KR20110123778A - 단리된 단핵구 집단 및 관련된 치료적 적용 - Google Patents
단리된 단핵구 집단 및 관련된 치료적 적용 Download PDFInfo
- Publication number
- KR20110123778A KR20110123778A KR1020117021989A KR20117021989A KR20110123778A KR 20110123778 A KR20110123778 A KR 20110123778A KR 1020117021989 A KR1020117021989 A KR 1020117021989A KR 20117021989 A KR20117021989 A KR 20117021989A KR 20110123778 A KR20110123778 A KR 20110123778A
- Authority
- KR
- South Korea
- Prior art keywords
- cells
- isolated
- population
- monocyte
- monocytes
- Prior art date
Links
- 210000001616 monocyte Anatomy 0.000 title claims abstract description 230
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 title description 27
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims abstract description 265
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 117
- 210000003743 erythrocyte Anatomy 0.000 claims abstract description 44
- 102100035877 Monocyte differentiation antigen CD14 Human genes 0.000 claims abstract description 36
- 101000946889 Homo sapiens Monocyte differentiation antigen CD14 Proteins 0.000 claims abstract description 35
- 101000934338 Homo sapiens Myeloid cell surface antigen CD33 Proteins 0.000 claims abstract description 31
- 102100025243 Myeloid cell surface antigen CD33 Human genes 0.000 claims abstract description 31
- 208000014245 Ocular vascular disease Diseases 0.000 claims abstract description 31
- 239000008280 blood Substances 0.000 claims abstract description 24
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 claims abstract description 23
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 claims abstract description 22
- 210000001185 bone marrow Anatomy 0.000 claims abstract description 21
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 claims description 34
- 102100031573 Hematopoietic progenitor cell antigen CD34 Human genes 0.000 claims description 25
- 101000777663 Homo sapiens Hematopoietic progenitor cell antigen CD34 Proteins 0.000 claims description 25
- 208000017442 Retinal disease Diseases 0.000 claims description 24
- 206010038923 Retinopathy Diseases 0.000 claims description 24
- 238000001943 fluorescence-activated cell sorting Methods 0.000 claims description 22
- 208000002780 macular degeneration Diseases 0.000 claims description 22
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 claims description 21
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 claims description 20
- 101710155857 C-C motif chemokine 2 Proteins 0.000 claims description 19
- 210000005259 peripheral blood Anatomy 0.000 claims description 18
- 239000011886 peripheral blood Substances 0.000 claims description 18
- 206010012689 Diabetic retinopathy Diseases 0.000 claims description 15
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 claims description 15
- 239000007924 injection Substances 0.000 claims description 15
- 238000002347 injection Methods 0.000 claims description 15
- 206010038933 Retinopathy of prematurity Diseases 0.000 claims description 14
- 210000003714 granulocyte Anatomy 0.000 claims description 13
- 230000000302 ischemic effect Effects 0.000 claims description 12
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 claims description 9
- 208000022873 Ocular disease Diseases 0.000 claims description 8
- 229920001612 Hydroxyethyl starch Polymers 0.000 claims description 7
- 210000001772 blood platelet Anatomy 0.000 claims description 7
- 229940064366 hespan Drugs 0.000 claims description 7
- 206010038910 Retinitis Diseases 0.000 claims description 6
- 229920001917 Ficoll Polymers 0.000 claims description 5
- 208000010412 Glaucoma Diseases 0.000 claims description 5
- 241001529936 Murinae Species 0.000 claims description 5
- 208000007014 Retinitis pigmentosa Diseases 0.000 claims description 5
- 210000004700 fetal blood Anatomy 0.000 claims description 5
- 208000004644 retinal vein occlusion Diseases 0.000 claims description 5
- 108010031801 Lipopolysaccharide Receptors Proteins 0.000 claims description 4
- 201000010183 Papilledema Diseases 0.000 claims description 4
- 206010038886 Retinal oedema Diseases 0.000 claims description 4
- 201000005667 central retinal vein occlusion Diseases 0.000 claims description 4
- 201000003142 neovascular glaucoma Diseases 0.000 claims description 4
- 201000011195 retinal edema Diseases 0.000 claims description 4
- 238000000432 density-gradient centrifugation Methods 0.000 claims description 3
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 claims description 3
- 108010029180 Sialic Acid Binding Ig-like Lectin 3 Proteins 0.000 claims description 2
- 102000001555 Sialic Acid Binding Ig-like Lectin 3 Human genes 0.000 claims description 2
- 102100021943 C-C motif chemokine 2 Human genes 0.000 claims 4
- 108020002663 Aldehyde Dehydrogenase Proteins 0.000 claims 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 abstract description 32
- 239000000463 material Substances 0.000 abstract description 10
- 230000007850 degeneration Effects 0.000 abstract description 5
- 238000002372 labelling Methods 0.000 abstract description 5
- 238000012216 screening Methods 0.000 abstract 1
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 36
- 239000002158 endotoxin Substances 0.000 description 33
- 229920006008 lipopolysaccharide Polymers 0.000 description 33
- 210000001525 retina Anatomy 0.000 description 26
- 230000002792 vascular Effects 0.000 description 24
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 22
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 21
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 19
- 210000001508 eye Anatomy 0.000 description 17
- 206010064930 age-related macular degeneration Diseases 0.000 description 16
- 102000000018 Chemokine CCL2 Human genes 0.000 description 15
- 230000008439 repair process Effects 0.000 description 15
- 230000002207 retinal effect Effects 0.000 description 15
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 14
- 210000000265 leukocyte Anatomy 0.000 description 14
- 229940035032 monophosphoryl lipid a Drugs 0.000 description 14
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 14
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 14
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 14
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 14
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 13
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 13
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 description 13
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 12
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 12
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 11
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 11
- 208000030533 eye disease Diseases 0.000 description 10
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 10
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 description 10
- 201000004569 Blindness Diseases 0.000 description 9
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 9
- 230000033115 angiogenesis Effects 0.000 description 9
- 230000001537 neural effect Effects 0.000 description 9
- 102000004890 Interleukin-8 Human genes 0.000 description 8
- 108090001007 Interleukin-8 Proteins 0.000 description 8
- 210000000601 blood cell Anatomy 0.000 description 8
- 208000035475 disorder Diseases 0.000 description 8
- 108090001005 Interleukin-6 Proteins 0.000 description 7
- 102000004889 Interleukin-6 Human genes 0.000 description 7
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 7
- 230000004438 eyesight Effects 0.000 description 7
- 210000003958 hematopoietic stem cell Anatomy 0.000 description 7
- 210000002540 macrophage Anatomy 0.000 description 7
- 239000000047 product Substances 0.000 description 7
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 7
- 101000611183 Homo sapiens Tumor necrosis factor Proteins 0.000 description 6
- 206010025421 Macule Diseases 0.000 description 6
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 6
- 201000007737 Retinal degeneration Diseases 0.000 description 6
- 102100040247 Tumor necrosis factor Human genes 0.000 description 6
- 230000002159 abnormal effect Effects 0.000 description 6
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 6
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 6
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 6
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 6
- 239000012472 biological sample Substances 0.000 description 6
- 230000006870 function Effects 0.000 description 6
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 6
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 6
- 230000004258 retinal degeneration Effects 0.000 description 6
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 6
- 208000001344 Macular Edema Diseases 0.000 description 5
- 206010025415 Macular oedema Diseases 0.000 description 5
- 101000897464 Mus musculus C-C motif chemokine 2 Proteins 0.000 description 5
- 238000013355 OIR mouse model Methods 0.000 description 5
- 208000007135 Retinal Neovascularization Diseases 0.000 description 5
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 5
- 238000011161 development Methods 0.000 description 5
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 5
- 206010012601 diabetes mellitus Diseases 0.000 description 5
- 201000010230 macular retinal edema Diseases 0.000 description 5
- 230000035899 viability Effects 0.000 description 5
- 230000004393 visual impairment Effects 0.000 description 5
- NLXLAEXVIDQMFP-UHFFFAOYSA-N Ammonia chloride Chemical compound [NH4+].[Cl-] NLXLAEXVIDQMFP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 206010003694 Atrophy Diseases 0.000 description 4
- 208000005590 Choroidal Neovascularization Diseases 0.000 description 4
- 206010060823 Choroidal neovascularisation Diseases 0.000 description 4
- 101000897480 Homo sapiens C-C motif chemokine 2 Proteins 0.000 description 4
- 206010053648 Vascular occlusion Diseases 0.000 description 4
- 230000037444 atrophy Effects 0.000 description 4
- -1 bone marrow Substances 0.000 description 4
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 4
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 4
- 125000002485 formyl group Chemical class [H]C(*)=O 0.000 description 4
- 239000008187 granular material Substances 0.000 description 4
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 4
- 239000007925 intracardiac injection Substances 0.000 description 4
- 206010023332 keratitis Diseases 0.000 description 4
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 4
- 230000004770 neurodegeneration Effects 0.000 description 4
- 230000001575 pathological effect Effects 0.000 description 4
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 4
- 230000009885 systemic effect Effects 0.000 description 4
- 208000021331 vascular occlusion disease Diseases 0.000 description 4
- 238000011746 C57BL/6J (JAX™ mouse strain) Methods 0.000 description 3
- 208000032843 Hemorrhage Diseases 0.000 description 3
- 101000669447 Homo sapiens Toll-like receptor 4 Proteins 0.000 description 3
- 102000005482 Lipopolysaccharide Receptors Human genes 0.000 description 3
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 3
- 208000001140 Night Blindness Diseases 0.000 description 3
- 102100039360 Toll-like receptor 4 Human genes 0.000 description 3
- 208000025865 Ulcer Diseases 0.000 description 3
- 230000035605 chemotaxis Effects 0.000 description 3
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 3
- 102000046768 human CCL2 Human genes 0.000 description 3
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 3
- 238000000099 in vitro assay Methods 0.000 description 3
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 3
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 3
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 3
- 238000010172 mouse model Methods 0.000 description 3
- 208000015122 neurodegenerative disease Diseases 0.000 description 3
- 230000000704 physical effect Effects 0.000 description 3
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 3
- 230000000750 progressive effect Effects 0.000 description 3
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 3
- 230000000069 prophylactic effect Effects 0.000 description 3
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 3
- 210000003583 retinal pigment epithelium Anatomy 0.000 description 3
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 3
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 3
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 3
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 3
- 231100000397 ulcer Toxicity 0.000 description 3
- OZFAFGSSMRRTDW-UHFFFAOYSA-N (2,4-dichlorophenyl) benzenesulfonate Chemical compound ClC1=CC(Cl)=CC=C1OS(=O)(=O)C1=CC=CC=C1 OZFAFGSSMRRTDW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102100032912 CD44 antigen Human genes 0.000 description 2
- 239000012591 Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline Substances 0.000 description 2
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 208000008069 Geographic Atrophy Diseases 0.000 description 2
- 201000002563 Histoplasmosis Diseases 0.000 description 2
- 101000868273 Homo sapiens CD44 antigen Proteins 0.000 description 2
- 101001046686 Homo sapiens Integrin alpha-M Proteins 0.000 description 2
- 102100022338 Integrin alpha-M Human genes 0.000 description 2
- 206010065630 Iris neovascularisation Diseases 0.000 description 2
- 102100027754 Mast/stem cell growth factor receptor Kit Human genes 0.000 description 2
- 206010062207 Mycobacterial infection Diseases 0.000 description 2
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 2
- 108010014608 Proto-Oncogene Proteins c-kit Proteins 0.000 description 2
- 102000016971 Proto-Oncogene Proteins c-kit Human genes 0.000 description 2
- 206010038848 Retinal detachment Diseases 0.000 description 2
- 206010057430 Retinal injury Diseases 0.000 description 2
- 208000014139 Retinal vascular disease Diseases 0.000 description 2
- 206010045178 Tunnel vision Diseases 0.000 description 2
- 230000002411 adverse Effects 0.000 description 2
- 235000019270 ammonium chloride Nutrition 0.000 description 2
- 230000001772 anti-angiogenic effect Effects 0.000 description 2
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 2
- 238000000149 argon plasma sintering Methods 0.000 description 2
- 208000021328 arterial occlusion Diseases 0.000 description 2
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 2
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- 230000000740 bleeding effect Effects 0.000 description 2
- 210000004204 blood vessel Anatomy 0.000 description 2
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 2
- 230000008859 change Effects 0.000 description 2
- 230000001684 chronic effect Effects 0.000 description 2
- 210000004087 cornea Anatomy 0.000 description 2
- 201000000159 corneal neovascularization Diseases 0.000 description 2
- 210000000805 cytoplasm Anatomy 0.000 description 2
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 2
- 210000004443 dendritic cell Anatomy 0.000 description 2
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 2
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 2
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 2
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 2
- 230000002757 inflammatory effect Effects 0.000 description 2
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 2
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 2
- 208000014674 injury Diseases 0.000 description 2
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 2
- 238000010253 intravenous injection Methods 0.000 description 2
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 2
- 208000018769 loss of vision Diseases 0.000 description 2
- 231100000864 loss of vision Toxicity 0.000 description 2
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 2
- 210000004379 membrane Anatomy 0.000 description 2
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 2
- 208000027531 mycobacterial infectious disease Diseases 0.000 description 2
- 210000000066 myeloid cell Anatomy 0.000 description 2
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 2
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 2
- 108091008695 photoreceptors Proteins 0.000 description 2
- 239000004033 plastic Substances 0.000 description 2
- 229920003023 plastic Polymers 0.000 description 2
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 description 2
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 description 2
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 description 2
- 230000002062 proliferating effect Effects 0.000 description 2
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 2
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 2
- 230000004044 response Effects 0.000 description 2
- 230000004264 retinal detachment Effects 0.000 description 2
- 239000000790 retinal pigment Substances 0.000 description 2
- 201000000306 sarcoidosis Diseases 0.000 description 2
- 208000007056 sickle cell anemia Diseases 0.000 description 2
- 208000011580 syndromic disease Diseases 0.000 description 2
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 2
- 208000006379 syphilis Diseases 0.000 description 2
- 238000007910 systemic administration Methods 0.000 description 2
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 2
- KBPHJBAIARWVSC-XQIHNALSSA-N trans-lutein Natural products CC(=C/C=C/C=C(C)/C=C/C=C(C)/C=C/C1=C(C)CC(O)CC1(C)C)C=CC=C(/C)C=CC2C(=CC(O)CC2(C)C)C KBPHJBAIARWVSC-XQIHNALSSA-N 0.000 description 2
- 230000006459 vascular development Effects 0.000 description 2
- JKQXZKUSFCKOGQ-JLGXGRJMSA-N (3R,3'R)-beta,beta-carotene-3,3'-diol Chemical compound C([C@H](O)CC=1C)C(C)(C)C=1/C=C/C(/C)=C/C=C/C(/C)=C/C=C/C=C(C)C=CC=C(C)C=CC1=C(C)C[C@@H](O)CC1(C)C JKQXZKUSFCKOGQ-JLGXGRJMSA-N 0.000 description 1
- 102100031585 ADP-ribosyl cyclase/cyclic ADP-ribose hydrolase 1 Human genes 0.000 description 1
- 101000640990 Arabidopsis thaliana Tryptophan-tRNA ligase, chloroplastic/mitochondrial Proteins 0.000 description 1
- 206010003645 Atopy Diseases 0.000 description 1
- 102100024222 B-lymphocyte antigen CD19 Human genes 0.000 description 1
- 238000011731 BALB/cByJ (JAX™ mouse strain) Methods 0.000 description 1
- 208000009137 Behcet syndrome Diseases 0.000 description 1
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 1
- 229940124294 CD33 monoclonal antibody Drugs 0.000 description 1
- 102000049320 CD36 Human genes 0.000 description 1
- 108010045374 CD36 Antigens Proteins 0.000 description 1
- 101100289995 Caenorhabditis elegans mac-1 gene Proteins 0.000 description 1
- 241000282472 Canis lupus familiaris Species 0.000 description 1
- 102100025470 Carcinoembryonic antigen-related cell adhesion molecule 8 Human genes 0.000 description 1
- 208000009043 Chemical Burns Diseases 0.000 description 1
- 208000002691 Choroiditis Diseases 0.000 description 1
- 108010062580 Concanavalin A Proteins 0.000 description 1
- 206010055665 Corneal neovascularisation Diseases 0.000 description 1
- 206010012688 Diabetic retinal oedema Diseases 0.000 description 1
- 206010014476 Elevated cholesterol Diseases 0.000 description 1
- 241000282326 Felis catus Species 0.000 description 1
- 102000002702 GPI-Linked Proteins Human genes 0.000 description 1
- 241000287828 Gallus gallus Species 0.000 description 1
- 102100035716 Glycophorin-A Human genes 0.000 description 1
- 239000012981 Hank's balanced salt solution Substances 0.000 description 1
- 208000028782 Hereditary disease Diseases 0.000 description 1
- 208000009889 Herpes Simplex Diseases 0.000 description 1
- 208000007514 Herpes zoster Diseases 0.000 description 1
- 102100026122 High affinity immunoglobulin gamma Fc receptor I Human genes 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- 101000777636 Homo sapiens ADP-ribosyl cyclase/cyclic ADP-ribose hydrolase 1 Proteins 0.000 description 1
- 101000980825 Homo sapiens B-lymphocyte antigen CD19 Proteins 0.000 description 1
- 101000914320 Homo sapiens Carcinoembryonic antigen-related cell adhesion molecule 8 Proteins 0.000 description 1
- 101001074244 Homo sapiens Glycophorin-A Proteins 0.000 description 1
- 101000913074 Homo sapiens High affinity immunoglobulin gamma Fc receptor I Proteins 0.000 description 1
- 101000935040 Homo sapiens Integrin beta-2 Proteins 0.000 description 1
- 101000917858 Homo sapiens Low affinity immunoglobulin gamma Fc region receptor III-A Proteins 0.000 description 1
- 101000917839 Homo sapiens Low affinity immunoglobulin gamma Fc region receptor III-B Proteins 0.000 description 1
- 101000934372 Homo sapiens Macrosialin Proteins 0.000 description 1
- 101000581981 Homo sapiens Neural cell adhesion molecule 1 Proteins 0.000 description 1
- 101000738771 Homo sapiens Receptor-type tyrosine-protein phosphatase C Proteins 0.000 description 1
- 101000884271 Homo sapiens Signal transducer CD24 Proteins 0.000 description 1
- 208000035150 Hypercholesterolemia Diseases 0.000 description 1
- 206010020649 Hyperkeratosis Diseases 0.000 description 1
- 206010058490 Hyperoxia Diseases 0.000 description 1
- 206010021143 Hypoxia Diseases 0.000 description 1
- 101150101999 IL6 gene Proteins 0.000 description 1
- 108091058560 IL8 Proteins 0.000 description 1
- 206010061218 Inflammation Diseases 0.000 description 1
- 108090000723 Insulin-Like Growth Factor I Proteins 0.000 description 1
- 102100025390 Integrin beta-2 Human genes 0.000 description 1
- 102000008070 Interferon-gamma Human genes 0.000 description 1
- 108010074328 Interferon-gamma Proteins 0.000 description 1
- 102000003777 Interleukin-1 beta Human genes 0.000 description 1
- 108090000193 Interleukin-1 beta Proteins 0.000 description 1
- 206010022557 Intermediate uveitis Diseases 0.000 description 1
- 208000007766 Kaposi sarcoma Diseases 0.000 description 1
- 108090001090 Lectins Proteins 0.000 description 1
- 102000004856 Lectins Human genes 0.000 description 1
- 102100029185 Low affinity immunoglobulin gamma Fc region receptor III-B Human genes 0.000 description 1
- 208000016604 Lyme disease Diseases 0.000 description 1
- 102100025136 Macrosialin Human genes 0.000 description 1
- 206010025412 Macular dystrophy congenital Diseases 0.000 description 1
- 102000018697 Membrane Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010052285 Membrane Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000014962 Monocyte Chemoattractant Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010064136 Monocyte Chemoattractant Proteins Proteins 0.000 description 1
- 241000204801 Muraenidae Species 0.000 description 1
- 101001065556 Mus musculus Lymphocyte antigen 6G Proteins 0.000 description 1
- 241000428199 Mustelinae Species 0.000 description 1
- 206010029113 Neovascularisation Diseases 0.000 description 1
- 108010025020 Nerve Growth Factor Proteins 0.000 description 1
- 102000015336 Nerve Growth Factor Human genes 0.000 description 1
- 206010056677 Nerve degeneration Diseases 0.000 description 1
- 208000028389 Nerve injury Diseases 0.000 description 1
- 102100027347 Neural cell adhesion molecule 1 Human genes 0.000 description 1
- 102000004230 Neurotrophin 3 Human genes 0.000 description 1
- 108090000742 Neurotrophin 3 Proteins 0.000 description 1
- 102000003683 Neurotrophin-4 Human genes 0.000 description 1
- 108090000099 Neurotrophin-4 Proteins 0.000 description 1
- 206010030113 Oedema Diseases 0.000 description 1
- 241000906034 Orthops Species 0.000 description 1
- 208000010191 Osteitis Deformans Diseases 0.000 description 1
- 208000027868 Paget disease Diseases 0.000 description 1
- 241001494479 Pecora Species 0.000 description 1
- 102100024616 Platelet endothelial cell adhesion molecule Human genes 0.000 description 1
- 208000003971 Posterior uveitis Diseases 0.000 description 1
- 206010036590 Premature baby Diseases 0.000 description 1
- 208000002158 Proliferative Vitreoretinopathy Diseases 0.000 description 1
- 208000010362 Protozoan Infections Diseases 0.000 description 1
- 201000002154 Pterygium Diseases 0.000 description 1
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 1
- 102100037422 Receptor-type tyrosine-protein phosphatase C Human genes 0.000 description 1
- 206010038934 Retinopathy proliferative Diseases 0.000 description 1
- 206010039705 Scleritis Diseases 0.000 description 1
- 208000034189 Sclerosis Diseases 0.000 description 1
- 206010039897 Sedation Diseases 0.000 description 1
- 102100038081 Signal transducer CD24 Human genes 0.000 description 1
- 102000013275 Somatomedins Human genes 0.000 description 1
- 241000282887 Suidae Species 0.000 description 1
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 101150052863 THY1 gene Proteins 0.000 description 1
- 102000002689 Toll-like receptor Human genes 0.000 description 1
- 108020000411 Toll-like receptor Proteins 0.000 description 1
- 201000005485 Toxoplasmosis Diseases 0.000 description 1
- 206010052779 Transplant rejections Diseases 0.000 description 1
- 102100034300 Tryptophan-tRNA ligase, cytoplasmic Human genes 0.000 description 1
- 206010046851 Uveitis Diseases 0.000 description 1
- 208000024248 Vascular System injury Diseases 0.000 description 1
- 208000012339 Vascular injury Diseases 0.000 description 1
- 241000251539 Vertebrata <Metazoa> Species 0.000 description 1
- 208000010011 Vitamin A Deficiency Diseases 0.000 description 1
- 206010047663 Vitritis Diseases 0.000 description 1
- 208000027418 Wounds and injury Diseases 0.000 description 1
- JKQXZKUSFCKOGQ-LQFQNGICSA-N Z-zeaxanthin Natural products C([C@H](O)CC=1C)C(C)(C)C=1C=CC(C)=CC=CC(C)=CC=CC=C(C)C=CC=C(C)C=CC1=C(C)C[C@@H](O)CC1(C)C JKQXZKUSFCKOGQ-LQFQNGICSA-N 0.000 description 1
- QOPRSMDTRDMBNK-RNUUUQFGSA-N Zeaxanthin Natural products CC(=C/C=C/C=C(C)/C=C/C=C(C)/C=C/C1=C(C)CCC(O)C1(C)C)C=CC=C(/C)C=CC2=C(C)CC(O)CC2(C)C QOPRSMDTRDMBNK-RNUUUQFGSA-N 0.000 description 1
- 230000005856 abnormality Effects 0.000 description 1
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 1
- 208000038018 age-related macular disease Diseases 0.000 description 1
- 230000002776 aggregation Effects 0.000 description 1
- 238000004220 aggregation Methods 0.000 description 1
- 239000000556 agonist Substances 0.000 description 1
- JKQXZKUSFCKOGQ-LOFNIBRQSA-N all-trans-Zeaxanthin Natural products CC(=C/C=C/C=C(C)/C=C/C=C(C)/C=C/C1=C(C)CC(O)CC1(C)C)C=CC=C(/C)C=CC2=C(C)CC(O)CC2(C)C JKQXZKUSFCKOGQ-LOFNIBRQSA-N 0.000 description 1
- VREFGVBLTWBCJP-UHFFFAOYSA-N alprazolam Chemical compound C12=CC(Cl)=CC=C2N2C(C)=NN=C2CN=C1C1=CC=CC=C1 VREFGVBLTWBCJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- 230000002491 angiogenic effect Effects 0.000 description 1
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 1
- 230000002424 anti-apoptotic effect Effects 0.000 description 1
- 239000003529 anticholesteremic agent Substances 0.000 description 1
- 229940127226 anticholesterol agent Drugs 0.000 description 1
- 239000003146 anticoagulant agent Substances 0.000 description 1
- 229940127219 anticoagulant drug Drugs 0.000 description 1
- 239000003963 antioxidant agent Substances 0.000 description 1
- 235000006708 antioxidants Nutrition 0.000 description 1
- 210000002565 arteriole Anatomy 0.000 description 1
- 210000001130 astrocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000003140 astrocytic effect Effects 0.000 description 1
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 210000003651 basophil Anatomy 0.000 description 1
- 230000008827 biological function Effects 0.000 description 1
- 229920001222 biopolymer Polymers 0.000 description 1
- 239000010836 blood and blood product Substances 0.000 description 1
- 229940125691 blood product Drugs 0.000 description 1
- 210000002798 bone marrow cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 description 1
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 1
- 210000005252 bulbus oculi Anatomy 0.000 description 1
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 1
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 1
- 238000002659 cell therapy Methods 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 235000013330 chicken meat Nutrition 0.000 description 1
- 210000003161 choroid Anatomy 0.000 description 1
- 230000001886 ciliary effect Effects 0.000 description 1
- 238000010224 classification analysis Methods 0.000 description 1
- 238000012864 cross contamination Methods 0.000 description 1
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 1
- 238000004163 cytometry Methods 0.000 description 1
- 210000004395 cytoplasmic granule Anatomy 0.000 description 1
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 1
- 230000003412 degenerative effect Effects 0.000 description 1
- 230000001934 delay Effects 0.000 description 1
- 230000008021 deposition Effects 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 230000006866 deterioration Effects 0.000 description 1
- 201000011190 diabetic macular edema Diseases 0.000 description 1
- 235000013367 dietary fats Nutrition 0.000 description 1
- 238000011978 dissolution method Methods 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 230000004064 dysfunction Effects 0.000 description 1
- 230000002500 effect on skin Effects 0.000 description 1
- 210000002257 embryonic structure Anatomy 0.000 description 1
- 238000000295 emission spectrum Methods 0.000 description 1
- 210000003979 eosinophil Anatomy 0.000 description 1
- 210000005081 epithelial layer Anatomy 0.000 description 1
- 230000005713 exacerbation Effects 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 210000000887 face Anatomy 0.000 description 1
- 230000002349 favourable effect Effects 0.000 description 1
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 description 1
- 230000001497 fibrovascular Effects 0.000 description 1
- 239000010419 fine particle Substances 0.000 description 1
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 1
- 238000005194 fractionation Methods 0.000 description 1
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 1
- 230000002538 fungal effect Effects 0.000 description 1
- 229940044627 gamma-interferon Drugs 0.000 description 1
- 238000001415 gene therapy Methods 0.000 description 1
- 230000002518 glial effect Effects 0.000 description 1
- 150000004676 glycans Chemical class 0.000 description 1
- 108091005631 glycosylphosphatidylinositol-linked proteins Proteins 0.000 description 1
- 210000000224 granular leucocyte Anatomy 0.000 description 1
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- 239000008241 heterogeneous mixture Substances 0.000 description 1
- 208000013653 hyalitis Diseases 0.000 description 1
- 230000000222 hyperoxic effect Effects 0.000 description 1
- 230000007954 hypoxia Effects 0.000 description 1
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 1
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 1
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 1
- 238000002991 immunohistochemical analysis Methods 0.000 description 1
- 239000002955 immunomodulating agent Substances 0.000 description 1
- 229940121354 immunomodulator Drugs 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 208000000509 infertility Diseases 0.000 description 1
- 230000036512 infertility Effects 0.000 description 1
- 208000021267 infertility disease Diseases 0.000 description 1
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 description 1
- 208000017532 inherited retinal dystrophy Diseases 0.000 description 1
- 230000037041 intracellular level Effects 0.000 description 1
- 230000009545 invasion Effects 0.000 description 1
- YWXYYJSYQOXTPL-SLPGGIOYSA-N isosorbide mononitrate Chemical compound [O-][N+](=O)O[C@@H]1CO[C@@H]2[C@@H](O)CO[C@@H]21 YWXYYJSYQOXTPL-SLPGGIOYSA-N 0.000 description 1
- 239000002523 lectin Substances 0.000 description 1
- 206010024378 leukocytosis Diseases 0.000 description 1
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 1
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 1
- WLHQHAUOOXYABV-UHFFFAOYSA-N lornoxicam Chemical compound OC=1C=2SC(Cl)=CC=2S(=O)(=O)N(C)C=1C(=O)NC1=CC=CC=N1 WLHQHAUOOXYABV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010025135 lupus erythematosus Diseases 0.000 description 1
- 235000012680 lutein Nutrition 0.000 description 1
- 229960005375 lutein Drugs 0.000 description 1
- KBPHJBAIARWVSC-RGZFRNHPSA-N lutein Chemical compound C([C@H](O)CC=1C)C(C)(C)C=1\C=C\C(\C)=C\C=C\C(\C)=C\C=C\C=C(/C)\C=C\C=C(/C)\C=C\[C@H]1C(C)=C[C@H](O)CC1(C)C KBPHJBAIARWVSC-RGZFRNHPSA-N 0.000 description 1
- 239000001656 lutein Substances 0.000 description 1
- ORAKUVXRZWMARG-WZLJTJAWSA-N lutein Natural products CC(=C/C=C/C=C(C)/C=C/C=C(C)/C=C/C1=C(C)CCCC1(C)C)C=CC=C(/C)C=CC2C(=CC(O)CC2(C)C)C ORAKUVXRZWMARG-WZLJTJAWSA-N 0.000 description 1
- 210000003712 lysosome Anatomy 0.000 description 1
- 230000001868 lysosomic effect Effects 0.000 description 1
- 208000027202 mammary Paget disease Diseases 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 210000002901 mesenchymal stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000005012 migration Effects 0.000 description 1
- 238000013508 migration Methods 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 210000005087 mononuclear cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000002433 mononuclear leukocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000000877 morphologic effect Effects 0.000 description 1
- 238000011527 multiparameter analysis Methods 0.000 description 1
- 125000001446 muramyl group Chemical group N[C@@H](C=O)[C@@H](O[C@@H](C(=O)*)C)[C@H](O)[C@H](O)CO 0.000 description 1
- 210000003643 myeloid progenitor cell Anatomy 0.000 description 1
- 208000001491 myopia Diseases 0.000 description 1
- 230000004379 myopia Effects 0.000 description 1
- 230000001613 neoplastic effect Effects 0.000 description 1
- 208000021971 neovascular inflammatory vitreoretinopathy Diseases 0.000 description 1
- 230000008764 nerve damage Effects 0.000 description 1
- 229940053128 nerve growth factor Drugs 0.000 description 1
- 210000004498 neuroglial cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000002569 neuron Anatomy 0.000 description 1
- 229940032018 neurotrophin 3 Drugs 0.000 description 1
- 229940097998 neurotrophin 4 Drugs 0.000 description 1
- 230000002276 neurotropic effect Effects 0.000 description 1
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 1
- 210000000440 neutrophil Anatomy 0.000 description 1
- 230000000422 nocturnal effect Effects 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 210000001328 optic nerve Anatomy 0.000 description 1
- 150000002894 organic compounds Chemical class 0.000 description 1
- 239000011368 organic material Substances 0.000 description 1
- 238000006053 organic reaction Methods 0.000 description 1
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 1
- 230000005043 peripheral vision Effects 0.000 description 1
- PHEDXBVPIONUQT-RGYGYFBISA-N phorbol 13-acetate 12-myristate Chemical compound C([C@]1(O)C(=O)C(C)=C[C@H]1[C@@]1(O)[C@H](C)[C@H]2OC(=O)CCCCCCCCCCCCC)C(CO)=C[C@H]1[C@H]1[C@]2(OC(C)=O)C1(C)C PHEDXBVPIONUQT-RGYGYFBISA-N 0.000 description 1
- 229920003229 poly(methyl methacrylate) Polymers 0.000 description 1
- 239000004926 polymethyl methacrylate Substances 0.000 description 1
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 1
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 description 1
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 description 1
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 1
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 1
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 1
- 230000002028 premature Effects 0.000 description 1
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 1
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 1
- 230000002250 progressing effect Effects 0.000 description 1
- 230000006785 proliferative vitreoretinopathy Effects 0.000 description 1
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 description 1
- 238000011321 prophylaxis Methods 0.000 description 1
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 1
- 230000008929 regeneration Effects 0.000 description 1
- 238000011069 regeneration method Methods 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 230000004242 retinal defects Effects 0.000 description 1
- 208000032253 retinal ischemia Diseases 0.000 description 1
- 210000001210 retinal vessel Anatomy 0.000 description 1
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 1
- 206010039073 rheumatoid arthritis Diseases 0.000 description 1
- 201000004700 rosacea Diseases 0.000 description 1
- 230000037390 scarring Effects 0.000 description 1
- 230000036280 sedation Effects 0.000 description 1
- 238000004062 sedimentation Methods 0.000 description 1
- 230000000087 stabilizing effect Effects 0.000 description 1
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 1
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 description 1
- 230000002459 sustained effect Effects 0.000 description 1
- 230000008961 swelling Effects 0.000 description 1
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 description 1
- 238000012385 systemic delivery Methods 0.000 description 1
- 201000000596 systemic lupus erythematosus Diseases 0.000 description 1
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 description 1
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 1
- 230000008467 tissue growth Effects 0.000 description 1
- 238000011200 topical administration Methods 0.000 description 1
- 230000000699 topical effect Effects 0.000 description 1
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 1
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 102000027257 transmembrane receptors Human genes 0.000 description 1
- 108091008578 transmembrane receptors Proteins 0.000 description 1
- 238000002054 transplantation Methods 0.000 description 1
- 230000008733 trauma Effects 0.000 description 1
- 230000003827 upregulation Effects 0.000 description 1
- 230000006496 vascular abnormality Effects 0.000 description 1
- 208000019553 vascular disease Diseases 0.000 description 1
- 210000003556 vascular endothelial cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000006444 vascular growth Effects 0.000 description 1
- 210000005166 vasculature Anatomy 0.000 description 1
- 210000003462 vein Anatomy 0.000 description 1
- 230000004382 visual function Effects 0.000 description 1
- 238000012800 visualization Methods 0.000 description 1
- 235000019195 vitamin supplement Nutrition 0.000 description 1
- 201000007790 vitelliform macular dystrophy Diseases 0.000 description 1
- FJHBOVDFOQMZRV-XQIHNALSSA-N xanthophyll Natural products CC(=C/C=C/C=C(C)/C=C/C=C(C)/C=C/C1=C(C)CC(O)CC1(C)C)C=CC=C(/C)C=CC2C=C(C)C(O)CC2(C)C FJHBOVDFOQMZRV-XQIHNALSSA-N 0.000 description 1
- 235000010930 zeaxanthin Nutrition 0.000 description 1
- 239000001775 zeaxanthin Substances 0.000 description 1
- 229940043269 zeaxanthin Drugs 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
- C12N5/0602—Vertebrate cells
- C12N5/0634—Cells from the blood or the immune system
- C12N5/0645—Macrophages, e.g. Kuepfer cells in the liver; Monocytes
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
- A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/46—Cellular immunotherapy
- A61K39/461—Cellular immunotherapy characterised by the cell type used
- A61K39/4614—Monocytes; Macrophages
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/46—Cellular immunotherapy
- A61K39/462—Cellular immunotherapy characterized by the effect or the function of the cells
- A61K39/4622—Antigen presenting cells
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/46—Cellular immunotherapy
- A61K39/464—Cellular immunotherapy characterised by the antigen targeted or presented
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
- A61P27/02—Ophthalmic agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
- A61P27/02—Ophthalmic agents
- A61P27/06—Antiglaucoma agents or miotics
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
- A61P9/10—Drugs for disorders of the cardiovascular system for treating ischaemic or atherosclerotic diseases, e.g. antianginal drugs, coronary vasodilators, drugs for myocardial infarction, retinopathy, cerebrovascula insufficiency, renal arteriosclerosis
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
- A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
- A61K2035/124—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells the cells being hematopoietic, bone marrow derived or blood cells
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K2239/00—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K39/46
- A61K2239/31—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K39/46 characterized by the route of administration
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
- C12N2501/05—Adjuvants
- C12N2501/051—Lipid A (MPA, MPL)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
- C12N2501/05—Adjuvants
- C12N2501/052—Lipopolysaccharides [LPS]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
- C12N2501/20—Cytokines; Chemokines
- C12N2501/21—Chemokines, e.g. MIP-1, MIP-2, RANTES, MCP, PF-4
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N15/00—Investigating characteristics of particles; Investigating permeability, pore-volume or surface-area of porous materials
- G01N15/04—Investigating sedimentation of particle suspensions
- G01N15/042—Investigating sedimentation of particle suspensions by centrifuging and investigating centrifugates
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N15/00—Investigating characteristics of particles; Investigating permeability, pore-volume or surface-area of porous materials
- G01N15/10—Investigating individual particles
- G01N15/14—Optical investigation techniques, e.g. flow cytometry
- G01N15/149—Optical investigation techniques, e.g. flow cytometry specially adapted for sorting particles, e.g. by their size or optical properties
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N15/00—Investigating characteristics of particles; Investigating permeability, pore-volume or surface-area of porous materials
- G01N15/10—Investigating individual particles
- G01N15/14—Optical investigation techniques, e.g. flow cytometry
- G01N2015/1497—Particle shape
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Mycology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Ophthalmology & Optometry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Hematology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Vascular Medicine (AREA)
- Virology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Cardiology (AREA)
- Developmental Biology & Embryology (AREA)
- Heart & Thoracic Surgery (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
Abstract
본 발명은 다양한 안구 혈관 질환 또는 안구 변성 장애를 앓는 대상을 치료하기 위한 단리된 단핵구 집단의 이용 방법을 제공한다. 본 발명은 또한 실질적으로 순수한 단핵구 집단을 단리하는 신규한 방법을 제공한다. 상기 방법은 혈액 샘플 또는 골수 샘플을 대상으로부터 추출하는 단계, 적혈구를 샘플로부터 제거하는 단계, 및 그 후 샘플에서 나머지 적혈구 및 다른 세포 유형을 단핵구로부터 분리하는 단계를 수반한다. 임의의 선별 또는 표지화 물질을 사용하는 대신, 적혈구 및 다른 세포 유형은 단핵구로부터 그들의 크기, 입상도 또는 밀도에 기초하여 분리된다. 단리된 단핵구는 대상에게 투여되기에 앞서 시험관내에서 또는 생체외에서 추가로 활성화될 수 있다. 실질적으로 순수한 CD14+/CD33+ 단핵구를 함유하는 단리된 세포 집단이 또한 본 발명에서 제공된다.
Description
정부 지원에 대한 언급
본 발명은 일부가 미국 정부 지원으로 국립보건원 승인 번호 EY11254, EY14174 및 EY017540 에 의해 이루어졌다. 미국 정부는 그러므로 본 발명에 일정한 권리를 갖는다.
관련 출원에 대한 교차 참조
본 특허 출원은 미국 가 특허 출원 번호 61/208,173 (2009 년 2 월 20 일에 출원됨) 및 61/283,244 (2009 년 11 월 30 일에 출원됨) 에 대한 우선권을 주장한다. 우선 출원의 전체 공개 전문이 본원에 참조에 의해 모든 목적으로 포함된다.
발명의 배경
안구 혈관 질환 예컨대 연령 관련 황반 변성 (ARMD) 및 당뇨병 망막병증 (DR) 은 각각 비정상적 맥락막 또는 망막 혈관신생으로 인한 것이다. 이는 산업 국가에서 시각 상실의 주요 원인이다. 망막은 뉴런, 신경교, 및 혈관 구성요소들의 뚜렷한 층들로 이루어지므로, 비교적 작은 교란 예컨대 혈관 증식 또는 부종에서 나타나는 것들은 시각 기능의 상당한 상실을 초래할 수 있다. 유전성 망막 변성들, 예컨대 색소성 망막염 (RP) 이 또한 혈관 비정상, 예컨대 세동맥 협착 및 혈관 위축과 연관된다. 그들은 3500 개체 중 1 명에게 영향을 미치고, 진행성 야맹증, 시야 상실, 시신경 위축, 세동맥 감쇠, 및 종종 완전맹으로 진행하는 시각의 중심 상실이 특징이다. 혈관생성을 촉진하고 저해하는 인자들을 식별함에 있어서 상당한 진보가 이루어졌지만, 여전히 이들 망막 변성 질환의 진행을 둔화 또는 역전시키는 효과적인 치료는 존재하지 않는다.
다양한 안구 혈관 질환을 치료하고 예방하기 위한 더 나은 수단에 대한 필요가 당업계에 존재한다. 본 발명은 이러한 및 다른 필요를 지향한다.
발명의 요약
하나의 양상에서, 본 발명은 CD33 항원 및 CD14 항원을 발현하는 실질적으로 순수한 단핵구를 함유하는 단리된 세포 집단을 제공한다. 이들 일부의 단리된 세포 집단은 포유류 말초 혈액 샘플, 제대혈 샘플 또는 골수 샘플로부터 단리된다. 일부의 단리된 세포 집단은 인간 세포 또는 쥐과 세포로 이루어진다. 일부의 단리된 세포 집단에서, 70%, 80% 또는 90% 이상의 세포가 표면 마커 CD14 및 CD33 을 발현한다. 일부의 단리된 세포 집단은 CD34 를 발현하는 세포를 함유하지 않는다. 일부의 단리된 세포 집단에는 ALDHbr 세포가 실질적으로 없다. 단리된 세포 집단은 시험관내에서 또는 생체외에서 추가로 활성화될 수 있다. 이는 임의의 단핵구 활성화 화합물, 예를 들어, LPS, MPLA, 또는 MCP-1 로 달성될 수 있다.
또다른 양상에서, 본 발명은 안구 혈관 장애의 치료 방법을 제공한다. 상기 방법은 안구 혈관 장애를 앓는 대상에게 단리된 단핵구 집단을 안구 혈관 장애를 치료 또는 개선하기에 충분한 양으로 투여하는 것을 포함한다. 바람직하게는, 단핵구 집단은 대상으로부터의 혈액 샘플 또는 골수 샘플로부터 단리된다. 일부 바람직한 구현예에서, 상기 방법으로 치료될 대상은 인간이다. 상기 방법의 일부에서, 단핵구 집단은 실질적으로 순수한 CD14+/CD33+ 세포를 포함한다. 예를 들어, 단리된 단핵구 집단 중 80% 이상의 세포가 CD14+/CD33+ 이다. 일부 방법에서, 단리된 단핵구 집단은 대상에게 투여되기에 앞서 시험관내에서 또는 생체외에서 활성화된다. 단핵구를 활성화시킬 수 있는 것으로 알려진 임의의 화합물이 이들 구현예에서 사용될 수 있다. 예를 들어, 단리된 단핵구 세포는 LPS, MPLA, 또는 MCP-1 로 활성화될 수 있다. 일부 방법에서, 미처리된 단핵구 집단 (또는 시험관내에서 또는 생체외에서 활성화된 단핵구 집단) 은 대상에게 상기 단핵구 활성화 화합물과 함께 동시투여된다.
많은 안구 혈관 장애가 본 발명의 방법으로 치료될 수 있다. 그 예는 허혈성 망막병증, 당뇨병 망막병증, 미숙아 망막병증, 신생혈관 녹내장, 중심 망막 정맥 폐쇄, 망막 부종, 황반 변성 및 색소성 망막염이다. 일부 방법에서, 단리된 단핵구 집단은 대상에게 국소 경로를 통해, 예를 들어, 유리체내 주사를 통해 투여된다. 일부 다른 방법에서, 단핵구 집단은 대상에게 전신 경로를 통해, 예를 들어, 정맥내 주사를 통해 투여된다.
관련된 양상에서, 본 발명은 대상에서 안구 질환을 치료 또는 개선하는 다른 방법을 제공한다. 이들 방법은 하기 단계를 수반한다: (i) 안구 혈관 질환을 갖는 대상의 혈액 샘플 또는 골수 샘플로부터 실질적으로 순수한 단핵구 집단을 단리하는 단계; 및 (ii) 단리된 단핵구 집단을 대상에게 안구 혈관 질환을 치료 또는 개선하기에 충분한 양으로 투여하는 단계. 이들 방법의 일부는 세포를 대상에게 투여하기에 앞서 단리된 단핵구 집단을 생체외에서 활성화시키는 단계를 부가적으로 수반한다. 단핵구를 활성화시킬 수 있는 것으로 알려진 임의의 화합물이 이들 구현예에서 사용될 수 있다. 예를 들어, 단리된 단핵구 세포는 LPS, MPLA, 또는 MCP-1 로 활성화될 수 있다. 일부 다른 구현예에서, 단리된 단핵구 집단은,추가로 생체외에서 활성화시키거나 활성화시키지 않고, 대상에게 단핵구 활성화 화합물과 함께 동시투여된다.
전형적으로는, 이들 방법에서 사용되는 단핵구 집단은 실질적으로 순수한 CD14+/CD33+ 세포를 함유한다. 바람직하게는, 단리된 단핵구 집단 중 약 80% 이상의 세포가 표면 마커 CD33 및 CD14 를 발현한다. 일부 방법에서, 단핵구 집단은 하기 단계에 의해 단리된다: (i) 적혈구를 샘플로부터 제거하는 단계; 및 (ii) 샘플에서 나머지 적혈구 및 다른 세포 유형을 단핵구로부터 그들의 크기, 입상도 또는 밀도에 기초하여 분리하는 단계. 이들 방법의 일부에서, 나머지 적혈구 및 다른 세포 유형은 단핵구로부터 밀도 원심분리 또는 형광-활성화 세포 분류 (FACS) 에 의해 분리된다. 이들 방법으로 치료하기에 적합한 안구 질환 또는 장애는 허혈성 망막병증, 당뇨병 망막병증, 미숙아 망막병증, 신생혈관 녹내장, 중심 망막 정맥 폐쇄, 황반 변성 및 색소성 망막염을 포함한다.
또다른 양상에서, 본 발명은 실질적으로 순수한 단핵구 집단을 단리하는 방법을 제공한다. 상기 방법은 하기 단계를 포함한다: (i) 대상으로부터 혈액 샘플 또는 골수 샘플을 제공하는 단계; (ii) 적혈구를 샘플로부터 제거하는 단계; 및 (iii) 샘플에서 나머지 적혈구 및 다른 세포 유형 (혈소판, 과립구 및 림프구) 을 단핵구로부터 분리하는 단계. 상기 방법의 일부에서, 나머지 적혈구 및 다른 세포 유형은 단핵구로부터 그들의 크기, 입상도 또는 밀도에 기초하여 분리된다. 상기 방법의 일부에서, 나머지 적혈구 및 다른 세포 유형은 단핵구로부터 밀도 원심분리 또는 형광-활성화 세포 분류 (FACS) 에 의해 분리된다. 이들 방법에서, 적혈구는 헤스판 (Hespan) 분별 원심분리 또는 피콜 (Ficoll) 밀도 구배 원심분리에 의해 제거될 수 있다. 이들 방법은 단리된 세포 집단을 표면 마커 CD14 및 CD33 의 발현에 대해 검정하는 단계를 부가적으로 포함할 수 있다.
본 발명의 본질 및 이점은 명세서의 나머지 부분 및 청구항을 참조하여 추가로 이해될 수 있다.
도 1A-1B 는 단리된 단핵구 집단의 특성 및 치료적 활성을 보여준다. (A) 림프구와 구별되는 단핵구 (선 내부) 의 집단을 보여주는 유세포측정 플롯. 이들 집단을 구별하는데 표지를 사용하지 않았다. (B) 마우스 산소-유도성 망막병증 모델로부터 수득된 데이타로서, 기술된 방식으로 단리된 인간 말초 혈액 (HuPB) 단핵구가 신생혈관 다발 면적 (검은색 막대) 뿐만 아니라 혈관 폐색 (흰색 막대) 을 비히클 주사에 비해 현저히 감소시킴을 입증한다. 이들 결과는 양성 대조군으로서 사용된 마우스 골수-유래 CD44hi 세포와 유사했다.
도 2A-2B 는 밀도 원심분리에 의해 생성된 분획의 유세포측정 분석으로부터의 결과를 보여준다. 데이타는 샘플에 CD2+/CD3+ 림프구 (A) 가 고갈되어 있고 CD14+/CD33+ 단핵구 (B) 가 풍부함을 보여준다.
도 3 은 말초 혈액의 ALDH 표지화로부터의 결과를 보여주며, 무시해도 될 정도의 ALDHbr/SSC 집단을 나타낸다.
도 4 는 단리된 세포 집단 중 표적 CD14+ 단핵구 (왼쪽 위) 에 비해 소수의 CD34+ 세포 (오른쪽 위) 가 존재함을 나타내는 유세포측정 분석으로부터의 결과를 보여준다.
도 5 는 상기 기술된 광 산란 특성에 기초하여 선별된 인간 말초 혈액 단핵구 또는 림프구의 분류 후 분석을 보여준다. 단핵구 분획은 ~88% CD14+ 세포로 이루어지는 한편, 림프구 집단은 CD14+ 세포를 거의 함유하지 않는 것으로 보인다. 또한 CD11b 및 CD33 의 분석은 단핵구 분획에서 이들 미엘로이드 마커 둘다가 고도로 발현되고 림프구 분획에서 양성 세포가 적음을 보여준다.
도 6 은 단핵구 (Mono) 의 이주가 MCP-1 에 반응하여 투여량-의존적으로 증가함을 보여주는 시험관내 주화성 검정의 결과를 나타낸다. 림프구 (Lympho) 는 MCP-1 에 반응하는데 실패했다. 단핵구를 함유하는 마우스 CD44hi 골수 세포 (CD44Hi) 도 또한 MCP-1 에 반응했다.
도 7 은 증가하는 수의 단핵구가 미처리된 세포 배양 플라스틱에 부착하는 능력을 입증하는 시험관내 차등적 부착 검정 (differential adhesion assay) 을 보여준다. 림프구는 동일한 기질에 상당한 수로 부착할 수 없었다.
도 8 은 심장내 주사 후 5 일 뒤 망막 중 GFP-발현 세포의 존재를 나타내는 망막 전재 (whole mount) 로부터의 이미지를 보여준다. 과산소에의 노출을 통해 망막에서 손상이 일어났다.
도 9 는 LPS-처리된 단핵구-풍부 F5 세포 (ActF5) 로부터 분비된 사이토카인의 세포측정 비드 배열 (cytometric bead array) (CBA) 분석을 보여준다. 데이타는 LPS 자극 후 IL-1베타, Il-6, IL-8 및 TNF 의 증가된 분비를 보여줬다. 각각의 사이토카인에 대해, 약 ED50 이 매질에 존재하는 단백질의 양 및 생물학적 활성에 대한 참조로서 제시되어 있다. 단위는 pg/㎖ 이다.
도 10 은 LPS, MPLA 또는 마우스 MCP-1 과 1 hr 또는 4 hr 동안 인큐베이션한 후 사이토카인의 분비가 증가되었음을 입증하는 세포측정 비드 배열 데이타를 보여준다. LPS 및 MPLA 의 2 개의 농도가 나타나 있다. 값은 처리된 (활성화된) 세포 대 미처리된 (대조군) 세포의 비를 나타낸다.
도 11 은 상이한 농도의 LPS, 마우스 MCP-1, 인간 MCP-1 및 MPLA 로 4h 및 19h 자극 후 세포측정 비드 배열 데이타를 보여준다. 19h 시점은 LPS 및 MPLA 에 더하여, 마우스 및 인간 MCP-1 도 또한 더 낮은 수준에서도 IL-8 및 IL-6 의 분비를 자극함을 보여준다.
도 12 는 마우스 OIR 모델에서 정상적 및 당뇨병 공여체 둘다로부터의 활성화된 단핵구-풍부 분획 5 (F5) 가 비활성화된 F5 또는 다른 분획보다 더욱 효과적으로 혈관 복구를 촉진함을 보여준다. 나타난 데이타는 혈관 폐색이 10,000 제곱 마이크론 미만인 처리 군 내의 망막의 백분율이다.
도 2A-2B 는 밀도 원심분리에 의해 생성된 분획의 유세포측정 분석으로부터의 결과를 보여준다. 데이타는 샘플에 CD2+/CD3+ 림프구 (A) 가 고갈되어 있고 CD14+/CD33+ 단핵구 (B) 가 풍부함을 보여준다.
도 3 은 말초 혈액의 ALDH 표지화로부터의 결과를 보여주며, 무시해도 될 정도의 ALDHbr/SSC 집단을 나타낸다.
도 4 는 단리된 세포 집단 중 표적 CD14+ 단핵구 (왼쪽 위) 에 비해 소수의 CD34+ 세포 (오른쪽 위) 가 존재함을 나타내는 유세포측정 분석으로부터의 결과를 보여준다.
도 5 는 상기 기술된 광 산란 특성에 기초하여 선별된 인간 말초 혈액 단핵구 또는 림프구의 분류 후 분석을 보여준다. 단핵구 분획은 ~88% CD14+ 세포로 이루어지는 한편, 림프구 집단은 CD14+ 세포를 거의 함유하지 않는 것으로 보인다. 또한 CD11b 및 CD33 의 분석은 단핵구 분획에서 이들 미엘로이드 마커 둘다가 고도로 발현되고 림프구 분획에서 양성 세포가 적음을 보여준다.
도 6 은 단핵구 (Mono) 의 이주가 MCP-1 에 반응하여 투여량-의존적으로 증가함을 보여주는 시험관내 주화성 검정의 결과를 나타낸다. 림프구 (Lympho) 는 MCP-1 에 반응하는데 실패했다. 단핵구를 함유하는 마우스 CD44hi 골수 세포 (CD44Hi) 도 또한 MCP-1 에 반응했다.
도 7 은 증가하는 수의 단핵구가 미처리된 세포 배양 플라스틱에 부착하는 능력을 입증하는 시험관내 차등적 부착 검정 (differential adhesion assay) 을 보여준다. 림프구는 동일한 기질에 상당한 수로 부착할 수 없었다.
도 8 은 심장내 주사 후 5 일 뒤 망막 중 GFP-발현 세포의 존재를 나타내는 망막 전재 (whole mount) 로부터의 이미지를 보여준다. 과산소에의 노출을 통해 망막에서 손상이 일어났다.
도 9 는 LPS-처리된 단핵구-풍부 F5 세포 (ActF5) 로부터 분비된 사이토카인의 세포측정 비드 배열 (cytometric bead array) (CBA) 분석을 보여준다. 데이타는 LPS 자극 후 IL-1베타, Il-6, IL-8 및 TNF 의 증가된 분비를 보여줬다. 각각의 사이토카인에 대해, 약 ED50 이 매질에 존재하는 단백질의 양 및 생물학적 활성에 대한 참조로서 제시되어 있다. 단위는 pg/㎖ 이다.
도 10 은 LPS, MPLA 또는 마우스 MCP-1 과 1 hr 또는 4 hr 동안 인큐베이션한 후 사이토카인의 분비가 증가되었음을 입증하는 세포측정 비드 배열 데이타를 보여준다. LPS 및 MPLA 의 2 개의 농도가 나타나 있다. 값은 처리된 (활성화된) 세포 대 미처리된 (대조군) 세포의 비를 나타낸다.
도 11 은 상이한 농도의 LPS, 마우스 MCP-1, 인간 MCP-1 및 MPLA 로 4h 및 19h 자극 후 세포측정 비드 배열 데이타를 보여준다. 19h 시점은 LPS 및 MPLA 에 더하여, 마우스 및 인간 MCP-1 도 또한 더 낮은 수준에서도 IL-8 및 IL-6 의 분비를 자극함을 보여준다.
도 12 는 마우스 OIR 모델에서 정상적 및 당뇨병 공여체 둘다로부터의 활성화된 단핵구-풍부 분획 5 (F5) 가 비활성화된 F5 또는 다른 분획보다 더욱 효과적으로 혈관 복구를 촉진함을 보여준다. 나타난 데이타는 혈관 폐색이 10,000 제곱 마이크론 미만인 처리 군 내의 망막의 백분율이다.
발명의 상세한 설명
I. 개관
본 발명은 안구 혈관 질환 또는 변성 장애의 치료 또는 개선에 유용한 단핵구 세포의 단리된 및 실질적으로 순수한 집단에 관한 것이다. 하기 실시예에서 기술된 바와 같이, 본 발명자들에 의해 단리된 단핵구 집단은 실질적으로 순수한 CD14+/CD33+ 단핵구를 함유한다. 단리된 단핵구 집단은 눈 질환 모델에서 조사된 바와 같이 혈관 복구를 촉진하는 활성을 보유한다. 또한 단핵구 집단은 AldeFluor Bright 표지화의 결여 및 CD34+ 세포에 독립적인 그들의 치료적 활성에 의해 증명되는 바와 같이, 임상적 용도의 다른 알려진 조혈 세포 집단과 구별된다. 또한, 일부의 단리된 세포 집단은 CD34- 이고/거나 알데히드 데히드로나제를 높은 수준으로 발현하는 세포 (ALDHbr 세포) 를 매우 적은 양으로 함유하는 것이 특징이다. 게다가, 본 발명자들은 단리된 단핵구 집단의 일부가 생체외에서 활성화되었을 때 혈관 복구를 촉진하는 능력이 증강되었음을 발견했다. 마지막으로, 망막 혈관 장애가 있는 공여체로부터 단리된 단핵구는 또한 정상적 공여체로부터 단리된 세포와 유사하게 허혈성 망막병증의 마우스 모델에서 생체외에서 활성화될 수 있고 혈관 복구를 촉진할 수 있음이 관찰되었다. 이들 발견은 치료적으로 활성인 단핵구 집단이 망막 혈관 장애를 자가 방식으로 치료하는데 이용될 수 있음을 추가로 지지한다.
본 발명자들은 또한 신생혈관 눈 질환 예컨대 황반 변성 및 당뇨병 망막병증을 치료하기 위한 단핵구 집단의 신규한 단리 절차를 개발했다. 생물 샘플 예컨대 골수, 말초 혈액 또는 제대혈을 이용하는 상기 방법은 표적 세포 집단의 물리적 특성에 의존하며, 선별 물질 예컨대 단핵구의 표면 항원을 특이적으로 인식하는 항체에 대한 필요를 없앤다. 표면 결합된 이종 물질 예컨대 항체가 결여되므로, 이들 방법으로 단리된 세포 집단은 치료적 용도에 더욱 바람직하다. 이들 단핵구 제제의 순도 및 활성을 입증하기 위해 일련의 시험관내 검정이 수행되었다. 또한, 본원에서 개시된 방법을 사용하여 단리된 단핵구 집단이 허혈성 망막병증의 모델에서 원하는 치료적 활성을 보유함이 밝혀졌다.
이들 발견에 따라서, 본 발명은 치료적으로 효과적인 단리된 또는 실질적으로 정제된 단핵구 집단을 제공한다. 본 발명은 또한 그러한 단핵구 집단을 단리하는 신규한 방법을 제공한다. 본 발명은 추가로 이상 안구 혈관화와 관련되거나 이에 의해 매개되는 질환 또는 장애를 치료 또는 개선하는 방법을 제공한다. 또한, 단핵구를 활성화시킬 수 있는 화합물 (예를 들어, CD14 또는 TLR4 의 아고니스트 화합물) 에 의한 시험관내 또는 생체외 활성화에 의해 고도로 활성인 단핵구 세포를 생성하는 방법, 뿐만 아니라 유사한 방식으로 단핵구 세포를 활성화시킬 수 있는 신규한 화합물을 동정하는 방법에 제공된다. 본 발명은 또한 단리된 단핵구 집단의 조합, 및 세포를 활성화 및 동원할 수 있는 화합물 (예를 들어, MCP-1) 을 사용하는 치료 방법을 포함한다. 이들 방법으로, 세포는 대상에서 투여될 때 활성화될 수 있고, 부가적인 동원된 세포에 의해 지속되는 효과가 매개될 수 있다.
고도로 활성화된 세포 및 신규한 활성화 화합물은 다양한 눈 질환의 치료에 유용하다. 그러한 질환의 예는 당뇨병 망막병증, 당뇨병 황반 부종, 망막 정맥 폐쇄, 미숙아 망막병증, 연령 관련 황반 변성, 망막 혈관종성 증식, 황반 모세혈관확장증, 허혈성 망막병증, 홍채 혈관신생, 안구내 혈관신생, 각막 혈관신생, 망막 혈관신생, 맥락막 혈관신생, 및 망막 변성을 포함한다. 본 발명의 방법으로 치료하기에 적합한 대상은 이들 질환 중 임의의 하나를 갖거나 발달시킬 위험이 있는 대상을 포함한다. 하기 부분은 본 발명의 방법의 실시에 대한 더욱 상세한 안내를 제공한다.
II. 정의
다르게 규정되지 않는 한, 본원에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어는 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자에게 통상적으로 이해되는 바와 동일한 의미를 갖는다. 하기 참조는 본 발명에서 사용된 많은 용어의 일반적 정의를 당업자에게 제공한다: Academic Press Dictionary of Science and Technology, Morris (Ed.), Academic Press (1st ed., 1992); Illustrated Dictionary of Immunology, Cruse (Ed.), CRC Pr I Llc (2nd ed., 2002); Oxford Dictionary of Biochemistry and Molecular Biology, Smith et al. (Eds.), Oxford University Press (revised ed., 2000); Encyclopaedic Dictionary of Chemistry, Kumar (Ed.), Anmol Publications Pvt. Ltd. (2002); Dictionary of Microbiology and Molecular Biology, Singleton et al. (Eds.), John Wiley & Sons (3rd ed., 2002); Dictionary of Chemistry, Hunt (Ed.), Routledge (1st ed., 1999); Dictionary of Pharmaceutical Medicine, Nahler (Ed.), Springer-Verlag Telos (1994); Dictionary of Organic Chemistry, Kumar and Anandand (Eds.), Anmol Publications Pvt. Ltd. (2002); 및 A Dictionary of Biology (Oxford Paperback Reference), Martin and Hine (Eds.), Oxford University Press (4th ed., 2000). 또한, 하기 정의는 본 발명의 실시에 있어서 독자를 돕기 위해 제공된다.
다르게 규정되지 않는 한, 본원에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어는 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자에게 통상적으로 이해되는 바와 동일한 의미를 갖는다. 본원에서 기술된 바와 유사한 또는 동등한 임의의 방법 및 물질이 본 발명의 시험을 위한 실시에 사용될 수 있고, 바람직한 물질 및 방법이 본원에 기술되어 있다. 본 발명을 기술하고 청구함에 있어서, 하기 용어들이 사용될 것이다.
조혈 줄기 세포는 다양한 혈액 세포 유형 예를 들어, B 세포, T 세포, 과립구, 혈소판, 및 적혈구로 발달할 수 있는 줄기 세포이다. 계통 표면 항원 (표면 마커) 은 성숙한 혈액 세포 계통의 마커인 세포-표면 단백질의 군이고, CD2, CD3, CD11, CD11a, Mac-1 (CD11b:CD18), CD14, CD16, CD19, CD24, CD33, CD36, CD38, CD45, CD45RA, 쥐과 Ly-6G, 쥐과 TER-119, CD56, CD64, CD68, CD86 (B7.2), CD66b, 인간 백혈구 항원 DR (HLA-DR), 및 CD235a (글리코포린 A) 를 포함한다. 이들 항원을 상당한 수준으로 발현하지 않는 조혈 줄기 세포는 통상적으로 계통 음성 (Lin -) 으로 언급된다. 인간 조혈 줄기 세포는 통상적으로 다른 표면 항원 예컨대 CD31, CD34, CD117 (c-kit) 및/또는 CD133 을 발현한다. 쥐과 조혈 줄기 세포는 통상적으로 다른 표면 항원 예컨대 CD34, CD117 (c-kit), Thy-1, 및/또는 Sca-1 을 발현한다.
혈류 중 순환하는 세포는 일반적으로 하기 3 가지 유형으로 분류된다: 백색 혈액 세포 (백혈구), 적색 혈액 세포 (적혈구), 및 혈소판 또는 트롬보사이트. 백혈구는 과립구 (다형핵 백혈구) 및 무과립구 (단핵 백혈구) 를 포함한다. 과립구는 광학 현미경으로 볼 때 그들의 세포질 중 상이하게 염색된 과립의 존재가 특징인 백혈구이다. 하기 3 가지 유형의 과립구가 존재한다: 호중구, 호염기구, 및 호산구. 무과립구 (단핵 백혈구) 는 그들의 세포질 중 과립의 명백한 부재가 특징인 백혈구이다. 이들 세포는 그 이름이 과립의 결여를 암시하지만, 라이소좀인 비특이적 아주르친화성 과립을 함유한다. 무과립구는 림프구, 단핵구, 및 마크로파지를 포함한다.
단핵구는 단핵모구로 호칭되는 조혈 줄기 세포 전구체로부터 골수에 의해 생성된다. 단핵구는 혈류에서 약 1 내지 3 일 동안 순환한 후, 전형적으로는 신체 전체의 조직으로 이동한다. 그들은 혈액 중 3 내지 8 퍼센트의 밸혈구를 구성한다. 조직에서 단핵구는 상이한 해부학적 위치에서 상이한 유형의 마크로파지로 성숙한다. 단핵구는 면역계에서 하기 2 가지 주요 기능을 한다: (1) 정상 상태 하에 상주 마크로파지 및 수지상 세포를 보충하고, (2) 염증 신호에 반응하여, 단핵구는 조직 내의 감염 자리로 신속하게 (약 8-12 시간) 이동할 수 있고, 마크로파지 및 수지상 세포로 분할/분화하여 면역 반응을 유발할 수 있다. 단핵구는 보통 염색된 도말표본에서 그들의 큰 이엽 핵에 의해 식별된다.
안구 혈관신생 또는 안구 혈관 장애는 변경된 또는 비조절된 증식 및 안구 조직의 구조 예컨대 망막 또는 각막 내로의 새로운 혈관의 침입이 특징인 병적 상태이다. 안구 신생혈관 질환의 예는 허혈성 망막병증, 홍채 혈관신생, 안구내 혈관신생, 연령 관련 황반 변성, 각막 혈관신생, 망막 혈관신생, 맥락막 혈관신생, 당뇨병 망막 허혈, 망막 변성 및 당뇨병 망막병증을 포함한다.
각막 혈관신생과 연관되는 다른 질환은, 이에 제한되는 것은 아니나, 유행성 각막결막염, 비타민 A 결핍, 콘택트 렌즈 과도착용, 아토피성 각막염, 우수한 변연 각막염, 건성 익상편 각막염, 쇼그렌, 여드름 장미증, 파일렉테뉼로시스 (phylectenulosis), 매독, 마이코박테리아 감염, 지질 변성, 화학 화상, 세균 궤양, 곰팡이 궤양, 헤르페스 단순 감염, 헤르페스 대상 포진 감염, 원생동물 감염, 카포시 육종, 무렌 궤양, 테리엔 한계 변성, 한계 각질용해증, 류마티스 관절염, 전신 루푸스, 다발성동맥염, 트라우마, 베게너 사코이드증, 공막염, 스티븐 존슨 질환, 페리피고이드 (periphigoid) 방사상 각막절개, 및 각막 이식 거부를 포함한다.
망막/맥락막 혈관신생과 연관되는 질환은, 이에 제한되는 것은 아니나, 당뇨병 망막병증, 황반 변성, 겸상 적혈구 빈혈, 사코이드, 매독, 탄성섬유가황색종, 파제트병, 정맥 폐쇄, 동맥 폐쇄, 목동맥 폐쇄 질환, 만성 포도막염/유리체염, 마이코박테리아 감염, 라임병, 전신 홍반 루푸스, 미숙아 망막병증, 색소성 망막염, 망막 부종 (예컨대 황반 부종), 일스병, 베체트병, 망막염 또는 맥락막염을 야기하는 감염, 추정 안구 히스토플라스마증, 베스트병, 근시, 시와, 스타가르트병, 주변포도막염, 만성 망막 박리, 고점도 증후군, 톡소포자충증, 트리우마 및 레이저후 합병증을 포함한다. 다른 질환은, 이에 제한되는 것은 아니나, 피부홍조와 연관되는 질환 (각의 혈관신생) 및 섬유혈관 또는 섬유성 조직의 비정상적 증식에 의해 야기되는 질환 예컨대 모든 형태의 증식성 유리체망막병증을 포함한다.
미숙아 망막병증 (ROP) 은 미숙아에게 영향을 미치는 눈 질환이다. 그것은 망막 혈관의 비조직적 성장에 의해 야기되는 것으로 여겨지며, 흉터형성 및 망막 박리를 초래할 수 있다. ROP 는 경도일 수 있고 자발적으로 해결될 수 있으나, 심각한 경우에는 실명을 초래할 수 있다. 그와 같이, 모든 조산아는 ROP 에 대한 위험에 처해 있고, 출생시 매우 적은 체중이 부가적인 위험 인자이다. 산소 독성 및 상대적 저산소가 모두 ROP 의 발달에 기여할 수 있다.
황반 변성은 노인에서 우세하게 발견되는 의학적 상태로서, 망막의 황반 부위로 알려진 눈의 내부 막의 중심이 박화, 위축, 및 어떤 경우에는 출혈을 겪는다. 이는 미세한 세부적인 부분을 보거나, 면을 판독하거나 인지하는 능력의 결여를 수반하는, 중심 시각의 상실을 초래할 수 있다. 미국 안과 학술원 (The American Academy of Ophthalmology) 에 따르면, 그것은 오늘날 미국에서 50 세가 넘는 사람들에 대한 중심 시각 상실 (실명) 의 주요 원인이다. 더 어린 개체에 영향을 미치는 일부 황반 이상증이 때때로 황반 변성으로 언급되지만, 이 용어는 일반적으로 연령 관련 황반 변성 (AMD 또는 ARMD) 을 언급한다.
연령 관련 황반 변성은 망막 색소 상피와 그 밑의 맥락막 사이에 있는 황반 (와 (fovea) 로 호칭되는 세부적인 중심 시각을 제공하는 망막의 중심 부위) 에서의 특징적 황색 침착 (드루젠으로 호칭됨) 으로 시작된다. 이들 조기 변화 (연령 관련 황반병증으로 언급됨) 가 있는 대부분의 사람들은 양호한 시각을 갖는다. 드루젠이 있는 사람들은 진행성 AMD 를 발달시키기 시작할 수 있다. 그 위험은 드루젠이 크고 다수이고 황반 밑의 유색 세포 층 내의 교란과 연관되는 경우에 상당히 더 높다. 크고 연성인 드루젠은 상승된 콜레스테롤 침착과 관련되고, 콜레스테롤 저하제 또는 레오 절차 (Rheo Procedure) 에 반응할 수 있다.
진행성 AMD 는 극심한 시각 상실의 원인이 되고, 하기 2 가지 형태를 갖는다: 건성 및 습성. 중심 지리적 위축, 진행성 AMD 의 건성 형태는, 망막 밑의 망막 색소 상피 층으로의 위축에서 초래되고, 이는 눈의 중심 부분에서 광수용체 (간상체 및 원추체) 의 상실을 통해 시각 상실을 야기한다. 이러한 상태에 이용가능한 치료는 없지만, 고용량의 항산화제, 루테인 및 제아잔틴이 함유된 비타민 보충제가 건성 황반 변성의 진행을 늦추고 일부 환자에서 시력을 개선함이 국립 눈 기관 (National Eye Institute) 등에 의해 입증되었다.
색소성 망막염 (RP) 은 유전적 눈 상태의 군이다. RP 에 관한 증상의 진행에서, 야맹증은 일반적으로 터널 시야를 수년 또는 심지어 수십년 선행한다. RP 가 있는 많은 사람들이 그들이 40 대 또는 50 대가 될 때까지 법적으로 맹인이 되지 않고 평생 일부 시력을 보유한다. 다른 사람들은, 어떤 경우에는에는 이미 아동기에, RP 로 인해 완전히 실명된다. RP 의 진행은 각각의 경우에 상이하다. RP 는 망막의 광수용체 (간상체 및 원추체) 또는 망막 색소 상피 (RPE) 의 비정상이 진행성 시각 상실을 초래하는 유전성 장애의 군인 유전성 망막 이상증의 한 유형이다. 이 병에 걸린 개체는 먼저 결손성 암 순응 또는 밤소경증 (야맹증), 그 후 말초 시야의 감소 (터널 시야로 알려짐) 및, 때때로, 질환 경과의 후기에 중심 시각의 상실을 경험한다.
망막의 황색 중심 부위인 눈의 황반에 또는 그 밑에 유체 및 단백질 침착물이 모일 때 황반 부종이 발생하여, 황반이 진해지고 팽윤된다. 팽윤은 사람의 중심 시각을 왜곡할 수 있는데, 이는 황반이 안구 뒤쪽의 망막 중심에서 가깝기 때문이다. 이 부위는 또렷하고 선명한 중심 시각을 제공하여 사람이 바로 시선에 있는 형태, 색, 및 세부적인 부분을 볼 수 있게 하는 빽빽히 찬 원추체를 보유한다. 낭상 황반 부종은 낭 형성을 포함하는 황반 부종의 한 유형이다.
용어 "대상" 및 "환자" 는 호환되게 사용되고, 포유동물 예컨대 인간 환자 및 비인간 영장류, 뿐만 아니라 실험 동물 예컨대 토끼, 랫트, 및 마우스, 및 다른 동물을 언급한다. 동물은 모든 척추동물, 예를 들어, 포유동물 및 비포유동물, 예컨대 개, 고양이, 양, 소, 돼지, 토끼, 닭 등을 포함한다. 본 발명의 치료 방법을 실시하기에 바람직한 대상은 인간이다. 치료를 필요로 하는 대상은 안구 혈관 질환 또는 장애를 이미 앓고 있는 환자 뿐만 아니라 그 장애를 발달시키는 경향이 있는 환자를 포함한다.
용어 "실질적으로 순수한" 또는 "실질적 순수" 는 단리된 세포 집단을 언급할 때 집단 중 소정의 세포 (표적 세포) 의 백분율이 자연 환경에서 (예를 들어, 대상의 조직 또는 혈액에서) 발견되는 것보다 상당히 더 높음을 의미한다. 전형적으로는, 실질적으로 순수한 세포 집단 중 표적 세포 (예를 들어, 단핵구) 의 백분율은 세포 집단 내 총 세포의 약 50% 이상, 바람직하게는 약 60%, 70%, 75% 이상, 더욱 바람직하게는 약 80%, 85%, 90% 또는 95% 이상이다.
본원에서 사용되는, "치료" 또는 "개선" 은 하기를 포함한다: (i) 병적 상태 (예를 들어, 황반 변성) 발생의 방지 (예를 들어, 예방); (ii) 병적 상태 (예를 들어, 황반 변성) 의 저해 또는 그의 발달의 저지; 및 (iii) 병적 상태 (예를 들어, 황반 변성) 와 연관되는 증상의 완화. 따라서, "치료" 는 본원에서 기술된 안구 질환의 증상, 합병증, 또는 생물학적 징후의 개시를 방지 또는 지연시키는 본 발명의 단리된 세포 집단 및/또는 다른 치료적 조성물 또는 물질의 투여, 증상의 경감 또는 개선 또는 질환, 상태, 또는 장애의 추가적 발달의 저지 또는 저해를 포함한다. "치료" 는 또한 본원에서 기술된 안구 질환, 상태, 또는 장애의 치료 또는 개선 또는 방지에 있어서의 임의의 성공의 징후를 언급하며, 임의의 객관적 또는 주관적 파라미터 예컨대 진정; 완화; 증상의 감소 또는 환자에게 질환 상태를 더욱 용인가능하게 하는 것; 악화 또는 쇠퇴 속도의 둔화; 또는 악화의 마지막을 덜 쇠약하게 하는 것을 포함한다. 안구 장애 또는 그의 증상의 치료 또는 개선을 위한 세부 절차는 의사에 의한 검사 결과를 비롯한 객관적 또는 주관적 파라미터에 기초할 수 있다.
III. 단핵구 세포의 집단을 단리하는 방법
본 발명은 본원에서 기술된 다양한 안구 혈관 장애를 치료하는데 유용한 단핵구의 집단을 단리하는 방법을 제공한다. 하기 실시예에서 예시된 바와 같이, 단핵구 집단은 포유류 대상으로부터 수득되는 적합한 생물 샘플, 예를 들어, 말초 혈액 또는 골수로부터 단리될 수 있다. 본 발명의 방법은 실질적으로 순수한 (예를 들어, 순도가 50%, 75% 또는 85% 이상인) 단핵구 집단을 골수 또는 혈액 샘플로부터 단리할 수 있게 한다. 혈액 샘플은 전혈로부터의 대량의 백색 혈액 세포 또는 단핵 백혈구를 함유하는 임의의 샘플일 수 있다. 예를 들어, 혈액 샘플은 전혈 또는 전혈로부터의 백혈구성분채집술 산물일 수 있다. 백혈구성분채집술은 백색 혈액 세포가 혈액 샘플로부터 분리되는 실험 절차이다. 바람직하게는, 단리된 세포 집단에 존재하는 단핵구는 CD14+/CD33+ 이다. CD33 은 단핵구/골수 계통의 세포에서 발현되는 경막 수용체이다. CD14 는 세포, 특히 마크로파지의 표면에서 발현되는 막-연합된 글리코실포스파티딜이노시톨-연결된 단백질이다. 골수, 말초 혈액, 및 제대혈은 각각 CD14 항원 및 CD33 을 발현하는 단핵구의 하위집단을 포함한다. 따라서, 이들 생물 샘플은 본원에서 개시된 방법에 따라 CD14+ 및 CD33+ 세포가 풍부한 단핵구 집단을 단리하는데 바람직하다. 일부 구현예에서, 단리된 세포 집단은 또한 CD34- 이고/거나 알데히드 데히드로나제 (ALDH) 를 발현하지 않거나 낮은 수준으로 발현하는 것으로 특징화된다. 바람직하게는, 단핵구 집단은 인간 골수, 인간 말초 혈액, 인간 제대혈 또는 다른 관련 혈액 샘플로부터 단리된다.
전형적으로는, 상기 방법은 먼저 대다수의 적혈구 (RBC) 를 샘플로부터 제거하는 것 ("제거") 을 수반한다. 이러한 단계는 다른 혈액 세포 (예를 들어, 혈소판, 과립구 및 림프구) 및 나머지 적혈구가 존재하는 경우에 이들을 단핵구로부터 분리하는 것을 동반한다. 당업계에 달려진 방법과는 달리, 본 발명의 방법에서는 상이한 세포 유형의 세포 표면 마커를 인지하는 표지화 물질 (예를 들어, 항체) 이 사용되지 않는다. 그 대신, 본 발명은 단핵구를 다른 혈액 세포 유형, 특히 다른 단핵 세포 (예를 들어, 림프구) 로부터 오직 물리적 특성 예컨대 크기, 입상도 및 밀도에 기초하여 분리한다. 일부 구현예에서, 본 발명의 단핵구 집단은 적합한 샘플 예컨대 골수 또는 말초 혈액으로부터 형광-활성화 세포 분류 (FACS) 에 기초하는 방법을 통해 단리된다. 하기 실시예에서 상술된 바와 같이, 포유류 대상으로부터의 생물 샘플 (예를 들어, 말초 혈액) 에 존재하는 RBC 이 먼저 단리 절차에서 제거된다. 이는 당업계에 잘 알려진 표준 절차, 예를 들어, 암모늄 클로리드-기반 용해 방법으로 RBC 를 용해시킴으로써 달성될 수 있다. 참고, 예를 들어, [Tiirikainen, Cytometry 20:341-8, 1995; 및 Simon et al., Immunol. Commun. 12:301-14, 1983]. 대안적으로는, RBC 는 침강될 수 있고 단핵 세포는 피콜 상에서의 원심분리에 의해 분리될 수 있다. 적혈구를 피콜 밀도 구배 원심분리를 통해 분리하는 절차가 당업계에, 예를 들어, [Tripodi et al., Transplantation. 11:487-8, 1971; Vissers et al., J. Immunol. Methods. 110:203-7, 1988; 및 Boyum et al., Scand. J. Immunol. 34:697-712, 1991] 에 기술되어 있다. RBC 를 제거하는데 적합한 또다른 방법은 헤스판 (Dupont, Dreieich, Germany) 이 적혈구 응집을 유도하는 능력을 이용하는 분별 원심분리에 의한다. 참고, 예를 들어, [Nagler et al., Exp. Hematol. 22:1134-40, 1994; 및 Pick et al., Br. J. Haematol. 103:639-50, 1998]. RBC 를 제거하는데 사용될 수 있는 추가의 기술은 혈액 세포 필터의 사용을 포함한다. 그러한 혈액 세포 필터는 상업적 공급자로부터 용이하게 입수가능하고, 예를 들어, Pall Biomedical Products Company (East Hills, New York) 에 의해 제조된 백혈구 고갈 필터가 있다.
RBC 의 제거 후, 샘플 중 나머지 세포는 FACS 에 의한 후속 단리 단계에 적합한 적당한 완충액에 현탁된다. 예를 들어, 세포는 DPBS/0.5% BSA/2mM EDTA 에 재현탁될 수 있다. 유세포측정은 유체 스트림에 현탁된 미세 입자를 계수, 검사, 및 분류하기 위한 기술이다. 이는 광학적 및/또는 전자적 탐지 장치를 통해 유동하는 단일 세포의 물리적 및/또는 화학적 특성의 동시 다중파라미터 분석을 허용한다. 전형적으로는, 단일 파장의 광선 (통상적으로는 레이저 광) 이 수력학적으로 집중된 유체 스트림 위로 지향된다. 다수의 탐지기가 스트림이 광선을 통과하는 지점을 겨냥한다; 하나는 광선 방향이고 (전방 산란 또는 FSC) 여러 개가 그것에 수직이다 (측면 산란 (SSC) 및 하나 이상의 형광 탐지기). 선을 통과하는 각각의 현탁된 입자는 광을 일정한 방향으로 산란시키고, 입자에서 발견되거나 입자에 부착된 형광 화학물질은 여기되어 광원보다 더 낮은 주파수의 광을 방출할 수 있다. 이러한 산란광 및 형광의 조합은 탐지기에 의해 탐지되고, 각각의 탐지기에서 휘도의 변동을 분석함으로써 (각각의 형광 방출 피크에 대해 하나) 각각의 개별 입자의 물리적 및 화학적 구조에 대한 다양한 유형의 정보를 얻는 것이 가능하다. FSC 는 세포 부피와 상관관계에 있고, SSC 는 입자의 내부 복잡성 (즉, 핵의 형상, 세포질 과립의 양 및 유형 또는 막 조도) 에 의존한다. 시판 중인 일부 유세포측정기는 형광에 대한 필요를 없앴고 측정을 위해 오직 광 산란기만을 사용한다. 다른 유세포측정기는 세포의 형광, 산란광, 및 투과광의 이미지를 형성한다.
최신 유세포측정기는 수천 개의 입자를 매초 실시간 분석할 수 있고, 특정 특성을 갖는 입자를 능동적으로 분리 및 단리할 수 있다. 유세포측정이 세포의 이미지를 생성하는 대신 세트 파라미터의 고속 대량 자동화된 정량화를 제공하는 것을 제외하고는, 유세포측정기는 현미경과 유사하다. 유세포측정기는 하기 5 개의 주요 구성요소를 갖는다: 유동 세포 - 액체 스트림, 광원 (예를 들어, 레이저), FSC 및 SSC 뿐만 아니라 형광 신호를 생성하는 아날로그 디지털 변환 (ADC) 시스템 및 탐지기, 증폭 시스템, 및 신호 분석을 위한 컴퓨터. 유세포측정기에 의해 생성되는 데이타는 단일 차원으로, 또는 2 차원적 점 도표로 또는 심지어 3 차원으로 도표화되어 히스토그램을 생성할 수 있다. 이들 도표 상의 영역들은 형광 강도에 기초하여 "게이트" 로 불리는 일련의 아집단 추출을 생성함으로써 순차적으로 분리될 수 있다. 특히 혈액학에 관련되는 진단 및 임상 목적의 특정 게이트화 프로토콜이 존재한다. 도표는 종종 대수 눈금으로 만들어진다. 상이한 형광 염료들의 방출 스펙트럼이 중복되기 때문에, 탐지기에서의 신호는 전자적으로 뿐만 아니라 컴퓨터적으로 보상되어야 한다.
형광-활성화 세포 분류 (FACS) 는 전문화된 유형의 유세포측정이다. 이는 생물학적 세포의 이종 혼합물을, 각각의 세포의 특이적 광 산란 및 형광 특성에 기초하여, 한 번에 한 세포씩 2 이상의 용기로 분류하는 방법을 제공한다. 이는 개별 세포로부터의 형광 신호를 급속, 객관적 및 정량적으로 기록할 뿐만 아니라 특정 관심의 세포의 물리적 분리를 제공하므로 유용한 과학적 기구이다. 세포 현탁액은 액체의 좁은, 신속하게 유동하는 스트림의 중심에 연행된다. 세포들 사이에 그들의 직경에 비례하여 대규모 분리가 일어나도록 흐름이 배열된다. 진동 메카니즘은 세포 스트림이 개별적 소적으로 나눠지게 한다. 하나 이상의 세포가 소적에 존재할 확률이 낮도록 시스템이 조정된다. 스트림이 소적으로 나뉘기 직전에 흐름이 형광 측정 위치를 통과하고 거기서 각각의 세포의 관심의 형광 특성이 측정된다. 스트림이 소적으로 나뉘는 지점에 전기적 충전 고리가 배치된다. 직전의 형광 강도 측정에 기초하여 전하가 고리에 배치되고, 소적이 스트림으로부터 나뉠 때 반대 전하가 소적에 포착된다. 그 후 하전된 소적은 그의 전하에 기초하여 소적의 방향을 용기로 돌리는 정전기적 편향 시스템을 통하여 떨어진다. 일부 시스템에서 전하는 스트림에 직접 적용되고, 나뉘는 소적은 스트림과 동일한 신호의 전하를 보유한다. 그 후 소적이 나뉜 뒤 스트림은 중성으로 복귀한다.
본 발명의 예로서, FACS 는 BD FACSAria 세포-분류 시스템 (BD Biosciences, San Jose, CA) 에서 일련의 게이트를 사용하여 수행될 수 있다. 항체 또는 다른 선별 물질은 분류에 사용되지 않는다. 오직 생활성 백색 혈액 세포만을 포함하는 영역을 그려서 죽은 세포 및 잔해가 먼저 축출될 수 있다. 그 후, 소적 또는 응집된 세포가 전방 산란 너비 (FSC-W) 대 전방 산란 면적 (FSC-A) 및 측면 산란 너비 (SSC-W) 대 측면 산란 면적 (SSC-A) 을 각각 심문하는 2 차 및 3 차 게이트로 제거될 수 있다. 상기 절차는 당업계에 잘 알려져 있는 표준 프로토콜, 예를 들어, [Flow cytometry - A practical approach, Ormerod (ed.), Oxford University Press, Oxford, UK (3rd ed., 2000); 및 Handbook of Flow Cytometry Methods, Robinson et al. (eds.), Wiley-Liss, New York (1993)] 에 따라 수행될 수 있다.
일부 다른 구현예에서, 본 발명의 단핵구 집단은 Elutra® 세포 분리 시스템 (Gambro BCT Inc., Lakewood, Colorado) 에 기초하는 분리 책략을 사용하여 단리된다. Elutra® 은 연속적 역류 일루트리에이션 (elutriation) 기술을 사용하여 세포를 크기 및 밀도에 기초하여 여러 분획으로 분리하는 반자동, 원심분리-기반 기구이다. Elutra® 에 의한 분리에 앞서 포유류 대상으로부터 수득된 생물 샘플 (예를 들어, 인간 환자로부터의 말초 혈액 샘플) 은 먼저 예를 들어 헤스판으로 침강시킴으로써 대량의 RBC 를 제거하도록 처리될 수 있다. 그 후 유핵 세포 분획은 Elutra® 장치로 가공되기 전에 예를 들어 혈장 익스프레서 (expressor) 로 수집될 수 있다. 하기 실시예에서 상술된 바와 같이, Elutra® 장치에 의한 분획화는 단핵구를 혈소판, 나머지 RBC, 림프구 및 과립구로부터 분리할 수 있게 한다. 분획된 세포는 세포 계수, 생활력 및 순도에 대해 추가로 분석될 수 있다.
일부 구현예에서, 본 발명은 치료적 적용을 위한 고도로 활성인 세포의 생산 방법을 제공한다. 이들 구현예에서, 본 개시에 따라 단리된 단핵구 집단은 안구 혈관 장애가 있는 대상에게 투여되기에 앞서 시험관내에서 또는 생체외에서 추가로 활성화된다. 전형적으로는, 세포는 단핵구를 활성화시킬 수 있는 화합물로 처리된다. 단리된 단핵구 집단을 활성화시키는 상세한 절차가 이하에서 기술된다.
IV. 단리된 단핵구 집단의 특성 및 활성
생물 샘플 예컨대 전혈 또는 골수로부터 단리된 단핵구 집단은 그들의 면역학적 또는 생물학적 특성, 뿐만 아니라 그들의 치료적 활성에 대해 검사될 수 있다. 실시예예서 상술되는 바와 같이, 단리된 단핵구 집단의 순도 및 활성은 다수의 검정법으로 평가될 수 있다. 예를 들어, 표면 마커 발현을 분석하기 위해, 본 발명의 일부 방법은 단리된 단핵구 집단에 의한 CD14 및 CD33 의 발현을 평가하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 단리된 세포의 표면 마커 발현은 항-CD14 및 항-CD33 모노클로날 항체와 함께 유세포측정으로 검사될 수 있다. 하기 실시예에서 예시되는 바와 같이, 본 발명의 방법으로 단리된 세포 집단은 실질적으로 정제된 CD14+/CD33+ 단핵구를 함유한다. 예를 들어, 단리된 세포 집단은 CD14 및 CD33 을 발현하는 세포를 50%, 60%, 75%, 80%, 85%, 90% 또는 95% 이상 함유한다.
그들의 실질적 순도 외에도, 단리된 세포 집단은 안구 혈관 장애와 연관되는 증상을 치료 또는 개선하는데 기능적으로 효과적이다. 예를 들어, 본원에서 개시된 바와 같이, 단리된 세포 집단은 마우스에서 산소-유도성 망막병증에서 혈관 복구를 촉진할 수 있다. 허혈성 망막병증의 마우스 모델 및 안구 혈관화 장애에 대한 단리된 세포 집단의 치료적 활성을 평가함에 있어서의 그의 용도가 당업계에 기술되어 있다. 참고, 예를 들어, [Ritter et al., J. Clin. Invest. 116:3266-76, 2006; 및 Ritter et al., Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 46:3021-6, 2005].
단리된 세포의 기능 및 생화학적 활성은 또한 세포의 주화성을 측정함으로써, 예를 들어 단핵구 주화성 단백질 예컨대 MCP-1 을 사용하여 분석될 수 있다. 그러한 활성 검정으로부터의 결과는 또한 제제의 상대적 순도의 판독 및 단리된 세포의 생활력 및 기능의 암시를 제공한다. 단리된 단핵구의 순도 및 생활력을 검사하는 부가적 방법은 다른 단핵 세포에 상대적인 단핵구에 의한 세포 배양 기층으로의 차등적 부착에 기초하는 검정을 포함한다. 실시예에서 입증되는 바와 같이, 본 발명의 단리 방법에 의해 생성되는 세포는 주로 단핵구임이 밝혀졌고 이는 기술된 검정 조건 하에 그들의 부착 능력에 의해 증명된다.
본 발명의 단리된 단핵구 집단의 일부는 또한 CD34 - 이다. 본 발명의 CD34 - 단핵구 집단은, CD14+ 및 CD33+ 인 것 외에도, CD34+ 세포를 함유하지 않거나 매우 낮은 수준 (예를 들어, 약 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 0.5%, 0.25%, 0.1%, 0.05% 또는 0.01% 미만) 으로 함유하는 단핵구 집단으로 정의된다. 세포 집단 중 CD34+ 세포의 존재는 당업계에 잘 알려져 있거나 본원에서 개시된 방법을 사용하여 용이하게 확인될 수 있다. 본 발명의 CD34 - 단핵구 집단은 본 발명의 일부 치료적 적용에서 사용하기에 더욱 적합하다. CD34+ 줄기 세포는 원치않는 세포 유형으로 분화하는 잠재력을 갖는 것으로 알려져 있고, 증식 능력을 가질 수 있다. CD34+ 세포의 그러한 특성은 본원에서 개시된 치료 방법을 실시할 때 바람직하지 않을 수 있다. 미분화된 줄기 세포 집단, 예컨대 CD34+ 줄기 세포를 마우스 눈에 주사하는 것이 불량한 결과를 초래함이 밝혀졌다 (실시예 3). 따라서, CD14+/CD33+ 인 것 외에도, 본 발명의 단핵구 집단의 일부는 또한 CD34+ 세포가 결여되거나 CD34+ 세포가 매우 적은 양인 것이 특징이다. 하기 실시예에서 예시되는 바와 같이, 초기 세포 제제에 존재할 수 있는 소량의 CD34+ 세포는 최종적인 단리된 단핵구 집단으로부터 추가로 고갈될 수 있다. 중요한 것은, 본원에서 개시되는 바와 같이, CD34+ 세포의 제거가 단핵구 집단의 치료적 활성에 어떠한 변화도 초래하지 않는다는 것이다.
일부 다른 구현예에서, 본 발명의 단핵구 집단은 또한 알데히드 데히드로나제를 고발현하는 세포 (ALDHbr 세포) 를 함유하지 않거나, 이러한 세포가 실질적으로 없는 것이 특징이다 . ALDHbr 세포는 당업계에 잘 알려져 있다. 그들은 조상 세포 활성을 갖고 세포 요법 적용에서 유용한 것으로 제안되었다 (Gentry et al., Cytother. 9:259-274, 2007). 세포 집단 중 ALDHbr 세포의 존재는 전형적으로는 본원의 실시예에서 그리고 또한 당업계에서, 예를 들어, [Russo et al., Biochem. Pharmacol. 37:1639-1642, 1988; 및 Storms et al., Blood 106:95-102, 2005] 에서 기술된 바와 같이 형광-활성화 세포 분류 (FACS) 를 통해 분류되고 정량화될 수 있다. 도 3 에서 나타나는 바와 같이, 본 발명의 단리된 단핵구 집단의 일부는 무시해도 될 정도의 양 (약 0.04%) 의 ALDHbr 세포를 함유한다. 따라서, 본 발명의 일부 바람직한 구현예는 ALDHbr 세포가 실질적으로 없는 단리된 또는 정제된 단핵구 집단을 제공한다. 형광-활성화 세포 분류에 의해 측정되는 바와 같이, 이들 단핵구 세포 집단은 약 5%, 2%, 또는 1% 미만의 ALDHbr 세포를 함유할 것이다. 더욱 바람직하게는, 이들 세포 집단 중 ALDHbr 세포의 백분율은 0.5% 미만, 0.1% 미만, 또는 0.05% 미만일 것이다. CD34- 및/또는 ALDH 가 둘다 낮은 것에 의해, 본 발명의 이들 CD14+/CD33+ 단핵구 집단은 당업계에 보고된 다른 혈액 세포 또는 줄기 세포 집단으로부터 추가로 구별된다 (참조, 예를 들어, Storms et al., Bloold 106:95-102, 2005).
본 발명의 단핵구 집단으로부터의 세포는 또한 치료적으로 유용한 물질, 예컨대 세포 기반 유전자 요법에서 사용되는 항혈관생성 물질 또는 뉴런 복구 효과를 증강시키는 향신경 물질을 발현하도록 조작될 수 있다. 이들 구현예에서, 단리된 단핵구 세포 집단은 치료적으로 유용한 물질을 인코딩하는 유전자로 트랜스펙션된다. 본 발명의 단핵구 집단의 세포를 트랜스펙션시키는데 적합한 유전자 및 방법은, 예를 들어, 미국 특허 출원 일련 번호 10/080,839 에 기술되어 있다. 이들 구현예의 일부에서, 세포는 혈관생성 저해 펩티드, 예를 들어, TrpRS 또는 그의 항혈관생성 (즉, 혈관생성억제) 조각을 작동적으로 인코딩하는 폴리뉴클레오티드로 트랜스펙션된다 (참고, 예를 들어, 미국 특허 출원 일련 번호 11/884,958). 단핵구 세포 집단으로부터의 조작된 혈관생성 저해 세포는 비정상적 혈관 발달과 연관되는 질환, 예컨대 ARMD, 당뇨병 망막병증, 및 특정 망막 변성 및 유사 질환에서의 비정상적 혈관 성장을 조정하는데 유용하다. 일부 다른 구현예에서, 본 발명의 단리된 단핵구 세포 집단의 세포는 향신경 물질을 인코딩하는 유전자를 발현하도록 트랜스펙션된다. 트랜스펙션된 유전자에 의해 발현되는 향신경 물질은, 예를 들어, 신경 성장 인자, 뉴로트로핀-3, 뉴로트로핀-4, 뉴로트로핀-5, 섬모 향신경 인자, 망막 색소성 상피-유래 향신경 인자, 인슐린 유사 성장 인자, 신경아교 세포주-유래 향신경 인자, 뇌-유래 향신경 인자 등일 수 있다. 그러한 유전자로 트랜스펙션된 단핵구 세포는 망막 신경 변성, 예컨대 녹내장, 색소성 망막염, 망막 신경의 손상 등을 비롯한 안구 질환에서 뉴런 복구를 촉진하는데 유용하다. 참고, 예를 들어, [Kirby et al., Mol. Ther. 3:241-8, 2001; Farrar et al., EMBO J. 21:857-864, 2002; Fournier et al., J. Neurosci. Res. 47:561-572, 1997; 및 McGee et al., Mol. Ther. 4:622-9, 2001].
V. 안구 혈관 질환의 치료
본 발명은 안구 질환을 앓는 포유류의 망막에서 혈관 장애 및 뉴런 변성을 치료 또는 개선하는 방법을 제공한다. 이 방법에 따라, 상기 기술된 단리된 단핵구 집단 또는 그의 조작된 세포는 포유류의 망막에 유리체내 주사 또는 전신 투여에 의해 투여될 수 있다. 세포는 망막 내 혈관 및/또는 뉴런 변성을 개선하기에 충분한 양으로 투여된다. 바람직하게는, 단리된 단핵구 집단은 치료될 포유류에 대해 자가이다. 바람직하게는, 단리된 단핵구 세포는 생리적으로 용인가능한 매질, 예컨대 포스페이트 완충 식염수 (PBS) 중에서 투여된다.
치료 방법의 일부에서, 실질적으로 정제된 (예를 들어, 75% 또는 80% 이상) CD14+/CD33+ 세포를 함유하는 단핵구 집단은 먼저 치료될 대상으로부터 수득된 전혈 샘플 또는 골수 샘플로부터 단리된다. 단핵구 세포 집단은 상기 기술된 방법을 사용하여 단리된다. 단리된 CD14+/CD33+ 단핵구 집단은 그 후 대상에게 망막의 혈관 및/또는 뉴런 변성을 개선 또는 치료하기에 충분한 양으로 투여된다. 세포는 안구 변성 질환 또는 안구 혈관 질환을 앓는 포유류로부터, 바람직하게는 안구 질환의 조기 단계에서 또는 안구 변성 질환을 발달시키는 성향이 있는 것으로 알려진 건강한 대상으로부터 (즉, 유전적 성향을 통해) 단리될 수 있다. 후자의 경우, 단리된 단핵구 집단은 단리 후에 저장될 수 있고, 그 후 나중에 발달되는 안구 질환의 조기 단계 동안 예방적으로 주사될 수 있다.
이론에 구속되는 것을 의도하지는 않지만, 본 발명의 CD14+/CD33+ 단핵구 집단으로부터의 세포는 성상세포를 선별적으로 표적화하고, 발달하는 혈관계 내로 혼입시킨 후, 분화시켜 혈관 내피 세포가 되게 함으로써 그들의 치료적 효과를 발휘할 수 있다. 세포는 망막에서 뉴런 복구를 촉진하고 항-세포자멸 유전자의 상향조절을 촉진할 수 있다. 세포가 단리되었던 포유류 대상 (예를 들어, 인간 또는 마우스) 의 눈에 전신 투여하거나 유리체내 주사했을 때, 세포는 망막 혈관신생 및 망막 혈관 변성 질환의 치료, 및 망막 혈관 손상의 복구에 유용하다.
본 발명의 방법으로 치료하기에 적합한 대상은 신생아, 청소년 또는 완전히 성숙한 성인일 수 있다. 일부 구현예에서, 치료될 대상은 안구 장애 예컨대 산소 유도성 망막병증 또는 미숙아 망막병증을 앓는 신생아 대상이다. 일부 구현예에서, 대상은 인간이고, 사용될 단리된 단핵구 집단은 인간 세포, 바람직하게는 치료될 대상으로부터 단리된 자가 세포이다. 다양한 안구 혈관 질환 또는 안구 변성 장애를 앓는 대상이 본 발명의 단핵구 집단으로 치료하기에 적합하다. 이들은 안구 질환 예컨대 망막 변성 질환, 망막 혈관 변성 질환, 망막 부종 (예컨대, 황반 부종), 허혈성 망막병증, 혈관 출혈, 혈관 유출, 맥락막병증, 망막 혈관계의 방해 또는 붕괴를 수반하는 망막 결함 및 망막 손상을 포함한다. 그러한 질환의 구체적 예는 연령 관련 황반 변성 (ARMD), 당뇨병 망막병증 (DR), 추정 안구 히스토플라스마증 (POHS), 미숙아 망막병증 (ROP), 겸상적혈구빈혈, 및 색소성 망막염, 뿐만 아니라 망막 손상을 포함한다. 또한, 단핵구 집단을 사용하여 유전적으로 동일한 세포주, 즉 클론을 생성함으로써, 망막 혈관계의 재생 또는 수복 치료, 뿐만 아니라 망막 뉴런 변성의 치료 또는 개선에 사용할 수 있다. 게다가, 본 발명의 단핵구 집단은 망막 혈관 발달을 연구하고 선별된 세포 표적, 예컨대 성상세포에 유전자를 전달하는 연구 도구로서 유용하다.
치료적 또는 예방적 적용의 경우, 본 발명의 단리된 단핵구 집단은 대상에게 국소 경로 또는 전신 경로를 통해 투여될 수 있다. 일부 구현예에서, 의도되는 치료 효과를 달성하기 위해 세포의 국소 투여가 바람직하다. 예를 들어, 세포 집단은 대상에게 안구내 주사 (유리체내 주사) 에 의해 투여될 수 있다. 이는 당업계에 알려진 표준 절차에 따라 수행될 수 있다. 참고, 예를 들어, [Ritter et al., J. Clin. Invest. 116:3266-76, 2006; Russelakis-Carneiro et al., Neuropathol. Appl. Neurobiol. 25:196-206, 1999; 및 Wray et al., Arch. Neurol. 33:183-5, 1976]. 본 발명의 일부 다른 치료 방법에서, 단리된 단핵구 집단의 전신 투여 경로가 이용된다. 예를 들어, 세포는 대상에게 당업계에서 일상적으로 실시되는 정맥내 주사에 의해 투여될 수 있다. 일부 다른 구현예에서, 비인간 대상에게 또한 심장내 주사를 통해 세포가 투여될 수 있다. 이는 당업계에서 일상적으로 실시되는 절차에 기초하여 달성될 수 있다. 참고, 예를 들어, [Iwasaki et al., Jpn. J. Cancer Res. 88:861-6, 1997; Jespersen et al., Eur. Heart J. 11:269-74, 1990; 및 Martens, Resuscitation 27:177, 1994]. 다른 투여 경로가 또한 본 발명의 실시에 이용될 수 있다. 참고, 예를 들어, [Remington: The Science and Practice of Pharmacy, Mack Publishing Co., 20th ed., 2000].
일반적으로, 눈에 주사되는 단핵구 집단으로부터의 세포 수는 눈의 질환 상태를 저지하기에 충분해야 한다. 예를 들어, 주사되는 세포의 양은 눈의 망막 손상을 복구하고, 망막 신생혈관계를 안정화시키고, 망망 신생혈관계를 성숙시키고, 혈관 유출 및 혈관 출혈을 방지 또는 복구하는데 효과적일 수 있다. 전형적으로는, 유리체내 주사의 경우, 약 1×104 이상, 1×105 이상, 또는 1×106 이상의 단리된 단핵구 집단으로부터의 세포 또는 단핵구 집단으로부터의 트랜스펙션된 세포가 안구 혈관 장애 (예를 들어, 망막 변성 질환) 를 겪는 대상의 눈에 주사된다. 주사될 세포의 수는 망막 변성의 중증도, 대상의 연령 및 안구 질환 치료 분야의 당업자에게 용이하게 명백할 다른 인자에 따라 다를 수 있다. 단핵구 집단으로부터의 세포는 단일 투여로 또는 일정 기간에 걸친 다중 투여로 투여될 수 있으며, 이는 치료 담당 의사에 의해 결정될 수 있다. 또한, 세포의 수 및 투여 빈도는 치료가 예방적인지 또는 치료적인지 여부에 따라 달라질 수 있다. 예방적 적용에서, 상대적으로 적은 수의 세포가 긴 기간에 걸쳐 상대적으로 덜 빈번한 간격으로 투여될 수 있다. 일부 대상은 여생 동안 치료를 계속 받을 수 있다. 치료적 적용에서, 환의 진행이 감소 또는 종결될 때까지, 바람직하게는 대상이 안구 혈관 질환 증상의 부분적 또는 완전한 개선을 보일 때까지 상대적으로 많은 수의 세포가 상대적으로 짧은 간격으로 요구될 수 있다. 그 후, 대상은 예방 요법을 받을 수 있다.
VI. 생체외 활성화를 통한 단리된 단핵구 집단의 활성의 증강
상기 기술된 다양한 치료적 적용에서, 단리된 단핵구 집단 또는 그의 조작된 세포는 또한 치료를 필요로 하는 대상에게 투여되기에 앞서 시험관내에서 또는 생체외에서 활성화될 수 있다. 이들 구현예에서, 증강된 치료적 활성은 생체외에서 활성화된 단핵구가 안구 혈관 장애를 겪는 대상의 망막에 투여될 때 달성될 수 있다.
단리된 단핵구 집단의 활성화는 당업계에서 일상적으로 실시되거나 하기 실시예에서 예시되는 물질 및 방법에 따라 용이하게 수행될 수 있다. 단핵구 및 마크로파지는 다양한 물질 예컨대 LPS 에 의해, CD14 및 톨 유사 수용체를 통해 활성화되는 것으로 알려져 있다 (Le-Barillec et al., J. Leukoc. Biol. 68:209-15, 2000; Mirlashari et al., Med. Sci. Monit. 9:BR316-24, 2003). 하기 실시예에서 입증되는 바와 같이, 단리된 단핵구 집단은 다양한 물질 예컨대 지질다당류 (LPS), 모노포스포릴 지질 A (MPLA) 및 단핵구 주화성 단백질 1 (MCP-1) 로 활성화될 수 있다. 또한 산소-유도성 망막병증이 있는 동물에서 미처리된 세포에 비해 활성화된 세포가 더 양호한 치료 결과를 낳는 것으로 밝혀졌다. 따라서, 이들 물질은 단리된 단핵구 집단의 생체외 활성화에 용이하게 이용될 수 있다. 당업계에 알려진 많은 다른 단핵구 활성화 화합물이 또한 본 발명의 실시에 사용될 수 있다. 그러한 화합물의 예는 면역조절물질 (예컨대 감마 인터페론, 림포카인, 무라밀 이펩티드), 포르볼 미리스테이트 아세테이트, 콘카나발린 A, 폴리메틸메타크릴레이트, 및 식이 지방을 포함한다. 참고, 예를 들어, [Koff et al., Science 224:1007-1009, 1984; Chung et al., J. Leukoc. Biol. 44:329-336, 1988; Horwitz et al., J. Exp. Med. 154:1618-1635, 1981; Laing et al., Acta Orthop. 79:134-40, 2008; Bently et al., Biochem. Soc. Trans. 35:464-5, 2007].
단핵구를 활성화시키기 위해, 단리된 세포는 상기 화합물 중 임의의 하나와 적당한 농도에서 충분한 시간 동안 인큐베이션될 수 있다. 사용될 화합물의 양 및 세포의 투여 전 활성화의 시간 길이는 경험적으로 또는 당업계의 지식에 따라 결정될 수 있다. 단리된 단핵구 집단을 상기 화합물의 일부로 활성화시키는 것에 대한 구체적인 안내가 또한 하기 실시예에서 제공된다. LPS 로 예를 들면, 세포는 LPS 와 농도 약 1 ng/㎖ 내지 약 1000 ng/㎖ 로, 바람직하게는 농도 약 5 ng/㎖ 내지 약 200 ng/㎖ 또는 약 20 ng/㎖ 내지 약 50 ng/㎖ 로 인큐베이션될 수 있다. 세포는 전형적으로는 치료적 적용에서 사용하기에 앞서 활성화 화합물로 10 분 이상, 바람직하게는 1 시간 이상 동안 처리된다. 일부 구현예에서, 세포는 화합물로 2 시간 이상, 4 시간 이상, 10 시간 이상, 24 시간 이상 동안 처리된다.
처리된 세포를 대상에게 투여하기에 앞서, 세포는 또한 그의 활성화를 확인하기 위해 시험관내에서 검사될 수 있다. 이는 전형적으로는 처리된 단핵구에 의한 사이토카인 분비를 정성적으로 또는 정량적으로 모니터링함으로써 수행될 수 있다. 실시예에서 나타나는 바와 같이, 활성화된 단핵구는 사이토카인 예컨대 IL-1β, IL-8, IL-6 및 TNF 의 분비를 증가시켰다. 실시예에서 예시되는 바와 같이, 단핵구의 사이토카인 분비 프로파일은 일상적으로 실시되는 방법 예컨대 세포측정 비드 배열 (CBD) 분석으로 용이하게 평가될 수 있다. 참고, 예를 들어, [Elshal et al., Methods. 38:317-329, 2006; 및 Morgan et al., Clin. Immunol. 110:252-266, 2004].
세포를 대상에게 투여하기 전에 단리된 단핵구 집단을 시험관내에서 또는 생체외에서 활성화시키는 것에 더하여, 본 발명의 일부 치료 방법은 대상에게 미처리된 단핵구 집단 및 본원에서 개시된 단핵구 활성화 화합물 (예를 들어, MCP-1) 을 동시 투여하는 것을 수반한다. 일부 관련 구현예에서, 치료를 필요로 하는 대상에게 시험관내에서 또는 생체외에서 활성화된 단핵구 집단과 함께 상기 기술된 단핵구 활성화 화합물 (예를 들어, MCP-1) 이 투여된다. 이들 구현예에서, 동시 투여되는 화합물은 투여되는 단핵구를 생체내에서 활성화시키거나 처리된 세포의 활성을 생체내에서 강화시킬 수 있다.
관련된 양상에서, 본 발명은 단핵구의 치료적 활성을 활성화 및 자극할 수 있는 신규한 화합물을 동정하는 방법을 제공한다. 전형적으로는, 이들 방법은 후보 화합물을 단핵구 또는 마크로파지의 집단 (예를 들어, 본원에서 기술된 단핵구 집단) 과 접촉시키고, 세포 집단의 활성화 상태의 지표인 단핵구의 파라미터를 모니터링하는 것을 수반한다. 모니터링되는 파라미터는 세포의 임의의 생물학적, 생화학적 또는 형태학적 특징일 수 있다. 일부 바람직한 구현예에서, 후보 물질로 처리되는 세포는 하나 이상의 사이토카인 예컨대 IL-6, IL8 또는 TNF 의 분비 수준에 대해 검사된다. 미처리된 세포에 비해 처리된 세포에 의한 하나 이상의 이들 사이토카인의 증가된 분비는 후보 화합물이 신규한 단핵구 활성화 화합물임을 시사한다.
방법에서 스크리닝되는 후보 화합물은 화학적 부류, 예컨대 소형 유기 분자, 단백질, 폴리펩티드, 다당류, 폴리뉴클레오티드 등으로부터일 수 있다. 일부 바람직한 구현예에서, 후보 화합물은 소형 분자 유기 물질 (예를 들어, 약 500 달톤 미만 또는 약 1,000 달톤 미만의 유기 화합물) 이다. 바람직하게는, 고속 대량 검정이 후보 화합물의 조합 라이브러리 (예를 들어 소형 유기 분자의 라이브러리) 를 스크리닝하기 위해 적응되어 이용된다. 그러한 검정은 당업계에 잘 알려져 있고, 예를 들어, [Schultz (1998) Bioorg Med Chem Lett 8:2409-2414; Weller (1997) Mol Divers. 3:61-70; Fernandes (1998) Curr. Opin. Chem. Biol. 2:597-603; 및 Sittampalam (1997) Curr. Opin. Chem. Biol. 1:384-91] 에 기술되어 있다. 후보 화합물의 큰 조합 라이브러리가 WO 95/12608, WO 93/06121, WO 94/08051, WO 95/35503 및 WO 95/30642 에 기술된 인코딩된 합성 라이브러리 (ESL) 방법에 의해 구축될 수 있다. 화합물의 다양한 라이브러리를 합성하는 다른 방법이, 예를 들어, [Overman, Organic Reactions, Volumes 1-62, Wiley-Interscience (2003); Broom et al., Fed Proc. 45: 2779-83, 1986; Ben-Menahem et al., Recent Prog. Horm. Res. 54:271-88, 1999; Schramm et al., Annu. Biochem. 67: 693-720, 1998; Bolin et al., Biopolymers 37: 57-66, 1995; Karten et al., Endocr. Rev. 7: 44-66, 1986; Ho et al., Tactics of Organic Synthesis, Wiley-Interscience; (1994); 및 Scheit et al., Nucleotide Analogs: Synthesis and Biological Function, John Wiley & Sons (1980)] 에 기술되어 있다.
실시예
하기 실시예는 본 발명을 추가로 설명하기 위해 제공되며 발명의 범주를 제한하려는 것이 아니다. 본 발명의 다른 변형은 당업자에게 용이하게 명백할 것이고 첨부된 청구항에 포함된다.
실시예 1 단핵구 집단의 단리
말초 혈액 또는 골수가 여기에 기술된 절차를 위한 공급 물질로서 사용될 수 있다. 예를 들어, 말초 혈액이 골수에 비해 단핵구가 상대적으로 풍부하고 수집이 용이/안전하므로 말초 혈액을 세포 공급원으로서 선별했다. 치료적 용도의 경우 세포에 선별과 관련되는 임의의 결합된 화합물이 없는 것이 바람직하다. 이러한 목적으로, 오직 물리적 특성 예컨대 크기, 입상도 및 밀도에 기초하여 단핵구를 다른 단핵 세포 (예를 들어, 림프구) 로부터 구별하는 방법을 고안하고 실행했다. 개발한 첫번째 방법은 항체를 사용하지 않고 세포 크기 및 입상도의 차이에 기초하여 단핵구를 림프구로부터 민감하게 분리하기 위한 FACS 에 기초한다. 이러한 방법으로 단리된 단핵구 집단을 보여주는 결과가 도 1A 에 나타나 있다. FACS 기반 분리에 앞서, 전혈에 존재하는 적혈구 및 과립구를 분류전 피콜 원심분리 단계 동안 제거했다. 이는 여러 수단으로 달성할 수 있으며, 예를 들어, (1) 암모늄 클로리드를 사용하여 RBC 를 용해할 수 있고, (2) RBC 를 침강시키고 단핵 세포를 피콜 상에서의 원심분리에 의해 단리할 수 있고, (3) RBC 를 또한 헤스판을 사용하여 침강시킬 수 있다.
RBC 제거 후, 세포를 DPBS/0.5% BSA/2mM EDTA 에 현탁시켜 형광-활성화 세포 분류 (FACS) 를 준비했다. 항체 또는 다른 선별 물질은 사용하지 않고 BD Biosciences ARIA 에서 일련의 게이트를 사용하여 분류를 수행했다. 오직 생활성 백색 혈액 세포만을 포함하는 영역을 그려서 죽은 세포 및 잔해를 먼저 축출했다. 그 후, 소적 또는 응집된 세포를 전방 산란 너비 (FSC-W) 대 전방 산란 면적 (FSC-A) 및 측면 산란 너비 (SSC-W) 대 측면 산란 면적 (SSC-A) 을 각각 심문하는 2 차 및 3 차 게이트로 제거했다. 오직 단일한 백색 혈액 세포를 고려하여, FSC-A 대 SSC-A 모드로 게이트를 그려서 단핵구를 재현가능하게 함유하는 영역에 존재하는 세포를 선별했다. 실시예 2 에 기술된 검정을 사용하여, 이러한 방법으로 수득한 세포 집단이 CD14+/CD33+ 단핵구를 순도 80% - 85% 로 함유함을 밝혔다.
밀도에 기초하여 세포를 구별하는 단핵구 집단의 두번째 단리 방법은 원심분리 동안의 차등적 이동성에 의존한다. 상기 방법은 일회용 튜브 세트를 사용하여 멸균성을 보장할 수 있고 샘플의 교차 오염을 피할할 수 있으므로 임상적 적용에서 특정 이점을 갖는다. 구체적으로, 인간 혈액 샘플을 먼저 헤스판을 사용하는 침강에 의해 적혈구 (RBC) 를 제거하도록 처리했다. 그 후, 적당한 부피의 6% 헤스판을 항-응고 혈액 산물에 첨가하여 최종 농도가 1.5% 가 되게 했다. 백 (bag) 을 약하게 혼합하고 수직으로 세워 실온에서 45 분 동안 인큐베이션하여 RBC 가 침강되게 했다. 그 후 수동 혈장 익스프레서를 사용하여 유핵 세포 분획 (NCF) 을 수득하여, 별도의 멸균 600 ㎖ 빈 혈액 백에 수집했다. 수득한 세포 산물을 구배 밀도 원심분리에 기초하는 추가의 분리를 위한 출발 물질로서 사용했다.
그 후 단핵구 집단을 농축시키도록 고안된 Elutra® 장치 (Gambro BCT Inc., Lakewood, Colorado) 를 이용하여 출발 세포 산물을 가공했다. 일회용 튜브 세트를 Elutra® 장치에 연결시켰다. 그 후, 출발 세포 산물인, HBSS 및 0.5% HSA 를 함유하는 1 차 및 2 차 매질 백을 튜브 세트의 적당한 연결부에 연결시켰다. 튜브 세트를 2 차 백을 사용하여 준비했다. 프로그램 번호 1 (하기 표 1 참고) 을 사용하여 출발 세포 산물을 가공했다. 상기 프로그램은 출발 세포 산물을 체임버 내로 자동으로 로딩시키고 1 차 매질 백을 사용하여 가공했다. 그 후 세포를 연속적으로 원심분리하고, 분리하고 다양한 흐름 속도에서 여러 분획으로 수집했다. 하기와 같이 각각 특정 세포 집단이 풍부한 5 개의 분획을 수집하도록 프로그램을 고안했다. 혈소판을 분획 1 에서, RBC 를 분획 2 에서, 림프구를 분획 3 에서, 단핵구를 분획 4 에서, 과립구를 분획 5 에서 수집했다. 각각의 분획을 샘플링하고, 핵 세포 계수기에 의해 세포 수, 생활력을, 유세포측정에 의해 순도를 분석했다. 각각의 분획의 흐름 속도 및 수집 부피가 표 1 에 나타나 있다. 순도 및 세포 수에 기초하여, 단핵구를 함유하는 적당한 부피를 수집한 후 300 × g 에서 원심분리했다.
도 2 에서 나타나는 바와 같이, 밀도 원심분리 방법에 의해 단리된 단핵구 제제는 FACS-기반 방법에 의해 분리된 것과 성질이 유사한 것으로 밝혀졌다.
| 분획 | 흐름 속도 | 원심분리 속도 | 수집 부피 |
| 1 | 37 | 2400 | 900 |
| 2 | 97.5 | 2400 | 975 |
| 3 | 103.4 | 2400 | 975 |
| 4 | 103.9 | 2400 | 975 |
| 5 | 103.9 | 0 | 250 |
실시예 2 단리된 단핵구 집단에 의한 안구 혈관 장애의 치료
산소-유도성 망막병증의 쥐과 모델을 이용하여 본원에 기술된 방법으로 단리된 단핵구 집단의 치료적 활성을 검사했다. 산소-유도성 망막병증이 있는 마우스를 [Ritter et al., J. Clin. Invest. 116:3266-76, 2006] 에 기술된 바와 같이 생성했다. 구체적으로, 산소-유도성 망막병증을 C57BL/6J 마우스에서 [Smith et al., Invest. OphthalMol. Vis. Sci. 35:101-111, 1994] 에 기술된 프로토콜에 따라 유도했다. 비교를 위해, BALB/cByJ 마우스를 또한 동일한 상태에 적용했다. 간략히, P7 강아지 및 그들의 어미를 실내 공기로부터 75% 산소 환경으로 옮기고, 5 일 후 다시 실내 공기로 옮겼다. BioSpherix 사제 체임버를 사용하여 과산소 환경을 만들어 유지시켰다. 이들 상태 하에서, C57BL/6J 마우스에서 과산소 동안 중심 망막에 넓은 혈관과소 영역이 형성되었고, 정상산소로의 복귀 후 비정상적 망막앞 혈관신생이 발생했고, P17 근처에서 피크를 형성하고 궁극적으로 해결되었다.
그 후 단리된 세포를 마우스에 안구내 주사했다. 그 후, 치료된 마우스 뿐만 아니라 대조군 마우스의 눈에서 혈관계의 면역조직화학 분석 및 시각화를 수행했다. 이들 연구를 [Ritter et al., J. Clin. Invest. 116:3266-76, 2006] 에 기술된 절차를 사용하여 수행했다. 이들 연구의 결과가 도 1B 에 나타나 있다. 도에 나타난 바와 같이, 본 발명자들에 의해 단리된 단핵구의 실질적으로 순수한 집단은 산소-유도성 망막병증이 있는 마우스에서 혈관 복구를 촉진할 수 있었다.
실시예 3 단리된 단핵구 집단의 다른 특성 및 활성
본 발명자들이 단리한 세포가 임상적 사용 또는 개발 중인 다른 알려진 세포 집단과 구별됨을 입증하기 위해, 높은 수준 (ALDHbr) 으로 발현되는 경우 CD34+ 세포, CD133+ 세포, 키트+ 세포, 계통-항원 음성 (Lin-) 세포를 동정하는 알데히드 데히드로나제의 발현에 대해 말초 혈액 샘플을 표지화했다. 말초 혈액 샘플에서의 그러한 표지화 (도 3) 가 고정화된 말초 혈액에 줄기 세포가 매우 드물게 존재하리라는 예상과 본질적으로 맞지 않음이 밝혀졌다.
CD34 는 조혈 줄기 세포의 마커이고 다양한 임상적 적용을 위해 세포를 선별하는데 사용되어 왔다. 상기 세포는 본원에서 기술된 치료적 적용의 결과를 포함하거나 이에 유해하게 영향을 미칠 수 있음이 밝혀졌다. 구체적으로, 본 발명자들은 안구내 주사 후 미분화된 줄기 세포의 행태를 확인하기 위해, 마우스 배아 및 인간 중간엽 줄기 세포 (CD34+ 줄기 세포처럼, 미분화된 세포임) 를 유리체내에 주사했다. 이들 세포를 정상적 눈 또는 산소-유도성 망막병증 (OIR) 을 겪은 모델에 주사했다. 또한, 눈과 관련되지 않는 세포 유형의 효과를 평가하기 위해, 마우스 OIR 모델에서 정상적 인간 진피 섬유모세포를 유리체내에 주사했다. 상기 모든 경우에, 망막에서 상당한 염증 및 신생물 활성을 관찰했다. 이들 발견은 미분화된 줄기 및/또는 증식 세포의 안구내 주사가 정상적 또는 허혈성 눈에서 상당한 유해 사건을 초래할 수 있음을 시사한다. 이들 연구는 또한 미분화된 줄기 세포와 대조적으로, 본 발명에서 기술된 미엘로이드 조상 세포의 집단이 유해 사건 예컨대 염증 또는 신생물의 발생 없이 망막 혈관계의 제어성 복구를 촉진한다는 발견을 강조한다.
도 4 에서 나타나는 바와 같이, 본 발명의 방법을 사용하여 제조한 집단은 소수의 CD34+ 세포를 함유할 수 있다 (도 4). 그러나, 이들 세포는 본 발명자들의 모델에서 기능에 요구되지 않는다. 또한, 본 발명자들은 CD34-발현 세포를 본 발명자들의 단핵구 제제로부터 특이적으로 고갈시켰고 효능의 변화를 나타내지 않았다.
실시예 4 단리된 단핵구의 순도 및 기능에 대한 시험관내 검정
상기 기술된 바와 같이 단리된 세포의 순도 및 활성을 평가하기 위해, 상이한 단핵구 특징들을 독립적으로 평가하는 여러 시험관내 검정을 개발했다. 첫번째 검정은 단핵구 제제의 순도를 측정하는 것이었다. 이는 단핵구 마커 CD14 에 대한 항체 및 유세포측정을 사용했다 (도 5). 도 5 에서 나타나는 바와 같이, 이 검정은 단리된 세포 집단에 존재하는 비단핵구 세포의 수를 측정하고 본 발명자들의 단리 방법의 효능을 확인할 수 있게 했다. 두번째 검정은 단리된 단핵구의 활성의 측정이었다. 이는 단핵구 주화성 단백질 1 (MCP-1) 의 구배에 대한 세포의 주화성을 정량화했다. 이들 시험을 공극 크기가 3 ㎛ 또는 5 ㎛ 인 Boyden 체임버를 사용하여 세포가 2 hr 동안 38 ℃ 에서 이주하도록 하여 수행했다. 단리된 단핵구 제제는 MCP-1 의 영향 하에 효과적으로 이주했으나, 림프구는 그렇지 않았음이 밝혀졌다 (도 6). 따라서, 이 검정은 제제의 상대적 순도의 판독 및 단리된 세포의 생활력 및 기능의 지표를 제공했다.
세번째 검정은 세포 배양 기질에 대한 차등적 부착에 기초했다. 단핵구는 세포 배양 플라스틱에 부착할 수 있는 반면 림프구는 부착하지 않음이 확인되었다. 도 7 에서 확인되는 바와 같이, 이러한 검정의 결과는 본원에서 기술된 단리 방법에 의해 생성된 세포가 주로 단핵구임을 나타냈고, 이는 상기 상태 하에서 그들의 부착 능력에 의해 입증된다.
실시예 5 치료적 세포 집단의 전신 투여
이 실시예는 마우스 망막병증 모델에서 치료적 적용을 위한 CD44hi 미엘로이드 세포의 심장내 투여를 설명한다. 이러한 전신 전달 경로는 상기 실시예에서 사용한 전형적인 국소 투여 경로 (안구내 주사) 와 상이하다. GFP-발현 CD44hi 미엘로이드 세포를 [Ritter et al., J. Clin. Invest. 116:3266-76, 2006] 에 기술된 바와 같이 준비하고 수득했다. 산소-유도성 망막병증이 있는 C57BL/6J 마우스 (전형적으로는, 출생후 7 일째 마우스) 내로의 세포의 심장내 주사를 표준 절차를 사용하여 수행했다. 세포의 혈관 표적화 활성을 주사 후 며칠 뒤에 (예를 들어, 그 후 7 일 또는 10 일 뒤에) 주사된 마우스의 GS 렉틴-염색된 망막을 분석함으로써 입증했다. 망막 혈관계의 이미지를 Radiance2100 MP 레이저 스캐닝 동일초점 현미경 (Bio-Rad; Zeiss) 을 사용하여 수득했다. 망막을 염색하고 동일초점 현미경 이미지를 분석하는 절차를 [Ritter et al., J. Clin. Invest. 116:3266-76, 2006] 에 기술된 바와 같이 수행했다.
이 연구로부터 수득한 결과는 치료적 세포의 분획이 과산소 상해 후 망막으로 표적화되었음을 입증했다 (도 8). 이들 발견은 본원에서 기술된 단핵구 집단이 또한 전신적으로 투여되어 (예를 들어, 심장내 주사를 통해) 그들의 치료적 효과를 달성할 수 있음을, 예를 들어 손상을 복구하거나 눈에 치료적 물질을 전달할 수 있음을 시사한다.
실시예 6 시험관내에서 활성화된 단핵구 집단의 증강된 활성
이 실시예는 단핵구 집단의 생체외 활성화 및 비활성화된 세포에 비해 그들의 증강된 활성을 설명한다.
상기 기술된 방법을 사용하여 단핵구 세포를 단리한 후, 단리된 단핵구 세포 (분획 5 (F5) 세포) 를 지질다당류 (LPS) 로 농도 25 ng/㎖ 에서 4 시간 동안 처리했다. BD 세포내 사이토카인 염색 검정으로부터 변형된 유세포측정-기반 검정을 통해 사이토카인의 세포내 수준을 측정하여 활성화를 측정했다. 이 검정으로 미처리된 세포 및 림프구-풍부 분획 (F3) 에 비해 LPS 로 처리된 단핵구 (F5) 세포에서 IL-6, IL-8 및 TNF 단백질의 증가된 축적을 탐지했다. 구체적으로, 데이타는 림프구-풍부 집단 (F3) 이 LPS 후 실질적으로 활성화되지 않는 반면, 단핵구-풍부 집단 (F5) 은 LPS 로 명백히 활성화됨을 나타냈다. 또한, 세포내 사이토카인 염색으로 측정되는 바와 같이 당뇨병 공여체로부터 유래된 세포가 정상적으로 활성화되는 것으로 나타났다. 또한, 유세포측정 분석으로부터 전방 산란 대 측면 산란에 의해 측정되는 바와 같이 LPS 처리가 F5 세포의 형태에 거의 효과를 미치지 않음이 밝혀졌다.
세포측정 비드 배열을 사용하여 미처리된 세포와 비교하여 LPS-활성화된 세포로부터 분비된 사이토카인의 수준을 정량적으로 측정함으로써 상기 발견들을 독립적으로 입증했다. 분비된 IL-6, IL-8 및 TNF 단백질의 상당한 증가를 탐지했다. 이 검정으로 또한 F5 세포에서 LPS 자극 후 IL-1β 는 상당히 상향조절되었으나 (도 9), IL-10 및 IL-12p70 의 분비는 본질적으로 변화되지 않았음을 확인했다.
단리된 단핵구 세포를 LPS 로 활성화시키는 것 외에도, 더 유리한 안전성 프로파일을 갖는 다른 활성화 화합물의 활성을 또한 검사했다. 구체적으로, 먼저 LPS 수용체, TLR4 에 대한 대안적 라간드에 노력을 집중했다. 이들 대안적 TLR4 리간드 중 하나인, 모노포스포릴 지질 A (MPLA) 를 상기 기술된 세포측정 비드 배열에 사용했다. 결과는 LPS 로 관찰된 바와 유사하게 MPLA 가 IL-8, IL-6 및 TNF 의 증가와 함께 F5 세포를 활성화시킴을 나타낸다 (도 10). 또한, MPLA 처리 후 IL-1 β 분비의 증가가 관찰되었지만, 그 수준이 LPS 자극으로 수득된 것의 대략 절반이었다.
본 발명자들은 또한 F5 단핵구 세포에서 마우스 및 인간 단핵구 주화성 단백질 1 (MCP-1) 의 능력의 활성화를 시험했다. 마우스 및 인간 MCP-1 은 둘다 IL-8 및 IL-6 의 증가를 자극했다. 그러나 그 수준은 LPS 또는 MPLA 로 수득된 것보다 더 낮았다 (도 10 및 11).
생체외에서 활성화된 단핵구 집단의 사이토카인 분비를 측정하는 것 외에, 동물 연구에서 세포의 치료적 활성을 추가로 검사했다. 이들 연구에서, LPS-처리된 또는 대조군 세포의 병행 군을 마우스에게 유리체내 주사를 통해 투여했다 (0.5㎕ 중 250,000 세포). 그 후 이들 동물을 과산소 및 산소-유도성 망막병증에 적용했다. 이들 동물로부터의 망막의 분석으로 LPS 에 의해 활성화된 F5 단핵구 세포에 의한 치료가 이 모델에서 측정된 하기 2 개의 주요 파라미터를 감소시켰음이 밝혀졌다: 혈관폐색 부분 및 혈관신생 부분 (다발). 이들 파라미터의 감소는 LPS-처리된 F5 의 경우가 미처리된 F5 세포, 처리된 F3 세포, 비히클 또는 LPS 단독의 경우보다 더 컸다.
10,000 평방 마이크론 값을 컷오프로 사용하여 그 값 미만은 망막에 본질적으로 혈관 폐색이 없는 (본원에서 "치유된" 으로 기술함) 것으로 간주함으로써, LPS-처리된 F5 세포로 처리한 후 미처리된 F5 또는 다른 LPS-처리된 분획 (F3) 에 비해 더 많은 수의 망막이 컷오프 미만의 폐색 부분을 가졌음을 입증할 수 있었다 (도 12). 이는 활성화된 단핵구-풍부 세포 집단이 이러한 허혈성 망막병증의 모델에서 혈관 복구를 촉진할 수 있음을 시사한다. 도 12 에 알 수 있는 바와 같이, F3 분획은 OIR 모델에서 일정한 수준의 효능을 보였고, 이는 활성 세포가 이러한 분획에도 또한 존재함을 시사한다. 따라서, 이러한 집단, 또는 F5 및 F3 세포의 조합이 또한 치료적으로 유용할 수 있다.
당뇨병 망막병증의 치료에 있어서 자가적 접근의 잠재적 사용시, 당뇨병 공여체로부터 유래된 세포가 활성임을 입증하는 것이 중요하다. OIR 모델을 사용하여, 본 발명자들은 실제로 이것이 사실임을 밝혔다. 당뇨병 공여체로부터의 단핵구 풍부 분획 (F5) 은 정상적 공여체와 구별할 수 없는 활성화 패턴을 보였고 (도 9), 이들 활성화된 세포는 또한 OIR 모델에서 비활성화된 F5 세포 또는 다른 LPS-처리된 분획 (F3) 보다 혈관 복구를 더 큰 정도로 촉진하는 것으로 나타났다 (도 12). 또한, 일정한 수준의 활성이 림프구-풍부 F3 분획에서 관찰되었다.
***
상기 발명은 이해를 명확하게 하기 위해 설명 및 예에 의해 어느 정도 상세히 기술되었지만, 첨부된 청구항의 정신 또는 범주에서 벗어나지 않으면서 거기에 특정 변화 및 변경이 가해질 수 있음이 본 발명의 교시에 비추어 당업자에게 용이하게 명백할 것이다.
본 명세서에서 언급된 모든 문헌, 데이타베이스, GenBank 서열, 특허, 및 특허 출원은 각각 구체적으로 및 개별적으로 참조에 의해 포함되는 것으로 명시된 것처럼 참조에 의해 본원에 포함된다.
Claims (34)
- CD33 항원 및 CD14 항원을 발현하는 실질적으로 순수한 단핵구를 포함하는 단리된 세포 집단.
- 제 1 항에 있어서, 세포 집단이 포유류 말초 혈액 샘플, 제대혈 샘플 또는 골수 샘플로부터 단리되는 단리된 세포 집단.
- 제 1 항에 있어서, 단리된 세포 집단 내의 세포가 인간 세포 또는 쥐과 세포인 단리된 세포 집단.
- 제 1 항에 있어서, 단리된 세포 집단 중 70%, 80% 또는 90% 이상의 세포가 표면 마커 CD14 및 CD33 을 발현하는 단리된 세포 집단.
- 제 1 항에 있어서, 세포 집단이 CD34- 인 단리된 세포 집단.
- 제 1 항에 있어서, 세포 집단에 실질적으로 ALDHbr 세포가 없는 단리된 세포 집단.
- 제 1 항에 있어서, 시험관내에서 추가로 활성화되는 단리된 세포 집단.
- 제 7 항에 있어서, 단리된 세포 집단이 LPS, MPLA, 또는 MCP-1 로 활성화되는 방법.
- 안구 혈관 장애를 앓는 대상에게 단리된 단핵구 집단을 투여하는 것을 포함하고, 투여되는 세포 집단이 안구 혈관 장애를 치료 또는 개선하기에 충분한 양으로 투여되는, 대상에서 안구 혈관 장애를 치료 또는 개선하는 방법.
- 제 9 항에 있어서, 단핵구 집단이 대상으로부터의 혈액 샘플 또는 골수 샘플로부터 단리되는 방법.
- 제 9 항에 있어서, 대상이 인간인 방법.
- 제 9 항에 있어서, 단핵구 집단이 실질적으로 순수한 CD14+/CD33+ 세포를 포함하는 방법.
- 제 9 항에 있어서, 단리된 단핵구 집단 중 80% 이상의 세포가 CD14+/CD33+ 인 방법.
- 제 9 항에 있어서, 안구 혈관 장애가 허혈성 망막병증, 당뇨병 망막병증, 미숙아 망막병증, 신생혈관 녹내장, 중심 망막 정맥 폐쇄, 망막 부종, 황반 변성 및 색소성 망막염으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 방법.
- 제 9 항에 있어서, 단핵구 집단이 대상에게 유리체내 주사를 통해 투여되는 방법.
- 제 9 항에 있어서, 단핵구 집단이 대상에게 투여되기에 앞서 시험관내에서 또는 생체외에서 활성화되는 방법.
- 제 16 항에 있어서, 단핵구 집단이 LPS, MPLA, 또는 MCP-1 로 활성화되는 방법.
- 제 9 항에 있어서, 단핵구 집단이 대상에게 단핵구 활성화 화합물과 동시투여되는 방법.
- 제 18 항에 있어서, 단핵구 활성화 화합물이 LPS, MPLA, 또는 MCP-1 인 방법.
- 하기 단계를 포함하는, 대상에서 안구 질환을 치료 또는 개선하는 방법: (i) 안구 혈관 질환을 갖는 대상의 혈액 샘플 또는 골수 샘플로부터 실질적으로 순수한 단핵구 집단을 단리하는 단계; 및 (ii) 단리된 단핵구 집단을 대상에게 안구 혈관 질환을 치료 또는 개선하기에 충분한 양으로 투여함으로써, 대상에서 안구 혈관 질환의 증상을 치료 또는 개선하는 단계.
- 제 20 항에 있어서, 단리된 단핵구 집단이 실질적으로 순수한 CD14+/CD33+ 세포를 포함하는 방법.
- 제 20 항에 있어서, 단리된 단핵구 집단 중 약 80% 이상의 세포가 표면 마커 CD33 및 CD14 를 발현하는 방법.
- 제 20 항에 있어서, 단핵구 집단이 하기 단계에 의해 단리되는 방법: (i) 적혈구를 샘플로부터 제거하는 단계; 및 (ii) 샘플에서 나머지 적혈구 및 다른 세포 유형을 단핵구로부터 그들의 크기, 입상도 또는 밀도에 기초하여 분리하는 단계.
- 제 23 항에 있어서, 나머지 적혈구 및 다른 세포 유형이 단핵구로부터 밀도 원심분리 또는 형광-활성화 세포 분류 (FACS) 에 의해 분리되는 방법.
- 제 20 항에 있어서, 안구 혈관 장애가 허혈성 망막병증, 당뇨병 망막병증, 미숙아 망막병증, 신생혈관 녹내장, 중심 망막 정맥 폐쇄, 황반 변성 및 색소성 망막염으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 방법.
- 제 20 항에 있어서, 단리된 단핵구 집단이 대상에게 투여되기에 앞서 생체외에서 활성화되는 방법.
- 제 26 항에 있어서, 단핵구 집단이 LPS, MPLA, 또는 MCP-1 로 활성화되는 방법.
- 하기 단계를 포함하는, 실질적으로 순수한 단핵구 집단을 단리하는 방법: (i) 대상으로부터 혈액 샘플 또는 골수 샘플을 제공하는 단계; (ii) 적혈구를 샘플로부터 제거하는 단계; 및 (iii) 샘플에서 나머지 적혈구 및 다른 세포 유형을 단핵구로부터 분리함으로써, 실질적으로 순수한 단핵구를 포함하는 세포 집단을 단리하는 단계.
- 제 28 항에 있어서, 나머지 적혈구 및 다른 세포 유형이 단핵구로부터 그들의 크기, 입상도 또는 밀도에 기초하여 분리되는 방법.
- 제 28 항에 있어서, 나머지 적혈구 및 다른 세포 유형이 단핵구로부터 밀도 원심분리 또는 형광-활성화 세포 분류 (FACS) 에 의해 분리되는 방법.
- 제 28 항에 있어서, 다른 세포 유형이 혈소판, 과립구 및 림프구인 방법.
- 제 28 항에 있어서, 적혈구가 헤스판 분별 원심분리 또는 피콜 밀도 구배 원심분리에 의해 제거되는 방법.
- 제 28 항에 있어서, 단리된 세포 집단을 표면 마커 CD14 및 CD33 의 발현에 대해 검정하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
- 제 28 항의 방법에 의해 단리된 실질적으로 순수한 단핵구 세포 집단.
Applications Claiming Priority (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US20817309P | 2009-02-20 | 2009-02-20 | |
| US61/208,173 | 2009-02-20 | ||
| US28324409P | 2009-11-30 | 2009-11-30 | |
| US61/283,244 | 2009-11-30 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| KR20110123778A true KR20110123778A (ko) | 2011-11-15 |
Family
ID=42634163
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| KR1020117021989A KR20110123778A (ko) | 2009-02-20 | 2010-02-19 | 단리된 단핵구 집단 및 관련된 치료적 적용 |
Country Status (11)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP2398900A4 (ko) |
| JP (1) | JP2012518407A (ko) |
| KR (1) | KR20110123778A (ko) |
| CN (1) | CN102317446A (ko) |
| AU (1) | AU2010216374A1 (ko) |
| BR (1) | BRPI1008392A2 (ko) |
| CA (1) | CA2752679A1 (ko) |
| EA (1) | EA201190109A1 (ko) |
| MX (1) | MX2011008826A (ko) |
| WO (1) | WO2010096177A1 (ko) |
| ZA (1) | ZA201105869B (ko) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR20160104217A (ko) * | 2015-02-26 | 2016-09-05 | 충북대학교 산학협력단 | 혈액성분을 유효성분으로 포함하는 녹내장의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물 |
Families Citing this family (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP2999479B1 (en) * | 2013-05-22 | 2021-01-06 | Yeda Research and Development Co., Ltd. | Human monocyte sub-population for treatment of eye diseases and disorders |
| FR3084463B1 (fr) * | 2018-07-30 | 2023-04-21 | Francais Du Sang Ets | Procede d'analyse des plaquettes d'un echantillon sanguin |
| CN114441419B (zh) * | 2022-01-29 | 2022-11-22 | 杭州翔宇医学检验实验室有限公司 | 流式圈门方法及应用 |
Family Cites Families (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2006031467A2 (en) * | 2002-07-25 | 2006-03-23 | The Scripps Research Institute | Isolated lineage negative hematopoietic stem cells and methods of treatment therewith |
| JP2007521831A (ja) * | 2004-02-11 | 2007-08-09 | アルダジェン， インコーポレイテッド | 幹細胞集団および使用方法 |
| US20070231306A1 (en) * | 2005-02-24 | 2007-10-04 | The Scripps Research Institute | Isolated myeloid-like cell populations and methods of treatment therewith |
| EP2046366B1 (en) * | 2006-06-28 | 2016-08-31 | Yeda Research And Development Company Limited | Copolymer-1 for treatment of age-related macular degeneration |
-
2010
- 2010-02-19 CA CA2752679A patent/CA2752679A1/en not_active Abandoned
- 2010-02-19 BR BRPI1008392-8A patent/BRPI1008392A2/pt not_active IP Right Cessation
- 2010-02-19 KR KR1020117021989A patent/KR20110123778A/ko not_active Application Discontinuation
- 2010-02-19 WO PCT/US2010/000477 patent/WO2010096177A1/en active Application Filing
- 2010-02-19 EP EP10744061A patent/EP2398900A4/en not_active Withdrawn
- 2010-02-19 AU AU2010216374A patent/AU2010216374A1/en not_active Abandoned
- 2010-02-19 CN CN2010800079738A patent/CN102317446A/zh active Pending
- 2010-02-19 MX MX2011008826A patent/MX2011008826A/es not_active Application Discontinuation
- 2010-02-19 JP JP2011551065A patent/JP2012518407A/ja not_active Withdrawn
- 2010-02-19 EA EA201190109A patent/EA201190109A1/ru unknown
-
2011
- 2011-08-11 ZA ZA2011/05869A patent/ZA201105869B/en unknown
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR20160104217A (ko) * | 2015-02-26 | 2016-09-05 | 충북대학교 산학협력단 | 혈액성분을 유효성분으로 포함하는 녹내장의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EA201190109A1 (ru) | 2012-07-30 |
| BRPI1008392A2 (pt) | 2015-08-25 |
| WO2010096177A1 (en) | 2010-08-26 |
| CA2752679A1 (en) | 2010-08-26 |
| AU2010216374A1 (en) | 2011-08-18 |
| MX2011008826A (es) | 2011-11-02 |
| EP2398900A1 (en) | 2011-12-28 |
| JP2012518407A (ja) | 2012-08-16 |
| CN102317446A (zh) | 2012-01-11 |
| EP2398900A4 (en) | 2012-08-22 |
| ZA201105869B (en) | 2012-10-31 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| RU2331669C2 (ru) | Популяция стволовых кроветворных клеток и ее применение | |
| RU2403906C2 (ru) | Способ лечения ретинопатии при недоношенности и родственных ретинопатических заболеваний | |
| Friedlander et al. | Progenitor cells and retinal angiogenesis | |
| JP2012040021A (ja) | 幹細胞集団および使用方法 | |
| RU2473686C2 (ru) | Выделенные популяции миелоподобных клеток и способы лечения с использованием таких популяций | |
| JP2018518975A5 (ko) | ||
| DE69734989T2 (de) | Antigenpräsentierende zellen, ein verfahren zur deren herstellung und deren verwendung als zelluläre impfstoffen | |
| KR20170010894A (ko) | 림프구로부터의 다계열 분화능 세포 생성 방법 | |
| KR20110123778A (ko) | 단리된 단핵구 집단 및 관련된 치료적 적용 | |
| JPH08509377A (ja) | ヒトのエリスロイド前駆細胞集団 | |
| JP2008537478A (ja) | 単離骨髄球様骨髄細胞集団及びそれを用いた治療方法 | |
| WO2023216799A1 (zh) | 一种人nkt细胞系及其应用 | |
| US20170196950A1 (en) | Method for producing autologous tolerogenic dendritic cells (toldcs) with specific antigens and their use in the preparation of a medicament useful for the treatment of systemic lupus erythematosus (sle) | |
| US20120009166A1 (en) | Isolated monocyte populations and related therapeutic applications | |
| JP4714580B2 (ja) | 造血幹細胞及び該細胞による眼の血管新生性疾患の治療方法 | |
| Owen et al. | Monocytes recruited to sites of inflammation express a distinctive proinflammatory (P) phenotype | |
| US20110268716A1 (en) | Methods for the enrichment of viable foxp3+ cells and uses thereof | |
| EA035338B1 (ru) | Композиция гемопоэтических стволовых клеток с пониженной воспалительной активностью, ее получение и применение | |
| JP6706836B2 (ja) | 単核球培養用無血清培地 | |
| Taher | Examining the role of lymphocytes in health and in neonatal encephalopathy and the influence of mucosal associated T cells on B cell functions | |
| Bornemann | Exploring immune cell migration and its prognostic and diagnostic potential by time-lapse video and light sheet fluorescence microscopy | |
| Bacherini et al. | CD3+ CD4-CD8-double-negative lymphocytes are increased in the aqueous humour of patients affected by retinitis pigmentosa: their possible role in mediating inflammation | |
| Nakov | The role of CC motif chemokine ligand 7, CC motif chemokine ligand 11 and interleukin-9 in T helper type 9 cell mediated neuronal damage | |
| JP2004201574A (ja) | 造血幹細胞活性化マーカー | |
| Meng2De et al. | Modulation effects of human immature and mature dendritic cells on glatiramer acetate specific T cell lines in vitro |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| WITN | Application deemed withdrawn, e.g. because no request for examination was filed or no examination fee was paid |