MX2011008826A

MX2011008826A - Poblaciones de monocitos aisladas y aplicaciones terapeuticas relacionadas.

Info

Publication number: MX2011008826A
Application number: MX2011008826A
Authority: MX
Inventors: Martin Friedlander; Matthew R Ritter; Stacey K Moreno; Mohammad A El-Kalay
Original assignee: Scripps Research Inst
Priority date: 2009-02-20
Filing date: 2010-02-19
Publication date: 2011-11-02
Also published as: BRPI1008392A2; CN102317446A; KR20110123778A; CA2752679A1; WO2010096177A1; EP2398900A1; AU2010216374A1; EP2398900A4; ZA201105869B; EA201190109A1; JP2012518407A

Abstract

La invención proporciona métodos para usar poblaciones de monolitos aisladas para tratar a sujetos que sufren de varias enfermedades vasculares oculares o trastornos degenerativos oculares. La presente invención también proporciona métodos novedosos para aislar poblaciones de monolitos sustancialmente puras. Los métodos involucran extraer una muestra sanguínea o una muestra de médula ósea a partir de un sujeto, separar en bruto los glóbulos rojos de la muestra, y luego separar glóbulos rojos restantes y otros tipos de células en la muestra de los monolitos. En lugar de usar algún agente de selección o marcado, los glóbulos rojos y otros tipos de células se separan de los monolitos con base en su tamaño, granulosidad o densidad. Los monolitos aislados pueden además activarse in Vitro o ex vivo previo a administrarse a un sujeto. Poblaciones celulares aisladas conteniendo monolitos CD14+/CD33+ sustancialmente puros también son provistas en la invención.

Description

POBLACIONES DE MONOCITOS AISLADAS Y APLICACIONES TERAPÉUTICAS RELACIONADAS Declaración sobre Apoyo Gubernamental Esta invención fue realizada en parte con apoyo del gobierno de los Estados Unidos de América por conducto de los National Institutes of Health (Institutos Nacionales de Salud) , subvenciones Nos. EY11254, EY14174 y EY017540. El gobierno de los Estados Unidos de América en consecuencia tiene ciertos derechos en la invención.

Antecedentes de la Invención Enfermedades vasculares oculares tales como degeneración macular relacionada con la edad (ARMD) y retinopatía diabética (DR) son debidas a neo-vascularización coroidea o retinal anormales, respectivamente. Son las causas principales de pérdida visual en naciones industrializadas. Dado que la retina consiste de capas bien definidas de elementos neuronal, glial, y vascular, perturbaciones relativamente pequeñas tales como aquellas observadas en proliferación o edema vascular pueden llevar a pérdida significativa de la función visual. Degeneraciones retínales heredadas, tales como retinitis pigmentosa (RP) , también se asocian con anormalidades vasculares, tales como estrechamiento arteriolar y atrofia vascular. Afectan a tantos como 1 en 3,500 individuos y se caracterizan por ceguera nocturna progresiva, pérdida de campo visual, atrofia de nervio óptico, atenuación arteriolar, y pérdida central de visión frecuentemente progresando a ceguera completa. Aunque progreso significativo se ha hecho para identificar factores que promueven e inhiben angiogénesis, aun no hay tratamientos efectivos que hacen lento o invierten la progresión de estas enfermedades degenerativas retínales .

Hay una necesidad en la materia por mejores medios para tratar y prevenir varias enfermedades vasculares oculares. La presente invención se dirige a estas y otras necesidades.

Compendio de la Invención En un aspecto, la presente invención proporciona poblaciones celulares aisladas conteniendo monocitos sustancial -mente puros que expresan antígeno CD33 y antígeno CD14. Algunas de estas poblaciones celulares aisladas se aislan a partir de una muestra de sangre periférica mamífera, una muestra de sangre de cordón o una muestra de médula ósea. Algunas de las poblaciones celulares aisladas están comprendidas de células humanas o células murinas. En algunas de las poblaciones celulares aisladas, por lo menos 70%, 80% o 90% de las células expresan marcadores superficiales CD14 y CD33. Algunas de las poblaciones celulares aisladas no contienen células que expresan CD34. Algunas de las poblaciones celulares aisladas están sustancial -mente libres de células ALDHbr. Las poblaciones celulares aisladas pueden además activarse in vitro o ex vivo. Esto puede lograrse con cualquier compuesto activador de monocitos, v.gr.( LPS, MPLA, o MCP-1.

En otro aspecto, la invención proporciona métodos para tratar trastornos vasculares oculares. Los métodos involucran administrar a un sujeto que sufre de un trastorno vascular ocular una población de monocitos aislada en una cantidad que es suficiente para tratar o mejorar al trastorno vascular ocular. De preferencia, la población de monocitos es aislada a partir de una muestra de sangre o una muestra de médula ósea a partir del sujeto. En algunas formas de realización preferidas, el sujeto a ser tratado con los métodos es un humano. En algunos de los métodos, la población de monocitos comprende células CD14+/CD33+ sustancialmente puras. Por ejemplo, por lo menos 80% de las células en la población de monocitos aislada son CD14+/CD33+ . En algunos métodos, la población de monocitos aislada se activa in vitro o ex vivo previo a administrarse al sujeto. Cualquier compuesto conocido por ser capaz de activar monocitos puede usarse en estas formas de realización. Por ejemplo, las células de monocitos aisladas pueden ser activadas con LPS, MPLA, o MCP-1. En algunos métodos, una población de monocitos sin tratar (o una población de monocitos activada in vitro o ex vivo) es coadministrada a un sujeto junto con tal un compuesto activador de monocitos .

Muchos trastornos vasculares oculares pueden ser tratados con métodos de la invención. Ejemplos incluyen retinopa- tía isquémica, retinopatía diabética, retinopatía de prematurie-dad, glaucoma neo-vascular, oclusiones de vena retinal central, degeneración macular y retinitis pigmentosa. En algunos métodos, la población de monocitos aislada es administrada al sujeto mediante una ruta local, v.gr. , mediante inyección intra-vítrea . En algunos otros métodos, la población de monocitos se administra al sujeto mediante una ruta sistémica, v.gr., mediante inyección intravenosa .

En un aspecto relacionado, la invención proporciona otros métodos para tratar o mejorar una enfermedad ocular en un sujeto. Estos métodos involucran (i) aislar a partir de una muestra de sangre o una muestra de médula ósea de un sujeto teniendo una enfermedad vascular ocular una población de monocitos sustancialmente pura; y (ii) administrar la población de monocitos aislada a un sujeto en una cantidad suficiente para tratar o mejorar la enfermedad vascular ocular. Algunos de estos métodos adicionalmente involucran activar la población de monocitos aislada ex vivo previo a administrar las células al sujeto. Cualquier compuesto conocido por ser capaz de activar monocitos puede usarse en estas formas de realización. Por ejemplo, las células de monocitos aisladas pueden activarse con LPS, MPLA, o MCP-1. En algunas otras formas de realización, la población de monocitos aisladas, cono sin activación adicional ex vivo, es co-administrada al sujeto junto con un compuesto activador de monocitos.

Típicamente, la población de monocitos usada en estos métodos contiene células CD14+/CD33+ sustancialmente puras. De preferencia, por lo menos alrededor de 80% de las células en la población de monocitos aislada expresa marcadores superficiales CD33 y CD1 . En algunos métodos, la población de monocitos es aislada mediante (i) separar en bruto glóbulos rojos de la muestra; y (ii) separar glóbulos rojos restantes y otros tipos de células en la muestra de monocitos con base en su tamaño, granulosidad o densidad. En algunos de estos métodos, los glóbulos rojos restantes y otros tipos de células se separan de monocitos por centrifugación de densidad o clasificación celular activada por fluorescencia (FACS) . Enfermedades o trastornos oculares que son adecuados para tratamiento con estos métodos incluyen retinopatía isquémica, retinopatía diabética, retinopa-tía de prematuriedad, glaucoma neo-vascular, oclusiones de vena retinal central, degeneración macular y retinitis pigmentosa.

En otro aspecto, la invención proporciona métodos para aislar una población de monocitos sustancialmente pura. Los métodos involucran (i) proporcionar una muestra de sangre o una muestra de médula ósea a partir de un sujeto; (ii) separar en bruto glóbulos rojos a partir de la muestra; y (iii) separar glóbulos rojos restantes y otros tipos de células (plaquetas y granulocitos) en la muestra de monocitos. En algunos de los métodos, los glóbulos rojos restantes y otros tipos de células se separan de monocitos con base en su tamaño, granulosidad o densidad. En algunos de los métodos, los glóbulos rojos restantes y otros tipos de células se separan de los monocitos por centrifugación por densidad o clasificación celular activada por fluorescencia (FACS) . En estos métodos, los glóbulos rojos pueden ser separados en bruto por centrifugación diferencial HESPA o centrifugación de gradiente de densidades Ficoll. Estos métodos pueden incluir además un paso de ensayar la población celular aislada para expresión del marcador superficial CD14 y CD33.

Un entendimiento completo de la naturaleza y ventajas de la presente invención puede realizarse por referencia a las porciones restantes de la especificación y las reivindicaciones.

Breve Descripción de los Dibujos Las figuras 1A-1B muestran propiedades y actividades terapéuticas de poblaciones de monocitos aisladas. (A) Trazo de citometría de flujo mostrando población de monocitos (con compuerta) que son distintos de linfocitos. Ningún marcado se usó para discriminar estas poblaciones; y (B) datos obtenidos a partir del modelo de retinopatía inducida por oxígeno de ratón demostrando que monocitos de sangre periférica humana (HuPB) aislados en la manera descrita significativamente reducen tanto el área de cresta neo-vascular (barras negras) así como destrucción vascular (barras blancas) comparados con inyección de vehículo. Estos resultados fueron similares a células CD44hi derivadas de médula ósea de ratón usadas como un control positivo.

Las figuras 2A-2B muestran resultados a partir del análisis de citometría de flujo de fracciones generadas por centrifugación por densidad. Los datos muestran que la muestra está agotada de linfocitos CD2+/CD3+ (A) y enriquecida para monocitos CD14+/CD33+ (B) .

La figura 3 muestra resultados a partir de marcado ALDH de sangre periférica indicando población de ALDHbr/SSC despreciable.

La figura 4 muestra resultados a partir de análisis de citometría de flujo indicando la presencia de un número pequeño de células CD34+ (derecha superior) con relación a los monocitos CD14+ objetivo (izquierda superior) en la población celular aislada .

La figura 5 muestra análisis post-clasificación de monocitos o linfocitos de sangre periférica humana seleccionados en la base de propiedades de chisporroteo de luz como se describe anteriormente. La fracción de monocitos se muestra estando compuesta de -88% de células CD14+ mientras que la población de linfocitos virtualmente no contiene células CD14+. También mostrado es análisis de CDllb y CD33 mostrando alta expresión de ambos de estos marcadores mieloides en la fracción de monocitos y algunas células positivas en la fracción de linfocitos.

La figura 6 muestra resultados de un ensayo de quimotaxis in vi tro mostrando incremento dependiente de dosis en la migración de monocitos (Mono) en respuesta a MCP-1. Linfocitos (Lympho) fallaron en responder a MCP-1. Células de médula ósea CD44hi de ratón (CD44HÍ) , las cuales contienen monocitos, también responden a MCP-1.

La figura 7 muestra adhesión diferencial in vitro demostrando la habilidad de números en incremento de monocitos para adherirse a plástico de cultivo celular no tratado. Linfocitos fueron incapaces de adherirse en número significativo al mismo sustrato.

La figura 8 muestra imágenes a partir de montajes enteros retínales los cuales indican la presencia de células expresando GFP en la retina después de inyección intracardiaca 5 días antes. Lesión se creó en la retina a través de exposición a hiperoxia .

La figura 9 muestra análisis de arreglo de perlas citométrico (CBA) de citoquinas secretadas a partir de células F5 enriquecidas con monocitos tratadas con LPS (ActF5) . Los datos mostraron secreción incrementada de IL-lbeta, IL-6, IL-8 y TNF después de estimulación con LPS. Para cada citoquina, ED50 aproximada es dada como una referencia para cantidad y actividad biológica de proteína presente en medio. Unidades están en pg/ml .

La figura 10 muestra datos de arreglo de perlas citométrico demostrando secreción incrementada de citoquinas después de incubación con LPS, MPLA o MCP-1 de ratón por 1 o 4 h. Dos concentraciones de LPS y MPLA se muestran. Valores represen-tan la relación de las células tratadas (activadas) a células no tratadas (de control) .

La figura 11 muestra datos de arreglo de perlas citométrico después de estimulación por 4 y 19 h con LPS, MCP-1 de ratón, MCP-1 humana a diferentes concentraciones. El punto de tiempo de 19 h muestra que, además de LPS y MPLA, MCP-1 de ratón y humana también estimulan secreción de IL-8 e IL-6, aunque a niveles inferiores.

La figura 12 muestra que fracción 5 (F5) enriquecida con monocitos activada a partir de donadores tanto normales y diabéticos promueve reparación vascular en el modelo OIR de ratón mas efectivamente que F5 no activada u otras fracciones. Datos mostrados son el porcentaje de retinas dentro de un grupo de tratamiento con destrucción vascular por debajo de 10,000 mieras cuadradas .

Descripción Detallada de la Invención I . Compendio La presente invención se refiere a poblaciones aisladas y sustancialmente puras de células de monocitos las cuales son útiles para tratar o mejorar enfermedades vasculares oculares o trastornos degenerativos. Como se detalla en los ejemplos siguientes, las poblaciones de monocitos aisladas por los presentes inventores contienen monocitos CD14+/CD33+ sustancialmente puros. Las poblaciones de monocitos aisladas poseen la actividad de promover reparación vascular según se examina en modelos de enfermedad del ojo. Las poblaciones de monocitos también son distintas de otras poblaciones celulares hematopoyé-ticas para uso clínico, como es evidente por una falta de marcado AldeFluor Bright e independencia en células CD34+ por sus actividades terapéuticas. Además, algunas de las poblaciones celulares aisladas también se caracterizan por ser CD34- y/o conteniendo una cantidad muy baja de células con alto nivel de expresión de aldehido deshidrogenasa (células ALDHbr) . Mas aun, los inventores encontraron que algunas de las poblaciones de monocitos aisladas ante activación ex vivo tienen habilidad acrecentada para promover reparación de vasos sanguíneos.

Finalmente, se observó que monocitos aislados a partir de donadores con trastornos vasculares de retina pueden ser activados ex vivo y promover reparación vascular en un modelo de ratón de retinopatía isquémica, similar a células aisladas a partir de donadores normales. Estos descubrimientos proporcionan soporte adicional que poblaciones de monocitos terapéuticamente activas pueden emplearse para tratar trastornos vasculares de retina en una manera autóloga.

Los inventores también desarrollaron procedimientos novedosos para aislar poblaciones de monocitos para tratar enfermedades neo-vasculares del ojo tales como degeneración macular y retinopatía diabética. Utilizando muestras biológicas tales como médula ósea, sangre periférica o sangre de cordón, los métodos dependen de las propiedades físicas de la población celular objetivo y circunvienen la necesidad por agentes de selección tales como anticuerpos que específicamente reconocen antígenos superficiales de los monocitos. Debido a la falta de materiales heterólogos ligados a superficie tales como anticuerpos, las poblaciones celulares aisladas con estos métodos son mas deseables para usos terapéuticos. Una serie de ensayos in vitro se llevaron a cabo para demostrar la pureza y actividad de estas preparaciones de monocitos. Además, se encontró que poblaciones de monocitos aisladas usando métodos divulgados en la presente poseen la actividad terapéutica deseada en un modelo de retinopa-tía isquémica.

De acuerdo con estos descubrimientos, la presente invención proporciona poblaciones de monocitos aisladas o sustancialmente purificadas que son terapéuticamente efectivas. La invención también proporciona métodos novedosos para aislar tales poblaciones de monocitos. La invención además proporciona métodos para tratar o mejorar enfermedades o trastornos relacionados con o mediados por vascularización ocular aberrante. Adicionalmente , métodos son provistos para producir células de monocitos altamente activas por activación in vitro o ex vivo con compuestos capaces de activar monocitos (v.gr., compuestos agonistas de CD14 o TLR4) , así como métodos para identificar compuestos novedosos que pueden activar células de monocitos en una manera similar. La invención también abarca métodos terapéuticos usando una combinación de poblaciones de monocitos aisladas y un compuesto capaz de activar y reclutar las células (v.gr. , MCP-1) . En estos métodos, las células pueden ser activadas ante administración al sujeto, y un efecto sostenido puede ser mediado por células reclutadas adicionales.

Las células altamente activadas y los compuestos activadores novedosos son útiles en el tratamiento de varias enfermedades del ojo. Ejemplos de tales enfermedades incluyen retinopatía diabética, edema macular diabético, oclusiones de vena retinal, retinopatía de prematuriedad, degeneración macular relacionada con la edad, proliferación angiomatosa retinal, telangectasia macular, retinopatía isquémica, neo-vascularización del iris, neo-vascularización intra-ocular , neo-vascularización córnea, neo-vascularización retinal, neo-vascularización coroidea, y degeneración retinal. Sujetos adecuados para tratamiento con métodos de la invención incluyen unos que tienen o están en riesgo de desarrollar cualquiera de estas enfermedades. Las siguientes secciones proporcionan guía mas detallada para practicar los métodos de la invención.

II . Definiciones A menos que se defina de otra manera, todos los términos técnicos y científicos usados en la presente tienen el mismo significado como se entiende comúnmente por los técnicos en la materia a la cual pertenece la invención. Las siguientes referencias proporcionan a los técnicos en la materia con una definición general de muchos de los términos usados en esta invención: Academic Press Dictionary of Science and Technology, Morris (Ed.), Academic Press (la. ed. , 1992); Illustrated Dictionary of Immunology, Cruse (Ed.), CRC Pr I Llc (2a. ed. , 2002) ; Oxford Dictionary of Biochemistry and Molecular Biology, Smith et al. (Eds.), Oxford University Press (ed. revisada, 2000); Encyclopaedic Dictionary of Chemistry, Kumar (Ed.), Anmol Publications Pvt . Ltd. (2002); Dictionary of Microbiology and Molecular Biology, Singleton et al. (Eds.), John Wiley & Sons (3a. ed. , 2002); Dictionary of Chemistry, Hunt (Ed.), Routledge (la. ed. , 1999); Dictionary of Pharmaceutical Medicine, Nahler (Ed.), Springer-Verlag Telos (1994); Dictionary of Organic Chemistry, Kumar y Anandand (Eds.), Anmol Publications Pvt. Ltd. (2002) ; y A Dictionary of Biology (Oxford Paperback Reference) , Martin y Hiñe (Eds.), Oxford University Press (4a. ed., 2000) . Además, las siguientes definiciones son provistas para ayudar al lector en la práctica de la invención.

A menos que se defina de otra manera, todos los términos técnicos y científicos usados en la presente tienen el mismo significado como se entiende comúnmente por los técnicos en la materia a la cual pertenece la invención. Aunque cualquier método y material similar o equivalente a aquellos descritos en la presente pueden usarse en la práctica para pruebas de la presente invención, los materiales y métodos preferidos se describen en la presente. Al describir y reivindicar la presente invención, la siguiente terminología será usada.

Células madre hematopoyéticas son células que son capaces de desarrollar hacia varios tipos de células sanguíneas, v.gr., células B, células T, granulocitos, plaquetas, y eritrocitos. Los antígenos superficiales de linaje (marcadores superficiales) son un grupo de proteínas de superficie celular que son marcadores de linajes celulares sanguíneos maduros, incluyendo CD2 , CD3, CD11, CDlla, Mac-1 (CDllb : CD18 ) , CD14, CD16, CD19, CD24, CD33, CD36, CD38, CD45, CD45RA, Ly-6G murino, TER-119 murino, CD56, CD64, CD68, CD86 (B7.2), CD66b, antígeno de leucocito humano DR (HLA-DR) , y CD235a (Glicoforina A) . Células madres hematopoyéticas que no expresan niveles significativos de estos antígenos son comúnmente referidas como un linaje negativo (Lin.) . Células madre hematopoyéticas humanas comúnmente expresan otros antígenos superficiales tales como CD31, CD34, CD117 (c-kit) y/o CD133. Células madre hematopoyéticas murinas comúnmente expresan otros antígenos superficiales tales como CD34, CD117 (c-kit) , Thy-1, y/o Sca-1.

Las células que circulan en el torrente sanguíneo son generalmente divididas en tres tipos: glóbulos blancos (leucocitos) , glóbulos rojos (eritrocitos), y plaquetas o trombocitos. Leucocitos incluyen granulocitos (leucocitos polimorfonucleares) y agranulocitos (leucocitos mononucleares) . Granulocitos son leucocitos caracterizados por la presencia de gránulos manchados de manera diferente en su citoplasma cuando se observan bajo luz de microscopio. Hay tres tipos de granulocitos: neutrófilos, basófilos, y eosinófilos. Agranulocitos (leucocitos mononuclea- res) son leucocitos caracterizados por la ausencia aparente de gránulos en su citoplasma. Aunque el nombre implica una carencia de gránulos, estas células si contienen gránulos azurófilos no específicos, los cuales son lisosomas. Agranulocitos incluyen linfocitos, monocitos, y macrofagos.

Monocitos son producidos por la médula ósea a partir de precursores de células madre hematopoyéticos llamados monoblas-tos. Los monocitos circulan en el torrente sanguíneo por alrededor de uno a tres días y luego típicamente se mueven hacia tejidos a través del cuerpo. Constituyen entre tres a ocho porciento de los leucocitos en la sangre. En los tejidos monocitos maduran hacia tipos diferentes de macrofagos en diferentes ubicaciones anatómicas. Los monocitos tienen dos funciones principales en el sistema inmunológico : (1) re-abastecer a macrofagos residentes y células dendríticas bajo estados normales, y (2) en respuesta a señales de inflamación, los monocitos pueden moverse rápidamente (aproximadamente 8-12 horas) a sitios de infección en los tejidos y dividír/diferenciar en macrofagos y células dendríticas para producir una respuesta inmunológica . Los monocitos son usualmente identificados en embarraduras manchadas por sus núcleos bilobatos grandes.

Neo-vascularización ocular o trastorno vascular ocular es una condición patológica caracterizada por proliferación e invasión alteradas o no reguladas de nuevos vasos sanguíneos en las estructuras de tejidos oculares tales como la retina o la córnea. Ejemplos de enfermedades neo-vasculares oculares incluyen retinopatía isquémica, neo-vascularización del iris, neo-vascularización intra-ocular, degeneración macular relacionada con la edad, neo-vascularización córnea, neo-vascularización retinal, neo-vascularización coroidea, isquemia retinal diabética, degeneración retinal y retinopatía diabética.

Otras enfermedades asociadas con neo-vascularización córnea incluyen, pero no se limitan a, queratoconjuntivitis epidémica, deficiencia de vitamina A, sobreuso de lentes de contacto, queratitis atópica, queratitis límbica superior, pterygium keratitis sicca, sjogrens, acné rosácea, filectenulo-sis, sífilis, infecciones de Mycobacteria, degeneración de lípidos, quemaduras químicas, úlceras bacterianas, úlceras fúngales, infecciones de Herpes simplex, infecciones de Herpes zoster, infecciones de protozoarios , sarcoma de Kaposi, úlcera de Mooren, degeneración marginal de Terrien, queratolisis marginal, artritis reumatoide, lupus sistémico, poliarteritis , trauma, sarcoidosis de egener, escleritis, enfermedad de Steven Johnson, quetatotomia radial perifigoide, y rechazo de injerto córneo.

Enfermedades asociadas con neo-vascularización retinal/coroidea incluyen, pero no se limitan a, retinopatía diabética, degeneración macular, anemia de células falciformes, sarcoide, sífilis, pseudoxantoma elástica, enfermedad de Paget, oclusión de venas, oclusión de arterias, enfermedad obstructiva de la carótida, uveitis/vitritis crónica, infecciones micobacte- rianas, enfermedad de Lyme, lupus sistémico eritematoso, retinopatía de prematuriedad, retinitis pigmentosa, edema de retina (incluyendo edema macular) , enfermedad de Eales, enfermedad de Bechet, infecciones ocasionando una retinitis o coroidi-tis, histoplasmosis ocular presumida, enfermedad de Best, miopía, fosos ópticos, enfermedad de Stargart, planitis pars, separación retinal crónica, síndromes de hiperviscosidad, toxoplasmosis , trauma, y complicaciones post-láser. Otras enfermedades incluyen, pero no se limitan a, enfermedades asociadas con rubeosis (neo-vascularización del ángulo) y enfermedades ocasionadas por la proliferación anormal de tejido fibrovascular o fibroso incluyendo todas las formas de vitreo-retinopatía proliferativa .

Retinopatía de prematuriedad (ROP) es una enfermedad del ojo que afecta a bebés nacidos de manera prematura. Se cree que se ocasiona por crecimiento desorganizado de los vasos sanguíneos retínales los cuales pueden resultar en cicatrización y separación retinal. ROP puede ser suave y puede resolverse de manera espontánea, pero puede llevar a ceguera en casos serios. Como tal, todos los bebés prematuros están en riesgo de ROP, y peso al nacer muy bajo es un factor de riesgo adicional. Tanto toxicidad a oxígeno e hipoxia relativa pueden contribuir al desarrollo de ROP.

Degeneración macular es una condición médica encontrada de manera predominante en adultos mayores en la cual el centro del revestimiento interno del ojo, conocido como el área de mácula de la retina, sufre de adelgazamiento, atrofia, y en algunos casos, sangrado. Esto puede resultar en pérdida de la visión central, lo cual involucra incapacidad para ver detalles finos, para leer, o para reconocer caras. De acuerdo con la Academia Americana de Oftalmología (American Academy of Ophthal -mology) , es la causa principal de pérdida de la visión central (ceguera) en los Estados Unidos hoy en día para aquellos de edad superior a cincuenta años. Aunque algunas distrofias maculares que afectan a individuos mas jóvenes son en ocasiones referidas como degeneración macular, el término generalmente se refiere a degeneración macular relacionada con la edad (AMD o A MD) .

Degeneración macular relacionada con la edad comienza con depósitos amarillos característicos en la mácula (área central de la retina la cual proporciona visión central detallada, llamada fovea) llamados drusas entre el epitelio de pigmento retinal y la coroides subyacente. La mayoría de las personas con estos cambios tempranos (referidos como maculopatía relacionada con la edad) tienen buena visión. Gente con drusas puede pasar a desarrollar AMD avanzada. El riesgo es considerablemente mas alto cuando las drusas son grandes y numerosas y asociadas con una perturbación en la capa celular pigmentada bajo la mácula. Drusas grandes y suaves se relacionan con depósitos de colesterol elevado y pueden responder a agentes reductores de colesterol o el procedimiento Rheo.

AMD avanzada, la cual es responsable por pérdida de visión profunda, tiene dos formas: seca y húmeda. Atrofia geográfica central, la forma seca de AMD avanzada, resulta de atrofia a la capa epitelial de pigmento retinal por debajo de la retina, la cual ocasiona pérdida de visión a través de la pérdida de foto-receptores (vástagos y conos) en la parte central del ojo. Aunque ningún tratamiento está disponible para esta condición, suplementos de vitaminas con altas dosis de antioxidantes, luteína y zeaxantina, han sido demostrados por el Instituto Nacional del Ojo (National Eye Institute) y otros para hacer mas lenta la progresión de degeneración macular seca y en algunos pacientes, mejorar la agudeza visual.

Retinitis pigmentosa (RP) es un grupo de condiciones genéticas del ojo. En la progresión de síntomas para RP, ceguera nocturna generalmente procede a visión de túnel por años o aun décadas. Mucha gente con RP no se vuelve legalmente ciega hasta sus 40s o 50s y retiene alguna visión toda su vida. Otros pasan a completamente ciegos a partir de RP, en algunos casos tan pronto como la niñez. Progresión de RP es diferente en cada caso. RP es un tipo de distrofia retinal hereditaria, un grupo de trastornos heredados en los cuales anormalidades de los foto-receptores (vástagos y conos) o el epitelio de pigmento retinal (RPE) de la retina llevan a pérdida visual progresiva. Individuos afectados experimentan primero adaptación defectuosa a la obscuridad o nictalopia (ceguera nocturna) , seguido por reducción del campo visual periférico (conocido como visión de túnel) y, en ocasiones, pérdida de la visión central tardía en el curso de la enfermedad.

Edema macular ocurre cuando depósitos de fluido y proteína se colectan en o bajo la mácula del ojo, un área central amarilla de la retina, ocasionando que se espese y se hinche. La hinchazón puede distorsionar la visión central de una persona, pues la mácula está cerca del centro de la retina en la parte trasera del ojo. Esta área mantiene conos empacados de manera apretada que proporcionan visión central clara, aguda, para permitir a una persona ver forma, color, y detalle que están directamente en la línea de visión. Edema macular cistoideo es un tipo de edema macular que incluye formación de quistes.

Los términos "sujeto" y "paciente" se usan de manera intercambiable y se refieren a mamíferos tales como pacientes humanos y primates no humanos, así como animales experimentales tales como conejos, ratas, y ratones, y otros animales. Animales incluyen todos los vertebrados, v.gr., mamíferos y no mamíferos, tales como perros, gatos, ovejas, vacas, cerdos, conejos, pollos, y etc. Sujetos preferidos para practicar los métodos terapéuticos de la presente invención son humanos. Sujetos en necesidad de tratamiento incluyen pacientes ya sufriendo de una enfermedad o trastorno vascular ocular así como aquellos susceptibles a desarrollar el trastorno.

El término "sustancialmente puro" o "pureza sustancial" cuando se refiere a una población celular aislada significa el porcentaje de una cela dada (célula objetivo) en la población es significativamente mayor que se encuentra en el ambiente natural (v.gr. , en un tejido o un torrente sanguíneo de un sujeto) . Típicamente, el porcentaje de la célula objetivo (v.gr., monocito) en una población celular sustancialmente pura es por lo menos alrededor de 50%, de preferencia por lo menos alrededor de 60%, 70%, 75%, y mas preferentemente por lo menos alrededor de 80%, 85%, 90%, o 95% de las células totales en la población celular .

Como se usa en la presente, "tratar" o "mejorar" incluye (i) prevenir que una condición patológica (v.gr., degeneración macular) ocurra (v.gr., profilaxis); (ii) inhibirla condición patológica (v.gr., degeneración macular) o arrestar su desarrollo; y (iii) aliviar síntomas asociados con la condición patológica (v.gr., degeneración macular) . Por ende, "tratamiento" incluye la administración de una población celular aislada de la invención y/u otras composiciones terapéuticas o agentes para prevenir o retrasar el establecimiento de síntomas, complicaciones, o indicadores bioquímicos de una enfermedad ocular descrita en la presente, aliviar o mejorar los síntomas o arrestar o inhibir desarrollo adicional de la enfermedad, condición, o trastorno. "Tratamiento" se refiere además a cualquier indicador de éxito en el tratamiento o mejora o prevención de la enfermedad, condición, o trastorno ocular descritos en la presente, incluyendo cualquier parámetro objetivo o subjetivo tal como abatimiento; remisión; disminución de síntomas o hacer la condición de enfermedad mas tolerable al paciente; desacelerar la tasa de degeneración o declive; o hacer el punto final de degeneración menos debilitante. Procedimientos detallados para el tratamiento o mejora de un trastorno ocular o síntomas del mismo puede basarse en parámetros objetivos o subjetivos, incluyendo los resultados de una examinación por un médico.

III . Métodos para aislar población de células de monocitos La invención proporciona métodos para aislar una población de monocitos que es útil para tratar varios trastornos vasculares oculares como se describe en la presente. Como se ejemplifica en los ejemplos siguientes, las poblaciones de monocitos pueden aislarse a partir de muestras biológicas adecuadas obtenidas a partir de un sujeto mamífero, v.gr., sangre periférica o médula ósea. Los métodos de la presente invención permiten el aislamiento de poblaciones de monocitos sustancial -mente puras (v.gr., con por lo menos 50%, 75%, u85% de pureza) a partir de una muestra de médula ósea o sangre. La muestra de sangre puede ser cualquier muestra que contiene el grueso de glóbulos blancos o leucocitos mono-nucleares a partir de sangre entera. Por ejemplo, si puede ser sangre entera o producto de leucaféresis a partir de sangre entera. Leucaféresis es un procedimiento de laboratorio en el cual glóbulos blancos se separan a partir de una muestra de sangre. De preferencia, los monocitos presentes en las poblaciones celulares aisladas con CD14+/CD33+. CD33 es un receptor de trans-membrana expresado en células de linaje monocítico/mieloide . CD14 es una proteína enlazada a glicosilfosfatidilinositol asociada con membrana expresada en la superficie de células, especialmente macrófagos. Médula ósea, sangre periférica, y sangre de cordón umbilical cada una incluyen una sub-población de monocitos que expresan al antígeno CD14 y CD33. Por ende, estas muestras biológicas son preferidas para aislar poblaciones de monocitos enriquecidas para células CD14+ y CD33+ de acuerdo con los métodos divulgados en la presente. En algunas formas de realización, las poblaciones celulares aisladas también se caracterizan por ser CD34- y/o expresando niveles nulos o bajos de aldehido deshidrogenasa (ALDH) . De preferencia, las poblaciones de monocitos son aisladas a partir de médula ósea humana, sangre periférica humana, sangre de cordón umbilical humana u otras muestras de sangre relacionadas .

Típicamente, los métodos involucran primero remoción de la mayoría de glóbulos rojos (RBCs) a partir de la muestra ("separar en bruto") . Este paso se acompaña por separación de otras células sanguíneas (v.gr., plaquetas, granulocitos y linfocitos) y glóbulos rojos restantes, si hubiera, a partir de monocitos. A diferencia de métodos conocidos en la materia, ningún agente de marcado (v.gr., anticuerpos) que reconocen marcadores de superficie celular de los diferentes tipos celulares se usan en los métodos de la presente invención. En su lugar, la presente invención separa monocitos de otros tipos de células sanguíneas, especialmente otras células mononucleares (v.gr., linfocitos) con base solamente en propiedades físicas tales como tamaño, granulosidad y densidad. En algunas formas de realización, poblaciones de monocitos de la presente invención son aisladas a partir de una muestra adecuada tal como médula ósea o sangre periférica mediante un método con base en clasificación celular activada por fluorescencia (FACS) . Como se detalla en los ejemplos siguientes, RBCs presentes en una muestra biológica (v.gr., sangre periférica) a partir de un sujeto mamífero se remueven primero en los procedimientos de aislamiento. Esto puede lograrse mediante lisar RBCs con procedimientos estándar bien conocidos en la materia, v.gr. , método de lisado a base de cloruro de amonio. Ver, v.gr., Tirikainen, Cytometry 20:341-8, 1995; y Simón et al., Immunol . Commun. 12:301-14, 1983. Alternativamente, RBCs pueden sedimentarse y células mononucleares separarse por centrifugación en Ficoll. Procedimientos para separar glóbulos rojos mediante centrifugación por gradiente de densidades Ficoll se describen en la materia, v.gr. , Tripodi et al., Transplantation, 11:487-8, 1971; Vissers et al . , J. Immunol. Methods 110:203-7, 1988; y Boyum et al., Scand. J. Immunol. 34:697-712, 1991. Otro método adecuados para separar en bruto RBCs es mediante centrifugación diferencial usando la habilidad de HESpan (Dupon, Dreieich, Alemania) para inducir aglutinación de glóbulos rojos. Ver, v.gr., Nagler et al., Exp. Hematol . 22:1134-40, 1994; y Pick et al., Br . J. Haematol . 103:639-50, 1998. Técnicas adicionales que pueden usarse para separar en bruto RBCs incluyen el uso de filtros de células sanguíneas. Tales filtros de células sanguíneas están fácilmente disponibles a partir de proveedores comerciales, v.gr. , el filtro agotador de leucocitos fabricado por Pall Biomedical Products Company (East Hills, Nueva York) .

Después de remoción de RBCs, células restantes en la muestra son suspendidas en un regulador apropiado que es adecuado para el paso de aislamiento subsecuente con FACS . Por ejemplo, las células pueden re-suspenderse en DPBS/BSA al 0.5%/EDTA 2 mM. Citometría de flujo es una técnica para contar, examinar, y clasificar partículas microscópicas suspendidas en una corriente de fluido. Permite análisis multi-paramétrico simultáneo de las características físicas y/o químicas de células solas fluyendo a través de un aparato de detección óptica y/o electrónica. Típicamente, un haz de luz (usualmente luz de láser) de una sola longitud de onda se dirige sobre una corriente de fluido enfocada hidro-dinámicamente . Un número de detectores se apuntan en el punto donde la corriente pasa a través del haz de luz; uno en línea con el haz de luz (Diseminador Hacia Adelante o FSC) y varios perpendiculares al mismo (Diseminador Lateral (SSC) y uno o mas detectores fluorescentes) . Cada partícula suspendida pasando a través del haz disemina la luz en alguna manera , y químicos fluorescentes encontrados en la partícula o unidos a la partícula pueden excitarse hacia emitir luz a una frecuencia mas baja que la fuente de luz. Esta combinación de luz diseminada y fluorescente se toma por los detectores, y mediante analizar fluctuaciones en el brillo en cada detector (uno para cada pico de emisión fluorescente) es entonces posible derivar varios tipos de información acerca de la estructura física y química de cada partícula individual. FSC se correlaciona con el volumen celular y SSC depende de la complejidad interna de la partícula (es decir, figura del núcleo, la cantidad y el tipo de granulos citoplásmicos o la aspereza de membrana) . Algunos citómetros de flujo en el mercado han eliminado la necesidad por fluorescencia y usan solamente diseminación de luz para medición. Otros citómetros de flujo forman imágenes de fluorescencia de cada célula, luz diseminada, y luz transmitida.

Citómetros de flujo modernos son capaces de analizar mil partículas cada segundo en tiempo real, y pueden de manera activa separar y aislar partículas teniendo propiedades específicas. Un cítómetro de flujo es similar a un microscopio, excepto que en lugar de producir una imagen de la célula, citometría de flujo tiene 5 componentes principales: una corriente de flujo de célula-líquido, una fuente de luz (v.gr., láser), un detector y un sistema de Conversión de Analógico a Digital (ADC) el cual genera FSC y SSC así como señales de fluorescencia, un sistema de amplificación, y un computador para análisis de las señales. Los datos generados por citómetros de flujo pueden trazarse en una sola dimensión, para producir un histograma, o en trazos de puntos de dos dimensiones o aun en tres dimensiones. Las regiones en estos trazos pueden separarse secuencialmente , con base en intensidad de fluorescencia, mediante crear una serie de extracciones de sub-conjunto, denominadas "compuertas" . Protocolos de formación de compuertas específicos existen para propósitos de diagnóstico y clínicos especialmente con relación a hematología. Los trazos son frecuentemente hechos en escalas logarítmicas. Debido a que espectros de emisión de colorantes fluorescentes diferentes se traslapan, señales en los detectores tienen que compensarse electrónicamente así como computacional-mente .

Clasificación celular activada por fluorescencia (FACS) es un tipo especializado de citometría de flujo. Proporciona un método para clasificar una mezcla heterogénea de células biológicas en dos o mas recipientes, una célula a la vez, con base en la diseminación de luz específica y características fluorescentes de cada célula. Es un instrumento científico útil pues proporciona registro rápido, objetivo y cuantitativo de señales fluorescentes a partir de células individuales así como separación física de células de interés particular. La suspensión celular se atrapa en el centro de una corriente de líquido que fluye rápidamente, estrecha. El flujo se arregla tal que haya una gran separación entre células con relación a su diámetro. Un mecanismo vibrador ocasiona que la corriente de células se descomponga en gotas individuales. El sistema se ajusta tal que ahora haya una baja probabilidad de que mas de una célula esté en una gota. Justo antes de que la corriente se descomponga en gotas el flujo pasa a través de una estación medidora de fluorescencia donde el carácter fluorescente de interés de cada célula se mide.

Un anillo de carga eléctrica se coloca justo en el punto donde la corriente se descompone en gotas . Una carga se coloca en el anillo con base en la medición de intensidad de fluorescencia inmediatamente previa y la carga opuesta se atrapa en la gota conforme se descompone de la corriente. Las gotas cargadas entonces caen a través de un sistema de deflexión electrostático que desvía gotas hacia recipientes con base en su carga. En algunos sistemas la carga se aplica directamente a la corriente y la gota descomponiéndose retiene carga del mismo signo como la corriente. La corriente entonces se regresa a neutro después de que la gota se descompone.

Como un ejemplo de la presente invención, FACS puede llevarse a cabo en un Sistema de Clasificación Celular BD FACSAria (BD Biosciences, San José, CA) usando una serie de compuertas. Ningún anticuerpo u otro agente de selección se usa en la clasificación. Células muertas y desechos pueden primero pasarse por compuertas fuera mediante tomar una región que incluye solamente glóbulos blancos viables. Por lo tanto, dobletes o células aglomeradas pueden removerse con compuertas secundaria y terciaria que interrogan anchura de diseminación hacia adelante (FSC- ) contra área de diseminación hacia adelante (FSC-A) y anchura de diseminación lateral (SSC- ) contra área de diseminación lateral (SSC-A) , respectivamente. Los procedimientos pueden llevarse a cabo de acuerdo con protocolos estándar bien conocidos en la materia, v.gr., Flow cytometry - A practical approach, Ormerod (ed.), Oxford University Press, Oxford, Reino Unido (3ra. edición, 2000); y Handbook of Flow Cytometry Methods, Robinson et al. (editores), Wiley-Liss, Nueva York (1993).

En algunas otras formas de realización, poblaciones de monocitos de la invención son aisladas usando un esquema de separación con base en el Sistema de Separación Celular Elutra (Gambro BCT Inc., Lakewood, Colorado) . Elutra es un instrumento a base de centrífuga, semi-automático, usando tecnología de elutriación de contra- flujo continuo para separar células en múltiples fracciones con base en tamaño y densidad. Previo a separación con Elutra, la muestra biológica obtenida a partir de un sujeto mamífero (v.gr., muestra de sangre periférica a partir de un paciente humano) puede primero tratarse para remover el grueso de RBCs, v.gr., por sedimentación con HESPAN. La fracción de células nucleadas puede entonces colectarse, v.gr., con un expresor de plasma, antes de procesarse con el dispositivo Elutra. Como se detalla en los ejemplos siguientes, fraccionamiento por el dispositivo Elutra permite separación de monocitos de plaquetas, RBCs restantes, linfocitos y granulocitos . Las células fraccionadas pueden analizarse adicionalmente para conteo celular, viabilidad y pureza.

En algunas formas de realización, la invención proporciona métodos para producir células altamente activas para aplicaciones terapéuticas. En estas formas de realización, poblaciones de monocitos aisladas de acuerdo con la presente divulgación se activan adicionalmente in vi tro o ex vivo previo a ser administradas a un sujeto con trastornos vasculares oculares. Típicamente, las células son tratadas con un compuesto que es capaz de activar monocitos. Procedimientos detallados para activar poblaciones de monocitos aisladas se describen mas adelante .

IV. Propiedades y actividades de poblaciones de monocitos aisladas Poblaciones de monocitos aisladas a partir de muestras biológicas tales como sangre entera o médula ósea pueden examinarse por sus propiedades inmunológicas o biológicas, así como sus actividades terapéuticas. Como se detalla en los ejemplos, pureza y actividades de las poblaciones de monocitos aisladas pueden evaluarse con un número de ensayos. Por ejemplo, para analizar expresiones de marcadores superficiales, algunos métodos de la invención pueden involucrar adicionalmente un paso de evaluar expresión de CD14 y CD33 por las poblaciones de monocitos aisladas. Expresiones de marcadores superficiales de las células aisladas pueden examinarse con anticuerpos monoclona-les anti-CD14 y anti-CD33 en conjunto con citometría de flujo.

Como se ejemplifica en los ejemplos mas adelante, poblaciones celulares aisladas con los métodos de la presente invención contienen monocitos CD14+/CD33+ sustancialmente purificados. Por ejemplo, las poblaciones celulares aisladas pueden tener por lo menos 50%, 60%, 75%, 80%, 85%, 90% o 95% de células expresando CD14 o CD33.

Además de su pureza sustancial, las poblaciones de células aisladas son funcionalmente efectivas para tratar o mejorar síntomas asociados con trastornos vasculares oculares. Por ejemplo, como se divulga en la presente, las poblaciones de células aisladas pueden promover reparación vascular en retinopa-tía inducida por oxígeno en ratones. Modelo de ratón de retinopa-tía isquémica y su uso para evaluar actividades terapéuticas de poblaciones celulares aisladas para trastornos de vascularización ocular se describen en la materia. Ver, v.gr., Ritter et al., J. Clin. Invest . 116:3266-76, 2006; y Ritter et al., Invest . Ophthalmol. Vis. Sci . 46:3021-6, 2005.

Función y actividad bioquímica de las células aisladas puede también analizarse mediante medir quimotaxis de las células, v.gr., usando una proteína quimotáctica de monocito tal como MCP-1. Resultados a partir de tal un ensayo de actividad proporcionan una lectura de la pureza relativa de la preparación y una indicación de la viabilidad y función de las células aisladas. Métodos adicionales para examinar pureza y viabilidad de los monocitos aislados incluyen un ensayo que se basa en adhesión diferencial a los substratos del cultivo celular por monocitos con relación a otras células mononucleares . Como se demuestra en los ejemplos, se encontró que células generadas por los métodos de aislamiento de la invención son principalmente monocitos según es evidenciado por su habilidad para adherirse bajo las condiciones de ensayo descritas.

Algunas de las poblaciones de monocitos de la invención también son CD34". Las poblaciones de monocitos CD34~ de la invención se definen como poblaciones de monocitos que, además de ser CD14+ y CD33+, contienen niveles nulos o muy bajos (v.gr., menores que alrededor de 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 0.5%, 0.25%, 0.1%, 0.05%, o 0.01%) de células CD34+. La presencia de células CD34+ en una población celular puede determinarse y cuantificarse fácilmente usando métodos bien conocidos en la materia o divulgados en la presente. Las poblaciones de monocitos CD34" de la invención son mas adecuadas para uso en algunas aplicaciones terapéuticas de la presente invención. Células madre CD34+ se conocen por tener el potencia de diferenciarse hacia tipos de células no deseados y pueden tener capacidad proliferativa . Tales propiedades de células CD34+ pueden ser no deseables en la práctica de los métodos terapéuticos actualmente divulgados. Se encontró que inyección de poblaciones de células madre no diferenciadas, tales como células madre CD34+, hacia el ojo de ratón resultó en un resultado pobre (ejemplo 3) . Por ende, además de ser CD14+/CD33+ , algunas de las poblaciones de monocitos de la presente invención también se caracterizan por una falta de células CD34+ o una cantidad muy baja de células CD34+. Como se ejemplifica en los ejemplos siguientes, una cantidad pequeña de células CD34+ que pueden estar presentes en las preparaciones de células iniciales pueden además agotarse a partir de las poblaciones de monocitos aisladas finales. De manera importante, como se divulga en la presente, remoción de las células CD34+ no resulta en cualquier cambio de las actividades terapéuticas de las poblaciones de monocitos.

En algunas otras formas de realización, las poblaciones de monocitos de la invención también se caracterizan por no contener, o estar sustancialmente libres de, células con alta expresión de aldehido deshidrogenasa (células ALDHbr) . Células ALDHbr son bien conocidas en la materia. Tienen actividad celular progenitora y se ha sugerido que sean útiles en aplicaciones de terapia celular (Gentry et al., Cytother. 9:259-274, 2007). Presencia de células ALDHbr en una población celular puede típicamente clasificarse y cuantificarse por clasificación celular activada por fluorescencia (FACS) como se describe en los ejemplos presentes y también en la materia, v.gr. , Russo et al., Biochem. Pharmacol . 37:1639-1642, 1988; y Storms et al., Blood 106:95-102, 2005. Como se muestra en la figura 3, algunas de las poblaciones de monocitos aisladas de la invención contienen cantidad despreciable (alrededor de 0.04%) de células ALDHb . Por ende, algunas formas de realización preferidas de la invención proporcionan poblaciones de monocitos aisladas o purificadas que están sustancialmente libres de células ALDHbr. Según se mide por clasificación celular activada por fluorescencia, estas poblaciones celulares de monocitos deben contener menos de alrededor de 5%, 2%, o 1% de células ALDHr. Mas preferentemente, el porcentaje de células ALDHbr en estas poblaciones celulares debe ser menor que 0.5%, menor que 0.1%, o menor que 0.05%. Mediante ser bajas en tanto CD34" y/o ALDH, estas poblaciones de monocitos CD14+/CD33+ de la invención se distinguen además de otras poblaciones de células sanguíneas o células madre que se han reportado en la materia (ver, v.gr., Storms et al., Blood 106:95-102 , 2005) .

Células a partir de las poblaciones de monocitos de la presente invención también pueden diseñarse para expresar un agente terapéuticamente útil, tal como agentes anti-angiogénicos para uso en terapia genética a base de células o agentes neurotróficos para acrecentar efectos de rescate neuronal . En estas formas de realización, las poblaciones celulares de monocitos aisladas se transfectan con un gen que codifica al agente terapéuticamente útil. Genes adecuados y métodos para transfección hacia células de las poblaciones de monocitos de la presente invención se describen en, v.gr. , la solicitud de patente US 10/080,839. En algunas de estas formas de realización, las células se transfectan con un polinucleótido que codifica operativamente un péptido inhibidor de angiogénesis , v.gr., TrpRS o fragmentos anti-angiogénicos (es decir, angiostáticos) del mismo (ver, v.gr., la solicitud de patente US 11/884,958). Las células inhibidoras de angiogénesis diseñadas a partir de la población celular de monocitos son útiles para modular crecimiento anormal de vasos sanguíneos en enfermedades asociadas con desarrollo vascular anormal, tales como ARMD, retinopatía diabética, y ciertas degeneraciones retínales y enfermedades similares. En algunas otras formas de realización, células de la población celular de monocitos aislada de la presente invención se transfectan para expresar un gen que codifica a un agente neurotrofico. El agente neurotrofico expresado por el gen transfectado puede ser, v.gr., factor de crecimiento de nervios, neurotrofina-3 , neurotrofina- , neurotrofina-5 , factor neurotrofico ciliar, factor neurotrofico derivado de epitelio pigmentado retinal, factor de crecimiento similar a insulina, factor neurotrofico derivado de línea celular glial, factor neurotrofico derivado del cerebro, y similares. Las células de monocitos transfectadas con tal un gen son útiles para promover rescate neuronal en enfermedades oculares involucrando degeneración neural retinal, tales como glaucoma, retinitis pigmentosa, lesiones a los nervios retínales, y similares. Ver, v.gr., Kirby et al., Mol. Ther. 3:241-8, 2001; Farrar et al., EMBO J. 21:857-864, 2002; Fournier et al., J. Neurosci . Res. 47:561-572, 1997; y McGee et al., Mol. Ther. 4:622-9, 2001.

V. Tratar enfermedades vasculares oculares La presente invención proporciona métodos para tratar o mejorar trastornos vasculares y degeneración neuronal en la retina de un mamífero que sufre de una enfermedad ocular. De acuerdo con los métodos, poblaciones de monocitos aisladas o células diseñadas de las mismas como se describe anteriormente pueden administrarse a la retina del mamífero, ya sea por inyección intra-vítrea o administración sistémica. Las células se administran en una cantidad suficiente para mejorar degeneración vascular y/o neuronal en la retina. De preferencia, la población de monocitos aislada es autóloga al mamífero a ser tratado. De preferencia, las células de monocitos aisladas se administran en un medio fisiológicamente tolerable, tal como solución salina regulada por fosfato (PBS) .

En algunos de los métodos terapéuticos, una población de monocitos conteniendo células CD14+/CD33+ sustancialmente purificadas (v.gr. , por lo menos 75% u 80%) primero se aisla a partir de una muestra de glóbulos blancos o una muestra de médula ósea obtenida a partir del sujeto a ser tratado. La población celular de monocitos es aislada usando los métodos descritos anteriormente. La población de monocitos aislados CD14+/CD33+ entonces se administra al sujeto en una cantidad que es suficiente para mejorar o tratar la degeneración vascular y/o neuronal de la retina. Las células pueden aislarse a partir de un mamífero que sufre de una enfermedad degenerativa ocular o enfermedad vascular ocular, de preferencia a una etapa temprana de la enfermedad ocular o a partir de un sujeto saludable conocido por estar pre-dispuesto al desarrollo de una enfermedad degenerativa ocular (es decir, a través de pre-disposición genética) . En el último caso, la población de monocitos aislada puede almacenarse después de aislamiento, y puede entonces inyectarse de manera profiláctica durante etapas tempranas de una enfermedad ocular desarrollada posteriormente.

Sin la intención de limitarse en teoría, células a partir de la población de monocitos CD14+/CD33+ de la invención pueden ejercer su efecto terapéutico mediante apuntar selectivamente a astrocitos, incorporándolos en vasculatura en desarrollo y luego diferenciando para volverse células endoteliales vasculares. Las células pueden promover rescate neuronal en la retina y promover regulación hacia arriba de genes anti-apoptósi-eos. Cuando se administra de manera sistémica o se inyecta de manera intra-vítrea dentro del ojo de un sujeto mamífero (v.gr., un humano o un ratón) a partir del cual se aislaron las células, las células son útiles para el tratamiento de enfermedades degenerativas neo-vascular retinal y vascular retinal, y para reparación de lesión vascular retinal.

Los sujetos adecuados para tratamiento con métodos de la invención pueden ser neo-natos, juveniles o adultos completamente maduros. En algunas formas de realización, los sujetos a ser tratados son sujetos neo-natos que sufren de trastornos oculares tales como retinopatía inducida por oxígeno o retinopa- tía de prematuriedad . En algunas formas de realización, los sujetos son humanos, y las poblaciones de monocitos aisladas a ser usadas son células humanas, de preferencia células autólogas aisladas a partir del sujeto a ser tratado. Sujetos que sufren de varias enfermedades vasculares oculares o trastornos degenerativos oculares son adecuados para tratamiento con las poblaciones de monocitos de la invención. Estas incluyen enfermedades oculares tales como enfermedades degenerativas retínales, enfermedades degenerativas vasculares retínales, edema de retina (incluyendo edema macular) , retinopatías isquémicas, hemorragias vasculares, fuga vascular, coroidopatías , lesiones retínales y defectos retínales involucrando una interrupción en o degradación de la vasculatura retinal. Ejemplos específicos de tales enfermedades incluyen degeneración macular relacionada con la edad (ARMD) , retinopatía diabética (DR) , histoplasmosis ocular presumida (POHS) , retinopatía de prematuriedad (ROP) , anemia de células falciformes, y retinitis pigmentosa, así como lesiones retínales. Además, las poblaciones de monocitos también pueden usarse para generar una línea de células genéticamente idénticas, es decir, clones, para uso en tratamiento regenerador o reparador de vasculatura retinal, así como para tratamiento o mejora de degeneración neuronal retinal. Mas aun, las poblaciones de monocitos de la invención son útiles como herramientas de investigación para estudiar desarrollo vascular retinal y para entregar genes a objetivos celulares seleccionados, tales como astrocitos .

Para aplicaciones terapéuticas o profilácticas, la población de monocitos aislada de la invención puede administrarse al sujeto ya sea mediante una ruta local o una ruta sistémica. En algunas formas de realización, administración local de las células se desea para lograr el efecto terapéutico pretendido. Por ejemplo, la población celular puede administrarse al sujeto por inyección intra-ocular (inyección intra-vítrea) . Esto puede llevarse a cabo de acuerdo con procedimientos estándar conocidos en la materia. Ver, v.gr., Ritter et al., J. Clin. Invest. 116:3266-76, 2006; Russelakis-Carneiro et al., Neuropathol . Appl . Neurobiol . 25:196-206, 1999; y Wray et al., Arch. Neurol . 33:183-5, 1976. En algunos otros métodos terapéuticos de la invención, una ruta de administración sistémica de la población de monocitos aislada se emplea. Por ejemplo, las células pueden administrarse al sujeto por inyección intravenosa que se practica rutinariamente en la materia. En algunas otras formas de realización, sujetos no humanos pueden administrarse también con las células mediante inyección intra-cardiaca. Esto se puede lograr con base en procedimientos practicados rutinariamente en la materia. Ver, v.gr., Iwasaki et al., Jpn. J. Cáncer Res. 88:861-6, 1997; Jespersen et al., Eur. Heart J. 11:269-74, 1990; y Martens, Resuscitation 27:177, 1994. Otras rutas de administración también pueden emplearse en la práctica de la presente invención. Ver, v.gr., Remington: The Science and Practice of Pharmacy, Mack Publishing Co.( 2a. ed. , 2000.

En general, el número de células a partir de la población de monocitos inyectada dentro del ojo deberá ser suficiente para arrestar el estado de enfermedad del ojo. Por ejemplo, la cantidad de células inyectadas puede ser efectiva para reparar daño retinal del ojo, estabilizar neo-vasculatura retinal, madurar neo-vasculatura retinal, y prevenir o reparar fuga vascular y hemorragia vascular. Típicamente, para inyección intra-vítrea, por lómenos alrededor de lxlO4, por lo menos 1x10s, o por lo menos lxlO6 células a partir de la población de monocitos aislada o células transíectadas a partir de la población de monocitos se inyecta a un ojo del sujeto que sufre de un trastorno vascular ocular (v.gr. , una enfermedad degenerativa retinal) . El número de células a ser inyectadas puede depender de la severidad de la degeneración retinal, la edad del sujeto y otros factores que serán fácilmente aparentes a un técnico en la materia para tratar enfermedades oculares. Las células a partir de la población de monocitos puede administrarse en una sola dosis o por administración de múltiples dosis sobre un periodo de tiempo, como puede determinarse por el médico a cargo del tratamiento. También, el número de células y frecuencia de administración puede variar dependiendo de si el tratamiento es profiláctico o terapéutico. En aplicaciones profilácticas, un número relativamente bajo de células puede administrarse en intervalos relativamente infrecuentes sobre un largo periodo de tiempo. Algunos sujetos pueden continuar recibiendo tratamiento por el resto de sus vidas. En aplicaciones terapéuticas, un número relativamente elevado de células a intervalos relativamente cortos puede requerirse hasta que progresión de la enfermedad se reduce o termina, y de preferencia hasta que el sujeto muestra mejora parcial o completa de síntomas de enfermedad vascular ocular. Posteriormente, el sujeto puede ser administrado con un régimen profiláctico.

VI . Mejorar actividades de poblaciones de monocitos aisladas mediante activación ex vivo En las varias aplicaciones terapéuticas descritas anteriormente, la población de monocitos aislada o célula diseñadas de la misma también pueden activarse in vitro o ex vivo previo a administrarse a un sujeto en necesidad de tratamiento. En estas formas de realización, actividades terapéuticas mejoradas pueden lograrse cuando los monocitos activados ex vivo se administran a la retina de sujetos afligidos con trastornos vasculares oculares .

La activación de las poblaciones de monocitos aisladas pueden llevarse a cabo fácilmente de acuerdo con materiales y métodos practicados rutinariamente en la materia o ejemplificados en los ejemplos siguientes. Monocitos y macrófagos se conocen por activarse por una variedad de agentes tales como LPS, a través de CD14 y receptores similares a Toll (Le-Barillec et al., J. Leukoc. Biol . 68:209-15, 2000; Mirlashari et al., Med. Sci.

Monit. 9:BR316-24, 2003). Como se demuestra en los ejemplos siguientes, las poblaciones de monocitos aisladas pueden activarse con diversos agentes tales como lipopolisacárido (LPS) , monofosforil lípido A (MPLA) y proteína 1 quimotáctica de monocito (MCP-1) . También se mostró que, con relación a células no tratadas, las células activadas produjeron mejores resultados terapéuticos en animales con retinopatía inducida con oxígeno. Por ende, estos agentes pueden emplearse fácilmente para activación ex vivo de las poblaciones de monocitos aisladas. Muchos otros compuestos activadores de monocitos que se conocen en la materia pueden también usarse en la práctica de la presente invención. Ejemplos de tales compuestos incluyen inmunomoduladores (tales como interferón gamma, linfocinas, muramil dipéptido) , miristato acetato de forbol, concanavalina A, poli (metacrilato de metilo), y grasas dietarias. Ver, v.gr., Koff et al., Science 224:1007-1009, 1984; Chung et al., J. Leukoc . B'iol . 44:329-336, 1988; Horwitz et al., J. Exp. Med. 154:1618-1635, 1981; Laing et al., Acta Orthop. 79:134-40, 2008; Bently et al., Biochem. Soc . Trans. 35:464-5, 2007.

Para activar los monocitos, las células aisladas pueden incubarse con cualquiera de los compuestos a una concentración apropiada por un periodo de tiempo suficiente. La cantidad de compuestos a ser usados y la longitud de tiempo para la activación previo a administración de las células puede determinarse de manera empírica o de acuerdo con las enseñanzas de la materia.

Guía específica para activar poblaciones de monocitos aisladas con algunos de los compuestos también son provistos en los ejemplos mas adelante. Usando LPS como un ejemplo, las células pueden incubarse con LPS a una concentración de alrededor de 1 ng/ml a alrededor de 1,000 ng/ml, de preferencia a una concentración de alrededor de 5 ng/ml a alrededor de 200 ng/ml o de alrededor de 20 ng/ml a alrededor de 50 ng/ml. Las células son típicamente tratadas con un compuesto activador por al menos 10 minutos, de preferencia por lo menos una hora previo a ser usadas en aplicaciones terapéuticas. En algunas formas de realización, las células son tratadas con el compuesto por al menos 2 horas, al menos 4 horas, al menos 10 horas, al menos 24 horas o mas.

Previo a administrar las células tratadas a un sujeto, las células también pueden examinarse in vi tro para evaluar su activación. Esto puede típicamente llevarse a cabo mediante monitorizar cualitativamente o cuantitativamente secreciones de citoquina por monocitos tratados. Como se muestra en los ejemplos, monocitos activados tienen secreciones incrementadas de citoquinas tales como IL-?ß, IL-8, IL-6 y TNF. Como se ejemplifica en los ejemplos, perfiles de secreción de citoquina de monocitos pueden fácilmente evaluarse con métodos practicados de manera rutinaria tales como análisis de arreglo de perlas citométrico (CBD) . Ver, v.gr., Elshal et al., Methods 38:317-329, 2006; y Morgan et al., Clin. Immunol . 110:252-266, 2004.

Además de activar la población de monocitos aislada in vitro o ex vivo antes de administrar las células a un sujeto, algunos métodos terapéuticos de la invención involucran coadministrar al sujeto una población de monocitos no tratada y un compuesto activador de monocitos divulgado en la presente (v.gr. , MCP-1) . En algunas formas de realización relacionadas, el sujeto en necesidad de tratamiento se administra con una población de monocitos activada in vitro o ex vivo junto con un compuesto activador de monocitos descrito anteriormente (v.gr., MCP-1) . En estas formas de realización, el compuesto co-administrado puede activar los monocitos administrados in vivo o reforzar actividades de las células tratadas in vivo.

En un aspecto relacionado, la invención proporciona métodos para identificar compuestos novedosos que son capaces de activar y estimular actividades terapéuticas de monocitos. Típicamente, estos métodos involucran poner en contacto un compuesto candidato con una población de monocitos o macrófagos (v.gr., una población e monocitos descrita en la presente) y monitorizar un parámetro de los monocitos que es indicativo de un estado activado de la población celular. El parámetro a ser monitorizado puede ser cualquier característica biológica, bioquímica o morfológica de las células. En algunas formas de realización preferidas, las células tratadas con un agente candidato se examinan para niveles de secreción de una o mas citoquinas tales como IL-6, IL-8 o TNF . Una secreción incrementada de una o mas de estas citoquinas por las células tratadas con relación a células no tratadas indica que el compuesto candidato es un compuesto activador de monocitos novedoso.

Compuestos candidatos a ser analizados/seleccionados en los métodos pueden ser a partir de clases químicas, incluyendo moléculas orgánicas pequeñas, proteínas, polipéptidos , polisacá-ridos, polinucleótidos , y similares. En algunas formas de realización preferidas, los compuestos candidatos son agentes orgánicos de moléculas pequeñas (v.gr., compuestos orgánicos de menos de alrededor de 500 Daltons o menos que alrededor de 1,000 Daltons) . De preferencia, ensayos de alto rendimiento se adaptan y se emplean para analizar/seleccionar bibliotecas de combinación de compuestos candidatos (v.gr., bibliotecas de moléculas orgánicas pequeñas) . Tales ensayos son bien conocidos en la materia, v.gr., como se describen en Schultz (1998) Bioorg. Med. Chem. Lett. 8:2409-2414; Weller (1997) Mol. Divers . 3:61-70; Fernandes (1998) Curr. Opin. Chem. Biol . 2:597-603; y Sittampalam (1997) Curr. Opin. Chem. Biol. 1:384-91. Bibliotecas de combinación grandes de compuestos candidatos pueden construirse por el método de bibliotecas sintéticas codificadas (ESL) descrito en WO 95/12608, WO 93/06121, WO 94/08051, WO 95/35503 y WO 95/30642. Otros métodos para sintetizar varias bibliotecas de compuestos se describen en, v.gr., Overman, Organic Reactions, Volumes 1-62, Wiley-Interscience (2003); Broom et al., Fed Proc . 45: 2779-83, 1986; Ben-Menahem et al., Recent Prog . Horm. Res. 54:271-88, 1999; Schramm et al., Annu. Rev. Biochem. 67: 693-720, 1998; Bolin et al., Biopolymers 37: 57-66, 1995; Karten et al . , Endocr. Rev. 7: 44-66, 1986; Ho et al . , Tactics of Organic Synthesis, iley-Interscience ; (1994); and Scheit et al . , Nucleotide Analogs: Synthesis and Biological Function, John Wiley & Sons (1980) .

Ejemplos Los siguientes ejemplos son provistos para ilustrar adicionalmente la invención pero no para limitar su alcance. Otras variantes de la invención serán fácilmente aparentes a un técnico en la materia y se abarcan por las reivindicaciones anexas .

Ejemplo 1. Aislar poblaciones de monocitos Sangre periférica o médula ósea pueden usarse como un material fuente para los procedimientos descritos en la presente. Como un ejemplo, se ha seleccionado sangre periférica como una fuente celular debido a la abundancia relativa de monocitos y la facilidad/seguridad de colección contra médula ósea. Para uso terapéutico es deseable tener células que están libres de cualquier compuesto ligado relativo a selección. Con esta meta en mente, se han concebido y puesto en práctica métodos de práctica que distinguen a monocitos de otras células mononucleares (v.gr. , linfocitos) con base solamente en las propiedades físicas tales como tamaño, granulosidad y densidad. El primer método desarrollado se basa en FACS para separar de manera sensible monocitos a partir de linfocitos con base en diferencias en tamaño celular y granulosidad, sin el uso de anticuerpos. Previo a separación a base de FACS, los eritrocitos y granulocitos presentes en sangre entera se remueven durante un paso de centrifugación Ficoll pre-clasificación . Esto puede lograrse con varios medios, v.gr., (1) cloruro de amonio puede usarse para lisar RBCs, (2) RBCs pueden sedimentarse y células mononucleares aislares por centrifugación en Ficoll, y (3) RBCs pueden también sedimentarse usando HESpan.

Siguiendo la separación en bruto de RBC, células son se suspenden en DPBS/BSA al 0.5%/EDTA 2 mM en preparación para clasificación celular activada por fluorescencia (FACS) .

Clasificación se lleva a cabo en un BD Biosciences ARIA usando una serie de compuertas y ningún anticuerpo u otro agente de selección. Células muertas y desechos primero se sacan por compuerta mediante tomar una región que incluye solamente glóbulos blancos viables. Siguiente, dobletes o células aglomeradas se remueven con compuertas secundaria y terciaria que interrogan anchura de diseminación hacia adelante (FSC-W) contra área de diseminación hacia adelante (FSC-A) y anchura de diseminación lateral (SSC-W) contra área de diseminación lateral (SSC-A) , respectivamente. Con solamente glóbulos blancos bajo consideración, una compuerta se toma en modo FSC-A contra SSC-A para seleccionar células que se encuentran en una región que contiene de manera reproducible monocitos. Usando los ensayos descritos en el ejemplo 2, se encontró que poblaciones celulares obtenidas con este método contienen monocitos CD14+/CD33+ con purezas de 80%-85%.

Un segundo método para aislar poblaciones de monocitos el cual discrimina células con base en densidad depende de movilidad diferencial durante centrifugación. Este método tiene ciertas ventajas en aplicaciones clínicas debido a que conjuntos de tubos desechables pueden usarse para asegurar esterilidad y eliminar contaminación cruzada de muestras. Específicamente, muestra de sangre humana se trató primero para separar en bruto glóbulos rojos (RBCs) por sedimentación usando HESPAN. Por lo tanto, un volumen apropiado de HESPAN al 6% se añadió a producto sanguíneo anti -coagulado para alcanzar concentración final de 1.5%. La bolsa se mezcló suavemente y se incubó erecta, a temperatura ambiente por 45 minutos para permitir que los RBCs se sedimenten. La fracción celular nucleada (NCF) se expresó entonces usando un expresor de plasma manual y se colectó en una bolsa de sangre vacía de 600 mL estéril separada. El producto celular resultante se usó como el material inicial para separación adicional con base en centrif gación por gradiente de densidad.

Un dispositivo Elutra (Gambro BCT Inc., Lakewood, Colorado) diseñado para enriquecer para la población de monocitos puede entonces utilizarse para procesar el producto celular inicial. El conjunto de tubos desechables se conectó al dispositivo Elutra. El producto celular inicial, bolsas de medio primarias y secundarias conteniendo HBSS y HSA al 0.5% se conectaron entonces a la conexión apropiada en el conjunto de tubos. El conjunto de tubos se cebó usando la bolsa secundaria. El número de programa uno (ver Tabla 1 siguiente) se usó para procesar al producto celular inicial. El programa automáticamente cargó al producto celular inicial hacia la cámara y lo procesó usando la bolsa de medio primaria. Las células se centrifugaron continuamente, se separaron y se colectaron en múltiples fracciones a varias tasas de flujo. El programa se diseñó para colectar 5 fracciones cada una enriquecida con una población celular particular como sigue. Plaquetas se colectaron en la fracción uno, RBC en la fracción dos, linfocitos en la fracción tres, monocitos en la fracción cuatro y granulocitos en la fracción cinco. Se tomó muestra de cada fracción y se analizó para conteo celular, la viabilidad por conteo celular nuclear y la pureza por citometría de flujo. Las tasas de flujo y los volúmenes de colección para cada fracción se muestran en la Tabla 1. Con base en la pureza y el conteo celular, volumen apropiado conteniendo monocitos se colectó y luego se centrifugó a 300 x g.

Como se indica en la figura 2, preparaciones de monocitos aisladas por el método de centrifugación por densidad se encontraron siendo similares en naturaleza a aquellos separados por el método a base de FACS.

Tabla 1 Ejemplo 2. Tratar trastorno vascular ocular con poblaciones de monocitos aisladas Un modelo murino de retinopatía inducida por oxígeno se empleó para examinar actividades terapéuticas de las poblaciones de monocitos aisladas con los métodos descritos en la presente. Ratones con retinopatía inducida por oxígeno se generaron como se describe en Ritter et al., J. Clin. Invest . 116:326-76, 2006. Específicamente, retinopatía inducida por oxígeno se indujo en ratones C57BL/6J de acuerdo con el protocolo descrito por Smith et al., Invest. Ophthalmol . Vis. Sci. 35:101-111, 1994. Para comparación, ratones BALB/cByJ también se sometieron a las mismas condiciones. Brevemente, cachorros P7 y sus madres se transfirie-ron a partir de aire ambiental a un ambiente de oxígeno al 75% por 5 días y posteriormente se regresaron a aire ambiental . El ambiente hiperóxico se creó y se mantuvo usando una cámara BioSpherix. Bajo estas condiciones, áreas hipovasculares grandes formadas en la retina central durante hiperoxia en ratones C57BL/6J, y neo-vascularización pre-retinal anormal ocurrieron después de regreso a normoxia, haciendo pico en alrededor de P17 y finalmente resolviendo.

Inyección intra-ocular de las células aisladas en ratones entonces se llevó a cabo. Esto es seguido por análisis de inmunohistoquimica y visualización de vasculatura en los ojos de los ratones tratados así como ratones de control . Estos estudios se llevaron a cabo usando los procedimientos descritos en Ritter et al., J. Clin. Invest . 116:3266-76, 2006. Resultados a partir de estos estudios se muestran en la figura IB. Como se indica en la figura, las poblaciones sustancialmente puras de monocitos aislados por los presentes inventores fueron capaces de promover reparación vascular en los ratones con retinopatía inducida por oxígeno .

Ejemplo 3. Otras propiedades y actividades de poblaciones de monocitos aisladas Para demostrar que las células que se aislaron son distintas de otras poblaciones celulares conocidas en uso clínico o desarrollo, se marcaron muestras de sangre periférica para la expresión de aldehido deshidrogenasa las cuales, cuando se expresan en altos niveles (ALDHbr) identifican células CD34+, células CD133+, células kit+, células negativas de antígeno de linaje (Lin") . Esencialmente no se encontró tal marcado en muestras de sangre periférica (figura 3) , ajustando con la idea que se espera que células madre sean excesivamente raras en sangre periférica inmovilizada.

CD34 es un marcador de células madre hematopoyéticas y ha sido usado para seleccionar células para varias aplicaciones clínicas. Se ha encontrado que tales células pueden comprender o afectar de manera adversa el resultado de las aplicaciones terapéuticas descritas en la presente. Específicamente, se inyectaron células madre embriónicas de ratón y mesenquimales humanas (las cuales, como células madre CD34+, son células no diferenciadas) de manera intra-vítrea para determinar el comportamiento de células madre no diferenciadas después de inyección intra-ocular. Estas células se inyectaron en ya sea ojos normales o aquellos que han sido sometidas al modelo de retinopatía inducida por oxígeno (OIR) . Adicionalmente , para evaluar el efecto de un tipo celular no relacionado con el ojo, se inyectaron de manera intra-vítrea fibroblastos dérmicos humanos normales en el modelo OIR de ratón. En todos los casos anteriores, se observó actividad inflamatoria y neoplástica significativa en las retinas. Estos descubrimientos sugieren que inyección intra-ocular de células madre y/o proliferativas no diferenciadas llevaría a eventos adversos significativos en ojos normales o isquémicos. Estos estudios también resaltan el descubrimiento de que, en contraste a células madre no diferenciadas, poblaciones de células progenitoras mieloides como se describen en la presente invención, promueven una reparación controlada de la vasculatura retinal sin la ocurrencia de eventos adversos tales como inflamación o neoplasia.

Como se muestra en la figura 4, las poblaciones preparadas usando los métodos pueden contener un pequeño número de células CD34+ (figura 4) . Sin embargo, estas células no se requieren para función en los modelos. Además, se han agotado específicamente células expresando CD34 de las preparaciones de monocitos y no mostraron cambio en eficacia.

Ejemplo 4. Ensayos in vitro para pureza y función de monocitos aislados De modo de evaluar la pureza y actividad de las células aisladas como se describe anteriormente, se desarrollaron varios ensayos in vitro que evalúan de manera independiente diferentes características de monocitos. El primer ensayo fue para medir la pureza de la preparación de monocitos. Se usó como anticuerpo contra el marcador de monocitos CD14 y citometría de flujo (figura 5) . Como se muestra en la figura 5, este ensayo permitió determinar si el número de células no de monocitos presentes en la población celular aislada y validar la eficiencia de los métodos de aislamiento. El segundo ensayo fue una medición de la actividad de los monocitos aislados. Cuantificó la quimotaxis de células hacia un gradiente de proteína 1 quimotáctica de monocitos (MCP-1) . Estas pruebas se llevaron a cabo usando una cámara Boyden con un tamaño de poros de 3 µt? o 5 µp? donde se permitió que las células migraran por 2 h a 37°C. Se mostró que preparaciones de monocitos aisladas efectivamente migran bajo la influencia de MCP-1, pero no linfocitos (figura 6). Por ende, este ensayo proporcionó una lectura de la pureza relativa de la preparación y una indicación de la viabilidad y función de las células aisladas.

El tercer ensayo se basó en adhesión diferencial a substratos de cultivo celular. Se estableció que monocitos son capaces de adherirse a plástico de cultivo celular mientras que los linfocitos no se adhieren. Como se demuestra en la figura 7, resultados a partir de este ensayo indicaron que las células generadas por los métodos de aislamiento descritos en la presente fueron principalmente monocitos como es evidente por su habilidad para adherirse bajo estas condiciones.

Ejemplo 5. Administración sistémica de poblaciones celulares terapéuticas Este ejemplo describe administración intra-cardiaca de células mieloides CD44hi para aplicaciones terapéuticas en modelo de retinopatía de ratón. Esta ruta de entrega sistémica difiere de la ruta de administración local típica (inyección intra-ocular) usada en los ejemplos anteriores. Células mieloides CD44hi expresando GFP se prepararon y obtuvieron como se describe en Ritter et al., J. Clin. Invest . 116:3266-76, 2006. Inyección intra-cardiaca de las células en ratones C57BL/6J con retinopatía inducida por oxígeno (típicamente, ratones post -natales en el día 7) se llevó a cabo usando procedimientos estándar. Actividad de apuntado vascular de las células se demostró mediante analizar retinas manchadas con GS lectina de los ratones inyectados varios días después de la inyección (v.gr., 7 días o 10 días posteriormente) . Imágenes de la vasculatura retinal se obtuvieron usando un microscopio confocal de exploración por láser Radiance 2100 MP (Bio-Rad; Zeiss) . Procedimientos para manchar la retina y analizar las imágenes microscópicas confocales se llevaron a cabo como se describe en Ritter et al., J. Clin. Invest . 116:3266-76, 2006.

Los resultados obtenidos a partir del estudio demostraron que una fracción de las células terapéuticas se apuntaron a la retina después de lesión hiperóxica (figura 8) . Estos descubrimientos indican que las poblaciones de monocitos descritas en la presente puede también administrarse de manera sistémica (v.gr., mediante inyección intra-cardiaca) para lograr sus efectos terapéuticos, v.gr., para reparar daño o entregar agentes terapéuticos a los ojos.

Ejemplo 6. Actividades acrecentadas de población de monocitos activada in vitro Este ejemplo describe activación de poblaciones de monocitos ex vivo y sus actividades acrecentadas con relación a células no activadas.

Después de aislar células de monocitos usando los métodos descritos anteriormente, las células de monocitos aisladas (células de fracción 5 (F5) ) se trataron con lipopolisa-cárido (LPS) a una concentración de 25 ng/ml por 4 horas. Activación se midió a través de un ensayo a base de citometría de flujo, modificado a partir del ensayo de Manchado de Citoquina Intracelular BD, el cual mide niveles intracelulares de citoqui-nas . Este ensayo detectó acumulación incrementada de proteínas IL-6, IL-8 y TNF en células de monocitos (F5) que se trataron con LPS contra células no tratadas y contra fracciones enriquecidas con linfocitos (F3) . Específicamente, los datos mostraron que aunque la población enriquecida con linfocitos (F3) no se activa sustancialmente después de LPS, población enriquecida con monocitos (F5) claramente se activa con LPS. Además, se mostró que células derivadas a partir de donador diabético normalmente se activan según se mide por manchado de citoquina intracelular. Además, se encontró que a partir del análisis de citometría de flujo tratamiento con LPS tiene poco efecto sobre la morfología de células F5 según se mide por diseminación hacia adelante contra diseminación lateral.

Se corroboraron de manera independiente estos descubrimientos usando un Arreglo de Perlas Citométrico para medir cuantitativamente niveles de citoquinas secretados a partir de células activadas con LPS contra células no tratadas. Se detectaron incrementos significativos en proteínas IL-6, IL-8 y TNF secretadas. Este ensayo también estableció que IL-?ß es significativamente regulada hacia arriba después de estimulación con LPS en células F5 (figura 9) , pero secreción de IL-10 e IL-12p70 estuvo esencialmente sin cambio.

Además de activar las células de monocitos aisladas con LPS, también se examinaron actividades de otros compuestos activadores con perfiles de seguridad mas favorables. Específicamente, se enfocaron primero los esfuerzos sobre ligandos alternativos para el receptor de LPS, TLR4. Uno de estos ligandos TLR4 alternativos, monofosforil lípido A (MPLA.) , se usó en el Arreglo de Perlas Citométrico descrito anteriormente. Los resultados indican que MPLA activa células F5 con incrementos en IL-8, IL-6 y TNF que fueron similares a aquellos observados con LPS (figura 10) . Un incremento también se observó sobre secreción de IL-?ß después de tratamiento con MPLA, aunque el nivel también fue aproximadamente la mitad del obtenido con estimulación con LPS.

También se probó la capacidad activadora de proteína 1 quimotáctica de monocitos (MCP-1) humana sobre células de monocitos F5. Tanto MCP-1 de ratón y humana estimularon incrementos en IL-8 e IL-6. Pero los niveles fueron mas bajos que los obtenidos con LPS o MPLA (figuras 10 y 11) .

Además de medir las secreciones de citoquina de poblaciones de monocitos activadas ex vivo, se examinaron además actividades terapéuticas de las células en estudios animales. En estos estudios, grupos paralelos de células tratadas con LPS o de control se administraron a ratones mediante inyección intra-vítrea (250,000 células en 0.5 µ?) . Estos animales entonces se sometieron a hiperoxia y retinopatía inducida por oxígeno. Análisis de retinas a partir de estos animales mostró que tratamiento con células de monocitos F5 activadas por LPS redujo los dos parámetros principales medidos en este modelo: área de vaso-destrucción y área de neo-vascularización (crestas) . Reducción en estos parámetros fue mayor con células F5 tratadas con LPS que con F5 no tratadas, células F3 tratadas, vehículo o LPS solo.

Usando un valor de 10,000 mieras cuadradas como un corte por debajo del cual se consideran retinas esencialmente no teniendo destrucción vascular (descritas en la presente como "sanadas") se fue capaz de demostrar que un número sustancialmen-te mayor de retinas tuvieron áreas de destrucción por debajo de este corte después de tratamiento con células F5 tratadas con LPS comparadas con F5 no tratada u otras fracciones (F3) tratadas con LPS (figura 12) . Esto indica que poblaciones celulares enriquecí-das con monocitos activados son capaces de promover reparación vascular en este modelo de retinopatía isquémica. Como se puede observar a partir de la figura 12, la fracción F3 muestra un nivel de eficacia en el modelo OIR, sugiriendo que células activas están presentes en esta fracción también. Por ende, esta población, o una combinación de células F5 y F3, también puede ser terapéuticamente útil.

Con el uso potencial de un enfoque autólogo en el tratamiento de retinopatía diabética, es crítico demostrar que células derivadas a partir de donadores diabéticos están activas. Usando el modelo OIR, se ha mostrado que, de hecho, este es el caso. Fracciones enriquecidas con monocitos (F5) a partir de donadores diabéticos mostraron un patrón de activación que no fue distinguible a partir de donadores normales (figura 9) , y estas células activadas también se mostraron promoviendo reparación vascular en el modelo OIR en un mayor grado que células F5 no activadas u otras fracciones tratadas con LPS (F3) (figura 12) . De nuevo, algún nivel de actividad se observó en la fracción F3 enriquecida con linfocitos.

Aunque la invención anterior ha sido descrita en algún detalle a manera de ilustración y ejemplo para propósitos de claridad de entendimiento, será fácilmente aparente a los técnicos en la materia a la luz de las enseñanzas de esta invención que ciertos cambios y modificaciones pueden hacerse a la misma sin salir del espíritu o alcance de las reivindicaciones anexas .

Todas las publicaciones, bases de datos, secuencias GenBank, patentes, y solicitudes de patente citadas en esta especificación se incorporan en la presente por referencia como si cada una se indicara específicamente e individualmente para incorporarse por referencia.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Una población celular aislada comprendiendo monocitos sustancialmente puros que expresan antígeno CD33 y antígeno CD14.

2. La población celular aislada de la reivindicación 1, en donde la población celular es aislada a partir de una muestra de sangre periférica mamífera, una muestra de sangre de cordón o una muestra de médula ósea.

3. La población celular aislada de la reivindicación 1, en donde células en la población celular aislada son células humanas o células murinas .

. La población celular aislada de la reivindicación 1, en donde por lo menos 70%, 80% o 90% de las células en la población celular aislada expresan marcadores superficiales CD14 y CD33. '

5. La población celular aislada de la reivindicación 1, en donde la población celular es CD34".

6. La población celular aislada de la reivindicación 1, en donde la población celular está sustancialmente libre de células ALDHr.

7. La población celular aislada de la reivindicación 1, la cual se activa además in vitro.

8. El método de la reivindicación 7, en donde la población celular aislada se activa con LPS, MPLA, o MCP-1.

9. Un método para tratar o mejorar un trastorno vascular ocular en un sujeto, comprendiendo administrar a un sujeto que sufre del trastorno vascular ocular una población de monocitos aislada, en donde la población celular siendo administrada está en una cantidad suficiente para tratar o mejorar al trastorno vascular ocular.

10. El método de la reivindicación 9, donde la población de monocitos es aislada a partir de una muestra sanguínea o una muestra de médula ósea a partir del sujeto.

11. El método de la reivindicación 9, en donde el sujeto es un humano.

12. El método de la reivindicación 9, en donde la población de monocitos comprende células CD14+/CD33+ sustancial -mente puras .

13. El método de la reivindicación 9, en donde por lo menos 80% de las células en la población de monocitos aislada son CD14+/CD33+.

14. El método de la reivindicación 9, en donde el trastorno vascular ocular se selecciona a partir del grupo que consiste en retinopatía isquémica, retinopatía diabética, retinopatía de prematuriedad, glaucoma neo-vascular, oclusiones de vena retinal central, edema de retina, degeneración macular y retinitis pigmentosa.

15. El método de la reivindicación 9, en donde la población de monocitos se administra al sujeto mediante inyección intra-vítrea.

16. El método de la reivindicación 9, en donde la población de monocitos se activa in vitro o ex vivo previo a administrarse al sujeto.

17. El método de la reivindicación 16, en donde la población de monocitos se activa con LPS, MPLA, o MCP-1.

18. El método de la reivindicación 9, en donde la población de monocitos se co-administra al sujeto con un compuesto activador de monocitos.

19. El método de la reivindicación 18, en donde el compuesto activador de monocitos es LPS, MPLA, o MCP-1. a

20. Un método para tratar o mejorar una enfermedad ocular en un sujeto, comprendiendo (i) aislar a partir de una muestra sanguínea o una muestra de médula ósea de un sujeto teniendo una enfermedad vascular ocular una población de monocitos sustancialmente pura; y (ii) administrar la población de monocitos aislada al sujeto en una cantidad suficiente para tratar o mejorar la enfermedad vascular ocular, con ello tratando o mejorando síntomas de la enfermedad vascular ocular en el suj eto .

21. El método de la reivindicación 20, en donde la población de monocitos aislada comprende células CD14+/CD33+ sustancialmente puras.

22. El método de la reivindicación 20, en donde por lo menos alrededor de 80% de las células en la población de monocitos aislada expresan marcadores superficiales CD33 y CD14.

23. El método de la reivindicación 20, en donde la población de monocitos es aislada por (i) separar en bruto glóbulos rojos de la muestra; y (ii) separar glóbulos rojos restantes y otros tipos de células en la muestra a partir de monocitos con base en su tamaño, granulosidad o densidad.

24. El método de la reivindicación 23, en donde los glóbulos rojos restantes y otros tipos de células se separan de monocitos por centrifugación por densidad o clasificación celular activada por fluorescencia (FACS) .

25. El método de la reivindicación 20, en donde el trastorno vascular ocular se selecciona a partir del grupo que consiste en retinopatía isquémica, retinopatía diabética, retinopatía de prematuriedad, glaucoma neo-vascular, oclusiones de vena retinal central, degeneración macular y retinitis pigmentosa .

26. El método de la reivindicación 20, en donde la población de monocitos aislada se activa ex vivo previo a administrarse al sujeto.

27. El método de la reivindicación 26, en donde la población de monocitos se activa con LPS, MPLA, o MCP-1.

28. Un método para aislar una población de monocitos sustancialmente pura, comprendiendo (i) proporcionar una muestra sanguínea o una muestra de médula ósea a partir de un sujeto; (ii) separar en bruto glóbulos rojos de la muestra; y (iii) separar glóbulos rojos restantes y otros tipos de células en la muestra a partir de monocitos, con ello aislando una población celular comprendiendo monocitos sustancialmente puros.

29. El método de la reivindicación 28, en donde los glóbulos rojos restantes y otros tipos de células se separan de monocitos con base en su tamaño, granulosidad o densidad.

30. El método de la reivindicación 28, en donde los glóbulos rojos restantes y otros tipos de células se separan a partir de monocitos por centrifugación por densidad o clasificación celular activada por fluorescencia (FACS) .

31. El método de la reivindicación 28, en donde los otros tipos de células son plaquetas y granulocitos .

32. El método de la reivindicación 28, en donde los glóbulos rojos son separados en bruto por centrifugación diferencial HESPAN o centrifugación por gradiente de densidad Ficoll .

33. El método de la reivindicación 28, comprendiendo además ensayar la población celular aislada para expresión de marcador superficial CD14 y CD33.

34. Una población celular de monocitos sustancialmente pura aislada por el método de la reivindicación 28.