CN101306208A - 一种注射用人体液态真皮层制剂及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种注射用人体液态真皮层制剂及其制备方法，属于医学生物工程领域。注射用人体液态真皮层制剂，由来源于治疗者自体的皮肤经过消化分离，得到的真皮成纤维干细胞、成纤维前体细胞、成纤维细胞进行体外全程无血清培养和扩增后，将收集到的有效成分与生理盐水注射液或其它注射液、以及任选的其它适用成分配成，有效成分由选自培养后收集到的真皮成纤维干细胞、成纤维前体细胞、成纤维细胞中的至少一种和胶原蛋白组成；每毫升注射用填充剂中，有效细胞成分的总个数为1000－8000万个，胶原蛋白的含量为10－100mg/ml注射用填充剂。本发明的优点：使用的材料取自治疗者自体，无排斥反应及副作用，治疗后见效快，疗效显著，表情自然，效果作用持久，可维持数年。

Description

一种注射用人体液态真皮层制剂及其制备方法

技术领域

本发明涉及一种注射用人体液态真皮层制剂及其制备方法，更具体地说是一种细胞类组织填充剂，用于人体软组织的填充和修复，包括除去皱纹和修复凹陷性疤痕。在其组织填充剂中包含了经体外培养、扩增后的自体的成纤维干细胞、成纤维前体细胞、成纤维细胞和胶原蛋白。其制备过程应用了无血清培养材料，最终制备成组织填充剂的注射悬浮液，注射到皱纹、凹陷性疤痕、创伤性皮肤真皮中、以及嘴唇等部位，以达到填充，修复的目的，属于医学生物工程领域。

背景技术

通常应用于人体软组织填充的方法可分为真皮填充和皮下填充，这些填充剂以往都不是自体组织活体材料，而是生物合成材料或者异性蛋白。最早应用填充材料是在十九世纪末，它以石蜡作为填充剂，出现了许多并发症，前期效果也不好。六十年代又应用了硅氧烷溶液作为填充剂，也同样出现了局部和全身性反应。随后又应用外源性蛋白作为填充材料，尤其是牛的胶原蛋白填充剂，这种填充剂可以立刻得到治疗效果，但三到六个月内被组织消化吸收。牛的胶原蛋白制备和利用可见美国专利3,949,073和4,424,208及4,488,911。其规格为35mg/ml及65mg/ml，商品名为Zyderm I、ZydermII、Zyderm III，在使用Ryder后，90％受治者有抗体产生，1-3％的受治者产生了明显的过敏反应而不能令人满意；因而应用戊二醛交联，然后用细筛过滤，产生出一种Zyplast的交联牛胶原蛋白，从而克服过敏的反应，其制备过程见美国专利4,582,640和4,642,117，但其治疗效果又出现了不平整的问题，是因为戊二醛交联后得到的材料粘性太大。对应用过牛胶原蛋白的受试者调查表明，一个处理过程的效果一般只能持续4-6月。

为了消除牛胶原的免疫反应，有人从人的胎盘中提取人胶原，像美国曾经出售过的品牌AUTOLOGEN，见美国专利4,969,912和5,332,802，但也只能维持几个月的时间。

美国市场上也出现过一种称为FIBREL的软组织填充剂，它是明胶粉末和氨基乙酸以及受治者的血浆的混合物，它对部分受治者有效，但易出现注射部位团块和疗效不持久等问题。

肉毒素(BOTOX)是一种近年来应用广泛的短期注射除皱液，于2004年4月获得FDA的批准，进行临床应用。依靠其可以使面部运动肌肉麻醉而达到治疗效果。因为该制剂操作简便，立即见效而闻名，但其治疗后出现面部表情僵化，疗效短，也有些出现面瘫的问题。

爱贝芙(Artecoll)是人工合成颗粒和牛胶原蛋白的复合物，已在加拿大、墨西哥和欧洲应用多年。通过该材料刺激局部真皮而诱导产生自体胶原来达到长期有效的目的，疗效上也出现了治疗者触摸有颗粒感等问题，16％的治疗者的治疗部位出现突出肿块。

由于异体材料注射后常出现过敏、排异反应和疗效短等问题，美国Isolagen公司1995年开始在门诊上应用一种培养自体真皮成纤维细胞修复皮肤和软组织缺损的治疗方法(见美国专利5,591,444、5,665,372、5,660,850)，其具体做法是，应用自体取得的皮肤组织，在体外应用含有牛血清的培养液进行培养，最后制备于林格氏液中而得到自体成纤维细胞注射液，它无严重的过敏、排斥反应。但是美国FDA从2000年开始对于应用动物血清制备的、用于人的注射液提出了限用和禁用的要求，并且受试者对于牛血清疑带有疯牛病等病毒的潜在危险提出了质疑，因而Isolagen公司重新开始了三期临床试验。该方法的另一个不足之处是，林格氏液不便于较长时间地保持有效成分的活性，配制成了注射剂后需要很快使用，实际使用中不方便。

北京以岭生物工程有限公司从2000年开始开发得到的一种除皱祛疤的注射剂(中国专利申请第03155833.X号)中，应用了自体皮肤，经体外分离、培养和扩增，制成于生理盐水注射液中的一种注射剂，治疗疤痕和祛除皱纹。

按照中国专利申请号03155833.X的注射剂中的有效成分是用部分含血清的培养液对自体皮肤样品进行组织培养而得到的。该技术的不足之处是，注射剂中能立即发挥人体软组织的填充和修复功能的胶原蛋白含量较低，导致注射到疤痕和皱纹处后见效较慢，一般要4-6个月；另外，受治者对使用动物血清作为培养液的成分也可能存有安全性方面的疑惑。

本发明人应用无血清培养液，从自体皮肤组织中培养出了既可包含大量自体的成纤维干细胞、成纤维前体细胞和成纤维细胞、同时又含有丰富的自体胶原蛋白的复合填充剂，在1-3个月就可出现明显的填充和修复效果，其见效快，疗效持久，自然安全。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种新的自体注射用人体液态真皮层制剂，它可以用于美容、改善皮肤弹性和光泽、以及其它部位和类型的填充，自然、疗效持久。

本发明的另一个目的是提供上述注射用填充剂在美容、改善皮肤弹性和光泽、以及其它部位和类型的填充和修复中的应用。

本发明的另一个目的是提供这种注射用填充剂的制备方法。

本发明的另一个目的是提供体外长时间保存离体皮肤组织块的方法。

为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

按本发明的注射用人体液态真皮层制剂由来源于治疗者自体的皮肤，离体后保存皮肤组织块保存液中，经过胰蛋白酶消化和组织块贴壁两种原代细胞分离方法，得到的真皮成纤维干细胞、成纤维前体细胞、成纤维细胞进行体外全程无血清培养和扩增后，再与生理盐水注射液或其它注射液、以及任选的其它适用成分配成，有效成分由选自培养后收集到的真皮成纤维干细胞、成纤维前体细胞、成纤维细胞中的至少一种及其分泌的胶原蛋白组成；在每毫升填充剂中，有效细胞成分的总个数为1000-8000万个，胶原蛋白的含量为10-100mg/ml，优选20-60mg/ml。

按本发明的组织填充剂的一个优选方案，所述的填充剂中的自体真皮成纤维干细胞、成纤维前体细胞、成纤维细胞、胶原蛋白是将来源于治疗者自体的少量皮肤(1-30平方毫米的皮肤)，在细胞培养室经过胰蛋白酶消化和组织块贴壁两种原代细胞分离方法，得到的真皮成纤维干细胞、成纤维前体细胞、成纤维细胞，在加入了生长因子和营养材料的无血清培养液中进行体外培养和扩增而最终得到的；采用了较长的体外培养和扩增时间，优选6-10周。

按本发明的组织填充剂的一个优选方案，填充剂中的有效成分由所说的自体真皮成纤维干细胞、成纤维前体细胞、成纤维细胞及胶原蛋白共同组成，成纤维干细胞、成纤维前体细胞、成纤维细胞之间的个数比例范围为5-20∶20-50∶30-70；胶原蛋白的重量比例10-100mg/ml，优选20--60mg/ml注射填充剂。

本发明所采集的皮肤组织：包括从耳后，切眼袋，切眉，以及其他部位所取的皮肤，为包括表皮和真皮的皮肤。

成纤维干细胞、成纤维前体细胞、成纤维细胞和胶原蛋白的鉴定和表征方式为：

成纤维干细胞：采用Brdu抗体测定(黄晖，赖西南，王正国，王丽丽，创伤愈合中物质对表皮干细胞迁移及受体表达的作用；中华创伤杂志2004年；20(3)142-145.利用核标记物)，细胞形态可参见说明书附图1。

成纤维前体细胞：在100倍光学显微镜下做形态学观察，其标准形态为细小长梭状，细胞形态可参见说明书附图2。

成纤维细胞：在100倍光学显微镜下做形态学观察，其标准形态为呈多触突的长梭形细胞，细胞形态可参见说明书附图3。

胶原蛋白：“采用胶原蛋白测定法”，中华人民共和国卫生部药典委员会，《中华人民共和国药典》(二部)，北京，化学工业出版社，2000。

按照本发明的注射用人体液态真皮层制剂可以用在美容、改善皮肤弹性和光泽、以及其它部位和类型的填充和修复中，包括处理由于真皮缺损而导致的各种症状，例如面部皱纹，凹陷性疤痕，妊娠纹，手背皱纹；用于丰唇，增强真皮厚度和改善皮肤基质等。

按照本发明的离体皮肤组织块长时间保存方法是指生长因子、活性材料、体外培养组织细胞有效成分、和将有效成分与生理盐水注射液或其他注射液、以及任选的其它适用成分配制成离体皮肤组织块保存液。所说生长因子为至少一种选自上皮生长因子、成纤维生长因子的成分；所说活性材料为至少一种选自皮质激素、脑垂体提取液的成分，这些培养液和生长因子及活性材料可以来源于一个公司或者多个公司(如美国Sigma公司)的市售产品。所说生长因子在培养液中的含量可以为1-10ng/ml，优选为2-5ng/ml；所说活性材料在培养液中的含量可以为0.1-1％，优选为0.2-0.5％。

按照本发明制备注射用人体液态真皮层制剂的方法包含自体皮肤取材、组织消化和细胞分离、体外无血清培养组织细胞有效成分、和将有效成分与生理盐水注射液或其它注射液、以及任选的其它适用成分配成注射填充剂几个步骤。有效成分由选自培养后收集得到的真皮成纤维干细胞、成纤维前体细胞、成纤维细胞中的至少一种和胶原蛋白组成；在每毫升填充剂中，有效细胞成分的总个数为1000-8000万个，胶原蛋白的含量为10-100mg/ml，优选20-60mg/ml。

按照本发明制备注射用人体液态真皮层制剂的方法的一个优选方案，在体外全程无血清培养和扩增过程中使用的培养液中还包含生长因子和活性材料，所说生长因子为至少一种选自上皮生长因子、成纤维生长因子的成分；所说活性材料为至少一种选自皮质激素、脑垂体提取液的成分，这些培养液和生长因子及活性材料可以来源于一个公司或者多个公司(如美国的Sciencell公司、Sigma公司、Hyclone公司等)的市售产品。所说生长因子在培养液中的含量可以为1-10ng/ml，优选为2-5ng/ml；所说活性材料在培养液中的含量可以为0.1-1％，优选为0.2-0.5％。

按照本发明方法的一个优选方案，在体外全程无血清培养和扩增过程中使用的培养液中包含生长因子和活性材料的情况下，还使用了较长的体外培养和扩增时间，优选为6-10周。

按照本发明方法的一个优选方案，注射填充剂中的有效成分同时包含所说的自体真皮成纤维干细胞、成纤维前体细胞、成纤维细胞和胶原蛋白；成纤维干细胞、成纤维前体细胞、成纤维细胞之间的个数比例范围为5-20∶20-50∶30-70；胶原蛋白的重量含量范围10-100mg/ml注射填充剂，优选20-60mg/ml注射填充剂。

自体皮肤取材：用酒精消毒取材部位，进行局部表面麻醉。用取皮器或手术刀和手术剪刀将1-30平方毫米的表皮和真皮组织取下，或手术切除眼袋或切眉的皮肤，放入离体皮肤组织块保存液中，将创伤部位做一到三针缝合，创可贴覆盖。

组织消化和细胞分离：将皮肤组织块放置于培养皿中，加入胰酶/EDTA液，DMEM+10％FBS液终止；将消化后的组织块剪碎并用吸管打散；吹散后的细胞收集至离心管中，离心5分钟，弃去上清液；将皮肤组织块放置于培养皿中，剪碎皮肤组织块；把剪碎后的组织块均匀地铺种在培养皿底部；

细胞体外培养：采用组织消化培养法和组织块培养法；包括原代细胞培养和传代细胞培养。

按本发明所采用的细胞培养方法与以往方法不同之处在于，首次采用全程无血清培养方式，在培养液中加入生长因子(如上皮生长因子、成纤维生长因子等)和活性材料(如皮质激素、脑垂体提取液等)，培养6-10周，从而促进细胞的扩增和胶原蛋白的充分分泌。其细胞活性和形态正常，特别是这种培养后收集到的有效成分中除有自体的成纤维细胞、成纤维干细胞、成纤维前体细胞外，还有较大量的胶原蛋白，其浓度能使配制后的注射用填充剂中胶原蛋白的重量含量范围为10-100mg/ml。

基础培养液的组成是本领域普通技术人员所熟知的，具体内容请参见《细胞实验指南》(2001年，科学出版社出版，主编：D.L.斯佩克特，黄培唐翻译)；在此基础上再加入上述的生长因子和/或活性材料，即是本发明优选的培养液。

生长因子可以是上皮生长因子(EGF)，它的使用浓度范围是0.1-5ng/ml，优选浓度范围是0.5-2ng/ml；

活性材料可以是脑垂体提取液(BPE)，它的使用浓度范围是0.1-1％，优选浓度范围是0.2-0.5％。

培养过程：将从组织块分离出的真皮细胞(含成纤维干细胞、成纤维前体细胞和成纤维细胞)用上述的无血清培养液在温度为37℃，5％的CO₂细胞培养箱中培养；

将均匀铺种在培养皿底部的皮肤组织块用上述的无血清培养液在温度为37℃，5％的CO₂细胞培养箱中培养；

上述培养，每三天换上述培养液一次，共培养35-63天。

填充剂制备：按照本发明的注射用人体液态真皮层制剂的配制方法包括，将按上述方法体外扩增和培养后的有效成分与生理盐水注射液或其它注射液、以及任选的其它适用成分配制成悬浊液，即是按本发明的注射填充剂，有效成分由选自自体真皮成纤维干细胞、成纤维前体细胞、成纤维细胞中的至少一种及胶原蛋白组成；每毫升注射液中，有效细胞成分总个数为1000万-8000万个，胶原蛋白的含量为10-100mg/ml注射液。

本发明的注射填充剂本身包含了大量的胶原蛋白，在注射部位能很快产生填充皱纹和疤痕的作用；注射填充剂中包含的其它有效成分还能源源不断地分泌出大量的胶原蛋白，从而使沟纹和疤痕长平，在消除皱纹和疤痕同时，又能改善局部皮肤的环境，起到年轻美颜的作用。

本发明产品适用的范围为：填充修复面部所有皱纹和凹陷性疤痕，如脖颈皱纹、妊娠皱纹、手背皱纹，也用于美容，增强皮肤厚度、皮肤弹性和其它部位的填充修复。

本发明的优点：所使用的有效成分来源于受治者自体，无排异反应，不会感染动物源性疾病、无副作用，受治者用过后美容疗效显著，表情自然，见效快、效果作用持久，可维持数年。

下面结合具体实施方式对本发明作进一步说明，并不以任何方式限制本发明，凡依照本领域的公知技术所作出的任何等同替换，均属于本发明的保护范围。

附图说明

附图1是成纤维干细胞在100倍光学显微镜下形态学照片；

附图2是成纤维前体细胞在100倍光学显微镜下形态学照片；

附图3是成纤维细胞在100倍光学显微镜下形态学照片。

具体实施方式

实施例1：人体软组织填充剂的制备----用于祛除皱纹治疗(20例)

一.自体健康皮肤样品的提取

用70％的酒精消毒耳后，然后用10％的利多卡因和十万分之一的肾上腺素进行局部表面麻醉。用取皮器或手术刀和手术剪刀将接受治疗者耳后4平方毫米的表皮和真皮组织取下，放入组织保存液(DMEM细胞保存液，美国Hyclone公司)中，将创伤部位做一针缝合，创可贴覆盖。

二.细胞悬液的制备(组织消化培养法)

1.组织消化(Forma，或Sanyo CO₂培养箱)：将皮肤组织块放置于35mm培养皿中，加入1ml浓度为0.05％的胰酶/EDTA液，37℃，10分钟；DMEM+10％FBS液终止。

2.细胞分离：将消化后的组织块剪碎并用吸管打散。

3.离心：吹散后的细胞收集至离心管中，Backman公司控温离心机，25℃，1000转/分钟，离心5分钟，弃去上清液。

4.原代细胞培养：在离心管中加入加1ml真皮细胞培养液(Sciencell公司，牌号为2301，其中主要成分是基础培养液，生长因子EGF的浓度为1ng/ml，营养材料BPE的浓度为0.2％，美国)吹悬，接种入35mm培养皿；CO₂培养箱，37℃，5％ CO₂，进行培养；

5.传代细胞培养：每隔2～3天换上述培养液1次，当原代细胞达到50-70％汇集后传代，用胰酶消化、离心，弃去上清液，按1∶3扩增倍数培养。

6.配制注射剂：收集在体外传代至第8周的培养物中的有效成分；向生理盐水注射液中加入收集的有效成分，使每毫升混悬液含大约2000-6000万个有效细胞成分，配制成1-4ml混悬液。

三.产品检测

1.病毒检测：将皮肤组织进行培养6周后，取1ml含有细胞的培养液进行HIV和肝炎病毒的检验，确定此为无病毒细胞。

2.免疫反应测试：第6周将0.1ml细胞悬浮液对受术者进行皮试(同青霉素皮试方法)，无免疫反应。

3.成品检测

1)外观：本品为淡白色混悬液。

本品中有效成分分类检定：

成纤维干细胞：采用Brdu抗体测定表明，该填充剂中成纤维干细胞的个数占三种细胞总个数的比例为10-20％。

成纤维前体细胞：采用细胞形态学方法观察，该填充剂中成纤维前体细胞个数占三种细胞总个数的比例为30-40％。

成纤维细胞：采用细胞形态学方法观察，该填充剂中成纤维细胞个数占三种细胞总个数的比例为50-70％。

胶原蛋白：采用胶原蛋白测定方法，测定该填充剂中胶原蛋白成分重量含量为20-60mg/ml。

2)无菌试验：按《中国生物制品规程》(2000版)通则《生物制品无菌试验规程》A/B项进行，结果符合无菌要求。

产品的储存和运输在4℃的特殊保存箱中，该箱符合阴凉、干燥、清洁、避免阳光直射、无腐蚀性气体、无重压的条件。

四.治疗

用于额头皱纹，眼角鱼尾纹，脖颈皱纹，妊娠纹等所有面部及其它身体部位的皱纹和细小皱纹；治疗25例。

1.治疗者术前检查，各项指标均正常，包括：血尿便常规、心电图、肝肾功能、HIV、HbsAg。

2.将注射部位用70％的酒精消毒，局部注射1％的利多卡因麻醉。

3.将1.5ml细胞悬液吸入3ml的注射器中备用。

4.取2.2cm长的4.5号针头，采用多点斜面(针头与皮肤的角度20°～45°)，在注射部位注射时，将注射部位表皮拉紧注射细胞，使其发白，注射时使注射部位留有弥散空间。注射完后用冰袋外敷2小时。

疗程：注射部位共注射2次，间隔2周。

五、术后观察、调护：

1.手术后，用冰袋敷注射处2小时。

2.观察局部及全身的情况：一切正常。

3.每天二次口服维生素C(每次200mg，每天共400mg)，服用6个月。

4.术后3天内防曝晒及慎用刺激性化妆品。

六、效果描述：

皱纹在注射后三个月后基本消失或明显变浅，效果良好。

实施例2：人体软组织填充剂的制备——祛除凹陷性疤痕(20例)

一.自体健康皮肤样品的提取

用70％的酒精消毒耳后，然后用10％的利多卡因和十万分之一的肾上腺素进行局部表面麻醉。用取皮器或手术刀和手术剪刀将接受治疗者耳后4平方毫米的表皮和真皮组织取下，放入组织保存液(DMEM细胞保存液，美国Hyclone公司)中，将创伤部位做一针缝合，创可贴覆盖。

二.细胞悬液的制备

1.组织块培养法：将组织块切碎成1×1mm²，平铺于35mm培养皿中，加入2ml上述真皮细胞培养液(Sciencell公司，牌号为2301，其中主要成分是基础培养液，生长因子EGF的浓度为1ng/ml，营养材料BPE的浓度为0.2％，美国)进行原代细胞培养。

2.传代细胞培养：每隔2～3天换上述培养液1次，当原代细胞达到50-70％汇集后传代，用胰酶消化、离心，弃去上清液，按1∶3扩增倍数培养。

3.配制注射剂：收集体外传代至第8周的培养物中的有效成分；向生理盐水注射液中加入收集的有效成分，使每毫升混悬液含大约3000-7000万个有效细胞成分，配制成1-4ml混悬液。

三.产品检测

1.病毒检测：将皮肤组织进行培养8周后，取1ml含有细胞的培养液进行HIV和肝炎病毒的检验，确定此为无病毒细胞。

2.免疫反应测试：第8周将0.1ml细胞悬浮液对受术者进行皮试(同青霉素皮试方法)，无免疫反应。

3.成品检测

1)外观：本品为淡白色混悬液。

本品中有效成分分类检定：

成纤维干细胞：采用Brdu抗体测定表明，该填充剂中成纤维干细胞个数占三种细胞总个数的比例为15-20％。

成纤维前体细胞：采用细胞形态学方法观察，该填充剂中成纤维前体细胞个数占三种细胞总个数的比例为20-50％。

成纤维细胞：采用细胞形态学方法观察，该填充剂中成纤维细胞个数占三种细胞总个数的比例为30-50％。

胶原蛋白：采用胶原蛋白测定方法，测定该填充剂中胶原蛋白成分重量含量为30-80mg/ml。

2)无菌试验：按《中国生物制品规程》(2000版)通则《生物制品无菌试验规程》A/B项进行，结果符合无菌要求。

产品的储存和运输在4℃的特殊保存箱中，该箱符合阴凉、干燥、清洁、避免阳光直射、无腐蚀性气体、无重压的条件。

四.治疗

面部痤疮，天花疤痕，创伤性、凹陷性疤痕，治疗20例。

1.治疗者术前检查，各项指标均正常，包括：血尿便常规、心电图、肝肾功能、HIV、HbsAg。

2.将注射部位用70％的酒精消毒，局部注射1％的利多卡因麻醉。

3.将1.5ml细胞悬液吸入3ml的注射器中备用。

4.取2.2cm长的4.5号针头，采用多点斜面(针头与皮肤的角度20°～45°)，在注射部位注射细胞悬液。注射时将注射部位表皮拉紧，使其发白，注射时使注射部位留有弥散空间。注射完后用冰袋外敷2小时。

疗程：上述部位共注射2次，间隔2周。

五、术后观察、调护：

同实施例1。

六、效果描述：

治疗一个半月后，其凹陷性的疤痕表现平整，与周围皮肤基本一致，皮肤有光泽，效果良好。

实施例3：人体软组织填充剂的制备——用于皮肤基质的改善和美容(20例)

一.自体健康皮肤样品的提取

用70％的酒精消毒耳后，然后用10％的利多卡因和十万分之一的肾上腺素进行局部表面麻醉。用取皮器或手术刀和手术剪刀将接受治疗者耳后4平方毫米的表皮和真皮组织取下，放入组织保存液(DMEM细胞保存液，美国Hyclone公司)中，将创伤部位做一针缝合，创可贴覆盖。

二.细胞悬液的制备

1.组织块培养法：将组织块切碎成1×1mm²，平铺于35mm培养皿中，加入2ml上述真皮细胞培养液(Sciencell公司，牌号为2301，其中主要成分是基础培养液，生长因子EGF的浓度为1ng/ml，营养材料BPE的浓度为0.2％，美国)进行原代细胞培养。

2.传代细胞培养：每隔2～3天换上述培养液1次，当原代细胞达到50-70％汇集后传代，用胰酶消化、离心，弃去上清液，按1∶3扩增倍数培养。

3.配制注射剂：收集体外传代至第8周的培养物中的有效成分；向生理盐水注射液中加入收集的有效成分，使每毫升混悬液含大约1500-5500万个有效细胞成分，配制成1-4ml混悬液。

三.产品检测

1.病毒检测：将皮肤组织进行培养8周后，取1ml含有细胞的培养液进行HIV和肝炎病毒的检验，确定此为无病毒细胞。

2.免疫反应测试：第8周将0.1ml细胞悬浮液对受术者进行皮试(同青霉素皮试方法)，无免疫反应。

3.成品检测

1)外观：本品为淡白色混悬液。

本品中有效成分分类检定：

成纤维干细胞：采用Brdu抗体测定表明，该填充剂中成纤维干细胞个数占三种细胞总个数的比例为5-20％。

成纤维前体细胞：采用细胞形态学方法观察，该填充剂中成纤维前体细胞个数占三种细胞总个数的比例为20-50％。

成纤维细胞：采用细胞形态学方法观察，该填充剂中成纤维细胞个数占三种细胞总个数的比例为30-70％。

胶原蛋白：采用胶原蛋白测定方法，测定该填充剂中胶原蛋白成分重量含量为15-50mg/ml。

2)无菌试验：按《中国生物制品规程》(2000版)通则《生物制品无菌试验规程》A/B项进行，结果符合无菌要求。

产品的储存和运输在4℃的特殊保存箱中，该箱符合阴凉、干燥、清洁、避免阳光直射、无腐蚀性气体、无重压的条件。

四.治疗

治疗皮肤不平整，有皮肤细纹，皮肤光泽暗淡，和用于丰厚嘴唇，填充鼻唇沟等，治疗20例。

1.治疗者术前检查，各项指标均正常，包括：血尿便常规、心电图、肝肾功能、HIV、HbsAg。

2.将注射部位用70％的酒精消毒，局部注射1％的利多卡因麻醉。

3.将1.5ml细胞悬液吸入3ml的注射器中备用。

4.取2.2cm长的4.5号针头，采用多点斜面(针头与皮肤的角度20°～45°)，在注射部位注射细胞悬液。注射时将注射部位表皮拉紧，使其发白，注射时使注射部位留有弥散空间。注射完后用冰袋外敷2小时。

疗程：上述部位共注射2次，间隔2周。

五、术后观察、调护：

同实施例1。

六、效果描述：

治疗三个月后，皮肤基本平整，细小纹消失，皮肤变得光洁有弹性；嘴唇显得较丰满，鼻唇沟明显变浅。

实施例4：注射用人体液态真皮层制剂治疗病例统计报告(病例数60)

1.纳入标准：年龄在60岁以下(包括60岁)；皱纹者为额头、眼周、口周皱纹；疤痕者为粉刺、创伤疤痕(大小范围无要求)，皮肤松垂、光泽暗淡等。

2.排除标准：年龄在60岁以上治疗者；有自身免疫性疾病；有慢性皮肤病者；有传染病者。

3.经过对60例的病例分析，两次注射的有48例，持续观察时间6个月。结果为，从接受注射处理开始3周内，有30例显示出明显的填充修复效果，治疗者自我感觉满意的有60例(其满意率为100％)；到3个月时，治疗后的皱纹基本消失，疤痕明显减小，皮肤基质状况明显得到改善。

其中有几个治疗者至今已观察二年，其皱纹、疤痕已完全消失，皮肤光滑而富有弹性。

实施例5：对比实施例：现有技术除皱祛疤注射剂的制备和应用

按照中国专利申请第03155833.X号中记载的方法，制备了现有技术的除皱祛疤注射剂，并对比检验了其应用效果，具体做法如下述。

一.自体健康细胞的提取

用70％的酒精消毒受试者耳后或胳膊内侧，然后用10％的利多卡因和十万分之一的肾上腺素进行局部表面麻醉。用取皮器将耳后4平方毫米的表皮和真皮组织取下，放入组织保存液(DMEM和10％胎牛血清，美国Hyclone公司)中，将创伤部位做一针缝合，创可贴覆盖。

二.细胞悬液的制备

1.组织消化(Sanyo CO₂培养箱)：将皮肤组织块放置于35mm培养皿中加入2ml浓度为0.05％的胰酶/EDTA液，37℃，10分钟；DMEM+10％FBS培养液终止。

2.细胞分离：将消化后的组织块剪碎并用吸管打散。

3.离心：吹散后的细胞收集至离心管中，Backman公司控温离心机，25℃，1000转/分钟，离心5分钟，弃去上清液。

4.原代细胞培养：在离心管中加入1ml含血清真皮细胞培养液(DMEM，D5546，加胎牛血清F2242，Sigma公司，美国)吹悬，接种入1×35mm培养皿；Sony CO₂培养箱，37℃，5％ CO₂，进行培养。

5.传代细胞培养：每隔2～3天换液1次，当细胞达到50-70％汇集细胞后传代。

6.配制注射剂：收集在体外传代至第5周后的有效成分，向生理盐水注射液中加入收集的有效成分，配制成每毫升混悬液含1000-2000万个有效细胞成分的1-4ml混悬液。

三.产品检测

1.病毒检测：将皮肤组织进行培养5周后，取1ml含有细胞的培养液送北京传染病医院进行HIV和肝炎病毒的检验，为无病毒细胞。

2.免疫反应测试：第四周将0.1ml细胞悬浮液对受术者进行皮试(同青霉素皮试方法)，无免疫反应。

3.成品检测

1)外观：本品为淡白色混悬液。

本品中有效成分分类检定：

成纤维干细胞：采用Brdu抗体测定表明，该填充剂中成纤维干细胞个数占三种细胞总个数的比例为5-15％。

成纤维前体细胞：采用细胞形态学方法观察，该填充剂中成纤维前体细胞个数占三种细胞总个数的比例为30-50％。

成纤维细胞：采用细胞形态学方法观察，该填充剂中成纤维细胞个数占三种细胞总个数的比例为40-60％。

胶原蛋白：采用胶原蛋白测定方法，测定该填充剂中胶原蛋白成分重量含量为2-5mg/ml。

2)无菌试验：按《中国生物制品规程》(2000版)通则《生物制品无菌试验规程》A/B项进行，结果符合无菌要求。

产品的储存和运输在4℃的特殊保存箱中，该箱符合阴凉、干燥、清洁、避免阳光直射、无腐蚀性气体、无重压的条件。

四.治疗

治疗面部面部皱纹，凹陷性疤痕，28例。

1.患者术前检查均正常，包括：血尿便常规、心电图、肝肾功能、HIV、HbsAg。

2.将注射部位用70％的酒精消毒，表皮用2.5％利多卡因麻醉。

3.将1.5ml细胞悬液吸入3ml的注射器中备用。

4.取2.2cm长的4.5号针头，采用多点斜面(针头与皮肤的角度20°～45°)将细胞悬液注入到皱纹和凹陷性疤痕真皮层的上层与中层，注射时应将注射部位表皮拉紧，使其发白，注射时应使注射部位留有弥散空间。注射完后用冰袋外敷2小时。

术后无其它的局部和全身反应。

疗程：注射2次，每次注射间隔2周。

五、术后观察、调护：

1.手术后，用冰袋敷注射处2小时。

2.观察局部及全身的情况。

3.每天二次局部搽含有维生素C的面霜，约6个月。

4.术后3天内防曝晒及慎用刺激性化妆品。

六、效果描述：

治疗六个月后，眼角鱼尾纹基本消失，额头皱纹变浅和部分消失，额头皮肤有光泽，弹性增强。治疗者普遍认为，需6-9个月后方出现明显效果，起效时间嫌慢。

Claims (11)

1.一种注射用人体液态真皮层制剂，其特征在于：由来源于治疗者自体的皮肤经过消化分离，得到的真皮成纤维干细胞、成纤维前体细胞、成纤维细胞进行体外全程无血清培养和扩增后，将收集到的有效成分与生理盐水注射液或其它注射液、以及任选的其它适用成分配成，有效成分由选自培养后收集到的真皮成纤维干细胞、成纤维前体细胞、成纤维细胞中的至少一种和胶原蛋白组成；每毫升注射用填充剂中，有效细胞成分的总个数为1000-8000万个，胶原蛋白的含量为10-100mg/ml注射用填充剂。

2.根据权利要求1所述的注射用人体液态真皮层制剂，其特征在于：所述注射填充剂中的有效成分由所说的自体真皮成纤维干细胞、成纤维前体细胞、成纤维细胞及胶原蛋白共同组成，成纤维干细胞、成纤维前体细胞、成纤维细胞之间的个数比例范围为5-20∶20-50∶30-70；胶原蛋白的含量为10-100mg/ml注射用填充剂，优选20-60mg/ml注射用填充剂。

3.根据权利要求2所述的注射用人体液态真皮层制剂，其特征在于：所述有效成分是在体外全程无血清培养和扩增过程中使用了还包含生长因子和活性材料的培养液后得到的。

4.根据权利要求3所述的注射用人体液态真皮层制剂，其特征在于：所说生长因子为至少一种选自上皮生长因子、成纤维生长因子等的成分，其在培养液中的含量范围为1-10ng/ml，优选为2-5ng/ml；所说活性材料为至少一种选自皮质激素、脑垂体提取液等的成分，其在培养液中的含量范围为0.1-1％，优选为0.2-0.5％。

5.根据权利要求1-4中任意一项所述的注射用人体液态真皮层制剂的应用，用于真皮缺损而导致的各种症状的填充，包括处理面部皱纹，颈部皱纹，凹陷性疤痕，妊娠纹，手背皱纹，丰唇，以及增强真皮厚度和改善皮肤基质。

6.一种制备注射用人体液态真皮层制剂的方法，包含自体皮肤取材、离体皮肤组织块的体外长时间保存、组织消化和细胞分离、体外无血清培养组织细胞有效成分、和将有效成分与生理盐水注射液或其它注射液、以及任选的其它适用成分配成填充剂几个步骤，有效成分由选自培养后收集到的真皮成纤维干细胞、成纤维前体细胞、成纤维细胞中的至少一种和胶原蛋白组成；在每毫升填充剂中，有效细胞成分的总个数为1000-8000万个，胶原蛋白的含量为10-100mg/ml注射用填充剂。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，离体皮肤组织块的体外长时间保存是由生长因子、活性材料、体外培养组织细胞有效成分、和将有效成分与生理盐水注射液或其他注射液、以及任选的其它适用成分配制成的离体皮肤组织块保存液。

8.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，有效成分由所说的自体真皮成纤维干细胞、成纤维前体细胞、成纤维细胞和胶原蛋白共同组成；成纤维干细胞、成纤维前体细胞、成纤维细胞之间的个数比例范围为5-20∶20-50∶30-70；胶原蛋白的含量10-100mg/ml注射用填充剂，优选20-60mg/ml注射用填充剂。

9.根据权利要求8所述的的方法，其特征在于，在体外全程无血清培养和扩增过程中使用的培养液中还包含生长因子和活性材料，所说生长因子为至少一种选自上皮生长因子、成纤维生长因子的成分；所说活性材料为至少一种选自皮质激素、脑垂体提取液的成分。

10.根据权利要求9所述的的方法，其特征在于，培养液中所说生长因子的含量为0.1-5ng/ml，优选为0.5-2ng/ml；所说活性材料的含量为0.1-1％，优选为0.2-0.5％。

11.根据权利要求6、8、9、10中任意一项所述的的方法，其特征在于，体外培养时间为6-10周。

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