CN102317446A - 分离的单核细胞群及相关的治疗应用 - Google Patents

分离的单核细胞群及相关的治疗应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了使用分离的单核细胞群治疗罹患眼部血管疾病或者眼部退化疾病的方法。本发明还提供了分离基本上纯的单核细胞群的新方法。所述方法涉及从受试者抽取血样本或骨髓样本，从样本中缩减红血细胞，并且接着将样本中剩余的红血细胞和其他细胞类型与单核细胞分离开。不是使用选择试剂或者标识试剂，而是基于所述红血细胞和其他细胞类型的大小、粒度或者密度将其与单核细胞分离。所述分离的单核细胞可以在对受试者给药前，进一步体外或者在活体外激活。本发明也提供了包含基本上纯的CD14+/CD33+单核细胞的分离的细胞群。

Description

分离的单核细胞群及相关的治疗应用
政府支持的声明
本发明由美国政府提供了部分支持，美国国家卫生研究院批准号为：EY1254、EY14174和EY017540。因此，美国政府对本发明享有一定的权利。
相关申请的交叉引用
本主题专利申请主张申请号分别为61/208,173(2009年2月20日申请)和61/283,244(2009年11月30日申请)的美国临时专利申请的优先权利益。该些在先申请的全部公开以其所有内容并且基于所有的目的以引用的方式并入本发明中。
背景技术
眼部血管疾病，如与年龄相关的黄斑变性(ARMD)和糖尿病性视网膜病变(DR)分别归因于不正常的脉络膜或视网膜异常新生血管。它们在工业化国家是视力丧失的主要原因。由于视网膜由神经细胞、胶质细胞和血管元素的清晰可辨的层组成，所以诸如血管增生或水肿中所看到的那些相对小的干扰可导致视觉功能的显著丧失。遗传性视网膜变性，如色素性视网膜炎(RP)，也都与血管的异常，如小动脉狭窄和血管萎缩有关。每3500个个体中就有多达1个个体受到它们的影响，并且以下述症状为特征：渐进的夜盲、视野缺损、视神经萎缩、小动脉衰减和往往会发展到完全失明的中央视力丧失。虽然在辨别促进和抑制血管生成的因素方面已取得重大进展，但在减缓或扭转这些视网膜变性疾病的进展方面仍然没有有效的治疗方法。
本技术领域需要治疗和预防各种眼部血管疾病的更好的手段。本发明就是针对这种需求以及其他需求的。
发明内容
在一个方面，本发明提供含有表达CD33抗原和CD14抗原的基本上纯的单核细胞(monocyte)的分离的细胞群。这些分离的细胞群中的一些是从哺乳动物的外周血样本、脐血样本或骨髓样本中分离出来的。所述分离的细胞群中的一些是由人体细胞或鼠细胞组成。在所述分离的细胞群的一些中，所述细胞中至少有70％、80％或90％表达表面标志CD 14和CD33。一些分离的细胞群不含表达CD34的细胞。一些分离的细胞群基本不含ALDHbr细胞。所述分离的细胞群可以在体外或在活体外(ex vivo)进一步激活。这可以使用任何单核细胞激活化合物，例如，LPS、MPLA，或MCP-1完成。
在另一个方面，本发明提供治疗眼部血管疾病的方法。所述方法涉及给患有眼部血管疾病的受试者施予数量上足以治疗或改善所述眼部血管疾病的分离的单核细胞群。优选地，所述单核细胞群是从所述受试者的血液样本或骨髓样本中分离出来的。在一些优选实施方式中，使用所述方法治疗的所述受试者是人。在所述方法的一些中，所述单核细胞群包括基本上纯的CD14+/CD33+细胞。例如，所述分离的单核细胞群中的所述细胞至少有80％是CD14+/CD33+。在一些方法中，所述分离的单核细胞群在被施予受试者前在体外或在活体外激活。在这些实施方式中能够使用任何已知的能激活单核细胞的化合物。例如，所述分离的单核细胞细胞可以用LPS，MPLA，或MCP-1激活。在一些方法中，未经处理的单核细胞群(或在体外或在活体外激活的单核细胞群)与这样的单核细胞激活化合物对受试者联合给药。
许多眼部血管疾病是可以用本发明的方法治疗。例子包括缺血性视网膜病变、糖尿病性视网膜病变、早产儿视网膜病变、新生血管性青光眼、视网膜中央静脉阻塞(occlutions)、视网膜水肿，黄斑变性和色素性视网膜炎。在一些方法中，所述分离的单核细胞群是通过局部途径(a local route)，例如通过玻璃体内注射，对所述受试者给药的。在一些其他方法中，所述单核细胞群通过全身途径(a systemic route)，例如通过静脉注射，对所述受试者给药。
在相关的方面，本发明提供其他治疗或改善受试者眼部疾病的方法。这些方法需要(i)从患有眼部疾病的受试者的血液样本或骨髓样本分离出基本上纯的单核细胞群；以及(ii)将所述分离的单核细胞群对所述受试者给药，给药数量足以治疗或者改善所述眼部血管疾病。此外这些方法有些需要所述分离的单核细胞群在施予所述受试者前在体外激活。在这些实施方式中能够使用任何已知的能激活单核细胞的化合物。例如，所述分离的单核细胞可以用LPS、MPLA或MCP-1激活。在一些其他的实施方式中，所述分离的单核细胞群，不管有还是没有进一步在活体外激活，都与单核细胞激活化合物一起对所述受试者联合给药。
典型地，这些方法中使用的单核细胞群包含基本上纯的CD14+/CD33+细胞。优选地，分离的单核细胞群的细胞中至少约80％表达表面标志CD33和CD14。在一些方法中，所述单核细胞群通过以下方式分离得到：(i)缩减(debulk)样本中的红血细胞；(ii)将所述样本中的剩余的血红细胞和其他细胞类型根据它们的大小、粒度或密度与单核细胞分离开。在这些方法的一些中，所述剩余的红血细胞和其他细胞类型通过密度离心或荧光激活细胞分选(FACS)与单核细胞分离开。适合用这些方法来治疗的眼部疾病或障碍包括缺血性视网膜病变、糖尿病性视网膜病变、早产儿视网膜病变、新生血管性青光眼、视网膜中央静脉阻塞，黄斑变性和色素性视网膜炎。
在另一方面，本发明提供分离基本上纯的单核细胞群的方法。该方法涉及(i)提供受试者的血液样本或骨髓样本；(ii)缩减所述样本中的红血细胞；以及(iii)将所述样本中的剩余的红血细胞和其他细胞类型(血小板、粒细胞和粒细胞)与单核细胞分离开。在所述方法的一些中，所述剩余的红血细胞和其他细胞类型根据它们的大小、粒度或密度与单核细胞分离开。在所述方法的一些中，所述剩余的红血细胞和其他细胞类型通过密度离心或荧光激活细胞分选(FACS)与单核细胞分离开。在这些方法中，所述红血细胞通过羟乙基淀粉(Hespan)差速离心或聚蔗糖(Ficoll)密度梯度离心进行缩减。这些方法可以额外包括对表达表面标志CD14和CD33的所述分离的细胞群进行检验的步骤。
对本发明的性质和优点的进一步理解可参考说明书和权利要求的其余部分实现。
附图说明
图1A-1B所示为分离的单核细胞群体的属性和治疗活性。(A)流式细胞仪图显示不同于淋巴细胞的单核细胞群(门)。没有用标记来区分这些群；并且(B)从鼠氧诱导视网膜病变模型获得的数据表明，与介质注射相比，以所述方式分离出的人外周血(HuPB)单核细胞明显减少了新生血管簇区(黑条)以及血管闭塞(白条)。这些研究结果类似作为阳性对照的小鼠骨髓衍生的CD44hi细胞。
图2A-2B所示为通过密度离心产生的部分(fraction)的流式细胞仪分析的结果。数据显示，该样本耗尽了CD2+/CD3+淋巴细胞(A)并且富集了CD14+/CD33+单核细胞(B)。
图3所示为表示可以忽略不计的ALDHbr/SSC群的周边血液中的ALDH标记的结果。
图4所示为流式细胞仪分析结果，表明在所述分离的细胞群中，相对于靶CD14+单核细胞(左上)存在少量的CD34+细胞(右上)。
图5所示为根据上文所述的光散射特性所选择的人外周血单核细胞或淋巴细胞分选后的分析。显示单核细胞部分是由～88％的CD14+细胞组成，而淋巴细胞群几乎不含有CD14+细胞。还显示了对CD11b和CD33的分析，该分析显示CD11b和CD33对单核细胞部分上的这些骨髓标志与淋巴细胞部分里的很少量阳性细胞两者的高表达。
图6所示为在体外趋化检测的结果，表明响应于MCP-1，单核细胞(Mono)迁移呈剂量依赖性增加。淋巴细胞(Lympho)对MCP-1没有响应。鼠CD44hi骨髓细胞(CD44Hi)，其含有单核细胞，也响应MCP-1。
图7显示体外差别粘性实验表明了粘附到未经处理的细胞培养塑料的单核细胞的数量增加的能力。淋巴细胞不能在同一基质上大量粘附。
图8显示了来自视网膜整个标本的图像，表明心内注射后，不到5天，GFP表达细胞就在视网膜中出现。通过接触到过多氧(hyperoxia)，视网膜就会受到损伤。
图9所示为LPS处理过的单核细胞富集F5细胞(ActF5)分泌的细胞因子的式微珠阵列(CBA)分析。数据显示，LPS刺激后IL-lbeta、Il-6、IL-8和TNF的增加的分泌。对于每一细胞因子，作为介质中出现的蛋白质的数量和生物活性的参考，给出近似的ED50。单位为pg/ml。
图10所示为式微珠阵列数据，表明用LPS、MPLA或鼠MCP-l培养1小时或4小时后细胞因子的增加的分泌。显示了LPS和MPLA的两种浓度。值代表处理(激活)过的细胞对未处理(对照)过的细胞的比例。
图11所示为用不同浓度的LPS、鼠MCP-1，人类MCP-1和MPLA刺激4h和19h以后的式微珠阵列数据。19h的时间点显示，除了LPS和MPLA以外，鼠和人类MCP-1也刺激分泌IL-8和IL-6，虽然以较低的水平。
图12显示，来自正常和糖尿病供体的激活的单核细胞富集部分5(F5)都促进鼠OIR模型的血管修复，该修复比在非激活的F5或其他部分更有效。数据显示，在具有10000平方微米以下的血管闭塞的治疗组内视网膜所占的百分比。
具体实施方式
I概述
本发明涉及用于治疗或改善眼部血管疾病或退化性疾病的分离的和基本上纯的单核细胞细胞群。如下文实施例中所详述的，由本发明人分离的单核细胞群包含基本上纯的CD14+/CD33+单核细胞。如同眼部疾病模型中所测试到的一样，分离的单核细胞群具有促进血管修复的活性。所述单核细胞群也不同于供临床使用的其他已知的造血细胞群，这已经通过它们的治疗活性缺乏AldeFluorBright标记以及不依赖CD34+细胞而得到了证实。此外，所述分离的细胞群中的一些也以是CD34-和/或包含具有高水平表达醛脱氢酶(ALDHbr细胞)的数量非常低的细胞为特征。此外，发明人发现，在活体外激活的分离的单核细胞群中的一些具有促进血管修复的增强了的能力。最后，据观察，从具有视网膜血管疾病的供体分离出的单核细胞还可以在活体外激活，并促进缺血性视网膜病变的鼠模型的血管修复，这与从正常供体分离的细胞类似。这些发现提供了额外的支持，即可以采用自体方式将治疗活性单核细胞群应用于治疗视网膜血管疾病。
发明人还研发了新的程序，以分离单核细胞群，用于治疗新生血管性眼病，例如黄斑变性和糖尿病性视网膜病变。利用如骨髓、外周血或脐血等生物样本，该方法依赖于靶细胞群的物理属性，并且规避了对诸如抗体之类选择试剂的要求，所述抗体特异性识别单核细胞的表面抗原。由于缺乏表面约束异源材料，如抗体，用这些方法分离出的细胞群更符合治疗用途。进行的一系列体外实验以证明这些单核细胞制剂的纯度和活性。此外，发现，使用本发明所公开的方法分离的单核细胞群具备缺血性视网膜病变模型中所期望的治疗活性。
根据这些发现，本发明提供治疗上有效的分离的或基本上纯化的单核细胞群。本发明还提供了分离这样的单核细胞群的新方法。本发明进一步提供治疗或改善与异常眼部血管疾病相关或由异常眼部血管疾病引发的疾病或者障碍的方法。此外，提供了使用能激活单核细胞(如CD14或TLR4的激动剂化合物)的化合物在体外或在活体外激活的方式生产高活性的单核细胞的方法，以及使用类似的方式辨别能激活单核细胞的新化合物的方法。本发明还包括将分离的单核细胞群和能够激活与吸收细胞(例如，MCP-1)的化合物结合使用的治疗方法。在这些方法中，细胞在被施予受试者后，能被激活，并且通过额外吸收的细胞而让激活的效果得以维持。
高度激活的细胞和新的激活化合物在治疗各种眼疾中有用。这类疾病的例子包括：糖尿病视网膜病变、糖尿病性黄斑水肿、视网膜静脉闭塞、早产儿视网膜病变、年龄相关性黄斑变性、视网膜血管瘤增生、黄斑毛细血管扩张、缺血性视网膜病变、虹膜新生血管形成、眼内新生血管形成、角膜新生血管形成、视网膜新生血管形成、脉络膜新生血管形成以及视网膜变性。适合用本发明的方法治疗的受试者包括那些患有这些疾病或有患上这些疾病的任何一些的风险的受试者。以下各节提供更详细的指导以实施本发明的方法。
II.定义
除非有其他的定义，否则，本文中所使用的所有的技术和科学术语的含义与本发明相关技术领域里的普通技术人员通常理解的含义相同。以下参考文献为技术人员提供了在本发明中使用的许多术语的一般定义：Academic Press Dictionary of Science andTechnology，Morris(编)，Academic Press(第1版，1992)；IllustratedDictionary of Immunology，Cruse(编)，CRC Pr I Lie(第2版，2002)；Oxford Dictionary of Biochemistry and Molecular Biology，Smith等(合编)，牛津大学出版社(修订版，2000)；Encyclopaedic Dictionary ofChemistry，Kumar(编)，Anmol Publications Pvt.Ltd.(2002)；Dictionary of Microbiology and Molecular Biology，Singleton等(合编)，John Wiley&Sons(第3版，2002)；Dictionary of Chemistry，Hunt(编)，Routledge(第1版，1999)；Dictionary of PharmaceuticalMedicine，Nahler(编)，Springer-Verlag Telos(1994)；Dictionary ofOrganic Chemistry，Kumar and Anandand(合编)，Anmol PublicationsPvt.Ltd(2002)；以及A Dictionary of Biology(Oxford PaperbackReference)，Martin and Hine(合编)，牛津大学出版社(第4版，2000)。此外，以下定义供实施本发明的读者参考。
除非有其他的定义，否则，本文中所使用的所有的技术和科学术语的含义与本发明相关技术领域里的普通技术人员通常理解的含义相同。虽然在实施本发明的实验过程中，可以使用类似或等同于此处描述的任何方法和材料，但在此描述了优选的材料和方法。在描述和主张本发明时，将使用下列术语。
造血干细胞是能够发展成各种血细胞类型的干细胞，例如，B细胞、T细胞、粒细胞、血小板和红细胞。谱系表面抗原(表面标志)是一组属于成熟血细胞谱系标志的细胞表面蛋白质，包括CD2、CD3、CD11、CD11a、Mac-1(CD11b：CD18)、CD14、CD16、CD19、CD24、CD33、CD36、CD38、CD45、CD45RA、小鼠Ly-6G、小鼠TER-119、CD56、CD64、CD68、CD86(B7.2)、CD66b、人类白细胞抗原DR(HLA-DR)和CD235a(血型糖蛋白A)。不表达这些抗原显著的水平的造血干细胞，通常涉及谱系阴性(Lin.)。人造血干细胞通常表达其他的表面抗原，如CD31、CD34、CD117(c-kit)和/或CD133。鼠造血干细胞通常表达其他表面抗原，如CD34，CD117(c-kit)、Thy-1和/或Sca-1。
在血液中循环的细胞一般分为三种类型：白血细胞(白细胞)、红血细胞(红细胞)和血小板或凝血细胞。白细胞包括粒细胞(多形核白细胞)和无粒细胞(单核白细胞)。粒细胞是以在光学显微镜下观察时其细胞质存在不同染色颗粒为特征的白细胞。有三种类型的粒细胞：中性粒细胞、嗜碱性粒细胞和嗜酸性粒细胞。无粒细胞(单核白细胞)是以其细胞质中颗粒明显缺乏为特征的白细胞。虽然名字暗示缺乏颗粒，这些细胞包含非特异性嗜天青颗粒，该非特异性嗜天青颗粒是溶酶体。无粒细胞包括淋巴细胞、单核细胞和巨噬细胞。
单核细胞通过骨髓由称为原单核细胞的造血干细胞前体产生。单核细胞在血液中循环约1至3天，然后通常进入遍布全身的组织。他们构成血液中白细胞的3％至8％之间。在组织中，单核细胞在不同的解剖位置成熟为不同类型的巨噬细胞。单核细胞在免疫系统中有两个主要功能：(1)补充正常状态下的原位的巨噬细胞和树突状细胞，以及(2)响应炎症信号，单核细胞可以快速移动(约8-12小时)到组织感染部位并分裂/分化成巨噬细胞和树突状细胞以引起免疫反应。单核细胞通常通过其大的两裂片核在染色涂片上得以辨别。
眼部新生血管或眼血管疾病是一种病理状态，以异常的或不正常的眼组织增生以及新血管侵入眼组织结构为特征，所述眼组织如视网膜或角膜。眼部新生血管性疾病的例子包括：缺血性视网膜病变、虹膜新生血管形成、眼内新生血管形成、年龄相关性黄斑变性、角膜新生血管形成、视网膜新生血管形成、脉络膜新生血管形成、糖尿病视网膜缺血、视网膜变性和糖尿病性视网膜病变。
与角膜新生血管相关的其他疾病包括但不限于，流行性角结膜炎、维生素A缺乏症、接触透镜过度(contact lens overwear)、过敏性角膜炎、上(superior)边缘性角膜炎、翼状胬肉干燥性角膜炎、舍格伦(sjogrens)病、酒渣鼻痤疮、phylectenulosis病、梅毒、结核分枝杆菌感染、脂质变性、化学烧伤(bums)、细菌性溃疡、真菌性溃疡、单纯疱疹感染、带状疱疹感染、原虫感染、卡波西氏肉瘤、蚕蚀性角膜溃疡、Terrien边缘变性、边缘角质层分离、类风湿关节炎、系统性红斑狼疮、多动脉炎、外伤、韦格纳(Wegeners)结节病、巩膜炎、Steven′s Johnson疾病、periphigoid放射状角膜切开和排异反应角膜图。
与视网膜/脉络膜新生血管形成相关的疾病包括但不限于，糖尿病性视网膜病变、黄斑变性、镰状细胞贫血症、结节病、梅毒、弹性纤维性假黄瘤、变形性骨炎(Pagets disease)、静脉闭塞、动脉闭塞、颈动脉阻塞性疾病、慢性葡萄膜炎/玻璃体炎、分枝杆菌感染、莱姆病、系统性红斑狼疮、早产儿视网膜病变、色素性视网膜炎、视网膜水肿(包括黄斑水肿)、视网膜静脉周围炎(Eales disease)、Bechets疾病、造成视网膜炎或脉络膜炎的感染、推定眼组织胞浆菌病、先天性黄斑变性(Bests disease)、近视、视盘先天性小凹(opticpits)、Stargarts疾病，睫状体平坦部炎(pars planitis)、慢性视网膜脱离、高粘滞综合征、弓形体病、创伤和激光后并发症。其他疾病包括，但不限于，与虹膜红变(rubeosis)(角新生血管形成)有关的疾病和由纤维血管或纤维组织不正常增生引起的疾病，包括所有形式的增生性玻璃体视网膜病变。
早产儿视网膜病变(ROP)是感染早产婴儿的眼睛疾病。它被认为是视网膜血管杂乱无章的增长造成的，这可能会导致瘢痕形成和视网膜脱落。ROP可能是轻微的，并可以自然痊愈，但在严重的情况下可能会导致失明。因此，所有早产儿都有ROP风险，并且出生体重很低也是额外的风险因素。氧中毒和相对缺氧也能导致ROP的感染。
黄斑变性是主要发现于老年人中的医学情形，其中被称为视网膜黄斑区的眼睛内层中心罹患变薄、萎缩、并且在某些情况下出血等病症。这可能会导致中央视力的损失，进而导致无法看到精细的细节、不能阅读或不能识别脸。据美国眼科学院的研究，在美国，黄斑变性是目前导致年龄在五十岁以上的人中央视力丧失(失明)的主要原因。虽然年轻个体患有的黄斑营养不良有时被称为黄斑变性，但该术语一般是指年龄相关性黄斑变性(AMD或ARMD)。
年龄相关性黄斑变性开始时在被称为玻璃膜疣的黄斑(提供细节(detailed)中央视力的视网膜的中心区，被称为中心凹)上出现特征性的黄色沉淀物，所述玻璃膜疣位于视网膜色素上皮细胞和下层脉络之间。具有这些早期变化(指年龄相关性黄斑病变)的大多数人有良好的视力。具有玻璃膜疣的人可能继续感染深度的AMD。当玻璃膜疣大、数量多并且与黄斑下的色素细胞层的扰动有关时，风险远远更高。大和软的玻璃膜疣与升高的胆固醇沉积有关，并可能响应应降胆固醇剂或流变过程。
深度的AMD，其导致深度视力减退，有两种形式：干性和湿性。中央区域萎缩(深度的AMD的干性形式)产生于视网膜下的视网膜色素上皮细胞层的萎缩，其因眼睛中央部分的光感受器(视杆细胞和视锥细胞)的丧失而导致视力丧失。虽然这种病不能医治，但美国国家眼科研究所和其他机构已经证明，具有高剂量的抗氧化剂、叶黄素和玉米黄素的维生素补充剂可减慢干性黄斑变性的进展，并提高某些病人的视力。
色素性视网膜炎(RP)是一组遗传性眼病。在RP症状的加剧过程中，夜盲症一般先于视野狭窄症几年甚至几十年出现。患有RP的很多人直到40多岁或50多岁才成为法律意义上的失明，并且一生都保留一些视力。其他因RP而完全失明，在某些情况下早在幼年时期就完全失明。RP的发展对每个个案都不同。RP是一种遗传性视网膜营养不良，是一组遗传性疾病，在这组遗传性疾病中，视网膜的光感受器(视杆细胞和视锥细胞)或视网膜色素上皮(RPE)的异常导致渐进的视力丧失。感染的个体最先经历有缺陷的暗适应或夜盲症(夜盲)，随后周边视野(被称为视野狭窄)缩小，并且有时在病程后期中央视力丧失。
流体和蛋白质沉淀聚集在眼睛黄斑(视网膜的黄色中央区域)的上面或下面时，就发生黄斑水肿，导致该黄斑增厚或者肿胀。当黄斑在眼球后部视网膜的中心附近时，肿胀可能会扭曲人的中央视力。这个区域拥有紧密叠集的视锥细胞，其提供敏锐，清晰的中央视力，以使人直接看到视线方向上的形状、颜色和细节。黄斑囊状水肿是黄斑水肿的一种类型，其包括囊肿形成物。
术语“受试者”和“患者”可以互换使用，并指代哺乳动物，如病人和非人类的灵长类动物，以及实验动物，如兔、大鼠和小鼠，和其他动物。动物包括所有脊椎动物，例如，哺乳动物和非哺乳动物，如狗、猫、羊、牛、猪、兔、鸡等。优选地，实施本发明的治疗方法的受试者是人。需要治疗的受试者包括已经患上眼部血管疾病或障碍以及那些易于患上这种疾病的患者。
当涉及分离的细胞群时，术语“基本上纯的”或“基本纯”时，指的是在所述群里给定的细胞(靶细胞)的百分比明显比在自然环境中(如在受试者的组织或血液流中)发现的群中明显要高。典型地，基本上纯的细胞群中的靶细胞(如单核细胞)的百分比是所述细胞群中的细胞总数的至少约50％，优选至少约60％、70％、75％，并且更优选至少约80％、85％、90％或95％。
如本文所使用的，“治疗”或“改善”包括(i)防止病理条件(例如黄斑变性)的发生(如预防)；(ii)抑制病理条件(如黄斑变性)或阻止其发展；及(iii)缓解与病理条件(如黄斑变性)有关的症状。因此，“治疗”包括本发明分离的细胞群和/或其他治疗成分或治疗药剂的用药，以防止或延缓本文所述的眼部疾病的症状、并发症或生化征象(indicia)的发作，减轻或改善症状，或阻止或抑制疾病、条件或障碍的进一步发展。“治疗”还指任何治疗或改善或预防本文所述的眼部疾病、条件或障碍的成功的迹象，包括任何客观或主观的参数，如消减；缓解；症状的消除或者使疾病条件对患者更能忍受；减慢退化率或下降率；或使变性的最后点造成衰弱更轻。眼疾病或症状的治疗或改善的详细程序可以基于客观或主观的参数，包括医生的诊断结果。
III.分离单核细胞群的方法
本发明提供了分离单核细胞群的方法，所述单核细胞群对于治疗如本文所述的各种眼部血管疾病是有用的。如下文例子所例示的，所述单核细胞群可以从合适的生物样本中分离，该合适的生物样本从哺乳动物受试者获得，例如从其外周血或骨髓。本发明的方法能从骨髓或血液样本分离出基本上纯的(例如，有至少50％，75％或85％的纯度)单核细胞群。血液样本可以是包含全血中的大量白血细胞，或单核的白细胞的任何样本。例如，它可以全血或全血的白细胞采集法(leukapheresis)产品。白细胞采集法是实验室方法，在该方法中白血细胞从血液样本中分离。优选地，存在于分离出的细胞群中的单核细胞是CD14+/CD33+。CD33是表达在单核细胞/髓系的细胞上的跨膜受体。CD14是被表达在细胞(特别是巨噬细胞)表面的膜相关糖基磷脂酰肌醇连接蛋白质。骨髓、外周血和脐带血液中的每个包括表达CD 14抗原和CD33的单核细胞的子群。因此，这些生物样本优选用于根据本发明所公开的方法分离富含CD14+和CD33+细胞的单核细胞群。在一些实施方式中，分离的细胞群也以是CD34-和/或没有表达或表达低水平醛脱氢酶(ALDH)为特征。优选地，单核细胞群是从人骨髓、人外周血、人脐血或其他有关的血液样本中分离出的。
通常，所述方法需要先从样本去除(“缩减”)大部分的红血细胞(RBC)。这一步是伴随着将其他血细胞(如血小板，粒细胞和淋巴细胞)和剩余的红细胞(如果有的话)与单核细胞分离开。与本技术领域中已知的方法不同，本发明的方法没有使用识别不同细胞类型的细胞表面标志的标记试剂(如抗体)。相反，本发明仅基于物理性质(如大小、粒度和密度)将其他血液细胞类型，特别是其他单核的细胞(如淋巴细胞)与单核细胞分离开。在一些实施方式中，本发明的单核细胞群通过基于荧光激活细胞分选(FACS)的方法从合适的样本(如骨髓或外周血)分离出来。如下面的例子所详述的，存在于哺乳动物受试者中的生物样本(例如，外周血)中的RBC最先从分离方法中去除。这可能伴随着通过用本技术领域公知的标准方法裂解红细胞，该标准程序如氯化铵为基础的裂解方法。参见例如，Tiirikainen，Cytometry 20：341-8，1995；和Simon等，Immunol.Commun.12：301-14，1983。替代地，可以将RBC沉淀并且通过聚蔗糖(ficoll)上离心将单核的细胞分离。通过聚蔗糖密度梯度离心分离红细胞的方法在本技术领域被描述了，例如，Tripodi等，Transplantation.11：487-8，1971；Vissers等，J.Immunol.Methods 110：203-7，1988；以及Boyum等，Scand J Immunol34：697-712，1991.另一种适合缩减RBC的合适的方法是使用羟乙基淀粉(德国德莱艾希杜邦公司)性能通过差别离心诱导红细胞凝集。参见，例如，Nagler等，Exp Hematol.22：1134-40，1994；以及Pick等，Br.J Haematol.103：639-50，1998。可用于缩减RBC的进一步的技术包括血细胞过滤器的使用。这种血细胞过滤器容易从商品供应商处购得，例如，由Pall Biomedical Products Company(EastHills，纽约)生产的白细胞去除过滤器。
去除RBC后，样本中剩余的细胞悬浮在适当的缓冲剂中，该缓冲剂适宜用FAC法进行随后的分离步骤。例如，细胞可再悬浮于DPBS/0.5％BSA/2mM EDTA中。流式细胞仪是一项计算、检测和分选悬浮在流体流中的微小颗粒的技术。其能对流经光学和/或电子检测仪器的单个细胞的物理和/或化学特性进行同步多参数分析。典型地，单一波长的光束(通常激光光)直接射向水动聚焦的流体流。许多的探测器瞄准于点，在该点所述流穿过所述光束；一个探测器与光束成直线(前向散射或FSC)，数个探测器垂直于光束(侧散射(SSC)和一个或多个荧光探测器)。每个穿过光束的悬浮颗粒以某种方式散射光，并且在颗粒中发现或附着在所述颗粒上的荧光化学物质可以被激发，从而发出频率比光源发出的光的频率较低的光。所述散射的光与荧光可以被探测器检测出，并且通过分析在每个检测器(一个用于每个荧光发射峰)的亮度的波动，接着就可以推导出关于每个单个颗粒的物理和化学结构的各种类型的信息。FSC与细胞体积相关并且SSC取决于粒子的内在复杂性(即细胞核的形状，细胞质颗粒的数量和类型或膜表面粗糙度)。市场上的流式细胞仪对荧光已经没有要求，并且仅使用光散射用于测量。其他流式细胞仪形成每个细胞的荧光、散射光以及透射光的图像。
现代流式细胞仪每秒钟能够实时分析数千个颗粒，并能有效地分离和隔离具有特定属性的颗粒。流式细胞仪与显微镜相似，除了不生产细胞图像，流式细胞仪提供高通量的自动定量的组参数。流式细胞仪有5个主要组成部分：流动液体池流，光源(如激光)，检测器和产生FSC和SSC以及荧光信号的模拟数字转换器(ADC)系统，放大系统，和信号分析计算机。流式细胞仪产生的数据可以绘制在单一的维度上，以产生直方图，或在二维散点图上，或甚至三个维度上。对这些绘图的区域可以根据荧光强度按顺序分开，从而创建一系列的子集，术语称为“门”。具体的门实验方案(gatingprotocol)基于诊断和临床目的而存在，尤其在涉及血液学时。绘图往往根据对数刻度绘制。由于不同的荧光染料的发射光谱的重叠，在探测器的信号不得不通过电子的或者计算的方式进行补偿。
荧光激活细胞分选(FACS)是特殊类型的流式细胞仪。它基于每一个细胞的特定的光散射和荧光特性，提供了将生物细胞的异质混合物分选装入两个或多个容器，每次装入一个细胞。这是一个有用的科学仪器，因为它提供了来自单个细胞以及特定目的细胞的物理分离的荧光信号的快速、客观和定量的记录。细胞悬液夹带在狭窄的、快速流动的液体流的中央。所述流的布置使得相对于细胞的直径在细胞之间有大的间隔。振动机构导致细胞流分裂成单个的小滴。调整该系统，以便一个液滴中有多于一个细胞的可能性低。就在所述细胞流分裂成小滴前，所述流穿过荧光测量站，在该站，测量每个细胞的目标荧光特征。充电环刚好放置所述细胞流分裂成小滴的位点。根据紧接的荧光强度测量，将电荷放在环上，并在所述小滴从所述细胞流分裂后，所述小滴上就捕获相反的电荷。带电小滴然后通过静电偏转系统，静电偏转系统根据小滴的电荷将小滴转移到容器中。在某些系统中，电荷直接施加给所述细胞流，并且分裂的小滴保持与所述细胞流相同信号的电荷。在所述小滴分裂后，所述流然后返回至中性。
作为本发明的示例，流式细胞仪可使用一系列的门在BDFACSAria细胞分选系统(BD Bioscience，San Jose，加利福尼亚州)上实施。在分选中，没有使用抗体或其他选择试剂。通过划定一个区域，将死细胞和碎片最先从门排出，所述区域只包括存活的白血细胞。此后，成对的(doublet)细胞或聚合的细胞可以通过第二门和第三门去除，第二门和第三门各自询问前向散射宽度(FSC-W)比前向散射面积(FSC)和侧向散射宽度(SSC-W)比侧散射面积(SSC-A)。根据本技术领域公知的标准实验方案可以执行这些程序，如Flow cytometry-A practical approach，Ormerod(编)，牛津大学出版社，牛津，英国(第3版，2000)；和Handbook of FlowCytometry Methods，Robinson等(合编)，Wiley-Liss，纽约(1993)。
在一些其他实施方式中，本发明的单核细胞群使用基于
Figure BDA0000083710710000171
Cell Separation System(
Figure BDA0000083710710000172
细胞分离系统，Gambro BCT有限公司生产，Lakewood，科罗拉多州)的分离方案分离。是一种半自动、离心-基仪器，其使用连续逆流淘洗技术，根据大小和密度将细胞分成多个部分。在用
Figure BDA0000083710710000174
分离前，从哺乳动物受试者获得的生物样本(例如，从人患者获得的外周血样本)可先处理，以去除大量红细胞，如通过用羟乙基淀粉沉淀。然后，在用
Figure BDA0000083710710000175
设备进行处理前，可以收集有核细胞部分，例如，用血浆压榨器(plasma expressor)收集。如下面例子所详述的，通过
Figure BDA0000083710710000181
设备分级分离可以将单核细胞与血小板、剩余红细胞、淋巴细胞和粒细胞分离开。分离的细胞可进一步用于细胞计数、存活性和纯度分析。
在一些实施方式中，本发明提供了生产用于治疗应用的高活性细胞的方法。在这些实施方式中，按照本公开分离的单核细胞群在被施予患有眼部血管疾病的受试者前在体外或在活体外被进一步激活。典型地，细胞用能激活单核细胞的化合物进行处理。激活分离的单核细胞群的详细方法在下文阐述。
IV分离的单核细胞群的属性和活性
从诸如全血或骨髓之类生物样本中分离的单核细胞群可以对其免疫或生物特性以及它们的治疗活性进行检测。如示例中所详述的，分离的单核细胞群的纯度和活性可以通过许多的实验进行评估。例如，分析表面标志表达，本发明的一些方法可以进一步涉及评估由分离的单核细胞群表达CD14和CD33的步骤。使用抗-CD 14和抗-CD33单克隆抗体结合流式细胞仪可以检测分离的细胞的表面标志表达。例如在下面的例子所例证的，用本发明的方法分离出的细胞群中含有基本上纯化的CD14+/CD33+单核细胞。例如，分离的细胞群可以有至少50％、60％、75％、80％、85％、90％或95％的表达CD14和CD33的细胞。
除了它们的基本上纯以外，分离的细胞群在功能上对治疗或减轻于眼部血管疾病相关的症状是有效的。例如，如本文所披露的，分离的细胞群能促进小鼠的氧诱导视网膜病变的血管修复。缺血性视网膜病变的小鼠模型和其在评估分离的细胞群对眼部血管疾病的治疗活性中的用途在本技术领域中有描述。参见，例如，Ritter等，J.Clin.Invest.116：3266-76，2006；和Ritter等，Invest.Ophthalmol.Vis.Sci.46：3021-6，2005。
分离的细胞的功能和生化活性也可以通过测量细胞的趋化性进行分析，例如使用单核细胞趋化蛋白，如MCP-1。这样的活性实验的结果也提供了该制剂的相对纯度读数以及分离的细胞的存活性和功能的指征(indication)。检测分离的单核细胞的纯度和存活性的其他方法包括以单核细胞相对于其他单核的(monoclear)细胞对细胞培养基的不同粘性为基础的实验。如示例中已证实的，发现由本发明的分离方法所产生的细胞主要是单核细胞，这已通过在所述实验条件下它们所具备的粘附力所证明。
本发明的分离的单核细胞群中一些也是CD34-。本发明的CD34-单核细胞群被定义为单核细胞群，该单核细胞群除了是CD14+和CD33+外，不包含或包含非常低水平(例如，小于约5％、4％、3％、2％、1％、0.5％、0.25％、0.1％、0.05％或0.01％)的CD34+细胞。细胞群中CD34+细胞的存在可以很容易确定，并且使用本技术领域公知的方法或者本文中披露的方法可以确定其数量。发明的CD34-单核细胞群更适合用于本发明的一些治疗应用中。已知CD34+干细胞可以再分化成无用的细胞类型，并可能有增殖能力。CD34+细胞的这种特性在本公开的治疗方法的实践中是不利的。结果发现，注射未分化的干细胞群(如CD34+干细胞)到老鼠的眼睛产生了糟糕的结果(例3)。因此，除了是CD14+/CD33+外，本发明的单核细胞群也以缺乏或有非常低量的CD34+细胞为特征。如在下面的例子中所例证的，可能存在于最初的细胞制剂中的少量的CD34+细胞可以进一步从最终分离的单核细胞群中去除。重要的是，如本文所公开的，去除CD34+细胞不造成单核细胞群的治疗活性的任何改变。
在其他的一些实施方式中，本发明的单核细胞群也以不包含，或者基本上没有高表达醛脱氢酶的细胞(ALDHbr细胞)为特征。在本技术领域ALDHbr细胞是公知的。它们有祖细胞活性，并已表明在细胞治疗应用中是有用的(Gentry等，Cytother 9：259-274，2007)。存在于细胞群中的ALDHbr细胞通常可以通过荧光激活细胞分选(FACS)进行分选和定量，如本文的示例中以及在本技术领域所述的那样，例如Russo等，Biochem.Pharmacol 37：1639-1642，1988；以及Storms等，Blood 106：95-102，2005。如图3所示，本发明的分离的单核细胞群中的一些包含可忽略的(约0.04％)ALDHbr细胞。因此，本发明的一些优选的实施方式提供了基本不含ALDHbr细胞的分离的或纯化的单核细胞群。当用荧光激活细胞分选进行测量时，这些单核细胞群应该包含小于约5％、2％或1％的ALDHbr细胞。更优选地，在这些细胞群中ALDHbr细胞的百分比应小于0.5％、小于0.1％或小于0.05％。因都是低CD34-和/或ALDH，本发明的这些CD14+/CD33+单核细胞群进一步与其他血细胞或干细胞群区分开，这已在本技术领域有报道(参见，例如，Storms等，Blood106：95-102，2005)
本发明的单核细胞群中的细胞也可以被转变成用于表达治疗上有用的药剂，如用于细胞-基基因治疗的抗血管生成剂或提高神经元的救援效果的神经营养剂。在这些实施方式中，分离的单核细胞群用编码治疗上有用的药剂的基因转染。转染到本发明的单核细胞群中的细胞的合适的基因和方法在诸如专利申请编号：10/080,839的美国专利中描述了。在这些实施方式的一些中，细胞用可用于编码血管生成抑制肽例如，TrpRS或其抗血管生成(即抑制血管生成的)片段(参见，例如，美国专利申请序列号11/884,958专利申请)，的多(聚)核苷酸转染。抑制单核细胞细胞群中的细胞的工程(engineered)血管生成在调节与血管发育异常有关的疾病中的血管生长异常是有用的，血管发育异常如ARMD、糖尿病性视网膜病变、以及某些视网膜变性和类似疾病。在其他的一些实施方式中，本发明的分离的单核细胞细胞群中的细胞被转染以表达编码神经营养剂的基因。由转染基因表达的神经营养剂可以是，例如，神经生长因子、神经营养因子-3、神经营养因子-4、神经营养因子-5、睫状神经营养因子、视网膜色素上皮细胞源性神经营养因子、胰岛素样生长因子、神经胶质细胞源性神经营养因子、脑源性神经营养因子以及类似物。用这种基因转染的单核细胞细胞能用于促进涉及视网膜神经变性的眼部疾病的神经救援，所述视网膜神经变性如青光眼、色素性视网膜炎、视网膜神经受伤以及类似疾病。参见，例如，Kirby等，MoI.Ther.3：241-8，2001；Farrar等，EMBO J.21：857-864，2002；Fournier等，J.Neurosci.Res.47：561-572，1997；以及McGee等，MoI.Ther.4：622-9，2001。
V.治疗眼部血管疾病
本发明提供了治疗或改善罹患眼部疾病的哺乳动物的视网膜血管疾病和神经元变性的方法。根据该方法，上文所述的分离的单核细胞群或工程细胞可以向哺乳动物的视网膜给药，通过玻璃体内注射或全身用药。这些细胞的给药的数量足以改善视网膜的血管和/或神经元变性。优选地，分离的单核细胞群对于待治疗的哺乳动物是自体的。优选地，分离的单核细胞通过生理上可相容的介质给药，所述介质如磷酸盐缓冲液(PBS)。
在所述治疗方法的一些中，含有基本上纯化的(例如，至少75％或80％)CD14+/CD33+细胞的单核细胞群最先从待治疗的受试者身上采集的全血样本或骨髓样本中分离出来。使用上述方法分离单核细胞群。分离的CD14+/CD33+单核细胞群然后施予该受试者，给药数量足以改善或治疗视网膜的血管和/或神经元变性。可以从罹患眼部退化性疾病或眼部血管疾病的哺乳动物中分离所述细胞，优选在眼部疾病的早期阶段，或从已知的易患眼部退化疾病(例如，通过遗传易感性)的健康受试者分离。在后一种情况下，分离的单核细胞群可以在分离后存储，然后就可以在以后罹患的眼部疾病的早期阶段预防注射。
不打算受理论上的约束，本发明的CD14+/CD33+单核细胞群中的细胞可通过选择性靶向星形胶质细胞、掺入患病血管并接着分化成为血管内皮细胞，从而发挥其治疗效果。所述细胞可促进视网膜神经元的抢救，并促进抗细胞凋亡基因的上调。当将所述细胞系统给药或玻璃体内注入到从其分离出所述细胞的哺乳动物受试者(例如，人或鼠)的眼睛时，所述细胞对于视网膜新生血管和视网膜血管变性疾病的治疗以及视网膜血管损伤的修复是有用的。
适合用本发明的方法治疗的受试者可以是新生儿，青少年或完全发育成熟的成年人。在一些实施方式中，要治疗的受试者是罹患如氧诱导视网膜病变或早产儿视网膜病变等眼疾的新生儿受试者。在一些实施方式中，受试者是人，并且要采用的分离的单核细胞群是人的细胞，优选为从待治疗的受试者分离出的自体细胞。患有各种眼部血管疾病或眼部退化性疾病的受试者适于用本发明所述的单核细胞群治疗。这些疾病包括眼部疾病，如视网膜退化病变、视网膜血管变性疾病、视网膜水肿(包括黄斑水肿)、缺血性视网膜病变、血管出血、血管渗漏、脉络膜病变、视网膜损伤、以及涉及视网膜血管中断或退化的视网膜缺陷。这类疾病的具体例子包括年龄相关性黄斑变性(ARMD)、糖尿病性视网膜病变(DR)、拟眼组织胞浆菌病(POHS)、早产儿视网膜病变(ROP)、镰状细胞性贫血和色素性视网膜炎，以及视网膜损伤。此外，单核细胞群也可用于产生系列基因相同的细胞，即克隆，用于再生或修复治疗视网膜血管，以及治疗或改善视网膜神经元退化。另外，本发明的单核细胞群可用作研究工具，以研究视网膜血管的发育，并提供基因给选定的靶细胞，如星形胶质细胞。
对于治疗或预防应用，本发明分离的单核细胞群可通过局部途径或者通过全身途径对受试者给药。在一些实施方式中，为了获得预期的治疗效果，需要将细胞进行局部给药。例如，细胞群可以通过眼内注射(玻璃体内注射)向受试者给药。这可以根据本技术领域已知的标准操作进行。参见，例如，Ritter等，J.Clin.Invest.116：3266-76，2006；Russelakis-Carneiro等，Neuropathol.Appl.Neurobiol.25：196-206，1999；以及Wray等，Arch.Neurol.33：183-5，1976。在本发明的一些其他治疗方法，使用分离的单核细胞群的全身给药途径。例如，可通过静脉注射将所述细胞施予受试者，静脉注射是本技术领域常用的方法。在其他一些实施例，还可以通过心内注射将细胞施予非人类受试者。这可以基于本技术领域经常实践的操作完成。参见，例如，Iwasaki等，日本J.Cancer Res.88：861-6，1997；Jespersen等，Eur.Heart J.11：269-74，1990；以及Martens，Resuscitation 27：177，1994。其他注射方法也可以用于本发明的实践中。参见，例如，Remington：The Science and Practice of Pharmacy，Mack Publishing Co.，第20版，2000。
通常，注射到眼睛的单核细胞群中的细胞的数量应足以控制眼睛疾病的状态。例如，注射细胞量，可以有效地修复眼睛的视网膜损伤，稳定视网膜新生血管，使视网膜新生血管成熟，并防止或修复血管渗漏和血管出血。典型地，对于玻璃体内注射，至少约1×104，至少有1×105，或至少1×106分离的单核细胞群中的细胞或单核细胞群中的转染细胞被施予到患有眼部血管疾病(例如，视网膜退化疾病)的受试者的眼睛。注入的细胞数量可以取决于视网膜变性的严重程度、受试者的年龄和对于本技术领域的普通技术人员显而易见的治疗眼部疾病的其他因素。在一段时间内，单核细胞群中的细胞可单次剂量用药或者通过多次剂量用药，这可由主治医生决定。此外，用药的细胞数量和频率，可以根据治疗是预防性的或医治性的而变化。在预防性应用中，在一段长的时间内，可以在相对不频发的时间间隔内，施予数量相对较少的细胞。有些受试者可能在余生都会继续接受治疗。在治疗性应用中，可能需要在相对短的时间间隔内，施予数量相对较多的细胞，直至减缓或终止病情的发展，并且优选地，直至受试者显示部分或完全的眼部血管疾病症状的缓解。此后，受试者按预防性阶段用药。
VI.通过在活体外激活，增强分离的单核细胞群的活性
在如上所述的各种治疗应用中，分离的单核细胞群或其工程细胞也可以在体外或在活体外被激活后，再向需要治疗的受试者给药。在这些实施方式中，当将在活体外激活的单核细胞施予到患有眼部血管疾病的受试者的视网膜时，可以获得增强的治疗活性。
根据本技术领域经常使用的材料和方法，或者根据下述例子所例证的材料和方法，分离的单核细胞群的激活可以容易地进行。单核细胞和巨噬细胞用各种试剂，如LPS，通过CD14和钟样受体(Le-Barillec等，J.Leukoc.Biol.68：209-15，2000；Mirlashari等，Med.Sci.Monit.9：BR316-24，2003)激活。正如下面的例子所表明的，分离的单核细胞群可以用多种试剂，如脂多糖(LPS)、单磷酰脂A(MPLA)和单核细胞趋化蛋白1(MCP-1)激活。它也表明，相对于未经处理的细胞，激活细胞对于氧诱导视网膜病变的动物产生了更好的治疗效果。因此，可以容易地利用这些试剂在活体外激活这些分离的单核细胞群。本技术领域公知的许多其他的单核细胞激活化合物也可以用在本发明的实践中。这些化合物的例子包括免疫调节剂(如γ干扰素、淋巴因子、胞壁酰二肽)、佛波醇肉豆蔻酸乙酸酯、刀豆素A、聚甲基丙烯酸甲酯以及膳食脂肪。参见，例如，Koff等，Science 224：1007-1009，1984；Chung等，J.Leukoc.Biol.44：329-336，1988；Horwitz等，J.Exp.Med.154：1618-1635，1981；Laing等，Acta Orthop.79：134-40，2008；Bently等，Biochem.Soc.Trans.35：464-5，2007。
为了激活单核细胞，可以用所述化合物中的任何一种以合适的浓度将分离的细胞培养一段足够长的时间。根据经验或者根据本领域技术的教导可以确定化合物的使用量和细胞给药前激活细胞的时间长度。下面的例子也提供了用所述化合物中的一些激活分离的单核细胞群的具体指导。使用LPS作为例子，细胞可以用LPS培养，LPS的浓度为约1ng/ml至约1000ng/ml，优选约5ng/ml至约200ng/ml，或从约20ng/ml至约50ng/ml。这些细胞在用于治疗应用前通常用激活的化合物处理至少10分钟，优选至少1小时。在一些实施方式中，细胞用化合物处理至少2小时、至少4小时、至少10小时、至少24小时或更长时间。
在将处理过的细胞对受试者给药前，细胞也可以在体外检查，以确定其活性。这通常可以通过定性或定量监测处理过的单核细胞的细胞因子分泌物来进行。如例子中所显示的，激活的单核细胞增加了细胞因子，如IL-1β、IL-8、IL-6和TNF的分泌。如例子中所例证的，单核细胞的细胞因子分泌物分布图(profile)可以通过常用的实践方法，例如式微珠阵列(CBD)的分析方法容易地进行评估。参见，例如，Elshal等，Methods.38：317-329，2006；以及Morgan等，Clin.Immunol.110：252-266，2004。
除了将细胞在对受试者给药之前在体外或者在活体外激活分离的单核细胞群以外，本发明的一些治疗方法涉及将未经处理的单核细胞群和本文公开的单核细胞激活化合物(例如MCP-1)共同施予受试者。在一些相关的实施方式中，将上文所述的体外或在活体外激活的单核细胞群与单核细胞激活化合物(例如，MCP-1)共同施予需要治疗的受试者。在这些实施方式中，共同给药的化合物，可以在体内激活给药的单核细胞或者在体内增强处理过的细胞的活性。
在相关方面，本发明提供了用于识别能激活或刺激单核细胞的治疗活性的新的化合物的方法。典型地，这些方法需要让待选化合物与单核细胞或巨噬细胞群(如本文所述的单核细胞群)接触，并且监测指示单核细胞群的激活状态的单核细胞的参数。要监控的参数可以是所述细胞的任何生物的、生化的或形态的特征。在一些优选实施方式中，检测用待选试剂处理的细胞的一种或多种细胞因子(如IL-6，IL8或TNF)的分泌水平。相对于未处理过的细胞，由处理过的细胞分泌的这些细胞因子中的一种或多种的增加的分泌表明待选化合物是新型的单核细胞激活化合物。
本方法筛选的待选化合物可以是化学类形式的，包括小的有机分子、蛋白质、多肽、多糖、多核苷酸以及类似物。在一些优选实施方式中，待选化合物是小分子有机试剂(例如，低于约500道尔顿或低于约1000道尔顿的有机化合物)。优选地，高通量实验适应于并被用于筛选待选化合物的组合库(例如，小的有机分子库)。这种实验在本技术领域是公知的，例如，如以下文献中所阐述的：Schultz(1998)Bioorg Med Chem Lett 8：2409-2414；Weller(1997)MolDivers.3：61-70；Fernandes(1998)Curr.Opin.Chem.Biol.2：597-603；以及Sittampalam(1997)Curr.Opin.Chem.Biol.1：384-91。通过编码合成库(ESL)方法可以建立待选化合物的大型组合库，该方法在专利WO 95/12608、WO 93/06121、WO 94/08051、WO 95/35503和WO 95/30642中有描述。合成各种化合物库的其他方法在以下文献中有描述，例如，Overman编，Organic Reactions，卷1-62，Wiley-Interscience(2003)；Broom等，Fed Proc.45：2779-83，1986；Ben-Menahem等，Recent Prog.Horm.Res.54：271-88，1999；Schramm等，Annu.Rev.Biochem.67：693-720，1998；Bolin等，Biopolymers 37：57-66，1995；Karten等，Endocr.Rev.7：44-66，1986；Ho等，Tactics ofOrganic Synthesis，Wiley-Interscience；(1994)；以及Scheit等，Nucleotide Analogs：Synthesis and B iological Function，John Wiley&Sons(1980)。
实施例
下面提供的例子进一步说明本发明，但不限制其范围。本发明的其他变型对于本技术领域的普通技术人员是显而易见的，并被所附权利要求所包含。
例1，分离单核细胞群
外周血或骨髓可以用来作为这里所描述的程序的源材料。作为例子，我们选择外周血作为细胞来源，因为相比于骨髓，外周血有相对丰富的单核细胞，并且采集简易/安全。对于治疗用途，期望细胞没有与选择有关的任何限制(bound)化合物。记住这个目标，我们已经设想了并且实施了仅仅基于物理特性，例如大小、粒度和密度而将单核细胞从其他单核的细胞(如淋巴细胞)中区分开来的方法。我们已经研发的第一种方法是基于FACS，不使用抗体，根据细胞大小和粒度的差异灵敏地将单核细胞与淋巴细胞分离。显示用这种方法分离的单核细胞群的结果表示在图1A中。在基于FACS的分离之前，出现在全血中的红细胞和粒细胞在预分选聚蔗糖离心步骤中被去除。这可以通过几种手段实现，例如，(1)可用氯化铵溶解红细胞，(2)可以沉淀红细胞并且用聚蔗糖离心分离单核的细胞，以及(3)也可使用羟乙基淀粉沉淀红细胞。
RBC缩减后，细胞悬浮在DPBS/0.5％BSA/2mM EDTA，准备荧光激活细胞分选(FACS)。分选是使用一系列的门在BDBiosciences ARIA上实施，并且没有使用抗体或其他选择剂。划定只包含存活白血细胞的区域，将死细胞和碎片最先从门排出。然后，各自通过询问前向散射宽度(FSC-W)对前向散射面积(FSC-A)和侧向散射宽度(SSC-W)对侧散射面积(SSC-A)的第二门和第三门将成对的或者聚集的细胞去除。只考虑单一的白血细胞，用FSC-A对SSC-A模式画门以选择在区域中找到的细胞，该区域可再现地包含单核细胞。使用例2中描述的实验，我们发现，用这种方法获得的细胞群中含有纯度为80％-85％的CD14+/CD33+单核细胞。
基于密度区分细胞的分离单核细胞群的第二方法依赖于离心过程中的不同的流动性。这种方法在临床应用中具有一定的优势，因为一次性管套可用于保证样本无菌并消除样本的交叉污染。具体来说，人类血液样本首先使用羟乙基淀粉沉淀法处理，以将红血细胞缩减。此后，向抗凝固血液制品中添加适当体积的6％羟乙基淀粉，直至最终浓度为1.5％。将袋中物轻轻拌和并在室温下直立培养45分钟，以让红细胞沉淀。然后用手动血浆压榨器压榨出核细胞部分(NCF)，并用单独的无菌600mL空血袋收集。将所获得的细胞产品用作为基于密度梯度离心法的进一步分离的起始原料。
然后，用设计为浓缩单核细胞群的
Figure BDA0000083710710000281
设备(Gambro BCT公司，Lakewood，科罗拉多州)处理起始细胞产品。一次性管套连接到
Figure BDA0000083710710000282
设备上。然后将起始细胞产品、包含HBSS和0.5％的HAS的主要和次要介质袋连接到连接管套的适当连接处。使用所述次要袋预处理管套。程序号一(见下表1)用于处理起始细胞产品。该程序自动将起始细胞产品加载到室内并且使用主要介质袋进行处理。然后以不同的流速对细胞进行连续的离心处理，分离成多个部分并收集。将程序设计成收集5个部分，每个部分用下述的特殊细胞群进行浓缩。血小板收集在部分1，RBC在部分2，淋巴细胞在部分3，单核细胞在部分4以及粒细胞在部分5。对每个部分进行采样并用核细胞计数器分析细胞计数、存活性以及用流式细胞仪分析纯度。表1示出了每个部分的流速和收集容积。基于纯度和细胞数，收集含有单核细胞的适当容量物，然后以300×g进行离心。
如图2中所指出的，发现通过密度离心法分离出的单核细胞制剂与通过FACS-基方法分离出的单核细胞制剂本质上是类似的。
表：1
  部分   流速   离心速度   收集容积
  1   37   2400   900
  2   97.5   2400   975
  3   103.4   2400   975
  4   103.9   2400   975
  5   103.9   0   250
例2，用分离的单核细胞群治疗眼部血管疾病
使用氧诱导视网膜病变小鼠模型检测用本文所述的方法分离的单核细胞群的治疗活性。氧诱导视网膜病变小鼠的产生方法如Ritter等，J.Clin.Invest.116：3266-76，2006中所述。具体来说，根据Smith等，Invest.Ophthalmol.Vis.Sci.35：101-111，1994里描述的方案诱导C57BL/6J小鼠产生氧诱导视网膜病变。作为对比，也用相同的条件处理BALB/cByJ小鼠。简单地说，P7的幼崽和它们的母亲从室内空气环境被转移到含氧气75％的环境，持续5天并随后返回到室内空气环境。使用BioSpherix室创建和维持高氧环境。在这些条件下，在C57BL/6J小鼠的高氧处理过程中，大的少血管区在中央视网膜形成，并且在返回到常氧态后，异常的视网膜前新生血管形成发生，P17左右达到顶峰，并最终消解(resolving)。
接着将分离的细胞通过眼内注射注入小鼠。随后对治疗的小鼠以及对照组小鼠的眼睛的血管进行免疫组织化学分析和可视化分析。使用了Ritter等，J.Clin.Invest.116：3266-76，2006里描述的方法进行这些研究。这些研究的结果显示在图IB。正如图所示，由本发明者分离的基本上纯的单核细胞群能够促进氧诱导视网膜病变小鼠的血管修复。
例3，分离的单核细胞群的其他属性和活性
为了证明我们分离的细胞不同于已经公知的临床使用或者研发上的细胞群，我们已经标记了用于醛脱氢酶表达的外周血样本，当被高水平表达时(ALDHbr)，其辨别CD34+细胞、CD133+细胞、kit+细胞、谱系抗原阴性(Lin-)细胞。我们发现，外周血标本(图3)基本上没有这样的标记，匹配于这样的观念，即预计在不流动的外周血中干细胞是极为罕见的。
CD34是造血干细胞的标志，并已用于选择各种临床应用细胞。我们发现，这类细胞可能包括或不利地影响本文所述的治疗应用的结果。具体而言，为了确定眼内注射后未分化的干细胞的行为，我们采用玻璃体内注入小鼠胚胎和人类间质干细胞(其如CD34+干细胞一样是未分化的细胞)。这些细胞或注入正常的眼睛或注入那些经受了氧诱导视网膜病变(OIR)模型的眼睛。此外，为了评估与眼睛无关的细胞类型的效果，我们将人体正常皮肤纤维细胞通过玻璃体内注射入鼠OIR模型。在上述所有情况下，我们观察到视网膜明显的炎症和肿瘤活性。这些结果表明，眼内注射未分化的干细胞和/或增殖细胞，会导致正常的或缺血性的眼睛的显著的不良反应。这些研究还强调以下发现，即与未分化的干细胞相比，本发明所述的髓系祖细胞群促进视网膜血管控制修复，但没有发生如炎症或瘤之类不良反应。
如图4所示，用我们的方法制备的所述群可能含有少量CD34+细胞(图4)。然而，这些细胞并不需要具有我们的模型中的功能。此外，我们特别地将我们的单核细胞制剂中的CD34-表达细胞去除并且显示疗效没有变化。
例4，分离的单核细胞纯度和功能的体外实验
为了评估如上所述的分离的细胞的纯度和活性，我们开发了几种独立评估不同的单核细胞特性的体外实验。第一个实验是测量单核细胞制剂的纯度。其使用了针对单核细胞标志CD 14的抗体和流式细胞仪(图5)。如图5所示，这个实验使我们能够确定分离出的细胞群中存在的非单核细胞细胞的数量，并验证我们的分离方法的效率。第二个实验是分离的单核细胞活性的测量。它将细胞的趋化性量化成单核细胞趋化蛋白1(MCP-1)的斜度。这些测试使用孔径为3μm或5μm的博伊登室(Boyden chamber)进行，其中让细胞在37℃迁移2小时。结果表明，分离的单核细胞制剂在MCP-1的影响下有效地迁移，但淋巴细胞没有(图6)。因此，这个实验提供了制剂的相对纯度的读数以及分离的细胞存活性和功能的标示。
第三个实验是基于对细胞培养基质的不同的粘性。确定单核细胞能够粘附细胞培养塑料，而淋巴细胞不粘附。如图7所表明的，这个实验的结果表明，由本文所述的分离方法产生的细胞主要是单核细胞，这通过在这些条件下其粘附能力予以证实。
例5，治疗细胞群的全身给药
这个例子描述了在小鼠视网膜病变模型的治疗应用中，CD44hl骨髓细胞的心内给药。这种全身给药途径不同于上述例子中使用的典型的局部给药途径(眼内注射)。用文献Ritter等，J.Clin.Invest.116：3266-76，2006中所述的方法，制备和获取GFP-表达CD44hl骨髓细胞。使用标准操作将细胞通过心内注射到氧诱导视网膜病变C57BL/6J小鼠(通常，在产后第7天小鼠)体内。通过分析注射后数天受注射小鼠(例如，7天或10天以后)的GS凝集素染色视网膜，细胞的血管靶向活性得以证实。使用Radiance2100 MP激光扫描共聚焦显微镜(Bio-Rad；Zeiss)获得视网膜血管图像。染色视网膜和分析共焦显微图像的操作按Ritter等，J.Clin.Invest116：3266-76，2006Ritter中所述的操作进行。
研究结果表明，治疗细胞的部分靶向高氧损伤后的视网膜(图8)。这些发现表明，此处所描述的单核细胞群也可以全身给药(例如，通过心内注射)来实现其治疗效果，例如，修复损伤或将治疗药剂递送至眼睛。
例6，在体外激活的单核细胞群的增强的活性
这个例子描述了单核细胞群在活体外的激活，以及相对于未激活的细胞的其增强的活性。
使用如上所述的方法分离单核细胞细胞后，分离的单核细胞细胞(部分5(F5)细胞)用浓度25ng/ml的脂多糖(LPS)处理4小时。激活通过一个基于流式细胞仪的实验检测，并通过BD细胞内细胞因子染色实验修正，从而测得细胞内的细胞因子水平。与未处理的细胞和与淋巴细胞富集的部分(F3)相比，此法检测用LPS处理过的单核细胞(F5)细胞中IL-6，IL-8和TNF蛋白质的累积增加量。具体而言，数据显示，LPS处理后淋巴细胞富集群(F3)没有基本上激活时，单核细胞富集群(F5)清晰地用LPS激活了。此外，结果表明，当用细胞内细胞因子染色法测量时，来源糖尿病供体的细胞正常激活。此外，从流式细胞仪分析发现，当用前向散射对侧向散射测量时，LPS处理对F5细胞的形态影响不大。
我们使用式微珠阵列定量测量LPS-激活细胞与未经处理的细胞相比的分泌的细胞因子水平，独立地证实了这些发现。我们检测到所分泌的IL-6、IL-8和TNF蛋白的显著增加。该实验还确定了LPS刺激F5细胞后IL-1β显著上调(图9)，但IL-10和IL-12p70的分泌基本保持不变。
除了用LPS激活分离的单核细胞外，我们还检测了其他具有更良好安全内容的激活化合物的活性。具体来说，我们首先聚焦于LPS受体的替代配体TLR4。这些替代TLR4的配体之一，单磷酰脂A(MPLA)，用于上文所述的式微珠阵列。结果表明，MPLA激活F5细胞，伴随IL-8，IL-6和TNF增加，这与使用LPS观察到的结果类似(图10)。MPLA处理后，IL-1β分泌物的增加也被观察到，虽然增加水平为用LPS刺激获得的大约一半。
我们还测试了小鼠和人单核细胞趋化蛋白1(MCP-1)对F5单核细胞细胞的激活能力。受刺激的小鼠的和人的MCP-1都增加IL-8和IL-6。但增加水平低于用LPS或MPLA所增加的水平(图10和11)。
除了测量在活体外激活的单核细胞群的细胞因子分泌物外，我们在动物研究中进一步检测了细胞的治疗活性。在这些研究中，LPS处理的细胞或对照细胞的平行组通过玻璃体内注射对小鼠给药(250,000个细胞/0.5μL)。然后，让这些动物进行高氧处理和罹患氧诱导视网膜病变。对这些动物的视网膜的分析表明，用被LPS激活的F5单核细胞所进行的处理减少了在此模型中所测量到的两个主要参数：血管闭塞面积和新生血管形成(簇)的面积。使用LPS处理的F5导致这些参数的减少量比单独使用未经处理的F5细胞、处理过的F3细胞、赋形剂(vehicle)或LPS所导致的参数的减少量要大。
使用10,000平方微米这个值作为截止值，该值以下我们认为视网膜本质上没有血管闭塞(这里描述为“经医治的”)，我们能够证明，与用未经处理的F5或其他LPS-处理的部分(F3)相比，用LPS处理过的F5处理后，有远远较高数量的视网膜有低于截止值的闭塞区域(图12)。这表明，激活的单核细胞富集细胞群能够促进这种缺血性视网膜病变模型的血管修复。如图12中所能看到的，F3部分显示在OIR模型的疗效水平，表明在这个部分也存在活性细胞。因此，这个群，或F5和F3细胞的结合也是有治疗用途的。
在治疗糖尿病性视网膜病变方面，自体的方法有潜在用途，关键是要证明来源于糖尿病供体的细胞具有活性。我们已经表明，事实上，使用OIR模型就是这种情况。来自糖尿病供体的单核细胞富集部分(F5)示出了激活图案，其与正常供体没有区别(图9)，并且与非激活F5细胞或其他LPS处理过的部分(F3)相比，这些激活的细胞还显示出在较高的程度上促进OIR模型中血管的修复(图12)。某些程度的活性在淋巴细胞富集F3部分又被观察到。
虽然基于清晰理解的目的，上述发明已通过解说和示例进行了详细描述，但是，显而易见，得到本发明教导的本领域的普通技术人员可以对本发明作出某些改变或者修正，而不背离所附权利要求的精神或范围。
本说明书引用的所有出版物、数据库、GenBank序列、专利和专利申请通过引用并入本文，似乎每份资料特别地并且单个地被指明通过引用并入本文。

Claims (34)

1.一种分离的细胞群，其包括表达CD33抗原和CD 14抗原的基本上纯的单核细胞。
2.根据权利要求1所述的分离的细胞群，其中，所述的细胞群从哺乳动物的外周血样本、脐血样本或骨髓样本中分离出来。
3.根据权利要求1所述的分离的细胞群，其中所述分离的细胞群中的细胞是人体细胞或鼠细胞。
4.根据权利要求1所述的分离的细胞群，所述分离的细胞群中的所述细胞中至少有70％、80％或90％的细胞表达表面标志CD 14和CD33。
5.根据权利要求1所述的分离的细胞群，其中所述细胞群是CD34-。
6.根据权利要求1所述的分离的细胞群，其中所述细胞群基本上没有ALDHbr细胞。
7.根据权利要求1所述的分离的细胞群，其进一步在体外被激活。
8.根据权利要求7所述的方法，其中所述分离的细胞群用LPS、MPLA或MCP-1激活。
9.治疗或改善受试者眼部血管疾病的方法，包括将分离的单核细胞群施予患有眼部血管疾病受试者，其中所述细胞群的给药数量足以治疗或改善所述眼部血管疾病。
10.根据权利要求9所述的方法，其中所述单核细胞群从所述受试者的血液样本或骨髓样本中分离出来。
11.根据权利要求9所述的方法，其中所述受试者为人。
12.根据权利要求9所述的方法，其中所述单核细胞群包含基本上纯的CD14+/CD33+细胞。
13.根据权利要求9所述的方法，其中所述分离的单核细胞群的所述细胞中的至少80％是CD14+/CD33+。
14.根据权利要求9所述的方法，其中所述眼部血管疾病选自缺血性视网膜病变、糖尿病性视网膜病变、早产儿视网膜病变、新生血管性青光眼、中央视网膜静脉阻塞、视网膜水肿、黄斑变性和色素性视网膜炎。
15.根据权利要求9所述的方法，其中所述单核细胞群是通过玻璃体内注射对受试者给药的。
16.根据权利要求9所述的方法，其中所述单核细胞群在对受试者给药前在体外或在活体外激活。
17.根据权利要求16所述的方法，其中所述单核细胞群用LPS、MPLA或MCP-1激活。
18.根据权利要求9所述的方法，其中所述单核细胞群与单核细胞激活化合物对受试者联合给药。
19.根据权利要求18所述的方法，其中所述单核细胞激活化合物用LPS、MPLA或MCP-1激活。
20.治疗或改善受试者眼部疾病的方法，包括(i)从患有眼部血管疾病的受试者的血液样本或骨髓样本分离出基本上纯的单核细胞群；以及(ii)将分离的单核细胞群施予到所述受试者，给药数量足以治疗或者改善所述眼部血管疾病，从而治疗或者改善所述受试者的所述眼部血管疾病的症状。
21.根据权利要求20所述的方法，其中所述分离的单核细胞群包括基本上纯的CD14+/CD33+细胞。
22.根据权利要求20所述的方法，其中所述分离的单核细胞群的细胞中的至少约80％表达表面标志CD33和CD14。
23.根据权利要求20所述的方法，其中所述单核细胞群通过以下方式分离得到：(i)缩减所述样本中的红血细胞；(ii)将所述样本中的剩余的血红细胞和其他类型的细胞根据它们的大小、粒度或密度与单核细胞分离开。
24.根据权利要求23所述的方法，其中所述剩余的红血细胞和其他类型的细胞通过密度离心法或荧光激活细胞分选(FACS)与单核细胞分离开。
25.根据权利要求20所述的方法，其中所述眼部血管疾病选自缺血性视网膜病变、糖尿病性视网膜病变、早产儿视网膜病变、新生血管性青光眼、中央视网膜静脉阻塞、黄斑变性和色素性视网膜炎。
26.根据权利要求20所述的方法，其中所述分离的单核细胞群在对受试者给药前在活体外激活。
27.根据权利要求26所述的方法，其中所述单核细胞群用LPS、MPLA或MCP-1激活。
28.分离基本上纯的单核细胞群的方法，包括(i)提供受试者的血液样本或骨髓样本；(ii)缩减所述样本中的红血细胞；以及(iii)将所述样本中的剩余的血红细胞和其他类型的细胞与单核细胞分离开，从而分离出包含基本上纯的单核细胞的细胞群。
29.根据权利要求28所述的方法，其中所述剩余的红血细胞和其他类型的细胞根据它们的大小、粒度或密度与单核细胞分离开。
30.根据权利要求28所述的方法，其中所述剩余的红血细胞和其他类型的细胞通过密度离心或荧光激活细胞分选(FACS)与单核细胞分离开。
31.根据权利要求28所述的方法，其中所述其他类型的细胞为血小板、粒细胞和粒细胞。
32.根据权利要求28所述的方法，其中所述红血细胞通过羟乙基淀粉差速离心或聚蔗糖密度梯度离心进行缩减。
33.根据权利要求28所述的方法，进一步包括检验用于表达表面标志CD14和CD33的所述分离的细胞群。
34.根据权利要求28所述的方法分离出的基本上纯的单核细胞细胞群。
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