KR20160016874A - 안질환 및 장애의 치료를 위한 인간 단핵구 하위집단 - Google Patents
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Abstract
CD3+ 세포, CD19+ 세포, CD56+ 세포 및 선택적으로 CD16+ 세포의 양이 상대적으로 적거나 또는 실질적으로 없는 단핵구 하위집단이 제공되되, 단핵구 하위집단은 망막 또는 시신경에서 신경 변성의 저해, 글루타민산염 독성으로부터 뉴런의 보호 또는 신경 재생의 촉진에서 사용을 위한 것이며, 망막 또는 시신경은 눈의 염증성 질환, 장애 또는 병태에 의해 또는 눈의 질환, 장애 또는 병태의 치료를 위해 손상된다.
Description
본 발명은 일반적으로 염증 성분이 있는 또는 염증 성분이 없는 망막 및 시신경 변성의 치료에서 그리고 눈의 염증성 질환, 장애 또는 병태의 치료에서 유용한 인간 단핵구 하위집단(monocyte sub-population)에 관한 것이다.
중추신경계(central nervous system: CNS) 조직에 대한 초기 손상 후 신경세포사는 항상성이 빠르게 회복되지 않는 한, 손상의 확산을 야기하는 신경독성의 악순환을 야기한다(Doble, 1999). 유발된 보호 및 회복 메커니즘이 불충분한 경우에, CNS의 부분인 망막 및 시신경의 신경세포를 비롯한 주요 손상 원인 및 그들의 병인과 상관없이 다수의 CNS 병리에 관련 있는 현상인 뉴런의 추가적인 사멸이 일어난다. 항상성으로부터의 모든 편향(deviation)에서, 체류 면역 세포가 활성화된다. CNS에서 이러한 면역 세포는 체류 미세아교세포이다. 이들 세포가 충분히 활성화되지 않거나 혹은 활성화되지만 제때에 분해되지 않는다면, 그들은 병리의 주요 원인은 아니지만 그의 진행의 부분일 수 있는 국소 염증의 악순환으로 들어갈 수 있다. 제때에 저지되지 않은 면역 활성의 불충분한 국소 면역 활성을 중단하는 것은 새로 동원되고(recruited) 국소로 양성되어 염증-분해 세포가 될 수 있는 염증-분해 세포인 순환 단핵구의 도움을 필요로 한다. 이하에서 본 발명자들은 면역 세포가 연루된 안질환을 요약할 것이다.
연령관련 황반변성(AMD)은 선명한 시야가 얻어지는 망막 내 영역인 눈의 황반 영역에 영향을 미치는 질환이며, 망막 아래 망막 색소 표층의 위축 및 광수용체(간상세포와 원추세포)의 손실에 의해 나타난다. 약 10%의 AMD 환자는 비정상적 혈관 성장에 기인하는 망막 중심부의 퇴화에 의해 야기되는 신생혈관 또는 삼출성 황반변성으로 고통받고 있다. 다양한 세포 과정은 염증, 산화적 스트레스, 변용된 콜레스테롤 대사 및/또는 망막 색소 상피의 손상된 기능을 포함하여 AMD 발병에 연루되었다. 망막 내의 비정상적 혈관 증식은 혈관 내피 성장인자(vascular endothelial growth factor: VEGF)에 의해 자극된다.
포도막염은 류마티스 관절염 또는 강직성 척추염, 감염 또는 독소에 대한 노출과 같은 자가면역 장애에 의해 야기되는 것으로 생각된다. 그러나, 다수의 경우에, 원인은 알려져 있지 않다. 가장 흔한 형태의 포도막염은 눈의 앞 부분에서의 염증을 수반하는 전방 포도막염이다. 염증은 자가면역 질환과 관련될 수 있지만, 대부분의 사례는 건강한 사람에서 일어난다. 후방 포도막염은 눈의 맥락막 및 신경 망막에 영향을 미치는 잠재적으로 실명의 안염증 병태이다. 몇몇 연구가 분해 단계에서 대식세포의 존재를 마찬가지로 나타내었지만, 다수의 연구는 주로 질환의 유도 및 효과 단계와 관련하여 실험적 자가면역 포도막염(experimental autoimmune uveitis: EAU), 인간 후방 포도막염에 대한 모델에서 중요한 참가자로서 대식세포를 동정하였다. 그러나, 대부분의 이들 연구에서, 체류 미세아교세포와 침윤성 대식세포 사이의 기능적 차이는 없었다. 추가로, 생체내 질환의 상이한 단계에서 단핵구 유래 대식세포의 별도의 서브세트의 특징과 그들의 기능은 아직 보고되지 않았다.
망막 이영양증의 형태인 망막색소변성증 ( Retinitis pigmentosa : RP)은 중심시(central vision) 상실을 야기할 수 있는 주변시 상실 및 야간 시력 곤란함(야맹증)을 특징으로 하는 유전 장애의 군이다. RP는 진행성 시력 상실을 야기하는 망막의 광수용체(간상세포와 원추세포) 또는 망막 색소 상피(RPE)의 기형에 의해 야기된다. RP에서 지속된 만성 염증 반응의 임상 증거는 염증이 RP 발병의 기저를 이룰 수 있다는 것을 시사하는 것으로 나타났다(Yoshida et al., 2013).
당뇨망막병증은 당뇨병의 합병증에 의해 야기되는 망막증인데, 종국적으로 실명을 야기할 수 있다. 당뇨병은 망막에서 다수의 대사 및 생리적 이상을 야기하지만, 이들 이상 중 어떤 것이 당뇨망막병증(DR)의 인식된 특징에 기여하는지는 덜 분명하다. 당뇨병에서 망막 내에서 진행되는 것으로 발견된 다수의 분자 및 생리적 이상은 염증과 일치된다. 게다가, 다수의 항염증 치료는 동물 모델에서 상이한 DR 양태의 발생을 상당히 저해하는 것이 발견되었다(Tang et al., 2011).
녹내장은 노인 집단(대략 1%)에서 고발생률을 지니는 서서히 진행하는 시각 신경병증이다. 최근까지, 이는 높은 안압(intraocular pressure: IOP)과 관련되었으며, 따라서 시도들은 항고혈압제 약물에 의해 질환 진행을 늦추는 것에 중점을 두었다. 수년 간, 녹내장은 질환의 패밀리이며, 반드시 압력과 관련되지 않는다는 것이 명확해졌다. 게다가, 질환이 압력과 관련될 때조차, 안압은 정상으로 그리고 심지어 정상값 미만으로 감소될 수 있고, 변성이 계속될 수 있다는 것이 명확해졌다. 임상의 사이에 진행 중인 논의는, 정상 IOP 값에도 불구하고 녹내장 환자에서 지속적인 변성이 압력 이외의 추가적인 위험 인자 존재의 반영 또는 남아있는 뉴런 및 섬유의 증가된 취약성의 반영인지의 여부 그리고 따라서 정상값 미만으로 IOP를 감소시킬 필요가 있는지의 여부에 의문을 가졌다. 녹내장은 시력 상실까지 시야의 진행성 상실을 야기하는 특히 망막 신경절 세포(RGC)의 신경퇴화를 초래한다.
병인. 성인 CNS에서 급성 및/또는 만성 신경 상실은 상실된 뉴런을 증식하고 보상하기 위한 성숙 신경 세포의 매우 불량한 능력에 기인하는 비가역적 상실을 초래한다. 따라서, 신경 상실을 약화 또는 감소시키는 것은 기능의 보존에 필수적이다. 대부분의 신경퇴행성 질환에서, 병인은 명확하지 않은데, 그들은 불치성이다. 그럼에도 불구하고, 일부 1차 및 2차 위험 인자가 있는데, 이는 총괄적으로 신경보호 요법으로서 칭해지는 신경 상실 진행의 저해 또는 약화 시 목적으로 하는 치료적 개입에 대한 표적이다. 일부 위험 인자는 질환 특이적이지만, 자극적 아미노산, 유리 라디칼 및 일산화질소와 같은 나머지는 모든 신경퇴행성 장애에 공통된다. 이들 인자는 건강한 CNS에서 필수적 자기 성분이지만, 퇴행성 조직 내에서 과량으로 축적되며, 그들은 세포독성이 되어서 뉴런사멸의 초기 원인 이후의 손상의 퍼짐을 야기한다.
글루타민산염은 급성 및 만성 퇴행성 장애에서 가장 흔한 독성의 매개자 중 하나이다(Pitt et al., 2000). 글루타민산염은 인간 CNS에서 일차성 흥분성 신경전달물질이다. L-글루타민산염은 대다수의 시냅스에 존재하며, 이중 활성을 나타낼 수 있다: 이는 필수적 신경전달물질로서 정상 기능에서 중추적 역할을 하지만, 그의 생리학적 수준이 초과될 때 독성이 된다.
현재 질환 관리. 현재 신경퇴행성 질환에 대한 치료는 없으며, 치료는 증상을 완화시키거나 관리하는 것에 중점을 둔다. 신경보호 요법은 지금까지 수행한 대부분의 임상 연구에서 효능을 나타내지 못하였다. AMD에 관해, 항신생혈관 또는 항-VEGF 작용제는 비정상 혈관의 퇴행을 야기하고, 눈의 유리액 내로 직접 주사될 때 시야를 개선시킬 수 있다.
재생 의료 및 보호 자가면역. 재생의료는 이전으로 회복할 수 없는 기관을 조직 공학처리, 생체재료 및 세포요법을 포함하는 그 자체의 치유로 자극함으로써 손상된 조직 및 기관을 수선, 대체 및/또는 재생하는 것을 목적으로 하는 새로운 연구분야이다. 말초 조직에서 통상적인 치유 과정인 세포재생은 그것이 CNS의 나머지에 있기 때문에 성인 신경 망막으로 제한되지 않는다. 그러나, 망막 전구세포(RPC)의 무활동(quiescent) 집단은 성인기 내내 망막 모양체(ciliary body: CB) 내에 계속해서 존재하며, 망막의 다양한 세포로 분화되거나 또는 가능하게는 면역조절제 또는 신경영양제의 공급원으로서 작용할 가능성을 가진다. 이 휴면기 전구세포 틈새는 근본적인 메커니즘이 아직 드러나지는 않았지만, 망막 손상 후에 자극되는 것으로 보고되었다. 손상에 반응하여 작용하는 치유 과정 및 그들을 향상시키기 위한 발견 방법을 해결하는 것은 이 분야의 연구 목표 중에서 신경보호 및 세포 재생을 촉진시키기 위한 새로운 요법의 개발을 야기하였다.
CNS 외에, 치유 과정은 사멸 세포 및 세포 파편의 클리어런스를 위해 그리고 재성장 및 세포 재생의 지지를 위해 면역계의 도움을 필요로 한다. 이들 과정은 치유 시간 과정을 거쳐서 별개의 표현형을 획득하는 대식세포의 상이한 서브세트에 의해 부분적으로 매개된다. 임의의 발작에 대한 반응 과정에서, 전반적인 항염증 환경에 기여하고 재생에 필요한 성장 인자를 생성하는 단핵구-유래 대식세포를 수반하는 국소 면역 반응 종결의 중심 단계가 있다.
병변 부위 내로의 말초 혈액의 침윤/동원은 병변 부위로부터 유발된 신호에 의해 제어되는데, 이는 뇌척수액(cerebrospinal fluid: CSF) 장벽에 영향을 미친다. CNS 손상 후에 제한된 자발적 회복은 병변 부위에 대한 단핵구의 효과적인 서브세트의 부적절하고, 시기 상조이며, 자발적인 동원에 부분적으로 기인할 수 있다. 상기 고려사항은 본 발명자들을 신체의 전문적 치유 시스템인 면역계를 사용하는 신규한 생리학적 접근에 따르게 하여 신경보호 및 회복을 야기하는 CNS 손상의 결과와 맞서게 한다.
피부 단편과 함께 인큐베이션시킨 혈액 유래 단핵구는 문헌에 기재된 항염증 M2 단핵구와 유사한 비염증 표현형을 획득한 것이 본 발명자들의 연구에서 나타났다. 손상된 척수 내로의 단핵구의 주입은 래트에서 척수 손상(SCI)으로부터 더 양호한 회수를 유도하였다(미국 특허 제5,800,812호; 미국 특허 제6,117,424호; 및 미국 특허 제6,267,955호). 이 접근은 유망한 결과를 나타내는 급성 중증 척수 손상으로 고통받는 환자에 대한 임상 연구에서 시험되었다(WO 03/044037; Knoller et al., 2005). 본 발명자들은 또한 골수 유래 CD115+ 세포를 지니는 말초혈액 단핵 풀의 풍부화가 마우스에서 SCI 후에 기능 회복을 증가시켰음을 나타내었다(Shechter et al., 2009).
혈액 단핵구는 상이한 특징 및 활성을 지니는 이종성 세포 집단이다. 치료 목적을 위해 혈액 단핵구를 이용하는 것은 해로운 기능과 유리한 기능을 지니는 세포의 동정을 필요로 한다.
인간에서, 단핵구 상의 CD16의 발현은 3가지 서브세트, 즉, CD14++CD16-(고전적), CD14++CD16++(중간) 및 CD14dimCD16++(비고전적) 단핵구 간을 구별할 수 있지만, 생리학적 및 병리학적 병태에서 그들의 역할은 완전히 이해되지 않는 것이 제안되었다. 최근에, 본 발명자들은 척수 손상 후에 동물의 CSF 내로 주사 시 CD16+ 풍부화된 단핵구가 총 단핵구 하위 집단을 받은 동물에 비해 자발적 회수를 약화시킨다는 것을 발견하였다. 또한 CD16 발현 세포(CD16-)가 없는 단핵구 하위집단은 척수 손상 후 회복에 유리하다는 것을 발견하였다(PCT/IL2012/050522).
본 개시내용은 일반적으로, 부분적으로 망막 또는 시신경에서 신경 변성의 저해, 글루타민산염 독성으로부터 뉴런의 보호 또는 신경 재생의 촉진에서 사용을 위한 CD3+ 세포, CD19+ 세포 및 CD56+ 세포의 양이 상대적으로 적거나 또는 실질적으로 없는 말초혈액 단핵세포(peripheral blood mononuclear cell: PBMC)의 단핵구 하위집단, 또는 CD3+ 세포, CD19+ 세포, CD56+ 세포 및 CD16+의 양이 상대적으로 적거나 또는 실질적으로 없는 PBMC의 단핵구 하위집단에 관한 것이되, 망막 또는 시신경은 눈의 질환, 장애 또는 병태에 의해 손상된다.
또한 눈의 염증 질환, 장애 또는 병태의 치료에서 사용을 위한 CD3+ 세포, CD19+ 세포 및 CD56+ 세포의 양이 상대적으로 적거나 또는 실질적으로 없는 PBMC의 단핵구 하위집단, 또는 CD3+ 세포, CD19+ 세포, CD56+ 세포 및 CD16+의 양이 상대적으로 적거나 또는 실질적으로 없는 PBMC의 단핵구 하위집단이 본 명세서에 제공된다.
추가로 본 명세서에서 망막 또는 시신경에서 신경 재생의 글루타민산염 독성 또는 촉진으로부터 신경 변성의 저해, 신경의 보호를 위해 CD3+ 세포, CD19+ 세포 및 CD56+ 세포의 양이 상대적으로 적거나 또는 실질적으로 없는 PBMC의 단핵구 하위집단, 또는 CD3+ 세포, CD19+ 세포, CD56+ 세포 및 CD16+의 양이 상대적으로 적거나 또는 실질적으로 없는 PBMC의 단핵구 하위집단을 포함하는 조성물이 본 명세서에서 제공되되, 망막 또는 시신경은 눈의 질환, 장애 또는 병태에 의해 손상된다.
본 개시내용은 또한 일반적으로 눈의 염증성 질환, 장애 또는 병태의 치료에서 사용을 위한 CD3+ 세포, CD19+ 세포 및 CD56+ 세포의 양이 상대적으로 적거나 또는 실질적으로 없는 PBMC의 단핵구 하위집단 또는 CD3+ 세포, CD19+ 세포, CD56+ 세포 및 CD16+의 양이 상대적으로 적거나 또는 실질적으로 없는 PBMC의 단핵구 하위집단을 포함하는 조성물에 관한 것이다.
본 명세서에서 망막 또는 시신경에서 신경 변성의 저해, 글루타민산염 독성으로부터 뉴런의 보호 또는 신경 재생의 촉진을 위한 방법이 추가로 제공되되, 망막 또는 시신경은 눈의 질환, 장애 또는 병태에 의해 손상되고, 상기 방법은 신경 변성의 저해, 글루타민산염 독성으로부터 뉴런의 보호 또는 신경 재생의 촉진이 필요한 개체에게 유효량의, CD3+ 세포, CD19+ 세포 및 CD56+ 세포의 양이 상대적으로 적거나 또는 실질적으로 없는 PBMC의 단핵구 하위집단 또는 CD3+ 세포, CD19+ 세포, CD56+ 세포 및 CD16+ 세포의 양이 상대적으로 적거나 또는 실질적으로 없는 PBMC의 단핵구 하위집단을 투여하는 단계를 포함한다.
본 개시내용은 또한 일반적으로 치료가 필요한 개체에게 유효량의, CD3+ 세포, CD19+ 세포 및 CD56+ 세포의 양이 상대적으로 적거나 또는 실질적으로 없는 PBMC의 단핵구 하위집단 또는 CD3+ 세포, CD19+ 세포, CD56+ 세포 및 CD16+ 세포의 양이 상대적으로 적거나 또는 실질적으로 없는 PBMC의 단핵구 하위집단을 투여하는 단계를 포함하는, 눈의 염증성 질환, 장애 또는 병태의 치료방법에 관한 것이다.
도 1a 내지 도 1e는 글루타민산염 중독 후에 유리체에 대한 상승적 단핵구 주사가 신경보호적이라는 것을 도시한 도면. 망막 신경절 세포(Retinal Ganglion Cell: RGC)는 글루타민산염 중독 7일 후에 비손상, 손상 및 단핵구 처리된 망막의 절편에서 정량화되었다. 사례 당 4개 절편에서 Brn3a+ RGC의 정량화를 계수(a)로서 또는 비손상 망막에 대한 생존 백분율(b)로서 제시하였다. (c 내지 e) 비손상 마우스(c), 및 손상된 마우스(d 내지 e)(PBS로 유리체내 주사됨(d), 또는 RGC 마커인 Brn3a(적색; 기준자 100㎛)로 표지된 마우스 단핵구로 유리체내 주사됨(e))의 망막 내 RGC의 대표적인 현미경 사진. Brn3a+ RGC에 대한 화살표 지점. PBS 처리군에서 알 수 있는 바와 같은 손상 후 RGC의 손실, 및 단핵구(마우스 단핵구) 처리 망막에서 RGC의 검약(sparing)을 주목함. 도면 전체적으로 막대 그래프는 각각의 군의 평균 ± SE를 나타낸다. *, P < 0.05; **, P < 0.01. GT - 글루타민산염; 단핵구 - 단핵구; RGC - 망막 신경절 세포.
도 2a 내지 도 2h는 유리체내 주사된 마우스 단핵구의 국소화 및 특징을 도시하는 현미경 사진을 도시한 도면. 주사된 마우스 단핵구(CX3CR1-GFP, 녹색)에 의한 다수의 사이토카인 및 신경영양 인자의 발현(적색)을 나타내는 글루타민산염 중독 후 제7일에 망막의 대표적인 현미경 사진을 도시한 도면. (a) TGFβ; (b) IL-10; (c) CD38; (d) IGF-1; (e) BDNF; (f) Arg-1(알기나제-1); (g) TNF-α; (h) IL-1β. 세포의 비특이적 염색을 호크스트 염색(Hoechst stain)(청색)으로 행하였다. 유리체 내에서 그리고 주사한 RGC에 근접해서뿐만 아니라 망막하 공간에서 주사한 세포를 발견하였다. 화살표는 이중 표지 세포를 나타내고; 삽도는 더 고배율의 대표적인 세포를 나타낸다(기준자 50_m; 삽도 척도 10_m). GCL - 신경절 세포층; SRS - 망막하 공간; vit - 유리체.
도 3a 내지 도 3c는 보호적 CNS-기반 자가면역 백신화가 시신경 압좌(optic nerve crush: ONC) 후에 망막 내 면역 반응을 증가시킨다는 것을 도시한 도면. ONC 후 7일에 키메라 마우스의 망막 내에서 총 백혈구(CD45+; a), 침윤성 단핵구-유래 대식세포(CD11b+GFP+; b) 및 T 세포(TCRβ+; c)의 정량화. ONC 1주 전에 마우스의 하나의 그룹을 MOG-유래 변용 펩타이드(제45일)로 백신접종하였다. 백신접종군으로부터의 대측성 망막을 비손상 대조군으로서 사용하였다. 그래프는 각각의 군의 평균 ± SE를 나타낸다. *, P < 0.05; **, P < 0.01; P < 0.001.
도 2a 내지 도 2h는 유리체내 주사된 마우스 단핵구의 국소화 및 특징을 도시하는 현미경 사진을 도시한 도면. 주사된 마우스 단핵구(CX3CR1-GFP, 녹색)에 의한 다수의 사이토카인 및 신경영양 인자의 발현(적색)을 나타내는 글루타민산염 중독 후 제7일에 망막의 대표적인 현미경 사진을 도시한 도면. (a) TGFβ; (b) IL-10; (c) CD38; (d) IGF-1; (e) BDNF; (f) Arg-1(알기나제-1); (g) TNF-α; (h) IL-1β. 세포의 비특이적 염색을 호크스트 염색(Hoechst stain)(청색)으로 행하였다. 유리체 내에서 그리고 주사한 RGC에 근접해서뿐만 아니라 망막하 공간에서 주사한 세포를 발견하였다. 화살표는 이중 표지 세포를 나타내고; 삽도는 더 고배율의 대표적인 세포를 나타낸다(기준자 50_m; 삽도 척도 10_m). GCL - 신경절 세포층; SRS - 망막하 공간; vit - 유리체.
도 3a 내지 도 3c는 보호적 CNS-기반 자가면역 백신화가 시신경 압좌(optic nerve crush: ONC) 후에 망막 내 면역 반응을 증가시킨다는 것을 도시한 도면. ONC 후 7일에 키메라 마우스의 망막 내에서 총 백혈구(CD45+; a), 침윤성 단핵구-유래 대식세포(CD11b+GFP+; b) 및 T 세포(TCRβ+; c)의 정량화. ONC 1주 전에 마우스의 하나의 그룹을 MOG-유래 변용 펩타이드(제45일)로 백신접종하였다. 백신접종군으로부터의 대측성 망막을 비손상 대조군으로서 사용하였다. 그래프는 각각의 군의 평균 ± SE를 나타낸다. *, P < 0.05; **, P < 0.01; P < 0.001.
본 발명자들은 글루타민산염 눈 중독 후에, 단핵구-유래 대식세포가 마우스의 손상된 망막을 침윤한다는 것을 앞서 보고하였다. 이런 침윤의 저해는 모양체에서 감소된 생존의 망막 신경절 세포(RGC) 및 감소된 수의 증식성 망막 전구세포(RPC)를 초래한다. 순환 단핵구 풀의 향상은 증가된 RGC 생존 및 RPC 재생을 야기한다. 단핵구-유래 대식세포의 침윤은 항염증에 대해 손상된 망막의 환경을 왜곡시키며, 다른 면역 세포의 축적을 하향조절함으로써, 국소 염증을 해결하고 조직 손상을 향상시킨다(문헌[London et al., 2011], 본 명세서에 완전히 개시된 바와 같이 참고로 포함됨). 생리학적 수준을 초과하는 수준에서 글루타민산염은 1차 위험 인자와 관계없이 자기-영속적(self-perpetuating) 변성 과정에 기여하는 초기 인자 중 하나이다.
본 발명자들은 또한 CD3, CD19, CD56 및 선택적으로 CD16을 발현시키는 세포 수가 없거나, 거의 없거나 또는 상대적으로 낮음에 의해 정해지는 혈액 유래 인간 단핵구의 하위 집단이 뇌척수액(CSF)으로부터 척수 내 손상 부위로 귀소할 수 있고, 거기서 조직 회복을 촉진시키며, 기능적 회복을 개선시킨다는 것을 발견하였다(PCT/IL2012/050522). 추가로 손상된 척수를 치료함에 있어서 세포의 유리한 효과가 투여된 피부 조직과의 공동발현에 의해 활성화된 세포에 의해 병변의 경계에서 척수 내로, 또는 비활성화된 세포를 손상된 척수의 CSF 내로 투여함으로써 얻어진다는 것이 본 발명자들에 의해 최근에 발견되었다.
이제 본 발명에 따르면 마우스 CD115+ 골수 단핵구 세포의 유리체내 주사는 글루타민산염 중독 후에 마우스 망막 생존에 대해 보호 효과를 가진다는 것이 발견되었다(실시예 4).
세포 표면 상에서 발현하는 특정 동정 가능한 마커, 예컨대 분화 클러스터(Cluster of Differentiation: CD) 분자 X는 본 명세서에서 CD X+로서 지칭된다. 예를 들어, 세포 표면 상에서 발현하는 CD3 분자는 본 명세서에서 CD3+으로서 지칭된다. 세포 표면 상에서 발현되는 CD 분자의 상대적 양은 다량의 CD 분자에 대해 "+"를 더함으로써, 예를 들어, CD3++으로 지칭되거나 또는 용어 "dim"은 상대적으로 저수준의 CD 분자를 나타낸다. 특정 CD의 발현에 의해 정해지는 세포 유형을 포함하는 세포 집단, 이들 세포에 의해 상대적으로 풍부하게 되는 집단 또는 이러한 세포가 없는 집단은 각각 CD+, CD++ 또는 CD-를 지정한다.
따라서, 실시형태에서, PBMC의 인간 단핵구 하위집단은 CD3+ 세포, CD19+ 세포 및 CD56+ 세포의 양이 상대적으로 적거나 실질적으로 없다. 예를 들어, 본 발명의 PBMC는 CD3+ 세포의 양이 상대적으로 적거나, CD19+ 세포 및 CD56+ 세포가 실질적으로 없다.
일 실시형태에서, 또한 CD16+ 세포는 추가로 CD16+ 세포가 실질적으로 없는 PBMC의 단핵구 하위집단, 즉, CD3+ 세포, CD19+ 세포, CD56+ 세포 및 CD16+ 세포의 양이 상대적으로 적거나 또는 실질적으로 없는 단핵구 하위집단을 초래하는 PBMC 하위 집단으로부터 제거되었다. 예를 들어, 본 발명의 PBMC는 CD3+ 세포의 양이 상대적으로 적고 CD19+ 세포, CD56+ 세포 및 CD16+ 세포가 실질적으로 없을 수 있다.
비인간 동물에서 그리고 인간에서 다양한 단핵구 하위 집단 간에 분화를 위해 사용된 전형적인 항원은 상이하며, 따라서 특정 마우스 세포 집단은 인간에서 대응하는 세포 집단을 동정하기 위해 사용된 마커와 상이한 마커를 이용하여 동정될 수 있다. 예를 들어, 본 명세서에서 이하의 실시예 4에서 사용하는 마우스 CD115+ 단핵구는 2개의 하위 집단; GR1+ 및 GR1-로 분화되는 반면, 인간에서 대응하는 단핵구 집단은 막 마커 CD14 및 CD16의 그들의 발현에 기반하여 정한 3개의 하위 집단으로 나뉘어진다(Geissman et al. (2008) Blood monocytes: distinct subsets, how they relate to dendritic cells, and their possible roles in the regulation of T-cell responses. Immunology and Cell Biology (2008) 86, 398-408).
본 명세서에서 사용되는 용어 "말초혈액 단핵 세포(PBMC)"는 림프구, 단핵구 또는 대식세포와 같이 둥근 핵을 갖는 임의의 혈액 세포를 지칭한다. 혈액으로부터 PBMC를 단리시키는 방법은 당업자에게 용이하게 명확하다. 비제한적 실시예는 혈장층 하에서 연층을 형성하는 단핵구 및 림프구에 의한 또는 백혈구 성분 채집, 즉, 적혈구 및 백혈구 부족 혈장의 공여체로의 복귀에 의한 백혈구 농축물의 제조에 의해 혈액층을 분리시키는 친수성 다당류인 피콜(ficoll)을 이용하는 전혈로부터의 이들 세포의 추출이다.
어구 "[특정 세포]...가 실질적으로 없는 세포의 집단"은 본 명세서에서 어구 "거의 없는"과 상호호환적으로 사용되며, 바람직하게는 특정 세포 유형이 없거나, 또는 대안적으로 상기 세포 집단에서 세포 총 수의 약 0.05%, 0.1%, 0.5%, 1%, 2%, 3%, 4% 또는 5%를 초과하지 않는 특정 세포 유형의 상대적 양을 포함하는, 세포 집단을 포함한다. 어구 "[특정 세포]....가 상대적으로 적은 세포의 집단"은 새로 단리되고 비가공된 인간 PBMC 집단에서 동일산 종류의 세포의 상대적 양에 비해 세포의 양이 상대적으로 적지만, 이 세포 집단이 "실질적으로 없는" 집단보다 더 다량으로 존재하는 세포의 집단을 지칭한다.
따라서, 실시형태에서, CD19+ 세포 및 CD56+ 세포 중 각각의 하나의 상대적 양은 PBMC 집단에서 총 세포 수의 약 0.05%, 0.1%, 0.5%, 1%, 2%, 3%, 4% 또는 5%를 초과하지 않는다. 특정 실시형태에서, CD3+ 세포, CD19+ 세포, CD56+ 세포 및 CD16+ 세포가 실질적으로 없는 단핵구 하위집단에서 CD16+ 세포의 상대적 양은 세포 총 수의 약 0.05%, 0.1%, 0.5%, 1%, 2%, 3%, 4% 또는 5%를 초과하지 않는다.
정상 인간 PBMC 세포 집단은 "CD3+ 세포의 양이 상대적으로 낮은 세포의 집단"에 적용되는 특히 70% 초과의 CD3+ 세포 및 약 10 내지 15% 단핵구를 포함하며, CD3+ 세포의 상대적 양은 PBMC 집단 내 총 세포 수의 70% 초과로부터 약 10%, 15%, 20% 또는 25%까지 감소된다. 그러나, 개선된 세포 분리 방법에 의해 본 발명의 PBMC 집단은 CD3+ 세포가 거의 없게 될 것이고, 즉, 그들의 상대적 양은 PBMC 집단에서 총 세포 수의 0.05%, 0.1%, 0.5%, 1%, 2%, 3%, 4% 또는 5%가 된다는 것을 상상할 수 있다.
실시형태에서, CD3+ 세포, CD19+ 세포 및 CD56+의 양이 상대적으로 적거나 또는 실질적으로 없고, 선택적으로 또한 CD16+ 세포가 실질적으로 없는 단핵구 하위집단은 CD14+ 세포에서 실질적으로 풍부하다.
어구 "에서 실질적으로 풍부한 세포의 집단"은 상기 세포 집단 내 총 세포 수의 약 60%, 70%, 80%, 90%, 95% 또는 99%를 초과하는 특정 세포 유형의 상대적 양을 포함하는 세포 집단을 지칭한다.
실시형태에서, CD3+ 세포, CD19+ 세포 및 CD56+ 세포의 양이 상대적으로 적거나 또는 실질적으로 없는 PBMC의 단핵구 하위집단은 적어도 약 60% CD14+ 세포를 포함하고, CD3+ 세포, CD19+ 세포, CD56+ 세포 및 CD16+ 세포가 실질적으로 없는 단핵구 하위집단은 적어도 약 80% CD14+ 세포를 포함한다. 따라서, 본 명세서에 정의된 바와 같은 단핵구 하위집단은 또한 본 명세서에서 CD14++, CD16- 집단으로 지칭된다.
일부 실시형태에서, 본 발명의 단핵구 하위집단은 망막 또는 시신경에서 신경 변성의 저해, 글루타민산염 독성으로부터 뉴런의 보호 또는 신경 재생의 촉진에 유용하되, 망막 또는 시신경은 눈의 질환, 장애 또는 병태에 의해 손상된다.
예를 들어, 일 실시형태에서, 눈에서 신경 변성을 야기하고 글루타민산염 독성에 의해 악화되는 질환, 장애 또는 병태는 연령관련 황반변성 또는 망막색소변성증; 전방 허혈성 시신경병증; 녹내장 또는 포도막염으로부터 선택되는 망막 변성 장애로부터 선택된다. 이들 질환은 신경 조직에 대한 손상을 야기하며, 특정 실시형태에서, 본 발명의 단핵구 하위집단의 투여는 신경 재생을 촉진한다. 본 발명은 또한 전신 질환, 예컨대 당뇨병 또는 고혈압의 결과로서 만성 또는 급성 망막증, 방사선 망막증 및 태양광 망막증의 치료를 상정한다.
급성 발작, 노화, 독소, 대사 이상, 변용된 혈관 관류 또는 퇴행성 유전자 병태에 대해 2차성인 망막 항상성의 변용은 눈에서 다양한 염증 캐스케이드를 개시할 수 있다. 모든 이들 상황에서, 연장되고, 하향조절된 면역 반응은 그 자체가 병원성일 수 있으며, 망막 질환의 발병뿐만 아니라 시력 위협적 합병증 둘 다에 기여할 수 있다. 혈액 유래 단핵구는 염증을 해결하고 항상성을 회복하는 작용을 하기 때문에, 조직 그 자체가 치유되게 하며, 본 발명은 추가로 눈에서 신경퇴행을 필수적으로 야기하지 않는 눈의 염증성 질환의 치료에 관한 것이다. 일부 실시형태에서, 본 발명에서 사용되는 단핵구 하위집단은 눈의 염증성 질환, 예컨대 공막염(공막의 염증); 각막염(각막의 염증); 각막 궤양(눈 각막의 표면 표층의 상실); 설맹(밝은 빛에 대해 보호되지 않은 눈의 노출에 의해 야기되는 통증성 병태); 티제슨의 표재성 각막증(Thygeson's superficial punctate keratopathy); 각막 신생혈관화; 후치스 근이영양증(Fuchs' dystrophy)(흐릿한 아침 시야); 원추각막(각막 두께 및 형상의 변화); 건성각결막염(건성안); 또는 홍채염(홍채의 염증)을 치료하는데 효과적일 것이다. 특정 실시형태에서, PBMC는 망막 또는 시신경에서 신경 변성의 저해, 글루타민산염 독성으로부터 뉴런의 보호 또는 신경 재생의 촉진에 유용하되, 망막 또는 시신경은 눈의 염증성 질환, 장애 또는 병태에 의해 손상된다.
일 실시형태에서, 본 발명의 양태 중 임의의 하나에서 사용되는 PBMC의 단핵구 하위집단은 인간 PBMC를 포함한다.
인간 PBMC의 단핵구 하위집단은 자가 PBMC로부터 단리될 수 있고, 즉, 혈액은 안질환의 치료가 필요한 환자로부터 수집되며, 본 발명에 따른 PBMC 단핵구 하위집단은 본 명세서에서 이하에 정의하는 바와 같이 제조되고, 이어서, 환자에게 다시 투여된다.
대안적으로, 인간 PBMC의 단핵구 하위집단은 동종이계 PBMC로부터 단리될 수 있으며, 즉, 혈액은 유전적으로 유사하지만, 동일하지 않은 공여체로부터 수집되고, 본 발명에 따른 PBMC 단핵구 하위집단은 본 명세서에서 이하에 정의하는 바와 같이 제조되며, 선택적으로 환자에게 투여되기 전에 세포-은행에 저장된다.
일 실시형태에서, PBMC의 단핵구 하위집단은 주사를 위해, 예를 들어 눈에 주사를 위해 제형화된다.
또한, 본 명세서에서 상기 정의한 바와 같이 망막 또는 시신경에서 신경 변성의 저해, 글루타민산염 독성으로부터 뉴런의 보호 또는 신경 재생의 촉진을 위한 PBMC의 단핵구 하위집단을 포함하는 조성물이 제공되되, 망막 또는 시신경은 눈의 질환, 장애 또는 병태에 의해, 또는 눈의 염증성 질환, 장애 또는 병태의 치료를 위해 손상된다. 조성물은 주사에 적합한, 예를 들어 눈 내에 투여에 적합한 약제학적으로 허용가능한 담체 중에 현탁된 PBMC의 단핵구 하위집단의 세포를 포함할 수 있다.
본 발명에 따라 사용하기 위한 약제학적 조성물은 하나 이상의 생리학적으로 허용가능한 담체 또는 부형제를 이용하여 전통적인 방식으로 제형화될 수 있다. 담체(들)는 조성물의 다른 성분과 양립가능하고 이의 수용인에게 유해하지 않다는 의미에서 "허용가능"하여야 한다.
담체, 투여방식, 제형 등은 담체, 투여방식, 제형 등의 다음의 예시는, 담체, 투여방식, 제형 등이 본 발명에 의한 사용을 위해 선택될 수 있는 공지된 가능성으로서 열거된다. 그러나, 당업자는 선택된 임의의 주어진 제형 및 투여방식이 목적으로 하는 결과를 달성하는지를 결정하기 위해 우선 시험되어야 한다는 것이 이해될 것이다.
용어 "담체"는 세포와 함께 투여되는 희석제, 애주번트, 부형제 또는 비히클을 지칭한다. 약제학적 조성물 중의 담체는 결합제, 예컨대 미정질 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈(폴리비돈 또는 포비돈), 트래거캔스검, 젤라틴, 전분, 락트산 또는 락트산 1수화물; 붕해제, 예컨대 알긴산, 메이즈(maize) 전분 등; 윤활제 또는 계면활성제, 예컨대 스테아르산마그네슘 또는 라우릴황산나트륨; 및 활택제, 예컨대 콜로이드성 이산화규소를 포함할 수 있다.
조성물은 주사에 의한, 예를 들어, 볼루스 주사 또는 연속 주입에 의한 비경구 투여를 위해 제형화될 수 있다. 주사용 제형은 단위 제형, 예를 들어 앰플로 또는 다회용량 용기로, 추가되는 보존제와 함께 제공될 수 있다. 조성물은 유성 또는 수성 비히클로 현탁액, 용액 또는 에멀전으로서 이러한 형태를 취할 수 있고, 제형화제, 예컨대 현탁제, 안정제 및/또는 분산제를 함유할 수 있다.
눈에 대한 세포 또는 조성물의 투여는 유리체내 주사 또는 망막하 주사를 통할 수 있다.
척수 내 손상의 경계로 귀소 시, 세포가 이전에 피부 조직과 공동발현에 의해 활성화되었든 아니든, 즉, 그들이 피부 활성화세포이든 그들이 비활성화이든, PBMC 단핵구 하위집단은 손상을 완화시키고, 기능적 회복을 개선시킨다는 것이 본 발명자들에 의해 최근에 발견되었다(PCT/IL2012/050522).
따라서, 예를 들어, 눈 내로 주사되는 본 발명의 PBMC의 단핵구 하위집단 세포는 피부 활성화된 세포일 수 있다.
대안적으로, 눈 내로 주사된 본 발명의 PBMC의 단핵구 하위집단 세포는 비활성화된 세포일 수 있다.
상기 논의한 바와 같이, 본 명세서에 정의한 바와 같은 PBMC의 단핵구 하위집단 및 그들을 포함하는 조성물은 눈의 신경퇴행성 질환, 장애 또는 병태의 치료에 유용하다. 특히, 치료는, 예를 들어, 신경 변성의 예방 또는 저해, 신경 생존의 촉진, 신경돌기 재생 및/또는 발아(sprouting), 손상된 망막 또는 시신경 조직의 신경발생, 및/또는 기능 회복의 촉진을 포함하는, 신경 조직 회복의 촉진을 포함한다. 본 명세서에서 신경 세포 상의 적어도 부분적으로 유리한 효과는 본 명세서에서 정의한 바와 같은 PBMC의 특이적 단핵구 하위집단에 의한 염증 반응의 조절로부터 초래된다는 것을 나타내었다.
따라서, 본 발명은 추가로 망막 또는 시신경에서 신경 변성의 저해, 글루타민산염 독성으로부터 뉴런의 보호 또는 신경 재생의 촉진을 위한 방법을 제공하되, 망막 또는 시신경은 눈의 질환, 장애 또는 병태에 의해, 또는 눈의 염증성 질환, 장애 또는 병태의 치료에 대해 손상되고, 상기 방법은 치료가 필요한 개체에게 유효량의 본 명세서에 정의한 바와 같은 PBMC의 단핵구 하위집단을 투여하는 단계를 포함한다.
동일한 출원인의 PCT/IL2012/050522호는 (i) 혈액으로부터 단핵세포를 단리시키는 단계; 및 (ii) 상기 단핵세포를 항-CD3+ 항체, 항-CD19+ 항체 및 항-CD56+ 항체와 접촉시킴으로써 (i)의 단핵세포로부터 CD3+ 세포, CD19+ 세포 및 CD56+ 세포(이들의 각각의 하나는 마이크로 비드에 연결됨)를 제거함으로써 상기 세포를 상기 마이크로비드에 결합하고, 마이크로 비드를 제거함으로써 CD3+ 세포의 양이 상대적으로 적고, CD19+ 세포 및 CD56+ 세포가 실질적으로 없는 인간 말초혈액 단핵세포(PMBC)의 단핵구 하위집단을 얻는 단계를 포함하는, 본 명세서에 기재된 CD3+세포, CD19+ 세포 및 CD56+ 세포가 실질적으로 없는 인간 PMBC의 단핵구 하위집단의 혈액으로부터의 단리방법을 제공한다.
PCT/IL2012/050522호는: (iii) 혈액으로부터 단핵세포를 단리시키는 단계; 및 (iv) 상기 단핵세포를 항-CD3+ 항체, 항-CD19+ 항체, 항-CD56+ 항체 및 항-CD16+ 항체와 접촉시킴으로써 (iii)의 단핵세포로부터 CD3+ 세포, CD19+ 세포, CD56+ 세포 및 CD16+ 세포(이들의 각각의 하나는 마이크로비드에 연결됨)를 제거함으로써 상기 세포를 상기 마이크로비드에 결합하고, 마이크로비드를 제거함으로써 CD3+ 세포의 양이 상대적으로 적고, CD19+ 세포, CD56+ 및 CD16+ 세포가 실질적으로 없는 혈액으로부터 인간 PMBC를 얻는 단계를 포함하는, CD3+ 세포, CD19+ 세포, CD56+ 세포 및 CD16+ 세포가 실질적으로 없는 PMBC 단핵구 하위집단의 혈액으로부터의 단리방법을 추가로 제공한다.
실시형태에서, 단계 (iv), 즉, CD3+ 세포, CD19+ 세포, CD56+ 세포 및 CD16+의 제거 단계는, 하위 단계: (v) (iii)의 단핵세포로부터 CD3+ 세포, CD19+ 세포 및 CD56+ 세포를 제거함으로써 CD3+ 세포 CD19+ 세포 및 CD56+ 세포가 실질적으로 없는 혈액으로부터 인간 PMBC의 단핵구 하위집단을 얻는 단계; 및 (vi) (v)의 PMBC 집단으로부터 CD16+ 세포를 제거함으로써, CD3+ 세포, CD19+ 세포, CD56+ 세포 및 CD16+ 세포가 실질적으로 없는 혈액으로부터 인간 PMBC의 단핵구 하위집단을 얻는 단계를 포함한다.
일 실시형태에서, 단계 (iv)는 단일 단계로 수행된다.
세포 표면 상에서 목적으로 하는 항원을 발현시키는 세포를 포획하는 항체, 예컨대 CD3, CD19, CD56 및/또는 CD16은 바이오티닐화될 수 있고, 이어서, 아비딘 또는 스트렙타비딘 또는 동등한 바이오틴-결합 단백질에 연결되거나, 또는 항체는 마이크로 비드에 이미 결합되었을 때, 세포에 공급될 수 있다. 마이크로 비드는 자성 또는 비자성일 수 있고, 세포는 마이크로 비드에 결합될 때, 마이크로 비드가 자성이 아니라면 원심분리에 의해 또는 마이크로 비드가 자성이라면 자석의 자기장에 노출에 의해 세포가 현탁된 용액으로부터 제거될 수 있다.
일 실시형태에서, 항체는 세포와 접촉될 때 자기 마이크로 비드에 연결되고, 자석을 이용하여 용액으로부터 마이크로 비드를 끌어당김으로써 세포가 결합된 마이크로 비드를 제거하여 세포가 제거된다.
상기 개시한 방법은 CD3+ 세포, CD19+ 세포, CD56+ 세포 및/또는 CD16+ 세포의 양이 상대적으로 적거나 또는 실질적으로 없는 혈액으로부터 인간 말초혈액 단핵세포(PMBC)의 단핵구 하위집단을 단리시키기 위해 사용될 수 있으며, 이는 눈의 질환, 장애 또는 병태에 의해 또는 눈의 염증 질환, 장애 또는 병태의 치료를 위해 손상된 망막 또는 시신경에서 신경 변성의 저해, 글루타민산염 독성으로부터 뉴런의 보호 또는 신경 재생의 촉진을 위해 사용된다.
본 발명을 이제 다음의 비제한적 실시예에 의해 예시할 것이다.
실시예
재료 및 방법
동물. 성체 수컷(8 내지 10주령) C57BL/6J 마우스 및 이형접합적 돌연변이체 Cx3cr1GFP/+ 마우스(B6.129P-Cx3cr1tmlLitt/J, 여기서 CX3CR1 케모카인 수용체 대립유전자 중 하나는 GFP를 암호화하는 유전자로 대체됨; 문헌[Jung, S., J. Aliberti, P. Graemmel, M.J. Sunshine, G.W. Kreutzberg, A. Sher, and D.R. Littman. 2000. Analysis of fractalkine receptor CX(3)CR1 function by targeted deletion and green fluorescent protein reporter gene insertion. Mol. Cell. Biol. 20:4106-4114])를 사용한다. 추가적으로, C57BL/6J, 이형접합적 돌연변이체 Cx3cr1GFP/+ 마우스, MHC-II 널(null) 마우스(B6.129S-H2dlAbl-Ea/J), 및 IL-10 널 마우스(B6.129P2-I110tmlCgn/J; 문헌[
, D. Rennick, K. Rajewsky, and 
. Interleukin-10-deficient mice develop chronic enterocolitis. Cell. 75:263-274])를 단핵구 및 BM의 공여체로서 사용한다. CD11c 검출을 위해, 뮤린 CD11c 프로모터의 제어 하에 GFP 리포터를 암호화하는 이식 유전자를 운반하는 CD11cGFP/+ 유전자이식 마우스(B6.FVB-Tg Itgax-DTR/GFP 57Lan/J; 문헌[Jung, S., D. Unutmaz, P. Wong, G. Sano, K. De los Santos, T. Sparwasser, S. Wu, S. Vuthoori, K. Ko, F. Zavala, et al. 2002. In vivo depletion of CD11c+ dendritic cells abrogates priming of CD8+ T cells by exogenous cell-associated antigens. Immunity. 17:211-220])를 사용한다. FoxP3GFP 마우스는 메모리얼 슬로언 케터링 암센터(Memorial Sloan-Kettering Cancer Center)의 알렉산더 루덴스키 박사(Dr. Alexander Rudensky)가 제공한 관대한 선물이었다. 헌팅턴을 암호화하는 인간 유전자를 과발현시키는 유전자이식 R6/2 마우스를 잭슨 래버러토리(Jackson Laboratory)로부터 얻었다.
달리 언급되지 않는다면, 동물을 바이츠만 연구소의 동물 육종 센터에 의해 공급받았다. 본 명세서에 상술한 모든 실험은 바이츠만 연구소의 동물실험 윤리위원회(Institutional Animal Care and Use Committee)에 의해 만들어진 규정에 따른다.
BM 키메라 . WT 수용체 마우스에 치명적 전신 조사법(950rad)을 실시하는 한편, 앞서 기재한 바와 같이 머리를 차폐함으로써 [Cx3cr1 GFP /+> WT] BM 키메라를 제조하였다(Rolls, A., R. Shechter, A. London, Y. Segev, J. Jacob-Hirsch, N. Amariglio, G. Rechavi, and M. Schwartz. 2008. Two faces of chondroitin sulfate proteoglycan in spinal cord repair: a role in microglia/macrophage activation. PLoS Med. 5:e171.; Shechter et al.,2009). 이 차폐는 망막에 대한 직접 발작 및 글루타민산염 중독에 의해 유도되는 것 이외의 골수성 세포의 임의의 침윤을 방지한다. 다음날에, 앞서 기재한 프로토콜에 따라 5 x 106개 BM 세포와 함께 재구성한다(Shechter et al., 2009). 키메라 마우스에 BM 이식 후 8 내지 12주에 글루타민산염 중독 또는 EAU 유도 프로토콜을 실시한다.
MC-21 투여. MC-21(CCR2에 대한 항체; 문헌[Mack, M., J. Cihak, C. Simonis, B. Luckow, A.E. Proudfoot, J. 
, M. Frink, H.J. Anders, V. Vielhauer, et al. 2001. Expression and characterization of the chemokine receptors CCR2 and CCR5 in mice. J. Immunol. 166:4697-4704])을 손상 직후에 시작해서 실험 기간 내내 복강내로 주사한다. EAU 유도의 경우에, EAU 전에 또는 후에 총 5회 주사 동안 격일로 주사하였다(8㎍/주사).
양자(Adoptive) 단핵구 전달. CD115+ 단핵구를 앞서 보고한 바와 같이 단리한다(Varol, C, L. Landsman, D.K. Fogg, L. Greenshtein, B. Gildor, R. Margalit, V. Kalchenko, F. Geissmann, and S. Jung. 2007. Monocytes give rise to mucosal, but not splenic, conventional dendritic cells. J. Exp. Med. 204: 171-180). 간략하게, 마우스의 대퇴골 및 경골로부터 BM 세포를 채취하고 나서, 피콜(Ficoll) 밀도 구배 상에서 단핵세포를 풍부화시킨다. 제조업자의 프로토콜에 따라 바이오티닐화된 항-CD115 항체 및 스트렙타비딘 결합 자기 비드(밀테니바이오텍(MiltenyiBiotec))를 이용하는 MACS 풍부화를 통해 CD115+ BM 단핵구 집단을 단리시킨다. 이 절차 후에, 이 절차 후에, 단핵구(WT, (Cx 3 cr1 GFP /+,IL-10 결여, 또는 MHC-II 결여)를 손상 후 제1일에 i.v. 주사한다(마우스 당 4 내지 5 x 106개 세포).
BrdU 요법. BrdU(시그마-알드리치(Sigma-Aldrich))를 PBS 중에 용해시키고 나서, 발작 직후에 3연속일 동안 문헌[Zhao et al., 2005(Growth factor responsive progenitors in the postnatal mammalian retina. Dev. Dyn. 232:349-358)]으로부터 적합화된 프로토콜에 따라 유리체내 주사한다(1㎍/눈). 추가적인 조직 침투 없이 동일한 구멍을 통해 주사를 반복적으로 수행한다. 망막은 단일 주사를 받은 동물과 비슷한 형태를 나타내는 것으로 예상된다. 증식성 전구체의 수를 결정하기 위한 최종 주사 후 1일 또는 분화를 검출하기 위한 최종 주사 후 1주에 동물을 죽였다. 대조군 동물에 글루타민산염 중독 또는 상승된 IOP 없이 동일한 요법을 이용하여 유리체내로 BrdU를 투여한다. 특히, 본 발명자들은 손상의 상승적 효과를 배제할 수 없고, 이후의 증식성 RPC의 수에 대해 BrdU 주사를 반복하였지만, 상이한 단핵구 조작을 실시한 동물의 망막/모양체를 비교할 때 동일한 프로토콜을 적용하기 때문에, 이들 조작 후 증식성 전구세포 수의 변화는 대부분 단핵구 매개 효과에 기인할 수 있다.
RGC의 플루오로 -금 표지. 해부학적으로 무결함인 뉴런의 검출을 위해, 마우스를 다음의 조직화에서 우수한 소구(colliculi)에 대한 손상 후 제3일에 식염수 중의 1㎕ 5% 플루오로-금(플루오로크롬) 용액으로 주사한다: 브레그마(bregma)에 대해 2.92㎜ 후방, 정중선에 대해 0.5㎜ 후방, 및 두개골로부터 2㎜ 깊이. 72시간 후에, 마우스를 죽이고, 그들의 눈을 적출하고 나서, 각각의 망막을 PBS 중의 4% 파라폼알데하이드(PFA) 중에서 전층 절편으로서 납작하게 만든다. 선택한 장(field)을 시신경 원판으로부터 거의 동일한 거리에 위치시켜(0.3㎜) 시신경 원판으로부터의 거리의 함수로서 RGC 밀도의 변화를 극복하였다. 마우스가 받은 처리를 알지 못하는 관찰자에 의해 형광현미경(배율 x800) 하에서 장을 계수화하였다. 각각의 망막에서 장 당 RGC의 평균수를 계산하였다. 더 상세하게는, 문헌[Schori et al., 2001 (Vaccination for protection of retinal ganglion cells against death from glutamate cytotoxicity and ocular hypertension: implications for glaucoma. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 98:3398-3403)] 및 문헌[Schwartz and Kipnis, 2007 (Model of acute injury to study neuroprotection. Methods Mol. Biol. 399:41-53)] 참조.
면역조직화학. PBS를 이용한 관류 후에, 눈을 제거하고 나서, 2.5% PFA에서 24시간 동안 부가하고, 70% 에탄올에 옮기고, 이어서, 앞서 기재한 바와 같이 파라핀에 포매시켰다(Shechter, R., Y. Ziv, and M. Schwartz. 2007. New GABAergic interneurons supported by myelin-specific T cells are formed in intact adult spinal cord. Stem Cells 25:2277-2282). 조직병리학적 시험을 위해 대표적인 절편을 헤마톡실린 및 에오신으로 염색하였다. 면역표지를 위해 다음의 항체를 사용하였다: 토끼 항-GFP(1:100; MBL), 마우스 항-Brn3a(1:50; 산타 크루즈 바이오테크놀로지 인코포레이티드(Santa Cruz Biotechnology, Inc.)). M.O.M. 면역검출 키트(벡터 래버러토리즈(Vector Laboratories))를 사용하여 마우스 1차 단클론성 항체를 국소화하였다. 활성화된 골수성 세포 표지를 위해, FITC-컨쥬게이트된 반데이래아 심플리시폴리아 아이소렉틴 B4(Bandeiraea simplicifolia isolectin B4)(IB-4; 1:50; 시그마-알드리치(Sigma-Aldrich))를 1시간 동안 2차 항체 용액에 첨가하였다. 사용한 2차 항체는 Cy2/Cy3-컨쥬게이트된 당나귀 항-마우스 또는 -토끼 항체(1:150-1:200, 모두 잭슨 이뮤노리서치 래버러토리즈 인코포레이티드사제(Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc.))를 포함하였다. 슬라이드를 1분 동안 호크스트 염색(1:2,000; 인비트로젠(Invitrogen))에 노출시켰다. 현미경 분석을 위해, 형광현미경(E800; 니콘(Nikon))을 사용하였다. 형광현미경은 디지털 카메라(DXM 1200F; 니콘)와 20x NA 0.50 또는 40x NA 0.75 대물렌즈(플랜 플루오르(Plan Fluor); 니콘) 중 하나를 구비하였다. 24℃에서 NIS-구성요소, F3(니콘) 획득 소프트웨어를 이용하여 부가 조직에 대한 기록을 하였다. 포토샵(Photoshop) 9.0(어도비(Adobe))을 이용하여 콘트라스트에 대해 부수적인 조절을 함으로써 영상을 잘라내고, 병합하며 최적화시켰고, 캔버스(Canvas) X(데네바 소프트웨어)를 이용하여 정렬하였다.
망막 및 유세포분석의 단리. PBS를 이용하는 심장내 관류 후에, 망막을 절개에 의해 제거하고 나서, 앞서 기재한 바와 같이 단일-세포 현탁액으로 가공하였다(Kerr, E. C, B. J. Raveney, D. A. Copland, A. D. Dick, and L. B. Nicholson. 2008. Analysis of retinal cellular infiltrate in experimental autoimmune uveoretinitis reveals multiple regulatory cell populations. J Autoimmun 31:354-361, Luger, D., P. B. Silver, J. Tang, D. Cua, Z. Chen, Y. Iwakura, E. P. Bowman, N. M. Sgambellone, C. C. Chan, and R. R. Caspi. 2008. Either a Th17 or a Th1 effector response can drive autoimmunity: conditions of disease induction affect dominant effector category. J Exp Med 205:799-810). 다음의 플루오로크롬-표지 mAb를 BD, 바이오레전드(BioLegend), 이바이오사이언스(eBioscience) 또는 압드세로텍(AbDSerotec)으로부터 구입하고 나서, 제조업자의 프로토콜에 따라 사용하였다: PE-컨쥬게이트된 항-CD11b, CD206(MMR), 및 IL-4Rα 항체; PerCP-cy5.5-컨쥬게이트된 항-Ly6C 및 CD11b 항체; 알로피코사이아닌(APC)-컨쥬게이트된 항-CD115, TCRβ, FoxP3 및 CD204 항체, 알렉사(Alexa) 647-컨쥬게이트된 항-덱틴-1 항체; 및 퍼시픽 블루(Pacific Blue)/브릴리언트 바이올렛(Brilliant Violet)-컨쥬게이트된 항-TCRβ, CD4 및 CD45.2 항체. 제조업자의 프로토콜에 따라 Foxp3 염색 완충제 세트(이바이오사이언스(eBioscience))를 이용하여 FoxP3 염색을 수행하였다. FACSDiva 소프트웨어를 이용하여 FACS LSRII 세포계수기(둘다 BD사제) 상에서 세포를 분석하였다. 플로우조(FlowJo) 소프트웨어(트리 스타 인코포레이티드(Tree Star, Inc.))를 이용하여 분석을 수행하였다. 각각의 실험에서, 적절한 음성 및 양성 대조군을 사용하여 관심대상의 집단을 결정하고 나머지를 제외하였다.
생체내 형광 영상화. 마우스를 마취시키고, 플라스틱 장치를 이용하여 부드럽게 고정시켰다. 망막의 시각화를 위해, 한 방울의 0.5% 트로피카마이드(피셔 박사(Dr. Fischer))를 사용하여 동공을 확장시키고, 한 방울의 안구 윤활제(셀러스판(Celluspan); 피셔 박사)를 사용하여 눈의 유리 커버 슬립을 대신한다. 혈관 시각화를 위해 마우스에 덱스트란 로다민(Dextran Rhodamine)(1㎎/동물; 시그마-알드리치(Sigma-Aldrich))으로 i.v. 주사하였다. 마우스를 형광 조명기 및 픽셀플라이(Pixelfly) QE 전하 결합 소자 카메라(PCO)를 구비한 줌 스테레오 현미경(Zoom Stereo Microscope) SZX-RFL-2(올림푸스) 하에 둔다. 적색 필터 설정에 대한 여기 및 방출은 각각 510 내지 550㎚ 및 590㎚(롱패스)이다. 녹색 필터 설정은 여기에 대해 460 내지 490㎚이고 방출에 대해 510 내지 550㎚이다. 형광 노출 시간은 50ms이다. 캠웨어 카메라 제어 소프트웨어 프로그램(PCO)을 이용하여 영상을 획득한다. 이미지제이(ImageJ) 1.43 소프트웨어를 이용하여 영상 분석을 수행한다(W. Rasband, 메릴랜드주 베데스다에 소재한 미국 국립보건원).
통계학적 분석. 두 그룹 간의 비교를 위해 스튜던트 t 검정을 이용하여 데이터를 분석한다. 일원분산분석(One-way ANOVA)을 사용하여 몇몇 그룹을 비교한다. 귀무가설이 기각된 후에(F < 0.05) 그룹의 후속 쌍별 비교를 위해 피셔의 LSD 절차를 사용한다. 결과를 평균 ±SE로서 제시한다. 그래프에서, y-축 오차막대는 SE를 나타낸다. 포도막염 연구를 위해, 레벤(Levene) 검정을 사용하여 분산의 균등함을 확인하였다. 동일한 분산의 경우에, 두 그룹 간을 비교하기 위해 스튜던트 t 검정을 이용하거나, 또는 몇몇 그룹을 비교하기 위해 일원 ANOVA에 의해 데이터를 분석하였다. 귀무가설이 기각된 후에(p < 0.05) 그룹의 후속 쌍별 비교를 위해 터키(Tukey)의 HSD 검정을 사용한다. 동일하지 않은 분산의 경우에, 데이터를 로그 변환시켜 가능하다면 동일한 분산을 달성하였고; 다르게는, 크러스칼-왈리스 검정(Kruskal-Wallis test)을 사용하여 몇몇 그룹을 비교한 후, 던 검정(Dunn's test)을 사용하였다. 결과를 평균 ±SE로서 제시한다. 그래프에서, y-축 오차막대는 SE를 나타낸다.
실시예
1:
PBMC로부터
고수준의
CX
3
CR1
및 저수준의
CCR2를
발현시키는 인간 단핵세포의 단리
인간에서, 3집단의 단핵구를 CD14 및 CD16, 즉: CD14+CD16-, CD14+CD16+ 및 CD14dimCD16+의 발현에 의해 정한다. CD14+CD16- 단핵구는 혈액 단핵구의 80% 내지 90%를 나타내고, 고수준의 케모카인 수용체 CCR2 및 저수준의 케모카인 수용체 CX3CR1(프랙칼린(Fractalkine)의 수용체)을 발현시킨다. 이 주된 서브세트와 대조적으로, 인간 CD16+ 단핵구는 고수준의 CX3CR1 및 저수준의 CCR2를 발현시킨다(Cros et al., 2010). 문헌[Cros et al (2010)]에 따르면, 유전자 발현 분석은 인간 CD14dimCD16+과 뮤린 순찰(patrolling) Gr1dim 단핵구 간의 유사성을 나타낸다. CD14dimCD16+ 세포는 조직의 선천적 국소 감시 및 자가면역질환의 병리에 수반된 진정한 단핵구이다.
고수준의 CX3CR1 및 저수준의 CCR2를 발현시키는 CD14dimCD16+ 세포를 PBMC로부터 단리시키기 위해, 본 발명자들은 CCR2의 음성 선택(CCR2+ 결실) 및 CD14+의 양의 선택(CD14+)의 조합된 방법을 사용한 한편, PBMC로부터 CD14+의 단리를 계획 I에 도시하는 바와 같이 대조군으로서 사용하였다.
계획 I
CD14dimCD16
+ 세포 집단의
풍부화
:
(i) 인간 말초혈액으로부터 단핵세포의 단리 : 건강한 공여체로부터 수집한 새로운 혈액(8㎖)을 PBS 중에서 2.5% FCS와 1:1로 희석시키고 나서, 피콜 구배로 장입시켰다(피콜-파그 플러스(Ficoll-Paque plus), 아머샴 바이오사이언시스(Amersham Biosciences)). 관을 1000g에서 20분 동안 20℃에서 원심분리시켰다. 단핵세포상을 수집하고 나서, PBS로 2회 세척하였다.
(ii) CCR2 + 소모: 우선 단핵세포는 실온에서 15분 동안 FcR 차단 시약(2.5㎕/106개 세포)(130-059-901, 밀리테니바이오텍)으로 처리에 의해 차단시킨 Fc-수용체였다. 이어서, 세척하지 않고, 단클론성 항-인간 CCR2-바이오틴 시약(FAB 151B, 알앤디 시스템즈(R&D Systems)을 첨가하고 나서(10㎕/106개 세포) 2℃ 내지 8℃로 35분 동안 인큐베이션시켰다. 이어서, 세포를 차가운 MACS(상표명) 완충제(1mM EDTA, PBS 중의 2% FCS)로 세척하고 나서, 스트레타비딘 마이크로비드(130-048-101, 밀테니바이오텍)를 2℃ 내지 8℃로 20분 동안 첨가하였다(20㎕/107개 세포). 세포를 세척하고 나서, 0.5㎖의 MACS(상표명) 완충제로 재현탁시켰다. 제조업자의 프로토콜에 따라 LD 칼럼(130-042-901, 밀테니바이오텍)을 이용하여 CCR2+ 세포의 소모를 행하였다.
(iii) CD14+ 세포의 단리 : 세포를 MACS(상표명) 완충제(80㎕/107개 세포)로 재현탁시키고 나서, CD14+ 마이크로비드(130-050-201, 밀테니바이오텍)를 2℃ 내지 8℃로 15분 동안 첨가하였다(20㎕/107개 세포). 이어서, 세포를 세척하고 나서, 0.5㎖의 MACS 완충제로 재현탁시켰다. 제조업자의 프로토콜에 따라 LS 칼럼(130-042-401, 밀테니바이오텍) 상의 자기 분리를 이용함으로써 CD14+ 세포의 양성 선택을 행하였다.
(iv) 인간 단핵세포의 형광-활성화 세포 분류( FACS (상표명)) 염색 제조업자의 프로토콜에 따라 모든 샘플을 염색하였다. 모든 샘플을 70㎛ 나일론 메쉬를 통해 여과시키고 나서, 실온에서 15분 동안 FCR 차단 시약(30㎕/106개 세포)(130-059-901, 밀테니바이오텍)을 이용하여 차단시켰다. 다음의 플루오로크롬-표지된 항-인간 단클론성 항체를 제조업자의 프로토콜에 따라 사용하였다: PerCP 컨쥬게이트된 항 CD45(345809, BD), FITC 컨쥬게이트된 항 CD115(FAB329F, 알앤디 시스템즈), 퍼시픽 블루(Pacific Blue)(상표명) 컨쥬게이트된 항 CD14 (BLG-325616), 알렉사 플루오르(Alexa Fluor)(등록상표) 700 컨쥬게이트된 항 CD16(BLG-302026), PE 컨쥬게이트된 항 CX3CR1(MBL-D070-5) 및 PerCP 컨쥬게이트된 항 CCR2(BLG-335303).
실시예
2: 망막 내 신경변성의 저해.
본 발명자들은 몇몇 망막 변성 모델을 선택한다: 글루타민산염을 이용한 EAU 망막 중독의 유도, 신경퇴행성 병태 하에서 통상적인 독성의 매개체; 시신경 압좌;상승된 IOP 모델; 및 색소 상피 변성의 병리를 가장 잘 모방하는 유전자이식 마우스.
EAU 유도. 이는 인간 후방 포도막염에 대한 모델이다. 포도막염은 종종 망막의 변성을 초래하기 때문에, CNS 신경퇴화 모델을 고려한다. 마우스에 잔기 1 내지 20(22)의 인간 광수용체간 레티노이드 결합 단백질(IRBP)로부터 유래된 500㎍ 펩타이드를 2.5㎎/㎖(최종 1.25 ㎎/㎖)의 농도로 마이코박테리움 투베르쿨로시스(Mycobacterium tuberculosis) 균주 H37.RA를 함유하는 완전 프로인드 애주번트(CFA)와의 1:1 에멀전으로서 피하에 주사한다(아나스펙(AnaSpec), GL 바이오켐(GL Biochem)(상하이) 리미티드, 또는 바이츠만 연구소에서의 펩타이드 합성). 마우스에 복강내로 1㎍ 보델라 페르투시스(Bordella pertussis) 독소(시그마(Sigma))와 공동주사한다.
이 요법은 면역화 후 14일에 동물의 80 내지 100%에서 질환을 유도한다. 면역화 후 제22일 내지 제29일 사이에 질환의 정점에 도달된다. 특이적 RGC 마커인 Brn3a에 대한 면역염색에 의해(
, F.M., M. 
, M. Salinas-Navarro, M. Vidal-Sanz, and M. Agudo. 2009. Brn3a as a marker of retinal ganglion cells: qualitative and quantitative time course studies in naive and optic nerve-injured retinas. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 50:3860-3868), 그리고 해부학적으로 무결함인 축삭의 세포체를 표지하는 통상적으로 사용되는 방법인 플루오로-금을 이용하는 RGC의 표지를 역행함으로써(Schori et al., 2002, 상기 참조; Schwartz and Kipnis, 2007, 상기 참조), 글루타민산염 중독 후 제7일에 또는 EUA 질환의 전에, 과정 중에 또는 질환의 정점 후에 생존 RGC를 평가한다.
유리체내 글루타민산염 독성 모델. 다수의 CNS 장애에서 글루타민산염의 상승이 보고되었다. 흥분성 화합물로서 그의 역할에서, 글루타민산염은 급성 및 만성(녹내장에서 시신경 변성을 포함함) 퇴행성 장애에서 독성의 가장 흔한 매개체 중 하나이다(Doble, 1999). 따라서, 이는 중추신경계 신경의 신경퇴화에 대한 일반적 모델이다. 글루타민산염이 눈에 주사될 때, 이 모델은 망막 신경절 신경퇴화를 특히 대표하는데, 그것이 다양한 안질환, 예컨대 망막 변성 장애, 예를 들어, 연령관련 황반변성 또는 망막색소변성증; 전방 허혈성 시신경병증, 녹내장 또는 포도막염에서 생기기 때문이다. 마우스를 마취시키고, 눈에 직접 적용하는 국소 마취(로칼린(anesthesia); 피셔 박사)를 처리하고 나서, 앞서 기재한 바와 같이 400n㏖ 1-글루타민산염(시그마-알드리치)을 함유하는 총 용적 1㎕ 식염수로 유리체 내로 주사하였다(Yoles E, Friedmann I, Barouch R, Shani Y, Schwartz M. Self-Protective mechanism awakened by glutamate in retinal ganglion cells. J Neurotrauma. 2001, Mar;18(3):339-4; Schori, H., E. Yoles, L.A. Wheeler, T. Raveh, A. Kimchi, and M. Schwartz. 2002. Immune-related mechanisms participating in resistance and susceptibility to glutamate toxicity. Eur. J. Neurosci. 16:557-564).
N- 메틸 -N- 나이트로소유레아 ( MNU ) 독성 모델. MNU의 단일 전신 투여는 다양한 동물종에서 망막 변성을 야기한다. 망막 변성은 고도로 재생가능하며, 인간 망막색소변성증과 비슷한 세포자멸사를 통한 MNU 투여 후 7일 이내에 광수용체 세포 손실이 일어난다(Tsubura A, Yoshizawa K, Kuwata M, Uehara N. Animal models for retinitis pigmentosa induced by MNU; disease progression, mechanisms and therapeutic trials. Histol Histopathol. 2010 Jul;25(7):933-44. Review).
마우스에서의 시신경 압좌 . 교정한 시신경 압좌는 축삭 손상의 역행 신호전달에 기인하여 진행성 신경절 세포를 유도한다(Levkovitch-Verbin H, Harris-Cerruti C, Groner Y, Wheeler LA, Schwartz M, Yoles E. RGC death in mice after optic nerve crush injury: oxidative stress and neuroprotection. Invest Ophthalmol Vis Sci. 2000 Dec;41(13):4169-74). 간략하게, 마우스를 마취시키고 나서, 안구로부터 1 내지 2㎜로 시신경의 안와내부에서 중증으로 압좌 손상시켰다. 양안 수술현미경의 도움으로, 결막을 절단하고, 시신경을 노출시켰다. 작용 교차부(cross-action)를 교정한 겸자를 이용하고 혈액 공급과 상호작용하지 않는 특별한 관리를 취하여서, 신경을 2초 동안 압좌시킨다.
상승된 IOP 모델. 안압(IOP)은 녹내장에 대한 위험인자이며, 그것이 망막 및 시신경의 변성을 야기할 수 있기 때문에, 일반적으로 신경퇴화 그리고 특히 녹내장에 대한 모델로서 작용한다. 앞서 기재한 바와 같이 허혈성 손상이 생성된다(Da, T., and A.S. Verkman. 2004. Aquaporin-4 gene disruption in mice protects against impaired retinal function and cell death after ischemia. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 45:4477-4483; Ben Simon, G.J., S. Bakalash, E. Aloni, and M. Rosner. 2006. A rat model for acute rise in intraocular pressure: immune modulation as a therapeutic strategy. Am. J. Ophthalmol. 141: 1105-1111). 간단히 말해서, 마취 후에, 안압(IOP)은 등장성 염 용액(식염수)에 연결된 마이크로피펫의 전방 챔버 내로 도입됨으로써 상승된다. 저장소는 적절한 높이에 위치되어 60분 동안 120㎜Hg의 압력을 유도한다.
유전자이식 마우스 모델. 적절한 유전자이식 마우스는, 예를 들어, 맥락막 결손(choroideremia: CHM) 넉아웃 마우스(Tanya Tolmachova, Silene T. Wavre-Shapton, Alun R. Barnard, Robert E. MacLaren, Clare E. Futter, and Miguel C. Seabra. Retinal Pigment Epithelium Defects Accelerate Photoreceptor Degeneration in Cell Type-Specific Knockout Mouse Models of Choroideremia. Invest Ophthalmol Vis Sci. 2010 October; 51(10): 4913-4920.); 및 로돕신 돌연변이를 지니는 유전자이식 마우스(Pro23His)(Jane E. Olsson, Jon W. Gordon, Basil S. Pawlyk, Dorothy Roof, Annmarie Hayes, Robert S. Molday, Shizuo Mukai, Glenn S. Cowley, Eliot L. Berson, Thaddeus P. Dryja. Transgenic mice with a rhodopsin mutation (Pro23His): A mouse model of autosomal dominant retinitis pigmentosa. Neuron (1992) 9: 815-830)이다.
프로토콜. 이식을 위한 단핵구를 상승적 마우스의 골수로부터 단리시켰다. PBMC를 CD3, CD19및 CD56에 항체를 컨쥬게이션시킨 마이크로비드로 표지하여 T-세포, B-세포 및 NK 세포를 소모시켰다. 자기 칼럼을 통과한 비표지 세포를 수집하였다. 이 분획을 항-CD16 마이크로비드로 표지하고 나서, 자기 칼럼 상에 다시 장입시켰다. 칼럼을 통과한 세포를 수집하고 나서, CD14 및 CD16 형광 항체를 이용하는 FACS에서의 분석을 위해 염색하였다. PBMC에서, 19%의 총 살아있는 세포는 단핵구이다(CD14+). 단핵구 외에, 약 10%는 CD16+이다. 최종 산물에서, 약 90%의 살아있는 세포는 단핵구이며 그것에서 나온 CD16+는 0.1% 미만이다.
이어서, 본 발명자들은 망막 신경절 세포에 대한 공격 전에 또는 공격 후에 눈에 주사될 때 망막 손상 후에 망막 신경절 세포를 보호하기 위한 상기 기재한 하위집단의 능력을 검토한다.
마우스를 손상 개시 후 상이한 시점에 자가 단핵구의 단일 주사에 의해 처리한다. 각각의 동물 모델 당 두 경로의 투여를 시험한다: (i) 유리체내 주사 및 (ii) 망막하 주사. 연구의 종점은 형태 기준을 이용하고, 망막의 횡단면에서 살아남는 세포 구성요소를 계수화하는 것에 의한 망막 내 신경 생존의 평가이다.
단핵구 하위집단의 망막하 주사를, 예를 들어 문헌[Warfinge et al., 2011]에 따라 수행하지만; 그러나 망막하에서 단핵구를 주사하기 위해 임의의 기법을 사용할 수 있다. 동물을 일반적 마취하에 두고, 앞서 기재한 바와 같이 유리체망막 수술을 수행한다(K.Warfvinge, J. F. Kiilgaard, E. B. Lavik et al., "Retinal progenitor cell xenografts to the pig retina: morphologic integration and cytochemical differentiation," Archives of Ophthalmology, vol. 123, no. 10, pp. 1385-1393, 2005). 간략하게, 미다졸람, 졸라제팜, 틸레타민, 자일라진, 케타민 및 메타돈으로 이루어진 근육내 주사로 돼지를 사전마취시킨다. 이어서, 그들에 관을 삽입하고 나서, 인공적으로 환기시키고, 아이소플루란/산소로 마취시킨다. 국소 페닐에프린, 트로피카마이드 및 아트로핀을 이용하여 수술 동공을 확장시킨다. 수술 부위를 준비하고, 수술의 개시 전에 보통의 멸균 방식으로 가렸다. 국소화된 3-포트 유리체 절제술을 수행하고 나서, 녹색 아르곤 레이저 번을 망막의 중심와에 대해 격자형으로 적용하였다. 망막절개술을 준비하고, 단핵구를 적절한 바늘을 통해 레이저 번에 대응하는 영역 내 망막하 공간에 전달하였다. 정확한 그래프트 위치를 주사시 직접 시각화에 의해 확인한다. 감염을 피하기 위해 클로람페니콜을 수술의 마지막에 예방적으로 제공하였다.
실시예 3. 단핵구 하위집단을 이용한 연령관련 황반변성의 처리. 알비노 래트를 1, 3 또는 6개월 동안 3000-럭스 주기 광에 12시간 노출시킨다. 안락사시키기 전에 안저 검사, 안저촬영, 플루오레세인 및 인도사이아닌 녹색 형광 조영술 및 광 간섭성 단층촬영기술을 수행한다. 조직병리학적 평가를 위해 1, 3 또는 6개월 후에 광노출시킨 동물을 안락사시킨다. 망막을 면역형광 염색에 의해 4-하이드록시-2-노넨알- 및 나이트로타이로신-변형 단백질의 존재에 대해 시험한다(Daniel M. Albert et al., 2010. Development of choroidal neovascularization in rats with advanced intense cyclic light-induced retinal degeneration. Arch Ophthalmol. 2010;128(2):212-222). 광노출시킨 동물을 손상 개시 후 상이한 시점에 자가 단핵구의 단일 주입에 의해 상기 기재한 바와 같이 처리한다. 2개의 투여 경로를 각각의 동물 모델마다 시험한다: (i) 유리체내 주사 및 (ii) 망막하 주사. 연구의 종점은 형태학적 기준을 이용하고 망막의 횡단면에서 살아남는 세포 구성요소를 계수화하는 것에 의한 망막 내 신경 생존의 평가이다.
AMD와 알츠하이머병 사이의 유사성. AMD 및 알츠하이머병은 둘 다 노인의 실질적인 비율에 영향을 미치는 만성 신경퇴행성 장애이다. 이들 장애의 특징은 기능의 비가역적 손실인데, 이에 대한 치료법은 없다. AMD 및 알츠하이머병에서 생기는 변성은 어느 정도로 통상적인 발병을 가질 수 있다(Klaver et al., 1999. Is age-related maculopathy associated with Alzheimer's disease? The Rotterdam study. Am J Epidemiol; 150:963-8). AMD와 알츠하이머병 둘 다의 병인은 대부분 알려져 있지 않지만, 두 질환의 발병은 일부 현저한 유사성을 나타낸다. AMD에서, 조기 조직병리학적 징후는 세포밖 드루젠(drusen) 침착물 및 기저 층류 침착물이다(Hageman, GS. & Mullins, RF. Molecular composition of drusen as related to substructural phenotype. Mol Vis 5, 28 (1999)). 이들 병변은 지질, 당단백질 및 글라이코사미노글라이칸을 함유하는데, 이는 변성된 신경망막으로부터 유래될 가능성이 있다. 이들 침착물의 축적은 광수용체의 상실 및 황반 기능을 후속적 악화와 관련된다(Holz et al., Bilateral macular drusen in age-related macular degeneration. Prognosis and risk factors. Ophthalmology 101, 1522-8 (1994)). 상기 주목한 바와 같이, 알츠하이머병에서의 초기 병적 특징은 세포외 노인성 반점의 존재이다(Selkoe, 1991. The molecular pathology of Alzheimer's disease. Neuron 6, 487-98). 이들 반점은 아밀로이드 전구체 단백질로서 알려진 막관통 폴리펩타이드의 패밀리의 가수분해 절단에 의해 생성된 소펩타이드를 비롯한 다수의 구성성분으로 구성된다. 알츠하이머병의 병리에 대한 주된 기여자로서 널리 간주되는 2종의 펩타이드는 아밀로이드-β(Aβ) 펩타이드로서 공지되어 있다. 아밀로이드 침착물 및 드루젠의 공유되는 구성성분은 알츠하이머병에서 아밀로이드 플라크와 관련되는 비트로넥틴, 아밀로이드 P, 아포지질단백질 E, 및 심지어 Aβ 펩타이드 및 아밀로이드 올리고머와 같은 단백질을 포함한다(Luibl et al., 2006). 노화 및 연령 관련 황반변성과 관련된 드루젠 침착물은 비섬유성 아밀로이드 올리고머를 함유한다. 문헌[J Clin Invest 116, 378-85; Mullins et al., 2000]. 노화 및 연령관련 황반변성과 관련된 드루젠은 죽상동맥경화증, 탄력섬유증, 아밀로이드증, 및 조밀 침착병과 관련된 세포외 침착물에 공통된 단백질을 함유한다. 문헌[Faseb J 14, 835-46; Yoshida et al., 2005. The potential role of amyloid beta in the pathogenesis of age-related macular degeneration. J Clin Invest 115, 2793-800).
알츠하이머병에 존재하는 Aβ 펩타이드는 미세아교세포를 활성화시켜 반응성 산소 및 질소종, 전염증 사이토카인, 보체 단백질 및 신경퇴행성 변화를 초래하는 다른 염증 매개체와 같은 잠재적으로 신경독성인 물질을 생성한다. 알츠하이머병과 관련된 염증 반응은 종종 CD11b+ 활성화된 미세아교세포를 수반하는데, 이는 CNS에서 면역계의 타고난 부문을 나타낸다. CD11b+ 미세아교세포는 연령관련 정상 인간 뇌와 관련되는 것으로 보고되었고(Streit, 2004. Microglia and Alzheimer's disease pathogenesis. J Neurosci Res 77, 1-8), 이러한 미세아교세포는 연령 관련 인지상실과 손상된 신경발생 둘 다에 기인한다는 것이 가능하다(Monje et al., 2003. Inflammatory blockade restores adult hippocampal neurogenesis. Science 302, 1760-5). 또한 CD11b는 알츠하이머병을 지니는 환자에서 발견되었다(Akiyama &McGeer, 1990. Brain microglia constitutively express beta-2 integrins. J Neuroimmunol 30, 81-93). 게다가, 염증 매개체는 아밀로이드 침착물에서 뿐만 아니라 드루젠에 존재하는데, 이는 AMD와 알츠하이머병에서 염증 경로에 대해 가능한 통상적인 역할을 제시한다(Hageman et al., 2001. Molecular composition of drusen as related to substructural phenotype. Mol Vis 5, 28). 드루젠 생체내합성에서 국소 염증에 대한 역할은, 세포외 플라크 및 침착물의 축적이 1차 병원성 자극의 효과를 악화시키는 국소 만성 염증 반응을 유발하는 경우, 그것이 알츠하이머병이 생기는 과정과 유사하다는 것을 시사한다(Akiyama et al., 2000. Inflammation and Alzheimer's disease. Neurobiol Aging 21, 383-421).
상기에 관해, AMD 처리에 대해 상기 정의한 바와 같은 단핵구 하위집단의 효능은 응집된 Aβ에 대한 뉴런의 노출을 이용하는 모델을 사용하여 평가할 수 있다.
실시예
4. 마우스 단핵구의
유리체내
주사 -
글루타민산염
중독 후 망막 신경절 생존에 대한 효과 및 주사한 세포의 특성규명.
프로토콜:
마우스를 마취시키고, 우측 눈에 400n㏖ L-글루타민산염(1㎕ 식염수 중에서)으로 유리체 내로 주사하였다. - 다음날, 유리체내 주사를 위해 세포: 마우스로부터의 CD115+ 골수 단핵구 세포(BMMC)를 정제하였고 - 공여체 마우스의 대퇴골과 경골로부터 골수 세포(cx 3 cr1 골수 프로모터 하에서 GFP 리포터를 운반함)를 채취하고 나서, 피콜 밀도 구배 상에서 단핵세포를 풍부화시켰다. 표적화된 집단의 양성 선택을 위해 바이오티닐화된 항-CD115 항체 및 스트렙타비딘-결합 자기 비드(밀테니 바이오텍)를 이용하여 자기 활성화된 세포 분류(MACS)를 통해 CD115+ BM 단핵구 집단을 단리시켰다. 세포를 GT-중독된 눈에 (그 전날 GT를 도입하는 동일한 구멍을 통해) 105개 세포/마우스(1㎕ PBS에서)로 유리체내 주사하였다. 대조군에 PBS를 주사하였다.
GT 주사 후 제7일에, 마우스를 관류시키고 나서, 눈을 2.5% PFA 내로 밤새 수집하고, 이어서, 용액을 1% PFA로 대체하고, 눈을 추가 3 내지 4일 동안 침지시키고 나서, 추가로 RGC 마커인 Brn3a를 이용하는 면역조직 염색을 위해 추가로 가공하였다. 샘플 당 4개 절편을 정량화하고 나서, 상이한 깊이의 눈을 취하였다. 망막의 신경절 세포층에서 계수화한 세포는 Brn3a+, IB-4- 및 호크스트+였다. PBS-주사 눈은 음성 대조군으로서 작용하며, 동일한 마우스로부터의 손상되지 않은 대측성 눈은 RGC 생존을 위한 양성 대조군으로서 작용하였다.
주사된 마우스 세포를 GFP에 대한 염색에 의해 눈 내에서 추적하였고, 그들의 표현형은 몇몇 면역 마커(사이토카인, 성장인자, 식세포작용 마커)에 대한 염색을 특징으로 하였다.
결과:
유리체내 주사한 마우스 단핵구는 RGC 상에서 보호 효과를 가졌다(도 1a 내지 도 1c). 주사한 눈의 유리체에서뿐만 아니라 (손상된 RGC가 위치된) 신경절 세포층에 근접하여 단핵구를 검출하였다. 추가로, 일부 세포를 망막하 공간에서 검출할 수 있었다(도 2).
다수의 면역 마커와 함께 GFP의 이중 면역염색은 CX3CR1-GFP+ 마우스 단핵구 중에서 IL-10, TGF-β, IGF-1, BDNF, CD36 및 Arg-1(알기나제-1)뿐만 아니라 TNFα 및 IL-1β의 발현을 나타내었다(도 2). 특히, 이는 정량적 분석이었고, 따라서 주사한 세포 중에서 상이한 유형의 마커가 발현되는 빈도는 아직 결정되지 않았다.
실시예
5. CNS-기반 자가면역 백신접종은 시신경
압좌
후에 대식세포 및 T 세포의 망막 내로의 침윤을 증가시킨다.
손상된 신경계 부위에 대한 단핵구 동원을 증가시키는 방법은 중요하지 않으며, 망막에 대한 손상뿐만 아니라 시신경에 대한 손상은 치료될 수 있다는 것을 나타내기 위해, CNS-특이적 항원에 의한 면역화에 의해 시신경의 손상 부위로 내인성 세포를 이동시켰다.
프로토콜:
WT 수용체 마우스에 치명적 전신 조사법(950rad)을 실시하는 한편, 머리를 차폐함으로써 [Cx3cr1 GFP /+-> WT] BM 키메라를 제조하여, 망막에 대한 임의의 직접적 발작 또는 시신경 압좌(ONC)에 의해 유도되는 것 이외의 골수성 세포의 침윤을 방지하였다. 다음날에, 마우스를 꼬리정맥에 i.v. 주사에 의해 Cx3cr1 GFP /+ 유전자이식 마우스로부터 유래된 5x106개의 골수 세포로 재구성하였다. 얻어진 마우스에서, 혈액으로부터 침윤하는 단핵구만이 GFP 표지를 운반한다.
한 그룹의 마우스에 2.5㎎/㎖ 완전 프로인트 애주번트(디프코(Difco)) 중의 100㎍ MOG 변용 펩타이드(제45일; 서열: MEVGWYRSPFDRVVHLYRNGK)를 함유하는 100㎕ 에멀전으로 피하에 주사하였다.
백신접종 후 1주일에, 마우스(백신접종 마우스와 비백신접종 마우스)를 마취시키고 나서, 작용 교차부 겸자를 이용하여 양안 수술현미경 하에 우측 시신경에 중증의 압좌를 실시하였다. 대측성 신경은 건드리지 않고 남겨 두었다.
ONC 후 제7일에, 마우스를 관류시키고 나서, 망막을 수집하였고, 유세포 분석을 위해 단일 세포 현탁액에 처리하였다.
결과:
ONC는 망막 내 총 백혈구(CD45+)의 증가를 초래하였고, 이의 증가는 제45일-백신접종 손상 마우스에서 향상되었다(도 3a).
대식세포 및 T 세포는 또한 비백신접종의 손상된 마우스로부터의 망막에 비해 ONC 전 제45일에 백신접종한 마우스의 망막 내에서 증가되었다(도 3b 및 도 3c).
실시예
6. 시신경
압좌
후에 망막 신경절
세포에 대한 신경보호를 부여하는
CNS-기반 자가면역 백신접종의 능력 평가.
프로토콜:
손상된 망막에서 주위 단핵구 수를 증가시키는 것에 대한 백신접종의 효과와 시신경 압좌 손상 후에 RGC의 생존 간의 상관관계를 다음의 실험에서 입증할 것이다. 한 그룹의 마우스를 2.5㎎/㎖ 완전 프로인트 애주번트(디프코) 중에서 100㎍ MOG 변용 펩타이드 45D(위치 45에서 세린으로부터 아스파트산까지 변용된 미엘린 희돌기교세포 당단백질(MOG)35-55)를 함유하는 100㎕ 에멀전으로 피하에 주사하였다.
백신접종 후 일주일에, 마우스(백신접종 마우스와 비백신접종 마우스)를 마취시키고 나서, 작용 교차부 겸자를 이용하여 양안 수술현미경 하에 우측 시신경에 중증의 압좌를 실시하였다. 대측성 신경은 건드리지 않고 남겨 두었다.
ONC 후 제7일에, 마우스를 관류시키고 나서, 눈을 정착액(2.5% PFA ->1% PFA) 내로 수집하고, RGC 마커인 Brn3a로 면역조직학적 염색을 위해 추가로 가공하였다. 샘플 당 4개 절편을 정량화하고, 상이한 눈의 깊이로부터 취하였다. 망막의 신경절 세포층 내에서 계수화된 세포는 Brn3a+, IB-4- 및 호크스트+이다. 비백신접종 마우스로부터의 손상되지 않은 대측성 눈은 RGC 생존을 위한 양성 대조군으로서 작용한다(100%).
참고문헌
Claims (20)
- 망막 또는 시신경에서 신경 변성의 저해, 글루타민산염 독성으로부터 뉴런의 보호 또는 신경 재생의 촉진에서 사용하기 위한 CD3+ 세포, CD19+ 세포 및 CD56+ 세포의 양이 상대적으로 적거나 또는 실질적으로 없는 말초혈액 단핵세포(peripheral blood mononuclear cell: PBMC)의 단핵구 하위집단(monocyte subpopulation)으로서, 상기 망막 또는 시신경은 눈의 질환, 장애 또는 병태에 의해 손상되는, PBMC의 단핵구 하위집단.
- 제1항에 있어서, 추가로 CD16+ 세포가 실질적으로 없는, PBMC의 단핵구 하위집단.
- 망막 또는 시신경에서 신경 변성의 저해, 글루타민산염 독성으로부터 뉴런의 보호 또는 신경 재생의 촉진에서 사용하기 위한 CD3+ 세포, CD19+ 세포, CD56+ 세포 및 CD16+ 세포의 양이 상대적으로 적거나 또는 실질적으로 없는 PBMC의 단핵구 하위집단으로서, 상기 망막 또는 시신경은 눈의 질환, 장애 또는 병태에 의해 손상되는, PBMC의 단핵구 하위집단.
- 제1항 또는 제3항에 있어서, CD14+ 세포가 실질적으로 풍부한, PBMC의 단핵구 하위집단.
- 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 질환, 장애 또는 병태는 연령관련 황반변성 또는 망막색소변성증; 전방 허혈성 시신경병증; 녹내장 또는 포도막염으로부터 선택되는 망막 변성 장애로부터 선택되는, PBMC의 단핵구 하위집단.
- 눈의 염증성 질환, 장애 또는 병태의 치료에서 사용하기 위한 CD3+ 세포, CD19+ 세포 및 CD56+ 세포의 양이 상대적으로 적거나 또는 실질적으로 없는 말초혈액 단핵세포(PBMC)의 단핵구 하위집단.
- 제6항에 있어서, 추가로 CD16+ 세포가 실질적으로 없는, PBMC의 단핵구 하위집단.
- 눈의 염증성 질환, 장애 또는 병태의 치료에서 사용하기 위한 CD3+ 세포, CD19+ 세포, CD56+ 세포 및 CD16+ 세포의 양이 상대적으로 적거나 또는 실질적으로 없는, PBMC의 단핵구 하위집단.
- 제6항 또는 제8항에 있어서, CD14+ 세포가 실질적으로 풍부한, PBMC의 단핵구 하위집단.
- 제6항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 망막 또는 시신경에서 신경 변성의 저해, 글루타민산염 독성으로부터 뉴런의 보호 또는 신경 재생의 촉진에서 사용하기 위한 것이되, 상기 망막 또는 시신경은 눈의 질환, 장애 또는 병태에 의해 손상되는, PBMC의 단핵구 하위집단.
- 제10항에 있어서, 상기 질환, 장애 또는 병태는 연령관련 황반변성 또는 망막색소변성증; 전방 허혈성 시신경병증; 녹내장 또는 포도막염으로 선택되는 망막 변성 장애로부터 선택되는, PBMC의 단핵구 하위집단.
- 제6항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 공막염; 각막염; 각막 궤양; 설맹; 티제슨의 표재성 각막증(Thygeson's superficial punctate keratopathy); 각막 신생혈관화; 후치스 근이영양증(Fuchs' dystrophy); 원추각막; 건성각결막염; 또는 홍채염으로부터 선택되는 눈의 염증성 질환의 치료를 위한, PBMC의 단핵구 하위집단.
- 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 인간 PBMC인, PBMC의 단핵구 하위집단.
- 제13항에 있어서, 자가 PBMC인, PBMC의 단핵구 하위집단.
- 제13항에 있어서, 동종이계 PBMC인, PBMC의 단핵구 하위집단.
- 제14항 또는 제15항에 있어서, 주사용으로 제형화된, PBMC의 단핵구 하위집단.
- 제16항에 있어서, 눈 내로의 주사용으로 제형화된, PBMC의 단핵구 하위집단.
- 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항의 PBMC의 단핵구 하위집단을 포함하는 조성물.
- 망막 또는 시신경에서 신경 변성의 저해, 글루타민산염 독성으로부터 뉴런의 보호 또는 신경 재생의 촉진을 위한 방법으로서, 상기 망막 또는 시신경은 눈의 질환, 장애 또는 병태에 의해 손상되고, 상기 방법은 신경 변성의 저해, 글루타민산염 독성으로부터 뉴런의 보호 또는 신경 재생의 촉진이 필요한 개체에게 유효량의 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항의 PBMC의 단핵구 하위집단을 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
- 치료가 필요한 개체에게 유효량의 제6항 내지 제17항 중 어느 한 항의 PBMC의 단핵구 하위집단을 투여하는 단계를 포함하는, 눈의 염증성 질환, 장애 또는 병태의 치료방법.
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