CN102233144A - 一种利用组织工程技术进行皮下组织再生的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及了一种利用组织工程技术进行皮下组织再生的方法，属于组织工程领域。该发明是利用废弃的健康婴儿脐带，提取分离其内部的间充质干细胞，利用无动物源血清体外安全扩增后与可降解凝胶生物材料混合构成可皮下注射的复合物，该复合物主要应用范围为对衰老、凹陷填充、瘢痕修复以及烧伤科辅助大面积皮肤缺损修复、糖尿病足底溃疡的治疗。脐带来源的间充质干细胞活性好，无免疫排斥，避免了伦理限制，复合物回注手术简单，治疗后效果显著，能够针对临床治疗的及时性。

Description

一种利用组织工程技术进行皮下组织再生的方法

技术领域

本发明是取用健康胎儿分娩后废弃的脐带，分离其内部的间充质干细胞，进行无外源性动物血清培养扩增、安全检定后，结合可降解生物支架材料进行皮下组织再生，适用于整形美容科治疗衰老、修复瘢痕，烧伤科辅助大面积皮肤缺损修复，内分泌科糖尿病足的治疗等，属于组织工程领域。 

背景技术

应用可注射整形美容外科物质进行组织修复、畸形矫正和面貌年轻化治疗是为了适应患者和美容就医者对微创外科技术的需要，也是目前整形外科临床技术发展的趋势之一。随着消费者和病患要求的不断提高，整形美容外科填充去皱、皮肤光老化修复、皮肤凹陷填充等正在寻求一种无并发症、效果持久、手术简单无创伤的方法以应对患者和美容就医者的需求。 

目前，应用在整形美容外科填充去皱、皮肤光老化修复、皮肤凹陷填充主要通过以下的方法进行解决，第一类是利用以胶原、透明质酸、聚乳酸等可降解材料及丙烯酸水凝胶、聚甲基丙烯酸甲酯不可降解加可降解复合材料等天然组织提取物和化学聚合物作为皮下填充物。这类物质在注射到皮下后，很多会引起局部的过敏反应，同时由于皮下组织吸收的原因，也会造成注射后填充效果不能持久的现象；第二类是自体脂肪移植的方法，但是医师的脂肪抽取和注射手法直接影响着脂肪颗粒的成活率，临床上自体脂肪颗粒移植手术由于局部缺血状况常常导致液化性囊肿、钙化、坏死和感染的现象发生，同时脂肪抽取过程本身对病人的伤害也很大，手术不当常常会导致脂肪抽取部位出现瘢痕性损伤，降低了爱美者的生活质量；第三类是通过自体细胞移植的办法以达到填充的办法，这种方法可以避免免疫排斥，应用前景也很广阔，但是我们也不得 损伤，降低了爱美者的生活质量；第三类是通过自体细胞移植的办法以达到填充的办法，这种方法可以避免免疫排斥，应用前景也很广阔，但是我们也不得不考虑如下几个问题，第一：提取细胞的组织来自于患者自身，这样就不可避免地对自身局部造成了伤害，就像在第二类中概括的那样，抽脂很容易导致抽吸部位瘢痕性损伤；第二：人体细胞端粒长度随年龄的增加而逐渐缩短，细胞的活性也随着个体年龄的增大也逐渐地减弱，爱美者大部分是中年以上人士，有前甚至是老年，从这个年龄阶段获取来的细胞其活性远远不及年龄早期的活性好，活性降低直接导致移植后细胞的功能性减弱，所以也不会出现很好的临床效果；第三：在扩增细胞的过程中，目前广泛采用的动物血清(主要是牛血清)作为营养因子添加到培养基中，动物血清来源于异种，极有可能含有外源性动物病毒，这无疑就降低了细胞治疗的安全性。第四：自体细胞从分离培养到回注体内间隔的时间长，如此就导致了治疗的不及时性；同时有时甚至会出现诸如原代细胞培养失败、细胞污染等问题，这样就需再次从患者身上获取组织，大部分患者面对此类情况也会变得难以承受。 

随着社会的发展，大面积皮肤损伤非常常见，如烫伤、烧伤、撕脱伤、碾挫伤以及由糖尿病导致的皮肤损伤等，这些损伤在临床上很难治疗，只要治愈不及时，往往会引起感染等现象发生。尽管目前临床上采取了诸多方法去预防感染的发生，及时修复损伤的皮肤，例如进行皮肤移植、植入人造皮肤等，这些方法能够对损伤的皮肤起到一定的修复作用，但是综合目前的使用情况来看效果并不是很明显，同时采用这些方法治疗大面积皮肤缺损，价格也比较昂贵，并非每个患者都能够承受，所以寻求一种更加有效、更加经济的方式修复大面积皮肤缺损迫在眉睫。 

发明内容

针对以上方法的不足和缺陷，本发明提供了一种快速、安全、有效、持久的组织工程细胞移植的方法，用以解决整形美容行业治疗衰老、凹陷填充、瘢痕修复以及烧伤科辅助大面积皮肤缺损修复、糖尿病足底溃疡治疗。 

本发明选用了健康婴儿分娩后废弃的脐带，提提取分离其内部的间充质干细胞，根据患者的需求在体外培养扩增脐带来源的间充质干细胞，将脐带来源的间充质干细胞按照1×10⁵～10⁸个细胞与1～5ml生物支架材料混合形成复合物，并可在复合物内添加一定量的营养因子进行皮下注射，以满足对衰老、凹陷填充、瘢痕修复以及烧伤科辅助大面积皮肤缺损、糖尿病足底溃疡治疗的目的。 

本发明所选用的脐带来源的间充质干细胞，由于其免疫原性很弱，所以异体移植不会使供体产生免疫反应和过敏症状，同时由于间充质干细胞来源于早期的机体组织，细胞活性好，对衰老、凹陷填充、瘢痕修复以及烧伤科辅助大面积皮肤缺损修复、糖尿病足底溃疡的治疗效果非常明显。 

本发明在培养脐带来源的间充质干细胞过程中，所使用的营养添加物不是来自于动物血清，而是采用了人血液中血小板和血浆中的有效成分作为细胞生长的营养，这样就避免了动物血清中可能含有的异种病毒的污染，提高了细胞移植的安全性。 

本发明采用的间充质干细胞结合组织工程凝胶支架的技术可以更好地提高细胞的存活率，同时由于细胞外支架材料的存在，细胞向注射点周边部位迁移的数量减少，治疗的有效性得到了提高。 

本发明针对临床治疗的紧迫性，将脐带来源的间充质干细胞培养扩增到一 定的数量并检定其安全性后，将细胞分成若干批次冻存于-196℃的液氮内。这样就可以随时满足临床治疗的需要，把握了治疗的最佳时机，提高了治疗的效果，为患者减轻病痛之苦带来了希望。 

具体实施方式

具体实施方式一：脐带间充质干细胞的分离、培养及鉴定 

1.健康婴儿脐带的处理及运输 

在征得孕妇及其家属的同意后，对母体进行肝炎病毒、艾滋病毒等传染病的检测。检测合格后，在婴儿分娩的当日实施脐带采集。当婴儿脱离母体后，用止血钳夹住脐带的两端(靠近胎盘的一端和靠近婴儿的一端)，剪断止血钳夹住的两端部位，随即将分离得到的长约10cm脐带放入无菌的BasalMedia Eagle溶液中(溶液内预先添加了一定量的青霉素、链霉素、庆大霉素和两性霉素B，以防止在脐带采集过程中受到外界菌类的污染)。低温保存运输。 

2.脐带间充质干细胞的分离与扩增 

(1)将收集得到的脐带转移到GMP实验室后，用无菌的PBS清洗2-3遍，洗去脐带表面的血液，然后用5ml的无菌注射器吸取PBS冲洗脐带的静脉管2-3遍直至脐带成乳白色半透明状； 

(2)用眼科剪沿着脐带静脉血管将脐带剪开，同时用手术刀把脐带分成若干小段，每段长度控制在1cm左右； 

(3)把1cm左右的脐带小段转移到无菌小瓶内，用剪刀将其剪成大小约1mm³的块状，用镊子将块状的脐带转移到培养皿中，分散均匀，然后把培养皿放入37℃、5％CO₂的培养箱内，孵育5～10min； 

(4)孵育完成后，向培养皿内缓慢添加完全培养基(低糖DMEM+10％人血小板/血浆)，然后继续放入37℃、5％CO₂的培养箱内培养； 

(5)培养3天后，根据脐带组织块周边细胞生长的情况进行换液； 

(6)待细胞长至80％左右时，用0.25％胰酶/EDTA消化细胞并按照1∶5的比例传代培养，然后将培养皿转移到37℃、5％CO₂的培养箱中。 

3.脐带间充质干细胞的鉴定 

在细胞生长过程中，根据细胞生长的形态、生长周期等对细胞各方面的指标进行判断，结果显示培养中的脐带来源的间充质干细胞与国内外文献报道的细胞特征相符合；利用免疫荧光的方法对脐带间充质间充质干细胞相对特异性标记进行检测，结果显示脐带间充质间充质干细胞抗原CD73、CD90、CD105呈阳性表达，抗原CD45、CD34呈阴性表达；经过成骨、成脂分化培养基的诱导，脐带间充质干细胞能够分化形成成骨细胞和脂肪细胞。 

以上特征表明：由脐带分离得到的间充质干细胞具有典型的多潜能特征，各方面的指标均体现出脐带间充质干细胞在体外培养的过程中未出现任何异常现象。 

具体实施方式二：脐带间充质干细胞无外源动物血清的培养方法 

为了有效避免动物血清可能存在的病毒对细胞造成污染，本发明在培养脐带间充质干细胞过程中，所使用的培养基中的添加物不是常规的动物血清，而是从健康人体的血液中分离得到的血小板和血浆有效的营养成分。血液的来源主要来自于后期患者自身，经过处理、检测后得到血小板和血浆有效成分，并按照一定的比例与低糖DMEM基础培养基混合制备成完全培养基。 

具体实施方式三：脐带间充质干细胞与凝胶材料复合物安全性检测 

收集第三代至第五代的脐带间充质干细胞，按照1×10⁵～10⁸个细胞与生物凝胶混合形成可注射型复合物，并可选择在其中添加一定量的生长因子。按照相关标准检测细胞的成活率、菌类、病毒、致瘤性，主要参照的标准有：《中国药典》2005版第三部附录XII A第73页和《组织工程医疗产品第12部分：细胞、组织、器官的加工指南》相关规定；《中国药典》2005版第三部附录规定；人的体细胞治疗申报临床试验指导原则、实验动物管理条例等。结果显示：培养扩增的第三代到第五代的脐带间充质干细胞与凝胶材料结合形成的复合物未受到任何微生物及病毒的污染，动物致瘤性实验未观察到动物体表及体内器官发生癌变。 

具体实施方式四：脐带间充质干细胞与凝胶材料复合物的动物实验 

选取健康雄性裸鼠若干只，体重在20g左右，于皮下注射复合物150μl，以PBS为对照组，实验组和对照组各3只，实验重复三次。30天后，取注射部位皮肤及附属组织进行组织切片检测。结果显示：实验组注射部位的皮肤组织内有人源性细胞的存在，并主要分布在真皮层和皮下组织层，实验组真皮组织的厚度高于对照组。 

具体实施方式五：脐带间充质干细胞与凝胶材料复合物的临床试验 

1.临床试验志愿者招募标准：招募的临床试验病例年龄在30～60岁左右，性别不限，主要的病例有以下几类：(1)面部衰老症状明显的病例，皮肤光老化现象严重，光泽差，皱纹明显；(2)面部瘢痕明显的病例：由青春痘、粉刺等原因导致面部有较为明显的瘢痕，影响美观；(3)烧伤、烫伤 病例：烧伤、烫伤面积较大，需植皮手术才能修复的患者；(4)糖尿病患者：严重的I型糖尿病患者足底有溃疡产生。 

以上试验病例在临床试验前均需进行肝炎病毒、HIV病毒及血常规、尿常规、肝功能等检查，合格者才能进入临床试验。 

2.术前免疫反应检测：在临床实验注射前，取20～50μl的复合物对临床试验患者进行皮试检测，观察有无免疫反应出现。经皮试后，以上病例均未出项典型的免疫排斥反应，如注射部位无红肿、瘙痒、疼痛等症状出现。 

3.手术实施 

(1)面部衰老症状明显的病例：对于除皱的病例，在病人皱纹局部消毒、表面麻醉情况下，将本发明的复合物用1ml注射器注射到皱纹真皮和皮下组织的交界部位，边注射边退针。对于需要改善局部皮肤老化的病例，局部消毒麻醉后，采取局部多点进针，每个点的注射量控制在不超过50μl。 

(2)面部瘢痕明显的病例：在瘢痕局部消毒麻醉后，于瘢痕处进针注射，注射的部位在真皮和皮下组织之间，边注射边退针。 

(3)烧伤病例：先对烧伤部位进行清洗，然后局部消毒麻醉，在烧伤皮肤及其周边部位注射本发明的复合物，采取多点注射，每个点注射的量控制在100μl左右。 

(4)糖尿病足底溃疡患者：清洗足底溃疡，周边组织消毒麻醉后，在离溃疡1～1.5cm处注射本复合物，同样采取多点注射，每个点注射的量控制在100μl左右。 

4.术后观察与护理 

在复合物注射完成后，用冰袋冰敷注射部位1个小时；注射完成后注意 观察局部注射部位的变化；注射完成后，3天内不要在注射部位使用刺激性的化妆品或者过紧的包扎；注射手术完成后，服用维生素C一个月左右。 

5.临床试验术后效果 

针对皮肤衰老的患者，通过本发明治疗后，面部皮肤的光泽度得到和很大的提高，皱纹完全消失，部分皱纹较深的患者，在二次治疗注射后，皱纹也得到了很大改善，效果维持长久；面部瘢痕患者接受治疗的一个月以后，瘢痕得到了缓解，患者自信心也随之提高；皮肤严重缺损的患者在本发明复合物注射手术的辅助下，减低了感染的几率，缩短了皮肤痊愈的时间。 

Claims (6)

1.一种利用组织工程技术进行皮下组织再生的方法，其特征在于：组织工程种子细胞来源于健康胎儿分娩后废弃的脐带，经过分离提取、培养扩增后得到弱免疫原性的多潜能性间充质于细胞，同时结合可降解生物材料形成可注射型复合物，注射部位主要为皮下组织真皮与皮下组织之间。

2.如权利要求书1所述皮下组织再生的方法，其特征在于：种子细胞来自于健康、有活性、多潜能的脐带间充质干细胞，培养过程不添加外源性动物血清，种子细胞在植入皮下后可以分化形成表皮、真皮及脂肪组织。

3.如权利要求书1所述皮下组织再生的方法，其特征在于：1×10⁵～10⁸个细胞与1～5ml生物支架材料混合形成复合物。

4.如权利要求书1所述皮下组织再生的方法，其特征在于：生物材料为生物相容性好、可降解的凝胶支架，主要为泊洛沙姆(poloxamer)凝胶、胶原蛋白凝胶和透明质酸凝胶，生物材料内可添加一定量支持细胞生长的营养因子构成细胞—凝胶支架复合物。

5.如权利要求书1所述皮下组织再生的方法，其应用范围有：整形美容科(包括填充去皱、皮肤光老化修复、皮肤凹陷填充、皮肤瘢痕修复)、烧伤科大面积皮肤缺损后的再生和糖尿病足底溃疡治疗。

6.如权利要求书1所述皮下组织再生的方法，其特征在于：用于皮下组织再生的复合物皮下注射的方法为医用注射器注射到真皮和皮下组织之间。