CN1289156C

CN1289156C - 组织工程自体角膜上皮及其制备方法

Info

Publication number: CN1289156C
Application number: CN 03150375
Authority: CN
Inventors: 韩斌; 田书彦; 杜彦侠; 张旭
Original assignee: 吕伟光
Current assignee: Lv Weiguang
Priority date: 2003-07-25
Filing date: 2003-07-25
Publication date: 2006-12-13
Anticipated expiration: 2023-07-25
Also published as: CN1569259A

Abstract

本发明公开了一种组织工程自体角膜上皮，它由纤维蛋白生物支架和附着在其上的来源于患者自体的角膜上皮干细胞和角膜上皮细胞构成。其制备方法是将来源于患者自体的角膜上皮干细胞在体外扩增和分化后，接种到纤维蛋白生物支架上进行培养，在体外构建组织工程自体角膜上皮。该组织工程自体角膜上皮，可用于制备角膜移植用的生物材料。本发明的优点是：1.降低或消除了免疫排斥反应；2.细胞培养过程不使用非人类来源的动物细胞滋养层和培养基，避免了传染性疾病的发生；3.生物支架能很好地支持角膜干细胞、上皮细胞的增殖分泌，并且该生物膜吸收迅速，加快愈合速度；4.手术操作简便：克服了以往产品难以辨认细胞生长面和需要多针缝合的问题。

Description

组织工程自体角膜上皮及其制备方法

技术领域

本发明涉及一种组织工程自体角膜上皮及其制备方法，属于组织工程领域。

背景技术

据统计，我国每年有400～500万角膜病患者在等待着角膜移植，但由于受传统思想的影响，捐献角膜者甚少，导致患者需要长时间等待方可得到适宜的角膜，延误了治疗。

为解决这个问题，人们发明了生物工程角膜，将从胚胎角膜缘组织或者另一侧眼睛的角膜缘获得的角膜干细胞在体外培养至第三、四代时构建在一个生物支架上，共同构成角膜上皮。可用于治疗各种原因导致的角膜损伤、脱落病人的角膜移植。经过临床观察，胚胎干细胞因为是异体的，几乎不能达到任何效果；而采用自体的角膜缘的上皮细胞构建于羊膜上的生物工程复合皮肤经过几百例的临床试验，总有效率达到75％，病人视力和功能恢复良好。但是，这种生物工程角膜上皮还存在着许多不足：

首先、由于生物工程角膜的角膜干细胞来源于于异体的胚胎角膜缘组织，而角膜干细胞最终要存活于患者的角膜缘中，该部位具有免疫细胞，因而无法避免免疫排斥反应，导致移植失败。

第二、生物支架采用胶原蛋白、隐形眼镜或羊膜，导致角膜干细胞和上皮细胞在其表面难以均匀生长，手术后降解速度缓慢，因而限制了临床应用。

以前的这种角膜缘细胞的生长都采用了鼠源性滋养层细胞，有潜在的非人类来源的传染，同时采用了胎牛血清作为培养基，又易于传染牛的传染病等。

发明内容

本发明的目的是提供一种组织工程自体角膜上皮。

本发明的另一个目的是提供这种组织工程自体角膜上皮的制备方法。

本发明的第三个目的是提供这种组织工程自体角膜上皮的应用。

为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

一种组织工程自体角膜上皮，它由纤维蛋白生物支架和附着在其上的来源于患者自体的角膜上皮干细胞和角膜上皮细胞构成。角膜上皮干细胞取自患者角膜缘部位，具有增殖能力，经培养，分裂为角膜上皮干细胞和TA细胞(transientamplifying cell)。TA细胞具有分化能力，分化成为角膜上皮细胞。

所述的角膜上皮干细胞和角膜上皮细胞是由来源于患者自体的角膜干细胞经体外扩增、培养得到的。

如果一个病人只有一侧眼角膜出现损伤，就用其另一侧的角膜缘作为供体，取1-2平方毫米的角膜缘组织，进行体外的增殖培养，将培养传代至第三、四代时的上皮细胞建于生物支架上，继续培养，进行移植。

所述纤维蛋白为人的纤维蛋白，它作为组织工程自体角膜上皮的生物支架，能支持角膜上皮干细胞和角膜上皮细胞的增殖并能保持干细胞特征，该支架能较快地被吸收，降解速度快，并且柔软，可折皱，便于手术操作。

一种制备组织工程自体角膜上皮的方法，是将来源于患者自体的角膜上皮干细胞在体外扩增和分化后，接种到纤维蛋白生物支架上进行培养，在体外构建组织工程自体角膜上皮。

所述接种到纤维蛋白生物支架上进行培养是指：采用人的纤维蛋白原为材料，按照浓度为1-8mg/ml，加入1-5unit/ml人的凝血因子和1-5μmol/mlCaCl₂，同时加入40000-60000个传代角膜培养细胞，室内温下混合，立刻构建于35mm的培养皿上，形成附着有自体角膜上皮干细胞和自体角膜上皮细胞胞的生物支架；在培养皿中加入2ml角膜细胞培养液，Sony CO₂培养箱，37℃，5％CO₂，继续培养。

组织工程自体角膜上皮，用于制备角膜移植用的生物材料，可移植到病人损伤角膜表面，从而修复和恢复角膜功能。

本发明的有益效果在于：

一、降低或消除了免疫排斥反应，成功分离出角膜干细胞，并在体外快速增殖、分化，并且具有正常角膜上皮干细胞和上皮细胞的特征和功能。

二、无传染性疾病的交叉传染问题：细胞培养过程不使用非人类来源的动物细胞滋养层和培养基，避免了传染性疾病的发生。

三、新的生物支架能很好的支持角膜干细胞、上皮细胞的增殖分泌，并且该生物膜吸收迅速，从而病人愈合速度明显加快(从以往可四个月减少到一个月)。

四、手术操作简便：克服了以往产品难以辨认细胞生长面和需要多针缝合的问题。

下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步说明。

附图说明

图1为本发明成品外观图

图2为患者手术前眼角膜图

图3为移植本发明后患者的眼角膜图

具体实施方式

从正常人的眼角膜中分离出干细胞，进行体外培养、增殖和分化，在二到三周内使这些细胞增殖数百万倍，然后将这些带有干细胞的上皮细胞种在一种生物膜上，从而长成生物工程角膜，将其移植到角膜损伤病人的病变部位，进行修复，使病人视力恢复。

实施例1、组织工程自体角膜上皮的制备

在确定取角膜组织之前，由具有执业医师资格的医务人员向患者或患者家属解释原因，争得患者或家属同意，角膜上皮的取材部位由具有执业医师资格的医务人员确定，并按照医院规定的手术原则取材。患者进行体检和化验，包括常规检验、传染病病原(如HIV、肝炎病毒等)的检查。所取的角膜上皮立即由专业人员放入无菌容器内，并立即冷藏(10℃以下)，然后按规定的标准操作程序处理。

一、角膜上皮组织样品处理及细胞培养传代

(一)提取健康细胞

1.手术室取材(百级空气净化)：从患者的另一侧正常眼角膜缘由专业医生取1×1mm组织块。

2.所取的角膜组织的保存：用含的DMEM培养液的15ml保存管中保存组织(4℃)。

3.在超净工作台中消毒、清洗，组织剪碎：用含100单位/ml青霉素和100mg/ml的链霉素的PBS冲洗组织3次，修剪多余的脂肪和皮下结绨组织。

4.组织消化(Sony CO₂培养箱)：将1mm×1mm组织块放置于35mm培养皿中加入浓度为0.05％的胰酶/EDTA液，消化。DMEM+FBS(美国Hyclone公司)培养液终止。

5.细胞分离：将消化后的组织块剪碎并用吸管打散。

6.离心：吹散后的细胞收集至离心管中，Backman公司控温离心机，25℃，1000转/min，离心5分钟，弃去上清液。

7.细胞鉴定

1)形态学：采用倒置光学显微镜观察。细胞多呈多角型，角为钝角，细胞呈圆性。细胞外观透明，细胞紧密联结成单层或多层。为典型正常的角膜上皮细胞。

2)细胞表型：采用Keratin角质蛋白3的抗体(美国ICN公司)进行细胞免疫抗原结合反应，鉴定为典型正常的角膜上皮细胞。

3)致癌性：采用裸鼠试验，见《美国FDA关于生物制品生产用细胞株鉴定和指控的考虑要点》，结果无致癌性。

4)无菌检测：按《中国生物制品规程》(2000版)通则《生物制品无菌试验规程》A/B项进行，结果符合无菌要求。

5)细胞存活率：采用台盼蓝(Trypan blue)染色法检查，核染色的细胞为死亡细胞，不着色的细胞为活细胞，计数总细胞数和死细胞数，计算细胞存活率。

细胞存活率＝[(总细胞数-死细胞数)/总细胞数]×100％

经测定，细胞存活率超过80％。

(二)细胞培养传代

1.细胞培养：在离心管中加入角膜无血清培养液(美国Sigma公司)，接种入1×35mm培养皿，Sony CO₂培养箱，37℃，5％CO₂，进行培养。

2.细胞传代：每隔2～3天换液1次，上皮细胞达到50～70％汇集细胞后传代。

二、构建组织工程自体角膜上皮

(一)制备

1.制备人纤维蛋白原

用200ml血浆在4℃离心，3500转/min，离心30分钟，弃上清液，加10ml注射用水，制成悬浊液，保存备用。

2.构建角膜上皮

1)采用人的纤维蛋白原为材料，按照浓度为1-8mg/ml，加入1-5unit/ml人的凝血因子(购于Sigma公司)和1-5μmol/ml钙离子(CaCl₂)，同时加入50000个传代至第三代的细胞，室内温下混合，立刻构建于35mm的培养皿上，形成附着有自体角膜上皮干细胞和自体角膜上皮细胞胞的生物支架。

2)在培养皿中加入2ml角膜细胞培养液(购于Sigma公司)，Sony CO₂培养箱，37℃，5％CO₂，继续培养，2天后可用于临床移植。

(二)检测

1.生物支架的检测

生物支架柔软，可折叠，并且具有很强的粘附性，眼观为一个淡白色的膜状。

1)pH值测定：取材料支架5g，加入pH7.0的蒸馏水15ml，于37℃下浸泡24小时，测pH，pH值在7.0-7.5之间。

2)体外降解试验：取材料支架，浸入37℃含蛋白酶(2mg/ml)的磷酸缓冲液中，浸泡24小时后，支架全部消失。

3)皮肤刺激和致敏试验：按GB/T16886.10-2000医疗器械生物评价第10部分：刺激与致敏试验规定进行试验，结果无致敏性。

4)细胞毒性按照GB/T16886.5-1997医疗器械生物评价第5部分：细胞毒性试验的规定进行试验，结果符合要求。

5)肌肉植入试验按GB/T16886.6-1997医疗器械生物评价第6部分：植入后局部反应试验中规定的方法进行，结果无局部反应。

6)遗传毒性试验按照GB/T16886.3-1997医疗器械生物评价第3部分中规定的方法进行试验，结果无毒性。

2.成品检测

1)外观：呈半透明膜状，厚薄均匀，有光泽。

2)规格尺寸：直径为20-35mm的圆形。

3)弹性和强度：折叠和变形时组织工程角膜上皮能恢复其初始和设计形状，保持完整。

4)组织学观察：将培养的成品进行常规组织学包埋处理，10％福尔马林固定、组织处理、石蜡包埋，切片后进行H-E染色，封片后光学显微镜观察。光镜下，未见明显的细菌生长，无明显的上皮或成纤维细胞退变或坏死，无局域性细胞无规则生长；可见体外培养的组织工程角膜上皮，具有大量的角膜上皮细胞。

5)无菌试验：按《中国生物制品规程》(2000版)通则《生物制品无菌试验规程》A/B项进行，结果符合无菌要求。

本发明的使用方法：产品使用前，用不含血清的培养液冲洗三次。角膜的移植，需要眼外科医生对病人进行360度的环状的病变部位切除，将生物工程角膜做四针缝合于环状切割部位，用隐形镜片压迫，将眼睑采用两针缝合，一周后拆除缝线，将有新生的角膜上皮形成。

产品的储存和运输应在2℃～10℃、阴凉、干燥、清洁、避免阳光直射、无腐蚀性气体、无重压的环境中进行。

本发明主要应用于烧伤，化学烧伤，眼表皮肿瘤，过敏性、放射性损伤，遗传性眼病，眼表面化脓和其他眼综合症导致的眼角膜上皮细胞脱落，结膜覆盖于眼角膜表面而致的失明。

实施例2、临床报告

一、诊断标准

角膜缘干细胞缺乏诊断标准：角膜缘新生血管生长或角膜上皮结膜化大于或等于一个象限。

角膜上皮长期缺损诊断标准：角膜上皮缺损时间7天以上。

病因诊断：

1.酸、碱等化学烧伤及热烧伤

2.药物过敏

3.各种原因所致的角膜缘大量浅层新生血管

4.复发性翼状胬肉

二、纳入病例标准

1.符合角膜缘干细胞缺乏或角膜上皮长期缺损诊断标准。

2.患者年龄≥12岁，可配合各项检查。

3.单眼患病，对侧眼无明显眼病史。

4.签署知情同意书者。

5.基础泪液分泌试验≥5mm(滤纸统一规格)。

6.裂隙灯检查

角膜及结膜无明显感染及免疫性炎症表现。

角膜新生血管位于上皮下及基质浅层(≤1/4角膜厚度)。

睑球粘连≤2个象限。

睑裂闭合完全。无眼睑内翻倒睫。

三、健眼取材

术前检查血、尿常规，肝、肾功能，澳抗，爱滋病抗体。

术前点用抗生素眼药水3天，4次/天。

取材应在正规手术室、显微镜下进行。

取材部位：颞上或颞下角膜缘，大小为1×2mm²，深度为基质前。

四、实验室体外培养

标本取材后立即置于保存液中，放在2℃-10℃的保温箱中运输及保存，于6小时内进行培养，以生物工程组织为载体培养自体角膜缘干细胞，并符合其组织工程自体角膜上皮注册产品标准。

五、剔除病例标准

角膜缘干细胞培养失败，培养所得的产品不符合产品标准者。

六、移植手术

1.术前点用抗生素眼药水3天，4次/天。

2.手术应在正规手术室显微镜下进行。

3.角膜上皮刮除范围应大于病变2mm²。

4.移植片与植床应贴合紧密，不应有积血或积液残留。

5.以8-0可吸收线间断缝合固定植片。

6.如有睑球粘连，应将结膜与角膜组织彻底分离，充分止血并将结膜后退。

7.术毕，术眼涂点必舒眼膏并包扎。

七、术后处理

1.连续包扎2天，第三天打开点药。

2.口服抗生素3天，打开包扎后点用点必舒目液1周，4次/天。可同时点用人工泪液，但禁用上皮生长因子。

八、疗效评定标准

(一)显效：

1.角膜新生血管减少在二级(含二级)以上或消失。

2.角膜上皮缺损修复在二级(含二级)以上或消失。

3.眼部自觉刺激症状减轻在二级(含二级)以上或消失。

(二)有效：

1.角膜新生血管减少在一级或以上。

2.角膜上皮缺损修复在一级或以上。

3.眼部自觉刺激症状减轻在一级或以上。

(三)无效：各项指标未达到上述标准者。

显效、有效的判定标准：为至少满足第(1)条加第(2)或第(3)条。

九、数据管理和统计

1.数据收集

所有入选病例均必须完成病例观察表，研究者将观察、检查结果及时、准确、完整、规范、真实地记录于病历及病例观察表中。

全部数据录入数据库并校对后，将数据库交统计分析人员进行统计分析，并提供统计报告，交临床试验的主要研究者写出临床总结报告。

2.统计分析

根据数据性质，对基础资料数据、疗效分析(各指标分析)及安全性分析、分别进行统计描述。

计量数据统计方法：观察组内前后变化情况采用配对样本t检验。

计数数据统计方法：采用确切概率法。

等级型数据统计方法：观察组内前后变化情况采用符号秩和检验。

3.统计软件：所有的统计均利用SAS JMP5.0软件进行统计学分析，采用双侧检验，以P≤0.05作为有统计学意义。

十、结论

本产品在北京市两家三甲医院进行了临床研究，共入选20例患者，经六个月观察后评价其对于角膜上皮长期缺损和角膜缘干细胞缺乏患者的角膜刺激症、角膜上皮缺损、角膜新生血管以及视力的改善情况，各主要观察指标的疗效如下：

1.角膜刺激症状：明显改善10例，改善4例，无改善6例，改善率70％

2.角膜上皮缺损：明显改善10例，改善6例，无改善4例，改善率80％

3.角膜新生血管：明显改善7例，改善6例，无改善7例，改善率65％

4.视力：明显改善2例，改善3例，无改善15例，改善率25％

总体评价：显效：(3)明显改善+(2)或(1)明显改善共计7例

有效：(3)改善+(2)或(1)明显改善或改善共计6例即总体有效13例，总有效率65％。

本说明书附图例举角膜新生血管型患者术前和术后的眼角膜情况图以作说明，分别见图2和图3，可以看出在手术移植本发明的组织工程自体角膜后，患者的病情得到了改善。

Claims

1、一种组织工程自体角膜上皮，其特征在于：它由纤维蛋白生物支架和附着在其上的来源于患者自体的角膜上皮干细胞和角膜上皮细胞构成；所述纤维蛋白为人的纤维蛋白。

2、根据权利要求1所述的组织工程自体角膜上皮，其特征在于：所述的角膜上皮干细胞和角膜上皮细胞是由来源于患者自体的角膜干细胞经体外扩增、培养得到的。

3、一种制备组织工程自体角膜上皮的方法，是将来源于患者自体的角膜上皮干细胞在体外扩增和分化后，接种到纤维蛋白生物支架上进行培养，在体外构建组织工程自体角膜上皮；所述纤维蛋白为人的纤维蛋白。

4、根据权利要求3所述的组织工程自体复合皮肤的制备方法，其特征在于：所述接种到纤维蛋白生物支架上进行培养是指：采用人的纤维蛋白原为材料，按照浓度为1-8mg/ml，加入1-5unit/ml人的凝血因子和1-5μmol/mlCaCl₂，同时加入40000-60000个传代角膜培养细胞，室内温下混合，立刻构建于35mm的培养皿上，形成附着有自体角膜上皮干细胞和自体角膜上皮细胞胞的生物支架；在培养皿中加入2ml角膜细胞培养液，Sony CO₂培养箱，37℃，5％CO₂，继续培养。

5、权利要求1或2所述的组织工程自体角膜上皮，用于制备角膜移植用的生物材料。