CN105377273A - 用于治疗眼睛疾病或病症的人类单核细胞亚群 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种具有低相对量的或基本上不含CD3+细胞、CD19+细胞、CD56+细胞且任选地不含CD16+细胞的单核细胞亚群，其中所述单核细胞亚群用于抑制神经元变性、保护神经元免于谷氨酸中毒或促进视网膜或视神经中的神经再生，其中所述视网膜或视神经因眼睛的疾病、病症或病况而受损，或用于治疗眼睛的炎性疾病、病症或病况。
Description
技术领域
本发明一般而言涉及人类单核细胞亚群，其用于治疗存在或不存在炎性成分的视网膜和视神经变性且用于治疗眼睛的炎性疾病、病症或病况。
发明背景
对中枢神经系统(CNS)组织初始损害后的神经元死亡导致神经毒性的恶性循环，除非快速恢复体内平衡，否则导致损害蔓延(Doble,1999)。假如诱发的保护和修复机制不足，则将发生神经元的进一步死亡，这是一种与许多CNS病理学相关的现象，而与其病因或主要的损害原因无关，包括作为CNS部分的视网膜和视神经的神经细胞。在所有偏离体内平衡中，常驻型免疫细胞被活化。在CNS中，此类免疫细胞是常驻型小神经胶质细胞。如果这些细胞未充分被活化，或被活化但未按时消退，其即可进入局部炎症的恶性循环中，这并非主要病理原因，而是其发展的一部分。使未被按时阻止的免疫活性的不充分局部免疫活性停止需要炎症消退细胞、新募集且可局部培养成炎症消退细胞的循环单核细胞的帮助。下文我们将概述其中涉及免疫细胞的眼睛疾病。
年龄相关性黄斑变性。(AMD)是一种影响眼睛黄斑区域的疾病，黄斑区域是视网膜中获得敏锐视力的区域，表现为视网膜下方的视网膜色素上皮层萎缩和光感受器(视杆和视锥)损失。约10％的AMD患者罹患由于血管生长异常而由视网膜中心部位恶化引起的新生血管性或渗出性黄斑变性。在AMD发病机理中涉及多种细胞过程，包括视网膜色素上皮细胞炎症、氧化应激、胆固醇代谢改变和/或功能受损。视网膜中的异常血管增生受到血管内皮生长因子(VEGF)的刺激。
葡萄膜炎被认为是由诸如类风湿性关节炎或强直性脊柱炎的自体免疫病症、感染或暴露于毒素引起的。然而，在许多情形下，病因未知。葡萄膜炎最常见的形式是前葡萄膜炎，牵涉到眼睛前部的炎症。炎症可与自体免疫疾病相关，但大多数情形发生在健康人群中。后葡萄膜炎是一种影响眼睛脉络膜和神经视网膜的潜在性致盲的眼部炎症病况。许多研究已证实巨噬细胞在实验性自体免疫葡萄膜炎(EAU)中起重要作用，实验性自体免疫葡萄膜炎是人类后葡萄膜炎的一种模型，主要在疾病的诱发和效应阶段的情形下，尽管几项报道已表明在控制阶段也存在巨噬细胞。然而，在大多数这些研究中，在常驻型小神经胶质细胞与浸润性巨噬细胞之间不存在功能性区别。另外，关于源自单核细胞的巨噬细胞的不同子集的特征及其在疾病不同阶段的活体内功能尚无报道。
色素性视网膜炎(RP)，一种视网膜营养不良的形式，是一类遗传性病症，其特征是周边视觉逐渐丧失和可导致中心视觉丧失的夜间视觉困难(夜盲症)。RP由视网膜的光感受器(视杆和视锥)或视网膜色素上皮细胞(RPE)异常引起，导致视力逐渐丧失。显示RP中持续性慢性炎症反应的临床迹象，表明炎症可构成RP的发病机理(Yoshida等人,2013)。
糖尿病视网膜病变是由糖尿病并发症引起的视网膜病变，最终可导致失明。糖尿病导致视网膜中的大量代谢和生理异常，但这些异常中哪些造成糖尿病视网膜病变(DR)的确认特征尚不清楚。已发现在糖尿病患者的视网膜中发展的许多分子和生理异常都与炎症一致。另外，已发现许多消炎疗法显著抑制DR的不同方面在动物模型中的发展(Tang等人,2011)。
青光眼是一种在老年人群中具有高发病率(约1％)的进展缓慢的视神经病变。直到最近，其与高的眼内压(IOP)联系在一起且因此集中致力于通过抗高血压性药物来减缓疾病的发展。多年以来，很显然青光眼是一种疾病家族且并非全部与压力相关。此外，显然即使当疾病与压力相关时，后者仍可降至正常且甚至低于正常值并可以继续变性。临床医生间持续进行的讨论已质疑不管IOP值是否正常，青光眼患者中的持续变性是否反映除压力以外存在其它风险因素或反映剩余神经元和纤维的脆弱性增加且因此需要使IOP减小至低于正常值。青光眼尤其导致视网膜神经节细胞(RGC)的神经变性，从而导致视野逐渐丧失直至视力丧失。
病因。成人CNS的急性和/或慢性神经元损失由于成熟神经细胞增生和补偿损失神经元的能力极差而导致不可逆转的功能损失。因此，减弱或减少神经元损失对于保持功能而言是必需的。在大多数神经变性疾病中，病因不明确，因此无法治愈。尽管如此，仍存在一些主要和次要的风险因素，这是旨在抑制或减弱神经元损失进程的治疗性干预的目标，统称为神经保护性疗法。某些风险因素具有疾病特异性，但其它风险因素(如兴奋性氨基酸、自由基和一氧化氮)是所有神经变性病症所常见的。这些因素是健康CNS中的必需自有组成部分，但随着其在变性组织中的过量积聚，将变得具有细胞毒性，导致损害超越神经元死亡的最初起因而蔓延。
谷氨酸是急性和慢性变性病症中最常见的毒性介质之一(Pitt等人,2000)。谷氨酸是人类CNS中的一种主要的兴奋性神经递质。L-谷氨酸存在于大多数突触中且能够展示双重活性：它在正常充当必需神经递质中发挥关键作用，但当超过其生理学水平时即具有毒性。
目前疾病管理。目前尚无对于神经变性疾病的疗法，且治疗重在缓解或管理症状。神经保护性疗法在迄今进行的大多数临床研究中均无法显示功效。关于AMD，抗血管新生或抗VEGF药剂在直接注射至眼睛的玻璃体液中时可导致异常血管退化并改善视力。
再生医学和保护性自体免疫。再生医学是旨在通过刺激先前不可修复的器官自我恢复来修复、取代和/或使受损组织和器官再生的新兴领域，包括组织工程化、生物材料和细胞疗法。细胞更新是周边组织中一种常见的恢复过程，因其在CNS的剩余部分中而在成人的神经视网膜中受到限制。然而，视网膜祖细胞(RPC)的静止群体在成人期间继续存在于视网膜睫状体(CB)中且具有分化成视网膜的各种细胞或可能充当免疫调节剂或嗜神经型药剂来源的潜能。据报道这种休眠的祖细胞龛在视网膜损伤后受到刺激，尽管尚未公开其潜在的机制。阐明对损伤作出反应而进行操作的治愈过程并寻找使其增强的方式可导致用于促进神经保护和细胞更新的新疗法的发展，这是此领域的研究目标。
除CNS以外，治愈过程需要借助于免疫系统来清除死细胞和细胞碎片并用于支持再生长和细胞更新。这些过程部分地通过随着治愈的时间进程获得离散表型的不同巨噬细胞子集来调节。在对任何损害作出反应的过程中，存在终止涉及源自单核细胞的巨噬细胞的局部免疫反应的关键阶段，这有助于总体消炎环境并产生再生所需的生长因子。
外周血浸润/募集到病变部位受从病变部位引发的信号控制，这影响大脑-脑脊液(CSF)屏障。在CNS损伤后有限的自发恢复可部分地归因于单核细胞的有效子集不充分、过早、自发地募集到病变部位。以上考虑因素已导致发明人遵循采用身体专业康复系统、免疫系统的新的生理学方法来对付CNS损伤的后果，导致神经保护和恢复。
发明人实验室中已展示，用皮肤片段孵育源自血液的单核细胞获得了与文献中描述的消炎M2单核细胞类似的非炎症表型。将单核细胞注射到损伤的脊髓中在大鼠体内诱导从脊髓损伤(SCI)更好地恢复(US5,800,812；US6,117,424和US6,267,955)。在临床研究中对罹患急性切断脊髓损伤的患者测试这种方法，显示令人鼓舞的结果(WO03/044037；Knoller等人,2005)。发明人也表明，外周血单核细胞库(pool)中富集源自骨髓的CD115+细胞在小鼠体内增强了SCI后的功能恢复(Shechter等人,2009)。
血液单核细胞是具有不同特征和活性的异源细胞群。使用血液单核细胞用于治疗目的需要确认具有有害功能的细胞和有益的细胞。
在人类中，建议可区分三个子集，即CD14++CD16-(经典)、CD14++CD16++(中间物)和CD14dimCD16++(非经典)单核细胞之间CD16在单核细胞上的表达，但对于其在生理学和病理学病况中的作用尚未完全理解。最近，发明人发现在CD16+富集的单核细胞在脊髓损伤后注射到动物的CSF中之后与接受总的单核细胞亚群的动物相比减弱了自发性恢复。还发现不含CD16表达细胞(CD16-)的单核细胞亚群对脊髓损伤后的恢复有益(PCT/IL2012/050522)。
发明概要
本公开一般来说部分地涉及一种具有低相对量的或基本上不含CD3+细胞、CD19+细胞和CD56+细胞的外周血单核细胞(PBMC)的单核细胞亚群，或一种具有低相对量的或基本上不含CD3+细胞、CD19+细胞、CD56+细胞和CD16+的PBMC的单核细胞亚群，其用于抑制神经元变性、保护神经元免于谷氨酸中毒(glutamatetoxicity)或促进视网膜或视神经中的神经再生，其中视网膜或视神经因眼睛疾病、病症或病况而受损。
本文还提供一种具有低相对量的或基本上不含CD3+细胞、CD19+细胞和CD56+细胞的PBMC的单核细胞亚群，或一种具有低相对量的或基本上不含CD3+细胞、CD19+细胞、CD56+细胞和CD16+的PBMC的单核细胞亚群，其用于治疗眼睛的炎性疾病、病症或病况。
本文还提供包含具有低相对量的或基本上不含CD3+细胞、CD19+细胞和CD56+细胞的PBMC的单核细胞亚群、或具有低相对量的或基本上不含CD3+细胞、CD19+细胞、CD56+细胞和CD16+的PBMC的单核细胞亚群的组合物，其用于抑制神经元变性、保护神经元免于谷氨酸中毒或促进视网膜或视神经中的神经再生，其中视网膜或视神经因眼睛疾病、病症或病况而受损。
本公开一般来说还涉及包含具有低相对量的或基本上不含CD3+细胞、CD19+细胞和CD56+细胞的PBMC的单核细胞亚群、或具有低相对量的或基本上不含CD3+细胞、CD19+细胞、CD56+细胞和CD16+的PBMC的单核细胞亚群的组合物，其用于治疗眼睛的炎性疾病、病症或病况。
本文还提供用于抑制神经元变性、保护神经元免于谷氨酸中毒或促进视网膜或视神经中的神经再生的方法，其中视网膜或视神经因眼睛疾病、病症或病况而受损，所述方法包括向有需要的个体施用有效量的具有低相对量的或基本上不含CD3+细胞、CD19+细胞和CD56+细胞的PBMC的单核细胞亚群或具有低相对量的或基本上不含CD3+细胞、CD19+细胞、CD56+细胞和CD16+细胞的PBMC的单核细胞亚群。
本公开一般来说还涉及用于治疗眼睛炎性疾病、病症或病况的方法，包括向有需要的个体施用有效量的具有低相对量的或基本上不含CD3+细胞、CD19+细胞和CD56+细胞的PBMC的单核细胞亚群或具有低相对量的或基本上不含CD3+细胞、CD19+细胞、CD56+细胞和CD16+细胞的PBMC的单核细胞亚群。
附图说明
图1A-E显示注射到玻璃体中的同系单核细胞在谷氨酸中毒后具神经保护性。在谷氨酸中毒后7天对无损伤、有损伤和经单核细胞处理的视网膜切片中的视网膜神经节细胞(RGC)进行定量。对于每一例4个切片的Brn3a+RGC的定量，表示为计数(A)或相对于无损伤的视网膜的存活百分比(B)。(C-E)无损伤的小鼠(C)和经玻璃体内注射PBS(D)或小鼠单核细胞(E)的有损伤的小鼠(D-E)的视网膜中RGC的代表性显微照片，用RGC标记Brn3a进行标记(红色；比例尺100μm)。箭头指向Brn3a+RGC。注意，如在经PBS处理的组中所见，损伤后RGC损失，且在经单核细胞(小鼠mon)处理的视网膜中，RGC得以保留。整个图中的条形图显示每组的平均值±SE。*，P<0.05；**，P<0.01。GT-谷氨酸；mon-单核细胞；RGC-视网膜神经节细胞。
图2A-H显示描绘经玻璃体内注射的小鼠单核细胞的定位和特征的显微照片。谷氨酸中毒后第7天的视网膜的代表性显微照片，显示经注射的小鼠单核细胞(CX3CR1-GFP，绿色)对细胞因子和神经营养因子阵列(红色)的表达。(A)TGFβ；(B)IL-10；(C)CD38；(D)IGF-1；(E)BDNF；(F)Arg-1(精氨酸酶-1)；(G)TNF-α；(H)IL-1β。用Hoechst染色剂(蓝色)对细胞进行非特异性染色。在玻璃体和接近有损伤的RGC处以及在视网膜下间隙中发现注射的细胞。箭头指向双重标记的细胞；插图显示更高放大倍数的代表性细胞(比例尺50_m；插图比例10_m)。GCL-神经节细胞层；SRS-视网膜下间隙；vit-玻璃体。
图3A-C显示基于保护性CNS的自体免疫疫苗接种在视神经损伤(ONC)后增大了视网膜中的免疫反应。在ONC后7天对嵌合体小鼠的视网膜中的总的白血球(CD45+；A)、源自浸润性单核细胞的巨噬细胞(CD11b+GFP+；B)和T细胞(TCRβ+；C)进行定量。在ONC之前一周用源自MOG的变构肽(45D)对一组小鼠进行疫苗接种。使用来自疫苗接种组的对侧视网膜作为无损伤的对照物。图表显示每组的平均值±SE。*，P<0.05；**，P<0.01；***，P<0.001。
发明详述
发明人先前已报道，在谷氨酸眼睛中毒后，源自单核细胞的巨噬细胞浸润小鼠的受损视网膜。抑制此浸润作用导致视网膜神经节细胞(RGC)存活率降低且睫状体中的增生视网膜祖细胞(RPC)数量减少。增强循环单核细胞库导致RGC存活和RPC更新增加。源自浸润性单核细胞的巨噬细胞使有损伤的视网膜环境向消炎和神经保护性环境偏斜并下调其它免疫细胞的聚集，由此解决局部炎症且增强组织修复(London等人,2011，以引用的方式并入如同本文完全公开)。超过生理学水平的谷氨酸是导致自我保持变性过程的早期因素之一，而不考虑初始的风险因素。
发明人最近还发现，由不存在、接近不存在或低相对量的表达CD3、CD19、CD56且任选地表达CD16的细胞定义的源自血液的人类单核细胞亚群能够从脑脊液(CSF)返回脊髓中的损伤部位，并促进其组织恢复且改善功能恢复(PCT/IL2012/050522)。发明人最近还发现，细胞在恢复受伤脊髓中的有益作用是通过与在病变边界处施用到脊髓中的一片皮肤共同孵育而活化的细胞或通过向有损伤脊髓的CSF中施用未经活化的细胞来获得的。
根据本发明，现已发现玻璃体内注射小鼠CD115+骨髓单核细胞细胞对谷氨酸中毒后的小鼠视网膜神经节存活具有保护性作用(实施例4)。
在其表面上表达某种可识别标记(诸如分化群(CD)分子X)的细胞在本文中称作CDX+。举例来说，在其表面上表达CD3分子的细胞在本文中称作CD3+。在细胞表面上表达的CD分子的相对量通过添加“+”来表示，例如CD3++用于高量的CD分子，或术语“dim”表示相对低含量的CD分子。包含由某种CD的表达定义的细胞类型的细胞群、这些细胞相对富集的群或缺乏所述细胞的群分别表示为CD+、CD++或CD-。
因此，在一个实施方案中，PBMC的人类单核细胞亚群具有低相对量的或基本上不含CD3+细胞、CD19+细胞和CD56+细胞。举例来说，本发明的PBMC可具有低相对量的CD3+细胞且基本上不含CD19+细胞和CD56+细胞。
在一个实施方案中，也从PBMC亚群除去CD16+细胞，产生另外基本上不含CD16+细胞的PBMC的单核细胞亚群，即具有低相对量的或基本上不含CD3+细胞、CD19+细胞、CD56+细胞和CD16+细胞的单核细胞亚群。举例来说，本发明的PBMC可具有低相对量的CD3+细胞且基本上不含CD19+细胞、CD56+细胞和CD16+细胞。
用于区分非人类动物和人类体内各种单核细胞亚群的典型抗原是不同的，且因此可使用与用于识别人类体内相应细胞群的标记不同的标记来识别某种小鼠细胞群。举例来说，下文实施例4中所用的小鼠CD115+单核细胞分为两个亚群；GR1+和GR1-，而人类体内的相应单核细胞群分为基于其膜标记CD14和CD16的表达所定义的三个亚群(Geissman等人(2008)Bloodmonocytes:distinctsubsets,howtheyrelatetodendriticcell,andtheirpossiblerolesintheregulationofT-cellresponses.ImmunologyandCellBiology(2008)86,398-408)。
如本文所用的术语“外周血单核细胞(PBMC)”指的是具有圆形核的任何血细胞，诸如淋巴细胞、单核细胞或巨噬细胞。本领域技术人员易于了解从血液分离PBMC的方法。一种非限制性的实施例是使用聚蔗糖从全血中提取这些细胞，聚蔗糖是一种使血层分离的亲水性多糖，其中单核细胞和淋巴细胞在一层血浆下形成血沉棕黄层，或通过白细胞去除法制备白血球浓缩物，其中红细胞和少白血球的血浆返回供体。
短语“基本上不含...[某种细胞]的细胞群”在本文中与短语“接近不存在”可互换使用且优选地包括缺少某种细胞类型或者包含以所述细胞群中的细胞总数计不超过约0.05％、0.1％、0.5％、1％、2％、3％、4％或5％的相对量的某种细胞类型的细胞群。短语“具有低相对量的...[某种细胞]的细胞群”指的是以与新分离且未经处理的人类PBMC群中相同种类细胞的相对量相比相对低的量、但以比“基本上不含”此细胞群的群较高的相对量存在的细胞群。
因此，在一个实施方案中，CD19+细胞和CD56+细胞中每一者的相对量不超过PBMC群中的细胞总数的约0.05％、0.1％、0.5％、1％、2％、3％、4％或5％。在某些实施方案中，基本上不含CD3+细胞、CD19+细胞、CD56+细胞和CD16+细胞的单核细胞亚群中的CD16+细胞的相对量不超过细胞总数的约0.05％、0.1％、0.5％、1％、2％、3％、4％或5％。
正常的人类PBMC细胞群尤其包含大于70％的CD3+细胞和约10-15％的单核细胞，因此对于“具有低相对量的CD3+细胞的细胞群”而言，CD3+细胞的相对量从PBMC群中的细胞总数的大于70％减少到约10％、15％、20％或25％。然而，也可以想象通过改善的细胞分离方法，本发明的PBMC群将接近不存在CD3+细胞，即其相对量为PBMC群中细胞总数的约0.05％、0.1％、0.5％、1％、2％、3％、4％或5％。
在一个实施方案中，具有低相对量的或基本上不含CD3+细胞、CD19+细胞和CD56+且任选地也基本上不含CD16+细胞的单核细胞亚群基本上富含CD14+细胞。
短语“基本上富含…的细胞群”指的是某种细胞类型的相对量超过所述细胞群中的细胞总数的约60％、70％、80％、90％、95％或99％的细胞群。
在一个实施方案中，具有低相对量的或基本上不含CD3+细胞、CD19+细胞和CD56+细胞的PBMC的单核细胞亚群包含至少约60％的CD14+细胞，且基本上不含CD3+细胞、CD19+细胞、CD56+细胞和CD16+细胞的单核细胞亚群包含至少约80％的CD14+细胞。因此，如本文定义的单核细胞亚群在本文中也称作CD14++、CD16-群。
在一些实施方案中，本发明的单核细胞亚群用于抑制神经元变性、保护神经元免于谷氨酸中毒或促进视网膜或视神经中的神经再生，其中视网膜或视神经因眼睛疾病、病症或病况而受损。
举例来说，在一个实施方案中，导致眼睛神经元变性且因谷氨酸毒性而恶化的疾病、病症或病况选自视网膜变性病症，其选自年龄相关性黄斑变性或色素性视网膜炎；前部缺血性视神经病变；青光眼或葡萄膜炎。这些疾病导致损害神经组织且在某些实施方案中，施用本发明的单核细胞亚群促进神经再生。本发明还涵盖治疗慢性或急性视网膜病变、由诸如糖尿病或高血压的全身性疾病导致的视网膜病变、放射性视网膜病变和日光性视网膜病变。
急性损伤、老化、毒素、代谢异常、血管灌注改变或退变性遗传病况继发的视网膜体内平衡改变可引发眼睛的各种炎症级联反应。在所有这些情形下，延长的、调节异常的免疫反应本身可能是病态的，导致视网膜疾病的发病机理以及威胁视力的并发症。由于源自血液的单核细胞用以解决炎症和恢复体内平衡，有助于组织自我治愈，因此本发明另外涉及治疗眼睛的炎性疾病，其并不必然导致眼睛的神经变性。在一些实施方案中，本发明中所用的单核细胞亚群将有效治疗眼睛的炎性疾病，诸如巩膜炎(巩膜炎症)；角膜炎(角膜炎症)；角膜溃疡(眼睛角膜的表面上皮层缺失)；雪盲症(因眼睛未受保护暴露于亮光而引起的痛苦病况)；泰格森氏浅层点状角膜病变(Thygeson'ssuperficialpunctatekeratopathy)；角膜新生血管形成；富克斯氏营养不良(Fuchs'dystrophy)(晨起目昏)；圆锥形角膜(角膜的厚度和形状变化)；干燥性角膜结膜炎(干眼症)或虹膜炎(虹膜炎症)。在某些实施方案中，PBMC用于抑制神经元变性、保护神经元免于谷氨酸中毒或促进视网膜或视神经中的神经再生，其中视网膜或视神经因眼睛炎性疾病、病症或病况而受损。
在一个实施方案中，本发明中任一方面所用的PBMC的单核细胞亚群包含人类PBMC。
人类PBMC的单核细胞亚群可从自体PBMC中分离，即从需要治疗眼病的患者收集血液，如下文定义制备根据本发明的PBMC单核细胞亚群且随后施用回患者。
或者，可从异体PBMC分离人类PBMC的单核细胞亚群，即从遗传上类似但并非相同的供体收集血液，如下文定义制备根据本发明的PBMC单核细胞亚群且任选地储存在细胞库中，之后施用患者。
在一个实施方案中，将PBMC的单核细胞亚群配制成用于注射，例如注射到眼睛中。
本文还提供一种包含如上文定义的PBMC的单核细胞亚群的组合物，其用于抑制神经元变性、保护神经元免于谷氨酸中毒或促进视网膜或视神经中的神经再生，其中视网膜或视神经因眼睛疾病、病症或病况而受损，或用于治疗眼睛的炎性疾病、病症或病况。组合物可包含悬浮在适合注射、例如适合施用至眼睛中的医药学上可接受的载体中的PBMC的单核细胞亚群的细胞。
根据本发明使用的医药组合物可通过常规方式，使用一种或多种生理学上可接受的载体或赋形剂来配制。就与组合物的其它成分相容且对其接受者无害的角度而言，载体必须是“可接受的”。
下文列举载体、施用模式、剂型等的范例作为已知的可能性，从中可选择载体、施用模式、剂型等用于本发明。然而，本领域一般技术人员将理解所选择的任何给定的配制物和施用模式均应首先进行测试以确定其实现所需结果。
术语“载体”指的是稀释剂、佐剂、赋形剂或细胞所施用的媒介物。医药组合物中的载体可包含粘合剂，诸如微晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮(聚维酮或聚烯吡酮)、黄蓍胶、明胶、淀粉、乳糖或乳糖一水合物；崩解剂，诸如海藻酸、玉米淀粉等等；润滑剂或表面活性剂，诸如硬脂酸镁或十二烷基硫酸钠；和助流剂，诸如胶体二氧化硅。
组合物可配制成通过注射进行肠胃外施用，例如通过快速推注注射或连续输液。用于注射的配制物可呈现为单位剂型，例如在安瓿或多剂量容器中，其中添加有防腐剂。组合物可采用诸如在油性或含水媒介物中的悬浮液、溶液或乳剂的形式，而且可含有配制剂，诸如悬浮剂、稳定剂和/或分散剂。
向眼睛中施用细胞或组合物可以通过玻璃体内注射或视网膜下注射。
发明人最近已发现，PBMC单核细胞亚群通过返回脊髓中的损伤边界处缓和损伤且改善功能恢复，而无论细胞先前是否通过与一片皮肤共同培养而活化，即其为皮肤活化细胞，或无论其是否未经活化(PCT/IL2012/050522)。
因此，举例而言，注射到眼睛中的本发明的PBMC的单核细胞亚群的细胞可以是皮肤活化细胞。
或者，注射到眼睛中的本发明的PBMC的单核细胞亚群的细胞可以是未经活化的细胞。
如上文公开，如本文中定义的PBMC的单核细胞亚群及包含其的组合物用于治疗眼睛的神经变性疾病、病症或病况。具体来说，治疗包括促进神经组织恢复，例如包括预防或抑制神经元变性、促进神经元存活、轴突再生和/或出芽、受损视网膜或视神经组织中的神经形成和/或促进功能恢复。本文中已表明，对神经细胞的有益作用至少部分是源于如本文定义的PBMC的特异性单核细胞亚群对炎症反应的调节作用。
因此，本发明还提供一种抑制神经元变性、保护神经元免于谷氨酸中毒或促进视网膜或视神经中的神经再生的方法，其中视网膜或视神经因眼睛疾病、病症或病况而受损，或治疗眼睛炎性疾病、病症或病况的方法，所述方法包括向有需要的个体施用有效量的如本文定义的PBMC的单核细胞亚群。
同一申请人的PCT/IL2012/050522提供一种从血液中分离基本上不含本文所述的CD3+细胞、CD19+细胞和CD56+细胞的人类PMBC的单核细胞亚群的方法，包括以下步骤：(i)从血液中分离单核细胞；和(ii)通过使所述单核细胞与抗CD3+抗体、抗CD19+抗体和抗CD56+抗体(每一者都与微珠连接)接触从(i)的单核细胞除去CD3+细胞、CD19+细胞和CD56+细胞，由此使所述细胞与所述微珠结合并除去微珠，由此从血液中获得具有低相对量的CD3+细胞且基本上不含CD19+细胞和CD56+细胞的人类外周血单核细胞(PMBC)的单核细胞亚群。
PCT/IL2012/050522还提供一种从血液中分离基本上不含CD3+细胞、CD19+细胞、CD56+细胞和CD16+细胞的PMBC单核细胞亚群的方法，包括以下步骤：(iii)从血液中分离单核细胞；和(iv)通过使所述单核细胞与抗CD3+抗体、抗CD19+抗体、抗CD56+抗体和抗CD16+抗体(每一者都与微珠连接)接触从(iii)的单核细胞除去CD3+细胞、CD19+细胞、CD56+细胞和CD16+细胞，由此使所述细胞与所述微珠结合并除去微珠，由此从血液中获得具有低量的CD3+细胞且基本上不含CD19+细胞、CD56+细胞和CD16+的人类PMBC的单核细胞亚群。
在一个实施方案中，步骤(iv)，即除去CD3+细胞、CD19+细胞、CD56+细胞和CD16+包括以下子步骤：(v)从(iii)的单核细胞除去CD3+细胞、CD19+细胞和CD56+细胞，由此从血液中获得基本上不含CD3+细胞、CD19+细胞和CD56+细胞的人类PMBC的单核细胞亚群；和(vi)从(v)的PMBC群除去CD16+细胞，由此从血液中获得基本上不含CD3+细胞CD19+细胞、CD56+细胞和CD16+细胞的人类PMBC的单核细胞亚群。
在一个实施方案中，经过单一步骤进行步骤(iv)。
捕获在其表面上表达所需抗原的细胞(诸如CD3、CD19、CD56和/或CD16)的抗体可生物素化且随后与包含亲和素或链霉亲和素或等效生物素结合蛋白的微珠连接，或抗体可供应给已与微珠结合的细胞。微珠可以是磁性或非磁性的，且细胞在与微珠结合时可以通过离心(如果微珠是非磁性的)或通过暴露于磁铁的磁场(如果微珠是磁性的)而从细胞悬浮的溶液中除去。
在一个实施方案中，抗体在与细胞接触时与磁性微珠连接且通过用磁铁将细胞结合的微珠从溶液中拉出来除去微珠从而除去细胞。
上文公开的方法可用于从血液中分离具有低相对量的或基本上不含CD3+细胞、CD19+细胞、CD56+细胞和/或CD16+细胞的人类外周血单核细胞(PMBC)的单核细胞亚群，其在本文中用于抑制神经元变性、保护神经元免于谷氨酸中毒或促进因眼睛疾病、病症或病况而受损的视网膜或视神经中的神经再生，或用于治疗眼睛的炎性疾病、病症或病况。
现将通过以下非限制性实施例来说明本发明。
实施例
材料和方法
动物。使用成年雄性(8至10周龄)C57BL/6J小鼠和杂合突变体Cx3cr1GFP/+小鼠(B6.129P-Cx3cr1tm1Litt/J，其中CX3CR1趋化因子受体等位基因之一由编码GFP的基因取代；Jung,S.,J.Aliberti,P.Graemmel,M.J.Sunshine,G.W.Kreutzberg,A.Sher和D.R.Littman.2000.AnalysisoffractalkinereceptorCX(3)CR1functionbytargeteddeletionandgreenfluorescentproteinreportergeneinsertion.Mol.Cell.Biol.20:4106-4114)。另外，使用C57BL/6J、杂合突变体Cx3cr1GFP/+小鼠、MHC-II无效小鼠(B6.129S-H2dlAb1-Ea/J)和IL-10无效小鼠(B6.129P2-I110tm1Cgn/J；Kühn,R.,J.D.Rennick,K.Rajewsky和W.Müller.1993.Interleukin-10-deficientmicedevelopchronicenterocolitis.Cell.75:263-274)作为单核细胞和BM的供体。对于CD11c检测而言，使用在鼠类CD11c启动子的控制下带有编码GFP报道子的转基因的CD11cGFP/+转基因小鼠(B6.FVB-TgItgax-DTR/GFP57Lan/J；Jung,S.、D.Unutmaz,P.Wong、G.Sano,K.DelosSantos,T.Sparwasser,S.Wu、S.Vuthoori,K.Ko、F.Zavala等人,2002.InvivodepletionofCD11c+dendriticcellsabrogatesprimingofCD8+Tcellsbyexogenouscell-associatedantigens.Immunity.17:211-220)。FoxP3GFP小鼠是来自Dr.AlexanderRudensky,MemorialSloan-KetteringCancerCenter的慷慨馈赠。自Jackson实验室获得过表达编码亨廷顿蛋白(huntingtin)的人类基因的转基因R6/2小鼠。
如果未另外说明，动物由威兹曼科学院的动物饲养中心(theAnimalBreedingCenterofTheWeizmannInstituteofScience)供应。本文详述的所有实验均符合威兹曼科学院机构动物护理与使用委员会(theInstitutionalAnimalCareandUseCommitteeoftheWeizmannInstituteofScience)制定的规则。
BM嵌合体。如前文所述，通过在屏蔽头部的情形下使WT接受者小鼠经受致死性全身辐射(950拉德(rad))来制备[Cx3crlGFP/+>WT]BM嵌合体(Rolls,A.,R.Shechter,A.London,Y.Segev,J.Jacob-Hirsch,N.Amariglio,G.Rechavi和M.Schwartz.2008.Twofacesofchondroitinsulfateproteoglycaninspinalcordrepair:aroleinmicroglia/macrophageactivation.PLoSMed.5:e171.；Shechter等人,2009)。此屏蔽防止直接损害视网膜和除由谷氨酸中毒引起的以外的对骨髓细胞的任何浸润。次日，根据前文所述的实验方案用5×106个BM细胞使小鼠复原(Shechter等人,2009)。在BM移植8至12周后，使嵌合体小鼠经受谷氨酸中毒或EAU诱导方案。
MC-21施用。在损伤后即刻开始且在整个实验性阶段期间经腹膜内注射MC-21(CCR2的一种抗体；Mack,M.,J.Cihak,C.Simonis,B.Luckow,A.E.Proudfoot,J.H.Brühl,M.Frink,H.J.Anders,V.Vielhauer等人2001.ExpressionandcharacterizationofthechemokinereceptorsCCR2andCCR5inmice.J.Immunol.166:4697-4704)。在EAU诱导的情形下，在EAU峰值之前或之后每隔一天进行注射，总计注射5次(每次注射8μg)。
过继单核细胞转移。如先前报道分离CD115+单核细胞(Varol,C.,L.Landsman,D.K.Fogg,L.Greenshtein,B.Gildor,R.Margalit,V.Kalchenko,F.Geissmann和S.Jung.2007.Monocytesgiverisetomucosal,butnotsplenic,conventionaldendriticcells.J.Exp.Med.204:171-180)。简单来说，自小鼠的股骨和胫骨收获BM细胞且富集聚蔗糖密度梯度的单核细胞。根据制造商的实验方案，通过使用生物素化的抗CD115抗体和链霉亲和素偶联的磁性珠粒(MiltenyiBiotec)富集MACS来分离CD115+BM单核细胞群。在此程序之后，在损伤后第1天经静脉内(i.v.)注射单核细胞(WT，Cx3cr1GFP/+，IL-10缺失或MHC-II缺失)(每只小鼠4-5×106个细胞)。
BrdU疗法。根据自Zhao等人,2005(Growthfactorresponsiveprogenitorsinthepostnatalmammalianretina.Dev.Dyn.232:349-358)改编的实验方案，将BrdU(Sigma-Aldrich)溶解在PBS中并在损害后即刻经玻璃体内注射(每只眼睛1μg)且连续持续3天。通过同一孔重复进行注射，而无另外的组织渗透。预期视网膜展现与接受单次注射的视网膜可比较的形态。最后的注射后1天杀死动物以确定增生祖细胞的数量，或最后的注射后1周杀死动物以检测分化。在不存在谷氨酸中毒或IOP升高的情形下，使用相同疗法对对照动物经玻璃体内施用BrdU。注意，尽管我们无法排除在重复BrdU注射后损伤对增生RPC数量的协同作用，但因为在对经受不同单核细胞处理的动物的视网膜/睫状体进行比较时应用相同的实验方案，因此在这些处理后增生祖细胞数量的变化最可能归因于单核细胞介导的作用。
RGC的荧光金(Fluoro-Gold)标记。为检测解剖学上完整的神经元，在损伤后第3天在下列坐标处向小鼠的两个上丘处注射1μl5％的荧光金(荧光染料)盐水溶液：前囱后部2.92mm，中线侧向0.5mm，且距头盖骨2mm深度。72h后，杀死小鼠，将摘除它们的眼睛且使每个视网膜以全标本包埋在PBS中的4％多聚甲醛(PFA)中铺平。选定视野位于距视盘大致相同距离处(0.3mm)以克服随距视盘的距离而变化的RGC密度。由看不到小鼠接受的处理的观察者在荧光显微镜(放大倍数800倍)下对视野进行计数。计算每个视网膜中每个视野的RGC平均数。关于更多详情，参考Schori等人,2001(Vaccinationforprotectionofretinalganglioncellsagainstdeathfromglutamatecytotoxicityandocularhypertension:implicationsforglaucoma.Proc.Natl.Acad.Sci.USA.98:3398-3403)及Schwartz和Kipnis,2007(Modelofacuteinjurytostudyneuroprotection.MethodsMol.Biol.399:41-53)。
免疫组织化学。如前文所述，在灌注PBS以后，除去眼睛，在2.5％PFA中进行后固定处理持续24h，转移到70％乙醇中且随后包埋到石蜡中(Shechter,R.,Y.Ziv和M.Schwartz.2007.NewGABAergicinterneuronssupportedbymyelin-specificTcellsareformedinintactadultspinalcord.StemCells25:2277-2282)。用苏木精和曙红对代表性切片进行染色以用于组织病理学检查。使用以下抗体进行免疫标记：兔抗GFP(1:100；MBL)、小鼠抗Brn3a(1:50；SantaCruzBiotechnology,Inc.)。使用M.O.M.免疫检测试剂盒(VectorLaboratories)来定位小鼠一级单克隆抗体。对于活化的骨髓细胞标记而言，向二级抗体溶液中添加FITC缀合的西非单叶豆同工凝集素(BandeiraeasimplicifoliaisolectinB4，IB-4；1:50；Sigma-Aldrich)持续1h。所用的二级抗体包括Cy2/Cy3缀合的驴抗小鼠或抗兔抗体(1:150-1:200，全部来自JacksonImmunoResearchLaboratories,Inc.)。使载玻片暴露于Hoechst染色剂(1:2,000；Invitrogen)持续1min。为进行显微镜分析，使用荧光显微镜(E800；Nikon)。荧光显微镜装配有数字摄像机(DXM1200F；Nikon)和20倍的NA0.50或40倍的NA0.75物镜(PlanFluor；Nikon)。使用NIS-Elements,F3(Nikon)采集软件对在24℃下进行后固定处理的组织进行记录。收集图像、合并且通过使用Photoshop9.0(Adobe)对对比率进行微调来进行优化，并使用CanvasX(Deneba软件)进行排列。
视网膜的分离和流式细胞检测分析。如前文所述，在心脏内灌注PBS之后，通过解剖除去视网膜并处理成单细胞悬浮液(Kerr,E.C.、B.J.Raveney,D.A.Copland,A.D.Dick和L.B.Nicholson.2008.Analysisofretinalcellularinfiltrateinexperimentalautoimmuneuveoretinitisrevealsmultipleregulatorycellpopulations.JAutoimmun31:354-361,Luger,D.,P.B.Silver,J.Tang,D.Cua,Z.Chen,Y.Iwakura,E.P.Bowman,N.M.Sgambellone,C.C.Chan和R.R.Caspi.2008.EitheraTh17oraTh1effectorresponsecandriveautoimmunity:conditionsofdiseaseinductionaffectdominanteffectorcategory.JExpMed205:799-810)。以下经荧光染料标记的mAb从BD、BioLegend、eBioscience或AbDSerotec购买并根据制造商的实验方案进行使用：PE缀合的抗CD11b、CD206(MMR)和IL-4Rα抗体；PerCP-cy5.5缀合的抗Ly6C和CD11b抗体；别藻蓝素(APC)缀合的抗CD115、TCRβ、FoxP3和CD204抗体；Alexa647缀合的抗Dectin-1抗体以及太平洋蓝/明亮紫缀合的抗TCRβ、CD4和CD45.2抗体。根据制造商的实验方案，使用Foxp3染色缓冲液套件(eBioscience)进行FoxP3染色。使用FACSDiva软件在FACSLSRII血细胞计数器上(两者都来自BD)分析细胞。用FlowJo软件(TreeStar,Inc.)进行分析。在每次实验中，使用相关的阴性和阳性对照组来确定受关注的群组并排除其它群组。
活体内荧光成像。麻醉小鼠并使用塑料装置轻柔固定。为观察视网膜，使用一滴0.5％的托品酰胺(Tropicamide，Dr.Fischer)扩大瞳孔且使用一滴眼科润滑剂(Celluspan；Dr.Fischer)以使得玻璃盖片放置在眼睛上。对小鼠经静脉内注射葡聚糖罗丹明(每只动物1mg；Sigma-Aldrich)用于观察血管。将小鼠放置在装配有荧光照明器和PixelflyQE电荷耦合的装置摄像机(PCO)的Zoom立体显微镜SZX-RFL-2(Olympus)下。红色滤光镜组的激发和发射分别为510-550nm和590nm(长波通)。绿色滤光镜组的激发为460-490nm且发射为510-550nm。荧光暴露时间为50ms。使用Camware摄像机控制软件程序(PCO)获取图像。使用ImageJ1.43软件(W.Rasband,NationalInstitutesofHealth,Bethesda,MD)进行图像分析。
统计分析。使用学生t检验(Student’sttest)分析数据对两组进行比较。使用单因素方差分析(One-wayANOVA)来比较几个组。在排除无效假设(F＜0.05)后，使用Fisher的LSD程序来追踪对各组的成对比较。结果表示为平均值±SE。在图中，y轴误差条表示SE。对于葡萄膜炎研究而言，使用Levene检验来检查方差齐性。在等方差的情形下，使用学生t检验分析数据对两组进行比较或通过单因素方差分析来比较几个组。在排除无效假设(p<0.05)后，使用Tukey的HSD检验来追踪对各组的成对比较。在不等方差的情形下，对数据进行对数转换以在可能时实现等方差；否则，使用Kruskal-Wallis检验来比较几个组，接着进行Dunn检验。结果表示为平均值±SE。在图中，y轴误差条表示SE。
实施例1：从PBMC分离表达高水平的CX3CR1和低水平的CCR2的人类单核细胞
在人类中，由CD14和CD16的表达来定义单核细胞的三个群体，即CD14+CD16-、CD14+CD16+和CD14dimCD16+。CD14+CD16-单核细胞表示80％至90％的血单核细胞，且表达高水平的趋化因子受体CCR2和低水平的趋化因子受体CX3CR1(Fractalkine的受体)。与此主子集相反，人类CD16+单核细胞表达高水平的CX3CR1和低水平的CCR2(Cros等人,2010)。根据Cros等人(2010)，基因表达分析显示人类CD14dimCD16+与鼠类巡逻Gr1dim单核细胞之间的类似性。CD14dimCD16+细胞是在组织的固有局部监控和自体免疫疾病的发病机理中所涉及的真实单核细胞。
为了从PBMC分离表达高水平的CX3CR1和低水平的CCR2的CD14dimCD16+细胞，如流程I中所说明，我们使用阴性选择CCR2(CCR2+消耗)和阳性选择CD14+(CD14+)的组合方法，同时从PBMC的分离CD14+用作对照。
流程I
富集CD14dimCD16+细胞群：
(i)从人类周边血液分离单核细胞：将从健康供体收集的新鲜血液(8ml)用PBS中2.5％的FCS以1:1稀释，并负载聚蔗糖梯度(Ficoll-Paqueplus,AmershamBiosciences)上。将试管在20℃下以1000g离心20min。收集单核细胞相并用PBS洗涤两次。
(ii)CCR2+消耗：首先通过在室温下用FcR阻断试剂(2.5μl/106个细胞)(130-059-901,MiltenyiBiotec)处理15分钟将单核细胞进行Fc受体阻断。然后不经洗涤，添加单克隆抗人类CCR2-生物素试剂(FAB151B,R&DSystems)(10μl/106个细胞)并在2℃-8℃下孵育35分钟。然后用冷的MACSTM缓冲剂(1mMEDTA，PBS中2％的FCS)洗涤细胞并在2℃-8℃下添加链霉亲和素微珠(130-048-101,MiltenyiBiotec)(20μl/107个细胞)持续20分钟。用0.5mlMACSTM缓冲剂洗涤细胞且再悬浮。根据制造商的实验方案，用LD管柱(130-042-901,MiltenyiBiotec)进行CCR2+细胞的消耗。
(iii)分离CD14+细胞：用MACSTM缓冲剂(80μl/107个细胞)使细胞再悬浮，并在2℃-8℃下添加CD14+微珠(130-050-201,MiltenyiBiotec)(20μl/107个细胞)持续15分钟。然后洗涤细胞并用0.5mlMACS缓冲剂再悬浮。根据制造商的实验方案，通过在LS管柱(130-042-401,MiltenyiBiotec)上使用磁性分离进行CD14+细胞的阳性选择。
(iv)对人类单核细胞的荧光活化细胞拣选(FACSTM)染色。根据制造商的实验方案对所有样品染色。通过70μm的尼龙网布来过滤所有样品并用FCR阻断试剂(30μl/106个细胞)(130-059-901,MiltenyiBiotec)在室温下阻断15分钟。根据制造商的实验方案使用以下经荧光染料标记的抗人类单克隆抗体：PerCP缀合的抗CD45(345809,BD)、FITC缀合的抗CD115(FAB329F,R&DSystems)、太平洋蓝TM缀合的抗CD14(BLG-325616)、Alexa700缀合的抗CD16(BLG-302026)、PE缀合的抗CX3CR1(MBL-D070-5)和PerCP缀合的抗CCR2(BLG-335303)。
实施例2：抑制视网膜中的神经元变性。
我们选择使用几种视网膜变性模型：用谷氨酸(在神经变性情况下一种常见的毒性介质)诱导EAU视网膜中毒；视神经损伤；IOP升高的模型；和最佳模拟色素上皮细胞变性病理的转基因小鼠。
EAU诱导。这是一种人类后葡萄膜炎模型。由于葡萄膜炎常导致视网膜恶化，因此被认为是一种CNS神经变性模型。对小鼠经皮下注射500μg与含有浓度为2.5mg/ml的结核杆菌(Mycobacteriumtuberculosis)菌株H37.RA的完全弗氏佐剂(CompleteFreund’sAdjuvant，CFA)呈1:1乳剂(最终为1.25mg/ml)形式的源自人类光感受器间维生素A类结合蛋白(interphotoreceptorretinoidbindingprotein，IRBP)残基1-20(22)(AnaSpec,GLBiochem(Shanghai)Ltd.或位于威兹曼研究所的肽合成单位)的肽。对小鼠经腹膜内共同注射1μg百日咳杆菌(Bordellapertussis)毒素(Sigma)。
此疗法在80-100％的动物中在免疫后14天诱发疾病。疾病峰值出现在免疫后的第22天和第29天之间。在谷氨酸中毒后第7天、或在EUA疾病峰值之前、期间和之后通过对Brn3a(一种特异性的RGC标记)进行免疫染色(Nadal-Nicolás,F.M.,M.Jiménez-López,P.Sobrado-Calvo,L.Nieto-López,I.Cánovas-Martínez,M.Salinas-Navarro,M.Vidal-Sanz和M.Agudo.2009.Bm3aasamarkerofretinalganglioncells:qualitativeandquantitativetimecoursestudiesinnaiveandopticnerve-injuredretinas.Invest.Ophthalmol.Vis.Sci.50:3860-3868)以及通过用荧光金逆行标记RGC(标记解剖学上完整轴突细胞体的一种常用方法)(Schori等人,2002,前文；Schwartz和Kipnis,2007,前文)来评估存活的RGC。
玻璃体内谷氨酸毒性模型。许多CNS病症已报道谷氨酸升高。在其作为兴奋毒性化合物的作用中，谷氨酸是急性和慢性(包括青光眼中的视神经变性)变性病症中最常见的毒性介质之一(Doble,1999)。因此这是中枢神经系统神经的通用神经变性模型。当向眼睛中注射谷氨酸时，此模型因其发生在各种眼睛疾病中而尤其作为视网膜神经节神经变性的代表，所述眼睛疾病诸如视网膜变性病症，例如年龄相关性黄斑变性或色素性视网膜炎；前部缺血性视神经病变、青光眼或葡萄膜炎。如前文所述，麻醉小鼠，用直接应用到眼睛的局部麻醉(Localin；Dr.Fischer)进行处理并经玻璃体内注射总体积为1μl的含有400nmol1-谷氨酸的盐水(Sigma-Aldrich)(YolesE,FriedmannI,BarouchR,ShaniY,SchwartzM.Self-Protectivemechanismawakenedbyglutamateinretinalganglioncells.JNeurotrauma.2001年3月；18(3):339-4；Schori,H.,E.Yoles,L.A.Wheeler,T.Raveh,A.Kimchi和M.Schwartz.2002.Immune-relatedmechanismsparticipatinginresistanceandsusceptibilitytoglutamatetoxicity.Eur.J.Neurosci.16:557-564)。
N-甲基-N-亚硝基脲(MNU)毒性模型。单次全身施用MNU导致各种动物物种的视网膜变性。视网膜变性是高度可再生的，而且光感受器细胞损失发生在通过类似人类色素性视网膜炎的细胞凋亡施用MNU后的7天内(TsuburaA,YoshizawaK,KuwataM,UeharaN.AnimalmodelsforretinitispigmentosainducedbyMNU；diseaseprogression,mechanismsandtherapeutictrials.HistolHistopathol.2010年7月；25(7):933-44.Review)
小鼠的视神经损伤。校准的视神经损伤由于轴突损伤的逆行信号而诱发进行性神经节细胞死亡(Levkovitch-VerbinH,Harris-CerrutiC,GronerY,WheelerLA,SchwartzM,YolesE.RGCdeathinmiceafteropticnervecrushinjury:oxidativestressandneuroprotection.InvestOphthalmolVisSci.2000年12月；41(13):4169-74)。简单来说，麻醉小鼠并使其在距眼球1-2mm的视神经眶内部分中经受严重的损伤。借助于双目操作显微镜，切割结膜并使视神经暴露。使用交互作用校准的镊子且特别小心以不影响血液供应，历时2s使神经受损。
IOP升高的模型。眼内压(IOP)是造成青光眼的风险因素，而且由于其可造成视网膜变性且视神经通常充当神经变性模型且尤其充当青光眼模型。如前文所述产生缺血性损伤(Da,T.和A.S.Verkman.2004.Aquaporin-4genedisruptioninmiceprotectsagainstimpairedretinalfunctionandcelldeathafterischemia.Invest.Ophthalmol.Vis.Sci.45:4477-4483；BenSimon,G.J.,S.Bakalash,E.Aloni和M.Rosner.2006.Aratmodelforacuteriseinintraocularpressure:immunemodulationasatherapeuticstrategy.Am.J.Ophthalmol.141:1105-1111)。简单来说，麻醉之后，通过向前房中引入与等张盐溶液(盐水)储器连接的微量吸液管使眼内压(IOP)升高。储器位于适当高度，导致120mmHg的压力持续60min。
转基因小鼠模型。举例来说，相关的转基因小鼠是无脉络膜(CHM)基因敲除小鼠(TanyaTolmachova,SileneT.Wavre-Shapton,AlunR.Barnard,RobertE.MacLaren,ClareE.Futter和MiguelC.Seabra.RetinalPigmentEpitheliumDefectsAcceleratePhotoreceptorDegenerationinCellType-SpecificKnockoutMouseModelsofChoroideremia.InvestOphthalmolVisSci.2010年10月；51(10):4913-4920.)和具有视紫红质突变的转基因小鼠(Pro23His)(JaneE.Olsson,JonW.Gordon,asilS.Pawlyk,DorothyRoof,AnnmarieHayes,RobertS.Molday,ShizuoMukai,GlennS.Cowley,EliotL.Berson,ThaddeusP.Dryja.Transgenicmicewitharhodopsinmutation(Pro23His):Amousemodelofautosomaldominantretinitispigmentosa.Neuron(1992)9:815-830)。
实验方案。从同系小鼠的骨髓分离用于移植的单核细胞。用与CD3、CD19和CD56的抗体缀合的微珠标记PBMC来消耗T-细胞、B-细胞和NK细胞。收集通过磁性管柱的未标记细胞。将此部分用抗CD16微珠标记并再次负载到磁性管柱上。收集通过管柱的细胞并染色以供在FACS中用CD14和CD16荧光抗体进行分析。在PBMC中，总的活细胞中的9％是单核细胞(CD14+)。除单核细胞以外，约10％是CD16+。在最终产物中，约90％的活细胞是单核细胞，除此以外的CD16+小于0.1％。
我们随后检查上述亚群在视网膜神经节细胞受到攻击之前或之后注射到眼睛中时，在视网膜损伤后保护视网膜神经节细胞的能力。
通过在损害发生后的不同时间点单次注射自体单核细胞来处理小鼠。每只动物模型检查两种施用途径：(i)玻璃体内注射和(ii)视网膜下注射。研究的终点是使用形态标准并通过对在视网膜的横断切片中存活的细胞元素进行计数来评估视网膜中的神经元存活率。
例如根据Warfinge等人,2011进行单核细胞亚群的视网膜下注射；然而可使用经视网膜下注射单核细胞的任何技术。将动物置于全身麻醉下且如前文所述进行玻璃体视网膜手术(K.Warfvinge,J.F.Kiilgaard,E.B.Lavik等人,“Retinalprogenitorcellxenograftstothepigretina:morphologicintegrationandcytochemicaldifferentiation,”ArchivesofOphthalmology,第123卷,第10期,第1385-1393页,2005)。简单来说，通过肌肉内注射由咪达唑仑(midazolam)、唑拉西泮(zolazepam)、替来他明(tiletamine)、甲苯噻嗪(xylazine)、氯胺酮(ketamine)和美沙酮(methadone)组成的注射液使猪预麻醉。然后对其进行插管、人工通气并用异氟烷/氧麻醉。局部用苯肾上腺素、托品酰胺和阿托品(atropine)扩张操作性瞳孔。准备手术区域并且在手术开始之前以通常无菌的方式挂上消毒帷。进行局部的3通路玻璃体切除术且绿色氩激光器烧灼以网格图形的形式应用于视网膜的中央区域。准备视网膜切开术且通过适当的针头向对应于激光烧灼区域中的视网膜下间隙递送单核细胞。在注射时通过直接观察来确认正确的支架放置。在手术结束时预防性地给予氯霉素以避免感染。
实施例3.用单核细胞亚群治疗年龄相关性黄斑变性。使Albino大鼠暴露于12小时的3000勒克斯(lux)循环光持续1、3或6个月。在安乐死之前进行眼底检查、眼底照相术、荧光素和吲哚菁绿血管造影术以及光学相干断层成像术。在1、3或6个月后使光暴露的动物安乐死以供组织病理学评估。在4-羟基-2-壬烯醛-和硝基酪氨酸修饰的蛋白存在下通过免疫荧光染色检查视网膜(DanielM.Albert等人,2010.Developmentofchoroidalneovascularizationinratswithadvancedintensecycliclight-inducedretinaldegeneration.ArchOphthalmol.2010；128(2):212-222)。如上所述通过在损害发生后的不同时间点单次注射自体单核细胞来处理经光暴露的动物。每只动物模型检查两种施用途径：(i)玻璃体内注射和(ii)视网膜下注射。研究的终点是使用形态标准并通过对在视网膜的横断切片中存活的细胞元素进行计数来评估视网膜中的神经元存活率。
AMD与阿尔茨海默病(Alzheimer’sdisease)之间的类似性。AMD和阿尔茨海默病都是影响相当大比例老年人的慢性神经变性病症。这些病症的特征在于功能的不可逆丧失，无法治愈。AMD和阿尔茨海默病中发生的变性在某种程度上具有共同的发病机理(Klaver等人,1999.Isage-relatedmaculopathyassociatedwithAlzheimer'sdisease？TheRotterdamstudy.AmJEpidemiol；150:963-8)。尽管AMD和阿尔茨海默病的病因大部分未知，但这两种疾病的发病机理显示出一些显著的类似性。在AMD中，早期的组织病理学表现是细胞外玻璃膜疣沉积和基底层沉积(Hageman,GS.&Mullins,RF.Molecularcompositionofdrusenasrelatedtosubstructuralphenotype.MolVis5,28(1999))。这些病变含有脂质、糖蛋白和粘多糖，其大概来源于变性的神经视网膜。这些沉积的积聚与光感受器的损耗和黄斑功能的后续恶化相关(Holz等人,Bilateralmaculardruseninage-relatedmaculardegeneration.Prognosisandriskfactors.Ophthalmology101,1522-8(1994))。如上文所述，阿尔茨海默病的早期病理学特点是存在细胞外老年斑(Selkoe,1991.ThemolecularpathologyofAlzheimer'sdisease.Neuron6,487-98)。这些斑块由多种组分组成，包括由称作淀粉状前体蛋白的跨膜多肽家族经蛋白水解裂解所产生的小肽。广泛被认为主要造成阿尔茨海默病病理的两种肽称作淀粉状-β(Aβ)肽。淀粉状沉积和玻璃膜疣的共有组分包括蛋白，诸如玻璃体结合蛋白、淀粉状P、载脂蛋白E且甚至为Aβ肽和与阿尔茨海默病中的淀粉状斑块相关的淀粉状低聚物(Luibl等人,2006.Drusendepositsassociatedwithagingandage-relatedmaculardegenerationcontainnonfibrillaramyloidoligomers.JClinInvest116,378-85；Mullins等人,2000.Drusenassociatedwithagingandage-relatedmaculardegenerationcontainproteinscommontoextracellulardepositsassociatedwithatherosclerosis,elastosis,amyloidosis,anddensedepositdisease.FasebJ14,835-46；Yoshida等人,2005.Thepotentialroleofamyloidbetainthepathogenesisofage-relatedmaculardegeneration.JClinInvest115,2793-800)。
阿尔茨海默病(Alzheimer’sdisease)中存在的Aβ肽使小神经胶质细胞活化以产生潜在的神经毒性物质，诸如活性氧和活性氮物质、促炎性细胞因子、补体蛋白和引起神经变性变化的其它炎症介质。与阿尔茨海默病相关的炎症反应常涉及到CD11b+活化的小神经胶质细胞，代表CNS中固有的免疫系统。CD11b+小神经胶质细胞被报道与年龄相关的正常人类大脑相关(Streit,2004.MicrogliaandAlzheimer'sdiseasepathogenesis.JNeurosciRes77,1-8)，且所述小神经胶质细胞可能是导致年龄相关认知丧失和神经形成受损的物质(Monje等人,2003.Inflammatoryblockaderestoresadulthippocampalneurogenesis.Science302,1760-5)。在阿尔茨海默病患者中也已发现了CD11b(Akiyama&McGeer,1990.Brainmicrogliaconstitutivelyexpressbeta-2integrins.JNeuroimmunol30,81-93)。此外，在淀粉状沉积以及玻璃膜疣中存在炎症介质，表明炎症路径在AMD和阿尔茨海默病中可能具有共同的作用(Hageman等人,2001.Molecularcompositionofdrusenasrelatedtosubstructuralphenotype.MolVis5,28)。局部炎症在玻璃膜疣生物起源中的作用表明与在阿尔茨海默病中发生的过程类似，其中细胞外斑块和沉积的积聚引发使主要病原刺激的作用加剧的局部慢性炎症反应(Akiyama等人,2000.InflammationandAlzheimer'sdisease.NeurobiolAging21,383-421)。
鉴于上文，可使用利用将神经元暴露于聚集的Aβ的模型来评估如上文定义的单核细胞亚群对AMD治疗的功效。
实施例4.玻璃体内注射小鼠单核细胞-在谷氨酸中毒和特征化注射细胞后对视网膜神经节存活的作用。
实验方案：
麻醉小鼠且经玻璃体内向右眼中注射400nmolL-谷氨酸(在1μl盐水中)。-次日，纯化细胞以用于玻璃体内注射：自供体小鼠(在cx3cr1骨髓启动子的情形下带有GFP受体)的股骨和胫骨收集来自小鼠骨髓细胞的CD115+骨髓单核细胞(BMMC)且富集聚蔗糖(Ficoll)密度梯度的单核细胞。通过磁性活化的细胞拣选(MACS)系统，使用生物素化的抗CD115抗体和链霉亲和素偶联的磁性珠粒(MiltenyiBiotec)来分离CD115+BM单核细胞群以供阳性选择目标群。将细胞经玻璃体内注射到GT中毒的眼睛中(通过前一日引入GT的同一孔)，每只小鼠105个细胞(在1μlPBS中)。对对照组注射PBS。
注射GT后第7天，对小鼠进行灌注并将眼睛收集到2.5％的PFA中过夜且随后将溶液替换成1％的PFA并使眼睛再浸没3-4天，并进一步处理以供用RGC标记Brn3a进行免疫组织学染色。每种样品定量取自眼睛不同深度的四个切片。在视网膜的神经节细胞层中计数的细胞是Brn3a+、IB-4-和Hoechst+。注射PBS的眼睛充当阴性对照，且来自同一小鼠的无损伤的对侧眼睛充当RGC存活的阳性对照。
通过GFP染色追踪眼睛中经注射的小鼠细胞，且通过对几种免疫标记(细胞因子、生长因子、吞噬作用标记)染色对其表型进行特征化。
结果：
经玻璃体内注射的小鼠单核细胞对RGC具有保护作用(图1A-C)。在经注射眼睛的玻璃体中以及在接近神经节细胞层处(受损的RGC位于此处)检测到单核细胞。另外，在视网膜下间隙可检测到一些细胞(图2)。
在CX3CR1-GFP+小鼠单核细胞中，GFP的双重免疫染色以及免疫标记的阵列揭示了IL-10、TGF-β、IGF-1、BDNF、CD36和Arg-1(精氨酸酶-1)以及TNFα和IL-1β的表达(图2)。注意，这是定性分析，且因此在注射细胞中表达不同类型标记的频率有待确定。
实施例5.在视神经损伤后基于CNS的自体免疫疫苗接种扩大了巨噬细胞和T细胞浸润到视网膜中。
为了表明扩大单核细胞募集到受损神经系统部位的方法是无关紧要的，而且不仅对视网膜的损伤可治疗，对视神经的损伤也可治疗，因此通过用CNS特异性抗原进行免疫使内源细胞迁移至视神经的受损部位。
实验方案：
通过在屏蔽头部的情形下使WT接受者小鼠经受致命的全身辐射(950拉德)来制备[Cx3cr1GFP/+→WT]BM嵌合体以防止对视网膜的任何直接损害或除由视神经损伤(ONC)引起的以外的骨髓细胞浸润。次日，通过向尾静脉中经静脉内注射源自Cx3cr1GFP/+转基因小鼠的5×106个骨髓细胞使小鼠复原。在得到的小鼠中，只有自血液浸润的单核细胞带有GFP标记。
对一组小鼠经皮下注射100μl在2.5mg/ml完全弗氏佐剂(Difco)中含有100μgMOG变构肽(45D；序列：MEVGWYRSPFDRVVHLYRNGK)的乳剂。
疫苗接种一周后，使小鼠(接种疫苗和未接种疫苗)麻醉并在双目操作显微镜下使用交互作用的镊子使其右侧视神经经受严重损伤。对侧神经保持不受干扰。
ONC后第7天，对小鼠进行灌注并收集视网膜且处理成单细胞悬浮液以用于流式细胞检测分析。
结果：
ONC导致视网膜中总的白血球增加(CD45+)，即在45D-接种疫苗的有损伤小鼠体内增强的增加(图3A)。
与来自未经接种疫苗的有损伤小鼠的视网膜相比，在ONC之前用45D进行疫苗接种的小鼠的视网膜中的巨噬细胞和T细胞也增加(图3B和C)。
实施例6.评估基于CNS的自体免疫疫苗接种在视神经损伤后对视网膜神经节细胞赋予神经保护的能力。
实验方案：
以下实验中将表明疫苗接种对增加受损视网膜中周边单核细胞数量的作用与RGC在视神经损伤后的存活率之间的相关性。对一组小鼠经皮下注射100μ1在2.5mg/ml完全弗氏佐剂中含有100μgMOG变构肽45D(在45位处由丝氨酸变为天冬氨酸的髓磷脂少突细胞糖蛋白(MOG)35-55)的乳剂(Difco)。
疫苗接种一周后，使小鼠(接种疫苗和未接种疫苗)麻醉并在双目操作显微镜下使用交互作用的镊子使其右侧视神经经受严重损伤。对侧神经保持不受干扰。
ONC后第7天，对小鼠进行灌注并将眼睛收集到固定剂(2.5％PFA→1％PFA)中，且进一步处理以供用RGC标记Brn3a进行免疫组织学染色。每种样品定量取自眼睛不同深度的四个部分。在视网膜的神经节细胞层中计数的细胞是Bm3a+、IB-4-和Hoechst+。来自未接种疫苗小鼠的无损伤的对侧眼睛充当RGC存活的阳性对照(100％)。
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Claims (20)
1.一种具有低相对量的或基本上不含CD3+细胞、CD19+细胞和CD56+细胞的外周血单核细胞(PBMC)的单核细胞亚群，其用于抑制神经元变性、保护神经元免于谷氨酸中毒或促进视网膜或视神经中的神经再生，其中所述视网膜或视神经因眼睛疾病、病症或病况而受损。
2.根据权利要求1所述的PBMC的单核细胞亚群，其还基本上不含CD16+细胞。
3.一种具有低相对量的或基本上不含CD3+细胞、CD19+细胞、CD56+细胞和CD16+细胞的PBMC的单核细胞亚群，其用于抑制神经元变性、保护神经元免于谷氨酸中毒或促进视网膜或视神经中的神经再生，其中所述视网膜或视神经因眼睛疾病、病症或病况而受损。
4.根据权利要求1或3所述的PBMC的单核细胞亚群，其基本上富含CD14+细胞。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的PBMC的单核细胞亚群，其中所述疾病、病症或病况选自视网膜变性病症，其选自年龄相关性黄斑变性或色素性视网膜炎；前部缺血性视神经病变；青光眼或葡萄膜炎。
6.一种具有低相对量的或基本上不含CD3+细胞、CD19+细胞和CD56+细胞的外周血单核细胞(PBMC)的单核细胞亚群，其用于治疗眼睛的炎性疾病、病症或病况。
7.根据权利要求6所述的PBMC的单核细胞亚群，其还基本上不含CD16+细胞。
8.一种具有低相对量的或基本上不含CD3+细胞、CD19+细胞、CD56+细胞和CD16+细胞的PBMC的单核细胞亚群，其用于治疗眼睛的炎性疾病、病症或病况。
9.根据权利要求6或8所述的PBMC的单核细胞亚群，其基本上富含CD14+细胞。
10.根据权利要求6至9中任一项所述的PBMC的单核细胞亚群，其用于抑制神经元变性、保护神经元免于谷氨酸中毒或促进视网膜或视神经中的神经再生，其中所述视网膜或视神经因眼睛的炎性疾病、病症或病况而受损。
11.根据权利要求10所述的PBMC的单核细胞亚群，其中所述疾病、病症或病况选自视网膜变性病症，其选自年龄相关性黄斑变性或色素性视网膜炎；前部缺血性视神经病变；青光眼或葡萄膜炎。
12.根据权利要求6至9中任一项所述的PBMC的单核细胞亚群，其用于治疗选自巩膜炎、角膜炎、角膜溃疡、雪盲症、泰格森氏浅层点状角膜病变、角膜新生血管形成、富克斯氏营养不良、圆锥形角膜、干燥性角膜结膜炎或虹膜炎的眼睛炎性疾病。
13.根据权利要求1至12中任一项所述的PBMC的单核细胞亚群，其是人类PBMC。
14.根据权利要求13所述的PBMC的单核细胞亚群，其是自体PBMC。
15.根据权利要求13所述的PBMC的单核细胞亚群，其是异体PBMC。
16.根据权利要求14或15所述的PBMC的单核细胞亚群，其经配制用于注射。
17.根据权利要求16所述的PBMC的单核细胞亚群，其经配制用于注射至眼睛中。
18.一种组合物，其包含根据权利要求1至17中任一项所述的PBMC的单核细胞亚群。
19.一种抑制神经元变性、保护神经元免于谷氨酸中毒或促进视网膜或视神经中的神经再生的方法，其中所述视网膜或视神经因眼睛疾病、病症或病况而受损，所述方法包括向有需要的个体施用有效量的根据权利要求1至17中任一项所述的PBMC的单核细胞亚群。
20.一种治疗眼睛炎性疾病、病症或病况的方法，其包括向有需要的个体施用有效量的根据权利要求6至17中任一项所述的PBMC的单核细胞亚群。
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