀预混beads混合物，按照比例吸取相应体积，对于一个96孔板，吸取500ul beads体积，加入5ml RD2-1稀释液，充分混匀，待用。
检测抗体准备：充分混匀预混检测抗体混合物，按照比例吸取相应体积，对于一个96孔板吸取500ul检测抗体体积，加入5ml RD2-1稀释液，充分混匀，待用。
PE-链霉亲和素准备：充分混匀PE-链霉亲和素试剂，按照比例吸取相应体积，对于一个96孔板，吸取220ul PE-链霉亲和素体积，加入5.35ml清洗液，充分混匀，待用。
清洗液准备：取25×清洗液20ml加480ml去离子水。
重悬beads后，向每孔加入25ul的已稀释的beads，分别每孔对应加入2.5ul的标准品和样本，摇床室温下2h，摇床速度设置为800rpm左右，微孔板需要贴膜封口。将微孔板放置于磁力架上至少1min时间，确保beads被吸附住，用清洗液清洗，100ul每孔，清洗3次。
每孔加入50ul稀释后的生物素标记的检测抗体复合物，同样室温下1h，摇床速度设置为800rpm左右，微孔板需要贴膜封口。将微孔板放置于磁力架上至少1min时间，确保beads被吸附住，用清洗液清洗，100ul每孔，清洗3次。
每孔加入50ul稀释后的链霉亲和素标记的PE，同样室温下0.5h，摇床速度设置为800rpm左右，微孔板需要贴膜封口。将微孔板放置于磁力架上至少1min时间，确保beads被吸附住，用清洗液清洗，100ul每孔，清洗3次。
将微孔板从磁力架上取下，用100ul清洗液重悬beads，孵育2min，摇床速度设置为800rpm左右，上机检测。
结果如图6所示，与LPS组相比，CD146+/-组在12h时能显著降低促炎因子IL1β的水平，24h时水平相当；CD146+/-组在12h和24h时能降低促炎因子IL6的水平，但没有显著性差异；12h时，三组之间抑炎因子IL10的水平相似，然而，24h时CD146+组IL10水平较CD146-组(P<0.001)、LPS组(P<0.05)均有显著升高。LPS组TNFα随时间延长呈升高趋势，在24h，CD146+/-组TNFα呈下降趋势；CD146+组与LPS组IFNγ的变化相似，146-组IFNγ的水平一直较低；在12h时，CD146+组CXCL1的水平最高，24h恢复到较低水平，而LPS组CXCL1的含量维持在较高水平。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (10)
1.一种CD146+或CD146-脐带间充质干细胞亚群在制备防治脓毒症的产品中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述产品包括药物、试剂盒和试剂。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述CD146+或CD146-脐带间充质干细胞亚群通过调控免疫能力发挥防治脓毒症的作用。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述调控免疫能力包括调节T细胞水平、巨噬细胞水平和炎症因子水平。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述调节T细胞水平包括提高调节性T细胞亚群水平和降低辅助性T细胞亚群水平。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述辅助性T细胞亚群包括Th1、Th17亚群。
7.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述调节巨噬细胞水平包括提高巨噬细胞吞噬能力和调节巨噬细胞分型。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述调节巨噬细胞分型包括降低M1型和M2型巨噬细胞水平。
9.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述调节炎症因子水平包括降低促炎因子IL1β和IL6的水平，提高抑炎因子IL10的水平。
10.一种CD146+或CD146-脐带间充质干细胞亚群在制备提高脓毒症患者免疫调节能力的产品中的应用。
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|---|---|---|---|
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Applications Claiming Priority (1)
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Publications (1)
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Cited By (1)
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|---|---|---|---|---|
| CN113646425A (zh) * | 2019-06-18 | 2021-11-12 | 中国医学科学院基础医学研究所 | 一种异质性干细胞群、其制备方法及用途 |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN110520138A (zh) * | 2017-02-28 | 2019-11-29 | 洛林大学 | 从华顿氏胶获得的用于治疗脓毒症的间充质干细胞 |
-
2022
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Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN110520138A (zh) * | 2017-02-28 | 2019-11-29 | 洛林大学 | 从华顿氏胶获得的用于治疗脓毒症的间充质干细胞 |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN113646425A (zh) * | 2019-06-18 | 2021-11-12 | 中国医学科学院基础医学研究所 | 一种异质性干细胞群、其制备方法及用途 |
| CN113646425B (zh) * | 2019-06-18 | 2024-03-19 | 中国医学科学院基础医学研究所 | 一种异质性干细胞群、其制备方法及用途 |
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