CN1615357A - 人单核吞噬白细胞的制备方法 - Google Patents

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Abstract

一种制备人单核吞噬白细胞的方法，所述方法包括将从个体血样中分离的单核细胞与来自同一个体的皮肤组织一起培养，去除所述培养混合物中的真皮部分，通过离心将所获得的活化单核吞噬白细胞沉淀，洗涤所述活化巨噬白细胞并将其重悬于所述培养基中，然后评价所述培养物对人体给药的适应性。细胞治疗制品用所得培养物进行制备，并且用于促进CNS轴突再生、伤口愈合和治疗心肌梗塞。

Description

人单核吞噬白细胞的制备方法
发明领域和发明背景
本发明涉及一种制备人单核吞噬白细胞的方法、由此获得的细胞培养物及其应用。
受伤组织愈合是基于许多分子和生理因子间同步相互作用的复杂自然过程。有效的炎症反应是诱导受伤组织再生和修复的主要因素之一。这是组织再生能力的最早最重要的反应之一。募集并进一步在原位活化的巨噬细胞是有效炎症反应初期的关键因子。炎症反应是体内所有组织伤口愈合的组成部分。
在轴突损伤后，哺乳动物周围神经系统(PNS)的神经元比中枢神经系统(CNS)在轴突再生方面具有更大能力，已表明巨噬细胞在PNS轴突再生中起到关键作用(Schwartz等，1989，FASEB J.，3：2371-2378)。
哺乳动物的CNS显示出在轴突损伤后轴突再生能力差。CNS轴突再生和PNS轴突再生间的差异似乎主要是因为神经元的细胞环境，而不是神经元本身。在神经元损伤后，围绕着PNS神经元的神经膜细胞受到调节，从而变成容许或支持轴突再生，而围绕着CNS神经元的星形胶质细胞、少突胶质细胞和小胶质细胞不显示出这样的调节并保持不支持或抑制轴突再生。
损伤后炎症反应的差异与这种调节缺乏相关。特别是，与响应PNS的损伤相比，响应CNS损伤的单核吞噬细胞的积累被延迟并受到限制。
在CNS中，炎症反应的降低，至少部分是由于居留的组织巨噬细胞(小胶质细胞)的相对无效性所致。血源性单核细胞不能进入CNS，不能象它们在任何其它受损伤的需要伤口愈合的组织中那样发挥正常作用，这进一步强化了这种不足。
在美国专利第5,800,812号、第6,117,424号和第6,267,955号中，已公开了使用同种异体单核吞噬细胞以促使哺乳动物的CNS中轴突再生的方法和组合物，所有这些专利全都属于本申请的同一申请人，其每个及所有这些专利都通过引用结合到本文中，视同全部在此公开。这些专利描述了从成年Sprague-Dawley大鼠外周血中分离和培养单核细胞的方法，以及经与同系大鼠坐骨神经或视神经段共培养、或在适合同系大鼠坐骨神经或视神经的培养基中培养而刺激分离的单核细胞的方法。然后分析受刺激的单核细胞的吞噬活性和/或一氧化氮产量，并且在经受视神经横切的大鼠的伤口上或伤口附近给予受刺激的单核细胞。
发明概述
本发明的一个目的是提供一种用于制备人单核吞噬白细胞的方法。
本发明的另一个目的是提供一种用于制备这样的表达伤口愈合表型的人单核吞噬白细胞的方法。
本发明的再一个目的是提供一种用于制备这样的表达伤口愈合表型并适合于促进轴突再生(例如在脊髓损伤的病例中)的人单核吞噬白细胞的方法。
本发明的又一个目的是提供一种用于制备这样的表达伤口愈合表型并适合于皮肤伤口(特别是慢性皮肤溃疡)愈合的人单核吞噬白细胞的方法。
本发明的另一个目的是提供一种用于制备这样的表达伤口愈合表型并适合于减少坏死组织的体积(例如在心肌梗塞的病例中)的人单核吞噬白细胞的方法。
本发明的另一个目的是提供一种描述通过本发明方法产生的这样的表达伤口愈合表型的人单核吞噬白细胞的特征的方法。
本发明的这些和其它目的由以下方法提供：其中从个体血液中分离出单核细胞，将其悬浮于适合于培养单核细胞的培养基中，然后与组织工程皮肤或与从同一个体切取的皮肤组织(优选真皮)一起培养，然后去除所述皮肤组织，洗涤巨噬细胞，然后将所得活化单核吞噬白细胞重悬于与前述相同的合适培养基中。
在本发明的一个优选实施方案中，所述人单核吞噬白细胞是自体的，也就是说，从个体外周血液单核细胞制备它们并与同一个体的皮肤组织一起活化，然后给予所述同一个体。
本发明还提供用于促进CNS中轴突再生(特别是CNS损伤后)、伤口愈合和减少心肌梗塞坏死组织的细胞治疗制剂。
附图简述
图1A-1B分别是非颗粒型单核细胞(培养前)和颗粒型单核吞噬白细胞(培养后)的照片。
发明详述
吞噬细胞定义为能够摄取颗粒物质如微生物和其它调理颗粒抗原的细胞，包括诸如巨噬细胞和单核细胞的细胞。
单核细胞是单核吞噬白细胞。单核细胞是从骨髓造血细胞的幼单核细胞形成，进入血液，循环至多72小时，随后进入组织例如肺、肝、和患病组织例如恶性肿瘤和动脉粥样斑块，在此它们变为巨噬细胞。单核细胞分化为巨噬细胞涉及许多变化：形态学变化，体积增大，吞噬活性增加、表达细胞标记，分解酶水平更高和分泌多种可溶性因子。
巨噬细胞分散在全身。有些居留在特定组织，变为固定巨噬细胞，而另一些保持游动，被称为游离巨噬细胞。
虽然正常时处于静止状态，但巨噬细胞被多种刺激以免疫应答程序激活。颗粒抗原的吞噬作用是原始激活刺激。然而，由活化T辅助(TH)细胞分泌的细胞因子(例如干扰素-γ)、炎症反应介质和细菌细胞壁产物都可进一步增强巨噬细胞活性。
单核细胞是参与炎性过程的第一类细胞。它们有大量任务，其活性程度可能使它们行使其职责。单核细胞活化过程不是一个全或无现象，而是渐进的刺激物特异性效应。
单核细胞/巨噬细胞的许多功能与其活化程度直接相关，包括免疫功能、分泌功能、吞噬功能和其它功能。按照其活化程度，通常将巨噬细胞定义为以下三个不同的组：
(i)伤口愈合巨噬细胞，其主要功能是作为炎症反应的第一岗哨；
(ii)抗微生物和细胞毒性巨噬细胞，其主要功能是作为抵抗致病生物和恶性肿瘤细胞的体内防御机制；和
(iii)抗原呈递巨噬细胞，特别是TH细胞，在其功能中，它们帮助细胞参与任何炎症反应。
本申请所用的术语“单核吞噬白细胞”、“单核白细胞”、“单核吞噬细胞”和“巨噬细胞”可互换使用，是指用本发明方法制备的细胞。
在一个实施方案中，本发明提供一种用于制备人单核吞噬白细胞的方法，所述方法包括：
(i)从个体血样中分离单核细胞，然后将所述单核细胞悬浮于合适培养基(在本文称为“培养基”)中；
(ii)处理来自同一个体的皮肤组织，去除表皮，将真皮部分在含有抗生素的培养基中进行超声处理，将经超声处理的真皮部分浸泡在含有抗生素的新鲜培养基中，然后用不含抗生素的新鲜培养基冲洗；
(iii)将步骤(i)的单核细胞与冲洗的步骤(ii)的真皮部分共培养；
(iv)去除所述培养混合物中的真皮部分，通过离心沉淀所得活化单核吞噬白细胞；
(v)洗涤所述活化单核吞噬白细胞并重悬于所述培养基中；和
(vi)评价所述培养物对人体给药的适应性。
在步骤(i)中，所述人单核细胞可通过任何常规方法从血样中分离出来。在一个实施方案中，单核细胞的分离方法包括下述步骤：
(a)稀释血液；
(b)通过将步骤(a)稀释的血液铺在菲可(Ficoll)上再通过离心分离所述单核细胞部分；
(c)洗涤步骤(b)分离的细胞并通过在珀可(Percoll)上进行密度梯度离心而进一步分离；和
(d)洗涤步骤(c)的分离的富含单核细胞的部分并将所述细胞悬浮于合适培养基中。
可用磷酸缓冲盐溶液(PBS)进行上述步骤(a)的全血稀释和步骤(c)和步骤(d)的细胞洗涤，然后可将上述步骤(d)的富含单核细胞的部分悬浮于合适培养基中。
本文所用的术语“合适培养基”是指适合于培养单核细胞的培养基，例如但不限于Iscove氏改良Dulbecco培养基(IMDM)和RPMI1640。对所述单核细胞和所述皮肤组织的处理均在该同一合适培养基中进行。
在人单核吞噬白细胞制备方法的步骤(ii)中，可以通过下述步骤来处理人皮肤组织：将来自同一个体的皮肤组织进行冷冻，解冻后将所述皮肤组织浸泡在由合适培养基(如IMDM或RPMI 1640)和抗生素组成的洗涤液中，然后在去除表皮之前切成小块，从而获得约0.1-5cm2、优选约0.5-2.0cm2或甚至更小的真皮块。然后将该真皮块置于无菌塑料容器中，其中将它们浸渍在相同的含抗生素的合适培养基中，所述抗生素例如但不限于氧氟沙星、万古霉素和庆大霉素，将所述容器放在装有去离子水的超声浴中并进行超声处理。然后将所述超声处理的真皮块浸泡在新鲜的含同样抗生素的合适培养基中，然后用新鲜的不含所述抗生素的培养基冲洗。所述真皮块可在例如超声浴中以35-40kHz的频率进行超声处理。
在培养步骤(iii)中，所述真皮块在超声处理后，浸泡在新鲜的含抗生素的合适培养基中并用不含抗生素的同样培养基冲洗，然后与单核细胞一起在5％CO2的大气压下于约36-38℃培养至多38小时。然后去除培养混合物中的真皮块，通过离心、洗涤和重悬于新鲜的合适培养基(优选IMDM)中，回收所述活化细胞。
在本发明的一个优选实施方案中，分离单核细胞的血样以及用于活化单核细胞的皮肤组织都是自体的，即它们是从将要接受所述活化单核吞噬白细胞的病人中获得的。然而，本发明也设想了同种异体单核细胞和皮肤组织的应用，但优选它们来自同一个体。
在本发明的另一个实施方案中，步骤(ii)的皮肤组织可以用组织工程皮肤替代。任何可利用的组织工程皮肤或组织工程皮肤等同物如人工皮肤，无论它们是否含有活细胞，都可按本发明来使用。如果组织工程皮肤没有活细胞，就不进行抗生素处理步骤。
在步骤(vi)中，为了了解适用于人体给药的所述细胞的特征，对一批获取的活化单核吞噬白细胞的样品进行一些或所有以下试验：
(a)无菌检查—所述细胞应该没有细菌、酵母和真菌污染。为了进行无菌检查，按照21 CFR section 610.12，过滤所述细胞，并检查细菌和真菌污染情况；
(b)细胞活力检查—培养物活力优选采用熟知的锥虫蓝染色排除法进行检查；
(c)细菌内毒素试验—按照现行美国药典，采用鲎变形细胞溶解物(LAL)试验，定量测定细胞培养物中的革兰氏阴性细菌内毒素含量；
(d)革兰氏染色—通过革兰氏染色技术检查细菌的存在与否；
(e)通过相差显微镜术并比较单核细胞与真皮块培养前的形态测量学分析/细胞质颗粒计数—在相差显微镜下，进行所述细胞的形态测量学分析和细胞质颗粒计数是所述活化巨噬细胞的非常重要试验；
(f)采用单克隆抗体通过流式细胞仪分析所述细胞群体的纯度，所述单克隆抗体是用来检测所述单核细胞CD14细胞膜标记的；
(g)白介素-1β(IL-1β)测定，IL-1β由活化巨噬细胞高水平分泌的；
(h)采用抗甘露糖受体的单克隆抗体、通过流式细胞仪测定培养后细胞表达甘露糖受体并与培养前的细胞相比，所述甘露糖受体被活化巨噬细胞高水平表达；
(i)采用抗CD54抗体标记(ICAM-1)的单克隆抗体，通过流式细胞仪测定细胞膜上表达的ICAM-1，所述ICAM-1在活化后在细胞膜上高水平表达；
(j)对由所述活化巨噬细胞分泌的脑源神经营养因子(BDNF)的测定；和
(k)对由所述活化巨噬细胞分泌的IL-6的测定。
如结果满意的话，那么整批细胞都可用于所述个体的细胞治疗。
当进行本发明方法的步骤(ii)时，发现在上述条件下超声处理所述皮肤组织时也导致所述皮肤组织的净化。因此，另一方面，本发明提供一种用于净化皮肤组织的方法，所述皮肤组织优选人皮肤组织，更优选人真皮组织，其中包括在含有抗生素的合适培养基中超声处理的皮肤组织。
按照本方法，可以处理人皮肤组织，再通过去除表皮，在含有抗生素的合适培养基(在本文称为“培养基”)中超声处理真皮部分，将经超声处理的真皮部分浸泡在含有抗生素的新鲜培养基中，然后用新鲜的不含抗生素的培养基冲洗。人皮肤组织的处理可以通过下述步骤进行：将皮肤组织进行冷冻，解冻后将所述皮肤组织浸泡在由合适培养基(优选IMDM)和抗生素组成的洗涤液，然后在去除表皮之前切成小块，从而获得约0.1-5cm2的真皮块，优选0.5-2.0cm2或或更小的真皮块。为了进行超声处理，可将所述真皮块置于无菌塑料容器中，其中将它们浸泡在含有抗生素的合适培养基(优选IMDM)中，所述抗生素例如但不限于氧氟沙星、万古霉素和庆大霉素，将所述容器放在装有去离子水的超声浴中并进行超声处理，然后将经超声处理的真皮块浸泡在含同样抗生素的新鲜培养基(优选IMDM)中并用不含所述抗生素的新鲜培养基冲洗。所述真皮块可在例如超声浴中以35-40kHz的频率进行超声处理。
表征了按本发明方法获得的人单核吞噬白细胞，它们代表新的细胞群体，因此构成本发明的另一方面。
按照本发明，发现了用本发明方法所获得的活化人单核吞噬白细胞的最重要特征是细胞质颗粒的数量。在相差显微镜下，这些颗粒呈高折光球体并呈浅蓝色，可容易地对其进行计数，如图1B所示。
因此，另一方面，本发明提供人单核吞噬白细胞培养物，在相差显微镜下，至少25％最多颗粒的细胞中显示出每个细胞内至少4个颗粒。在一个实施方案中，优选至少40％、更优选60％或更多的细胞为CD14+。在另一个实施方案中，所述细胞产生的IL-1β水平至少为17pg/106 CD14+细胞。
在再一个实施方案中，本发明提供本发明的活化人单核吞噬白细胞培养物，所述培养物具有下列特征a-k中的至少特征a-g：
(a)14天无菌；
(b)采用锥虫蓝染色排除法，至少80％培养物有活力；
(c)细菌内毒素试验，小于200Eu/ml的产品合规范；
(d)革兰氏染色，无细菌证据；
(e)形态测量学分析方面，至少25％最多颗粒的细胞中显示出每细胞内至少4个颗粒；
(f)至少40％、优选60％或60％以上的细胞为CD14阳性(CD14+)；
(g)细胞产生的IL-1β水平至少是17pg/106 CD14+细胞；
(h)与其所来源的非活化单核细胞相比，所述活化细胞在甘露糖受体表达方面呈统计学显著性增加；
(i)所述细胞表达ICAM-1受体的几何平均荧光值约200或更高；
(j)所述细胞分泌BDNF的水平高于10pg/106CD14+细胞；和
(k)所述活化细胞与其所来源的非活化单核细胞相比，分泌的IL-6约为后者的4-15倍。
在本发明的另一方面，制备包含人活化单核吞噬白细胞的细胞治疗制品，所述人活化单核吞噬白细胞与皮肤(或仅真皮)部分一起培养至多5天，优选至多38小时，更优选至多24小时。在一个优选实施方案中，所述起始单核细胞和所述真皮是自体的，并且是从将要接受所述终制品的病人中收集的。
在一个优选的实施方案中，准备用作终制品的所述细胞培养物由包含人活化单核吞噬白细胞，所述人活化单核吞噬白细胞至少40％、一般超过50％是巨噬细胞。从病人外周血中分离单核细胞，随后与从所述受伤病人收获的自体皮肤(从全厚度皮肤组织制备的真皮)一起培养。所述细胞治疗终制品包含悬浮于药学上可接受的载体(例如磷酸缓冲盐溶液(PBS))、或者优选悬浮于培养基(例如IMDM)或任何其它合适的细胞培养基(例如RPMI 1640)中的1-1000万个巨噬细胞，而其它合适的药学上可接受的载体是本领域技术人员熟知的。
本发明活化人单核吞噬白细胞表达伤口愈合表型，因而在治疗人类的以下病症方面是有益的：
(i)在CNS任何部位的损伤或疾病而导致或伴随轴突损伤(例如但不限于脑损伤、脊髓损伤或视神经损伤)后，促使轴突再生长。这样的损伤包括脊髓损伤、创伤包括钝器创伤、穿透性创伤、脑外伤或对侧外伤、神经外科手术或其它手术创伤、以及中风包括出血性中风或局部缺血性中风。
(ii)慢性皮肤溃疡愈合。在创伤组织居留的巨噬细胞在溃疡边缘没有被皮肤充分激活，并且与正常皮肤组织相比，缺乏激活炎性细胞的能力。将所述活化巨噬细胞应用于所述伤口，将会提高愈合的机会。
(iii)减少心肌梗塞病例的坏死组织体积。预期表达伤口愈合表型的本发明活化巨噬细胞对减少心肌梗塞病例的坏死组织体积是有益的。延迟停止或显著降低血液流向心肌导致心肌细胞死亡。心肌死亡导致心功能降低。因为肌细胞不能再生，所以死亡的心肌组织被无功能的瘢痕组织取代。从再生方面看，肌细胞与中枢神经系统轴突的再生能力的缺乏非常相似。如上所示的CNS中的轴突，例如在美国专利第6,117,424号中，也设想了心肌细胞不能再生的原因不在于所述细胞本身，而在于在局部缺血后适当时间内发生在梗塞部位的延迟和无效的炎症反应，这是因为数量不足的巨噬细胞作用缓慢。在梗塞过程相对早期时，在原位给予本发明活化巨噬细胞，可将坏死体积减至最小，因此挽救心功能。
所述活化巨噬细胞可在创伤或梗塞部位或在CNS损伤部位或其附近原位给药，但是任何其它合适的给药方式，特别是静脉内给药，也是本发明所预期的。
因此，本发明还提供一种用于促进中枢神经系统(CNS)轴突再生的方法，所述方法包括在导致或伴随轴突损伤的CNS损伤部位或其附近给予有需要的病人有效量的本发明的人单核吞噬白细胞。
在一个优选实施方案中，所述活化单核吞噬白细胞是自体的，所述损伤是脊髓损伤，治疗是在手术中进行，而且包括在脊髓实质的损伤部位给予所述病人的所述细胞。
本发明也提供一种用于伤口愈合(特别是慢性皮肤溃疡例如糖尿病性伤口溃疡和慢性腿部溃疡)的方法，所述方法包括在创伤部位给予有需要的病人有效量的本发明的单核吞噬白细胞。
本发明还提供一种用于减小心肌梗塞病例的坏死组织体积的方法，所述方法包括在心肌原位、优选在梗塞发生的相对早期给予有需要的病人有效量的本发明的单核吞噬白细胞。
现在，将通过以下非限制性实施例举例说明本发明。
                       实施例
实施例1.病人组织标本的采集
大约在给予细胞治疗终制品的前1天，采集病人血液和皮肤标本。采集约200-250ml血液，装入到含抗凝剂的采血袋中。从同一病人获取约15cm2全厚度皮肤(表皮和真皮)，转移到含IMDM和抗生素(16μg/ml氧氟沙星、20μg/ml万古霉素和50μg/ml庆大霉素)的“洗涤液”的容器中。将所述血液和皮肤标本从独立的隔热装置(所述装置的内部温度：对于血液1-10℃，对于皮肤至多38℃)转移到细胞处理中心，并在专用无菌室设施中进行处理(所有步骤均在100级/ISO 5级(联邦标准209E/ISO 14644-1)的生物安全工作橱中进行，所述生物安全工作橱放在10,000级/ISO 7级无菌室中)。
实施例2.单核细胞的分离
全血用磷酸缓冲盐溶液(PBS)稀释。将所述稀释血液铺在装有Ficoll-Paque_PLUS(Amersham-Pharmacia Biotech，瑞典)(密度：20℃时为1.076-1.078g/ml)的离心管中并进行离心，以获得所述单核细胞部分。然后将所述单核细胞用PBS洗涤3次。从第2次PBS洗涤取出含上清液和105细胞的等份样品，然后进行无菌检查。将所述洗涤的细胞部分铺在事先已通过离心制备好的珀可(Percoll_)梯度上。通过珀可梯度离心所述细胞，获得富含单核细胞的部分。该部分用PBS洗涤，然后重悬于IMDM中，直到进行培养步骤。取出经PBS洗涤的含上清液和105细胞的部分进行无菌检查。除了无菌检查外，还进行包括活细胞计数(锥虫蓝染料排除)及以下基础试验在内的质量控制试验来监控所述单核细胞分离过程：培养物纯度(％CD14+细胞)、细胞膜上甘露糖受体(MR)表达、IL-1β表达、ICAM-1表达(所有这三种试验都用流式细胞仪进行)和形态学观察/细胞质颗粒计数。
实施例3.对皮肤组织的处理
一到达细胞处理中心，立即将含有全厚度皮肤组织标本的皮肤容器放入冷柜(-18℃)至少1小时。然后将所述皮肤容器放入温箱(36-38℃)解冻，使得更加容易地消除红细胞。解冻后，将所述皮肤容器转移到100级生物安全工作橱中。将所述皮肤标本从开始的容器中取出，然后在盛有新鲜洗涤液(含有IMDM和抗生素，参见以上的实施例1)的容器中浸泡一会儿。用新的洗涤液容器重复浸泡。然后将所述皮肤切成小块，并去除表皮和取样进行微生物鉴别(参见下面)。将一块真皮切成两个约2mm2的切片，进行无菌检查。将所述真皮块浸泡在含新鲜洗涤液的容器中，并放置在超声浴的容器中以35-40kHz的频率超声处理约30-60分钟。然后将所述真皮组织转移到用新鲜洗涤液的新的无菌容器中并于36-38℃浸泡至少4.5小时。该步骤的主要目的是将与所述单核细胞培养期间的微生物污染危险性降至最低。在与所述单核细胞共培养前，将所述真皮块用新鲜培养基(不含抗生素)洗涤2次。取出2块约2mm2的切片进行无菌检查。
实施例4.将分离的单核细胞与真皮组织一起培养
将以上实施例2富含单核细胞的部分加入到盛有IMDM的无菌50ml培养管或组织培养瓶(每容器9-100×106个细胞)中。向各管中加入2决真皮。准备一支装有4.5-5.5×106细胞和一块真皮的“平行培养”管。所有管在5％CO2静态湿润培养箱中于36-38℃培养至多38小时，优选培养至多24小时(将所述“平行培养”管培养16.5-17.5小时)。约培养17小时后，第1次评价培养物的生长情况。从培养箱中移出带“平行培养”标记的含培养的巨噬细胞和真皮的管并停止培养。弃去真皮，然后评价所述细胞培养物的培养物纯度(在流式细胞仪上的CD14+细胞百分率)和活力(采用锥虫蓝染料排除法)。在培养20.5-21.5小时后，结束所述含主要培养物的管的培养周期。
在培养结束时，用无菌镊子将所述真皮块从所述主要培养管中取出并弃去。通过离心沉淀所述培养细胞，测定培养上清液样品中的内毒素含量，并进行革兰氏染色以进行细菌检查。将所述细胞沉淀合并，洗涤，并重悬于IMDM中。进行细胞计数和质量控制试验例如活力、显微镜形态学、培养物纯度(CD14+细胞百分率)、甘露糖受体表达、ICAM-1表达、细胞因子分泌和颗粒形态测量学分析/计数。将含105个培养细胞的部分加入到所述培养上清液样品中，进行无菌检查。将含上清液和5×105个细胞的样品送检支原体。收到所述细胞培养物纯度报告后，对所述细胞进行计数，随后用无酚红的IMDM洗涤。然后用无酚红的IMDM将所述细胞沉淀重新悬浮至所述细胞制剂的终体积。即将给予所述病人的所述细胞终制品的质量鉴定是基于质量控制试验结果符合预先制定的规范。
实施例5.最终的细胞治疗制品的制备
所述细胞治疗终制品含有悬浮于无酚红的IMDM的细胞，其浓度约为15,000-75,000个巨噬细胞/μl，优选30,000-40,000个巨噬细胞/μl。所述终剂量含有1-1000万个巨噬细胞、优选5-700万个巨噬细胞，并装入一个注射器中。
实施例6.质量控制程序和检测
6a.原料和包装成分
用于所述细胞生产的原料和包装成分，在接收它们用于所述制备过程之前，必须按照书面的标准操作程序(SOP)进行合适的质量控制评价。
6b.程序控制—生物学活性和安全性试验
本实施例回顾了所述培养人巨噬细胞培养物的主要的生物学和安全特征。本文提出的所述细胞终制品规范是基于采用来源于健康人的同种异体和自体血液和皮肤组织以及来源于迄今为止所治疗的病人的自体组织，而获得的这些特征的检测结果。众所周知，巨噬细胞是多功能性的，但它们的活性不太可能依赖于与特异性抗原的相互作用，而且它们在伤口愈合中执行其功能与损伤原因无关。
建立了“工艺控制计划”以控制生产过程并保证所述细胞治疗终制品的完整性。在生产过程的不同阶段对所述细胞培养物进行取样并检查细菌和真菌污染。这些试验评价了所述细胞治疗制品的无菌和内毒素水平。另外，对所述细胞的形态学特征和活力进行监控。对所述细胞培养物取样以评价免疫学特征、培养物纯度和生物学活性。也被监控和记录所述生产过程的产量。
所述细胞治疗终制品必须通过批合格规范。每个病人的细胞制品是独立的批次。所述标准包括如下规范：细胞表面CD14标记(通过流式细胞仪检验)、细胞形态学(在显微镜下)和细胞颗粒形态测量学分析、IL-1β的定量ELISA分析、培养物活力(锥虫蓝染料排除)、内毒素和革兰氏染色。过程中样品的中间无菌结果也是合格质量控制试验的一部分。不满足合格规范导致该批拒收。还可进行其它检验，如通过流式细胞仪检测甘露糖受体和ICAM-1表达、通过ELISA分析巨噬细胞分泌的白介素-6(IL-6)和支原体检查。所述合格标准不包括这些参数的规范。
为了评价制品无菌，从生产过程的不同阶段取样进行无菌检查。在无菌检查培养周期中，每日检查所述无菌培养基容器的内容物，如有任何显示所述样品不是无菌的阳性结果，立即向所述医师报告。
在皮肤制备过程中在分离的表皮上进行微生物检查和鉴别试验。预期这些培养物含有污染物(可能是正常皮肤菌群)，因此这并不是制品不合格的根据。分离这些培养物中检出的微生物，进行鉴定并测试其对抗生素的敏感性。
在以下阶段中对组织、上清液和细胞取样并进行无菌检查：真皮块(为共培养而制备)；单核细胞分离物(在菲可分离后)：上清液和细胞；富含单核细胞的部分分离物(在珀可分离后)：上清液和细胞；和培养的巨噬细胞制剂(共培养后)：上清液和细胞。除了这些无菌检查外，还要从所述病人的血液(在分离程序之前)中取样进行支原体检查。
实施例7.质量控制试验的描述
常规安全性试验
7a.无菌检查
按照21 CFR 610.12[FDA″General Biological Products Standards″(通用生物制品标准)]，依照样品的类型，采用直接转移法或者过滤法，对样品进行无菌检查。
在所述直接转移法中，将每个样品分为2份。将每份放入装有合适培养基(胰酶解豆酪蛋白培养基或巯基乙酸液体培养基)的容器中，将所述容器密封并于合适温度(对于胰酶解豆酪蛋白，20-25℃；而对于液体巯基乙酸，30-35℃)和时间(14天)进行培养。
在所述过滤法中，将所述样品通过安装在罐上的滤器装置进行过滤。将所述样品分为2份且每份通过不同的滤器装置过滤。每个滤器用冲洗液冲洗，然后加入合适培养基(胰酶解豆酪蛋白和液体巯基乙酸)——每罐加一种培养基。将每个罐密封并于合适温度和时间(如上所述)进行培养。
将用于无菌检查的本发明样品(也称为“接种物”)接种到含有所述试验培养基(巯基乙酸或所述胰酶解豆酪蛋白)的容器中，充分混合，然后在合适温度(巯基乙酸培养在30-35℃，胰酶解豆酪蛋白培养在20-25℃)下培养14天。接种1天后，目测检查含有所述单核细胞(+105个细胞)的第2次PBS洗涤的样品(和无菌检查培养基)的容器、富含单核细胞的部分(+105个细胞)的PBS洗涤液以及在共培养前所述经处理的真皮，检查其中有无生长。在此阶段所述试验培养基中的浑浊或雾状被认为是微生物污染的证据，从而导致该产品不合格。
14天培养期间通过每日检查进一步评价所有所述样品的无菌。当所述培养物在检查期间没有可见的浑浊时，则被认为是无菌的。
仅当没有鉴定出微生物污染时，才可以将一批制品给予病人。培养后，检查所述培养物中有无微生物生长。如果发现菌落，就对它们进行革兰氏染色，然后采用用于鉴定具体生物类型的不同生化试验进行检测。
7b.细菌内毒素检查
采用冻干鲎变形细胞溶解物(LAL)(Associates of Cape Cod，目录号G5003或G2003(PYROTELL))和/或冻干大肠杆菌控制标准内毒素(Associates of Cape Cod，目录号E005)(每批的实际值由其生产商标注)进行细菌内毒素检查。制品合格标准为＜200Eu/ml。
7c.革兰氏染色
仅当革兰氏染色结果为阴性时，才可以将一批制品给予病人。
生物学活性试验
7d.活细胞计数
采用锥虫蓝染料染色排除法进行细胞活力检查。该法是基于活细胞不摄取所述染料而死细胞摄取的原理。染色也使细胞形态容易观察。将0.4％(w/v)的锥虫蓝溶液与细胞悬液样品混合，然后转移到血细胞计数器中。在显微镜下，用400倍放大倍数对所述细胞进行计数。如果培养物活力≥80％时，该批制品合格。
7e.细胞形态学和细胞质颗粒计数
采用显微镜在400倍放大倍数下定性分析细胞形态学。检查的参数为大小、培养物中细胞颗粒和不规则。对珀可分离后和细胞洗涤(0时间)、以及共培养终止后的富含单核细胞的部分的样品进行显微镜检查。比较细胞在培养前后的差别。培养后，所述细胞应显示出相对较大、不规则和颗粒。
观察到的细胞颗粒是培养物在培养后非常特殊的特征。在相差显微镜下，这些颗粒呈高折光球体并呈浅蓝色，可以容易地对其进行计数。在培养前，细胞内的颗粒是罕见的，但在培养后却很普遍，并可能是由所述培养物的培养和处理特异性诱导而来。分析所述颗粒的目的是为了获得培养后巨噬细胞中细胞质颗粒发生率的数量测定。所述分析提供很好的结果，即在需要进行其它质量控制试验以及制品包装操作的时间内刚好可以得到该结果。
通过分析计算机图像，对所述颗粒进行计数。开始，所述颗粒值用所述样品中每个细胞所含的颗粒平均数表示。但是，在分析多批制品后，发现所述颗粒在细胞间并不是正常分布，而且培养物的颗粒最好用在25％最多颗粒细胞(最多的1/4)中每个细胞的颗粒数目来表示。在考虑到中值和其它四分位数后，选取了最多的1/4。其中，发现这样的最多1/4的颗粒的阈值每批间具有最小变异系数而且在显示细胞在培养前后的统计学平均差异中是最灵敏的。其结果示于表1。
                表1-培养前后细胞颗粒计数
培养前颗粒数/细胞数 培养后颗粒数/细胞数
平均值  1/4的最大阈值 平均值 1/4的最大阈值
计数批次 19  18 21 20
最小值-最大值 0.5-4.2  1.0-5.3  2.0-12.4  3.0-15.8
平均值 2.5  3.5  7.6  10.4
标准差 1.1  1.2  2.4  3.4
根据这些结果，用最多1/4的细胞颗粒≥4个颗粒/细胞(即在25％最多颗粒细胞中至少4个颗粒)作为所述终制品用于病人的必要参数。通过这种方法测定的所有临床批次和大多数研究批次在最多1/4部分的每个细胞中含有至少4个颗粒。采用至少为60个细胞的样本量，选择最多1/4部分的颗粒阈值作为测量参数以及每个细胞4个颗粒为下限，是基于对所述细胞在培养前后间差异的最大灵敏度的需要。所选择的参数是检查多个批次中最小变异系数的参数。这样使对各样品间(如培养前后的细胞间)真实差异的灵敏度最大化。
为了进行颗粒计数，从新鲜制备的“富含单核细胞”部分(培养前)取样以及在一天后从“培养细胞”部分(培养后)取样。每一部分的新鲜样品进行显微镜检查。将样品放在显微镜玻片上，随后放置至少15分钟使所述细胞沉降，在显微镜下调整焦距。采用显微镜在100倍物镜和相差下检查所述细胞，并用数码相机拍照。在盖玻片下样品区被分为4个象限，系统观察每个象限以避免对同一细胞观察两次。对进入视野的细胞拍照直到每一象限拍照15个细胞。这样每个样品便得到60个细胞的照片。在每一拍照视野中，调节焦距使能看见的颗粒数目最大化。将所述数码照片转移到计算机中储存，随后进行分析。采用图像分析软件对细胞照片进行分析并评价颗粒。通过图像分析的计算机图像分析对所述颗粒进行计数。
在所有批次中，所述细胞与真皮培养后颗粒数有很明显的增加。结果表明，在与真皮培养的细胞中平均颗粒增加超过200％。
由此可下的结论是细胞颗粒是反映所述巨噬细胞在培养中经历的表型变化的一个参数。
图1A-1B分别是非颗粒型单核细胞(培养前)和颗粒型单核吞噬白细胞(培养后)的照片。
7f.培养物纯度—通过流式细胞仪测定CD14
通过流式细胞仪，用针对人CD14(一种已建立好的对人单核细胞/巨噬细胞有特异性的细胞表面标记)的单克隆抗体(mAb)监控细胞培养物的纯度。通过用市售的荧光色素缀合的mAb攻击，对所述细胞进行标记，然后用PBS洗涤。对CD14阳性的细胞部分被用来测量培养物纯度。分析培养前后所述参数。所培养的巨噬细胞培养物的纯度作为产品合格标准，应为≥40％CD14+细胞，优选60％或更高的CD14+细胞。
7g.甘露糖受体表达测定
甘露糖受体(MR)是一个参与酵母细胞吞噬作用的碳水化合物缀合的膜蛋白。采用对人甘露糖受体特异性的市售荧光色素缀合的mAb，用流式细胞仪测定细胞表面所述甘露糖受体的存在。将所述细胞与所述mAb一起温育，并按前述方法洗涤。对甘露糖受体阳性的细胞部分被认为是显示了潜在的细胞吞噬活性以及细胞成熟。对培养前后的所述细胞都进行这项分析。
为了提高对所述MR表达量小而明显增加的检测能力，以三重试验检测从所述“富含单核细胞”部分(与真皮共培养前)中获取的细胞。以双重试验检测从与真皮共培养后获取的细胞。以此方式，对两组独立的三重和双重测试分别进行统计学分析。
将在21小时(共培养后)的两组MR表达检测结果与在0小时的三组检测的结果相比。进行t-检验分析并在95-置信水平测定差异(在21小时的增加与在0小时的比较)的显著性。当与培养前水平相比时，培养后细胞申存在的MR表达的统计学显著性增加是有意义的，说明所述细胞培养物经历了特异性触发需求并将在体内持续发生神经再生表型。
7h.ICAM-1表达测定
细胞间相互作用部分是由粘着分子家族介导。胞间粘着分子(ICAM)是免疫球蛋白超基因家族结构上相关的成员并且是白细胞上存在的β2整联蛋白分子的配体。ICAM-1在内皮细胞和一些淋巴细胞和单核细胞上是组成型表达的。在细胞因子(TNFα、IL-1β和IFN-γ)的存在下其表达显著增加，因此显示出与细胞活化的关系。而且，已报道ICAM-1的作用是作为在神经损伤后巨噬细胞摄取的髓磷脂的共同刺激信号(Vougioukas等，2000，Involvement of intercellularadhesion molecule-1 in myelin recognition by macrophages(巨噬细胞的髓磷脂识别中涉及胞间粘着分子-1).Acta Neuropathol(Berl)，99：673-79)。
采用市售的特异性mAb免疫标记细胞，用流式细胞仪进行分析，以测定CD14+细胞中所述ICAM-1受体的表达。在与皮肤共培养后的细胞中增强了所述ICAM-1受体的表达。
7i.白介素-1β测定
IL-1β的产生是所述单核细胞与真皮培养的直接结果，而且该细胞因子是由终制品中的巨噬细胞分泌的。按照以下程序评价IL-1β水平：将1.4×106共培养的细胞转移到无菌试管中，离心并重悬于IMDM中。将所述细胞悬液在5％CO2湿润培养箱中于36-37℃培养30分钟。培养30分钟后，将所述试管离心，通过ELISA，采用市售试剂盒检测其IL-1β水平。计算每百万被测定为CD14+细胞的巨噬细胞的结果。至少17pg/106 CD14+细胞的结果是可接受的。
7j.BDNF测定
通过ELISA，采用市售试剂盒如Human BDNF DuoSet Elisadevelopment System(R&D目录号DY248)，测定细胞条件培养基中的BDNF水平。
分离人血源单核细胞，按上述方法与真皮一起培养。培养后，通过离心(380xg，10分钟，10℃)收获细胞。在1.4ml新鲜的IMDM中重新悬浮1.4×106个收获细胞以制备适合细胞的培养基，然后在湿润培养箱(5％CO2)中于37℃培养30分钟。然后将所述培养基酸化(通过加入56μL 1M HCl)，5分钟后，用56μL 1M NaOH中和。离心沉淀细胞后收集滗出的条件培养基并于-70℃冷冻直到测定。
采用所述BNDF试剂盒的同一供应商的合适市售ELISA检测试剂盒，测定这些样品中的其它神经营养因子如NT-3和NT-4。
7k.IL-6测定
通过ELISA，采用市售试剂盒，测定培养前所述单核细胞上清液和所获取的活化巨噬细胞的上清液中的IL-6水平。培养后巨噬细胞分泌的细胞因子IL-6水平是培养前单核细胞的4-15倍。
实施例8.在患有完全脊髓损伤的病人中，活化巨噬细胞促进部分感觉和运动功能恢复。
在I期临床试验中，向脊髓损伤部位直接注射4,000,000个自体巨噬细胞(按上述实施例所描述的与真皮培养后)，对8名完全脊髓损伤病人(按照美国脊髓损伤协会的分类定为ASIA A)进行治疗。他们中的3人恢复了运动和感觉功能并被重新归类于ASIA C。与所述损伤类型有关的人员统计数据示于表2。运动和感觉评分、允许(开始)参与研究的病人的ASIA分类和所述病人最后随访的ASIA分类示于下表3。以相对于开始检查的％增加值表示轻触、针刺(疼痛)和运动的恢复。
按照迄今获得的临床发现，没有发生与进行所述疗法的相关不良事件。
已观察到临床功效的开始迹象。在3个病人发现明显的感觉恢复和一些运动恢复，其中1号病人还达到了小便控制。
表2.完全脊髓损伤病人用局部注射自体活化巨噬细胞治疗后的特征
  病人编号     损伤原因 性别 年龄   神经学水平   损伤后治疗天数   最后随访检查的月份
  1     交通事故     女     19   T6   14   21
  2     跌落     男     31   C6   11   15
  3     交通事故     男     30   T6   9   15
  4     运动事故     男     20   T6   12   10
  5     跌落     男     41   T11   14   6
  6     交通事故     男     24   T6   14   6
  7     交通(运动)事故     男     19   T5   14   4
  8     交通事故     男     26   T5   10   6
表3.病人在允许(开始)参加本研究时和在最后随访时的运动和感觉评分和ASIA分类
  病人编号   随访月份(月)      ASIA等级          运动评分           轻触评分            针刺评分
  开始   结束   开始   结束   ％恢复*   开始   结束   ％恢复*   开始   结束   ％恢复*
  1   21   A   C   50   72   44   57   81   42   53   81   53
  2   18   A   C   20     34   70   40   77   92   40   68   70
  3   15   A   C   50     55   10   54   74   37   53   76   43
  4**   10   A   A   45     50** *   -   52   52   0   48   52   8
  5**   6   A   A   50     50   0   66   72   9   66   67   1
  6   6   A   A   46     46** *   0   49   54   10   44   50   14
  7   4   A   A   50     50   0   47   51   9   46   48   4
  8   3   A   A   40     50** *   -   50   50   0   48   55   15
相对于开始检查。*
手术中目测发现脊髓严重液化。**
除了所述脊髓损伤外，这3个病人的运动评分还受到上肢损伤的影响。***
这些结果表明，自体共培养人巨噬细胞经体外测定证明显示创伤-愈合表型。此外，已显示这些巨噬细胞促进人CNS再生，正如这些细胞能促进其它组织伤口愈合的实施例一样。
实施例9.给予培养的巨噬细胞作为急性心肌梗塞疗法的效果
下文用于检测活化巨噬细胞在两组Sprague-Dawley(SD)雄性大鼠(体重为300±20g)(Harlan Laboratories，Israel)的效果：用含有2.5×106个巨噬细胞和DCCM1培养基的25μl悬液治疗A组大鼠(12只大鼠)，而只用25μl DCCM1培养基治疗B组大鼠(6只大鼠)。
按照本文描述的程序或按照美国专利第5,800,812号、第6,117,424号和第6,267,955号所描述的程序，生产所述活化大鼠巨噬细胞，给药前，通过流式细胞仪检测巨噬细胞培养物的纯度和活性。
在SD大鼠中采用冠状动脉结扎诱导心肌局部缺血。所导致的坏死组织大小约为50mm3，这样的大小是我们通常在其它实验中用悬浮于5μl DCCM1培养基中的约400,000个活化巨噬细胞治疗的脊髓残留部分大小的约6倍。
以盲法方式，由外科医生将所述活化巨噬细胞植入到所述SD大鼠体内。与用于治疗脊髓横切的大鼠约400,000个细胞的数量相比，使用约6倍剂量的活化巨噬细胞。因此，将外推的总有效剂量(悬浮于25μl DCCM1培养基的2.5×106个活化巨噬细胞)分为5个剂量，然后在诱导梗死后立即注射到心肌中：向梗死中心注射一个剂量，接着在梗死与健康组织的边缘注射另外4个剂量。使用Hamilton注射器，通过22G针头进行所述注射。动物放在动物房中恢复，让它们自由吃喝，并处于12/12小时光/暗周期下。随后观察结果持续6周。本研究中存活率是关键参数。
所述结果的评价是以盲法方式进行，采用Masson三色染色片，对左心室(LV)横切片进行组织学评价，以评价梗塞区、LV腔直径和LV质量区。采用TUNEL染色片，评价细胞凋亡。进行巨噬细胞特异性染色，以评价正常心肌、边缘心肌或梗塞心肌的存在和位置。通过免疫组织化学染色，用针对增殖细胞核抗原(PCNA)特异性单克隆抗体，测定有丝分裂指数。为了进行数据分析，对每个参数都进行统计学分析。

Claims (34)

1.一种制备人单核吞噬白细胞的方法，所述方法包括：
(i)从个体血样中分离单核细胞，然后将所述单核细胞悬浮于合适培养基中，所述合适培养基在本文称为“培养基”；
(ii)处理来自同一个体的皮肤组织，去除表皮，将真皮部分在含有抗生素的培养基中进行超声处理，将所述经超声处理的真皮部分浸泡在含有抗生素的新鲜培养基中，然后用不含抗生素的新鲜培养基冲洗；
(iii)将步骤(i)的单核细胞与步骤(ii)的经冲洗的真皮部分共培养；
(iv)去除所述培养混合物中的所述真皮部分，然后通过离心使所获得的活化单核吞噬白细胞沉淀；
(v)洗涤所述活化单核吞噬白细胞，然后将其重悬于所述培养基中；和
(vi)评价所述培养物对人体给药的适应性。
2.一种权利要求1的方法，其中在步骤(ii)中处理所述人皮肤组织如下进行：通过将来自所述个体的皮肤组织进行冷冻，解冻后将所述皮肤组织用由培养基和抗生素组成的洗涤液浸泡，在去除表皮之前切成小块，从而获得约0.1-5cm2、优选约0.5-2cm2的真皮块。
3.一种权利要求2的方法，其中将所述真皮块转移至无菌容器中并使其浸渍在含有抗生素的培养基中，将所述容器放在装有去离子水的超声浴中并进行超声处理，然后将经超声处理的真皮块浸泡在含有同样抗生素的新鲜培养基中，最后用不含所述抗生素的新鲜培养基冲洗。
4.一种权利要求1-3中任一项的方法，其中所述培养基是IMDM或RPMI 1640，而所述抗生素是氧氟沙星、万古霉素和庆大霉素。
5.一种权利要求1的方法，其中所述真皮块在超声浴中以35-40kHz的频率进行超声处理。
6.一种权利要求1的方法，其中在步骤(iii)中所述单核细胞与所述真皮块的培养是在5％CO2的氛围下于约36-38℃培养至多38小时，更优选培养至多24小时。
7.一种权利要求1-6中任一项的方法，其中所述单核细胞和所述真皮块均是自体的。
8.一种权利要求1的方法，其中在步骤(ii)中用组织工程皮肤或组织工程皮肤等同物替代人皮肤组织。
9.一种权利要求1-8中任一项的方法，其中在步骤(vi)中通过至少以下试验来评价所述活化人单核吞噬白细胞对人体给药的适应性：(a)无菌检查；(b)细胞活力检查；(c)细菌内毒素试验；(d)革兰氏染色；(e)通过形态测量学分析的细胞质颗粒计数；(f)存在CD14+细胞；和(g)IL-1β的分泌水平。
10.一种权利要求9的方法，其中通过一个或多个以下试验进一步评价所述活化人单核吞噬白细胞对人体给药的适应性：甘露糖受体表达、ICAM-1表达、IL-6和BDNF的分泌。
11.一种权利要求1-10中任一项的方法，其中所产生的活化人单核吞噬白细胞至少表现出下列特征：
(a)14天无菌；
(b)采用锥虫蓝染色排除法，培养物活力至少为80％；
(c)细菌内毒素试验，小于200Eu/ml；
(d)革兰氏染色，无细菌证据；
(e)通过形态测量学分析，至少25％的最多颗粒的细胞中显示每个细胞内至少4个颗粒；
(f)至少40％、优选60％或60％以上的细胞为CD14阳性(CD14+)；和
(g)所述细胞产生的IL-1β水平至少为17pg/106CD14+细胞。
12.一种权利要求11的方法，其中所产生的活化人单核吞噬白细胞还表现出下列特征中的一个或多个特征：
(h)所述活化细胞与其所来源的非活化单核细胞相比，在所述甘露糖受体表达方面呈统计学显著性增加；
(i)所述细胞以约200或更高的几何平均荧光值表达所述ICAM-1受体；
(j)所述细胞以高于10pg/106 CD14+细胞的水平分泌BDNF；和
(k)所述活化细胞与其所来源的非活化单核细胞相比，前者分泌的IL-6约为后者的4-15倍。
13.一种人单核吞噬白细胞培养物，所述人单核吞噬白细胞培养物只要通过权利要求1-12中任一项的方法就能获得。
14.一种人单核吞噬白细胞培养物，在相差显微镜下，至少25％的最多颗粒的细胞中显示每个细胞内至少4个颗粒。
15.一种权利要求14的人单核吞噬白细胞培养物，其中至少40％、优选60％或60％以上的细胞为CD14+。
16.一种权利要求15的培养物，其中所述细胞产生的IL-1β水平至少为17pg/106 CD14+细胞。
17.一种权利要求14的人单核吞噬白细胞培养物，所述培养物至少表现出下列特征：
(a)14天无菌；
(b)采用锥虫蓝染色排除法，培养物活力至少为80％；
(c)细菌内毒素试验，小于200Eu/ml；
(d)革兰氏染色，无细菌证据；
(e)通过形态测量学分析，至少25％的最多颗粒的细胞中显示每个细胞内至少4个颗粒；
(f)至少40％、优选60％或60％以上的细胞为CD14阳性(CD14+)；和
(g)所述细胞产生的IL-1β水平至少为17pg/106 CD14+细胞。
18.一种权利要求17的人单核吞噬白细胞培养物，所述培养物还表现出下列特征中的一个或多个特征：
(h)所述活化细胞与其所来源的非活化单核细胞相比，在所述甘露糖受体表达方面呈统计学显著性增加；
(i)所述细胞以约200或更高的几何平均荧光值表达所述ICAM-1受体；
(j)所述细胞以高于10pg/106 CD14+细胞的水平分泌BDNF；和
(k)所述活化细胞与其所来源的非活化单核细胞相比，前者分泌的IL-6约为后者的4-15倍。
19.一种细胞治疗制剂，所述制剂包含权利要求13的活化人单核吞噬白细胞和药学上可接受的载体。
20.一种细胞治疗制剂，所述制剂包含权利要求14-19中任一项的活化人单核吞噬白细胞和药学上可接受的载体。
21.一种权利要求19或20的细胞治疗制剂，所述制剂用于伤口愈合。
22.一种权利要求21的细胞治疗制剂，所述制剂用于慢性皮肤溃疡愈合。
23.一种权利要求19或20的细胞治疗制剂，所述制剂用于促进轴突再生。
24.一种权利要求23的细胞治疗制剂，所述制剂在由CNS的轴突损伤引起的或伴有所述损伤的损伤或疾病后促进轴突再生。
25.一种权利要求24的细胞治疗制剂，其中所述损伤位于脊髓。
26.一种权利要求19或20的细胞治疗制剂，所述制剂用于减小心肌梗塞病例的坏死组织体积。
27.一种用于促进个体受伤脊髓的轴突再生的方法，所述方法包括给予所述个体有效量的一种权利要求13-18中任一项的自体活化单核吞噬白细胞培养物或一种权利要求19或20的细胞治疗制剂。
28.一种权利要求27的方法，其中将所述细胞给予脊髓实质的损伤部位或其附近，或者静脉内给予所述细胞。
29.一种使伤口愈合的方法，所述方法包括给予有需要的病人有效量的一种权利要求13-18中任一项的活化单核吞噬白细胞培养物或一种权利要求19或20的细胞治疗制剂，给药途径是给药到所述伤口或者静脉内给药。
30.一种权利要求29的方法，所述方法用于使慢性皮肤溃疡愈合，例如使糖尿病性伤口溃疡和慢性腿部溃疡愈合。
31.一种减小心肌梗塞病例的坏死组织体积的方法，所述方法包括给予有需要的病人有效量的权利要求13-18中任一项的单核吞噬白细胞或一种权利要求19或20的细胞治疗制剂，优选在所述梗塞发生的相对早期给药，给药途径是给药到心肌原位或者静脉内给药。
32.一种权利要求27-31中任一项的方法，其中所述单核吞噬白细胞是自体的。
33.一种净化皮肤组织的方法，所述方法包括在含有抗生素的合适培养基中超声处理皮肤组织。
34.一种权利要求33的方法，其中所述皮肤组织是真皮。
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