CN101305091A - 分离的髓样骨髓细胞群及用其治疗的方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种分离的髓样骨髓细胞群，其包含大部分为谱系阴性的细胞，并表达CD44抗原和CD11b抗原这二者。这些细胞在眼内施用给哺乳动物、特别是罹患眼退化性疾病的哺乳动物的眼时具有有益的血管营养性和神经营养性活性。髓样骨髓细胞如下分离：用抗CD44(透明质酸受体)、抗CD11b或抗这二者的抗体处理骨髓细胞，使用流式细胞术由其中正选择表达CD44和/或CD11b的细胞。本发明的分离的髓样骨髓细胞可用编码治疗上有用的蛋白的基因转染，用于传递所述基因至视网膜。

Description

分离的髓样骨髓细胞群及用其治疗的方法

相关申请的交叉引用

本申请要求2005年2月24日提交的美国临时专利申请序号60/656,037的权益，该临时申请在此引入作为参考。

政府利益声明

本文所述工作的一部分由美国国立卫生研究院国立眼科研究所(National Eye Institute of the National Institutes of Health)的资助号EY11254和EY12598资助。美国政府在本发明中享有一定权利。

发明领域

本发明涉及分离的哺乳动物骨髓细胞。更具体地说，本发明涉及具有髓样细胞特征并能够在玻璃体内注射入眼中时被掺入视网膜血管系统中的分离的骨髓细胞群。本发明还涉及通过给哺乳动物眼施用分离的骨髓细胞治疗眼退化性疾病的方法。

发明背景

年龄相关性黄斑变性(ARMD)与糖尿病性视网膜病(DR)在工业化国家是视力丧失的主因，由异常的视网膜新血管生成所致。因为视网膜由界限清楚的神经元层、神经胶质层和血管元件层组成，所以诸如在血管增生或水肿中可见的那些相对小的紊乱即可导致视觉功能显著丧失。遗传性视网膜变性，例如色素性视网膜炎(RP)，也与诸如小动脉狭窄及血管萎缩之类的血管异常相关。大部分遗传性人视网膜变性特异性地侵袭视杆光感受器，但也存在伴随的视锥丧失，视锥是黄斑的主要细胞组分，黄斑是人视网膜中负责中央精细的视敏度的区域。视锥特异性存活因子近来已有描述(Mohand-Said等，1998，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，95：8357-8362)，于视网膜变性小鼠模型中可促进视锥存活。

遗传性视网膜变性影响多达1/3500的个体，其特征是进行性夜盲、视野缺损、视神经萎缩、小动脉变弱、血管透性改变及通常会发展为全盲的视野中心缺损(Heckenlively，J.R.编辑，1988；RetinitisPigmentosa，Philadelphia：JB Lippincott Co.)。这些疾病的分子遗传学分析已在110多种不同基因中识别出突变，这些突变在已知受侵袭的个体中仅占相对较小的百分率(Humphries等，1992，Science 256：804-808；Farrar等，2002，EMBO J.21：857-864)。这些突变中有很多都与包括视紫红质、cGMP磷酸二酯酶、rds外周蛋白及RPE65在内的光转导器中的酶组分和结构组分相关。尽管有这些观察结果，但仍没有减缓或逆转这些视网膜变性疾病演进的有效疗法。在将野生型转基因传递到有特定突变的动物的光感受器或视网膜色素上皮(RPE)时，基因疗法的新进展已实现了小鼠中rds(Ali等，2000，Nat.Genet.25：306-310)及rd(Takahashi等，1999，J.Virol.73：7812-7816)表型与狗中RPE65表型(Acland等，2001，Nat.Genet.28：92-95)的成功逆转。

多年来已知在正常成人循环系统与骨髓中存在干细胞群。这些细胞的不同亚群可依照造血谱系阳性(Lin⁺)或谱系阴性(Lin^-)进行谱系分化。此外，近来已表明谱系阴性造血干细胞(HSC)群含有能够在体外和体内形成血管的内皮祖细胞(EPC)(参见Asahara等，1997，Science275：964-7)。这些细胞可参与正常的和病理性的出生后血管生成(参见Lyden等，2001 Nat.Med.7，1194-201；Kalka等，2000，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.97：3422-7；及Kocher等，2001，Nat.Med.7：430-6)，以及分化成各种各样的非内皮细胞类型，包括肝细胞(参见Lagasse等，2000，Nat.Med.6：1229-34)、小神经胶质细胞(参见Priller等，2002 Nat.Med.7：1356-61)、心肌细胞(参见Orlic等，2001，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.98：10344-9)及上皮细胞(参见Lyden等，2001，Nat.Med.7：1194-1201)。尽管这些细胞已用于若干血管生成的实验模型，但EPC靶向新生血管系统的机制仍是未知的，而且尚没有已鉴定的将有效增加对特定血管系统产生影响之细胞的数目的策略。

来自骨髓的造血干细胞是目前常用于治疗应用的唯一干细胞类型。骨髓HSC应用于移植已超过40年。目前，正在研究收获纯化的干细胞的先进方法，以开发出治疗白血病、淋巴瘤及遗传性血液病的疗法。已研究了干细胞在人中治疗少数人类患者的糖尿病及晚期肾癌的临床应用。

发明概述

本发明提供一种分离的髓样骨髓(MLBM)细胞群，其通过正选择哺乳动物骨髓中表达CD44、CD11b或这两种抗原的细胞来生产。这些细胞在眼内施用给哺乳动物、特别是罹患眼退化性疾病的哺乳动物的眼时表现出有益的血管营养性和神经营养性活性。本发明MLBM细胞群可如下分离：用抗CD44(透明质酸受体)的抗体、抗CD11b的抗体或抗这两种抗原的抗体处理骨髓细胞，并正选择与所述一种或多种抗体免疫反应的细胞，视情况而定(例如使用流式细胞术或包被抗体的珠或结合抗体的珠分离所述细胞)。本发明MLBM细胞群的大部分细胞是谱系阴性的，并且表达CD44抗原和CD11b抗原这二者。

本发明还提供治疗哺乳动物中的血管营养性和神经营养性疾病的方法。所述方法包括优选通过眼内注射，给哺乳动物的患病眼施用MLBM细胞群的分离细胞。优选地，MLBM细胞群对待治疗的哺乳动物是自体的(即MLBM细胞群分离自待治疗个体哺乳动物的骨髓)。该治疗方法缓解罹患眼病的哺乳动物视网膜中的血管变性和光感受器神经元变性。所述细胞以足以延迟视网膜中血管和神经退化的量施用。有益的是，MLBM细胞群之细胞掺入到视网膜血管系统中，并分化为内皮细胞，而且同时掺入到神经元网络中，缓解视网膜中的视锥细胞变性。分离的哺乳动物MLBM细胞群包括这样的细胞：其在玻璃体内注射入眼中时选择性地靶向活化的视网膜星形胶质细胞，但仍稳定地掺入到眼的新生血管系统和神经元网络中。优选所述哺乳动物为人。

在一个优选实施方案中，分离的髓样骨髓细胞群中至少约75％的细胞表达CD44，更优选地至少约90％的细胞表达CD44。

在一个优选实施方案中，用治疗上有用的基因转染MLBM细胞群之细胞。例如，所述细胞可用操作性编码神经营养药或抗血管生成药的多核苷酸转染，所述神经营养药或抗血管生成药通过基于细胞的基因治疗形式选择性地靶向新生血管系统，并抑制新血管形成，而对既有血管无影响。在一个实施方案中，本发明的分离的MLBM细胞群包含编码血管生成抑制肽的基因。MLBM细胞群的血管生成抑制细胞可用于在诸如ARMD、DR和某些与异常血管系统相关的视网膜变性的疾病中调节异常的血管生长。在另一个优选实施方案中，转染本发明MLBM细胞群的分离细胞，以使其包含编码神经营养肽的基因。神经营养性的转染MLBM细胞可用于在涉及视网膜神经变性的眼病如青光眼、色素性视网膜炎等中促进神经元拯救。

用本发明的分离的MLBM细胞群治疗眼的一个具体优势是在用MLBM细胞群之细胞玻璃体内治疗的眼中观察到的血管营养性和神经营养性拯救作用。在用本发明MLBM细胞群之细胞治疗的眼中，视网膜神经元和光感受器(特别是视锥)得以保留，视觉功能的某些测度可被维持。

本发明还提供通过负细胞标记选择由骨髓中分离髓样骨髓细胞群的方法。所述方法包括使多种骨髓细胞与对Ter119、CD45RB220和CD3e特异性的抗体接触，由多种骨髓细胞中去除与Ter119、CD45RB220和CD3e抗体免疫反应的细胞，以及回收缺失了表达Ter119、CD45RB220和CD3e的细胞的髓样骨髓细胞。使用此方法，可回收其中超过90％的细胞表达CD44的细胞群。

优选地，待用本发明MLBM细胞群和方法治疗的患病视网膜包含活化的星形胶质细胞。这可通过在有相关的神经胶质增生时早期治疗眼来实现，或者通过使用激光刺激活化星形胶质细胞的局部增殖来实现。

除了治疗应用之外，本发明的分离的髓样骨髓细胞群可用作研究眼中血管发育生理学和传递特定基因至眼内特定部位(例如星形胶质细胞)的研究工具。这样的应用为研究基因功能和潜在的治疗机制提供了一种有价值的工具。

附图简述

在附图中：

图1图示了发育中的小鼠视网膜的示意图。(a)原发丛(primaryplexus)的发育。(b)视网膜血管形成的第二阶段。GCL，神经节细胞层；IPL，内丛层；INL：内核层；OPL，外丛层；ONL，外核层；RPE，视网膜色素上皮；ON，视神经；P，外周。图(c)图示了骨髓源Lin⁺HSC和Lin^-HSC分离细胞的流式细胞术特征。顶行：非抗体标记细胞的散点图分布，其中R1确定阳性PE染色的可定量门控区；R2表示GFP阳性；中间行：Lin^-HSC(C57B/6)与底行：Lin⁺HSC(C57B/6)细胞，每个细胞系都用Sca-1、c-kit、Flk-1/KDR、CD31的PE缀合抗体标记。Tie-2数据得自Tie-2-GFP小鼠。百分数表示总Lin^-HSC或Lin⁺HSC群中阳性标记细胞的百分比。

图2图示了Lin^-HSC植入发育中的小鼠视网膜中。(a)在注射后4天(P6)时，玻璃体内注射的eGFP⁺Lin^-HSC细胞在视网膜上附着并分化。(b)Lin^-HSC(B6.129S7-Gtrosa26小鼠，用β-gal抗体染色)自身的确立先于用胶原蛋白IV抗体染色的血管系统(星号表示血管系统顶端)。(c)在注射后4天(P6)时，大部分Lin⁺HSC细胞(eGFP⁺)不能分化。(d)注射后4天(P6)时的肠系膜eGFP⁺鼠EC。(e)注射入成年小鼠眼中的Lin^-HSC(eGFP⁺)。(f)在GFAP-GFP转基因小鼠中依照已存在的星形胶质细胞模板归巢并分化的eGFP⁺Lin^-HSC(箭头处)的低倍放大。(g)Lin^-细胞(eGFP)与其下面的星形胶质细胞(箭头处)之间缔合(associate)的高倍放大。(h)未经注射的GFAP-GFP转基因对照。(i)注射后4天(P6)时，eGFP⁺Lin^-HSC向未来的深部丛(deep plexus)区迁移并经历分化。左图获取了整装(whole mounted)视网膜中的Lin^-HSC活性；右图指示Lin^-细胞(箭头处)在视网膜(顶部是玻璃体面，底部是巩膜面)中的位置。(j)用α-CD31-PE及α-GFP-alexa 488抗体进行双重标记。注射后7天，注入的Lin^-HSC(eGFP，红色)掺入血管系统(CD31)中。箭头指示掺入区。(k)注射后14天(P17)eGFP⁺Lin^-HSC细胞形成血管。(l与m)心内注射罗丹明-葡聚糖表明在原发丛(l)与深部丛(m)中的血管都是完整的和有功能的。

图3表明，eGFP⁺Lin^-HSC细胞归巢至激光(a)与机械(b)这二者在成年视网膜中诱发的损伤(星号表明损伤部位)诱导的神经胶质增生部位(由表达GFAP的星形胶质细胞指示，最左图)。最右图是一幅高倍放大图，表明Lin^-HSC与星形胶质细胞紧密缔合。标尺＝20μM。

图4表明，Lin^-HSC细胞拯救了视网膜变性小鼠的血管系统。(a-d)，注射后27天(P33)用胶原蛋白IV染色的视网膜；(a)与(b)，用Lin⁺HSC细胞(Balb/c)注射的视网膜与正常FVB小鼠在血管系统方面未表现出差异；(c)与(d)，用Lin^-HSC(Balb/c)注射的视网膜显示出与野生型小鼠类似的丰富血管网络；(a)与(c)，用DAPI染色的全视网膜的冷冻切片(顶部是玻璃体面，底部是巩膜面)；(b)与(d)，视网膜整装片的深部丛；(e)，条形图，表明在注射Lin^-HSC细胞的视网膜(n＝6)中形成的深部血管丛的血管分布(vascularity)增加。视网膜深部血管化的程度通过计算每幅图像中血管的总长度来定量。比较了Lin^-HSC、Lin⁺HSC或对照视网膜中的血管平均总长度/高倍视野(以微米为单位)。(f)用得自rd/rd小鼠的Lin^-HSC细胞(R，右眼)或Lin⁺HSC细胞(L，左眼)注射后进行深部血管丛长度的比较。显示了6只独立小鼠的结果(每一种颜色代表一只单独的小鼠)。(g)与(h)Lin^-HSC细胞(Balb/c)在注入P15眼中时也拯救了rd/rd血管系统。显示了注入Lin^-HSC细胞(G)或Lin⁺HSC细胞(H)的视网膜(注射后一个月)的中部血管丛及深部血管丛。

图5图示了小鼠视网膜组织的显微照片：(a)，视网膜整装片(rd/rd小鼠)的深层，eGFP⁺Lin^-HSC注射后五天(P11)可见(灰色)。(b)与(c)，于P6接受Balb/c Lin^-细胞(b)或Lin⁺HSC细胞(c)注射的Tie-2-GFP(rd/rd)小鼠的P60视网膜血管系统。在(b)和(c)的左图中只可见内源内皮细胞(GFP染色的)。(b)和(c)的中图用CD31抗体染色；箭头指示用CD31而不用GFP染色的血管，(b)和(c)的右图显示了用GFP与CD31这二者染色。(d)注射过Lin^-HSC的视网膜(左图)与对照视网膜(右图)的α-SMA染色。

图6表明，T2-TrpRS转染的Lin^-HSC抑制小鼠视网膜血管系统的发育。(a)人TrpRS、T2-TrpRS和在氨基末端带有Igk信号序列的T2-TrpRS的示意图。(b)注射T2-TrpRS转染的Lin^-HSC的视网膜在体内表达T2-TrpRS蛋白。(1)用大肠杆菌产生的重组T2-TrpRS；(2)用大肠杆菌产生的重组T2-TrpRS；(3)用大肠杆菌产生的重组T2-TrpRS；(4)对照视网膜；(5)注射过Lin^-HSC+pSecTag2A(只是载体)的视网膜；(6)注射过Lin^-HSC+pKLe135(在pSecTag中有Igk-T2-TrpRS)的视网膜。(a)，内源TrpRS。(b)，重组T2-TrpRS。(c)，注射过Lin^-HSC的视网膜的T2-TrpRS。(c-f)，注射后7天，接受注射的视网膜的代表性原发(浅层)丛与次生(secondary)(深部)丛；(c)与(d)，注射过空质粒转染的Lin^-HSC的眼发育正常；(e)与(f)，T2-TrpRS转染的Lin^-HSC注射过的眼多数表现出对深部丛的抑制作用；(c)与(e)，原发(浅层)丛；(d)与(f)，次生(深部)丛。在(f)中观察到的微弱血管轮廓是(e)中显示的原发网络血管的“渗通”(bleed-through)图像。

图7显示了编码His₆标记的T2-TrpRS的DNA序列SEQ ID NO：1。

图8显示了His₆标记的T2-TrpRS的氨基酸序列SEQ ID NO：2。

图9图示了小鼠视网膜的显微照片和视网膜电图(ERG)，所述小鼠的眼睛注射了Lin^-HSC和Lin⁺HSC(对照)。

图10图示了统计图，该图表明了用Lin^-HSC治疗的rd/rd小鼠眼的中部血管层(Int.)和深部血管层这二者的神经元拯救(y轴)和血管拯救(x轴)之间的相关性。

图11图示了统计图，该图表明用Lin⁺HSC治疗的rd/rd小鼠眼的神经元拯救(y轴)和血管拯救(x轴)之间没有相关性。

图12是用Lin^-HSC治疗的rd/rd小鼠眼(暗条)和未治疗的rd/rd小鼠眼(亮条)在注射后1个月(1M)、2个月(2M)和6个月(6M)的时间点以任意相对单位表示的血管长度(y轴)的条形图。

图13包含3张条形图，它们是注射后1个月(1M)、2个月(2M)及6个月(6M)时rd/rd小鼠外部神经层(ONR)的核数量，表明用Lin^-HSC治疗的眼(暗条)的核数目相对于用Lin⁺HSC治疗的对照眼(亮条)有显著增加。

图14描绘了个体rd/rd小鼠外部神经层核数量的图，该图比较了在(注射后)1个月(1M)、2个月(2M)及6个月(6M)的时间点时的右眼(R，用Lin^-HSC治疗)与左眼(L，用Lin⁺HSC治疗的对照眼)；所给出图中的每条线都比较了个体小鼠的左右眼。

图15描绘了rd1/rd1小鼠(C3H/HeJ，左图)或野生型小鼠(C57BL/6，右图)中视网膜血管系统和神经细胞的变化。显示了整装视网膜(红色：胶原蛋白IV，绿色：CD31)及同一视网膜的切片(红色：DAPI，绿色：CD31，下图)的中部血管丛(上图)或深部血管丛(中图)的视网膜血管系统(P：出生后天数)。(GCL：节细胞层；INL：内核层；ONL：外核层)。

图16表明，Lin^-HSC注射拯救了rd1/rd1小鼠中的神经细胞变性。(A、B与C)，注射过Lin^-HSC的眼(右图)与对侧注射过对照细胞(CD31^-)的眼(左图)在P30(A)、P60(B)和P180(C)时的中部丛(int.)或深部丛的视网膜血管系统。(D)，在P30(左图，n＝10)、P60(中图，n＝10)及P180(右图，n＝6)时注射过Lin^-HSC或对照细胞(CD31^-)的视网膜的血管系统平均总长度(平均值+或-标准偏差)。分别显示了中部丛(Int.)与深部丛的数据(Y轴：血管系统的相对长度)。(E)，在P30(左图，n＝10)、P60(中图，n＝10)或P180(右图，n＝6)时注射过对照细胞(CD31^-)或Lin^-HSC的视网膜的ONL中的细胞核平均数(Y轴：ONL中细胞核的相对数目)。(F)，在P30(左图)、P60(中图)及P180(右图)时注射过Lin^-HSC或对照细胞的视网膜的血管系统长度(X轴)与ONL中的细胞核数目(Y轴)之间的线性相关性。

图17表明通过注射Lin^-HSC拯救视网膜功能。使用视网膜电图(ERG)记录来测量注射过Lin^-HSC或对照细胞(CD31^-)的视网膜的功能。(A与B)，注射后2个月经拯救与未经拯救的视网膜的典型例子。显示了同一动物的注射过Lin^-HSC的右眼(A)与注射过CD31^-对照细胞的左眼(B)的视网膜切片(绿色：CD31染色的血管系统，红色：DAPI染色的核)。(C)，(A)与(B)中所示的同一动物的ERG结果。

图18表明，人骨髓细胞群能在rd1小鼠中拯救变性视网膜(A-C)。在另一视网膜变性模型rd10中也观察到这种拯救(D-K)。A，用绿色染料标记的人Lin^-HSC(hLin^-HSC)可在玻璃体内注射入C3SnSmn.CB17-Prkdc SCID小鼠后分化为视网膜血管细胞。(B与C)，注射后1.5个月时，在注射过hLin^-HSC的眼(B)或对侧的对照眼(C)中的视网膜血管系统(左图；上：中部丛，下：深部丛)与神经细胞(右图)。(D-K)，用Lin^-HSC拯救rd10小鼠(在P6时注射)。显示了在P21(D：Lin^-HSC，H：对照细胞)、P30(E：Lin^-HSC，I：对照细胞)、P60(F：Lin^-HSC，J：对照细胞)及P105(G：Lin^-HSC，K：对照细胞)时的代表性视网膜(每一时间点的治疗眼和对照眼都来自同一动物)。视网膜血管系统(每幅图的上图为中部丛；每幅图的中图为深部丛)用CD31(绿色)与胶原蛋白IV(红色)染色。每幅图的下图显示了由同一视网膜制备的横切切片(红色：DAPI，绿色：CD31)。

图19表明，在用Lin^-HSC治疗后，晶体蛋白αA在经拯救的外核层细胞中被上调，而在用对照细胞治疗的对侧眼中无此现象。左图：经拯救的视网膜中的IgG对照，中图：经拯救的视网膜中的晶体蛋白αA，右图：在未经拯救的视网膜中的晶体蛋白αA。

图20包括在已用本发明的Lin^-HSC治疗的鼠视网膜中被上调的基因列表。(A)其表达在用鼠Lin^-HSC治疗的小鼠视网膜中增加至3倍的基因。(B)在用鼠Lin^-HSC治疗的小鼠视网膜中被上调的晶体蛋白基因。(C)其表达在用人Lin^-HSC治疗的小鼠视网膜中增加至2倍的基因。(D)其表达在用人Lin^-HSC治疗的小鼠视网膜中被上调的神经营养因子或者生长因子的基因。

图21图示了CD31与整联蛋白α6表面抗原在CD133阳性(DC133⁺)和CD133阴性(CD133^-)的人Lin^-HSC群上的分布。左图显示了流式细胞术散点图。中央图和右图是直方图，显示了在细胞群上特异性抗体的表达水平。Y轴代表事件数，X轴显示信号强度。移至空心(对照)直方图右侧的实心直方图代表增加的荧光信号和高于背景水平的抗体表达。

图22图解了出生后的P0日至P30日于正常氧水平(含氧量正常)饲养的野生型C57/B16小鼠的出生后视网膜发育。

图23图解了P7至P12期间以高氧水平(含氧量高；75％氧)饲养、随后由P12至P17于正常含氧量饲养的C57/B16小鼠中的氧诱导性视网膜病模型。

图24显示了在氧诱导性视网膜病(OIR)模型中通过用Lin^-HSC群治疗进行的血管拯救。

图25表明，玻璃体内注射Lin^-HSC后rd1小鼠外核层(ONL)中的被拯救的光感受器主要为视锥。在野生型小鼠视网膜中小比例的光感受器(上图)是视锥，证据是表达红/绿视锥视蛋白(A)，而ONL的大部分细胞对视杆特异性视紫红质(B)呈阳性。在免疫前血清存在下视网膜血管系统自身发荧光(C)，但核层对用视杆或视锥特异性视蛋白染色完全阴性。rd/rd小鼠视网膜(下图)具有减少的内核层和接近完全萎缩的ONL，这二者对视锥(D)或视杆(图G)视蛋白均为阴性。CD31^-HSC治疗的对照眼与未经注射的rd/rd视网膜相同，对视锥(E)或视杆(H)视蛋白无任何染色。Lin^-HSC治疗的对侧眼表现出明显降低但明确存在的ONL，其主要由视锥组成，证据是对视锥红/绿视蛋白有阳性免疫反应性(F)。还观察到少量视杆(I)。

图26显示了谱系阴性和谱系阳性的干细胞群的流式细胞术表征的散点图(分别为左上图和左下图)，表明了表达CD44抗原的细胞百分率(红色的数据点)；以及CD31阴性和CD31阳性细胞群的图(分别为右上图和右下图)，表明了表达CD44抗原的细胞百分率(红色的数据点)。

图27显示了表达显著水平的CD44抗原的的谱系阴性细胞群(左侧的一组图)和不表达显著水平的CD44抗原的骨髓细胞亚群(右侧的一组图)的流式细胞术表征的散点图，表明了表达各种其它细胞表面抗原的细胞的相对百分率。

图28显示了玻璃体内注射本发明MLBM细胞群之细胞的小鼠的视网膜(左图)与玻璃体内注射CD44^lo细胞的小鼠的视网膜对比的显微照片图象。

图29显示了注射MLBM细胞群之细胞(CD44^hi)和CD44^lo细胞的眼视网膜的显微照片。

图30显示了条形图，表明了MLBM细胞群在氧诱导性早产儿视网膜病的视网膜病模型中缓解病理性血管生成和促进小鼠视网膜的有益生理性血管再生的有益作用。上图比较了对照视网膜(第一个条棒)、用CD44^lo细胞治疗的视网膜(中间条棒)和MLBM细胞群之细胞治疗的视网膜(右侧条棒)的视网膜的前新血管丛区。下图比较了对照视网膜(第一个条棒)、用CD44^lo细胞治疗的视网膜(中间条棒)和MLBM细胞群之细胞治疗的视网膜(右侧条棒)的血管消失区(vascularobliteraton area)。

图31是一张显微照片图象，表明MLBM细胞群之细胞一掺入到视网膜的血管系统中，所述细胞就表达血管内皮生长因子(VEGF)，其由图象下部中细胞的绿色染色指示。

图32图示了显微照片图象，表明本发明的CD11b⁺MLBM细胞群之细胞选择性地靶向视网膜的血管系统。

图33图示了显微照片图象，表明CD44^-CD11b^-骨髓细胞没有选择性地靶向视网膜的血管系统。

图34显示了TrpRS的T2片段(SEQ ID NO：3)及其T2-TrpRS-GD变体(SEQ ID NO：4)的氨基酸残基序列。

图35显示了mini-TrpRS的氨基酸残基序列(SEQ ID NO：5)。

图36显示了T1-TrpRS的氨基酸残基序列(SEQ ID NO：6)。

图37显示了氧诱导性视网膜病(OIR)模型小鼠中的正常视网膜血管发育和玻璃体内移植Lin^-骨髓源细胞后的拯救作用。所述小鼠天生就有大部分无血管的视网膜，如出生后第2天(P2)所显示(图a，视网膜整装片)，其中发现血管处于占据b中所示的单平面的浅层视网膜中。图b、d和f是由平面共焦z系列数据集旋转90度的3D透视图获得的图象。在出生后第一周期间，浅层视网膜血管系统由视神经乳头以辐射方式生长，至P10时几乎达到外周(c)。然后在第二周期间由浅层分支建立深层视网膜血管系统(d)。最后，在前两个血管丛之间形成第三个血管丛，并于约P30建立成熟视网膜血管系统(e、f)。图g显示了OIR模型中暴露于高氧引起中央血管消失，如本文于P10所示。图h表明，在P12移至常氧后，中央视网膜开始血管再生，在血管化视网膜(外周)和无血管视网膜(中心)之间的界面形成特征性视网膜前新血管丛。这些丛被同工凝集素强染色。图i-n表明，Lin^-造血祖细胞在OIR模型中促进血管修复。P17时与载体治疗的对侧眼相比，在接触高氧之前玻璃体内注射的Lin^-细胞急剧加速中央视网膜的血管再生。尽管用载体治疗的视网膜显示出浅层血管系统的部分缺失(i)和完全没有深层视网膜血管系统(k、m)，但Lin^-细胞治疗的对侧眼显示出相对正常的视网膜血管系统(j)，存在全部3种丛(k、m)。图o表明，在P17，用Lin^-细胞治疗的OIR眼明显比未注射眼或注射载体的那些眼更经常地完全血管再生。通过荧光素-葡聚糖的心脏灌注显现血管，如图a-f、i、j所示，以及通过图g、h、k-n中的GS凝集素显现血管。图k-n中的核用DAPI标记。

图38表明，Lin^-细胞在OIR中加速视网膜血管再生，并降低视网膜前新血管丛形成。图a-d显示了使用计算机图象分析方法计算视网膜血管消失区以及出生后第17天OIR眼的视网膜整装片中的视网膜前新生血管丛形成(红色)。图e显示了在高氧之前用Lin^-细胞治疗的视网膜，其显示出的消失区比未注射的对照减少至几乎1/6，比单独的载体治疗的眼减少至约1/5。图f表明，相比于未注射的眼和载体治疗的眼，Lin^-细胞治疗显著降低新生血管丛的二维区域。图g表明，Lin^-细胞移植不仅在高氧之前施用时有效降低消失区域，而且在高氧期间和刚回到常氧之后的P9-P12时也有效降低消失区域。(图表示为平均值±SEM；^*p＜0.001)。

图39表明，骨髓细胞治疗基本没有或没有长期毒性作用。在接受Lin^-细胞治疗后5或6个月评价的视网膜具有正常外观的视网膜血管系统，神经视网膜似乎在组织学上保留在横切切片上(a-f，未注射的视网膜对注射Lin^-细胞的视网膜，移植后6个月)。未观察到肿瘤，唯一的异常是在神经视网膜中的偶发性“玫瑰花形”，其在对照未注射眼中也可被观察到(g、h)。

图40表明，CD44^HI细胞在Lin^-群中是普遍存在的，在OIR模型中有效促进血管修复。图a表明，骨髓含CD44^HI和CD44^LO级分，相比于对照CD细胞，Lin^-群富含CD44^HI细胞。插图表明，CD44^HI细胞的光散射特性是单核细胞和粒细胞的典型特征，而CD44^LO细胞的光散射特性是淋巴细胞的典型特征。图b显示了在接触氧之前用CD44^LO和CD44^HI骨髓细胞治疗的眼的代表性P17视网膜。下图示例了于P17的定量的消失区和新血管生成区，用于建立图c所示的数据。图c表明，在用CD44^HI细胞治疗的眼中血管消失和视网膜前新血管生成降低，效力类似于用Lin^-细胞治疗的眼。相比于载体注射或未注射，在CD44^HI和Lin^-眼中的血管消失区(^*)和视网膜前新血管生成区(^**)显著降低(在所有情况下p＜10^-5)。Lin^-细胞治疗的眼中的消失区相比于CD44^HI也下降(p＝0.03)，但程度小得多。视网膜前新血管生成区在Lin^-和CD44^HI治疗的眼中无显著差异(p＝0.25)。

图41表明CD44^HI亚群表达髓样标记。在图a中，使用双色流式细胞术进一步表征CD44群。所有细胞都用抗CD44的抗体标记和用所示各种抗体共标记。CD44^HI群显示出对CD11a、CD11b和Ly6GC强标记。CD44hi细胞级分对CD14、F4/80、cKit和CD115阳性。这些抗原大部分存在于骨髓谱系(myeloid lineage)细胞上。CD44lo细胞被分别是成红细胞和B细胞之标记的Ter119和CD45R B220强标记。

图42表明，CD44^HI细胞在视网膜中呈现血管周定位。使用共焦成像在z维建立一系列图象，然后将这些图象绘制成3D。在图a中，其投影显示了CD31标记的血管内皮，显示了来自所导入骨髓细胞的GFP表达。骨髓细胞似乎采用血管周定位。3D数据表明，血管腔和GFP+骨髓细胞的相对定位可被显现。列于(b)中的数字对应于(a)中指示的横切切片位置。在所有情况下都检测到腔外部的GFP信号，只有图b的第3号除外，其是一个通过具有强荧光的细胞体的切片，其中信号渗漏明显。

图43显示了OIR模型中注射的CD44^HI骨髓细胞的原位分析。未接受细胞治疗的对照视网膜的标记表明，存在内源性F4/80+血管周细胞(a-c)。注射的CD44^HI细胞靶向视网膜血管系统，具有类似于内源细胞的定位、形态学和F4/80表达模式(d-i)。移植的血管周骨髓细胞丧失了CD44表达，而未与视网膜血管系统缔合的细胞保留CD44表达(j-o)。

图44显示了表达阵列分析，其揭示了髓样相关基因在CD44^HI群中高表达，而CD44^LO细胞表达与淋巴样细胞相关的基因。使用阵列比较这两种骨髓细胞群之间的基因表达谱。显示的基因在表达方面具有最小5倍的差异。相对于CD44^LO细胞，在CD44^HI群中观察到明显更高的CD44表达水平。

图45表明，CD44^HI细胞可分化为具有小神经胶质细胞特征的细胞。图A和B表明，注射的CD44^HI细胞表达CD11b和F4/80，具有类似于内源性小神经胶质细胞的形态学和血管周定位。图C提供了注射的CD44^HI细胞的血管周定位的3d图像。图D显示了注射的CD44^HI细胞形态学的高倍放大图象。

图46表明，CD44^HI细胞可通过负选择分离。图A表明，使用对CD45R/B220、TER119和CD3e选择性的抗体通过MACS对小鼠骨髓进行排除，产生CD44^HI细胞超过90％的细胞群。图B表明，负级分(CD44^HI群)基本没有CD45R/B220、TER119和CD3e细胞。图C表明，负选择的CD44^HI细胞保留了视网膜靶向能力和分化能力。

优选实施方案的详述

骨髓细胞包括表达CD44抗原(即透明质酸受体)和CD11b(整联蛋白αM)的细胞亚群。可如下由骨髓中分离富含CD44和CD11b表达细胞的髓样骨髓细胞群：用针对CD44抗原的抗体(抗CD44)和/或针对CD11b的抗体(抗CD11b)处理骨髓细胞，然后选择与抗体免疫反应的细胞。然后可通过本领域众所周知的方法由细胞中除去抗体。例如可使用流式细胞仪、使用结合至珠或包被在珠上的抗体后接过滤或者本领域众所周知的其它分离方法来选择细胞。大部分经选择的细胞是谱系阴性的，表达CD44抗原和CD11b抗原这二者，而不管在分离中使用哪种抗体。

骨髓包含干细胞。干细胞通常可根据细胞表面的抗原分布来识别(关于详细的讨论，参见Stem Cells：Scientific Progress and FutureDirections，国立卫生研究院科学政策办公室(the National Institutes ofHealth，Office of Science Policy)于2001年六月制定的报告，附录E：Stem Cell Markers(干细胞标记)，该报告按照相关程度引入本文作为参考)。分离自骨髓的谱系阴性造血干细胞约有75％还是CD44阳性。在一个优选实施方案中，MLBM细胞群的大部分细胞是谱系阴性造血干细胞(即CD44+Lin^-HSC)。

本发明提供一种改善罹患眼疾的哺乳动物视网膜中的血管和神经元变性的方法。优选通过玻璃体内注射将本发明的分离的MLBM细胞群施用给哺乳动物视网膜。所述细胞以足以改善视网膜中的血管和/或神经元变性的量施用。优选地，分离的MLBM细胞群对要治疗的哺乳动物是自体的。优选地，MLBM细胞群之细胞在生理耐受的培养基如磷酸缓冲盐水(PBS)中施用。

一种优选方法包括由待治疗的哺乳动物骨髓中分离MLBM细胞群，然后将所述细胞以足以改善视网膜的血管和/或神经元变性的数量施用给哺乳动物。所述细胞可分离自罹患眼退化性疾病(优选处于眼病早期)的哺乳动物或已知易患眼退化性疾病(即由于遗传素因)的健康哺乳动物。在后一情况下，分离的MLBM细胞群可在分离后储存，然后可在以后发展的眼病的早期预防性地注射。优选地，患病视网膜包含MLBM细胞群之细胞所靶向的活化星形胶质细胞。因此，当存在相关的神经胶质增生时早期治疗眼是有益的。可选地，视网膜可用激光治疗，以刺激视网膜中的活化星形胶质细胞局部增殖，然后施用自体MLBM细胞群。

造血干细胞是能够发育成各种血细胞类型(例如B细胞、T细胞、粒细胞、血小板及红细胞)的干细胞。谱系表面抗原是一组作为成熟血细胞谱系标记物的细胞表面蛋白，包括CD2、CD3、CD11、CD11a、Mac-1(CD11b:CD18)、CD14、CD16、CD19、CD24、CD33、CD36、CD38、CD45、CD45RA、鼠Ly-6G、鼠TER-119、CD56、CD64、CD68、CD86(B7.2)、CD66b、人白细胞抗原DR(HLA-DR)及CD235a(血型糖蛋白A)。不表达显著水平的这些抗原的造血干细胞一般称为谱系阴性(Lin^-)。人造血干细胞一般表达诸如CD31、CD34、CD117(c-kit)和/或CD133的其它表面抗原。鼠造血干细胞一般表达诸如CD34、CD117(c-kit)、Thy-1和/或Sca-1的其它表面抗原。

在其细胞表面上不表达显著水平的“谱系表面抗原”(Lin)的分离的造血干细胞在本文中称为“谱系阴性”或“Lin^-”造血干细胞，即Lin^-HSC。本发明MLBM细胞群之细胞大部分是Lin^-，表达相对大量的CD44抗原(CD44^hi)以及CD11b抗原。这些CD44⁺CD11b⁺Lin^-HSC能够掺入到发育中的血管系统中，然后分化形成血管内皮细胞。

本文以及后附权利要求书在提到骨髓和骨髓细胞时使用的表述“成体的”或“成年的”包括出生后分离的骨髓，即分离自幼年及成年个体，与胚胎相对。因此，术语“成体哺乳动物”指幼年(出生后)和完全成熟的哺乳动物这二者，与胚胎或出生前个体相对。

本发明的分离的MLBM细胞群选择性地靶向星形胶质细胞，并在玻璃体内注射入哺乳动物物种的眼中时掺入到视网膜新生血管系统中，所述哺乳动物例如为由其分离所述细胞的小鼠或人。

本发明的分离的MLBM细胞群包含分化为内皮细胞并在视网膜中产生血管结构的细胞。具体地说，本发明MLBM细胞群可用于治疗视网膜新生血管和视网膜血管变性疾病，以及用于修复视网膜血管损伤。本发明MLBM细胞群还促进视网膜中的神经元拯救，促进抗凋亡基因的上调。另外，本发明MLBM细胞群可用于治疗新生哺乳动物(例如罹患氧诱导性视网膜病或早产儿视网膜病的哺乳动物)眼中的视网膜缺损。

业已发现，不表达CD44的骨髓细胞(CD44^LO细胞)一般表达一种或多种以下细胞标记：Ter119、CD45RB220和CD3e。利用此事实，本发明的CD44^HI MLBM细胞可通过涉及负细胞标记选择的方法分离。所述方法包括使多种骨髓细胞与对Ter119、CD45RB220和CD3e特异性的抗体接触，由多种骨髓细胞中除去与Ter119、CD45RB220和CD3e抗体免疫反应的细胞，以及回收表达Ter119、CD45RB220和CD3e的细胞被除去的髓样骨髓细胞。使用此方法，可回收其中超过90％的细胞表达CD44的细胞群。

本发明还提供一种治疗哺乳动物眼疾的方法，该方法包括由哺乳动物骨髓中分离MLBM细胞群，并将MLBM细胞群之细胞以足以抑制疾病的量玻璃体内注射入哺乳动物眼中。本发明方法可用于在初生的、幼年的或者完全成熟的哺乳动物中治疗眼疾，例如视网膜变性疾病、视网膜血管变性疾病、缺血性视网膜病、血管出血、血管渗漏和脉络膜病。这些疾病的实例包括年龄相关性黄斑变性(ARMD)、糖尿病性视网膜病(DR)、拟眼组织胞浆菌病(presumed ocularhistoplasmosis，POHS)、早产儿视网膜病(ROP)、镰状细胞贫血与色素性视网膜炎以及视网膜损伤。

注射到眼中的MLBM细胞群的细胞数足以抑制眼睛的病状。例如，注射的细胞量可有效修复眼视网膜损伤、稳定视网膜新生血管系统、使视网膜新生血管系统成熟并防止或修复血管渗漏与血管出血。

可用治疗上有用的基因，例如编码抗血管生成蛋白的基因(用于眼部的基于细胞的基因疗法)和编码神经营养药(neurotrophic agent)的基因(用于增强神经元拯救作用)，转染本发明MLBM细胞群之细胞。

转染的细胞可包括任何在治疗上对视网膜障碍治疗有用的基因。在一个优选实施方案中，转染的本发明MLBM细胞群之细胞包含操作性编码抗血管生成肽的基因，该抗血管生成肽包括蛋白或蛋白片段，例如TrpRS或其抗血管生成(即血管生成抑制)的片段，例如称为T2-TrpRS(图34中的SEQ ID NO：3)、T2-TrpRS-GD(图34中的SEQ ID NO：4)的TrpRS片段，这二者都是优选的血管生成抑制肽，以及mini-TrpRS(图35中的SEQ ID NO：5)和T1-TrpRS(图36中的SEQ ID NO：6)。编码本发明的抗血管生成肽的MLBM细胞群的转染细胞对治疗与异常血管发育相关的视网膜病(例如糖尿病性视网膜病及类似疾病)有用。MLBM细胞群之细胞优选为人细胞。

在另一个优选实施方案中，本发明MLBM细胞群的转染细胞含操作性编码神经营养药的基因，所述神经营养药例如为神经生长因子、神经营养蛋白-3、神经营养蛋白-4、神经营养蛋白-5、睫状神经营养因子、视网膜色素上皮衍生的神经营养因子、胰岛素样生长因子、神经胶质细胞系衍生的神经营养因子、脑衍生神经营养因子等。这类神经营养性的MLBM细胞群之细胞可用于在视网膜神经元变性疾病(例如青光眼与色素性视网膜炎)中促进神经元拯救、治疗视网膜神经损伤等。业已报道了睫状神经营养因子植入体对色素性视网膜炎治疗有用(参见Kirby等，2001，Mol Ther.3(2)：241-8；Farrar等，2002，EMBO Journal 21：857-864)。据报道脑衍生神经营养因子在受损的视网膜神经节中调节生长相关基因(参见Fournier等，1997，J.Neurosci.Res.47：561-572)。据报道神经胶质细胞系衍生的神经营养因子在色素性视网膜炎中延缓光感受器变性(参见McGee等，2001，Mol Ther.4(6)：622-9)。

本发明还提供通过将本发明MLBM细胞群的转染细胞玻璃体内注射入眼中来施用所述细胞治疗眼部血管生成性疾病的方法。这些转染的MLBM细胞群之细胞包括用治疗上有用的基因(例如编码抗血管生成或神经营养性基因产物的基因)转染的MLBM细胞群之细胞。优选地，转染的MLBM细胞群之细胞是人细胞。

优选地，至少约1×10⁵个MLBM细胞群之细胞或转染的MLBM细胞群之细胞通过玻璃体内注射施用给罹患视网膜变性疾病的哺乳动物眼。要注射的细胞数可取决于视网膜变性的严重性、哺乳动物年龄以及对于视网膜疾病治疗领域的普通技术人员显而易见的其它因素。MLBM细胞群之细胞可通过以单剂量或在一段时间内多剂量给予来施用，这由负责治疗的临床医生决定。

本发明MLBM细胞群对治疗涉及视网膜血管系统中断或退化或视网膜神经元变性的视网膜损伤和视网膜缺损有用。人MLBM细胞群还可用于产生遗传上相同的细胞系，即无性繁殖系，用于再生性或修复性治疗视网膜血管系统，以及用于治疗或改善视网膜神经元变性。此外，本发明的MLBM细胞群可用作研究视网膜血管发育和传递基因至选定细胞靶(例如星形胶质细胞)的研究工具。

鼠视网膜血管发育。

眼血管生成模型。小鼠眼睛提供了一种公认的用于研究哺乳动物视网膜血管发育(例如人视网膜血管发育)的模型。在鼠视网膜血管系统发育期间，缺血诱生的视网膜血管以和星形胶质细胞紧密缔合的方式发育。这些神经胶质元件沿着神经节细胞层从视神经盘迁移至妊娠末三个月的人类胎儿或新生啮齿动物的视网膜上，并呈放射状展开。随着鼠视网膜血管系统发育，内皮细胞利用此已建立的星形胶质细胞模板确定视网膜血管样式(参见图1(a与b))。图1(a与b)图示了发育中的小鼠视网膜示意图。图(a)图示了叠加在星形胶质细胞模板(浅色线)上的原发丛(图左上方的深色线)的发育，而(b)描述了视网膜血管形成的第二阶段。在图1中，GCL代表神经节细胞层；IPL代表内丛层；INL代表内核层；OPL代表外丛层；ONL代表外核层；RPE代表视网膜色素上皮；ON代表视神经；而P代表外周。

在出生时，视网膜血管系统实际上是不存在的。至出生后第14天(P14)，视网膜已发育成复杂的原发层(浅层)与次生层(深层)视网膜血管，同视觉起始相符。开始时，辐射状视乳头周血管在已存在的星形胶质细胞网络上向外周呈放射状生长，通过毛细血管丛形成变为进行性地互连。这些血管至P10在神经纤维内长成单细胞层(图1(a))。在P7-P8之间，侧副枝从此原发丛开始生长，穿透视网膜至外部丛状层，在那里它们形成次生层或深层视网膜丛。至P21时，整个网状结构经历了广泛重建，在内核层内表面形成第三层丛或中间层丛(图1(b))。

新生小鼠视网膜血管生成模型可用于研究眼血管生成期间的HSC作用，理由有若干个。在此生理学相关模型中，在内源性血管出现之前存在大量的星形胶质细胞模板，这使得可评价新血管生成过程中细胞-细胞靶向的作用。此外，已知此一致且可重现的新生视网膜血管化过程是低氧驱动的，在此方面与许多其中已知缺血起作用的视网膜疾病具有相似性。

由骨髓富集内皮祖细胞(EPC)。

虽然已广泛评价了存在于HSC制备物中的EPC群上的细胞表面标记表达，但专一识别EPC的标记仍很难确定。为了富集EPC，造血谱系标记阳性细胞(Lin⁺)，即B淋巴细胞(CD45)、T淋巴细胞(CD3)、粒细胞(Ly-6G)、单核细胞(CD11)和红细胞(TER-119)，均从小鼠骨髓单核细胞中去除。用Sca-1抗原进一步富集EPC。对比玻璃体内注射等量的Lin^-Sca-1⁺细胞或者Lin^-细胞后获得的结果，未检测到两组之间的差异。实际上，当仅注射Lin^-Sca-1^-细胞时，观察到其在发育中血管中的掺入远大得多。

基于功能测定，Lin^-HSC群富集了EPC。此外，Lin⁺HSC群与Lin^-HSC群在功能上表现得相当不同。还评价了常用于鉴别各部分的EPC的表位(基于先前报道的体外表征研究)。尽管这些标记中没有一个与Lin^-部分专一关联，但同Lin⁺HSC部分相比，Lin^-HSC中的所有标记都增加约70％至约1800％(图1(c))。图1的图c说明了骨髓源Lin⁺HSC与Lin^-HSC分离细胞的流式细胞术表征。图(c)的顶行显示了非抗体标记细胞的造血干细胞散点分布。R1确定了阳性PE染色的可定量门控区；R2指示GFP阳性。中间行显示了Lin^-HSC的散点图，底行显示了Lin⁺HSC的散点图。C57B/6细胞用针对Sca-1、c-kit、Flk-1/KDR、CD31的PE缀合抗体标记。Tie-2数据得自Tie-2-GFP小鼠。散点图角内的百分比表示总Lin^-HSC或Lin⁺HSC群中阳性标记细胞的百分数。有趣的是，公认的EPC标记如Flk-1/KDR、Tie-2及Sca-1的表达都很差，因此没有用于进一步的分级分离。

Lin^-HSC可如下分离：(a)由成体哺乳动物抽取骨髓；(b)从骨髓中分离多种单核细胞；(c)用针对一种或多种谱系表面抗原的生物素缀合的谱系群体抗体(lineage panel antibodies)标记单核细胞，谱系表面抗原优选选自：CD2、CD3、CD4、CD11、CD11a、Mac-1、CD14、CD16、CD19、CD24、CD33、CD36、CD38、CD45、Ly-6G(鼠)、TER-119(鼠)、CD45RA、CD56、CD64、CD68、CD86(B7.2)、CD66b、人白细胞抗原DR(HLA-DR)及CD235a(血型糖蛋白A)；(d)由多种单核细胞中除去对所述一种或多种谱系表面抗原阳性的单核细胞；以及(e)由其中回收谱系阴性造血干细胞群。

当从成人骨髓中分离Lin^-HSC时，优选地，用针对谱系表面抗原CD2、CD3、CD4、CD11a、Mac-1、CD14、CD16、CD19、CD33、CD38、CD45RA、CD64、CD68、CD86(B7.2)和CD235a的生物素缀合的谱系群体抗体标记单核细胞。当从成体小鼠骨髓中分离Lin^-HSC时，优选地，用针对谱系表面抗原CD3、CD11、CD45、Ly-6G和TER-119的生物素缀合的谱系群体抗体标记单核细胞。

玻璃体内注射的HSC Lin^-细胞含有靶向星形胶质细胞并掺入发育中的视网膜血管系统的EPC。

为了测定玻璃体内注射的Lin^-HSC是否能够靶向视网膜的特定细胞类型、利用星形胶质细胞模板并参与视网膜血管生成，将分离自成体(GFP或LacZ转基因)小鼠骨髓的本发明Lin^-HSC组合物的约10⁵个细胞或Lin⁺HSC细胞(对照，约10⁵个细胞)注射入出生后第2天(P2)的小鼠眼中。注射后四天(P6)，得自GFP或者LacZ转基因小鼠的本发明Lin^-HSC组合物的许多细胞附着在视网膜上，并具有内皮细胞的特征性伸长外观(图2(a))。图2说明了Lin^-细胞移入发育中的小鼠视网膜中。如图2的图(a)所示，注射后四天(P6)玻璃体内注射的eGFP+Lin^-HSC在视网膜上附着并分化。

在视网膜的很多区域中，GFP表达细胞以符合下面的星形胶质细胞的样式排列，并与血管类似。这些荧光细胞在内源性的、发育中的血管网络之前被观察到(图2(b))。相反，只有少数Lin⁺HSC(图2(c))或成体小鼠肠系膜内皮细胞(图2(d))附着在视网膜表面。为了确认来自注射的Lin^-HSC群的细胞是否也能够附着在已建立血管的视网膜上，将Lin^-HSC组合物注射入成体眼中。有趣的是，没有观察到细胞附着在视网膜或掺入既有的正常视网膜血管中(图2(e))。这表明本发明的Lin^-HSC组合物并不破坏已正常发育的血管系统，不会在正常发育的视网膜中引发异常血管化。

为了确定注射的本发明Lin^-HSC组合物与视网膜星形胶质细胞之间的关系，使用转基因小鼠，其表达胶质细胞原纤维酸性蛋白(GFAP，星形胶质细胞的标记物)和启动子驱动的绿色荧光蛋白(GFP)。对注射了来自eGFP转基因小鼠的Lin^-HSC的这些GFAP-GFP转基因小鼠的视网膜进行检查，表明所注射的eGFP EPC与现存的星形胶质细胞共定位(图2(f-h)，箭头处)。观察到eGFP+Lin^-HSC的图版与下面的星形胶质细胞网络一致(箭头处，图2(g))。对这些眼的检查表明，所注射的标记细胞仅附着于星形胶质细胞上；在视网膜外周仍没有内源性血管的P6小鼠视网膜中，观察到所注射的细胞附着在这些尚未血管化区域中的星形胶质细胞上。令人惊讶的是，在视网膜深层中的确切位置(正常视网膜血管随后将在此处发育)上观察到所注射的标记细胞(图2(i)，箭头处)。

为了确定注射的Lin^-HSC是否稳定地掺入到发育中的视网膜血管系统中，在几个稍后的时间点检查视网膜血管。早在P9(注射后7天)时，Lin^-HSC已掺入到CD31⁺结构中(图2(j))。到P16(注射后14天)时，所述细胞已经广泛地掺入到视网膜的血管样结构中(图2(k))。在处死动物前血管内注射罗丹明-葡聚糖(以鉴别功能性视网膜血管)时，多数Lin^-HSC与伸展的(patent)血管排列在一起(图2(l))。观察到两种模式的标记细胞分布：(1)在一个模式中，细胞沿着未标记的内皮细胞之间的血管散布；和(2)另一个模式显示血管完全由标记细胞组成。所注射的细胞还掺入到深部血管丛的血管中(图2(m))。虽然以前业已报道过Lin^-HSC衍生的EPC零星掺入到新生血管系统中，但这是首次报道血管网络全部由这些细胞组成。这表明玻璃体内注射的骨髓源Lin^-HSC群中的细胞能够有效掺入形成中的视网膜血管丛的任一层中。

当在玻璃体内注射后达5或10天检查时，非视网膜组织(例如脑、肝脏、心脏、肺、骨髓)的组织学检查表明不存在任何GFP阳性细胞。这表明Lin^-HSC部分中的细胞亚群选择性地靶向视网膜星形胶质细胞，并稳定掺入发育中的视网膜血管系统中。由于这些细胞具有内皮细胞的许多特征(同视网膜星形胶质细胞缔合、伸长形态、稳定掺入伸展的血管中并且不出现在血管外位置)，所以这些细胞代表存在于Lin^-HSC群中的EPC。被靶向的星形胶质细胞与在许多低氧性视网膜病中观察到的是同一类型。众所周知，神经胶质细胞是DR和其它类型的视网膜损伤中所观察到的丛的新生血管叶的主要组分。在反应性神经胶质增生及缺血引发的新生血管化的情况下，活化星形胶质细胞增生、产生细胞因子并上调GFAP，与在包括人在内的许多哺乳动物物种的新生视网膜血管模板形成过程中观察到的情况相仿。

Lin^-HSC群会象在新生眼中那样靶向成体小鼠眼中的活化星形胶质细胞，将Lin^-HSC细胞注射入视网膜被光凝固(图3(a))或针尖(图3(b))损伤的成体眼中。在两个模型中，只是在损伤部位周围观察到具有明显GFAP染色的细胞群(图3(a与b))。来自所注射的Lin^-HSC组合物的细胞位于受损伤部位，并特异性地与GFAP阳性星形胶质细胞保持缔合(图3(a和b))。在这些部位，还观察到Lin^-HSC细胞移至视网膜的更深层，其所处层面与在深层视网膜血管系统新生形成期间观察到的层面类似。视网膜的未损伤部位不含Lin^-HSC细胞，这与Lin^-HSC注射入正常未受损成体视网膜中时所观察到的相一致(图2(e))。这些数据表明，在具有神经胶质增生的受损成体视网膜以及经历血管化的新生视网膜中，Lin^-HSC组合物可选择性地靶向活化神经胶质细胞。

玻璃体内注射的Lin^-HSC能够拯救并稳定变性血管系统。

因为玻璃体内注射的Lin^-HSC组合物靶向星形胶质细胞并掺入正常的视网膜血管系统中，所以在与神经胶质增生和血管变性相关的缺血性或变性视网膜疾病中这些细胞还稳定变性血管系统。rd/rd小鼠是视网膜变性模型，其至出生后一个月时表现出光感受器及视网膜血管层的深度变性。这些小鼠中的视网膜血管系统正常发育至P16，此时较深的血管丛退化；到P30时大多数小鼠的深部丛和中部丛几乎完全变性。

为了确定HSC是否能够拯救退化中的血管，P6时将Lin⁺HSC或Lin^-HSC(来自Balb/c小鼠)玻璃体内注射入rd/rd小鼠中。至P33时，注射Lin⁺细胞后，最深层视网膜层的血管几乎完全消失(图4(a和b))。相反，至P33时大多数注射了Lin^-HSC的视网膜具有几乎正常的视网膜血管系统，其具有3个平行的、良好成型的血管层(图4(a和d)。该作用的量化表明，注射了Lin^-的rd/rd眼的深部血管丛中的血管平均长度几乎是未治疗眼或Lin⁺细胞治疗的眼的3倍(图4(e))。令人惊讶的是，注射来源于rd/rd成体小鼠(FVB/N)骨髓的Lin^-HSC组合物也拯救变性中的rd/rd新生小鼠视网膜血管系统(图4(f))。早在出生后2-3周便观察到rd/rd小鼠眼中血管系统的变性。迟至P15时注射Lin^-HSC也能使rd/rd小鼠的变性中血管系统部分稳定达至少一个月(图4(g和h))。

注射至幼龄(例如P2)rd/rd小鼠中的Lin^-HSC组合物也掺入到发育中的浅层血管系统中。至P11时，观察到这些细胞移至深部血管丛层面，并形成与在野生型外部视网膜血管层中所观察到的样式相同的样式(图5(a))。为了更清晰描述所注射的Lin^-HSC组合物中的细胞掺入并稳定rd/rd小鼠中的变性中视网膜血管系统的方式，将来源于Balb/c小鼠的Lin^-HSC组合物注射入Tie-2-GFP FVB小鼠眼中。FVB小鼠具有rd/rd基因型，并且由于它们表达融合蛋白Tie-2-GFP，所以所有的内源性血管都发荧光。

当Lin^-HSC组合物中的未标记细胞被注射入新生Tie-2-GFP FVB眼中并随后掺入发育中的血管系统中时，Tie-2-GFP标记的内源性血管中应有未被标记的裂缝，这些裂缝对应于注射的、掺入的、未被标记的Lin^-HSC。那么随后用另一种血管标记物(例如CD-31)染色就描绘出整个血管，使得可以确定非内源性内皮细胞是否是血管系统的一部分。注射后两个月，在注射Lin^-HSC组合物的眼视网膜中观察到CD-31阳性的、Tie-2-GFP阴性的血管(图5(b))。有趣的是，多数经拯救的血管含有Tie-2-GFP阳性细胞(图5(c))。通过平滑肌肌动蛋白染色测定，不管是否存在血管拯救，周细胞分布都不因注射Lin^-HSC而改变(图5(d))。这些数据清楚表明，玻璃体内注射的Lin^-HSC细胞在遗传缺陷小鼠中移至视网膜、参与正常视网膜血管形成并稳定内源性变性中的血管系统。

由来自Lin^-HSC的转染细胞抑制视网膜血管生成。

多数视网膜血管疾病涉及异常的血管增生而不是变性。靶向星形胶质细胞的转基因细胞可用于传递抗血管生成蛋白并抑制血管生成。用T2-色氨酰-tRNA合成酶(T2-TrpRS)转染来自Lin^-HSC组合物的细胞。T2-TrpRS是有效抑制视网膜血管生成的TrpRS的一个43kD片段(图6(a))。P2时注射对照质粒转染的Lin^-HSC组合物(无T2-TrpRS基因)的眼视网膜在P12时具有正常的原发(图6(c))与次生(图6(d))视网膜血管丛。当将T2-TrpRS转染的本发明Lin^-HSC组合物注射入P2眼中并在10天后评价时，原发网络明显异常(图6(e))，深层视网膜血管系统的形成几乎完全被抑制(图6(f))。这些眼中观察到的少量血管明显变细，血管间有大间隙。分泌T2-TrpRS的Lin^-HSC所致的抑制程度详述于表1。

Lin^-HSC组合物中的细胞在体外产生和分泌T2-TrpRS，将这些转染细胞注射入玻璃体之后，在视网膜中观察到一个30kD的T2-TrpRS片段(图6(b))。此30kD片段仅在注射转染的Lin^-HSC的视网膜中才能明确地观察到，与重组或体外合成的蛋白相比这种表观分子量的降低可能归因于T2-TrpRS在体内被加工或降解。这些数据表明，Lin^-HSC组合物可用于通过靶向活化星形胶质细胞而将有功能活性的基因(例如表达血管生成抑制分子的基因)传递至视网膜血管系统。虽然观察到的血管生成抑制作用可能是由于细胞介导的活性所致，但这是极不可能的，因为用相同的、但非T2转染的Lin^-HSC组合物治疗的眼具有正常的视网膜血管系统。

表1.T2-TrpRS分泌型Lin^-HSC的血管抑制作用

玻璃体内注射的Lin^-HSC群定位至视网膜星形胶质细胞、掺入血管中并可用于治疗多种视网膜疾病。虽然注射的HSC组合物中的大多数细胞附着于星形胶质细胞模板，但少量细胞深入地移入视网膜中，归巢至深层血管网络随后将发育的区域。即便在出生后42天之前在此区域没有观察到GFAP阳性的星形胶质细胞，也不能排除GFAP阴性的神经胶质细胞已存在而为Lin^-HSC定位提供信号的可能性。以前的研究已表明许多疾病同反应性神经胶质增生相关。尤其是在DR中，神经胶质细胞及其胞外基质同病理性血管生成有关联。

由于注射的Lin^-HSC组合物中的细胞特异性地附着于表达GFAP的神经胶质细胞，因此不管什么类型的损伤，均可使用本发明的Lin^-HSC组合物靶向视网膜中的血管生成前的损伤部位。例如，在诸如糖尿病之类的缺血性视网膜病中，新生血管形成是对缺氧的一种反应。通过将Lin^-HSC组合物靶向病理性新生血管化部位，可以稳定发育中的新生血管系统，防止诸如出血或水肿这样的新生血管系统异常(同DR相关的视觉丧失的病因)，并能潜在地缓解原本刺激新生血管形成的缺氧。异常血管可被恢复成正常状态。此外，可使用转染的Lin^-HSC组合物和激光诱导的星形胶质细胞活化作用将血管生成抑制蛋白如T2-TrpRS传递到病理性血管生成部位。由于激光光凝术普遍应用于临床眼科学，所以该方法具有针对多种视网膜疾病的应用。尽管已在癌症治疗中研究了这些基于细胞的方法，但由于眼内注射使得有可能将大量细胞直接传递至患病部位，故这些方法对眼疾的用途更有优势。

Lin^-HSC引起的神经营养性和血管营养性拯救。

如上所述用MACS由增强型绿色荧光蛋白(eGFP)、C3H(rd/rd)、FVB(rd/rd)小鼠骨髓中分离Lin^-HSC。将来自这些小鼠的含EPC的Lin^-HSC玻璃体内注射入P6 C3H或FVB小鼠眼中。在注射后的不同时间点(1个月、2个月及6个月)收集视网膜。在用抗CD31抗体染色后利用扫描激光共焦显微镜和在用DAPI核染色后利用视网膜组织学来分析血管系统。还使用不同时间点的视网膜mRNA的微阵列基因表达分析来鉴别潜在地涉及该作用的基因。

至P21时rd/rd小鼠眼睛的视网膜神经感觉层和视网膜血管系统均出现严重变性。P6时用Lin^-HSC治疗的rd/rd小鼠眼于维持正常的视网膜血管系统长达6个月；在所有时间点(1M、2M和6M)上与对照相比时，深层与中间层都有显著改善(参见图12)。此外，我们观察到，相对于作为对照的用Lin⁺HSC治疗的眼，用Lin^-HSC治疗的视网膜还更厚(1M；1.2倍，2M；1.3倍，6M；1.4倍)，在外核层具有更多数目的细胞(1M；2.2倍，2M；3.7倍，6M；5.7倍)。同对照(未治疗或非Lin^-治疗的)rd/rd视网膜相比，对“经拯救的”视网膜(例如，Lin^-HSC)的大规模基因组分析表明：编码sHSP(小热激蛋白)以及与血管和神经拯救相关的特异性生长因子的基因(包括编码列于图20的图A与B中的蛋白的基因)明显上调。

骨髓源Lin^-HSC群显著且可重复地诱导正常血管系统的维持，并明显增加了rd/rd小鼠中的光感受器及其它神经元细胞层。这种神经营养性拯救作用与小热激蛋白和生长因子的显著上调相关，对目前尚无法治愈的视网膜变性疾病的治疗方法提供了思路。

rd1/rd1小鼠视网膜表现出深度血管和神经元变性。

小鼠中正常的出生后视网膜血管与神经元发育已有详细描述，与在妊娠末三个月的人类胎儿中所观察到的变化类似(Dorrell等，2002，Invest.Ophthalmol.Vis.Sci.43：3500-3510)。rd1基因纯合型小鼠享有人视网膜变性的多种特征(Frasson等，1999，Nat.Med.5：1183-1187)，表现出快速的光感受器(PR)丧失，并伴有由PR cGMP磷酸二酯酶编码基因中的突变导致的严重血管萎缩(Bowes等，1990，Nature 347：677-680)。为检查视网膜发育中的血管系统及其随后的变性，使用抗胶原蛋白IV(CIV)的抗体和抗CD31(PECAM-1)抗体(图15)，胶原蛋白IV为成熟血管系统的胞外基质(ECM)蛋白，CD31为内皮细胞标记物。rd1/rd1(C3H/HeJ)的视网膜正常发育，直至约出生后(P)第8天，此时含光感受器的外核层(ONL)开始变性。ONL快速变性，细胞经凋亡死亡，使得至P20时仅余下单层核。用CIV和CD31这二者的抗体双重染色整装视网膜揭示，rd1/rd1小鼠中的血管变性细节同其他人所描述的(Blanks等，1986，J.Comp.Neurol.254：543-553)相似。视网膜血管原发层和深层看起来发育正常，直至P12，之后内皮细胞快速损失，依据是不存在CD31染色。CD31阳性内皮细胞以正常分布存在，直至P12，但此后快速消失。有趣的是，CIV阳性染色在所检查的全部时间点都保持存在，提示血管及相连的ECM正常形成，但在P13之后仅保留基质，至P13时未观察到CD31阳性细胞。(图15，中图)。中部血管丛在P21之后也变性，但进度要慢于在深层丛中所观察到的(图15，上图)。为与rd1/rd1小鼠对比，给出了正常小鼠的视网膜血管和神经细胞层(右图，图15)。

骨髓源Lin^-HSC在rd1/rd1小鼠中的神经保护作用。

玻璃体内注射的Lin^-HSC掺入到全部三个血管丛中的内源性视网膜血管系统中，并防止血管变性。有趣的是，实际上从未在外核层观察到注射的细胞。这些细胞或掺入到形成中的视网膜血管中，或在这些血管附近被观察到。鼠Lin^-HSC(来自C3H/HeJ)于变性就要开始前的P6时玻璃体内注射入C3H/HeJ(rd1/rd1)小鼠眼中。至P30时，注射对照细胞(CD31^-)的眼表现出典型的rd1/rd1表型，即在每一个检查的视网膜中均观察到深层血管丛及ONL几乎完全变性。注射Lin^-HSC的眼保持了看上去正常的中部血管丛及深部血管丛。令人惊讶的是，在注射Lin^-HSC的眼的内核层(INL)和ONL中观察到的细胞明显多于注射了对照细胞的眼(图16(A))。Lin^-HSC的这种拯救作用可以在注射后2个月观察到(图16(B))，并持续长达6个月(图16(C))。当比较经拯救的与未经拯救的眼时，注射了Lin^-HSC的眼的中部丛和深部丛以及含神经元细胞的INL与ONL的血管系统中的差异在所有测量时间点都很明显(图16(B和C))。通过测量血管系统总长度(图16(D))并计数ONL中所观察到的DAPI阳性细胞核数(图16(E))量化这种作用。对所有时间点的数据都应用单元线性回归分析。

在注射Lin^-HSC的眼中于P30(p＜0.024)及P60(p＜0.034)时观察到血管拯救与神经元(例如ONL厚度)拯救之间的统计学显著相关性(图16(F))。当P180时比较注射过Lin^-HSC的视网膜和注射过对照细胞的视网膜时，尽管无统计学显著性(p＜0.14)，但相关性仍很高(图16(F))。相反，注射过对照细胞的视网膜在任何时间点都未显示出保留血管系统与ONL之间的显著相关性(图16(F))。这些数据表明，玻璃体内注射Lin^-HSC在rd1/rd1小鼠视网膜中导致同时发生的视网膜血管及神经元拯救。在ONL中或非视网膜血管内或非临近视网膜血管的任何位置都未观察到注射的细胞。

注射过Lin^-HSC的rd/rd视网膜的功能性拯救。

对注射对照细胞或鼠Lin^-HSC后两个月的小鼠做视网膜电图(ERG)(图17)。ERG记录后对每只眼进行免疫组化与显微分析，以确认已发生血管及神经元拯救。来自经拯救的治疗眼和未经拯救的对照眼的代表性ERG记录显示，在经拯救的眼中，运用数字计算方法扣减的信号(治疗的眼减去未治疗的眼)产生约8-10微伏振幅的可清晰检测的信号(图17)。显然，来自两种眼睛的信号严重异常。然而，由Lin^-HSC治疗的眼可记录到一致且可检测的ERG。在所有情况下，来自对照眼的ERG都是不可检测的。虽然经拯救的眼中的信号振幅远低于正常眼，但只要有组织学拯救就始终可以观察到信号，而且信号振幅与基于基因的其它拯救研究报道的那些振幅近似。总的来说，这些结果表明在用Lin^-HSC治疗的眼中存在某种程度的功能性拯救。

经拯救的rd/rd视网膜细胞类型主要为视锥。

用对视杆视蛋白或视锥视蛋白特异性的抗体以免疫组化方法分析经拯救的和未经拯救的视网膜。对用于图17列出的ERG记录的相同眼睛进行视杆视蛋白或视锥视蛋白分析。在野生型小鼠视网膜中，存在的光感受器中不足约5％为视锥(Soucy等，1998，Neuron21：481-493)，用红/绿视锥视蛋白(如图25(A)所示)或用视杆视紫红质(如图25(B)所示)所观测到的免疫组化染色图谱，符合视锥细胞的该百分率。当野生型视网膜用免疫前IgG染色时，在自发荧光的血管以外的视网膜神经感觉层中的任意位置都未观察到染色(图25(C))。出生后2个月，未注射的rd/rd小鼠的视网膜具有基本萎缩的外核层，其用红绿视锥视蛋白抗体(图25(D))或视紫红质抗体(图25(G))未显示出任何染色。注射对照CD31^-HSC的眼也未对视锥视蛋白(图25(E))或视杆视蛋白(图25(H))的存在呈阳性染色。相反，注射Lin^-HSC的对侧眼在被保持的外核层中具有约3至约8层核；这些细胞的大部分对视锥视蛋白阳性(图25(F))，约1-3％对视杆视蛋白阳性(图25(I))。引人注目的是，这与最初由正常小鼠视网膜观察到的几乎相反，正常小鼠视网膜以视杆为主。这些数据表明，注射Lin^-HSC可在视锥一般应变性的延长的时间段内保持视锥。

人骨髓(hBM)源Lin^-HSC也拯救变性中的视网膜。

分离自人骨髓的Lin^-HSC的表现类似于鼠Lin^-HSC。从人供体收集骨髓，除去Lin⁺HSC，产生人Lin^-HSC(hLin^-HSC)群。这些细胞用荧光染料离体(ex-vivo)标记，并注射入C3SnSmn.CB17-Prkdc SCID小鼠眼中。注射的Lin^-HSC迁移至和靶向视网膜血管生成部位，方式与注射鼠Lin^-HSC时观察到的方式相同(图18(A))。除了血管靶向以外，人Lin^-HSC还对rd1/rd1小鼠的血管和神经元细胞层这二者提供了一种有力的拯救作用(图18(B和C))。此观察结果证实，在人骨髓中存在靶向视网膜血管系统并可防止视网膜变性的细胞。

Lin^-HSC在rd10/rd10小鼠中具有血管营养性和神经营养性作用。

尽管rd1/rd1小鼠是应用最广泛且表征最详尽的视网膜变性模型(Chang等，2002，Vision Res.42：517-525)，但变性非常迅速，在这点上与在人类疾病中观察到的通常更慢的时程不同。在该品系中，光感受器细胞变性在P8左右开始，P8是视网膜血管系统仍在快速伸展的时刻(图15)。深层视网膜血管系统随后发生变性，即便中部丛仍在形成，因此，rd1/rd1小鼠的视网膜从未完全发育，这与在大多数患有该病的人中所观察到的不同。rd10小鼠模型具有更慢的变性时程，更紧密类似于人视网膜变性状态，使用该模型研究Lin^-HSC介导的血管拯救。在rd10小鼠中，光感受器细胞变性于P21左右开始，其后不久便开始血管变性。

因为正常的视网膜神经感觉层发育至P21时大体完成，所以观察到变性在视网膜已完成分化后开始，因此，该变性比rd1/rd1小鼠模型更类似于人视网膜变性。将来自rd10小鼠的Lin^-HSC或对照细胞注射入P6眼中，于变化的时间点评价视网膜。在P21时，注射了Lin^-HSC和对照细胞的眼的视网膜看起来都正常，所有的血管层都完全发育，INL与ONL正常发育(图18(D和H))。在约P21时视网膜变性开始发生并随时间加剧。至P30时，注射对照细胞的视网膜表现出严重的血管及神经元变性(图18(I))，而注射Lin^-HSC的视网膜保持几乎正常的血管层和光感受器细胞(图18(E))。经拯救的眼和未经拯救的眼之间的差异在后面的时间点上更加显著(对比图18(F和G)与图18(J和K))。在对照治疗的眼中，通过对CD31和胶原蛋白IV的免疫组织化学染色非常清楚地观察到血管变性的发展(图18((I-K))。对照治疗的眼对CD31几乎完全阴性，而胶原蛋白IV阳性血管“痕迹”仍然明显，表明已发生血管退化，而不是未完成的血管形成。相反，Lin^-HSC治疗的眼具有同时为CD31阳性和胶原蛋白IV阳性的血管，看起来非常类似于正常的野生型眼(对比图18(F和I))。

用Lin^-HSC治疗后rd/rd小鼠视网膜的基因表达分析。

使用大规模基因组学(微阵列分析)分析经拯救的和未经拯救的视网膜，以鉴别神经营养性拯救中推定的介导物。将用Lin^-HSC治疗的rd1/rd1小鼠视网膜中的基因表达与未注射的视网膜以及注射对照细胞(CD31^-)的视网膜进行比较。这些比较各以一式三份实施。在所有的三份测试中，要求基因所具有的表达水平至少为背景水平的2倍才可认定其存在。和注射了对照细胞及未注射的rd/rd小鼠视网膜相比，在Lin^-HSC保护的视网膜中被上调至3倍的基因如图20中的图A和B所示。通过将标准偏差除以各个cRNA复制物的平均表达水平，计算表达基因的变异系数(COV)水平。另外，通过使平均值和标准偏差(SD)关联计算表达水平和噪声离散(noise variance)之间的关联。获得各个基因的基因表达水平和标准偏差之间的关联，使得可以确定背景水平和可信表达水平阈值。总体来讲，数据完全落在容许限度内(Tu等，2002，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 99：14031-14036)。以下单独讨论的基因具有的表达水平高于这些临界表达水平。还测定了所讨论基因的成对“t检验”值。在各种情况下p值都是合理的(接近或低于0.05)，表明复制物之间存在相似性，不同测试组之间存在可能的显著性差异。许多显著上调的基因，包括MAD及Ying Yang-1(YY-1)(Austen等，1997，Curr.Top.Microbiol.Immunol.224：123-130)，编码具有涉及保护细胞免于凋亡之功能的蛋白。许多晶体蛋白基因与涉及保护细胞抵抗应激的已知热激蛋白具有序列同源性和相似的功能，这些晶体蛋白基因也被Lin^-HSC治疗上调。α-晶体蛋白的表达通过免疫组织化学分析定位在ONL(图19)。图19表明，在经拯救的外核层细胞中，在用Lin^-HSC治疗后晶体蛋白αA被上调，但在用对照细胞治疗的对侧眼中未被上调。左图显示了经拯救的视网膜中的IgG染色(对照)。中图显示了经拯救的视网膜中的晶体蛋白αA。右图显示了未经拯救的视网膜中的晶体蛋白αA。

将用人Lin^-HSC拯救的来自rd1/rd1小鼠视网膜的信使RNA杂交至人特异性Affymetrix U133A微阵列芯片上。经严格性分析后，发现了许多这样的基因：其mRNA表达是人特异性的、高于背景，与鼠Lin^-HSC拯救的视网膜和注射了人对照细胞的、未经拯救的视网膜相比，在人Lin^-HSC拯救的视网膜中明显更高(图20，图C)。CD6(一种在原生的和新分化的CD34+造血干细胞表面表达的细胞粘附分子)和干扰素α13(另一种由造血干细胞表达的基因)都是通过微阵列生物信息学技术发现的，验证了评价方法的有效性。此外，在人Lin^-HSC拯救的小鼠视网膜样品中，几种生长因子及神经营养因子高于背景表达(图20，图D)。

使用谱系定向造血细胞标记来负选择含EPC的骨髓源Lin^-HSC群。虽然可用作EPC的骨髓源Lin^-HSC亚群不是由常用的细胞表面标记表征的，但这些细胞在发育中或受损的视网膜血管系统中的行为完全不同于在Lin⁺或成熟内皮细胞群中所观察到的。这些细胞选择性地靶向视网膜血管生成部位，参与伸展血管的形成。

遗传性视网膜变性疾病通常伴发视网膜血管系统损失。对这类疾病的有效治疗要求恢复功能以及维持复杂的组织结构。尽管最近几项研究已经研究了营养因子或干细胞自身的基于细胞传递的应用，但这二者的某种组合可能是必需的。例如，使用生长因子疗法治疗视网膜变性疾病导致血管不受调节地过度生长，造成正常视网膜组织结构的严重破坏。使用神经或视网膜干细胞治疗视网膜变性疾病可重建神经元功能，但功能性血管系统对维持视网膜功能完整性也是必需的。Lin^-HSC群的细胞掺入到rd/rd小鼠视网膜血管，在不破坏视网膜结构的情况下稳定变性的血管系统。当所述细胞注射入P15rd/rd小鼠中时也观察到这种拯救作用。由于rd/rd小鼠中的血管变性在P16时开始，所以这个观察结果扩展了有效的Lin^-HSC治疗的治疗窗。在注射了Lin^-HSC细胞的眼中视网膜神经元和光感受器得以保持，视觉功能得以维持。

成体骨髓源Lin^-HSC在玻璃体内注射入患有视网膜变性疾病的小鼠中时，发挥出深度的血管营养性和神经营养性作用。这种拯救作用在治疗后持续达6个月，而且在完全视网膜变性之前(直到小鼠出生后16天，所述小鼠通常至出生后30天表现出完全视网膜变性)注射Lin^-HSC时最有效。这种拯救作用在两种视网膜变性小鼠模型中观察到，而且引人注目的是，当受体是患有视网膜变性的免疫缺陷啮齿类动物(例如SCID小鼠)时，或者当供体是患有视网膜变性的小鼠时，用成人骨髓源HSC能够实现这种拯救。虽然最近几篇报道描述了在利用野生型基因的病毒型(virus-based)基因拯救之后于患有视网膜变性的小鼠或狗中有部分表型拯救(Ali等，2000，Nat Genet25：306-310；Takahashi等，1999，J.Virol.73：7812-7816；Acland等，2001，Nat.Genet.28：92-95)，但本发明是第一个通过血管拯救获得的通用细胞型(cell-based)治疗作用。因此，此方法对治疗具有100个以上已知相关突变的一组疾病(例如色素性视网膜炎)的潜在用途比创建各个基因疗法来治疗每个已知突变更为实用。

神经营养性拯救作用的确切分子基础尚不清楚，但仅在有同时发生的血管稳定/拯救的情况下被观察到。存在注射的干细胞本身不足以产生神经营养性拯救，在外核层中明显不存在干细胞源神经元排除了所注射细胞转变为光感受器的可能性。由微阵列基因表达分析获得的数据表明，已知具有抗凋亡效应的基因明显上调。由于在视网膜变性中观察到的大多数神经元死亡都为凋亡方式，所以这种保护可能对在这些疾病中延长光感受器和其它视觉功能关键性神经元的寿命具有重大治疗益处。c-myc是一种通过上调多种下游凋亡诱导因子而参与凋亡的转录因子。c-myc表达在rd/rd小鼠中增加至野生型的4.5倍，表明它可能涉及在rd1/rd1小鼠中观察到的光感受器变性。已知两种在Lin^-HSC保护的视网膜中被显著上调的基因Mad1和YY-1(图20，图A)抑制c-myc活性，从而抑制c-myc诱导的凋亡。还已表明，Mad1过表达抑制Fas诱导的胱天蛋白酶(Caspase)-8活化，胱天蛋白酶-8是凋亡途径的另一种关键组分。这两种分子的上调可通过防止一般在rd/rd小鼠中导致变性的凋亡启动而在保护视网膜免于血管和神经变性方面发挥作用。

另一组在Lin^-HSC保护的视网膜中被大幅上调的基因包括晶体蛋白家族成员(图20，图B)。与热激蛋白及其它应激诱导蛋白相似，晶体蛋白可被视网膜应激激活，提供抗凋亡的保护作用。在视网膜营养不良大鼠模型中，晶体蛋白αA的异常低表达同光感受器损失相关，最近一个rd/rd小鼠视网膜的蛋白质组学分析表明，晶体蛋白上调的诱导是对视网膜变性的响应。根据我们的EPC拯救的rd/rd小鼠视网膜的微阵列数据，晶体蛋白的上调看起来在EPC介导的视网膜神经保护中起重要作用。

诸如c-myc、Mad1、Yx-1之类的基因和晶体蛋白可能是神经元拯救的下游介导物。神经营养药可调节抗凋亡基因表达，但我们的用小鼠干细胞拯救的视网膜的微阵列分析未证实诱导增加水平的已知神经营养因子。另一方面，用人特异性芯片分析人骨髓源干细胞介导的拯救的确表明：多种生长因子基因的表达低但显著地增加。

被上调基因包括成纤维细胞生长因子家族的几个成员与otoferlin。otoferlin基因中的突变与由于听觉神经病所致的导致耳聋的遗传障碍相关。有可能是由注射的Lin^-HSC产生的otoferlin也有助于预防视网膜神经病。在历史上，一直以来都假设在视网膜变性的病人及动物中观察到的血管变化是由于光感受器死亡所引起的代谢需求减少的继发结果。本文数据表明，至少对患有遗传性视网膜变性的小鼠来说，保持正常的血管系统可能也有助于维持外核层的组分。近来文献中的报道会支持这样一种观点：组织特异性血管系统具有的营养作用超出了仅提供血管“养分”的预期作用。例如，在VEGFR1活化后，肝内皮细胞当遭遇肝损伤时可被诱导产生肝细胞再生与维持的关键性生长因子(LeCouter等，2003，Science 299：890-893)。

已报道血管内皮细胞和邻近的肝实质细胞之间相似的指示性相互作用与肝器官形成有关，之后很久才形成功能性血管。在视网膜变性个体中的内源性视网膜血管系统可能不会促成如此显著的拯救，但如果该血管系统以来源于骨髓造血干细胞群的内皮祖细胞支持，则它们会使血管系统对变性更有抗性，同时有利于视网膜神经元以及血管存活。在患有视网膜变性的人中，延迟完全视网膜变性发作可提供数年的额外视觉能力。用Lin^-HSC治疗的动物明显保持了足可支持其视力的ERG。

在临床上广泛认识到，尽管仍能保持视觉功能，但光感受器与其它神经元可能已有实质损耗。在某些情况下，临界阈值相交，视觉丧失。由于几乎所有患有遗传性视网膜变性的人都发病早但发病慢，因此可鉴别视网膜变性个体，并用本发明的自体骨髓干细胞移植物玻璃体内治疗，以延迟视网膜变性和伴发的视觉丧失。为增强本发明干细胞的靶向与掺入，期望存在活化的星形胶质细胞(Otani等，2002，Nat.Med.8：1004-1010)；这可在存在相关的神经胶质增生时通过早期治疗实现，或通过使用激光刺激活化星形胶质细胞局部增殖来实现。可选地，在眼内注射前用一种或多种神经营养药离体转染干细胞可用于增强拯救作用。该方法可用于治疗其它视神经元变性疾病，例如其中存在视网膜神经节细胞变性的青光眼。

来自成体骨髓的Lin^-HSC群含有可在不破坏视网膜结构的情况下通过靶向活化星形胶质细胞并掺入既有模板中而促进血管生成的EPC群。Lin^-HSC还在患有视网膜变性的眼中提供了长期神经营养性拯救作用。此外，经遗传修饰的、含EPC的自体Lin^-HSC组合物可移植入缺血或异常血管化的眼中，并可稳定掺入新血管和神经元层中，在延长的时间段内持续地局部传递治疗分子。这种以生理学上有意义的剂量局部传递表达药物的基因代表了一种治疗目前无法治愈的眼疾的新范例。

例如，正常小鼠视网膜中的光感受器主要为视杆，但在用本发明的Lin^-HSC拯救后观察到的外核层主要含视锥。大部分遗传性人视网膜变性由原发性视杆特异性缺陷所致，一般认为视锥丧失是视杆功能失调的继发结果，视杆功能失调可能与视杆表达的某些营养因子的缺失有关。

实施例

实施例1.细胞分离与富集；鼠Lin^-HSC群A和B的制备

一般方法。所有体内评价均依照NIH Guide for the Care and Use ofLaboratory Animals(NIH实验动物看护与使用指南)执行，并且所有评价程序均得到Scripps Institute(TSRI，La Jolla，CA)Animal Care andUse Committee(动物看护与使用委员会)的批准。从B6.129S7-Gtrosa26、Tie-2GFP、ACTbEGFP、FVB/NJ(rd/rd小鼠)或Balb/cBYJ成体小鼠(The Jackson Laboratory，ME)中提取骨髓细胞。

然后，通过使用

聚蔗糖梯度(Sigma，St.Louis，MO)的密度梯度分离来分离单核细胞，并用在小鼠中用于Lin^-选择的生物素缀合的谱系群体抗体(CD45、CD3、Ly-6G、CD11、TER-119，Pharmingen，San Diego，CA)标记。使用磁分离设备(AUTOMACS^TM分选仪，Miltenyi Biotech，Auburn，CA)从Lin^-HSC中分离并除去谱系阳性(Lin⁺)细胞。所获得的含内皮祖细胞的Lin^-HSC群使用以下抗体：PE缀合的Sca-1、c-kit、KDR和CD31(Pharmingen，San Diego，CA)用FACS^TM Calibur流式细胞仪(Becton Dickinson，Franklin Lakes，NJ)进一步表征。Tie-2-GFP骨髓细胞用于表征Tie-2。

为收获成体小鼠内皮细胞，通过外科手术从ACTbEGFP小鼠中取出肠系膜组织，并置于胶原酶(Worthington，Lakewood，NJ)中以消化组织，然后使用45μm滤器过滤。收集流通液并与内皮生长培养基(Clonetics，San Diego，CA)孵育。通过观察形态上的鹅卵石状外观、用CD31 mAb(Pharmingen)染色以及检查在MATRIGEL^TM基质(Beckton Dickinson，Franklin Lakes，NJ)中形成管样结构的培养物确认内皮特征。

鼠Lin^-HSC群A。通过上述一般方法从ACTbEGFP小鼠中提取骨髓细胞。通过FACS流式细胞术表征Lin^-HSC细胞的CD31、c-kit、Sca-1、Flk-1与Tie-2细胞表面抗原标记。结果如图1(c)所示。约81％的Lin^-HSC显示出CD31标记，约70.5％的Lin^-HSC显示出c-kit标记，约4％的Lin^-HSC显示出Sca-1标记，约2.2％的Lin^-HSC显示出Flk-1标记，约0.91％的Lin^-HSC显示出Tie-2标记。相反，从这些骨髓细胞中分离的Lin⁺HSC具有显著不同的细胞标记谱(即，CD31：37.4％；c-kit：20％；Sca-1：2.8％；Flk-：0.05％)。

鼠Lin^-HSC群B。通过上述一般方法从Balb/C、ACTbEGFP及C3H小鼠中提取骨髓细胞。分析Lin^-HSC细胞中细胞表面标记(Sca-1、Flk-1/KDR、c-kit(CD117)、CD34、CD31和各种整联蛋白：α1、α2、α3、α4、α5、α6、α_L、α_M、α_V、α_X、α_IIb、β₁、β₂、β₃、β₄、β₅和β₇)的存在情况。结果如表2所示。

表2.Lin^-HSC群B的表征

实施例2.在鼠模型中玻璃体内给予细胞

用锋利的刀片在小鼠眼睑中做一条眼睑裂缝，暴露P2至P6眼球。然后使用一个33号(Hamilton，Reno，NV)针头的注射器玻璃体内注射本发明的谱系阴性HSC群A(在约0.5μl至约1μl细胞培养基中有约10⁵个细胞)。

实施例3.EPC转染

根据厂商的方案利用FuGENE^TM6转染试剂(Roche，Indianapolis，IN)用编码TrpRS的T2片段、又附有His₆标记的DNA(SEQ ID NO：1，图7)转染鼠Lin^-HSC(群A)。将Lin^-HSC细胞(每ml约10⁶个细胞)悬浮在含有干细胞因子(PeproTech，Rocky Hill，NJ)的OPTI-培养基(Invitrogen，Carlsbad，CA)中。然后加入DNA(约1μg)和FuGENE试剂(约3μl)的混合物，将混合物在约37℃孵育约18小时。孵育后，清洗并收集细胞。经FACS分析证实该系统的转染率约为17％。通过蛋白质印迹证实T2-TrpRS产生。His₆标记的T2-TrpRS的氨基酸序列如图8的SEQ ID NO：2所示。

实施例4.免疫组织化学和共焦分析

在不同时间点收集小鼠视网膜，为整装片或者冰冻切片制片做准备。对于整装片，使用4％多聚甲醛固定视网膜，在50％胎牛血清(FBS)及20％正常山羊血清中于室温封闭一小时。视网膜经第一抗体处理并用第二抗体检测。使用的第一抗体为：抗胶原蛋白IV(Chemicon，Temecula，CA)、抗β-gal(Promega，Madison，WI)、抗GFAP(DakoCytomation，Carpenteria，CA)、抗-α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA，DakoCytomation)。使用的第二抗体缀合Alexa 488或594荧光标记(Molecular Probes，Eugene，OR)。利用MRC 1024共焦显微镜(Bio-Rad，Hercules，CA)获取图像。利用

软件(Bio-Rad)创建三维图像，以检查整装视网膜中三个不同血管层的发育。利用由共焦显微镜辨别出的增强型GFP(eGFP)小鼠与GFAP/wtGFP小鼠间的GFP像素强度差异创建三维图像。

实施例5.小鼠中体内视网膜血管生成定量测定

对于T2-TrpRS分析，从小鼠视网膜三维图像重建原发丛与深部丛。原发丛分为两类：正常发育或停止的血管发展。深部血管发育抑制的分类基于血管抑制的百分比进行分析，包括以下标准：深部丛形成的完全抑制标记为“完全”，正常血管发育(含少于25％的抑制)标记为“正常”，其余的标记为“部分”。对于rd/rd小鼠的拯救数据，使用10x镜头获取每个整装视网膜中较深血管丛的四个单独区域。计算每幅图像的血管系统总长、总结并进行组间比较。为了获得精确的信息，将Lin^-HSC注射入小鼠的一只眼中，而将Lin⁺HSC注射到同一小鼠的另一只眼中。未注射的对照视网膜取自同一窝动物。

实施例6.成年视网膜损伤小鼠模型

使用二极管激光器(150mW，1秒，50mm)或用一个27号针头机械刺破小鼠视网膜建立激光模型和瘢痕模型。在伤后5天，利用玻璃体内方法注射细胞。5天后采集小鼠眼睛。

实施例7.视网膜变性的神经营养性拯救

成体鼠骨髓源谱系阴性造血干细胞(Lin^-HSC)在视网膜变性小鼠模型中具有血管营养性和神经营养性拯救作用。在10天龄小鼠的右眼玻璃体内注射约0.5微升含约10⁵个本发明Lin^-HSC，2个月后评价视网膜血管系统的存在情况与神经元层核的数目。同一小鼠的左眼注射约相同数目的Lin⁺HSC作为对照，并进行类似评价。如图9所示，在Lin^-HSC治疗的眼中，视网膜血管系统表现得几乎正常，内核层几乎正常，外核层(ONL)有约3至约4个核层。相比之下，对侧Lin⁺HSC治疗的眼有明显萎缩的中间视网膜血管层，完全萎缩的外视网膜血管层；内核层明显萎缩，外核层完全消失。这在小鼠3与小鼠5中表现得尤为明显。在小鼠1中未见拯救作用，这种情况存在于约15％的被注射小鼠中。

当使用视网膜电流图(ERG)评定视觉功能时，在观测到血管与神经元拯救(小鼠3与5)这二者时观察到正性ERG恢复。没有血管与神经元拯救时(小鼠1)未观察到正性ERG。图10所示的回归分析曲线说明了本发明的Lin^-HSC产生的rd/rd小鼠眼中血管和神经营养拯救之间的相关性。对于中间层血管系统类型(r＝0.45)和深层血管系统(r＝0.67)，观测到神经元(y轴)与血管(x轴)恢复之间的相关性。

图11说明了在Lin⁺HSC产生的血管与神经元拯救之间没有任何统计学上的显著相关性。对血管拯救定量，数据列于图12。图12显示的注射后1个月(1M)、2个月(2M)及6个月(6M)时的小鼠数据表明，用本发明的Lin^-HSC治疗的眼中的血管长度(深色柱)相对于同一小鼠的未治疗眼中的血管长度(浅色柱)有显著增加，特别是在注射后1个月与2个月时。在注射Lin^-HSC或Lin⁺HSC后约两个月，通过计数内核层和外核层中的核来定量神经营养性拯救作用。结果列于图13与14中。

实施例8.人Lin^-HSC群

通过上述一般方法从健康成人志愿者中抽取骨髓细胞。然后通过使用

聚蔗糖梯度(Sigma，St.Louis，MO)的密度梯度分离来分离单核细胞。为了从人骨髓单核细胞中分离Lin^-HSC群，将下述生物素缀合的谱系群体抗体用于磁分离系统(AUTOMACS^TM分选仪，Miltenyi Biotech，Auburn，CA)：CD2、CD3、CD4、CD11a、Mac-1、CD14、CD16、CD19、CD33、CD38、CD45RA、CD64、CD68、CD86、CD235a(Pharmingen)。

基于CD133表达将人Lin^-HSC群再分为两个亚群。细胞用生物素缀合的CD133抗体标记，并分成CD133阳性亚群和CD133阴性亚群。

实施例9.在视网膜变性鼠模型中玻璃体内给予人和鼠细胞

C3H/HeJ、C3SnSmn.CB17-Prkdc SCID与rd10小鼠品系用作视网膜变性模型。C3H/HeJ与C3SnSmn.CB17-Prkdc SCID小鼠(TheJackson Laboratory，Maine)是视网膜变性1(rd1)突变纯合型，所述突变是引起早期发作的严重视网膜变性的突变。该突变位于编码视杆光感受器cGMP磷酸二酯酶β亚基的Pde6b基因的外显子7中。该基因中的此突变已在常染色体隐性的色素性视网膜炎(RP)人患者中发现。C3SnSmn.CB17-Prkdc SCID小鼠还是重症联合免疫缺陷自发突变(Prkdc SCID)纯合型，用于人细胞转移实验。rd10小鼠中的视网膜变性由Pde6b基因的外显子13中的突变引起。这也是一种发作比rd1/rd1更晚、视网膜变性比rd1/rd1更轻微的临床相关性RP模型。所有评价均依照NIH实验动物看护与使用指南实施，所有方法都获得Scripps研究所(TSRI，La Jolla，CA)动物看护与使用委员会的批准。

用锋利的刀片在小鼠眼睑中做一条眼睑裂缝，暴露P2至P6眼球。使用一个33号(Hamilton，Reno，NV)针头的注射器将鼠群A或人群C的谱系阴性HSC细胞(在约0.5μl至约1μl细胞培养基中有约10⁵个细胞)玻璃体内注射入小鼠眼中。为使注射的人细胞可见，在注射前用染料(Cell tracker green CMFDA，Molecular Probes)标记细胞。

在不同时间点收集视网膜，并用4％多聚甲醛(PFA)和甲醇固定，接着在50％FBS/20％NGS中于室温封闭一小时。为使视网膜血管系统染色，将视网膜与抗CD31抗体(Pharmingen)及抗胶原蛋白IV抗体(Chemicon)孵育，接着与Alexa 488或594缀合的第二抗体(MolecularProbes，Eugene，Oregon)孵育。以四个放射状松解切口平铺视网膜，以获得整装制片。视网膜血管中部丛或深部丛中的血管系统图像(参见Dorrell等，2002 Invest Ophthalmol.Vis.Sci.43：3500-3510)利用Radiance MP2100共焦显微镜及

软件(Biorad，Hercules，California)获得。为定量分析血管系统，从中部血管层或深部血管层的中间部分随机选择四个独立区域(900μm×900μm)，使用

分析软件(Biorad)测量血管系统总长。同一丛中的这四个区域的总长用于进一步分析。

为制作冰冻切片，重新包埋视网膜平片。视网膜置于4％PFA中过夜，然后与20％蔗糖孵育。视网膜包埋在最佳切割温度复合物(OCT：Tissue-Tek；Sakura FineTech，Torrance，CA)中。冰冻切片(10μm)在含核染料DAPI(Sigma-Aldrich，St.Louis，Missouri)的PBS中再水合。通过共焦显微镜获取在含视神经乳头及完整周边视网膜的单个切片中的三个不同视野(280μm宽，无偏采样)的DAPI标记的核图像。对位于一个切片中的三个独立视野的ONL中的核数目进行计数并求和，以进行分析。进行简单线性回归分析，以检查深部丛中的血管系统长度与ONL中的细胞核数之间的关系。

在整夜暗适应后，通过腹膜内注射15μg/g氯胺酮与7μg/g赛拉嗪麻醉小鼠。使用金环角膜电极连同口参考和尾接地电极，在瞳孔放大后(1％硫酸阿托品)从每只眼的角膜表面记录视网膜电图(ERG)。用固定在高反射性Ganzfeld圆顶外面的Grass Photic Stimulator(光刺激器)(PS33 Plus，Grass Instruments，Quincy，MA)产生刺激。在直至光刺激器最大允许值(0.668cd-s/m²)的强度范围内记录对短波长(Wratten47A；λ_max＝470nm)闪光的视杆反应。对反应信号进行放大(CP511 AC放大器，Grass Instruments)、数字化(PCI-1200，National Instruments，Austin，TX)和计算机分析。每只小鼠作为其自身的内部对照，由治疗的眼和未治疗的眼记录ERG。将多达100次的扫描平均，用作最弱信号。运用数字计算由治疗眼的反应减去未治疗眼的平均反应，此信号差值用作功能性拯救的指标。

使用微阵列分析来评价经Lin^-HSC靶向的视网膜基因表达。用Lin^-HSC或CD31^-HSC注射P6rd/rd小鼠。注射后40天将这些小鼠的视网膜剥离到无RNA酶培养基中(在注射后的此时间点明显可见视网膜血管系统及光感受器层的拯救)。通过整装片分析每个视网膜的1个象限，以确保已获得正常的HSC靶向以及血管系统与神经保护作用。使用TRIzol(Life Technologies，Rockville，MD)、苯酚/氛仿RNA分离方案由成功注射的视网膜纯化RNA。使RNA杂交至AffymetrixMu74Av2芯片，使用

软件(SiliconGenetics，RedwoodCity，CA)分析基因表达。纯化的人或小鼠HSC玻璃体内注射入P6小鼠中。在P45时剥离视网膜并合并成以下部分：1)注射了人HSC的、经拯救的小鼠视网膜，2)注射了人HSC的、未经拯救的小鼠视网膜，及3)注射了小鼠HSC的、经拯救的小鼠视网膜，用于纯化RNA，并杂交至人特异性U133A Affymetrix芯片上。使用

软件鉴别高于背景值表达并在经人HSC拯救的视网膜中具有较高表达的基因。然后单独分析这些基因中每一个的探针对表达谱，并与使用dChip的正常人U133A微阵列实验模型对比，以确定人类物种特异性杂交，并消除由于种间杂交产生的假阳性。

图21显示了流式细胞术数据，该数据比较了CD31及整联蛋白α6表面抗原在本发明的CD133阳性(CD133⁺)与CD133阴性(CD133^-)的人Lin^-HSC群上的表达。左图显示了流式细胞术散点图。中央图和右图是直方图，显示了细胞群上特异性抗体的表达水平。Y轴代表事件数，X轴显示信号强度。空心直方图是表明非特异性背景染色水平的同种型IgG对照抗体。实心直方图显示了所述细胞群上特异性抗体的表达水平。位于空心(对照)直方图右侧的实心直方图代表增加的荧光信号和高于背景水平的抗体表达。两个细胞群之间实心直方图峰位置的对比代表了细胞上的蛋白表达差异。例如，CD31在本发明的CD133+和CD133^-细胞上均高于背景表达；但是，和CD133^-群相比，在CD133+细胞群中表达较低水平的CD31的细胞更多。由此数据显见，CD31表达在两个群之间有变化，α6整联蛋白表达大部分限于Lin^-群中的细胞，因此可用作具有血管营养性和神经营养性拯救功能的细胞的标记物。

当将CD133阳性与CD133阴性的Lin^-HSC亚群玻璃体内注射入初生SCID小鼠的眼中时，观察到既表达CD31又表达整联蛋白α6表面抗原的CD133阴性亚群在发育中血管系统中掺入的程度最大(参见图21，下图)。不表达CD31或整联蛋白α6的CD133阳性亚群(图21，上图)看上去靶向外周缺血驱动的新血管化部位，但在注射入经历新血管生成的眼中时无此现象。

用对视杆视蛋白或视锥视蛋白特异性的抗体以免疫组化方法分析经拯救的和未经拯救的视网膜。对用于图17列出的ERG记录的相同眼睛进行视杆视蛋白或视锥视蛋白分析。在野生型小鼠视网膜中，存在的光感受器不足5％为视锥(Soucy等，1998，Neuron 21：481-493)，用红/绿视锥视蛋白或用视杆视紫红质所观测到的免疫组化染色图谱如图25(A)或图25(B)所示，该图谱符合视锥细胞的该百分率。对视杆视紫红质特异性的抗体(ρ4D2)由Univercity of British Columbia(大不列颠哥伦比亚大学)的Robert Molday博士提供，如先前所述使用(Hicks等，1986，Exp.Eye Res.42：55-71)。对视锥红/绿视蛋白特异性的兔抗体购自Chemicon(AB5405)，按照生产商的说明使用。

实施例10.在氧诱导型视网膜变性的鼠模型中玻璃体内给予鼠细胞

在氧诱导型视网膜变性(OIR)模型中的出生后P7至P12日之间，使新生野生型C57B16小鼠暴露于高氧(75％氧)。图22显示了由P0至P30期间C57B16小鼠中的正常初生后血管发育。在P0时只能在视神经盘周围观察到正出芽的浅层血管。在接下来的几天内，原发浅层网络向外周扩展，在P10日时到达远外周。在P7与P12之间，次生(深部)丛发育。至P17时，出现广泛的浅层与深层血管网络(图22，插图)。在随后的时间里，同血管的第三(中间)层的发育一起发生重塑，直至大约在P21时获得成体结构。

相比之下，在本文所述的OIR模型中，在于P7-P12暴露于75％氧之后，事件的正常次序被严重扰乱(图23)。本发明的成体鼠Lin^-HSC群于P3时玻璃体内注射入小鼠的一只眼中，该小鼠随后进行OIR，另一只眼注射PBS或者CD31阴性细胞作为对照。图24表明，Lin^-HSC群可在发育中的小鼠视网膜中逆转高氧水平的变性作用。在P17时于治疗的眼中观察到完全发育的浅层及深层视网膜血管系统，而对照眼显示出大量无血管区域，实际上是没有深层血管(图24)。观察了OIR模型中的约100只小鼠眼睛。Lin^-HSC群治疗的眼有58％观察到正常血管形成，相比之下，用CD31^-细胞治疗的对照眼为12％，用PBS治疗的对照眼为3％。

实施例11.通过CD44选择由鼠骨髓分离髓样骨髓细胞

骨髓细胞由成体小鼠(The Jackson Laboratory，ME)提取。全骨髓用鼠CD44抗体处理，使用流式细胞术由骨髓分离表达CD44的细胞。将细胞与抗体分离，并储存在缓冲溶液中，以待后用。还分离了不显著表达CD44的细胞群(CD44^loBM)。

实施例12.通过CD44选择由鼠骨髓分离髓样骨髓细胞

还使用针对CD11b的抗体替代CD44，如在实施例11中所述的对骨髓细胞进行正选择。分离出为CD44^hi和CD11b+的髓样骨髓细胞群，它们与在实施例11中使用CD44分离的CD44^hi群具有相似的活性特征。还分离了CD44^loCD11b^-群，发现该群无活性。

实施例13.MLBM细胞群的特征

尽管CD44在此方面的作用尚不清晰，但有可能是该受体在细胞注射入眼中后于富含透明质酸的玻璃体中介导细胞存活、细胞迁移和/或细胞分化。不同的CD44^hi(即MLBM)和CD44^lo细胞群存在于未经分级分离的小鼠骨髓中。MLBM细胞群占先前实施例中使用的Lin^-群的76％，而分别只有约37％和4％的骨髓的Lin+和CD31^-/CD34^-/CD11b^-细胞群表达CD44(图26)。因此，在CD44表达和在这3种群中观察到的血管营养活性和神经营养活性之间有极佳关联，即Lin^-细胞最为有效，而CD31^-/CD34^-/CD11b^-细胞始终是效力最低的。使用一组谱系特异性抗体，大部分CD44^hi细胞经测定具有强的髓样特征(图27)。同样，几乎所有的CD44^hi骨髓细胞也都是CD11b⁺(图27)。

在实施例12中使用CD11b抗体正选择的MLBM(CD44^hiCD11b⁺)产生的活性结果类似于在血管靶向实验中使用CD44抗体选择分离的MLBM所获得的结果。

实施例12的MLBM细胞群和在实施例12中分离的CD44^loCD11b⁺细胞的细胞表面抗原特征示于以下的表3。在表3中，加号(+)越多表示抗原表达相对越高。减号(-)表示未检测到表达。

表3

实施例14.MLBM细胞群的血管营养性和神经营养性作用

实施例11的MLBM细胞群保留了Lin^-细胞在血管靶向以及血管营养性和神经营养性作用方面的特性，而CD44^loBM细胞基本没有或没有显示出活性。血管靶向活性如下证明：将GFP⁺MLBM细胞群之细胞玻璃体内注射入出生后第7天(P7)的小鼠中，并于P14分析视网膜。在用GS同工凝集素标记血管后，观察到GFP⁺细胞靶向视网膜血管系统，并呈现出血管周定位，没有掺入的证据。这些事件在使用MLBM时是常见的，但在用CD44^loBM治疗的眼中不常见或没有(图28)。

使用如上针对Lin^-HSC描述的视网膜变性小鼠模型评价实施例11的MLBM细胞群的血管营养性和神经营养性活性。rd1/rd1小鼠显示出视网膜变性疾病的特征，包括光感受器死亡和深层视网膜血管系统萎缩。如上所述，Lin^-HSC骨髓细胞保留了深层视网膜血管系统和部分被拯救的光感受器。本发明MLBM细胞群表现出相同的功能(图29)。

氧诱导性视网膜病模型与早产儿视网膜病共有一些特征。当用MLBM细胞群之细胞治疗眼时，与该模型相关的病况显著减轻。在该模型中MLBM细胞群之细胞的作用与使用上述Lin^-HSC观察到的作用相似。用MLBM细胞群之细胞治疗的眼在两个参数方面显示出显著减轻，这两个参数用于定量该模型中的病况程度：血管消失面积和新生血管丛面积。相反，用CD44^loBM细胞治疗的眼没有显示出相对于载体治疗的眼有改善(图30)。

除了靶向视网膜血管系统以外，MLBM细胞群之细胞分化为巨噬细胞样(F4/80⁺)细胞，穿过视网膜，占据与视网膜色素上皮细胞(RPE)紧密相对的位置。这种定位有利于所观察到的MLBM细胞群之细胞的血管和光感受器拯救作用。而且，一旦处于接近RPE的位置，MLBM细胞群之细胞就产生血管内皮生长因子(VEGF)，这通过注射来源于VEGF-GFP小鼠的MLBM细胞群之细胞得以证实，在VEGF-GFP小鼠中，绿色荧光蛋白(GFP)在VEGF基因活化时被表达(图31)。因此，MLBM细胞群之细胞看起来处于VEGF“活化”状态。导入的MLBM细胞群之细胞看起来募集相同类型的内源细胞，因为GFP⁺(导入的)细胞和GFP^-(内源)细胞均在RPE区被观察到。该定位已在正常视网膜血管发育期间于野生型小鼠中、在rd1/rd1小鼠的经拯救的视网膜中以及在氧诱导性视网膜病模型中被观察到。

发现实施例12的MLBM细胞群有相似的血管靶向结果。图32表明，到P20时，实施例12的CD44^hiCD11b⁺细胞(绿色)在P2注射时，以类似于实施例11的CD44^hi群的方式，特异性地靶向血管系统(红色)。图33表明，实施例12的CD44^loCD11b^-并不特异性地靶向血管系统。

本发明MLBM细胞群提供有效和通用的眼病治疗。所述细胞容易由自体骨髓分离，因此使经常在细胞型治疗中观察到的潜在免疫原性最小。另外，本发明MLBM细胞群可用有用的基因转染，以便传递功能性基因至视网膜。

实施例15.骨髓细胞亚群的其它特征

如在先前实施例中所述，所有实验都按照实验室动物看护和使用的NIH指南实施，所有实验步骤都得到TSRI动物看护和使用委员会批准。按照上述方案在C57B16小鼠中诱导OIR。出生后第7天将幼鼠及它们的母亲由室内空气转移至75％氧环境达5天，之后返回到室内空气。氧水平使用FDA批准的氧分析仪(AX-300，TeledyneAnalytical Instruments，CA，USA)监测。在这些条件下，在高氧期间于中央视网膜中形成大的血管过少区(hypovascular area)，在返回至常氧后出现异常的视网膜前新生血管化，于约P17时达到峰值，最终消退(图37，图g-i；图2，图a、c)。

细胞制备：基本上如下实施小鼠骨髓细胞提取：由actGFP小鼠的股骨和胫骨收集骨髓细胞，并使用两种不同方法加工。在第一种方法中，单核细胞通过使用FICO/LITE

(Atlanta Biologicals，Norcross，Georgia)的密度梯度分离，并用生物素缀合的谱系抗体(CD45R/B220、CD3e、Ly-6G/C、CD11b、TER119，Pharmingen，SanDiego，CA)标记。在此之后是与链霉抗生物素蛋白或抗生物素磁珠孵育，并使用MACS细胞分选系统(Miltenyi Biotech，Auburn，CA)分选，以获得Lin^-HSC群。在第二种方法中，全骨髓与缀合荧光标记的针对CD44的抗体孵育。然后使用荧光激活细胞分选法(FACS)分离CD44^HI细胞(即其中大部分细胞表达CD44的MLBM细胞群)和CD44^LO细胞(即其中少数细胞表达CD44的细胞群)。

骨髓细胞表征：使用两种方法进一步分析通过上述方法获得的细胞亚群：(1)双色流式细胞术与抗各种谱系标记和祖细胞表面标记的抗体相组合，所述标记包括CD11a、CD11b、Ly6G/C、CD43、F4/80、CD14、cKit、CD34、α6整联蛋白和CD115(全部来自Pharmingen，SanDiego，CA)；和(2)使用Mu430 Chips(Affymetrix，Santa Clara，CA)，使用本领域已知的标准方法进行基因表达分析。使用

软件(Agilent Technologies，Palo Alto，CA)分析基因表达。

玻璃体内注射：通过轻柔的解剖做一条眼睑裂缝，以暴露P2至P7(高氧前)小鼠的眼球。在每只动物的一只眼中，使用Hamilton注射器和33号针头(Hamilton，Reno，NV)将在0.5μl载体(含0.5％BSA和2mM EDTA的PBS)中的约150,000-250,000个骨髓源细胞注射入玻璃体中。在对侧对照眼中，注射约等量的对照细胞或单独的载体，在某些情况下根本不进行注射，以观察疾病的自然病程。在部分实验中，细胞移植在P9至P12之间的较晚期实施。

视网膜血管系统的染色：在P17时收集视网膜，用于血管系统成像以及定位和表征注射的细胞。在某些情况下，麻醉动物，并心内注射荧光素标记的高分子量葡聚糖(FITC Dextran，Sigma)，然后解剖视网膜，以显现伸展的血管。在其它情况下，使用染色血管的免疫组织化学技术和表达GFP的细胞。将视网膜固定在4％全氟乙酸(PFA)和甲醇中，接着在20％FBS/20％NGS中于室温封闭1小时。在此之后与缀合至594的同工凝集素GS-IB4过夜孵育，以鉴别血管(Molecular Probes，Eugene，Oregon)。以放射状松解切口平铺视网膜，以获得整装制片，或者包埋在OCT中并制作冰冻切片，以获得视网膜横切切片，该切片在封固前用DAPI复染色。

为了表征移植的细胞，使用免疫组织化学技术鉴别眼的各部分中的以下细胞标记：F4/80(Caltag，Burlingame，CA)、CD44、CD31(Pharmingen，San Diego，CA)和NG2(Chemicon，Temecula，CA)。所有视网膜都用凝集素、抗GFP和上述标记之一三重染色。

成像和图象分析：使用

2100MP激光扫描共焦显微镜(Biorad，Hercules，CA)获得视网膜血管系统的图象。血管消失和新生血管化的定量如下进行：通过使用

(Adobe)或

软件(Improvision，Lexington MA)在GS凝集素染色的视网膜的中央视网膜中仔细描画出无血管区，并计算总面积，来测量血管消失面积。同样，通过使用在视网膜前平面聚焦的共焦图象并基于像素强度选择丛(丛比正常血管系统更明亮地标记)计算视网膜前新生血管化(“丛”)的面积。然后将选定区域相加，以产生新生血管化的总面积。T-检验用于在统计学上比较不同的实验组。

视网膜血管系统和血管周骨髓细胞的三维图象如下产生：收集z系列共焦图象，并使用软件将它们绘制成立体图。然后有可能观察横切切片中的视网膜血管，并测定移植的骨髓细胞相对于血管腔的位置。

视网膜血管发育和氧诱导性视网膜病小鼠模型。在图37的图a-f中显示了在常氧条件下生长的出生后小鼠的正常视网膜血管发育。在出生后第2天(P2)，仅观察到正出芽的浅层血管占据视神经盘周围的单平面(图37，图a、b)。在下一周当中，原发浅层网络向外周延伸，在约P12时达到远外周(图37，图c)。在P7-P12之间，次生(深部)丛发育(图37，图d)。至第一个月结束时，在完全血管化的视网膜中发生重建(图37，图e)，同时出现第三(中间)层血管的发育，并达到成体结构(图37，图f)。

相比之下，在OIR模型中，P7-P12接触75％氧严重破坏事件的正常顺序：在中央视网膜中已形成的浅层血管网络出现显著退化，尤其是沿着动脉(图37，图g(P10)和图h、i(P17))的浅层血管网络，深部丛的发育被严重延迟(图37，图k、m，P17的视网膜横切切片)。异常方式的血管生长仅在P12时返回到常氧条件后再开始。本质上，对于严重血管过少的视网膜而言，现在有相对低氧的条件。在P17时，某些深层血管可在外周中鉴别，但与血管内染料渗漏相关的异常视网膜前新生血管丛可在处于血管过少的中央视网膜和更加血管化的外周之间的边界处的中外周见到(图37，图h)。接下来的数天中，浅层和深层血管在无血管区中缓慢发育，但在视网膜内界膜(ILM)之上穿入玻璃体中的新生血管丛经常持续至P21乃至更后。到P25-P30时，视网膜血管系统已重建，此时类似于正常的血管系统。

在高氧前注射造血祖细胞促进氧诱导性血管消失后的视网膜中的血管修复。于P2-P7注射本发明的Lin^-HSC显著改变视网膜血管系统在暴露于高氧后恢复的能力(图37，图j、l、n、o，和图38，图b、d、e、f、g)。注射单独的载体并不诱发这些改变。在超过50％的情况下，于P17时在注射Lin^-HSC的眼中观察到完全发育的浅层和深层视网膜血管系统，而注射载体的对侧眼显示出大的无血管区域，实际上没有深层血管(图37，图l、n，与图h、i、k、m以及图o相比)。在某些情况下，尤其在对侧对照眼中的损伤非常严重时，至P17时注射Lin^-HSC细胞的眼中的恢复不完全，但在大部分情况下明显好转。同一动物中对侧眼之间的该对比为Lin^-HSC有效地均衡大部分其它遗传和环境因子的效力提供了进一步的支持。

血管消失一直是该模型中的一个认识不足的特征，因为大多数研究仅分析了连续视网膜切片中的视网膜前新血管丛形成。可使用共焦显微镜和数字图象分析来评价同一视网膜中的血管消失和丛形成(参见例如图38，图a-d)。选择P17作为分析的主要时间点，因为丛形成经常在此时最大，同时在对照眼中仍存在显著的血管消失。使用组合分析的新方法鉴别是治疗的眼和对照眼之间有显著差异。与接受单独的载体或未注射的眼相比(图38，图e)，在Lin^-治疗的视网膜中于P17检测的血管消失显著下降(消失面积下降超过75％)。就此而言，在载体注射和未注射之间未观察到显著差异。同样，与注射载体的眼相比，用Lin^-细胞治疗的眼的新血管丛面积具有约70％下降，相对于未注射的对照有超过80％的下降(图38，图f)。因此，用Lin^-HSC治疗眼对小鼠OIR模型的两种主要的血管损伤和修复参数具有惊人的作用，即在加速“生理性”视网膜内血管再生的同时降低新血管丛的形成。

在高氧期间和返回到常氧时进行治疗时也观察到加速的修复，但效果下降。迄今为止描述的实验包括在P2-P7日实施注射，然后暴露于高氧。为测定在周期的高氧期和回到常氧时较迟注射的情况下Lin^-细胞是否也能影响血管修复，于P9、P11或P12进行注射，于不同的稍后时间点评价视网膜。结果示于图38的图g，表明注射Lin^-HSC对加速血管修复和减少消失面积有效，即便在高氧期间和P12时施用。但是，作用似乎稍微减弱，表明在暴露于高氧前实施治疗时获得最大效力。

在用Lin^-造血祖细胞治疗后，长期视网膜结构和功能被完好保留。还研究了用Lin^-HSC治疗的长期作用和可能的副作用。为此，由已按照既有模型经受Lin^-细胞注射和暴露于高氧的3-6月龄小鼠取出12个视网膜(图39)。未观察到肿瘤，在组织学上看起来在所有情况下神经视网膜都得以保留。唯一可注意到的异常是在视网膜中偶发性的“玫瑰花形”结构，此发现在对照眼中也存在(图39，图g、h)。注射Lin^-HSC的眼的视网膜血管系统具有正常外观，未发现与未注射的对照视网膜有明显差异(图39，图a-f)。

还研究了移植细胞的长期存在。GFP⁺细胞仅在低百分率(10％)的眼中观察到，表明大部分注射的细胞存活不超过几个月。当存在时，存活细胞经常位于视网膜血管系统附近。通过在移植后17日至6个月进行的视网膜电图记录检测的视网膜功能表明，Lin^-HSC移植的眼和年龄匹配的非OIR正常对照之间没有差异。为检查移植细胞可能离开眼并系统性散布的可能性，分析了注射后约7-10天来自15只小鼠的脾脏和/或肝脏中GFP⁺细胞的存在情况。未观察到眼外细胞。

鉴别活性细胞类型：Lin^-群富集CD44^HI细胞。为致力于更好地理解这些过程中可能有作用的机制和简化细胞选择步骤，尝试鉴别可用于由骨髓中分离活性HSC的单一标记。基于诸如涉及细胞迁移和分化的特征，集合了一大组候选骨髓祖细胞标记。使用流式细胞术筛选这些标记，对比其在Lin^-活性细胞中的表达和其在先前表明于众多实验系统中无活性的对照BM细胞中的表达。CD44证实在这两种群中差异表达：相比于在对照BM细胞群中的情况(4％)，CD44^HI细胞存在于明显较高比例的Lin^-细胞(76％)中(图40，图a)。如上所述，CD44是透明质酸的细胞表面受体，已表明参与几种细胞功能的调节，这几种功能据认为对介导包括存活、迁移和分化在内的拯救作用是重要的。CD44^HI细胞的分布在活性细胞群中是高度普遍的，在活性降低的对照细胞中相当稀少，表明CD44实际上是活性的有效指示剂。

例如，CD44^HI细胞促进OIR模型中的血管修复，而CD44^LO细胞不能。在OIR模型中证实了CD44^HI细胞在其促进血管修复的能力方面的效力。使用与对Lin^-细胞注射的描述相同的实验设计，证明CD44^HI细胞在该模型中促进视网膜血管修复，效力类似于用Lin^-细胞观察到的效力(图40，图b、c)。相反，CD44lo细胞对修复没有积极作用。值得指出的是，在CD44^LO治疗的动物中经常极少或没有观察到注射细胞，提示这些细胞在玻璃体中存活和/或迁移入视网膜中的能力下降。尚未知晓CD44^HI细胞是唯一有活性的骨髓亚群，还是具有该活性的其它亚群之一。

CD44^HI细胞表达提示骨髓来源的基因和标记。CD44^HI群的进一步表征通过大规模表达分析以及Lin^-以及祖细胞特异性标记的抗体标记后接流式细胞术来进行(图41和图44)。两种方法均揭示，CD44^HI细胞具有提示骨髓来源的表达模式。在蛋白质水平上观察到这些细胞上的CD11a、CD11b和Ly6G/C的强表达，同时通过流式细胞术检测到针对F4/80、CD14、cKit和CD115的强度较低的阳性标记。根据表达分析，与CD44lo细胞相比，包括CD204、CD114、CD33和CD115在内的几种骨髓特异性基因高度表达(图44)。相比之下，在蛋白质水平上，CD44^LO群具有显著的Ter119和CD45R B220表达，它们分别是成红细胞/红细胞和B细胞的标记。在表达阵列上，与含CD19、CD79a和CD22的CD44^HI细胞相比，与淋巴细胞相关的许多基因在CD44^LO中高度表达(图44)。因此，在转录水平和蛋白质水平上分析鉴别出活性CD44^HI群主要来源于骨髓，而无活性CD44^LO细胞主要是淋巴样细胞。

移植细胞的原位分析-分化的征据：在更清晰地定义了来自骨髓的活性细胞群之后，研究了这些细胞导入眼中之后的命运。为此，通过采用各种标记的免疫组织化学，分析了OIR模型的注射了CD44^HI的视网膜。绝大多数导入的细胞选择性地靶向视网膜血管系统，并呈现血管周定位，经常形成与宿主血管紧密缔合的延长结构(图42，图a)。使用抗CD31和NG2的抗体，在表达GFP的血管周骨髓细胞上未检测到这些标记，提示这些细胞没有分别分化为内皮细胞或周细胞。另外，移植的细胞看起来没有形成血管腔的任意部分(图42，图b)，因此表明这些细胞不能分化为内皮细胞。相反，巨噬细胞/小神经胶质细胞标记F4/80标记了CD44^HI治疗的眼中的许多但不是全部的血管周GFP⁺细胞(图43，图d-i)。这些导入的F4/80⁺细胞具有非常类似于也被F4/80标记的内源血管周细胞的外观(图43，图a-c)，提示移植的细胞表现出类似于OIR模型中的天然细胞的特性。

细胞治疗的其中一种可能优势是细胞响应于局部信号并在不断改变的环境中经历修饰的潜力，尤其在与常规药物治疗相比的情况下。观察到已经靶向视网膜血管系统并呈现血管周定位的P17(注射后10天)时的移植细胞将CD44下调至不可检测的水平(图43，图j-o)。但是，未与血管系统缔合的细胞保留CD44表达。因此，最初基于高CD44表达通过FACS选择的植入细胞亚群在体内下调该受体，而这与视网膜中的细胞定位相关。这提示，导入的细胞在眼环境中实际上确实经历了选择性改变(分化)。

以上详述的结果表明，细胞型治疗可用于治疗ROP和其它缺血性视网膜病。在小鼠模型中观察到的结果表明，该方法有效降低与高氧接触相关的血管病变，基本没有或没有显示出毒性。与单因子治疗相反，使用细胞治疗的优势可能在于细胞适应和响应于不断改变的环境的能力。由单因子治疗向药物和干预的组合、向复杂的可适应细胞的选择和传递的进展是一个令人激动的新理念，其中所述细胞在与宿主组织相互作用的同时可组织和进行一系列复杂的反应。在此方面，本发明在针对缺血性视网膜病/血管病的方法中提供“式样变更”，即不是强调抑制和消除，而是强调愈合和稳定。

本发明的分离的MLBM细胞群靶向视网膜血管系统，可用于传递血管生成抑制剂，在视网膜变性模型中具有血管营养性和神经营养性作用。在本研究中，分离的Lin^-MLBM细胞群的特异性亚群在加速OIR修复方面是高度有效的。令人感兴趣的是，所述活性细胞表达提示它们来源于骨髓的标记，可能在移植后经历分化和修饰。

心脏病学领域已率先使用细胞治疗促进血管化，目标在于使梗塞动脉侧支化(collateralizing)。大量证据表明，某些骨髓细胞有效提升灌注和心脏功能。但是，至今尚不明了哪种细胞类型负责所观察到的作用。研究骨髓源内皮祖细胞(EPC)的潜在作用的众多研究已断定，这些细胞存在于新血管或侧支血管(collateral vessel)中，但在这些研究的某一些当中报告的少量混入细胞使得对它们的重要性产生疑问。另外，含很少量干细胞和/或EPC的异源骨髓群，如单核细胞或未分级分离的细胞，也可显著增强侧支发育，提示除直接掺入血管之外有其它机制起作用。尽管无意囿于理论，但这些细胞有可能起支持性的副分泌作用，通过该作用，由它们分泌的因子优化宿主血管系统的环境。许多骨髓亚群已显示出为血管生成因子源，已知单核细胞分泌各种这样的因子。因此，存在骨髓细胞以副分泌方式起作用，补充EPC在侧支血管形成中的作用，并与宿主免疫系统相互作用的可能性。

尽管在该系统中精确起作用的机制至今尚不明了，但在理解功能性骨髓细胞的性质方面已得到有意义的进展。在鉴别出以本发明细胞提供的骨髓中活性髓样群的情况下，可作出一些有关机制的提议。髓样细胞，特别是单核细胞和巨噬细胞，已建立了通过分泌血管生成生长因子影响血管生长的能力。另外，巨噬细胞已表明比其它细胞类型更耐受低氧，通过分泌血管生成因子响应于低氧条件。因此，将髓样祖细胞导入缺血视网膜中可提供能够抵抗低氧条件并能够以副分泌方式促进血管修复的细胞。在OIR视网膜中存在宿主源的F4/80⁺血管周细胞提示，该类型的细胞在所述过程中起作用，通过直接移植入眼中传递大量相似细胞(或其祖先)可能放大了此作用。这种情况凸显了矛盾的观察结果：在本研究中观察到的，注射本发明的细胞群促进视网膜血管再生，同时抑制视网膜前新血管生成。尽管其基础至今尚未完全了解，但有可能是加速的“生理性”血管再生可降低视网膜所体验的低氧，使得缺血刺激的新血管丛没有形成至相同的程度。

髓样细胞支持血管生长的观点可能与涉及rd1和rd10小鼠视网膜变性模型的某些早期工作相关。注射的骨髓祖细胞可通过所分泌的因子维持深层视网膜血管系统，并防止在这些模型中观察到的血管变性。某些巨噬细胞分泌的血管生成因子如bFGF也已表现出神经营养性活性。因此，当将本发明的细胞群注射入rd小鼠中时所观察到的降低的光感受器死亡，可能通过副分泌机制介导，其中神经营养性因子由移植的骨髓源髓样细胞产生。作为对该机制的支持，本研究表明，本发明的分离的MLBM细胞群能够在rd模型中进行血管和神经元拯救，效力类似于注射分离的MLBM细胞时观察到的效力。

在ROP的临床治疗中，在高风险早产儿出生期间收集胎儿脐血细胞，然后分选细胞，以富集介导拯救作用的特异性亚群，这些自体祖细胞然后可注射入婴儿眼中。

应用细胞治疗的其中一个主要现时局限是在许多情况下作用的确切分子机制尚不明了的事实，实际上，这些机制可能在模型之间有差异。但是，这实际上可能是细胞型治疗的最大优势，即以不同方式和广泛的所有组成部分对不断改变的环境和信号应答的能力。这不仅在不同的实验系统和挑战之间如此，而且短暂地在一个系统中也是如此。换句话说，这样的细胞可在一个时间点分泌某些因子，而在另一个时间点分泌不同因子，最终如果对它们的需要减弱的话，则可一起停止作用。这是现时的化学型药物治疗不能做到的事情，并且基于细胞固有地使用反馈并对反馈应答的事实。在本研究中观察到的体内移植细胞的细胞标记的改变支持此观点。

实施例16.MLBM细胞分化为具有小神经胶质细胞特征的细胞

在注射CD44^HI细胞后对视网膜的分析表明，骨髓细胞的CD44^HI群在注射入眼中后分化为小神经胶质细胞。小神经胶质细胞是视网膜中驻留的髓样群，表达特征标记，包括CD11b和F4/80。这些细胞还可通过其分枝的形态学来分辨，呈现出血管周定位。已分析了注射入眼中后各个点的CD44hi细胞的定位、形态和表面标记表达。观察到注射的CD44^HI GFP⁺细胞展示出内源视网膜小神经胶质细胞的所有已描述的特征(图45)。图45中的图A和B表明，注射的CD44^HI细胞表达CD11b和F4/80，具有类似于内源性小神经胶质细胞的形态和血管周定位。图C提供了3D图象分析，表明注射的CD44^HI细胞定位在血管周区域中。图D显示了注射的CD44^HI细胞形态的高倍放大图象。

实施例17.通过负选择分离MLBM细胞

对于注射细胞的实验和临床应用而言，期望没有表面结合的选择剂，例如抗体和/或磁珠。实现此目标的一种方式是利用负选择策略分离CD44^HI细胞。通过表征本文描述的CD44^HI和CD44^LO细胞群的表面标记表达模式，已发现CD44^LO细胞展示出Ter119和CD45RB220高表达，Ter119和CD45RB220分别是类红细胞和B细胞的标记。抗这些标记的抗体连同加入的T细胞标记CD3e有效标记CD44^LO群，允许其经磁分离或FACS分离去除，留下“未触及的”CD44^HI细胞作为产物。使用该策略通过FACS分离的细胞显示出本发明MLBM细胞群的典型功能特征(图46)。

图46的图A表明，使用对CD45R/B220、TER119和CD3e选择性的抗体通过MACS对小鼠骨髓进行排除，产生超过90％为CD44^HI细胞的细胞群。图B表明，负性组分(CD44^HI群)基本上没有CD45R/B220、TER1119和CD3e细胞。图C表明，负选择的CD44^HI细胞保留了靶向视网膜和分化能力。

上述实施方案中的众多变化和修改可在不背离本发明新特征的精神和范围的情况下实施。就本文阐述的具体实施方案而言，无限制意图或不应推断为有限制作用。

Claims (36)

1.分离的髓样骨髓细胞群，所述细胞群包含大部分为谱系阴性的细胞，并表达CD44抗原和CD11b抗原这二者。

2.权利要求1的分离的髓样骨髓细胞群，其中所述细胞群通过一种方法来分离，所述方法包括：由哺乳动物分离骨髓，并由骨髓中正选择与抗体免疫反应的细胞，所述抗体选自抗CD44、抗CD11b及其组合。

3.权利要求1的分离的髓样骨髓细胞群，其中所述细胞为鼠细胞。

4.权利要求3的分离的髓样骨髓细胞群，其中所述细胞群基本上没有表达TER-119的细胞。

5.权利要求1的分离的髓样骨髓细胞群，其中所述细胞为人细胞。

6.制备权利要求1的分离的髓样骨髓细胞群的方法，所述方法包括由哺乳动物分离骨髓，并由骨髓中正选择与抗体免疫反应的细胞，所述抗体选自抗CD44、抗CD11b及其组合。

7.改善哺乳动物中的眼退化性疾病的方法，所述方法包括给罹患眼病的哺乳动物眼施用治疗有效量的细胞，所述细胞来自权利要求1的分离的髓样骨髓细胞群，所述细胞量在待施用细胞的眼的视网膜中足以延迟血管变性、神经元变性或这二者。

8.权利要求7的方法，其中所述细胞对待施用所述细胞的哺乳动物是自体的。

9.权利要求7的方法，其中所述哺乳动物为人。

10.权利要求7的方法，其中细胞通过眼内注射施用。

11.权利要求7的方法，其中所述疾病为视网膜变性疾病。

12.权利要求7的方法，其中所述疾病为缺血性视网膜病。

13.权利要求7的方法，其中所述疾病为血管出血。

14.权利要求7的方法，其中所述疾病为血管渗漏。

15.权利要求7的方法，其中所述疾病为脉络膜病。

16.权利要求7的方法，其中所述疾病为年龄相关性黄斑变性。

17.权利要求7的方法，其中所述疾病为糖尿病性视网膜病。

18.权利要求7的方法，其中所述疾病为拟眼组织胞浆菌病。

19.权利要求7的方法，其中所述哺乳动物为新生哺乳动物。

20.权利要求7的方法，其中所述疾病为早产儿视网膜病。

21.权利要求7的方法，其中所述疾病为镰状细胞贫血。

22.权利要求7的方法，其中所述疾病为色素性视网膜炎。

23.权利要求7的方法，其中所述细胞用操作性编码治疗上有用的肽的基因转染，然后将所述细胞施用于哺乳动物眼。

24.权利要求23的方法，其中所述治疗上有用的肽为抗血管生成肽。

25.权利要求23的方法，其中所述治疗上有用的肽为神经营养药。

26.权利要求25的方法，其中所述神经营养药选自：神经生长因子、神经营养蛋白-3、神经营养蛋白-4、神经营养蛋白-5、睫状神经营养因子、视网膜色素上皮衍生的神经营养因子、胰岛素样生长因子、神经胶质细胞系衍生的神经营养因子和脑衍生神经营养因子。

27.分离的、转染的髓样骨髓细胞群，所述细胞群包含大部分为谱系阴性并表达CD44抗原和CD11b抗原这二者的细胞，所述细胞用操作性编码治疗上有用的肽的基因转染。

28.权利要求27的分离的、转染的髓样骨髓细胞群，其中所述治疗上有用的肽为抗血管生成肽。

29.权利要求27的分离的、转染的髓样骨髓细胞群，其中所述治疗上有用的肽为神经营养药。

30.权利要求29的分离的、转染的髓样骨髓细胞群，其中所述神经营养药选自：神经生长因子、神经营养蛋白-3、神经营养蛋白-4、神经营养蛋白-5、睫状神经营养因子、视网膜色素上皮衍生的神经营养因子、胰岛素样生长因子、神经胶质细胞系衍生的神经营养因子和脑衍生神经营养因子。

31.权利要求27的分离的、转染的髓样骨髓细胞群，其中所述细胞为人细胞。

32.权利要求1的分离的髓样骨髓细胞群，其中在所述群中至少约75％的细胞表达CD44。

33.权利要求1的分离的髓样骨髓细胞群，其中在所述群中至少约90％的细胞表达CD44。

34.通过负细胞标记选择由骨髓分离髓样骨髓细胞群的方法，所述方法包括：使多种骨髓细胞与对Ter119、CD45RB220和CD3e特异性的抗体接触；由多种骨髓细胞中除去与多种骨髓细胞中的Ter119、CD45RB220和CD3e抗体免疫反应的细胞；以及回收表达Ter119、CD45RB220和CD3e的细胞被去除的髓样骨髓细胞；其中大部分回收细胞表达CD44。

35.髓样骨髓细胞群，所述细胞群通过权利要求34的方法制备。

36.权利要求35的髓样骨髓细胞群，其中在所述群中超过90％的细胞表达CD44。

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