CN101002964A - 一种组织工程复合皮肤材料及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种组织工程复合皮肤材料及其制备方法,该复合皮肤材料由附着于纤维蛋白生物支架上的自体与异体真皮细胞层和上皮细胞层构成。其制备方法是将自体的上皮干细胞和成纤维细胞与异体的上皮干细胞和成纤维细胞一同构建于纤维蛋白原液中,使细胞均匀分布其中,构成细胞悬液;另外配制凝血酶原溶液,将此细胞悬液和凝血酶原溶液混合涂抹于创面即可形成组织工程复合皮肤。组织工程复合皮肤材料,是应用于制备皮肤移植用的生物材料。本发明的优点在于:1.为自体和异体细胞结合进行治疗,移植速度快,创面保护好,不用重复移植。2.采用的生物材料粘附性好,在上皮细胞和成纤维细胞移植后成活率高,创伤面修复快。3.该组织工程复合皮肤既有上皮细胞,又有构成其真皮组织的成纤维细胞,因而其皮肤创伤愈合皮肤结实,不易破碎,愈合效果好,外观更正常。
Description
技术领域
本发明涉及一种组织工程复合皮肤材料及其制备方法,属于组织工程领域。
背景技术
组织工程技术是国际上于一九八零年后建立起来的一种用于制备可移植的、具备形态特征和功能的组织与器官的高新技术,目前国际上正在研发的产品有:皮肤、真皮、粘膜、肌腱、骨、软骨、血管、神经、角膜、心脏瓣膜、肾脏、腺体和消化器官等,而最先获得成功的是皮肤组织、真皮组织和软骨组织。皮肤和真皮组织是最先于1999年获得美国FDA认证的产品,其中包括Apligraf、Integraf和Dermagraf等产品。这些产品都是应用异体的皮肤来源在体外培养成上皮细胞和真皮细胞。由于异体皮肤组织来源于新生儿的包皮,比成年人的细胞活性好,细胞扩增速度也快,可以在烧伤或皮肤损伤后立即进行应用,从而及时修复皮肤创面的优点。但是,因为是异体细胞组织始终会被人体进行排异,异体细胞在移植一段时间后就会脱离而需要立即移植自体皮肤组织,否则仍然会产生疤痕组织皮肤。美国公司和我国韩斌已经开发的自体复合皮肤,对于创面的愈合具有很好的疗效,但是由于培养细胞的时间较长,只能在皮肤损伤或烧伤后2周左右的时间开始移植,往往错过了最佳移植期。为了克服上述产品对于皮肤创面修复过程中的缺点,进行本发明。
发明内容
本发明的目的是提供一种组织工程复合皮肤材料。
本发明的另一个目的是提供组织工程复合皮肤材料的制备方法。
本发明的第三个目的是提供这种组织工程复合皮肤材料的应用。
为实现上述目的,本发明采用以下技术方案:
一种组织工程复合皮肤材料,该复合皮肤材料一部分由存活于纤维蛋白原中的自体和异体成纤维细胞以及自体和异体上皮细胞构成,另一部分为凝血酶原溶液。
所述的自体和异体成纤维细胞是将来源于患者自体的真皮成纤维细胞经体外分离、培养、扩增和来源于新生儿包皮成纤维细胞经体外分离、培养扩增得到的。
所述的自体和异体成纤维细胞是将来源于患者自体和来源于新生儿包皮的成纤维细胞经体外扩增、培养得到的。
所述的自体和异体上皮细胞是将来源于患者自体和来源于新生儿包皮的上皮干细胞及上皮前体细胞经体外扩增、培养得到的。上皮干细胞在培养过程中分裂形成上皮干细胞和上皮前体细胞,其中上皮干细胞具有增殖能力,上皮前体细胞具有分化能力,可分化成为上皮细胞。
所述纤维蛋白原为人或动物来源的纤维蛋白原。纤维蛋白原和凝血酶原混合几秒钟至几分钟内即可凝固为胶样,该胶的优点在于:第一、能支持上皮细胞和成纤维细胞的生长;第二,能较快的被吸收;第三,将组织工程复合皮肤材料的两种液体涂抹于创面凝固为胶后,构成薄层,特别对于凹凸不平的创面更加容易操作;第四,有较强的粘附性,易于附着于创伤面。
一种组织工程复合皮肤材料的制备方法,一部分是将自体的上皮干细胞和成纤维细胞和异体的上皮干细胞和成纤维细胞一同构建于纤维蛋白原液中,使细胞均匀分布其中,构成细胞悬液;另一部分为配制的凝血酶原溶液。将此细胞悬液和凝血酶原溶液混合涂抹于创面即可形成组织工程复合皮肤。
所述含有患者自体和异体上皮细胞、成纤维细胞的纤维蛋白原生物材料的构建方法是:采用人或动物的纤维蛋白原为材料,按照浓度为1-8mg/ml,加入自体和异体上皮细胞、成纤维细胞,室温下均匀混合。
所述凝血酶原溶液以动物来源的凝血酶原制备成1-5单位/毫升的溶液。
所述加入自体上皮细胞的数量为10000-30000细胞/ml。
所述加入异体上皮细胞的数量为40000-60000细胞/ml。
所述加入自体真皮成纤维细胞的数量为10000-30000细胞/ml。
所述加入异体真皮成纤维细胞的数量为40000-60000细胞/ml。
所述的组织工程复合皮肤材料,是用于制备皮肤移植用的生物材料。
组织工程复合皮肤材料采用自体和异体上皮细胞以及自体和异体成纤维细胞在体外扩增后,与可降解的纤维蛋白原构成细胞悬液。然后与凝血酶原一起涂抹到病人创面,用于大面积烧伤患者和皮肤溃疡患者的皮肤移植和修复。该制品组织结构近似于或等同于人的皮肤组织,是目前治疗皮肤烧伤病人非常有效的方法。可以广泛应用于治疗皮肤烧伤、溃疡、创伤等多种原因造成的皮肤缺损,尤其是能用于大面积皮肤烧伤的急救。
本发明能在短时间内为患者提供大面积的表皮和真皮细胞,供移植使用,其优点在于:
1、为自体和异体细胞结合进行治疗,移植速度快,创面保护好,不用重复移植。
2、采用的生物材料粘附性好,其中的上皮细胞和成纤维细胞移植后成活率高,创伤面修复快。
3、该生物工程复合皮肤材料既有上皮细胞,又有构成其真皮组织的成纤维细胞,因而其皮肤创伤愈合皮肤结实,不易破碎,愈合效果好,外观更正常。
下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步说明。
附图说明
图1为本发明的成品外观图(左注射器内为含有细胞的纤维蛋白原溶液,右注射器内为配制的凝血酶原溶液)
图2-1为大面积烧伤患者进行皮肤移植前的局部皮肤状况图
图2-2为外伤创面患者进行皮肤移植前的局部皮肤状况图
图3-1为大面积烧伤患者进行皮肤移植后的局部皮肤状况图
图3-2为外伤创面患者进行皮肤移植后的局部皮肤状况图
具体实施方式
在确定取皮肤组织之前,由具有执业医师资格的医务人员向患者或患者家属解释原因,争得患者或家属同意,皮肤的取材部位由具有执业医师资格的医务人员确定,并按照医院规定的手术原则取材。患者进行体检和化验,包括常规检验、传染病病原(如HIV、肝炎病毒等)的检查。所取的皮肤立即由专业人员放入无菌容器内,并立即冷藏(2℃-10℃),然后按规定的标准操作程序处理。
实施例1、组织工程复合皮肤材料的制备
一.患者自体健康细胞的提取和健康新生儿包皮的细胞培养传代
(一)细胞的提取
1.手术室取材
1)用医用碘酊清理患者取皮面;
2)用生理盐水冲洗取皮面,除去残留的碘酊;
3)取1cm×2.5cm的窄长皮肤;
4)取下的皮肤放贮存液中送细胞培养室。
2.取材后皮肤组织的保存:用5ml含有100单位/ml青霉素和100mg/ml的链霉素的DMEM(购于美国Hyclone公司)培养液于保存管中保存组织(4℃)。
3.在超净工作台中消毒、清洗,组织大块分离:用含100单位/ml青霉素和100mg/ml的链霉素的0.1M PBS冲洗组织,修剪多余的脂肪和皮下结绨组织。将组织剪成1cm×1cm的组织块。
4.组织消化(Sony CO2培养箱):将3~4块1cm×1cm表皮组织块和真皮组织块分别放置于60mm培养皿中加入10ml浓度为0.25%的胰酶/EDTA液,37℃,120分钟;DMEM+10%FBS培养液终止。
5.细胞分离:将消化后的组织块剪碎并用吸管打散。
6.离心:吹散后的细胞收集至离心管中,Backman公司控温离心机,25℃,1000转/min,离心5分钟,弃去上清液。
7.细胞鉴定:
1)形态学:采用倒置光学显微镜观察。上皮细胞多呈多角型,角为钝角,细胞呈圆性;细胞外观透明,细胞紧密联结成单层,也可呈管状生长。真皮成纤维细胞质向外伸出2-3个长短不同的突起,呈多角形或长棱形。
2)细胞表型:采用角质蛋白抗体和胶原蛋白抗体(美国ICN公司)进行免疫抗原鉴定,结果显示分离得到的细胞为正常表皮细胞和正常真皮成纤维细胞。
3)致癌性:采用裸鼠试验,见《美国FDA关于生物制品生产用细胞株鉴定和指控的考虑要点》,结果显示无致癌性。
4)无菌检测:按《中国生物制品规程》(2000版)通则《生物制品无菌试验规程》A/B项进行,结果符合无菌要求。
5)细胞存活率:采用台盼蓝(Trypan blue)染色法检查,核染色的细胞为死亡细胞,不着色的细胞为活细胞,计数总细胞数和死细胞数,计算细胞存活率。
细胞存活率=[(总细胞数-死细胞数)/总细胞数]×100%
经测定,存活率超过80%。
(二)健康新生儿包皮来自于外科手术室。
(三)表皮细胞的原代培养与传代
1.原代细胞培养:在离心管中加入加10ml无血清上皮细胞培养液(Sigma公司,美国)吹悬,接种入4×60mm培养皿;Sony CO2培养箱,37℃,5%CO2,进行培养。
2.传代细胞培养:每隔2~3天换液1次,上皮细胞达到50-70%汇集细胞后传代。
(四)真皮成纤维细胞的原代培养与传代
1.原代细胞培养:在离心管中加入加10ml无血清上皮细胞培养液(Sigma公司,美国)吹悬,接种入4×60mm培养皿;Sony CO2培养箱,37℃,5% CO2,进行培养。
2.传代细胞培养:每隔2~3天换液1次,上皮细胞达到50-70%汇集细胞后传代。
二、构建生物工程复合皮肤:
(一)生物支架的构建
1.制备人纤维蛋白原:
用200ml血浆在4℃离心,3500转/min,30分钟,弃上清液,加10ml注射用水,制成悬浊液,保存备用。
2.构建附着有真皮成纤维细胞的生物材料:
采用人或动物的纤维蛋白原为材料,按照浓度为1-8mg/ml,加入50000细胞/ml的自体成纤维细胞、20000细胞/ml的异体成纤维细胞、50000细胞/ml的自体上皮细胞、20000细胞/ml的异体上皮细胞,室内温下混合,形成附着有上皮细胞和真皮成纤维细胞的悬液。同时制备含有1-5单位/毫升的凝血酶原和1-5μmol/ml的钙离子的混合液。将两种液体于在临床使用前24小时内制备完成,即可送往医院使用。
(二)生物支架和成品检测
1.生物支架的检测
1)pH值测定:取材料支架5g,加入pH7.0的蒸馏水15ml,于37℃下浸泡24小时,测pH,pH值在7.0-7.5之间。
2)体外降解试验:取材料支架,浸入37℃含蛋白酶(2mg/ml)的磷酸缓冲液中,浸泡24小时后,支架全部消失。
3)皮肤刺激和致敏试验:按GB/T16886.10-2000医疗器械生物评价第10部分:刺激与致敏试验规定进行试验,结果无致敏性。
4)细胞毒性按照GB/T16886.5-1997医疗器械生物评价第5部分:细胞毒性试验的规定进行试验,结果无细胞毒性。
5)肌肉植入试验按GB/T16886.6-1997医疗器械生物评价第6部分:植入后局部反应试验中规定的方法进行,结果无局部反应。
6)遗传毒性试验按照GB/T16886.3-1997医疗器械生物评价第3部分中规定的方法进行试验,结果无毒性。
2.成品检测
1)外观:呈半透明状液体,见图1。
2)规格尺寸:1毫升、5毫升、10毫升。
3)无菌试验:按《中国生物制品规程》(2000版)通则《生物制品无菌试验规程》A/B项进行,结果符合无菌要求。
产品的使用方法:使用前,用75%酒精消毒成品的外包装。进行移植时,用无菌的手术刀或外科镊子将创面的坏死组织清除,止血,然后用生理盐水冲冼三次,先将含有上皮细胞和真皮成纤维细胞的液体均匀涂抹于创面,再立即将含有凝血酶原的液体均匀的涂抹于创面,构建成膜状组织工程复合皮肤敷于创面,喷洒少量生理盐水,用油沙覆盖,使用一定压力使其紧贴创面,然后用棉纱打包固定。5-7天后打开包裹,可见新生皮肤(红、粉红)生长,一个月后伤口完全愈合。
产品的储存和运输应在2℃~10℃、阴凉、干燥、清洁、避免阳光直射、无腐蚀性气体、无重压的环境中进行。
实施例2、临床报告
一.纳入病例标准
1.深度烧伤病人切、削痂后创面。
2.各种原因引起的长期不愈合的溃疡创面及肉芽创面(III度烧伤后晚期肉芽创面、糖尿病足等难治性溃疡创面等)。
3.全身广泛瘢痕增生、挛缩畸形,或瘢痕疙瘩、增生性瘢痕,瘢痕硬、痒、痛,需切除瘢痕植皮者。
属于上述情况患者,且年龄不超过60岁为纳入对象。
二.排除病例标准
1.休克期、化学中毒等复合损伤。
2.合并心血管、脑血管、肝、肾、造血系统等严重原发疾病。
3.过敏体质者或自身免疫疾病者。
三.取材
1.术前检查血、尿常规,肝、肾功能。
2.自体皮肤取材术:视创面大小,在局麻下取正常皮肤1.5cm×0.5cm大小的一处或几处全层皮肤,供皮区用3-0丝线直接缝合。皮肤组织置于保存液中。
3.新生儿包皮来源于日常新生儿包皮切除术。
四.实验室体外培养
皮肤组织取材后立即置于保存液中,放在2℃-10℃的保温箱中运输及保存,于6小时内进行培养,以生物工程组织为载体培养皮肤细胞,并符合其组织工程复合皮肤注册产品标准。
五.剔除病例标准
皮肤细胞培养失败,培养所得的组织工程复合皮肤材料不符合产品标准者。
六.移植手术
复合皮移植术:2~3周后,先将含有上皮细胞和真皮成纤维细胞的纤维蛋白原溶液均匀涂抹于创面,再立即将含有凝血酶原的液体均匀的涂抹于创面,构建成膜状组织工程复合皮肤。
1.创面应新鲜,有血运,无坏死组织,无感染,创面清除彻底,大量抗菌素生理盐水冲洗,止血彻底。
2.将组织工程复合皮肤材料敷于创面,喷洒少量生理盐水,用油沙覆盖,使用一定压力使其紧贴创面,然后用棉纱打包固定。
3.如植皮位于关节部位,术毕用石膏托固定两周。
七.术后处理
术后用敏感抗菌素5-7天。
肉芽创面复合皮移植术后4-5天,切、削痂后创面或瘢痕切除后创面5-7天,打开外敷料剪开打包缝线,用生理盐水浸湿内层敷料,轻轻去除后,检视移植复合皮与受区成活情况,观察皮的颜色、分泌物、创缘情况。用油纱布、盐水纱布及纱布继续稍加压包装,术后一个月内每周2次换药,术后7-10天拆线。
八.疗效评定标准
显效:移植复合皮肤一个月创面愈合75%以上。
有效:移植复合皮肤一个月创面愈合在30%-75%。
无效:移植复合皮肤一个月创面愈合未及30%。
九.数据管理和统计
1.数据收集:
所有入选病例均必须完成病例观察表,研究者将观察、检查结果及时、准确、完整、规范、真实地记录于病历及病例观察表中。
全部数据录入数据库并校对后,将数据库交统计分析人员进行统计分析,并提供统计报告,交临床试验的主要研究者写出临床总结报告。
2.统计分析
根据数据性质,对基础资料数据、疗效分析(各指标分析)及安全性分析、分别进行统计描述。
计量数据统计方法:观察组内前后变化情况采用配对样本t检验。
计数数据统计方法:采用确切概率法。
等级型数据统计方法:观察组内前后变化情况采用符号秩和检验。
3、统计软件:所有的统计均利用SAS JMP5.0软件进行统计学分析,采用双侧检验,以P≤0.05作为有统计学意义。
十.结论
本产品在北京市两家三甲医院进行了临床研究,共入选20例患者,经术后一个月观察,评价其对于组织工程复合皮肤材料移植修复深度烧伤和瘢痕的改善情况,各主要观察指标的疗效如下:
(1)创面分泌物:均无创面分泌物渗出。
(2)创面肿胀:均无创面肿胀。
(3)创缘反应:均为阴性反应(即无创缘反应)
(4)创面愈合百分率:75%以上(即显效)15例;30%-75%(有效)1例,30%以下(无效)4例。
术后一个月:总有效病例16例,总有效率80%。
本说明书附图例举患者术前和术后的情况图以作说明,分别见图2-1、图2-2和图3-1、图3-2,可以看出在手术移植本发明的组织工程自体皮肤的部位,新生皮肤易愈合效果好,外观正常,患者的症状得到了改善。
Claims (9)
1、一种组织工程复合皮肤材料,其特征在于:该复合皮肤材料一部分是含有自体与异体真皮细胞和上皮细胞的纤维蛋白原溶液,另一部分为配制的凝血酶原溶液。
2、根据权利要求1所述的组织工程复合皮肤材料,其特征在于:所述的自体和异体成纤维细胞是将来源于患者自体的真皮成纤维细胞经体外分离、培养、扩增和来源于新生儿包皮成纤维细胞经体外分离、培养扩增得到的。
3、根据权利要求1所述的组织工程复合皮肤材料,其特征在于:所述的自体和异体上皮细胞是将来源于患者自体和来源于新生儿包皮的上皮干细胞及上皮前体细胞经体外扩增、培养得到的。
4、根据权利要求1所述的组织工程复合皮肤,其特征在于:所述纤维蛋白原为人或动物的纤维蛋白原。
5、一种组织工程复合皮肤材料的制备方法,是将自体的上皮干细胞和成纤维细胞和异体的上皮干细胞和成纤维细胞一同构建于纤维蛋白原液中,使细胞均匀分布其中,构成细胞悬液:另外配制凝血酶原溶液,将此细胞悬液和凝血酶原溶液两种材料混合涂抹于创面即可形成组织工程复合皮肤。
6、根据权利要求5所述的组织工程复合皮肤材料的制备方法,其特征在于:所述含有患者自体和异体上皮细胞、成纤维细胞的纤维蛋白原生物材料的构建方法是:采用人或动物的纤维蛋白原为材料,按照浓度为1-8mg/ml,加入自体和异体上皮细胞、成纤维细胞,室温下均匀混合。所述凝血酶原溶液以动物来源的凝血酶原制备成1-5单位/毫升的溶液。
7、根据权利要求5所述的组织工程复合皮肤材料的制备方法,其特征在于:组织工程复合皮肤材料是通过将含有细胞的纤维蛋白原溶液和配制的凝血酶原溶液在创面涂抹混合的应用方法,形成组织工程复合皮肤。
8、根据权利要求5所述的组织工程复合皮肤材料的制备方法,其特征在于:所述加入自体上皮细胞的数量为10000-30000细胞/ml;所述加入异体上皮细胞的数量为40000-60000细胞/ml;所述加入自体真皮成纤维细胞的数量为10000-30000细胞/ml;所述加入异体真皮成纤维细胞的数量为40000-60000细胞/ml。
9、权利要求1、或2、或3、或4所述的组织工程复合皮肤材料,用于制备皮肤移植用的生物材料。
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Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
C06 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
C10 | Entry into substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
C12 | Rejection of a patent application after its publication | ||
RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Open date: 20070725 |