CN1832750A - 破壁萌发激活的灵芝孢子对脊髓损伤治疗以及受损脊髓中的神经干细胞增殖和/或分化的作用 - Google Patents

Abstract

本发明以向患者给予萌发激活的灵芝孢子(GASP)而提供治疗患者脊髓损伤的方法。GASP是破壁孢子。GASP在损伤脊髓中促进轴突再生并改进运动神经元存活。本发明还提供促进哺乳动物神经干细胞的增殖和/或分化的方法，其中包含给哺乳动物口服破壁萌发激活的灵芝孢子(GASP)。GASP对神经干细胞增殖和/或分化的作用在脊髓损伤后的哺乳动物中尤为显著。

Description

破壁萌发激活的灵芝孢子对脊髓损伤治疗以及 受损脊髓中的神经干细胞增殖和/或分化的作用

技术领域

本发明涉及通过给予脊髓损伤的哺乳动物破壁萌发激活的灵芝孢子(GASP)治疗哺乳动物脊髓损伤的方法。GASP对促进脊髓中轴突再生和改善运动神经元的存活尤为显著。本发明还涉及通过向哺乳动物给予破壁萌发激活的灵芝孢子(GASP)而促进哺乳动物神经干细胞的增殖和/或分化的方法，尤其是哺乳动物脊髓受损伤后促进神经干细胞的增殖和/或分化的方法。

发明背景

脊髓协调身体的运动和出入大脑的知觉。它是个含有神经细胞(也称为神经元)和支持细胞(也称为神经胶质细胞或胶质细胞)的复杂器官。典型的神经元由细胞体，若干短的辐射状突起(树突)和一个长的突起(轴突)组成，其中细胞体含细胞核及其周围细胞质(核周体)，而长的突起终止于细枝状分支(终树突)并且可以沿主干发出分支(侧突)。轴突及其包被或髓鞘一起形成神经纤维。神经胶质或胶质细胞形成神经组织的支持结构。有三种类型的胶质细胞，分别是星形细胞，少突细胞和小胶质细胞。星形细胞和少突细胞(统称大胶质细胞)起源于外胚层。这些细胞在数量上远远超过脑和脊髓中神经元的数目，并且发挥很多基本功能。少突细胞形成髓鞘使轴突绝缘并提高神经信号传导的速度与可靠性。星形细胞，大的星星形状的胶质细胞，调节神经元周围的液体组成。当中有些细胞还可以在损伤之后形成疤痕组织。小胶质细胞是中胚层起源的。它们是较小的细胞，在损伤应答时被激活并帮助清除废物。所有这些胶质细胞都产生支持神经元存活并影响轴突生长的物质。

有几种类型的神经元位于脊髓中并发挥脊髓功能。大的运动神经元有长轴来控制颈、躯干、和肢体中的骨骼肌。感觉神经元(也称为背根神经节细胞)有将信息从身体携带至脊髓的轴突。脊髓中间神经元，完全位于脊髓中，帮助整合感觉信息并产生控制肌肉的协调信号。

脊髓中很多轴突被称为髓磷脂的绝缘物质的鞘所包被，并使之呈现苍白色；所以，它们存在的区域被叫做“白质”。神经元自身，及其接受来自其它神经元信号的树状树突，构成“灰质”。灰质位于脊髓中心处蝴蝶形状的区域。和脑一样，脊髓包裹有三层膜(脑脊膜)：软膜，蛛网膜和硬膜。然后脊髓被称为脊椎的环状骨所包围。

脊髓和脑共同组成中枢神经系统(CNS)。与携带信号至肢体、躯干和身体其它部分的周围神经系统(PNS)的神经元不同，一般认为中枢神经系统的神经元在受损后无法再生(Walker， New Eng.J.Med.，(1991)324：1885-1887)。然而，近期的研究揭示受损的脊髓可以成功再生，其前提是遭破坏的神经元必须能从损伤中存活或被替换，并且轴突必须能够再生长并能找到适当的靶。轴突和他们的靶相互作用而构成突触，这种特化结构作为神经元之间的功能性连接而起作用。

脊髓长约为18英寸，从脑的底部沿着背中部向下，大致可及腰的位置。脊髓沿着长度走向分成若干节段。从脊髓出来通向身体其它部位发出分支的脊神经是下位运动神经元(LMN)。在每个脊椎的高度有31对脊神经出入并与身体特定的区域交流。颈部节段或颈区，称为C1至C8，控制通向颈、臂和手的信号。位于胸或上背部区域的节段(T1至T12)转递通向躯干和部分臂区域的信号。位于上腰部或紧接肋骨下面的中背部区域的节段(L1至L5)控制通向臀部和腿的信号。最后，骶骨节段(S1至S5)位于紧接中背部的腰部节段下方并控制通向腹股沟、趾和部分腿部区域的信号。不同节段处脊髓损伤的后果反映这种组织结构。

脑和脊髓的神经元对信号的响应不同于包括外周神经系统(PNS)在内的身体的多数其它细胞。脑和脊髓(即CNS)限制于保护它们的骨腔内，但也使得它们易受由于肿胀或力量损伤而造成的压迫伤害。CNS中的细胞代谢率非常高并依赖于血糖供能。所谓“安全因子”，即超过健康功能活动最小需求的正常血流的范围，其中CNS的“安全因子”要远小于其他组织。因此，CNS细胞对血流降低(缺血)尤为敏感。CNS的其他独特性质是“血脑屏障”和“血脊髓屏障”。这些屏障由CNS中血管内层的细胞构成，通过限制潜在的有害物质和免疫系统的细胞进入来保护神经元。创伤能够削弱这些屏障，可能促进脑和脊髓的进一步受损。血脊髓屏障还可以阻止有些潜在治疗药物进入。最后，在脑和脊髓中，胶质细胞和细胞外基质(细胞周围的物质)与周围神经中的的不同。PNS和CNS之间这些种种差别使得他们对损伤的反应不同。

尽管脊髓受到良好的保护，但由于比如创伤(如：车祸、暴力、摔落、运动)和疾病(如：脊髓灰质炎、脊柱裂、遗传性共济失调(Friedreich’s Ataxia))的原因仍会发生脊髓损伤。在美国，大概有450,000人患有脊髓损伤，并且每年大约10,000个新增病例，他们大多数是16到30岁间的男性。脊髓损伤可分为完全损伤(损伤水平以下的丧失运动和感觉功能)和不完全损伤(具有原发损伤水平以下的部分功能)。由于神经元是已经高度特化的，并且不能分裂和产生新细胞，所以脊髓损伤的恢复更为困难。

通常，脊髓损伤不造成脊髓切断；而是使轴突受挤压。研究人员通过研究尸体解剖所获得的脊髓，已经识别出几种不同类型的脊髓损伤。最常见的脊髓损伤类型是挫伤(脊髓瘀伤)和压迫伤(压迫脊髓所至)。其他损伤类型包括裂伤(子弹或其他物体所致)和中央索综合症(central cord syndrome)。

脊髓轴突处发生的伤害在损伤发生后最初几个小时内是复杂的并且是阶段性的发生。正常血流被中断，导致有些脊髓组织的氧耗竭。血流入损伤部位引起肿胀，这将进一步压迫和破坏脊髓神经元。其化学环境变得具有破坏性，这主要是由于高活性分子如自由基的释放。这些分子破坏细胞膜，包括杀伤起初未受损的细胞。侵入损伤位点去清除残骸的巨嗜细胞也可以伤害未受损组织。非神经元细胞，如星形细胞，可能分裂太快，导致形成疤痕而阻碍受损的神经细胞轴突的再生长。

脊髓损伤后的早期事件可引起后继的其它类型伤害。在数周或数月内，可在损伤处形成内含脑脊液的囊肿。有代表性的是，疤痕组织围绕囊肿而生，产生永久性的腔，此腔可以延长并进一步破坏神经元。而且，起初未受损的神经细胞轴突也会丧失其髓鞘质。久而久之，这些和其他的事件能使更多组织退化和更多功能丧失。

脊髓损伤的有效药物治疗首先于20世纪90年代出现，此时第一个表现出能改善脊髓损伤恢复的药物甲基强的松龙从临床试验进入标准使用。NASCISII(National Acute Spinal Cord Injury Study II)试验，将甲基强的松龙与安慰剂以及药物纳洛酮进行比较的多中心临床试验，表明在人损伤后8小时内给予甲基强的松龙显著改善其恢复。给予甲基强的松龙的完全瘫痪的患者可平均恢复所丧失运动功能的20％，与之相比，未治疗的患者恢复所丧失运动功能的8％。部分瘫痪的患者平均恢复所丧失运动功能的75％，与之相比，未给药的患者恢复所丧失运动功能的59％。发生损伤超出8小时后，给予纳洛酮或甲基强的松龙的患者，与给予安慰剂的患者相比，并没有显著改善。(National Institutesof Health，“Spinal Cord Injury：Emerging Concepts”，(1996)www.ninds.nih.gov/health_and_medical/pubs)。甲基强的松龙的临床试验结果使思想发生了革命性变化，认为存在一个脊髓损伤的急性治疗的时机窗。

当今，更多的药物正在进行治疗脊髓损伤的测试。例如，美国专利6,291,493公开了氯美噻唑(即5-(2-氯乙基)-4-甲基噻唑)治疗脊髓压迫造成的病理状况的用途，无论是创伤导致的还是由于肿瘤、出血、感染或椎管狭窄所致的压迫。美国专利6,288,069公开了9-取代次黄嘌呤衍生物(如N-4-羧基苯基-3-(6-桥氧氢化嘌呤-9-基)丙酰胺(N-4-carboxyphenyl-3-(6-oxohydropurin-9-yl)propanamide))刺激哺乳动物运动神经元或哺乳动物感觉神经元的再生或存活的用途。美国专利6,143,714公开了肝细胞生长因子(HGF)促进运动神经元的存活、生长和分化的用途。

最近，已有报道发现在成年CNS中特定区域，如嗅球和海马齿状回中的神经元可以更新，其中嗅球将来自嗅觉器官的神经元的信号传递到脑。因为神经元无法分裂，增加新的神经元提示未成熟细胞即祖细胞或干细胞的存在，它们可以产生神经元。

干细胞是未分化的细胞，能够增殖、自我维持和产生大量分化的功能性的后代，从而使损伤后的组织再生。自早期胚胎囊胚中，即形成原肠胚之前分离的干细胞能够产生所有不同谱系的细胞类型(Keller，Curr.Opin. Cell Biol.，7：862-869(1995)。然而，成年个体中的干细胞是在替换因细胞自然死亡、损伤或疾病而损失的细胞中发挥作用。当移植入脑中的时候，这些神经干细胞存活下来并且分化成为神经元和神经胶质细胞(Johansson et al.， Cell(1999)，96(1)：25-34)。在脊髓当中也存在一定数量的神经干细胞。它们是成年哺乳动物中脊髓中央管的室管膜中的增殖细胞(Frisen et al.， J.Cell Biol.(1995)，131：453-464；Yamamoto et al.， Exp.Neurol.(2001)，172：115-127))。一种分离室管膜神经干细胞的方法最近已于美国专利6,541,247中描述。

通过培养来自成年大鼠脑和脊髓的细胞，首次证明在成年哺乳动物的中枢神经系统中存在神经干细胞。在某些培养条件下，成群的多能神经干细胞可以增殖。(Reynolds et al.， Science(1992)255：1707-1710)。于此条件下，单个细胞体外增殖并且其后代形成聚集的细胞簇。经过几天的体外培养之后，这些细胞克隆从培养皿上脱离。细胞继续增殖形成紧密成簇细胞的特征性球形细胞聚集体，该聚集体被称为神经球，所有细胞全部来自同一个细胞。神经球中的多数细胞表达巢蛋白(nestin)，一种于神经上皮干细胞中发现的中间丝(Lendahl etal.， Cell(1990)，60：585-595)，但不是分化细胞特有的标志物。如果铺板于粘附性基质或向培养基中加入血清的话，这些未分化的细胞将快速分化。重要的是，来自单个细胞的细胞克隆可以产生神经元、星形细胞和少突细胞，这表明至少该起始细胞是多能的(Reynolds et al， Science，ibid.)。而且，如果细胞克隆被分散开来，很多细胞会形成新的未分化的多能细胞簇，因此，满足作为干细胞的标准。

哺乳动物中枢神经系统的发育起始于胚胎发育早期阶段，并且在出生后仍然继续进行(U.S.Patent No.6,497,872)。神经发育第一步是细胞诞生，干细胞以及干细胞后代(即子干细胞和祖细胞)按照精确的时间空间顺序增殖。增殖中的细胞可以产生神经母细胞、胶质母细胞和新的干细胞。

第二步是细胞类型分化和迁移时期，此时未分化的祖细胞分化成神经母细胞和胶质母细胞，产生神经元和胶质细胞并迁移至它们的最终位置。来源于神经管的细胞产生中枢神经系统的神经元和神经胶质，而来源于神经嵴的细胞产生周围神经系统(PNS)。发育中出现的某些因子，如神经生长因子(NGF)，可以促进神经细胞生长。NGF由神经嵴细胞所分泌并刺激神经元轴突出芽和生长。

当细胞获得特异性表型特征时，例如表达特定的神经递质，发育的第三步便会发生。此时，神经元也延伸其突起，这些突起在其靶标上形成突触。神经元主要产生在胚胎阶段，而少突细胞和星形细胞产生于出生后早期。到出生后晚期，CNS具有其定量的全部神经细胞。

CNS发育的最终步骤是选择性的细胞死亡，其中特异性细胞的退化和死亡、纤维和突触连接“精细调节”神经系统的复杂回路。这一精细调节贯穿整个个体生命历程。生命晚期，由于衰老、感染和其他未知病因引起的选择性退化可导致神经退行性疾病。

不断增多的证据证明神经系统损伤可能影响到成年CNS中的干细胞。脑和脊髓损伤之后，中央管内层以及室下区(subventricular zone)的细胞中巢蛋白表达分别增加(Frisen et al.， J.Cell Biol.，Ibid.)。这些细胞可能起源于干细胞。随着时间继续，从中央管和侧脑室中进一步逐渐看到表达巢蛋白的细胞，并且这些细胞表达星状标志物(Frisen et al.， J.Cell Biol.，ibid.)。这些数据表明位于脑室系统的干细胞或祖细胞经诱导而增殖、迁移至损伤处并分化为星形细胞。

目前，还没有方法于临床实践中在神经系统中刺激产生新的细胞。移植人胚胎或动物的细胞已经用于临床试验并取得可喜结果。然而，这些方法还有些问题，主要是伦理问题和免疫问题，这使得它们极其不可能用于任何更大数目的患者中。因此，发现哺乳动物成年CNS中神经干细胞的增殖和分化因子是重要的，这使开发刺激产生新的神经元或胶质细胞的策略成为可能。

最近，Cheung et al.， FEBS Lett.(2000)，486：291-296公开，使用原始神经元细胞系统(即PC12细胞)，以赤芝(Ganoderma lucidum)提取物能于体外诱导神经元分化。PC12来源于响应神经生长因子(NGF)的大鼠嗜铬细胞瘤细胞。Cheung et al.所述的赤芝提取物是用赤芝的果实制得的。

在后面段落中要描述的发明中，用来自赤芝的破壁萌发激活的灵芝孢子(GASP)来治疗脊髓损伤的新用途被实施。以前已经公开GASP用于治疗癌症、AIDS、肝炎、糖尿病和心血管疾病的患者，并且GASP能防止或抑制自由基氧化和肝毒性效应。参见美国专利U.S.Patent Nos.6,316,002和6,468,542，通过参考引入此处。甲基强的松龙必须在损伤发生后的8小时内给予患者才有效，但不同于此，在晚得多的时间内给予人和哺乳动物GASP仍能够获得显著改善。使用GASP的另一个益处是没有毒性，所以可以给患者开更高剂量GASP的处方。

另外，还描述GASP的一个新用途，其中GASP作为有效、安全和实用的替代物来诱导损伤CNS的自身神经干细胞增殖和迁移至损伤区域并进一步分化成神经元来替换损伤的或丧失的神经元。

发明内容

本发明通过给予脊髓损伤后的哺乳动物，优选人，有效量的萌发激活的灵芝孢子来提供治疗脊髓损伤的有效方法。灵芝(Ganoderma lucidum Leyss ex Fr.Karst)是一种多孔真菌。它属于担子菌纲，多孔菌科，灵芝属。GASP是破壁孢子。GASP优选在所述脊髓损伤一天内以口服形式给予哺乳动物。

脊髓损伤原因包括压迫或切割脊髓(例如切割脊髓腹根，或者切割或挤压坐骨神经)、创伤(例如车祸、暴力、摔落、运动等)、或疾病(例如脊髓灰质炎、脊柱裂、遗传性共济失调)。另外，脊髓损伤也可以是由受损脊髓内的神经元破坏或死亡、或者受损脊髓内的轴突挤压引起的。

GASP优选以口服形式、每天每千克体重约0.5-15g的量给予包括人在内的哺乳动物，优选量为每天每千克体重约8g。

通过向脊髓受损的哺乳动物，优选人，给予有效量的GASP，本发明还提供改善脊髓受损后神经元尤其是运动神经元存活的方法。GASP是破壁孢子。优选在脊髓损伤1天内给予哺乳动物GASP。GASP的有效量是每天每千克体重约0.5-15g，优选量为每天每千克体重约8g。

在另一个实施方案中，提供在脊髓损伤后促进轴突再生的方法，所述方法要求将有效量的GASP给予，优选经口给予脊髓损伤的哺乳动物，优选人。GASP是破壁孢子。优选在脊髓损伤1天内经口给予哺乳动物每天每千克体重约0.5-15g的GASP，优选量为每天每千克体重约8g。

在另一个实施方案中，提供促进哺乳动物神经干细胞增殖和/或分化的方法。所述方法要求将有效量的破壁的、萌发激活的灵芝孢子(GASP)给予哺乳动物，优选人。GASP对于哺乳动物脊髓损伤后促进神经干细胞增殖和/或分化尤其有效。脊髓损伤包括，但并不限于压迫或割断脊髓、创伤(如车祸、暴力、摔落、运动等)、或疾病(例如脊髓灰质炎、脊柱裂、遗传性共济失调)。另外，脊髓损伤也可以是由受损脊髓内的神经元破坏或死亡、或者受损脊髓内的轴突挤压引起的。优选GASP以口服形式以每天每千克体重约0.5-15g的量给予哺乳动物，包括人，优选量为每天每千克体重约8g。

附图说明

图1表示在实施例1和2中使用的动物模型的右侧L3、L4和L5上的神经腹根切断位点。

图2表示右侧腹根切断后35天，中性红染色的脊髓图像。在图像中存活的运动神经元被染为红色并且作为以蓝色背景衬托的紫色点显示。如对照组(A)所示，损伤(右)一侧的运动神经元存活数目显著少于非损伤(左)一侧。如GASP处理组(B)所示，损伤(右)与非损伤(左)一侧的运动神经元存活数目没有统计学显著性，这表明GASP可有效促进由于腹根切断造成的脊髓损伤后的腰部运动神经元存活。

图3表示神经组织的图像，首先用烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸-心肌黄酶(NADPH-d)染色并用中性红复染。图(A)和图(B)分别是对照组大鼠腹根切断后第14和35天的神经组织的图像。图(C)和图(D)分别是GASP处理组大鼠腹根切断后第14和35天的神经组织的图像。存活的运动神经元被中性红染色。图(A)和图(C)中的箭头指向神经元一氧化氮合酶(nNOS)活性为阳性的神经元，并且该神经元染为紫色。腹根切断后第14天，与对照组(A)相比，GASP处理组(C)的神经组织中出现高数目的nNOS-阳性神经元，表明在脊髓损伤后GASP能有效促进运动神经元存活。

图4表示神经组织的图像(放大倍数为100×)，首先用烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸心肌黄酶(NADPH-d)染色并用中性红复染。图(A)和图(B)分别表示腹根切断后第14天对照组和GASP处理组大鼠的神经组织图像。存活的运动神经元被中性红染色。箭头指向神经一氧化氮合酶(nNOS)活性为阳性的神经元，并且该神经元染为紫色。

图5表示实施例3-6中使用的动物模型右侧坐骨神经的切断位点。

图6表示右侧坐骨神经切断接着将神经束膜层重新缝合之后用逆行示踪剂荧光金(FluoroGold，FG)标记的L4脊髓切片图像。图(A)和图(B)分别表示对照组的非损伤(左)和损伤(右)侧。图(C)和图(D)分别表示GASP处理组的非损伤(左)和损伤(右)侧。比较各组非损伤侧的FG-标记的神经元数目(参见(A)和(C))。对照组中损伤侧(B)的FG-标记的神经元数目远少于GASP处理组(D)，表明GASP能有效促进损伤运动神经元轴突的再生。

图7表示右侧坐骨神经切断并重新缝合之后，对照组的未损伤侧(A)和损伤侧(C)以及GASP组的未损伤侧(B)和损伤侧(D)坐骨神经的传导图。测量峰-峰值和电脉冲传导速度。比较图(C)和图(D)发现，图(D)中的峰-峰值和电脉冲传导速度更高并且更快，表明GASP处理能够改善损伤的坐骨神经中电脉冲传导。这提示GASP处理六周能有效促进损伤坐骨神经的轴突再生。

图8表示正常腓肠肌(calf muscle)(A)、坐骨神经切断后6周的对照组的腓肠肌(B)、坐骨神经切断后6周的GASP处理组的腓肠肌(C)的苏木精-伊红(H&E)染色图像。如图(A)所示正常腓肠肌组织是规则的、光滑并且呈现平行模式。对照组腓肠肌(B)呈现出明显的不规则，而GASP处理组的腓肠肌(C)保留大部分正常模式。这提示在脊髓损伤后GASP能够保护腓肠肌。

图9表示坐骨神经切断后对照组(A)以及GASP处理组(B)修复的坐骨神经组织的Mallory染色图像。染成红色来表示神经纤维再生，多见于GASP处理组(B)中的坐骨神经而在对照组(A)中则显著减少。表明GASP可有效促进神经纤维再生。

图10表示大鼠正常脊髓横断面的BrdU荧光免疫组化染色图像。箭头(↑)表示200倍放大的荧光显微镜下脊髓中央管室管膜中BrdU-阳性的细胞。室管膜是脑室和脊髓中央管的内层膜。

图11表示脊髓损伤后1天的大鼠脊髓横断面的BrdU荧光免疫组化染色图像。箭头(↑)表示200倍放大的荧光显微镜下脊髓中央管室管膜及其周围区域中BrdU-阳性的细胞。

图12表示脊髓损伤后1天的大鼠脊髓横断面的巢蛋白荧光免疫组化染色图像。箭头(↑)表示200倍放大的荧光显微镜下脊髓中央管室管膜及其周围区域中巢蛋白-阳性的细胞。

图13表示脊髓损伤后4周的大鼠脊髓横断面的巢蛋白荧光免疫组化染色图像。箭头(↑)表示200倍放大的荧光显微镜下损伤/处理组损伤的白质中巢蛋白-阳性的细胞。

图14A表示脊髓损伤后4周的大鼠脊髓横断面的BrdU和巢蛋白的双重荧光免疫组化染色图像。箭头(↑)表示200倍放大的荧光显微镜下损伤/处理组损伤脊髓的白质中BrdU-阳性的细胞。

图14B与图14A所示相同。箭头(↑)表示200倍放大的荧光显微镜下有些BrdU-阳性的细胞也表达巢蛋白。

图15A表示脊髓损伤后4周的大鼠脊髓横断面的BrdU和NF双重荧光免疫组化染色图像。箭头(↑)表示200倍放大的荧光显微镜下损伤/处理组的脊髓白质中BrdU-阳性的细胞。

图15B与图15A所示相同。箭头(↑)表示200倍放大的荧光显微镜下有些BrdU-阳性的细胞也表达NF。

图16A表示脊髓损伤后4周的大鼠脊髓横断面的BrdU和少树突细胞因子(oligodendrocytin)的双重荧光免疫组化染色图像。箭头(↑)表示200倍放大的荧光显微镜下损伤/处理组的脊髓白质中BrdU-阳性的细胞。

图16B与图16A所示相同。箭头(↑)表示200倍放大的荧光显微镜下有些BrdU-阳性的细胞也表达少树突细胞因子(oligodendrocytin)。

图17A表示脊髓损伤后4周的大鼠脊髓横断面的BrdU和GFAP的双重荧光免疫组化染色图像。箭头(↑)表示200倍放大的荧光显微镜下损伤/处理组的脊髓白质中BrdU-阳性的细胞。

图17B与图17A所示相同。箭头(↑)表示200倍放大的荧光显微镜下有些BrdU-阳性的细胞也表达GFAP。

具体实施方式

本发明提供能有效治疗脊髓损伤的方法和促进，尤其是在脊髓损伤之后促进哺乳动物神经干细胞的增殖和/或分化方法。所述方法包括给予脊髓损伤的哺乳动物有效量的萌发激活的灵芝孢子粉。

灵芝(Ganoderma lucidum Leyss ex Fr.Karst)是一种多孔真菌，属于担子菌纲，多孔菌科，灵芝属。灵芝孢子很小呈雾状，大小在5-8μm之间，具有极为坚硬和韧性的双层孢子外壁，使得它们很难被打开。孢子含有高浓度的很多种生物活性物质，包括但不限于多不饱和脂肪酸、多糖、维生素、甾醇、痕量矿物质、氨基酸和三萜类。本发明使用的GASP是破壁孢子(即孢子双层外壁破裂使得释放出孢子内的生物活性物质)，其生产方法已经在美国专利U.S.PatentNo.6,316,002(‘002专利)中描述。‘002专利的全部内容引入此处作为参考。经过‘002专利中描述的独特的破孢子方法，GASP中的生物活性物质以高产率被回收，并且成功保留生物活性物质的功能活性。

如下所述为专利‘002中所用方法的一般描述，所述方法可以获得GASP：

I.浸泡来诱导萌发：仔细选出成熟完整的赤芝孢子，将其浸泡来诱导其萌发。孢子保存于洁净水或蒸馏水、生物盐水溶液或可以使赤芝孢子快速萌发的其他营养溶液中。营养溶液的实例包括椰子汁或1-5％麦芽提取液、0.5-25％的赤芝孢子果提取物或赤芝孢丝、0.1-5％含生物素的培养液、0.1-3％含磷酸二氢钾和硫酸镁的培养液。溶液的选择依赖于所需的浸泡时间、待处理的孢子量和其他如材料有效性之类的因素。可使用一种或多种上述萌发溶液，加入量为赤芝孢子重量的0.1-5倍。浸泡时间可取决于水的温度，通常情况下是在水温为20-43℃时浸泡30分钟到8小时。优选浸泡时间为2-4小时，水温为25-35℃。

II.激活培养：从浸泡液中取出赤芝孢子，并沥干多余水分。之后孢子置于通风良好的培养箱中保持温度和湿度恒定进行激活。培养的相对湿度通常设为65-98％，培养温度为18-48℃，激活时间持续30分钟至24小时。优选的湿度为85-97％，温度为25-35℃。用本发明提供的方法，赤芝孢子的激活率达到95％以上。激活期间，红色赤芝孢子的细胞壁明显变软，因此更加容易渗透孢子的细胞壁。

III.孢子外壁处理：萌发激活之后，用酶解作用来处理孢子。该过程在低温且能保持酶活性的条件下进行，使用几丁质酶、纤维素酶或工业中常用的其他酶。当孢子外壁不再坚韧而变得易碎时，该过程即结束。作为替代方案，可用物理处理法来穿透胞壁，例如，可使用微粉化、滚压、研磨、超高压微流处理以及工业常用的其他机械方法，其中穿透率为99％以上。

IV.干燥或提取：使用标准方法在低温下进行干燥，包括冻干或真空干燥等工业常用方法。获得的产物含水量少于4％。干燥之后，用水或醇或者通过薄膜浓缩来提取生物活性物质。提取的生物活性物质能够用透析来进一步纯化以保证在最终产物中没有污染物。

V.生物活性物质的药物剂型：生物活性物质可以制成纯化的粉、提取浸膏、注射液或口服剂型。本发明还包含使用公知手段和本领域已知的制造方法生产活性物质的药物制剂。另外，可用任何方便方法将生物活性物质制成各种剂型，包括片剂、胶囊、溶液剂、栓剂、喷鼻剂、不经肠道的剂型、或注射装置。给药方式的选择取决于患者的临床条件。根据所述方法制备的本发明的生物活性物质，包括活性基因、生物势促进剂(biotic potential promotor)的诱导剂、多细胞激活因子诱导剂、干扰素诱导剂、内酯A、灵芝多糖、灵芝孢子脂肪酸、灵芝孢子长链烷烃、灵芝三萜、甾醇、超氧化物歧化酶、维生素E、活性糖蛋白、某些生长因子、灵芝酸A、超氧化物歧化酶(SOD)、活性糖蛋白、多种活性酶和生长因子等等。这些生物活性物质作为整体有助于如下部分中所述的治疗作用。

GASP无毒。优选的给药方式是口服摄入。目前，GASP已被the Food andDrug Administration(FDA)批准用作膳食补充剂，以胶囊的形式，以Enhanvol和Holistol商品名称，由Enhan Technology Holdings International Co.，Ltd.inHong Kong销售。每粒GASP胶囊含0.3克GASP。作为膳食补充剂时，推荐剂量为每日四次，每次4粒。因此，对于60千克的成年人，作为膳食补充剂每日GASP剂量约为0.08g/kg体重/天。

然而，已经指出，当给予患者和动物8g/kg/天的GASP时，未发现生理和病理异常。已经给予动物0.5-15g/kg/天的GASP也表现出对治疗脊髓损伤的显著作用。然而，需知晓的是每个患者个体的用量依赖于多种因素，包括年龄、体重、基本健康状况、性别、饮食、给药时间、给药途径、排泄率、药物组合以及病情严重程度。出于这些原因，用量留给技术熟练的临床医师判断。

使用大鼠模型实施本发明。根据Metz et al.， J Neurotrauma(2000)，17(1)：1-17，从大鼠脊髓损伤后的功能、电生理和形态学的结果参数可以外推出人的相关结果，该文献作为参考并入此处。Metz等人从慢性脊髓损伤的人患者中采集数据，并与重物下落诱发的挫伤脊髓损伤的大鼠的数据相比较。结果提示在大鼠和人之间的功能、电生理和形态学结果中有相似关联，这证明在研究脊髓损伤后的功能、电生理和形态学变化以及新治疗策略的作用时，大鼠可用作适当的动物模型。

本发明中，使用五(5)种组织染色方法和五(5)种荧光神经元标记物。五种组织染色方法是中性红(见，如图2，3和图4)、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸心肌黄酶(NADPH-d)(见，如图3和4)、荧光金(见，如图6)、苏木精和伊红(见，如图8)以及Mallory染色法(见，如图9)。五种荧光神经元标记物为BrdU，巢蛋白、神经丝(NF)、少树突细胞因子(oligodendrocytin)、以及胶质细胞纤维酸性蛋白(GFAP)。荧光神经元标记物用于研究一般性细胞增殖(基于BrdU的染色)、未分化的神经干细胞(基于巢蛋白的染色)、由神经干细胞新生成的神经元(基于NF的染色)、由神经干细胞新生成的少突胶质细胞(基于oligodendrocytin的染色)、以及新生成的星形细胞(基于GFAP的染色)。

以下实验设计是举例说明性的，但不限制本发明范围。不偏离本发明范围，此处可以进行合理的改变，如技术人员所作的合理改动。

实施例1

GASP对腰部运动神经元存活的效果

动物模型：

广东省医学动物中心(Guangdong Medical Animal Center)提供的健康SD大鼠，选择体重约为100g的SD大鼠。

方法：

将SD大鼠分为两组，即GASP处理组和对照组。切断每只大鼠的L3、L4和L5腰部神经右侧腹根。(参见图1)。左侧腹根留作比较不作处理。

将GASP(20克)溶于100ml 0.5％的羧甲基纤维素钠中获得终浓度为20％的溶液。腹根切断约1天后，GASP处理组的大鼠通过灌胃方式给予GASP溶液，每天两次，每次约2ml，如此持续35天。GASP日剂量为8克每天每千克体重。对照组的大鼠按照相同方式给予相同量的0.5％羧甲基纤维素钠溶液，每天两次，如此持续35天。所有大鼠在相同条件下饲养。

处理末期，从各组中收集神经组织样本。脊髓节段用4％多聚甲醛固定，浸泡在含30％蔗糖的磷酸盐缓冲液(PBS)中，并且用冷冻切片法切成30μm厚度的片。每隔5片选一片，共选10片用中性红染色。切片中存活的神经元被染为红色并依照Clarke和Oppenheim法计数。对于每只大鼠，取10张神经切片中存活的运动神经元数目的平均数。

使用T检验做统计分析。

结果：

结果参见表1和图2。

表1.GASP对腰部神经腹根切断后的运动神经元存活的影响

	对照组(n＝6)	GASP处理组(n＝7)	P值*
				非损伤(左)侧存活的运动神经元数目损伤(右)侧存活的运动神经元数目P值**损伤(右)侧的存活率％***	15.02±0.866.43±1.49＜0.0156.88±3.20	15.45±0.8113.61±0.74＜0.0189.88±2.24	＞0.05＜0.01

^*p值表示对照组和GASP处理组之间的比较

^**p值表示同组内的非损伤(左)侧和损伤(右)侧的神经元数目的比较

^***存活率％测定为损伤(右)侧神经元数目对非损伤(左)侧神经元数目的百分比。

结果表明各组中非损伤侧存活的神经元数目相似。然而，切断L3、L4和L5神经后未处理的损伤一侧存活的运动神经元数目(6.43±1.49)显著低于其非损伤侧(15.02±0.86)以及GASP处理组损伤侧(13.61±0.74)存活的运动神经元数目。GASP处理组的存活率是90％，显著高于对照组(57％)。在中性红染色的脊髓组织(图2)中也观察到相似结果。

这些结果说明切断大鼠腹根后，以8克/天/千克的GASP处理35天能有效促进高达90％腰部运动神经元得以存活。

结论：

已表明GASP可有效促进切割类型的神经损伤后运动神经元的存活。

实施例2

GASP对腰部运动神经元存活的效果

受损的神经元中神经元一氧化氮合酶(nNOS)的活性意味着运动神经元的存活性。组化烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸心肌黄酶(NADPH-d)反应被认为是nNOS活性的合适标志物。因此，可以用NADPH-d染色法测定nNOS活性来确定运动神经元存活。

方法：

动物模型的制备、分组以及处理如前面实施例1中所述。

经过14天处理后，将各组五(5)只大鼠处死分别收集神经组织。继续用日剂量的GASP或羧甲基纤维素钠喂养各组其余的大鼠直到第35天。然后将各组其余的大鼠处死并分别收集神经组织。

脊髓组织节段在4％多聚甲醛中固定，浸泡在含30％蔗糖的磷酸盐缓冲液(PBS)中，并且用冷冻切片法切成30μm厚度的片。入选的神经组织切片在NADPH溶液中孵育1-3小时，漂洗后用1％中性红复染。

用T检验对处理组和对照组做统计分析。

结果：

神经组织nNOS活性的结果如表2和图3和4所示。

表2.GASP对腰部神经腹根切断14天后的运动神经元存活的影响

	对照组(n＝5)	GASP处理组(n＝5)	P值*
				非损伤(左)侧存活的运动神经元数目损伤(右)侧存活的运动神经元数目损伤(右)侧的nNOS-阳性率％**	13.69±0.701.41±0.2610.36±1.85	15.26±0.305.55±0.6038.29±4.37	＜0.01

^*p值表示对照组和GASP处理组之间的比较。

^**nNOS-阳性率％测定为腹根损伤(右)侧nNOS-阳性神经元数目对存活的神经元数目的百分比。

如表2和图3和4所示，腹根切断14天后，对照组非损伤侧存活的运动神经元(染为红色)数目与GASP处理组的相似。然而，对照组nNOS-阳性神经元(染为紫色)数目显著少于GASP处理组的。如图3(B)和3(D)所示，与对照组(B)中相比GASP处理组(D)中存活有更多运动神经元。结果表明GASP对促进腹根切断后的运动神经元存活有积极的效果。

结论：

已表明GASP对促进切割类型的脊髓损伤后神经元存活有效。

实施例3

GASP对受损轴突再生的效果

动物模型：

本研究中使用的是坐骨神经切断/重新缝合的大鼠模型。简言之，如图5所示，暴露并切断实验动物的一段右侧坐骨神经。通过显微外科技术重新缝合坐骨神经的两个开放末端的神经外膜层以获得动物模型，用来模拟切割/挤压所致的损伤。左侧坐骨神经留作比较之用不作处理。

方法：

动物模型的制备如前面实施例1和2中所述，被分为两组，GASP处理组和对照组。

将GASP(20克)溶于100ml 0.5％的羧甲基纤维素钠中获得终浓度为20％的溶液。腹根切断约1天后，GASP处理组的大鼠通过灌胃方式给予GASP溶液，每天两次，每次约2ml。GASP日剂量为8克每天每千克体重。对照组的大鼠按照相同方式给予相同量的0.5％羧甲基纤维素钠溶液，每天两次。所有大鼠在相同条件下饲养。

荧光金(FG)，一种逆行荧光示踪剂，用于示踪轴突再生。用微注射器将2.5μl 3％的FG溶液注入坐骨神经的损伤(右)和非损伤(左)侧。在损伤一侧(右)，注射位点距离损伤位点5mm处。将L4脊髓从试验大鼠中取出，冷冻切片并在荧光显微镜下观察。“FG％”计算为同一动物中损伤侧的FG-阳性神经元数目对非损伤侧的神经元数目的百分比。

用T检验进行统计分析。

结果：

使用FG的轴突再生研究结果如表3和图6所示。

表3.GASP对受损轴突再生的影响

FG-阳性神经元	对照组(n＝5)	GASP处理组(n＝5)	P值*
				非损伤(左)侧损伤(右)侧P值**FG％***	18.27±0.973.37±0.38＜0.0117.89±4.41	16.99±0.969.75±0.64＜0.0159.41±3.47	＞0.05＜0.01

^*p值表示对照组和GASP处理组之间的比较

^**p值表示同组内的非损伤(左)侧和损伤(右)侧的神经元数目的比较

^***FG％计算为损伤(右)侧FG-阳性的神经元数目对非损伤(左)侧FG-阳性的神经元数目的百分比。

FG是一种逆行荧光示踪剂。将其注射于切断/重新缝合损伤的远端，因此，检测脊髓区域FG-标记的神经元可以表示轴突再生。

如表3和图6所示，各组非损伤侧FG-标记的神经元数目相似，而各组损伤侧FG-标记的神经元数目显著更低。然而，GASP处理组损伤侧FG-标记的神经元数目表现为显著高于对照组损伤侧FG-标记的神经元数目。

根据坐骨神经损伤和非损伤侧FG-标记的神经元计数，轴突的再生率(％)的测定可通过坐骨神经损伤侧FG-标记的神经元的数目除以同一动物坐骨神经非损伤侧FG-标记的神经元的数目来获得。基于这一计算，对照组的轴突再生率约为18％而GASP处理组的轴突再生率约为59％。

结论：

已表明GASP可以有效治疗脊髓挤压损伤，尤其是促进轴突再生。

实施例4

GASP对受损轴突再生的电生理影响

方法：

动物模型的制备如前面实施例3中所述。

使用或不用GASP处理六周后，将大鼠麻醉并暴露出坐骨神经和腓肠神经。将电刺激器附于修复一侧的中间，将记录电极置于远端。给予电刺激后，示踪并记录沿神经传导的电脉冲。在非损伤一侧执行同样操作。测定损伤和非损伤侧的坐骨神经传导速度。将损伤侧对非损伤侧传导速度的比率作为轴突再生的标志。测定沿着损伤和非损伤侧神经传导的电脉冲的峰-峰值，将其用作轴突再生的指标。

用T检验进行统计分析。

结果：

结果参见表4和图7。

表4.GASP对受损轴突再生的电生理影响

峰-峰值(mV)	对照组(n＝5)	GASP处理组(n＝5)	P值*
				非损伤(左)侧损伤(右)侧P值**％***	14.44±0.140.74±0.01＜0.015.13±0.08	19.30±0.157.75±0.09＜0.0140.19±0.51	＞0.05＜0.01

^*p值表示对照组和GASP处理组之间的比较

^**p值表示同组内的非损伤(左)侧和损伤(右)侧的神经元数目的比较

^***“％”计算为损伤(右)侧对非损伤(左)侧测量峰-峰值的百分比。

切断坐骨神经并将其外层重新缝合到一起后，沿着神经并跨过损伤位点的电脉冲传导对神经轴突再生有指示性。如表4和图7(A)和图7(B)所示，从峰-峰值和传导速度而言，各组非损伤侧的电脉冲传导相似。然而，对照组损伤侧的电脉冲传导几乎完全终止(表4和图7(C))。相比较，在GASP处理组损伤侧，约40％的电刺激以稍稍偏低的速度跨过损伤位点沿着坐骨神经传导。这些结果表明坐骨神经切断并将其外层重新缝合之后，8克每天每千克体重的GASP处理6周能够有效促进大鼠的轴突再生。

结论：

已表明GASP能有效促进挤压类型脊髓损伤的轴突再生。

实施例5

GASP对受损轴突再生的效果

方法：

动物模型的制备和处理如前面实施例3中所述。

使用或不用GASP处理六周之后，取出每只大鼠损伤和非损伤侧的腓肠肌(musculus peronaeus longus)。称重并记录分离出的肌肉。确定分离的肌肉的萎缩情况。之后将分离的肌肉进行苏木精-伊红(H&E染色)染色用于组织学研究。

结果：

从对照组损伤侧中分离出的腓肠肌呈现出明显的肌肉萎缩和减重。如图8(A)所示，正常的腓肠肌组织表现出规则的、平滑的、和平行的模式。对照组中的腓肠肌(图8(B))呈现出明显的非规则性，而GASP处理组的腓肠肌(图8(C))维持大部分正常模式。这表明GASP有保护神经损伤后腓肠肌的作用。

结论：

已表明GASP在脊髓神经损伤后促进对肌肉的保护。

实施例6

GASP对受损轴突的神经纤维再生的效果

方法：

动物模型的制备和处理如前面实施例3中所述。

经过六周的处理，取出每只大鼠损伤和非损伤侧的坐骨神经轴突。固定分离的神经组织，制成切片并进行Mallory染色。

结果：

如图9所示，染成红色表示神经纤维再生，主要在GASP处理组(图9(B))的神经组织中观察到，而在对照组中则显著减少(图9(A))。这表明在坐骨神经切断再将其外层重新缝合后，GASP可有效促进大鼠神经纤维再生。

结论：

已表明GASP可有效促进挤压神经损伤后的神经纤维再生。

实施例7

脊髓对切动物模型的制备，BrdU注射和GASP处理

动物分组：

从中山大学实验动物中心购买二十六(26)只雌性SD大鼠(150-180克)。动物分为3组：正常对照组(2只)、损伤/对照组(12只：1天组中有2只，2周和4周组各5只)以及损伤/处理组(12只：1天组中有2只，2周和4周组各5只)。

动物模型的制备：

通过腹腔注射1％戊巴比妥钠(35-40mg/kg)将损伤/对照组和损伤/处理组的大鼠麻醉。在中线处切开大鼠背部皮肤。在外科显微镜下暴露出胸(T)12脊髓节段并且对切脊髓右侧。手术后，肌肉注射青霉素。

注射BrdU和处理：

给所有三组中的动物注射BrdU(50mg/kg)，每天两次，如此持续10天。脊髓损伤后，通过灌胃方式给予损伤/处理组的动物每天每千克体重8g的GASP溶液，每天两次。而损伤/对照组的动物通过灌胃给予5％羧甲基纤维素钠溶液(即GASP溶液中的溶剂)。GASP由Enhan Technology HoldingsInternational Co.，Ltd.提供。胸苷类似物，5-BrdU，常规用于研究DNA合成和细胞增殖。5-BrdU是非放射性分子。在细胞生长的S-期(合成期)BrdU按化学计量组成替换DNA中的胸腺嘧啶，在介于G1和G2细胞阶段之间的S期中细胞的DNA含量加倍。其中掺入的BrdU的量与新DNA的量即S-期细胞的状态和定位相关。因此，检测BrdU替代的DNA在功能上与细胞周期S-期期间的DNA合成相关。

实施例8

灌注、固定和取样

脊髓损伤后1天、2周和4周时，通过腹腔注射1％戊巴比妥钠将相应组的动物麻醉。打开麻醉的动物胸腔从左心室将一根导管插入主动脉。首先给动物快速灌注生理盐水，接下来灌注含4％多聚甲醛的0.1M PBS(PH 7.4)来固定动物组织。收集T8至L1脊髓节段，并置于新鲜配置的固定液中固定4小时，然后置于30％蔗糖溶液于4℃下孵育过夜。T10、T11、T12、T13和L1脊髓节段在横断面处连续冷冻切片制成30μm厚度的切片。

实施例9

荧光免疫组化

首先用0.01M PBS将脊髓横断面切片漂洗3次，每次漂洗持续约5分钟。将脊髓切片于37℃下在2N HCl中浸泡30分钟，之后37℃下在0.1M硼酸钠缓冲液(pH 8.3)中浸泡15分钟，37℃下在20.2％ Triton X-100中30分钟。然后将脊髓切片于37℃下在正常绵羊血清中孵育20分钟。滴加小鼠抗BrdU一抗后将脊髓切片于37℃下继续孵育2小时。用0.01M PBS将脊髓横断面切片漂洗3次，每次5分钟。滴加生物素偶联的二抗后将脊髓切片于37℃下孵育30分钟。用0.01M PBS将脊髓横断面切片漂洗3次，每次5分钟。滴加SABC-cys3荧光复合体溶液将脊髓切片于37℃下孵育30分钟。用0.01MPBS将脊髓横断面切片漂洗3次，每次5分钟。对于负对照，将一抗替换为PBS。其余步骤与上述相同。

完成BrdU染色后，将每只大鼠的脊髓切片分成4份，每份分别用巢蛋白(神经干细胞标记物)、NF(神经元标记物)、少树突细胞因子(少突细胞标记物)和GFAP(星形细胞标记物)的荧光免疫组化染色处理。

在放大倍数为10×20的荧光显微镜下，计算脊髓横割面切片的中央管室管膜的BrdU-阳性细胞数目。对于每只大鼠，计算10个脊髓切片并以此确定每个脊髓切片的中央管室管膜中BrdU-阳性细胞的平均数。每组的计算结果表示为中央管室管膜的BrdU-阳性细胞数目平均值±标准差。对两类样本的平均值进行t检验。

实施例7-9的结果：

1.正常的脊髓中央管室管膜

在正常对照组颈和胸部位的脊髓横割面中，中央管室管膜细胞呈圆形，但是在腰部区域则呈椭圆形。为了定位室管膜细胞的增殖，主要计数室管膜中BrdU-阳性细胞数目。这是因为大多数BrdU-阳性细胞位于室管膜(图10)。只有少部分BrdU-阳性细胞分布在脊髓的白质和灰质。检测巢蛋白的表达即能达到对神经干细胞计数的目的。结果表明室管膜中仅有少数巢蛋白-阳性细胞。

2.脊髓对切后脊髓中央管的室管膜细胞增殖和巢蛋白表达

脊髓损伤后1天，中央管室管膜细胞层变厚。脊髓对切后BrdU-阳性细胞显著增加(图11)，与正常对照组相比在损伤动物中观察到更多的BrdU-阳性细胞。与此同时，与正常对照组相比，在脊髓对切后的脊髓白质和灰质中观察到更多的BrdU-阳性细胞。在受损位点附近的若干脊髓节段中也观察到此现象。脊髓损伤后2周，室管膜中BrdU-阳性细胞数目少于脊髓损伤后1天的数目，但是仍然高于2周时正常对照组的数目。与此同时，损伤/处理组动物中BrdU-阳性细胞数目高于损伤/对照组的。脊髓损伤后4周，室管膜中BrdU-阳性细胞数目更为降低，但是仍然显著高于同时期正常对照组的数目。损伤/处理组动物中BrdU-阳性细胞数目高于损伤/对照组的(表1)。因此，脊髓损伤后1天、2周和4周时，在脊髓中央管室管膜中观察到BrdU-阳性细胞。BrdU-阳性细胞数目随时间递减。BrdU-阳性细胞不仅仅出现于中央管室管膜，也出现在脊髓白质和灰质。越接近损伤位点，室管膜中BrdU-阳性细胞数目越多。

表5脊髓对切后4周脊髓中央管室管膜中BrdU-阳性细胞数目的平均值(x±s)

组别	大鼠数量	BrdU-阳性细胞数目的平均值
			正常对照组损伤/对照组损伤/处理组	255	18.17±2.8129.91±3.6845.67±3.62

t检验：三组之间配对比较，P＜0.05

脊髓对切后1天，中央管室管膜巢蛋白-阳性细胞增加。在脊髓白质和灰质中也存在巢蛋白-阳性细胞(图12)。脊髓损伤2和4周后，中央管室管膜中只有少数巢蛋白-阳性细胞，而大部分分布在脊髓白质和灰质中。在损伤位点附近的脊髓节段中，对切损伤位点的腹侧白质中有放射状巢蛋白-阳性突起。在其它白质中也看到巢蛋白阳性细胞体及其突起(图13)。

脊髓损伤后2周和4周时，损伤/处理组脊髓中央管的室管膜细胞层变厚，并且与损伤/对照组相比有更多的巢蛋白-阳性细胞。从BrdU和巢蛋白、BrdU和NF、BrdU和少树突细胞因子(oligodentrocytin)、以及BrdU和GFAP双重免疫组化染色结果中，发现中央管室管膜中没有出现呈双染阳性的细胞。然而，在损伤/处理组的脊髓白质中有少数细胞呈现BrdU和巢蛋白(图14A和图14B)、BrdU和NF(图15A和图15B)、BrdU和少树突细胞因子(oligodentrocytin)(图16A和图16B)、以及BrdU和GFAP(图17A和图17B)双重染色阳性。

讨论：

以上研究证实脊髓对切后1天，中央管室管膜细胞增殖，但是增殖的细胞数目随时间降低。越靠近脊髓损伤位点，有越多的室管膜细胞增殖。增殖的细胞不仅存在于中央管室管膜细胞，也存在于脊髓白质和灰质中。与此同时，有些增殖的细胞还表达巢蛋白，这表明这些细胞已分化为神经干细胞。这些发现支持Yamamoto等人在Exp.Neurol.，2001；172(1)：115-127中的报道，其中报道神经干细胞不仅存在于脊髓中央管室管膜，还存在于脊髓其他位置。此外，损伤/处理组中大鼠的中央管中增殖的室管膜细胞数目高于损伤/对照组的数目，表明GASP能有效促进受损脊髓的中央管室管膜细胞的增殖。

本研究的结果证实脊髓损伤后，少数增殖的室管膜细胞可以分化为神经干细胞、神经元样细胞、少突细胞样细胞和星形细胞样细胞，而这些细胞可能参与受损脊髓的修复。

结论：

GASP可有效促进脊髓损伤大鼠的神经干细胞的增殖和/或分化。

本发明已经以实施例的方式并用优选实施方案进行描述，须知晓本发明不受所公开的实施方案的限制。正相反，本发明意图涵盖对本领域技术人员显而易见的各种修改。因此，所附权利要求的范围应当与最广泛的解释相一致，以包括所有这些修改。

Claims (42)

1.治疗哺乳动物脊髓损伤的方法，包含：给予脊髓损伤的哺乳动物有效量的破壁萌发激活的灵芝(GASP)孢子。

2.根据权利要求1的方法，其中所述GASP通过口服方式给予所述哺乳动物。

3.根据权利要求1的方法，其中在所述脊髓损伤约1天内将所述GASP给予所述哺乳动物。

4.根据权利要求1的方法，其中所述哺乳动物是人。

5.根据权利要求1的方法，其中所述脊髓损伤是由于压迫或切割脊髓所致。

6.根据权利要求1的方法，其中所述脊髓损伤是由于创伤所致。

7.根据权利要求5的方法，其中所述脊髓损伤是由于切割脊髓腹根所致。

8.根据权利要求5的方法，其中所述脊髓损伤是由于切割或压碎坐骨神经所致。

9.根据权利要求1的方法，其中所述脊髓损伤是由于疾病所致。

10.根据权利要求9的方法，其中所述疾病是脊髓灰质炎、脊柱裂、遗传性共济失调。

11.根据权利要求1的方法，其中所述脊髓损伤是由于所述受损的脊髓中神经元遭破坏或死亡所致。

12.根据权利要求11的方法，其中所述神经元是运动神经元。

13.根据权利要求1的方法，其中所述神经损伤是由于压碎所述损伤的脊髓的轴突所致。

14.根据权利要求1的方法，其中所述GASP的有效量约为0.5-15g每天每千克体重。

15.脊髓损伤后改善神经元存活的方法，包含：根据权利要求1，给予具有所述脊髓损伤的所述哺乳动物有效量的GASP。

16.根据权利要求15的方法，其中所述哺乳动物是人。

17.根据权利要求15的方法，其中在所述脊髓损伤1天内将所述GASP给予所述哺乳动物。

18.根据权利要求15的方法，其中所述神经元是所述受损的脊髓中的运动神经元。

19.根据权利要求15的方法，其中所述GASP的有效量约为0.5-15g每天每千克体重。

20.促进脊髓损伤中轴突再生的方法，包含：根据权利要求1，给予具有所述脊髓损伤的所述哺乳动物有效量的所述GASP。

21.根据权利要求20的方法，其中在所述脊髓损伤1天内将所述GASP给予所述哺乳动物。

22.根据权利要求20的方法，其中所述GASP的有效量约为0.5-15g每天每千克体重。

23.促进哺乳动物神经干细胞增殖的方法，包含：给予哺乳动物有效量的破壁萌发激活的灵芝孢子(GASP)。

24.根据权利要求23的方法，其中所述促进神经干细胞增殖发生在脊髓损伤之后。

25.根据权利要求23的方法，其中所述GASP通过口服方式给予所述哺乳动物。

26.根据权利要求23的方法，其中所述哺乳动物是人。

27.根据权利要求23的方法，其中所述脊髓损伤是由于挤压或切割脊髓所致。

28.根据权利要求23的方法，其中所述脊髓损伤是由于创伤所致。

29.根据权利要求23的方法，其中所述脊髓损伤是由于疾病所致。

30.促进哺乳动物中神经干细胞分化的方法，包含：给予哺乳动物有效量的破壁萌发激活的灵芝孢子(GASP)。

31.根据权利要求30的方法，其中所述的神经干细胞是遭受脊髓损伤的。

32.根据权利要求30的方法，其中所述的促进神经干细胞分化发生在脊髓损伤之后。

33.根据权利要求30的方法，其中所述的神经干细胞分化为神经元。

34.根据权利要求30的方法，其中所述的神经干细胞分化为星形细胞。

35.根据权利要求30的方法，其中所述的神经干细胞分化为少突细胞。

36.根据权利要求30的方法，其中所述的GASP通过口服方式给予所述哺乳动物。

37.根据权利要求30的方法，其中所述的哺乳动物是人。

38.根据权利要求30的方法，其中所述的脊髓损伤是由于挤压或切割脊髓所致。

39.根据权利要求30的方法，其中所述的脊髓损伤是由于创伤所致。

40.根据权利要求30的方法，其中所述的脊髓损伤是由于疾病所致。

41.促进哺乳动物神经干细胞增殖和分化的方法，包含：给予哺乳动物有效量的破壁萌发激活的灵芝(GASP)孢子。

42.根据权利要求41的方法，其中所述神经干细胞的所述增殖和分化发生在脊髓损伤之后。

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