CN109069661A - 利用聚合蛋白共轭物的治疗 - Google Patents

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Abstract

本文公开了一种组成物，所述组成物用于治疗与关节软骨的退化及/或软骨下骨的骨质流失相关联的一病症。所述组成物包括一共轭物，所述共轭物包括一多肽，所述多肽具有附接至所述多肽的至少两个聚合物部分，至少一个所述聚合物部分表现一逆向热凝胶作用。本文进一步公开了一种组成物，所述组成物包括上述共轭物及一透明质酸、一抗炎剂、一镇痛剂、一生长因子、一血液部分、一核酸及/或一细胞；所述组成物为一水性组成物，所述水性组成物在32℃至37℃的一范围的一温度下形成一水凝胶；并且公开了一种利用这种包括一核酸的一组成物来实现基因递送的方法。在一实施例中，所述组成物包含纤维蛋白原对F127泊洛沙姆丙烯酸酯的一共轭物。

Description

利用聚合蛋白共轭物的治疗
技术领域及背景技术
在本发明的一些实施例中，本发明涉及治疗，并且特别地但不单独地涉及包括一聚合蛋白共轭物的组成物以及所述组成物在数个治疗应用中的用途，例如：用于治疗关节软骨的退化及/或软骨下骨的骨质流失以及与其相关联的病症，例如：关节炎。
软骨及软骨下骨(即软骨下面的骨骼)是在关节的承载中起到互补作用的动态应力承受结构。软骨下骨支撑覆盖的关节软骨并且在关节表面上分散机械载荷[Li等人,Arthritis Res Ther 2013,15:223]。
骨关节炎(OA)是最常见的关节疾病，仅在美国就有超过2000万的患病率，导致残疾、降低生活品质及参与社交活动。骨关节炎涉及软骨损失、软骨下骨的变化、滑膜炎症及半月板的退化[Favero等人，RMD Open 2015,1(Suppl 1)：e000062；Loeser等人，ArthritisRheum 2012,64：1697-1707]。骨关节炎的风险因素包括：年龄、性别、肥胖、职业、创伤、动脉粥状硬化导致的血管疾病及固定化[Alexander，Skeletal Radiol 2004,33：321-324]。骨关节炎可以源自发炎、代谢及机械性的原因。骨关节炎可能由关节软骨的破坏而产生；或者相反地，软骨下骨的硬化实际上可能在软骨退化及丧失之前发生[Moskowitz等人,Am JOrthop(Belle Mead NJ)2004,33(Suppl 2):5-9；Imhof等人,Invest.Radiol 2000,35:581-588]。它与所述关节软骨的进行性损伤相关联，伴随软骨下骨、骨赘的形成，关节囊的增厚及滑膜炎，引起所述受影响的关节的不适及疼痛。在许多情况下，膝关节的置换将是恢复功能及减轻疼痛的一最终方法[Cuervo等人,International Journal of Orthopaedics2015,210–218；Radin,J Rheumatol 2005,32:1136–1138]。
在人类骨关节炎的早期阶段，观察到骨质重塑的升高及软骨下骨的骨质流失，并且被认为是骨关节炎进展的一个因素[Bettica等人，Arthritis Rheum2002,46:3178-3184]。软骨下骨中的空洞损害，称为「软骨下骨囊肿」，软骨下骨囊肿在骨关节炎的患者中是常见的，并且最近的证据指出，软骨下骨囊肿(SBC)患者的疾病严重程度及疼痛程度更高，并且在关节置换手术中具有一更高的风险[Tanamas等人，Arthritis Res Ther 2010,12：R58]。
现今，骨关节炎的管理方式包括：通过体重控制及运动减少关节的过载、全身性或局部的非类固醇抗炎药(NSAIDS)、镇痛药(例如：对乙酰氨基酚)、局部辣椒素、口服及局部阿片类药物、去甲肾上腺素及血清素再摄取抑制剂(例如：度洛西汀)、互补葡萄糖胺及硫酸软骨素[Yu&Hunter，Aust Prescr2015,38：115-119]。
骨关节炎也通过关节内注射的治疗剂来治疗，例如：皮质类固醇、基于透明质酸(HA)的粘弹性补充剂及富含血小板的血浆(PRP)[Yu&Hunter，Aust Prescr 2015,38：115-119；Evans等人，Nat Rev Rheumatol 2014,10：11-22]。取决于所述注射分子的大小，这种递送的方式受到注射材料从关节空隙到所述循环或通过所述淋巴系统的快速排出现象的影响[Evans等人，Nat Rev Rheumatol 2014,10：11-22]。皮质类固醇是有效的，但由于可能的副作用及所述疾病的遽增，长期使用是不适当的。
基于透明质酸的黏弹性补充剂通常通过关节内注射递送，并且可包括：交联的透明质酸(例如：Synvisc-)或非交联的透明质酸(例如：)。上述补充剂的使用是基于观察到患有骨关节炎的关节中透明质酸的浓度及分子量的降低，这种情形被认为是导致润滑及减震的丧失[Ammar等人，Rev Bras Ortop 2015,50：489-494；Strauss等人，Am J Sports Med2009,37：1636-1644]。然而，近期在使用透明质酸粘弹性补充剂的大量临床试验中，所述临床试验的系统综述及荟萃分析表明透明质酸粘弹性补充剂的功效是有问题的[Jevsevar等人，J Bone Joint Surg Am 2015,97：2047-2060；Ammar等人，RevBras Ortop 2015,50：489-494；Evans等人，Nat Rev Rheumatol2014,10：11-22]。基于透明质酸的粘弹性补充剂的一个缺点是所述黏弹性补充剂与意图补充的内源性透明质酸具有相同的特性，即一相对短的半衰期，所述半衰期的范围从几小时到几天[Wen，Am FamPhysician 2000,62：565-70；Larsen等人，J Biomed Mater Res B Appl Biomater 2012,100：457-462；Benke&Shaffer，Curr Pain Headache Rep 2009,13：440-446]。
根据报道，在一些临床研究中，关节内注射富含血小板的血浆(PRP)可以显着提高透明质酸的疗效[Meheux等人，Arthroscopy 2016,32：495-505；Xie等人，Arthritis ResTher 2014,16：204；Cuervo等人，International Journal of Orthopaedics 2015,210-218]。
Saito等人[Clin Exp Rheumatol 2009,27：201-207]描述了含有PRP的一水凝胶，所述水凝胶用于在所述PRP中持续释放生长因子。
其他方法包括关节内注射干细胞；数种抗体及数种促炎细胞因子的受体拮抗剂，例如：抗TNF及抗IL1β抗体及IL1受体拮抗剂；及数种生长因子，例如：骨形态发生蛋白7(BMP-7)及成纤维细胞生长因子18(FGF-18))[Cuervo等人，International Journal ofOrthopaedics 2015,210-218]。
正在研究的另一种方法涉及通过病毒或非病毒载体在关节内递送基因，直接或通过施用在体外进行基因修饰的细胞[Madry等人，Cartilage 2011,2：201-225；Madry&Cucchiarini，J Gene Med 2013,15：343-355；Evans等人，Transl Res 2013,161：205-2016]。根据报导，在第二期临床试验中，在类风湿性关节炎患者的关节内注射用于依那西普的编码腺体相关病毒(AAV)的载体[Mease等人，J Rheumatol 2010,37：692-703]或在骨关节炎患者中产生TGF-β的基因工程软骨细胞后[Ha等人，Hum Gene Ther Clin Dev 2015,26：125-130]，改善了试验结果。
国际专利申请公开号WO2011/073991描述一种组成物，所述组成物包括：一聚合物(例如：F127泊洛沙姆)与一蛋白质(例如：纤维蛋白原)的共轭物，以及由这些组成物表现出的逆向热凝胶化，所述组成物与种子细胞的相容性，以及所述组成物在细胞生长及组织形成等应用中的用途。Shachaf等人进一步描述了纤维蛋白原F127泊洛沙姆共轭物的性质及用途[Biomaterials 2010,31：2836-2847]以及Frisman等人[Langmuir 2011,27：6977-6986]。
Rothenfluh等人[Nat Mater 2008,7：248-254]描述了一软骨结合六肽与一基于F127泊洛沙姆的纳米颗粒的共轭，以及使用所述共轭物将包封在所述纳米颗粒内的一药物递送至关节软骨。
其他背景技术包括：Almany及Seliktar[Biomaterials 2005,26：2467-2477]、Eguiluz等人[Biomacromolecules 2015,16：2884-2894]、Evans等人[Nat Rev Rheumatol2014,10：11-22]、Gobbi等人[Knee Surg Sports Traumatol Arthrosc2015,23：2170-2177]、Gonen-Wadmany等人[Biomaterials 2007,28：3876-3886]、Jay&Waller[MatrixBiol 2014,39：17-24]、Peled等人[Biomed Mater Res A2007,80：874-884]及Seliktar[Ann NY Acad Sci 2005,1047：386-394]；国际专利申请公开号WO 2005/061018、WO 2008/126092及WO 2014/207749；美国专利申请公开号No.2011/0125156；以及美国专利号8,007,774及7,842,667。
发明内容
根据本发明的一些实施例的一方面，提供一种组成物，所述组成物包括：一共轭物(conjugate)，所述共轭物包括一多肽(polypeptide)，所述多肽具有附接至所述多肽的至少两个聚合物部分(polymeric moieties)，至少一个所述聚合物部分表现一逆向热凝胶化(reverse thermal gelation)，所述组成物用于治疗关于关节软骨的退化及/或软骨下骨的骨质流失的一病症。
根据本发明的一些实施例的一方面，提供一医药组成物，所述医药组成物包括：
一共轭物，所述共轭物包括一多肽，所述多肽具有附接至所述多肽的至少两个聚合物部分，至少一个所述聚合物部分表现一逆向热凝胶化；以及
至少一个附加的治疗活性剂是选自于由一透明质酸(hyaluronic acid)、一抗炎剂(anti-inflammatory agent)、一镇痛剂(analgesic)、一生长因子(growth factor)、一血液部分(blood fraction)、一核酸(nucleic acid)及一细胞(cell)所组成的群组；
所述组成物在32℃至37℃的一范围的一温度下形成一水凝胶(hydrogel)。
根据本发明的一些实施例的一方面，提供一种实现递送基因的方法，所述方法使至少一个细胞与如本文所述的组成物接触，所述组成物包括如本文所述的一核酸，并且所述核酸包括上述的基因，从而实现将所述基因递送至至少一个细胞。
根据本发明的一些实施例，所述方法在体外实现。
根据本发明的任何实施例的一些实施例，治疗包括关节内施用所述组成物。
根据本发明的一些实施例，所述施用包括关节内注射。
根据本发明的一些实施例，所述关节软骨的退化及/或软骨下骨质流失与在所述关节软骨的一表面处的一摩擦相关联。
根据本发明的一些实施例，所述病症与一软骨下骨囊肿(subchondral bonecyst)相关联。
根据本发明的一些实施例，治疗包括注射所述组成物至所述骨囊肿。
根据本发明的一些实施例，其特征在于：所述组成物的一静摩擦系数小于0.2。
根据本发明的一些实施例，所述退化与一发炎(inflammation)相关联。
根据本发明的一些实施例，所述组成物减少发炎引起的软骨退化。
根据本发明的一些实施例，其特征在于：所述组成物在37℃的一温度下与一含水液体一起温育48小时后的水分吸收小于20重量百分比。
根据本发明的一些实施例，所述组成物包括所述共轭物的一水溶液。
根据本发明的一些实施例，所述组成物在32℃至37℃的一范围的一温度下形成一水凝胶。
根据本发明的一些实施例，所述水凝胶的一剪切储能模量为至少15帕斯卡。
根据本发明的一些实施例，所述组成物能够进行一逆向热凝胶化。
根据本发明的一些实施例，所述组成物进一步包括至少一附加的治疗活性剂。
根据本发明的一些实施例，所述附加的治疗活性剂是选自于由一透明质酸、一抗炎剂、一镇痛剂、一生长因子、一血液部分、一核酸及一细胞所组成的群组。
根据本发明的一些实施例，其中至少一附加的治疗活性剂是选自于由一透明质酸、一血液部份及一核酸所组成的群组。
根据本发明的一些实施例，所述组成物的至少20％重量是所述血液部分。
根据本发明的一些实施例，所述血液部分是选自于由一富含血小板的血浆及一缺乏血小板的血浆所组成的群组。
根据本发明的一些实施例，所述组成物能够持续释放所述治疗活性剂。
根据本发明的一些实施例，所述持续释放的特征在于：在一水性环境中温育48小时后，保留至少20％的治疗活性剂。
根据本发明的一些实施例，所述病症是关节炎(arthritis)。
根据本发明的一些实施例，所述关节炎是骨性关节炎(osteoarthritis)。
根据本发明的一些实施例，所述关节软骨及/或所述软骨下骨的至少一部分是在一滑膜关节(synovial joint)内。
根据本发明的一些实施例，所述组成物用于治疗可由一治疗活性剂治疗的一病症，所述组成物包括所述治疗活性剂。
根据本发明的一些实施例，所述病症通过局部施用所述治疗活性剂来治疗，并且所述治疗包括局部施用所述组合物。
根据本发明的一些实施例，所述至少一种治疗活性剂包括如本文所述的一血液部份，并且所述病症是选自于由关节炎、神经损伤(nerve injury)、肌腱炎(tendinitis)、肌肉损伤(muscle injury)、骨损伤(bone injury)及手术损伤(surgical injury)所组成的群组。
根据本发明的一些实施例，所述治疗包括将由如本文所述的一核酸组成的一基因递送至数个细胞，其中所述病症可通过在体内表现的所述基因来治疗。
根据本发明的一些实施例，所述至少一种治疗活性剂包括透明质酸，以及所述病症是关节炎。
根据本发明的一些实施例，所述病症可由所述细胞产生的一物质治疗。
根据本发明任何实施例的一些实施例，所述多肽是至少20个胺基酸的长度。
根据本发明的一些实施例，所述多肽能够黏附于软骨。
根据本发明的一些实施例，所述多肽对受损软骨表现出比未受损软骨更大的亲和力。
根据本发明的一些实施例，所述多肽包括一蛋白质或所述蛋白质的一片段。
根据本发明的一些实施例，所述多肽是选自于由纤维蛋白原(fibrinogen)、胶原蛋白(collagen)、纤维连接蛋白(fibronectin)、弹性蛋白(elastin)、原纤蛋白(fibrillin)、腓骨蛋白(fibulin)、层粘连蛋白(laminin)、白蛋白(albumin)、温韦伯氏因子(von Willebrand factor)及明胶(gelatin)及其的数个片段所组成的群组。
根据本发明的一些实施例，所述多肽包括一纤维蛋白原或所述纤维蛋白原的一片段。
根据本发明的一些实施例，所述蛋白质是变性的。
根据本发明的一些实施例，所述多肽是一变性的纤维蛋白原。
根据本发明的一些实施例，每一个所述聚合物部分表现一逆向热凝胶化。
根据本发明的一些实施例，所述聚合物部分包括一合成聚合物。
根据本发明的一些实施例，至少一个所述聚合物部分包括一泊洛沙姆(聚(环氧乙烷-环氧丙烷)共聚物)。
根据本发明的一些实施例，每一个所述聚合物部份包括一泊洛沙姆(poloxamer)。
根据本发明的一些实施例，所述泊洛沙姆是F127泊洛沙姆。
根据本发明的一些实施例，至少一个所述聚合物部分进一步包括能够在体内使所述共轭物与一蛋白质共价交联的至少一个交联部分。
根据本发明的一些实施例，所述共价交联的部份是选自于由一丙烯酸酯(acrylate)、一甲基丙烯酸酯(methacrylate)、一丙烯酰胺(acrylamide)、一甲基丙烯酰胺(methacrylamide)及一乙烯基砜(vinyl sulfone)所组成的群组。
根据本发明的一些实施例，所述多肽是变性的纤维蛋白原，以及所述聚合物部分包括F127泊洛沙姆。
根据本发明的一些实施例，所述共轭物包括F127泊洛沙姆二丙烯酸酯部分，其中每一个所述F127泊洛沙姆二丙烯酸酯部分的一丙烯酸酯基团附着至所述纤维蛋白原的一半胱氨酸残基(cysteine residue)。
根据本发明的任何实施例的一些实施例，所述组成物是一可注射的组成物。
根据本发明的任何实施例的一些实施例，至少一个细胞被所述组成物包封及/或在所述组成物的一表面上培养。
除非另外定义，否则本文使用的所有技术及/或科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的含义相同的含义。尽管与本文描述的那些类似或等同的方法及材料可用于实践或测试本发明的实施方案，但下文描述了示例性的方法及/或材料。如有冲突，将控制专利说明书，包括定义。另外，材料、方法及实施例仅是说明性的，并非旨在限制。
附图说明
仅通过举例的方式，本文中参考附图描述了本发明的一些实施例。现在详细地具体参考附图，要强调的是，所示的细节是作为示例并且出于说明性讨论本发明的实施例的目的。在这方面，通过附图中的描述使得本领域的技术人员清楚如何实施本发明的实施例。
在所述附图中：
图1显示根据本发明(GelrinV)的一些实施例的一示例性聚合蛋白组成物在22℃时的所述流动性，以及所述聚合蛋白组成物(为了清楚起见，组成物经染色处理)在37℃下凝胶化的数个图像。
图2A及图2B是显示了相位差显微镜(图2A)及荧光显微镜(图2B)的图像，所述图像显示用异硫氰酸荧光素标记的F127纤维蛋白原培养3天后具有圆形磨耗(1.5毫米直径)的牛软骨外植体。
图3是显示在1奈克/毫升的IL-1β的存在下，根据本发明(GelrinV)的一些实施例，经由示例性聚合蛋白组成物处理的软骨状软骨细胞颗粒的组织学剖面图(上图显示第二型胶原蛋白的染色，下图显示所述相应区域中纤维蛋白原的染色)。
图4显示了单独暴露于0.5奈克/毫升的IL-1β或与Synvisc-粘弹性补充物或根据本发明(GelrinV)的一些实施例的一示例性聚合蛋白组成物一起暴露之后，对于第二型胶原蛋白的软骨细胞颗粒经染色后的切片的图像(控制组未暴露于IL-1β)。
图5是显示根据本发明(GelrinV)的一些实施例，在具有及不具有一示例性聚合蛋白组成物的IL-1β处理4天后，软骨细胞颗粒中糖胺聚糖的水平(作为未处理对照组的百分比)的柱状图(结果表示至少6个样品的平均±SEM值)。
图6A及图6B分别是柱状图，所述柱状图显示根据本发明(GelrinV)的一些实施例，一示例性聚合蛋白胶组成物的水分吸收的柱状图，基于一透明质酸的粘弹性补充凝胶(图6A中的Synvisc-图6B中的)，并且在37℃下，在PBS(凝胶与PBS的比例为1：3.5)中温育48小时之后，所述黏弹性补充物及GelrinV的1：1混合物(结果显示3个样品的平均±STDEV值)
图7是显示在不存在或存在300微克/毫升的透明质酸酶(HAase)的情况下，以37℃在PBS中温育48小时之前及之后，Synvisc-粘弹性补充剂(100％HA)、根据本发明(GelrinV)的一些实施例的一示例性聚合蛋白组成物以及以1：1的比例混合Synvisc-黏弹性补充剂及GelrinV(HA：GelrinV(1：1))的一混合物的最大剪切储能模量(G')的柱状图(结果代表3个样品的平均±STDEV值)。
图8是显示根据本发明(GelrinV)的一些实施例及Synvisc-粘弹性补充剂的示例性组成物的静摩擦系数的柱状图(显示的结果是4个样品的平均值)。
图9是显示根据本发明(GelrinV)的一些实施例的示例性组成物，以及用于Synvisc-粘弹性补充剂作为滑动速度的一函数的摩擦系数的图，(在每个滑动速度范围为每秒2毫米至81毫米，显示的结果是4个样品的平均值)。
图10是根据本发明的可选实施例，描绘表现出软骨侵蚀的一关节软骨表面(蓝色阴影)的一示意图以及一机制，所述机制包括：泊洛沙姆(Pluronic-F127)及纤维蛋白原部分的缀合物可通过所述纤维蛋白原部分粘附至所述软骨表面并且通过所述泊洛沙姆部分提供润滑。
图11显示了描述使用一手术诱导的关节炎大鼠模型的一实验方案的时间轴，包括通过von Frey方法(VF)及步态分析评估疼痛。
图12显示代表性组织学横截面的数个图像，所述图像显示在用根据本发明的一些实施例(GelrinV)，Synvisc-粘弹性补充剂或磷酸盐缓冲盐水(PBS)处理的示例性组盛物经处理后用甲苯胺蓝染色的大鼠关节(箭头指示软骨的位置，通过超过50％的软骨厚度变性)。
图13是一柱状图，显示根据本发明(GelrinV)的一些实施例或Synvisc-粘弹性补充剂的示例性组成物治疗后大鼠关节中的实质软骨退化的宽度，作为用以下治疗后的实质性软骨退化宽度的百分比，磷酸盐缓冲盐水(PBS)(结果代表10个样品的平均±SE值)。
图14显示了根据本发明(GelrinV)的一些实施例中，一示例性组成物经两次关节内注射(14及28天前)至一大鼠关节的一代表性组织学横截面(在不同放大倍数)的图像，显示由抗聚乙二醇抗体指示的GelrinV共轭物分子的所述存在(红色染色)(样品也用苏木精染成蓝色/紫色；右图表示中间图中由虚线矩形表示的区域，以及中间图表示左图中由虚线矩形表示的区域)。
图15是显示经由根据本发明(GelrinV)的一些实施例中的一示例性组成物、Synvisc-粘弹性补充剂或磷酸盐缓冲盐水(PBS)治疗后，在一骨关节炎模型中数只大鼠的爪中，平均异常性疼痛(根据von Frey疼痛方案)的一柱状图。
图16A及16B是显示使用根据本发明(GelrinV)的一些实施例的一示例性组成物、Synvisc-粘弹性补充剂或磷酸盐缓冲盐水(PBS)对大鼠步态进行治疗的效果柱状图，评价为平均步态评分(图16A；0分＝正常步态，最高分为6＝跳跃)及步态不足百分比(图16B)。
图17是显示通过以1：1的体积比混合(在低于20℃的温度下)一示例性组成物(GelrinV)与未活化富含人类血小板的血浆(PRP)、缺乏血小板的血浆(PPP)或磷酸盐缓冲盐水(PBS)所形成的均质溶液的所述剪切储能模量(G')的图。
图18显示以4℃，在混合300微升的所述组成物与Cy3标记的质粒DNA(0.5μg)的一溶液及未标记的质粒DNA(0.5μg)之后，在37℃下加入100微升的PBS进行培养，作为游离(「裸露」)质粒或与聚乙烯亚胺(PEI)或PolyJetTM的复合物包埋在一示例性组成物(GelrinV)中的Cy3标记的DNA质粒的图像作为一时间函数。
图19A至图19F显示了根据本发明(图19A)的一些实施例，在培养基中包含绿色荧光蛋白(GFP)质粒纳米复合物的一聚合蛋白组成物(GelrinV)的一图像以及C2C12成肌细胞的数个荧光显微图像；在与纳米复合物预先培养(图19B)或伴随纳米复合物(图19C)之后将数个细胞包封在GelrinV中，或者将细胞作为一2D层接种在GelrinV的一层上，所述层具有在一塑料培养板(图19E)或管(图19F)系统中的纳米复合物，或者具有纳米复合物的GelrinV沉积在所述细胞层上方(图19D)。
图20显示了在包含绿色荧光蛋白(GFP)质粒纳米复合物的一示例性聚合蛋白组成物(GelrinV)的一层上接种作为一2D层的C2C12成肌细胞的数个荧光显微图像；在两种不同条件下，显示3种不同的C2C12培养物(任意编号为1、2及3)：没有经过洗涤的培养物(上图)及充分洗涤后的培养物(下图)。
具体实施方式
在本发明的一些实施例中，本发明涉及治疗，更具体地但非排除地涉及包括聚合蛋白共轭物的数种组成物以及所述组成物在治疗应用中的用途，例如：用于治疗关节软骨的退化及/或软骨下骨的骨质流失，以及与关节软骨的退化及软骨下骨的骨质流失相关的病症，例如：关节炎。
在详细解说本发明的至少一个实施例之前，应当理解，本发明不一定限于在以下描述中所阐述的应用或通过所述数个实施例所说明的细节。本发明能够具有其他实施例或者能够以各种方式实践或实施。
在寻找能够更有效治疗关节炎等病症的治疗方法的过程中，本发明人设想一种组成物，所述组成物包括表现出逆向热凝胶化的聚合蛋白共轭物，所述组成物可用于润滑关节并且从而保护软骨免于退化，及/或施用于软骨下骨囊肿，同时也相对容易地以一流体(非凝胶)形式进行施用。
在将本发明简化至实践的同时，本发明的发明人惊奇地发现，聚合蛋白共轭物有利地粘附于软骨，保护软骨免受炎症影响，抵抗在水性环境中的稀释，并且与用于治疗关节的标准透明质酸粘弹性补充剂相比表现出优异的润滑及流变性质。
本发明的发明人已经构思并证明了这些性质使得包含这种聚合蛋白共轭物的组成物有利于多种应用，包含润滑关节软骨表面，以及促进一治疗活性剂及基因的递送。
现在参考图2A至图3，显示示例性泊洛沙姆纤维蛋白原共轭物在一体外模型中粘附于软骨。图2A及图2B进一步显示所述共轭物选择性地粘附于受损的软骨。图14显示所述共轭物在体内患有关节炎的关节中粘附于软骨。
图4至图5显示所述共轭物在一体外模型中在所述促炎细胞因子IL-1β的存在下保护软骨。图4进一步显示一透明质酸粘弹性补充剂不提供这种保护。图12至图13及图15至图16B显示所述共轭物在体内保护软骨免于关节炎。
图6A及图6B显示，与透明质酸粘弹性补充剂相比，包括泊洛沙姆纤维蛋白原共轭物的一示例性组成物不表现出水分的吸收。图7显示包括泊洛沙姆纤维蛋白原共轭物的所述组成物的粘度，在生理条件下比透明质酸粘弹性补充剂的粘度更持久。图8至图9显示包括泊洛沙姆纤维蛋白原共轭物的所述组成物比透明质酸粘弹性补充剂更具有润滑性。图15至图16B显示透明质酸粘弹性补充剂在体内不表现出所述示例性组成物的所述保护作用。
图10显示根据本发明的任选实施例，一泊洛沙姆纤维蛋白原共轭物可通过所述纤维蛋白原部分粘附至所述软骨表面，并且通过所述泊洛沙姆部分提供润滑的一非限制性机制。
图17显示包括泊洛沙姆纤维蛋白原共轭物的一示例性组成物与血液部分混合时，表现逆向热凝胶化。图18至图20显示所述组成物有效地保持DNA纳米聚合物，从而促进基因转移至数个细胞。
根据本发明的一些实施例的一方面，提供一种组成物，所述组成物包括：一共轭物，所述共轭物包括一多肽，所述多肽具有附接至所述多肽的至少两个聚合物部分。如本文中根据任何相应的实施例所述，至少一个所述聚合物部分表现一逆向热凝胶化。
为简洁起见，包括一多肽的一共轭物，所述多肽具有附接至所述多肽的至少两个聚合物部份(根据本文所述的任何相应的实施例)，在本文中可互换地称为一「聚合物蛋白共轭物」或简称为一「共轭物」。
在本文所述任何实施例的一些实施例中，所述组成物(根据本文所述的任何相应的实施例)用于治疗本文所述的一病症。
在本文所述任何实施例的一些实施例中，所述组成物(根据本文所述的任何相应的实施例)用于制备用于治疗本文所述一病症的一药物。
根据本发明的一些实施例的一方面，提供治疗本文所述一病症的一方法，所述方法包括将所述组成物(根据本文所述的任何相应的实施例)施用至有需要的一对象，从而治疗所述病症。
聚合蛋白共轭物：
所述术语「聚合物」及「聚合」是指主要由多个重复单元组成的一分子或部分。
如上所述，在本文所述的聚合蛋白共轭物中与多肽附接的至少一个聚合物部分表现逆向热凝胶化。
在本文所述任何实施例的一些实施例中，与多肽附接的至少两个聚合物部分表现一逆向热凝胶化。
在一些实施例中，每一个附接至一多肽的所述聚合物部分表现一逆向热凝胶化。
本文中，当对应于所述聚合物部分的一聚合物的一水溶液(例如：未附接至上述多肽的一聚合物)表现出如本文所述的一逆向热凝胶化时，认为一聚合物部分表现一逆向热凝胶化。
如本文所用，所述术语「逆向热凝胶化」描述了一种性质，从而一物质(例如：根据本文所述的任何相应实施例的一组成物或一聚合物的一水性溶液)在温度升高时黏度增加。所述粘度的增加可以是，例如：从液态转变为半固态(例如：凝胶)，从一液态转变为一更粘稠的液态，或从一半固态转变为一更坚固的半固态。在此，所有这些转换都包含在所述术语「凝胶化」中。所述温度的升高可以在任何两个温度之间影响凝胶。可选地，所述凝胶化在0℃至55℃的所述范围内的一温度下进行。
通常，逆向热凝胶化通过在分子之间形成非共价交联(例如：通过疏水相互作用、离子相互作用及/或氢键)来介导，其中非共价交联的所述程度响应于温度的一升高。
各种聚合物表现一逆向热凝胶化。每一种聚合物的特征在于一临界凝胶化温度，其中凝胶化在所述临界凝胶化温度或高于所述临界凝胶化温度的温度下进行。
本文中，「临界凝胶化温度」是指观察到一材料的一些凝胶化的最低温度(例如：通过剪切储能模量的增加)。
可以经由选择聚合物部分以使得含有所述聚合物部分的共轭物具有逆向热凝胶化，其特征在于在一温度范围内(例如：在0℃至55℃的一范围内)的一临界凝胶化温度，这允许通过暴露于高于及/或低于所述临界凝胶化温度的一环境温度，方便地操纵所述共轭物及/或包含所述共轭物的一组成物的所述性质。
可以选择所述聚合物的所述临界凝胶化温度，例如：基于所述使用意图或一共轭物的理想性质。例如：可以选择临界凝胶化温度，使得所述共轭物在一生理温度下而不是在室温下处于一凝胶状态，使得凝胶化可以在体内进行。在另一个实施例中，可以选择所述临界凝胶化温度，使得所述共轭物在室温但不在一适度降低的温度下处于一凝胶状态，使得凝胶化可以通过例如：从冷藏中移除来实现。
所述聚合部分可选地包括一合成聚合物。泊洛沙姆(例如：F127泊洛沙姆)是适合在用于本发明的数个实施例的温度下，显示出逆向热凝胶化的示例性聚合物。
所述短语「合成聚合物」是指由一合成材料制成的任何聚合物，即一非天然的、非细胞的材料。
如本文及本领域所用，「泊洛沙姆」是指具有一PEO-PPO-PEO结构的聚(环氧乙烷)(PEO)-聚(环氧丙烷)(PPO)嵌段共聚物。合适的泊洛沙姆可从商业上获得，例如：作为聚合物。
聚合物部分可包括一个或多个影响非共价交联的部分(例如：疏水部分)。所述凝胶化的程度及进行所述凝胶化的条件(例如：温度)可任选地通过参与非共价交联的部分的所述性质及所述数量来控制。
所述聚合物部分可包括1至高达100个及甚至1000个参与非共价交联的部分。在许多实施例中，这种部分的所述数目越多，以及所述部分越大(例如：所述分子量越高)，实现凝胶化的温度就越低。
所述聚合物部分可包括一种或多种影响交联的部分。所述部分可以通过相同分子间的相互作用(例如：疏水相互作用)或通过不同分子间的相互作用(例如：疏水及离子相互作用)以实现非共价交联。
表现出逆向热凝胶化的聚合物(在本领域中也称为RTG聚合物)包括但不限于聚(N-异丙基丙烯酰胺)，所述聚(N-异丙基丙烯酰胺)在高于约32℃至33℃的温度下经历逆向热凝胶化，以及表现出逆向热凝胶化的共聚物(例如：聚(N-异丙基丙烯酰胺-共-二甲基-γ-丁内酯)、聚(乙二醇)-聚(氨基氨基甲酸酯)(PEG-PAU)嵌段共聚物、聚(ε-己内酯)-聚(乙二醇)(PCL-PEG)嵌段共聚物(例如，PCL-PEG-PCL)及聚(2-丙酰胺基丙烯酸甲酯)。此外，已经描述了具有PEG及疏水性寡肽侧基的聚有机磷腈(所述疏水性寡肽侧基提供分子间的疏水相互作用)，所述聚有机磷腈在35℃至43℃的温度下进行胶凝化[Seong等人，Polymer2005,46：5075-5081]。
例如，一泊洛沙姆部分包括介导凝胶化的一疏水性PPO部分。一聚合物部分可任选地包括一个这样的PPO部分，或者可选地，包括多个(例如：2、3、4等，至多100以及甚至1000个这样的部分)这种部分。
类似地，PCL-PEG共聚物包括亲水性PEG及相对疏水的聚(ε-己内酯)(PCL)部分，及PEG-PAU共聚物包括亲水性PEG及疏水性聚(氨基氨基甲酸酯)(PAU)部分(例如：一双-1,4-(羟乙基)哌嗪-1,6-二异氰酸根合六亚甲基缩聚物部分)。
因此，一般来说，许多表现出逆向热凝胶化的嵌段聚合物可以由亲水及疏水结构单元的一组合制备。
在一些实施例中，每个聚合物部分包括一泊洛沙姆(例如：F127泊洛沙姆)。
任选地，一聚合物部分包括一种泊洛沙姆。
可选地或另外地，至少一个聚合物部分包括多个泊洛沙姆部分。包括多个泊洛沙姆部分的聚合物可由商业上获得，例如：聚合物。
根据任选的数个实施例，至少一个聚合物部分进一步包括至少一个能够在体内(例如：在生理条件下)与一蛋白质共价结合的交联部分。任选地，所述聚合物部分包括1至10个，任选为1至5个，以及任选为1至3个交联部分。
如本文所用，所述短语「交联部分」是指一部分(例如：本文所述的一聚合物部分中的一官能团)，其特征在于能够与另一分子的一官能团进行共价交联(例如：一蛋白质)。
根据本文描述的一些实施例的一共轭物可任选地以所述通式表示：
X(-Y-Zm)n
其中X是如本文所述的一多肽，Y是如本文所述的一聚合物部分，Z是如本文所述的一交联部分，n是大于1的一整数(例如：2、3、4及最多20)，以及m表示每个聚合物部分的交联部分的数目。因此，在缺少任选的交联部分的实施例中m为0，在包括所述任选的交联部分的数个实施例中，m为1或大于1的整数。
应当理解，由于上式包括多于一个-Y-Zm部分，一共轭物中不同的-Y-Zm部分可任选地具有一不同的m值。
合适的交联部分的数个示例包括但不限于一丙烯酸酯、一甲基丙烯酸酯、一丙烯酰胺，一甲基丙烯酰胺及一乙烯基砜，所述交联部分适合通过迈克加成反应与一硫醇基(例如，在一半胱氨酸残基中)连接；以及一醛及一N-羟基琥珀酰亚胺，它们适合与一胺基连接(例如在赖氨酸残基及/或N-末端)。
如本文所述数个实施例中所例示的部分，一聚合物部分可包括多个这样的交联部分(例如：丙烯酸酯)，其中一个所述交联部分将所述聚合物部分连接至所述共轭物的所述多肽，并且所述剩余的部分未与所述共轭物的所述多肽结合，因此可任选地用作交联部分。
因此，在数个示例性实施例中，所述共轭物包括泊洛沙姆二丙烯酸酯(例如：F127泊洛沙姆二丙烯酸酯)部分，其中每个部分中的一个丙烯酸酯基团连接至一多肽的一半胱氨酸残基(例如：变性的纤维蛋白原)，并且一个丙烯酸酯基团可任选地作一为交联部分。
所述共轭物的所述多肽(根据本文所述任何相应的数个实施例)的长度为至少10个氨基酸。在本文所述任何实施例的一些实施方案中，所述多肽的长度为至少20个氨基酸，并且任选地长度为至少50个氨基酸。
如本文所用的术语「多肽」包括数种天然多肽(降解产物、合成的合成多肽或重组多肽)及肽模拟物(通常是合成的合成多肽)，以及作为多肽类似物的拟肽及半细胞样肽，例如：所述多肽类似物经由修饰使得所述多肽在一体内的表现更稳定或更能够穿透数个细胞。此类修饰包括但不限于N-末端修饰、C-末端修饰、肽键修饰，包括但不限于CH2-NH、CH2-S、CH2-S＝O、O＝C-NH、CH2-O、CH2-CH2、S＝C-NH、CH＝CH或CF＝CH、骨架修饰及残基修饰。制备拟肽化合物的方法是本领域熟知的，并且例如在Quantitative Drug Design,C.A.Ramsden Gd.,Chapter 17.2,F.Choplin Pergamon Press(1992)，其通过引用并入本文，如同在本文中所完全阐述的内容。在下文中提供了这方面的进一步的细节。
所述多肽内的肽键(-CO-NH-)可以被取代，例如：被N-甲基化键(-N(CH3)-CO-)、酯键(-C(R)HCOOC(R)-N-、酮亚甲基键(-CO-CH2-)、α-氮杂键(-NH-N(R)-CO-)取代，其中R是任何烷基，例如：甲基、胺键(-CH2-NH-)、羟基亚乙基键(-CH(OH)-CH2)、硫代酰胺键(-CS-NH-)、烯属双键(-CH＝CH-)、反式酰胺键(-NH-CO-)、肽衍生物(-N(R))-CH2-CO-)，其中R是「正常」的侧链，天然存在于碳原子上。这些修饰可以在沿着所述多肽链的任何所述键上发生，甚至在数个键上(2个至3个)同时发生。
如本文所用，术语「氨基酸」或「数种氨基酸」应理解为包括20种天然存在的氨基酸；这些氨基酸经常在体内转译后修饰，包括例如：羟脯氨酸、磷酸丝氨酸及磷酸苏氨酸；以及其他独特的氨基酸，包括但不限于：2-氨基己二酸、羟赖氨酸、异锁链素，正缬氨酸、正亮氨酸及鸟氨酸。此外，术语「氨基酸」包括右旋及左旋氨基酸。
根据本文描述的任何一个实施例的一些实施例，所述多肽包括一蛋白质或所述蛋白质的一片段。
在一些实施例中，所述术语「多肽」及「蛋白质」可互换地使用。
所述蛋白质可以是一天然存在的蛋白质(例如：存在于真核生物及/或原核生物中的一蛋白质、数种细胞、细胞材料、非细胞材料等)或与一天然存在的蛋白质同源的一多肽(例如：至少90％同源，任选至少95％同源，及任选至少99％同源)。
在本文所述任一个所述实施例的一些实施方案中，所述蛋白质(或蛋白质片段)是变性的。
应当理解，本文所述的蛋白质可任选地包括一个以上的多肽链。
在包括以多于一条多肽链为特征的蛋白质的实施例中，本文所述的共轭物任选地包括一种所述蛋白质的多肽。
或者，本文所述的共轭物包括多种所述蛋白质的所述多肽(例如：所述蛋白质的所有所述多肽)。
在本文所述的任何一个实施例的一些实施方案中，所述多个多肽连接在一起(例如：通过非共价键及/或共价键)，以形成一多聚体(例如：一二聚体、一三聚体、一四聚体、一六聚体等)，如本文所述，所述多聚体具有至少两个聚合物部分。
在一些实施例中，所述蛋白质的所述多肽是分离的(例如：通过所述蛋白质的变性分离)，使得本文所述的共轭物是不同共轭物种的一混合物，其中每种所述共轭物种包括一不同的多肽。
在本文所述任一个实施例的一些实施方案中，选择所述多肽(例如：蛋白质或蛋白质片段)以显示对一生物性物质的亲和力。在一些实施例中，所述多肽能够粘附于软骨。
在本文所述的任何一个实施例的一些实施方案中，所述多肽对受损软骨表现出比未受损软骨更大的亲和力。
在一些实施例中，所述多肽能够粘附于润滑素及/或透明质酸。纤连蛋白是这种多肽的一非限制性示例。不受任何特定理论的束缚，Eguiluz等人相信这种粘附可能有助于润滑。[Biomacromolecules 2015,16：2884-2894]。
可以比较受损软骨及未受损软骨的亲和力，例如：通过使所述多肽(例如：本身或如本文所述一共轭物的所述形式)与包括一磨损的一软骨表面接触，所述软骨基本上未损坏，并且比较粘附于所述表面的磨损及未磨损部分的多肽量(例如：如本文举例说明的内容)。
适合用于包含在本文中所述共轭物中包括(本身或作为其片段)的数种蛋白质的数个实例包括但不限于：一细胞信号传导蛋白、一细胞外基质蛋白、一细胞粘附蛋白、一生长因子、白蛋白(例如：血清白蛋白，用于例如：GenBank登录号NP_000468)、温韦伯氏因子(例如，GenBank登录号NP_000543)、蛋白质A、蛋白酶及一蛋白酶底物。在本文所述任一个实施例的一些实施方案中，所述共轭物包括一细胞外基质蛋白。
细胞外基质蛋白的数个实例包括但不限于：纤维蛋白原(例如：α-链-GenBank登录号NP_068657；β-链-GenBank登录号P02675；γ-链-GenBank登录号P02679)、胶原蛋白(例如：GenBank登录号NP_000079)、纤连蛋白(例如：GenBank登录号NP_002017)、弹性蛋白、原纤维蛋白、纤维蛋白，层粘连蛋白(例如：GenBank登录号NP_000218)及明胶。
细胞信号传导蛋白的数个实例包括但不限于：p38丝裂原活化蛋白激酶(例如：GenBank登录号NP_002736)、核因子kappaB(例如：GenBank登录号NP_003989)、Raf激酶抑制蛋白(RKIP)(例如：GenBank登录号XP_497846)、Raf-1(例如：GenBank登录号NP_002871)、MEK(例如：GenBank登录号NP_002746)、蛋白激酶C(PKC)(例如：GenBank登录号NP_002728)、磷酸肌醇-3-激酶γ(例如：GenBank登录号NP_002640)、受体酪氨酸激酶如胰岛素受体(例如：GenBank登录号NP_000199)、异源三聚体G蛋白(例如：Galpha(i)-GenBank登录号NP_002060；Galpha(s)-GenBank登录号NP_000507；Galpha(q)-GenBank登录号NP_002063)、小窝蛋白-3(例如：GenBank登录号NP_001225)、微管相关蛋白1B及14-3-3蛋白(例如：GenBank登录号NP_003397)。
细胞粘附蛋白的数个实例包括但不限于：整联蛋白(例如：GenBank登录号NP_002202)、细胞间粘附分子(ICAM)1(例如：GenBank登录号NP_000192)、N-CAM(例如：GenBank登录号NP_000606)、钙粘蛋白(例如：GenBank登录号NP_004351)、生腱蛋白(例如：GenBank登录号NP_061978)、gicerin(例如：GenBank登录号NP_006491)及神经损伤诱导蛋白2(ninjurin2)(例如：GenBank登记号NP_067606)。
生长因子的数个实例包括但不限于：表皮生长因子(例如：GenBank登录号NP_001954)、转化生长因子-β(例如：GenBank登录号NP_000651)、酸性成纤维细胞生长因子(例如，GenBank登录号NP_000791)，碱性成纤维细胞生长因子(例如：GenBank登录号NP_001997)、促红细胞生成素(例如：GenBank登录号NP_000790)、血小板生成素(例如：GenBank登录号NP_000451)、神经突生长因子、肝细胞生长因子(例如：GenBank登录号NP_000592)、第一型胰岛素样生长因子(例如：GenBank登录号NP_000609)、第二型胰岛素样生长因子(例如：GenBank登录号NP_000603)、γ干扰素(例如：GenBank登录号NP_000610)及血小板衍生生长因子(例如：GenBank登录号NP_079484)。
蛋白酶的数个实例包括但不限于：胃蛋白酶(例如：GenBank登录号NP_055039)、低特异性胰凝乳蛋白酶、高特异性胰凝乳蛋白酶、胰蛋白酶(例如：GenBank登录号NP_002760)、羧肽酶(例如：GenBank登录号NP_001859)，氨肽酶(例如：GenBank登录号NP_001141)、脯氨酸内肽酶(例如：GenBank登录号NP_002717)、金黄色葡萄球菌V8蛋白酶(例如：GenBank登录号NP_374168)、蛋白酶K(PK)(例如：GenBank登录号P06873)、天冬氨酸蛋白酶(例如：GenBank登录号NP_004842)、丝氨酸蛋白酶(例如：GenBank登录号NP_624302)、金属蛋白酶(例如：GenBank登录号NP_787047)、ADAMTS17(例如：GenBank登录号NP_620688)、类胰蛋白酶-γ(例如：GenBank登录号NP_036599)、第二型细胞间质蛋白酶(例如：GenBank登录号NP_694564)。
蛋白酶底物的数个实例包括作为所述蛋白酶蛋白的所述靶标的所述多肽或所述多肽序列。例如：赖氨酸及精氨酸是胰蛋白酶的所述靶标；酪氨酸、苯丙氨酸及色氨酸是胰凝乳蛋白酶的所述靶标。
这种天然存在的蛋白质可以从任何已知的分子生物学试剂供应商获得。
根据本文所述任一个实施例的一些实施方案，所述组成物包括由不同的共轭物所组成的一混合物，所述不同的共轭物包括，例如：不同的多肽。
在一些实施例中，所述组成物包括数种共轭物的一混合物，其中至少一种共轭物包括白蛋白(例如：血清白蛋白)。
在一些实施例中，所述组成物包括数种共轭物的一混合物，其中至少一种共轭物包括：温韦伯氏因子。在一些实施例中，至少一种共轭物包括温韦伯氏因子，并且至少一种共轭物包括白蛋白(例如：血清白蛋白)。
在一些实施例中，所述组成物包括数种共轭物的一混合物，其中至少一种共轭物包括一细胞外基质蛋白。在一些实施例中，至少一种共轭物包括一细胞外基质蛋白，并且至少一种共轭物包括白蛋白(例如：血清白蛋白)。
在一些实施例中，至少一种共轭物包括一细胞外基质蛋白，并且至少一种共轭物包括温韦伯氏因子。在一些实施例中，至少一种共轭物包括一细胞外基质蛋白，至少一种共轭物包括白蛋白(例如：血清白蛋白)，并且至少一种共轭物包括温韦伯氏因子。在一些前述的实施例中，所述细胞外基质蛋白包括纤维蛋白原及/或纤连蛋白。在一些前述的实施例中，所述细胞外基质蛋白包括纤维蛋白原及纤连蛋白(在混合物中)。
根据本文所述任一实施例的一些实施方案，所述组成物包括至少一种共轭物，其中所述多肽包括一纤维蛋白原多肽(纤维蛋白原的α、β及/或γ链)或所述纤维蛋白原多肽的一片段。在一些实施例中，本文描述的所述共轭物包括纤维蛋白原的α、β及γ链。在一些实施例中，所述多肽是一变性的纤维蛋白原(例如：变性的纤维蛋白原的α、β及γ链的一混合物)。
适用于本发明任何实施例的聚合蛋白共轭物也描述于国际专利申请公开WO2011/073991中，其内容通过引用并入本文，尤其是描述聚合物蛋白共轭物的所述内容。
组成物：
在本文所述任何实施例的一些实施方案中，所述组成物包括所述共轭物的一水溶液。
本文中，所述短语「共轭物的水溶液」是指所述共轭物与一水性介质混合(例如：分散及/或溶解)，并且不应理解为排除其中不溶解共轭物的组成物或具有一高粘度的组成物(例如：以一水凝胶的一形式)。
在本文所述任何实施例的一些实施方案中，所述组成物中的聚合蛋白共轭物的一浓度为至少0.02重量百分比。在一些实施例中，所述共轭物上的所述浓度为至少0.05重量百分比。在一些实施例中，所述浓度为至少0.1重量百分比。在一些实施例中，所述浓度为至少0.2重量百分比。在一些实施例中，浓度为至少0.5重量百分比。在一些实施例中，浓度为至少1重量百分比。在一些实施例中，浓度为至少1.5重量百分比。在一些实施例中，浓度为至少2重量百分比。在一些实施例中，浓度为至少2.5重量百分比。
在本文所述任何实施例的一些实施方案中，所述组成物中的聚合蛋白共轭物的一浓度不超过20重量百分比。在一些实施例中，共轭物的所述浓度不超过10重量百分比。在一些实施例中，所述浓度不超过5重量百分比。在一些实施例中，浓度不超过2.5重量百分比。
在本文所述任何实施例的一些实施方案中，所述组成物中的聚合蛋白共轭物的一浓度范围为0.02至20重量百分比。在一些实施例中，共轭物的所述浓度范围为0.1至10重量百分比。在一些实施例中，共轭物的所述浓度范围为0.5至5重量百分比。在一些实施例中，共轭物的所述浓度范围为约1至约2重量百分比。
在本文所述的任何实施例的一些实施方案中，所述组成物在32℃至37℃的温度下形成一凝胶，即在上述范围内的至少一个温度下(任选地在上述范围内的每一个温度下)，所述组成物呈一凝胶形式。在一些实施例中，例如：所述凝胶是一水凝胶，其中包括所述共轭物的一水溶液的一组成物(根据本文所述的任何相应实施例)在32℃至37℃的一范围的一温度下形成一水凝胶。
如本文所用并且在本领域中是众所周知的，所述术语「水凝胶」是指一种材料，所述材料包括由水溶性天然或合成聚合物链形成的固态网络，通常含有超过99％的水。
在本文所述任何实施例的一些实施方案中，所述凝胶(例如：水凝胶)的特征在于在37℃下的剪切储能模量为至少15帕斯卡。在一些实施例中，所述剪切储能模量在37℃下为至少50帕斯卡、任选地至少为100帕斯卡及任选地至少为200帕斯卡。
如本文及本领域所用，「剪切模量」定义为剪切应力与剪切应变的所述比率。剪切模量可为一复数变量，在这种情况下，所述「储能模量」是所述实际分量，所述「损耗模量」是所述虚数分量。粘弹性固体中的所述储能模量及损耗模量的测量表示所述弹性部分的储存能量及表示所述粘性部分作为热量消散的能量。
在本文所述任何实施例的一些实施方案中，所述组成物能够经历逆向热凝胶化。在一些实施例中，所述组成物是根据本文所述的任何相应实施例的一水溶液。
在本文所述的涉及一凝胶及/或水凝胶的任何实施例的一些实施方案中，所述凝胶及/或水凝胶可通过根据本文所述的任何相应实施例的逆向热凝胶化形成。
任选地，所述组成物的所述逆向热凝胶化在低于55℃、任选地低于50℃、任选地低于40℃及任选地低于30℃的温度下发生。任选地，所述逆向热凝胶化在低于约32℃的温度下发生，使得在约32℃至37℃的一范围的一生理温度下(例如：在所述身体的四肢中)，所述组成物处于一凝胶化状态。
任选地，所述组成物的所述逆向热凝胶化在高于0℃、任选地高于10℃、任选地高于20℃及任选地高于30℃的温度下发生。
在一些实施例中，所述组成物的所述逆向热凝胶化在温度从0℃升高至55℃、任选地从10℃升高至55℃、任选地从10℃升高至40℃、任选地从15℃升高至37℃时、任选地从20℃升高至37℃及任选地从20℃升高至32℃时发生。从一室温(例如，约20℃，约25℃)升温至一生理温度(例如：约32℃至37℃)时发生的逆向热凝胶化对于一些应用来说是特别有用的(例如：医学应用)，因为可以通过将所述组成物从一室温环境转移至一生理温度来诱导凝胶化，例如：通过将所述组成物置于一身体内。
一组成物经历逆向热凝胶化的所述温度(根据本文所述的任何相应实施例)可任选地通过改变所述组成物中的所述共轭物的所述浓度来控制。
此外，一组成物经历逆向热凝胶化的所述温度(根据本文所述的任何相应实施例)可任选地通过选择具有一适当凝胶化温度的一聚合物以包含在所述聚合物部分中及/或通过改变所述浓度来控制，表现出逆向热凝胶化的所述聚合物部分(例如：通过改变与一多肽连接的聚合物部分的所述数量及/或通过改变所述聚合物部分的所述尺寸)。
如所述实施例部分中举例说明的，包括本文所述共轭物的水溶液可以在相对低的浓度下经历逆向热凝胶化，例如：小于20重量百分比的共轭物，任选地小于10重量百分比，任选地小于5重量百分比，并且任选地小于2重量百分比。一凝胶中的这种低浓度通常不能通过使用聚合物(例如：泊洛沙姆)本身而不是通过本文所述的聚合蛋白共轭物所获得。
不受任何特定理论的束缚，据信使用相对低浓度的共轭物是有利的，因为低浓度的共轭物可以减少在体内所述聚合物及生物分子之间的非期望的相互作用，例如：促进蛋白质沉淀及/或刺激。
如本文所述的组成物的逆向热凝胶化可通过测量组成物的一剪切储能模量来确定。所述储存模量的一温度依赖性的增加表示通过一逆向热凝胶化形成一凝胶。
在本文所述的任何实施例的一些实施方案中，根据本文所述的任何相应实施例的逆向热凝胶化使组成物的一剪切储能模量增加(在本文中也称为「储能模量」或G')至少十倍、任选地至少30倍、任选地至少100倍，及任选地至少300倍。
在本文所述的任何实施例的一些实施方案中，根据本文所述的任何相应实施例的逆向热凝胶化将所述水溶液的一剪切储能模量提高至至少15帕斯卡，任选地至少20帕斯卡、任选地至少50帕斯卡、任选地至少100帕斯卡及任选地至少200帕斯卡。
在本文所述的任何实施例的一些实施方案中，在逆向热凝胶化之前(例如：在低于发生凝胶化的一温度下)，本文所述的根据任何相应实施例的组成物的剪切储能模量小于2帕斯卡、任选地小于1帕斯卡、任选地小于0.5帕斯卡以及任选地小于0.2帕斯卡。
在本文所述任何实施例的一些实施方案中，所述组成物是一可注射的组成物，即，所述组成物可以通过注射器针头(例如：18号针头)容易地注射。
优选地，一可注射组成物不包括足以堵塞一针头的颗粒，并且具有一足够低的粘度以允许注射。这种低粘度可以是，例如：在逆向热凝胶化之前一组成物的一相对低粘度(例如：根据本文所述的任何相应实施例)及/或在注射期间施加剪切应力时所获得的一相对低粘度(例如：一触变性组成物)。
在本文所述任何实施例的一些实施方案中，所述组成物基本上缺乏聚合蛋白共轭物之间的共价交联。
不受任何特定理论的束缚，据信所述共轭物的大量共价交联可能导致所述组成物的过度坚硬，这可能限制所述组成物在一移动接头中适应所述几何变化的所述能力。
在本文所述任何实施例的一些实施方案中，所述组成物是可生物降解的。例如：根据本文所述的任何相应实施例的一凝胶(例如：水凝胶)任选地是一可生物降解的凝胶，即，所述凝胶在与一组织及/或一细胞接触时降解(例如：通过蛋白水解及/或水解)。
在本文所述任何实施例的一些实施方案中，所述组成物(例如：根据本文所述的任何相应实施例的一凝胶)的特征是在于与一水性液体温育时，水分的吸收是很少或没有的。在一些实施例中，组成物的特征是在37℃的一温度下与一含水液体温育48小时后，水分吸收小于20重量百分比。在一些实施例中，以37℃温育48小时后，水分吸收小于15重量百分比。在一些实施例中，以37℃温育48小时后，水分吸收小于10重量百分比。在一些实施例中，以37℃温育48小时后，水分吸收小于5重量百分比。在一些实施例中，以37℃温育48小时后，水分吸收小于2重量百分比。在一些实施例中，以37℃温育48小时后，水分吸收小于1重量百分比。
本文中，所述短语「水分吸收」是指所述组成物中水分的净增加与组成物的初始重量的所述重量比。
一组成物的水分吸收可任选地通过在所述指定条件下将一定量(例如，0.3毫升)的一组成物与一定量(例如：1毫升)的水性液体一起温育来决定，如磷酸盐缓冲盐水(例如：pH7.4)，并且比较培育前后所述组成物的所述重量，假设重量变化代表水分吸收(例如：如本文实施例部分中所举例说明的)。
不受任何特定理论的束缚，据信具有降低的水分吸收的组成物倾向于通过在体内稀释所述组成物而能抵抗有益活性的丧失。
在本文所述任何实施例的一些实施方案中，所述组成物包含至少一种额外的治疗活性剂，即除了本文所述的共轭物之外的一治疗活性剂。
在本文所述任何实施例的一些实施方案中，包括至少一种额外的治疗活性剂的所述组成物在32℃至37℃的温度下形成一水凝胶(根据本文所述的任何相应实施例)。在一些实施例中，所述组成物是一含水组成物(根据本文所述的任何相应实施例)。
可包括在本文所述的一些实施例中的额外治疗活性剂的数个实例包括但不限于：一透明质酸、一抗炎剂、一镇痛剂、一生长因子、一血液部分(例如：一自体血液部分)、一核酸及一细胞(优选为活细胞)。透明质酸、血液部分及核酸是示例性的额外治疗活性剂。
合适的生长因子的数个实例包括但不限于：TGF-β(例如：TGF-β1)、胰岛素样生长因子(例如：IGF-1)、成纤维细胞生长因子(例如：FGF-2)、骨形态发生蛋白(例如：BMP-2、BMP-7)及生长/分化因子(例如：GDF-5)，以及本文所述的任何其他生长因子。
合适的抗炎剂的数个实例包括但不限于：依那西普、英夫利昔单抗、阿达木单抗、介白素-1Ra、β干扰素、非类固醇消炎药及皮质类固醇。
合适的镇痛药的数个实例包括但不限于：利多卡因、布比卡因、罗哌卡因、阿片类药物及肉毒杆菌毒素A。
在包含一含水组成物中的一血液部分的数个实施例中，所述血液部分可任选地提供所述含水组成物中基本上所有的水分。或者，存在于所述血液部分中的水分补充有来自一其他来源的水分，例如所述组成物中包括一含水载体。
在本文所述任何实施例的一些实施方案中，所述组成物的至少20重量百分比是一种或多种血液部分。在一些实施例中，所述组合物的至少30重量百分比是所述血液部分。
在一些实施例中，所述组成物的至少40重量百分比是所述血液部分。在一些实施例中，所述组成物的至少50重量百分比是所述血液部分。在一些实施例中，所述组成物的至少60重量百分比是所述血液部分。在一些实施例中，所述组成物的至少70重量百分比是所述血液部分。在一些实施例中，所述组成物的至少80重量百分比是所述血液部分。在一些实施例中，所述组成物的至少90重量百分比是所述血液部分。在一些实施例中，所述组成物基本上由所述共轭物(根据本文所述的任何相应实施例)与一种或多种血液部分组成。
适合包含在本文所述组成物中的血液部分的数个实例包括但不限于：富含血小板的血浆及缺乏血小板血浆。
在一些实施例中，所述血液部分是自体血液部分，并且在一些实施例中，所述自体血液部分包括富含血小板的血浆。
透明质酸(HA)，也称为玻尿酸或透明质烷，是存在于所有哺乳动物中的一高分子量非硫酸化糖胺聚糖(GAG)。透明质酸由重复的双糖单元组成，所述双糖单元由(β-1,4-连接的D-葡糖醛酸及(β-1,3-连接的N-乙酰基-D-葡糖胺组成。
本文中，所述术语「透明质酸」包括纯(酸)或盐形式的低分子量及高分子量的透明质酸，以及透明质酸的所有交联、修饰或杂合的形式。
用于形成交联透明质酸的交联剂包括但不限于：戊二醛及其他醛、二醛、京尼平、肉桂酸或其衍生物、来自所述碳二亚胺家族(EDC)、二乙烯砜、BODE及甘露醇的合成交联剂、核糖及其他糖类。
可以存在于修饰的透明质酸中的经修饰的透明质酸及修饰的基团的数个实例包括但不限于：聚乙烯吡咯烷酮-透明质酸钠、二硫化物交联的修饰的透明质酸、缩水甘油基三甲基氯化铵(GTAC)、苯基琥珀酸修饰的透明质酸衍生物、钠透明质酸己酰胺、透明质酸钠、亮氨酸-透明质酸钠、荧光素-透明质酸钠、DTPA-透明质酸盐、DTPA(Gd)-透明质酸钠、透明质酸钠、透明质酸钠、丙基氨基-透明质酸钠、叠氮基丙氨基-透明质酸钠。
杂合修饰的透明质酸的数个实例包括但不限于：二苯丙氨酸透明质酸、白蛋白透明质酸、纤维蛋白原或纤维蛋白透明质酸、壳聚糖透明质酸及任何其他种类的蛋白质或具有透明质酸碳的水化合物聚合物。
任选地，所述透明质酸是一市售组成物的一形式，例如：一水溶液或凝胶(例如：粘弹性补充剂)，例如：Synvisc-或粘弹性补充剂。在包括一透明质酸组成物(例如：粘弹性补充剂)的数个实施例中，所述透明质酸组成物可任选地提供所述含水组成物中的一部分或甚至基本上全部的水分。
合适的核酸(例如：DNA)的数个实例包括但不限于：基因载体(例如：质粒、粘粒、人工染色体及/或病毒载体)、反义核酸、siRNA、shRNA、微RNA、核酶及DNA酶。
所述术语「siRNA」是指诱导所述RNA干扰(RNAi)途径的小抑制性RNA双链体(通常在18个至30个碱基对之间)。通常，siRNAs化学合成为一21个单体单元，所述21个单体单元具有一中心为19个碱基对的双链体区域及末端对称的2-碱基3'-突出端，尽管最近已经描述了与相同位置的21个单体单元相比，化学合成的RNA双链体(25个至30个碱基长度)可以具有高达100倍的效力增加。在诱发RNAi的过程中，观察到了使用较长RNAs所获得的增加的效力理论上是由于向Dicer酶提供一底物(27个单体单元)而不是一产物(21个单体单元)，并且这提高了siRNA双链体进入RNA诱导沉默复合体(RISC)的速率或效率。
已经发现3'-突出端的位置影响一siRNA的效力，并且在所述反义链上具有一3'-突出端的不对称双链体，所述3'-突出端的不对称双链体通常比所述有义链上具有3'-突出端的那些更有效(Rose等人，2005)。这可归因于不对称链加载到RNA诱导沉默复合体中，因为当标记所述反义转录物时，可以观察到所述相反的效力模式。
可以连接一双链干扰RNA(例如：一siRNA)的所述链以形成一发夹或茎环结构(例如：shRNA)。因此，如上所述，本发明的一些实施例的所述RNA沉默剂也可以是一短发夹RNA(shRNA)。
如本文所用，所述术语「shRNA」是指具有一茎环结构的一RNA试剂，所述RNA试剂包括互补序列的一第一及第二区域，所述区域的互补程度及取向足以使得所述碱基在所述区域之间发生配对，所述第一及第二区域由一环区域连接，所述环是由于所述环区域内的数个核苷酸(或核苷酸类似物)之间，因为缺乏碱基的配对而产生。所述环中所述核苷酸的数目是3个至23个、或5个至15个、或7个至13个、或4个至9个、或9个至11个之间的数字。环中的一些核苷酸可参与碱基配对与环中其他核苷酸的相互作用。可用于形成所述环的寡核苷酸序列的数个实例包括：5'-UUCAAGAGA-3'(Brummelkamp，TR等人(2002)Science 296：550)及5'-UUUGUGUAG-3'(Castanotto，D.等人(2002)RNA 8：1454)。本领域技术人员将理解，得到的单链寡核苷酸形成一茎环或发夹结构，其包括能够与RNAi机器相互作用的一双链区。
所述术语「微小RNA」，「miRNA」及「miR」是同义词，并且是指长度为约19个至28个核苷酸的非编码单链RNA分子的一集合，所述集合调节基因的表达。miRNA存在于广泛的生物体(例如：病毒、人类)中，并且已被证实在发育、恒定及疾病病原学中发挥作用。
miRNA可引导一RISC通过两种机制中的任一种下调基因的表达：mRNA切割或抑制转译。如果所述mRNA与所述miRNA具有一定程度的互补性，则所述miRNA可以指定所述mRNA的切割。当一miRNA引导切割时，所述切割通常发生在与miRNA的残基10及11配对的核苷酸之间。或者，如果所述miRNA不具有与所述miRNA的所述必需程度的互补性，则所述miRNA可以抑制转译。转译的抑制在动物中可能更普遍，因为动物在miRNA及结合位点之间可能具有一较低程度的互补性。
DNA酶是单链多核苷酸，其能够切割单链及双链靶序列[Breaker，R.R.and Joyce，G.Chemistry and Biology 1995；2：655；Santoro，S.W.&Joyce，G.F.PROC.Natl，Acad.Sci.USA 1997；943：4262]已经提出了DNA酶的一普遍模型(所述「10-23」模型)。「10-23」DNA酶具有15个脱氧核糖核苷酸的一催化结构域，两侧分别是具有7个至9个脱氧核糖核苷酸的两个底物识别结构域。这种类型的DNA酶可以在嘌呤：嘧啶连接处有效地切割其底物RNA[关于DNA酶的综述请参见Khachigian，Curr Opin Mol Ther 4：119-21(2002)]。单炼辨识及双炼靶切割位点的合成的、工程化的DNA酶的建构及放大的数个实施例已经在美国专利号6,326,174中公开。
核酶是能够特异性切割一mRNA转录物的另一种分子，并且通过切割编码目的蛋白质的mRNAs，而逐渐增加地用于基因表达的序列特异性抑制[Welch等人，Curr OpinBiotechnol。9：486-96(1998)]。设计核酶以切割任何特定靶RNA的所述可能性，使其成为基础研究及治疗应用中的有价值的工具。在所述治疗领域中，已经利用核酶靶向传染病中的病毒RNA，癌症中的显性癌基因及遗传病中的特定体细胞突变[Welch等人，Clin DiagnVirol。10：163-71(1998)]。最值得注意的是，针对HIV患者的数种核酶基因治疗方案已经进入第1阶段的试验。最近，核酶已被用于转植基因动物的研究、基因靶标验证及途径阐明。数种核酶处于临床试验的不同阶段。ANGIOZYME是第一个在人体临床试验中研究的化学合成核酶。ANGIOZYME特异性抑制所述VEGF-r(血管内皮生长因子受体)的形成，所述VEGF-r是血管生成途径中的一关键组分。核酶医药公司以及其他公司已经证明了抗血管生成疗法在动物模型中的所述重要性。HEPTAZYME是一种设计用于选择性破坏丙型肝炎病毒(HCV)RNA的一核酶，在细胞培养测定中有效地降低丙型肝炎病毒RNA(Ribozyme Pharmaceuticals，Incorporated-WEB主页)。
本文描述了根据本发明一些实施例中，关于核酸的构建及用途的进一步细节。
预期从本专利申请至期满的所述专利期间，将开发许多相关的治疗活性剂，并且所述术语「治疗活性剂」的范围旨在包括所有这些新技术的先验。
在本文所述任何实施例的一些实施方案中，所述组成物能够持续释放所述治疗活性剂(例如：在一生理条件下，如在37℃及pH 7.4的含水环境中)，也就是说所述治疗活性剂可以在一延长的时间区间内(例如：至少24小时)从组成物中逐渐释放。
在一些实施例中，持续释放的特征在于：所述组成物(例如：0.3毫升)在一含水环境(例如：37℃及pH 7.4)中温育48小时后保留至少20％的治疗活性剂，例如：如本文实施例部分中举例说明的。在一些实施例中，在温育48小时后所述治疗活性剂的保留为至少30％、任选地至少40％、任选地至少50％、任选地至少60％、任选地至少70％、任选地至少80％以及任选地至少90％。通常，在所述含水环境的体积与所述组成物的体积相比之下，所述含水环境具有一相当大的体积，使得先前释放的治疗活性剂从所述环境中重新进入所述组成物中的情况是很少的。可以通过本领域已知的任何合适的技术进行针对所述治疗活性剂量的定量。
应用：
在本文所述的任何实施例的一些实施方案中，涉及使用所述组成物(根据本文所述的任何相应实施例)用于治疗一病症的用途，所述病症与关节软骨退化及/或软骨下骨的骨质流失相关联。
根据本文所述任何实施例中的一些治疗方式，包括所述组成物的关节内施用，例如：通过关节内注射。
本文中，所述术语「关节内」是指施用及/或注射到关节中，并且包括施用于关节中的任何组织及/或空间，包括软骨、骨及/或滑膜腔。
关节内注射可任选地通过施用一足够流动的组成物以进行注射来实现。例如：在经受生理温度时，这种组成物通常是相对流动的(非粘性的)，或者在施用后所述组成物的流动性变得较差(例如：经历凝胶化)。此类组成物的数个非限制性实例包括表现出逆向热凝胶化的组成物(根据本文所述的任何相应实施例)，其在生理温度(例如：在32℃至37℃的范围内)进行凝胶化并且可以在低于所述组成物相对流动的生理温度下(例如：在4℃至20℃的一范围内)施用。
在本文所述任何实施例的一些实施方案中，退化的所述关节软骨的至少一部分在一滑膜关节中。
在本文所述任何实施例的一些实施方案中，与关节软骨退化相关的一病症与所述关节软骨的一表面的摩擦相关联。在一些实施例中，所述组成物的特征在于一静摩擦系数小于0.2。在一些实施例中，所述静摩擦系数小于0.15。在一些实施例中，所述静摩擦系数小于0.1。在一些实施例中，所述静摩擦系数小于0.05。
不受任何特定理论的束缚，据信以相对低的摩擦系数为特征的组成物在润滑关节软骨方面是有效的，从而有益于受关节软骨摩擦影响的一对象。
摩擦系数的测量可任选地根据本领域已知的程序进行(例如：如Singh等人[NatMater 2014,13：988-995]所述)。例如，一测试的组成物可任选地以一施加的法向力(例如：0.01牛顿至0.02牛顿)及扭矩放置在两个表面(例如：聚四氟乙烯表面)之间，如本文实施例部分中举例说明的。因此可以使用以下等式确定静摩擦系数(μs)：μs＝τmax/(Reff*N)，其中τmax是所述最大扭矩值(例如：在所述测试的启动时段期间)，Reff是所述扭矩施加的所述表面的所述有效半径，N是所述法向力。
骨关节炎是一种病症的一非限制性实例，其中关节软骨的退化与关节软骨表面的摩擦相关联。
在本文所述任何实施例的一些实施方案中，关节软骨的退化与炎症相关联，例如：其中所述炎症诱导软骨变性。在一些这样的实施例中，用于施用的所述组成物(根据本文描述的任何相应的实施例)能够减少由炎症诱导的软骨退化。
关节炎是与关节软骨退化相关的一病症的一非限制性实例，其中所述退化与一炎症有关。
本文及本领域中，所述术语「关节炎」是指涉及炎症的一关节病症，并且包括但不限于：骨关节炎、类风湿性关节炎、银屑病关节炎、脓毒性关节炎、痛风、假性痛风、强直性脊柱炎、幼年特发性关节炎、史迪尔氏症候群，以及继发于红斑性狼疮的关节炎。
在本文所述任何实施例的一些实施方案中，所述病症与一软骨下骨囊肿相关联。在一些实施例中，所述病症的特征在于任选地在没有可观察到的软骨损伤的情况下，产生关节疼痛的现象。
骨关节炎是与软骨下骨囊肿相关联的一病症的一非限制性实例。骨关节炎的治疗可任选地是预防性的，例如：其中患有软骨下骨囊肿的一对象被鉴定为有罹患骨关节炎的风险，但尚未被诊断出患有骨关节炎。
在本文所述的涉及骨囊肿的任何实施例的一些实施方案中，通过将组成物置于骨囊肿中来实现治疗，例如：通过将所述组成物注射到骨囊肿中。在一些实施例中，所述组成物在原位(在所述囊肿中)形成一凝胶(根据本文所述的任何相应实施例)。
注入硬组织(例如：软骨及/或骨)中可任选地通过本领域已知的任何合适技术进行，例如：包括钻入所述软骨及/或骨中。例如，合适的技术包括：美国专利申请公开号2011/0125156中描述的程序及装置，其内容通过引用并入本文(特别是描述施用一组成物至一软骨下骨缺损中的内容)；及/或以SubchondroplastyTM的所述名称销售。
在本文所述任何实施例的一些实施方案中，根据本文所述的任何相应实施例的一组成物能够在注入一软骨下骨囊肿后降低疼痛的严重程度。
在本文所述任何实施例的一些实施方案中，选择根据本文所述任何相应实施例的一组成物，其能够在注入一软骨下骨囊肿后增强软骨下骨的重建。
不受任何特定理论的束缚，据信在一软骨下骨囊肿的一区域中的软骨下骨的重建，可以降低治疗后的一对象的骨关节炎的一风险及/或严重性。
进一步认为，根据本文所述的任何相应实施例，置于一骨(例如：骨囊肿)内的一组成物有利地允许营养物及/或氧气通过由所述组成物占据的所述骨体积持续传递(例如：由于一水凝胶的一多孔性质，同时也促进细胞侵入所述骨体积(例如：从而修复一骨囊肿)。
相反地，替代组成物及/或骨水泥仅用诸如磷酸钙之类的一矿物质，或者使用诸如聚(甲基丙烯酸甲酯)之类的聚合物填充一骨体积，可能不太适合营养物及/或氧气的传递。
在本文所述的任何实施例的一些实施方案中，涉及包括一额外的治疗活性剂的一组成物，所述组成物用于治疗可由所述治疗活性剂治疗的一病症。在一些这样的实施例中，所述病症可通过局部施用所述治疗活性剂来治疗，并且前述的治疗包括局部施用所述组成物(对于局部施用所述治疗活性剂是有益的一身体区域)。
一血液部分(根据本文所述的任何相应实施例)可以是包括一额外的治疗活性剂(例如：根据本文所述的任何相应实施例)的一非限制性实例，所述治疗活性剂包括一组成物，所述组成物用于治疗关节炎(例如：骨关节炎)、神经损伤、肌腱炎(例如：慢性肌腱炎)、肌肉损伤(例如：心肌损伤)、骨损伤(例如：骨囊肿)及/或手术损伤(例如：一切口部位)。在一些这样的实施例中，所述血液部分是一富含血小板的血浆。
透明质酸是一额外的治疗活性剂的一非限制性实例，所述额外的治疗活性剂可以包括在一组成物中(例如：根据本文所述的任何相应实施例)用于治疗关节炎，例如：骨关节炎。
如本文举例说明的，在如本文所述的组成物中掺入透明质酸(包括交联或非交联的透明质酸)，可以减少透明质酸从一生理环境中的一预期位置稀释及/或清除，例如：罹患关节炎的一关节。
本领域已知透明质酸的使用受限于(尤其)透明质酸在体内的快速酶消化作用，所述体内快速酶消化通过称为透明质酸酶的一酶家族以在体内促进消化[Jiang等人，Physiol Rev 2011,91：221-264；及Girish&Kemparaju，Life Sciences 2007,80：1921-1943]，这限制了所述透明质酸在体内的寿命。这种酶促降解在其施用后的短时间内导致透明质酸作用的丧失，此外，已经表明所述降解的透明质酸的所述短片段在诱导局部炎症中发挥作用。
如本文进一步举例说明的，在如本文所述的一组成物中掺入透明质酸可保护透明质酸免于透明质酸酶的降解。
在本文所述涉及细胞用途的任何实施例的一些实施方案中，所述病症可由所述细胞产生的一物质治疗。
可由一细胞产生的合适治疗活性物质的数个实例包括但不限于：多肽(包括天然存在的蛋白质及人工多肽序列)，例如：生长因子(例如：TGF-β、胰岛素样生长因子、成纤维细胞生长因子、骨形态发生蛋白和生长/分化因子)及抗炎多肽(例如：依那西普、英夫利昔单抗、阿达木单抗、IL-1Ra、β型干扰素)；多糖(例如：透明质酸)；及核酸(例如：反义核酸、siRNA)，任选地用于下调一促炎蛋白。关于由数个细胞产生的治疗活性物质的技术描述于例如：Madry等人[Cartilage 2011,2：201-225]，Madry&Cucchiarini[J Gene Med 2013,15：343-355]及Evans等人[Transl Res 2013,161：205-2016]。
在本文所述的任何实施例的一些实施方案中，涉及包括一核酸的一组成物的用途，所述用途包括将包含一基因的所述核酸递送至数个细胞。在一些实施例中，所述用途是用于治疗可通过体内基因表达治疗的一病症，例如：通过由所述基因编码的一蛋白质。
根据本发明一些实施例的一个方面，提供了实现基因递送的一方法，所述方法包括使至少一种细胞与包括一共轭物及一核酸的一组成物接触(根据本文所述的任何相应实施例)，其中，所述核酸包括用于递送的所述基因。所述方法可任选地在体内或体外实现。
在根据这方面的一些实施例中，所述至少一种细胞被所述组成物包围及/或在所述组成物的表面上培养，例如：其中所述方法在体外进行。
在根据涉及核酸及/或基因递送的任何实施例的一些实施方案中(根据本文描述的任何方面)，一核酸构建体(在本文中也称为「表达载体」)包括额外的序列，所述序列使得所述载体适于在原核生物、真核生物或优选两者中复制及整合(例如：穿梭载体)。另外，一典型的克隆载体还可含有一转录及转译的起始序列、转录及转译的终止子及一多腺苷酸化信号。举例来说，此类构建体通常包括：一5'LTR、一tRNA结合位点、一包装信号、一第二链DNA合成的起点及3'LTR或其部分。
本发明的一些实施例的所述核酸构建体通常包括一信号序列，所述信号序列用于从放置所述肽的一宿主细胞中分泌所述肽。优选地，用于所述目的的信号序列是一哺乳动物的信号序列或本发明一些实施例的所述多肽变体的信号序列。
真核启动子通常含有两种类型的识别序列，所述TATA盒及上游启动子元件。TATA盒位于所述转录起始位点上游25个至30个碱基对，并且被认为参与引导RNA聚合酶开始合成RNA。其他上游启动子元件决定所述转录起始的速率。
优选地，本发明的一些实施例的所述核酸构建体使用的启动子在转化的所述特定细胞群中具有活性。细胞类型特异性及/或组织特异性启动子的数个实例包括数个启动子，例如：肝脏特异性的白蛋白[Pinkert等人，(1987)Genes Dev。1：268-277]、淋巴特异性启动子[Calame等人，(1988)Adv。Immunol.43：235-275]；特别是T细胞受体的数个启动子[Winoto等人，(1989)EMBO J.8：729-733]及免疫球蛋白；[Banerji等人(1983)Cell 33729-740]、数个神经元特异性启动子，例如：所述神经丝启动子[Byrne等人(1989)ProcProc.Natl.Acad.Sci.USA86：5473-5477]、胰腺特异性启动子[Edlunch等人(1985)Science 230：912-916]或数种乳腺特异性启动子，例如：所述乳清启动子(美国专利号4,873,316及欧洲申请公开号264,166)。
增强子元件可以从连接的数个同源或异源启动子刺激高达1,000倍的转录。当置于所述转录起始位点的下游或上游时，许多增强子是活跃的。源自于数种病毒的许多增强子元件具有广泛的宿主范围并且在多种组织中具有活性。例如：所述SV40早期基因增强子适合用于许多细胞类型。适合用于本发明一些实施例的其他增强子/启动子的组合包括衍生自多瘤病毒、人类或老鼠巨细胞病毒(CMV)的那些组合，来自各种逆转录病毒的长末端重复序列，例如：老鼠白血病病毒、老鼠或劳氏肉瘤病毒及HIV。参见〔Enhancers andEukaryotic Expression，Cold Spring Harbor Press，Cold Spring Harbor，N.Y.1983〕，其通过引用并入本文。
在所述表达载体的所述构建中，所述启动子优选地位于与所述异源转录起始位点大致相同的距离，因为所述启动子来自所述异源转录的自然环境中的所述转录起始位点。然而，如本领域所知，可以适应所述距离的一些变化而不损失启动子的功能。
还可以将聚腺苷酸化序列添加到所述表达载体中以提高mRNA转译的效率。准确及有效的多腺苷酸化需要两个不同的序列元件：位于所述多腺苷酸化位点下游的富含GU或U的序列及位于上游11至30个核苷酸的六个核苷酸AAUAAA的一高度保守序列。适用于本发明一些实施例的终止及多腺苷酸化信号包括：衍生自SV40的那些信号。
除了已经描述的元件之外，本发明的一些实施例的所述表达载体通常可以含有其他特化元件，所述特化元件旨在提高克隆核酸的所述表达水平或促进携带所述重组DNA的数个细胞的鉴定。例如：许多动物病毒含有DNA序列，其促进允许细胞类型中所述病毒基因组的所述染色体外复制。只要所述适当的因子由所述质粒上携带的基因或由所述宿主细胞的基因组提供，携带这些病毒复制子的数种质粒以游离方式复制。
所述载体可以包括或不包括一真核复制子。如果存在一真核复制子，则使用适当的选择标记在真核细胞中扩增载体。如果所述载体不包含一真核复制子，则不可能进行附加型扩增。相反地，所述重组DNA整合到所述基因工程细胞的所述基因组中，其中所述启动子引导所需核酸的表达。
本发明的一些实施例的所述表达载体可以进一步包括额外的多核苷酸序列，其允许例如：来自单个mRNA的几种蛋白质的转译，例如：一内部核糖体进入位点(IRES)及用于所述启动子-嵌合多肽基因组整合的序列。
哺乳动物的表达载体的数个实例包括但不限于：pcDNA3、pcDNA3.1(+/-)、pGL3、pZeoSV2(+/-)、pSecTag2、pDisplay、pEF/myc/cyto、pCMV/myc/cyto、pCR3.1、pSinRep5、DH26S、DHBB、pNMT1、pNMT41、pNMT81，上述表达载体可购自Invitrogen，pCI可购自Promega、pMbac、pPbac、pBK-RSV以及pBK-CMV可购自Strategene，pTRES可购自Clontech及其衍生品。
还可以使用含有来自真核病毒(例如：逆转录病毒)的调节元件的表达载体。SV40载体包括pSVT7及pMT2。衍生自牛乳头瘤病毒的载体包括：pBV-1MTHA，衍生自Epstein Bar病毒的载体包括：pHEBO及p2O5。其他示例性载体包括：pMSG、pAV009/A+、pMTO10/A+、pMAMneo-5、杆状病毒pDSVE，以及任何其他允许在启动子引导下表达蛋白的载体，例如：SV-40早期启动子、SV-40后期启动子、金属硫蛋白启动子、鼠乳腺肿瘤病毒启动子、劳氏肉瘤病毒启动子、多角体蛋白启动子或其他有效地在真核细胞中表达的数种启动子。
如上所述，病毒是非常特化的感染因子，在许多情况下，它们已经进化以逃避宿主的防御机制。通常，病毒只在特定细胞类型中感染及繁殖。病毒载体的所述靶向特异性利用其天然特异性来特异性靶向预定的细胞类型，从而将一重组基因引入所述感染的细胞中。因此，本发明的一些实施例使用的载体类型将取决于转化的细胞类型。根据所述转化的细胞类型选择合适载体的能力是普通技术人员的基本能力，因此本文不提供选择考虑的一般描述。例如：可以使用所述人类T细胞白血病病毒I型(HTLV-1)靶向骨髓细胞，并且可以使用存在于杆状病毒苜蓿银纹夜蛾核多角体病毒(AcMNPV)中的所述异源启动子靶向肾细胞，如Liang CY等人所述，2004(Arch Virol.149：51-60)。
重组病毒载体可用于在体内表达多肽(例如：根据本文所述的任何相应实施例的多肽)，因为所述载体提供如侧向感染及靶向特异性的优点。例如：侧向感染是在逆转录病毒的生命周期中固有的，并且是单个感染细胞产生许多后代病毒体并且感染相邻细胞的过程。导致一大面积迅速地被感染，其中大部分的面积最初未被所述原始病毒颗粒感染。这与垂直型感染形成对比，垂直型感染中的所述感染因子仅通过子代传播。还可以产生不能横向扩散的病毒载体。如果期望的目的是仅将一特定基因引入一局部数目的靶细胞中，则所述特征可能是有用的。
可以使用各种方法将本发明的一些实施例中的所述表达载体引入数个干细胞中。这些方法一般描述于Sambrook等人，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，ColdSprings Harbor Laboratory，New York(1989,1992)，Ausubel 等人，Current Protocolsin Molecular Biology，John Wiley and Sons，Baltimore，Md。(1989)，Chang等人，Somatic Gene Therapy，CRC Press，Ann Arbor，Mich。(1995)，Vega et al。，GeneTargeting，CRC Press，Ann Arbor Mich。(1995)，Vectors：A Survey分子克隆载体及其用途，Butterworths，Boston Mass。(1988)及Gilboa等人[Biotechniques 4(6)：504-512,1986]并且包括例如：稳定或暂时转染、脂质转染、电穿孔及用重组病毒载体感染。另外，参见用于阳性-阴性选择方法的美国专利，专利号为5,464,764及5,487,992。
通过病毒感染引入核酸提供了优于其他方法(例如：脂质转染及电穿孔)的若干优点，由于病毒的所述感染性质可以获得更高的转染效率。
目前优选的在体内将核酸转移的技术包括：利用病毒或非病毒构建体进行转染，例如：腺病毒、慢病毒、第一型单纯疱疹病毒或腺相关病毒(AAV)及基于脂质的系统。用于脂质介导的基因转移中，有效的脂质是例如：DOTMA、DOPE及DC-Chol[Tonkinson等人，CancerInvestigation，14(1)：54-65(1996)]。用于基因治疗的所述最优选构建体是病毒，最优选为腺病毒、AAV、慢病毒或逆转录病毒。一病毒构建体如逆转录病毒构建体包括至少一种转录启动子/增强子或基因座限定元件，或者通过其他方式控制基因表达的其他元件，例如：交替剪接、核RNA输出或信息的转译后的修饰。此类载体构建体还包括一包装信号、长末端重复序列(LTR)或其部分，以及适合于所述使用的病毒的正链及负链引物的结合位点，除非它已经存在于病毒构建体中。另外，这种构建体通常包括：用于从其中放置所述肽的一宿主细胞分泌肽的一信号序列。优选地，用于这个目的的所述信号序列是一哺乳动物信号序列或本发明一些实施例的多肽变体的信号序列。任选地，所述构建体还可以包括指导多腺苷酸化的一信号，以及一个或多个限制性位点及一转译终止序列。举例来说，此类构建体通常包括：5'LTR、tRNA结合位点、包装信号、第二链DNA合成的起点及3'LTR或其部分。可以使用非病毒的其他载体，例如：阳离子脂质、聚赖氨酸及树枝状大分子。
除了含有所述插入的编码序列的所述转录及转译所必需的元件之外，本发明的一些实施例的表达构建体还可以包括：经基因工程改造以增强所述表达的肽的稳定性、生产、纯化、产量或毒性的序列。例如：可以改造包含本发明一些实施例的所述多肽及一异源蛋白质的一融合蛋白或一可切割融合蛋白的所述表达。可以设计这样的一融合蛋白，使得所述融合蛋白可以通过亲和层析以容易地分离；例如：通过固定在所述对异源蛋白质特异的一柱上。当在所述多肽及所述异源蛋白质之间设计一切割位点时，可以通过使用破坏所述切割位点的一适当酶或经由试剂处理从所述色谱柱中释放所述多肽[例如：参见Booth等人，J.Biol.Chem，Vol.30，p.1998]。(1988)Immunol.Lett.19：65-70；及Gardella等人，(1990)J.Biol Chemistry 265：15854-15859]。
如上所述，多种原核或真核细胞可用作宿主表达系统以表达本发明一些实施例的多肽。这些宿主表达系统包括但不限于微生物，例如：用一重组噬菌体DNA转化的细菌、含有所述编码序列的质粒DNA或粘粒DNA的表达载体；用含有所述编码序列的重组酵母表达载体转化酵母菌；用重组病毒表达载体(例如：花椰菜花叶病毒、CaMV；烟草镶嵌病毒、TMV)感染的植物细胞系统或用含有所述编码序列的重组质粒表达载体进行转化，例如：Ti质粒。哺乳动物表达系统也可用于表达本发明一些实施例的多肽。
细菌构建体的数个实例包括pET系列的大肠杆菌表达载体[Studier等人。(1990)Methods in Enzymol。185：60-89)。
在酵母菌中，可以使用含有组成型或诱导型启动子的数种载体，如美国专利申请号5,932,447中所公开的。或者，可以使用促进外源DNA序列整合至所述酵母染色体中的数种载体。
在使用植物表达载体的情况下，所述编码序列的所述表达可以由许多启动子驱动。例如：病毒启动子如CaMV的所述35S RNA及19S RNA启动子[Brisson等人。(1984)Nature310：511-514]，或可以使用TMV的所述外壳蛋白启动子[Takamatsu等人。(1987)EMBO J.6：307-311]。或者，植物启动子，如RUBISCO的所述小亚单位[Coruzzi等人(1984)EMBO J.3：1671-1680及Brogli等人，(1984)Science 224：838-843]或热休克启动子，例如：可以使用大豆hsp17.5-E或hsp17.3-B[Gurley等人(1986)Mol.Cell.Biol.6：559-565]。可以使用Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、显微注射、电穿孔及本领域技术人员熟知的其他技术将这些构建体引入植物细胞中。参见，例如：Weissbach&Weissbach，1988，Methodsfor Plant Molecular Biology，Academic Press，NY，Section VIII，pp 421-463。
本领域众所周知并在下文中进一步描述的其他表达系统如昆虫及哺乳动物宿主细胞系统也可用于本发明的一些实施例。
在培养中的一适当时间后进行所述重组多肽的回收。所述短语「回收重组多肽」是指收集含有所述多肽的所述全部的发酵培养基，并且不需要暗示额外的分离或纯化步骤。尽管如此，本发明的一些实施例的多肽可以使用多种标准蛋白质纯化技术纯化，例如但不限于：亲和层析、离子交换层析、过滤、电泳、疏水相互作用层析、凝胶过滤层析、反相色谱、伴刀豆球蛋白A层析、色谱聚焦及差异溶解。
如本文所用，一「药物组成物」是指本文所述的一种或多种活性成分与其他化学组分如药学上可接受的载体及赋形剂的制剂。一药物组成物的所述目的是促进一化合物向一生物体进行施用。
本文中所述术语「活性成分」是指一聚合蛋白共轭物及/或一额外的治疗活性剂(根据本文所述的任何相应实施例)。
在下文中，所述短语「药学上可接受的载体」是指不会对一生物体造成显着刺激并且不会消除所述施用的化合物的所述生物活性及性质的一载体或一稀释剂。这些短语包括一佐剂。
本文中所述术语「赋形剂」是指添加到药物组成物中以进一步促进一活性成分施用的一惰性物质。赋形剂的数个实例包括但不限于：碳酸钙、磷酸钙、各种糖及淀粉类型、纤维素衍生物、明胶、植物油及聚乙二醇。
可以根据诸如特定病症或疾病、所述对象的健康状况、施用方法及剂量等参数来配制用于组合本发明的药物组成物与其他药剂的方案。这种组合方案的确定可以由例如：主治医师、医院工作人员等专业人员以及根据预定方案进行。
用于配制及施用药物的技术可以在「Remington's Pharmaceutical Sciences，Mack Publishing Co.，Easton，PA」的最新版本中找到，其通过引用并入本文。
合适的施用途径可以包括例如：口服、直肠、经粘膜、特别是经鼻、肠或肠胃外施用、包括肌肉内、皮下及髓内注射以及鞘内、直接心室内、心内，例如：进入所述右心室或左心室腔、进入冠状动脉、静脉注射、腹膜内、鼻内或眼内注射。
本发明的所述药物组成物可任选地包括根据本文所述的任何相应实施例的一活性剂的一「治疗有效量」。一「治疗有效量」是指在一必要的剂量及时间段内有效实现所需治疗结果的量。所述活性剂的一治疗有效量可根据诸如所述疾病状态、年龄、性别及所述个体的体重等因素以及所述活性剂在所述个体中引发一所需反应的所述能力而变化。一治疗有效量也是其中所述治疗有益效果超过所述活性剂的任何毒性或有害作用的量。
应注意，剂量值可随待缓解的病症的类型及严重程度而变化。应进一步理解，对于任何特定对象，应根据所述个体的需求以及施用或监控所述组成物的所述施用的人员的专业判断，随着时间调整特定的剂量方案，并且本文所述的任何剂量范围仅是示例性的，并且非旨在限制所述要求保护的组成物的所述范围或实践。
本发明的一些实施例的药物组成物可以通过本领域熟知的方法制备，例如：通过常规的混合、溶解、制粒、制糖衣、研磨、乳化、包封、包埋或冻干的数个过程。
因此，根据本发明一些实施例所使用的药物组成物可以使用一种或多种在药学上可接受的载体以常规方式配制，所述载体包括：赋形剂及助剂，其有助于将本文所述组成物的所述成分加工成可以在药学上使用的制剂。适当的配方取决于所选择的施用途径。
对于注射而言，所述药物组成物的所述活性成分可以配制在水溶液中，优选地在生理上相容的缓冲液中，例如：Hank’s溶液、Ringer溶液或生理盐缓冲液。对于穿粘膜施用而言，在所述制剂中使用适合于要渗透的所述屏障的渗透剂。这种渗透剂通常是本领域已知的，例如：表面活性剂。
对于口服施用而言，可以通过将所述活性化合物与本领域熟知的在药学上可接受的载体组合以容易地配制所述药物组成物。这些载体使所述药成组合物能够配制成：片剂、丸剂、糖衣丸、胶囊、液体、凝胶、糖浆、浆液、悬浮液等，提供患者口服摄取。口服使用的药物制剂可以使用一固体赋形剂制备，任选地研磨所得混合物，并且如果在有需要的情况下，在加入合适的助剂后加工所述颗粒混合物，以获得片剂或糖衣丸核心。合适的赋形剂特别是诸如糖的填充剂，包括：乳糖、蔗糖、甘露糖醇或山梨糖醇；纤维素制剂，例如：玉米淀粉、小麦淀粉、大米淀粉、马铃薯淀粉、明胶、黄蓍胶、甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、羧甲基纤维素钠；及/或药学上可接受的聚合物，例如：聚乙烯吡咯烷酮(PVP)。如果在有需要的情况下，可以加入崩解剂，例如：交联聚乙烯吡咯烷酮、琼脂或海藻酸或其盐，例如：海藻酸钠。
糖衣丸芯具有合适的涂层。为此目的，可以使用浓缩糖溶液，其可以任选地含有阿拉伯树胶、滑石、聚乙烯吡咯烷酮、卡波姆凝胶、聚乙二醇、二氧化钛、漆溶液及合适的有机溶剂或溶剂混合物。可以将染料或颜料添加到所述片剂或糖衣丸包衣中以用于鉴定或表征活性化合物剂量的不同组合。
可口服使用的药物组成物包括由明胶制成的推入式胶囊以及由明胶及一增塑剂(例如：甘油或山梨糖醇)制成的软密封胶囊。所述推入式胶囊可含有所述活性成分与填充剂(例如：乳糖)、粘合剂(例如：淀粉)、润滑剂(例如：滑石粉或硬脂酸镁)及任选的稳定剂的混合物。在软胶囊中，所述活性成分可以溶解或悬浮在合适的液体中，例如：脂肪油、液体石蜡或液体聚乙二醇。此外，可以添加稳定剂。用于口服施用的所有制剂应该是适合于所述选择的施用途径的剂量。
对于口腔施用，所述组成物可以采用以常规方式配制的片剂或锭剂的所述形式。
本文所述的药物组成物可以配制用于肠胃外施用，例如：通过推注或连续输注。用于注射的制剂可以以单位剂量的形式存在，例如：在安瓿中或在多剂量的数个容器中，任选地添加一防腐剂。所述组成物可以是油性或水性载体中的悬浮液、溶液或乳液，并且可以含有配制剂，例如：悬浮剂、稳定剂及/或分散剂。
用于肠胃外施用的药物组成物包括以溶于水形式的所述活性制剂的所述水溶液。另外，所述活性成分的悬浮液可以制备成适当的油性或水性注射悬浮液。合适的亲脂性溶剂或载体包括脂肪油，例如：芝麻油，或合成脂肪酸酯，例如：油酸乙酯、甘油三酯或脂质体。
水性注射悬浮液可含有增加所述悬浮液粘度的物质，例如：羧甲基纤维素钠、山梨糖醇或葡聚糖。任选地，所述悬浮液还可含有合适的稳定剂或增加所述活性成分溶解度的试剂，以制备高浓度溶液。
或者，如上文详述，所述活性成分可以是粉末形式，用于在使用前利用合适的载体(例如：无菌、无热原的水基性溶液)构建。
本发明的一些实施例的所述药物组成物还可以配制成直肠组合物，例如：栓剂或保留灌肠剂，使用例如：常规的栓剂基质，例如：可可脂或其他甘油酯。
如本文所讨论的，所述药物组成物可任选地以一局部而非全身的方式施用，例如：通过将所述药物组成物直接注射到一患者或其他有此需要的对象的一组织区域(例如：关节)中。
本文中，所述术语「组织」是指由具有执行一种或多种功能的数个细胞组成的一生物体的一部分。数个实例包括但不限于：脑组织、视网膜、皮肤组织、肝组织、胰腺组织、骨、软骨、结缔组织、血液组织、肌肉组织、心脏组织脑组织、血管组织、肾组织、肺组织、性腺组织、造血组织。
适用于本发明中一些实施例的药物组成物包括其中含有一有效量的所述活性成分以实现所述预期目的的组成物。更具体地，治疗有效量是指有效预防、缓解或改善病症症状或延长所治疗对象存活的活性成分(根据本文所述的任何相应实施例的经修饰的第一型脱氧核糖核酸酶)的量。
一治疗有效量的确定完全在本领域技术人员的能力范围内，特别是根据本文提供的所述详细公开内容。
对于本发明的所述方法中使用的任何制剂，最初可以从体外及细胞培养测定以及动物模型中估计所述治疗有效量或剂量(本文所述的共轭物及/或本文所述的一额外的治疗活性剂)。例如：可以在动物模型中配制一剂量(例如：根据本文所述的程序)以达到一所需的浓度或滴度。这些信息可用于更准确地确定人体中的有用剂量。
本文所述活性成分的毒性及治疗功效可通过体外标准药学方法、细胞培养物或实验动物来测定。从这些体外及细胞培养测定及动物研究中获得的数据可用于配制用于人类的一系列剂量。
所述剂量(本文所述的共轭物及/或本文所述的一额外的治疗活性剂)可根据采用的所述剂型及采用的施用途径而变化。所述确切的配方、施用途径及剂量可以由所述个别的医生根据患者的病情做选择。(参见例如：Fingl等人，1975，「The PharmacologicalBasis of Therapeutics」，Ch.1p.1)。
剂量及间隔可以单独调节，例如：以提供足以诱导或抑制所述生物效应(例如：最小有效浓度，MEC)的数个细胞、血清及/或关节中本文所述的共轭物及/或本文所述的一额外的治疗活性剂的数种水平。每种制剂的所述MEC都不同，但可以从体外数据估算。实现MEC所需的剂量取决于个体特征及施用途径。检测分析可用于确定血浆的浓度。
根据待治疗病症的所述严重程度及反应性，可以是单次或多次施用所述剂量，在几天或长达数年的治疗过程中从单次施用持续到多次施用，或直到实现治愈或达到所述疾病状态的缓解。
当然，施用一组成物的所述量取决于所述治疗的对象、所述疼痛的所述严重程度、所述施用方式，所述处方医师的所述判断等。
如果需要，本发明的一些实施例的组成物可以存在于一包装或分液器装置中，例如：FDA批准的试剂盒，其可以含有一种或多种单位剂型。例如：所述包装可以包括金属或塑料箔，例如：泡罩包装。所述包装或分液器装置可附有施用说明。所述包装或分液器也可以通过与所述容器相关的一通知来容纳，所述通知由管理药品的制造、使用或销售的政府机构所规定的一形式呈现，所述通知反映了所述机构批准的组成物的所述形式或人类或兽医的施用。例如：这种通知可以是美国食品药品管理局批准的用于处方药或一批准的产品插页的标签。还可以制备根据本文所述的本发明的任何相应实施例的组成物，将所述组成误置于一合适的容器中，并且标记用于治疗一指定的病症，如本文进一步详述的。
如本文所用，所述术语「约」是指±10％。
所述术语「包括」、「包含」、「含有」、「包揽」、「具有」及它们的词形变化表示「包括但不限于」。
所述术语「由...组成」表示「包括但限于」。
所述术语「基本上由...组成」是指组成物、方法或结构可包括其他成分，步骤及/或部分，但仅在附加成分、步骤及/或部分不实质上改变所要求保护的组成物、方法或结构的所述基本及新颖特征的情况下。
如本文所用，所述单数形式「一」、「一个」及「所述」包括复数指代，除非上下文另有明确说明。例如，所述术语「化合物」或「至少一种化合物」可包括多种化合物，包括所述多种化合物的混合物。在整个申请中，本发明的各种实施例可以以范围格式呈现。应当理解，范围形式的描述仅仅是为了方便及简洁，不应该被解释为对本发明范围的一不灵活限制。因此，应该认为一范围的所述描述具体公开了所有可能的子范围以及所述范围内的各个数值。例如，应该认为对诸如1至6的范围的描述具有特别公开的子范围，例如：从1到3、从1到4、从1到5、从2到4、从2到6、从3到6以及在所述范围内的个别数字，例如：1、2、3、4、5及6。无论所述范围的所述广度如何，这都适用。
无论何时在本文中指示一数值范围，其意图包括在所指示的范围内的任何引用的数字(分数或积分)。所述短语「范围/范围在…之间」一第一指示数字及一第二指示数字及「范围/范围从」一第一指示数字「到」一第二指示数字，在本文中可互换使用并且意味着包括所述第一及第二指示数字以及它们之间的所有所述分数及整数数字。
如本文所用，所述术语「方法」是指用于完成给定任务的方式、手段、技术及程序，包括但不限于已知方式或者对于化学、药理学、生物学、生物化学及医学领域的从业者来说易于从已知方式开发的那些方式、手段、技术及程序，的技术及程序。
如本文所用，所述术语「治疗」包括消除、基本上抑制、减缓或逆转一病症的所述进展，基本上改善一病症的临床或美学症状或基本上防止一病症的临床或美学症状的出现。
当提及特定序列表时，这种参考应理解为还包括基本上对应于其互补序列的序列，例如：包括由于定序错误、克隆错误或导致碱基替换、碱基缺失或碱基添加的其他改变而导致的次要序列变异，提供这种变异的所述频率小于50个核苷酸中的1个、或者100个核苷酸中少于1个、或者200个核苷酸中少于1个、或者500个核苷酸中少于1个、或者1000个核苷酸中少于1个、或者5,000个核苷酸中少于1个、或者10,000个核苷酸中少于1个。
应当理解，为了清楚起见，在单独的实施例的所述上下文中描述的本发明的某些特征也可以在一单个实施例中组合提供。相反地，为了简洁起见，在单个实施例的所述上下文中描述的本发明的各种特征也可以单独提供或以任何合适的子组合提供或者在本发明的任何其他描述的实施例中合适地提供。在各种实施例的所述上下文中描述的某些特征不被认为是那些实施例的必要特征，除非所述实施例在没有那些元件的情况下不起作用。
如上所述及如下面的权利要求部分所要求保护的本发明的各种实施例及数个方面，在以下数个实施例中得到实验的支持。
实施例
现在参考以下实施例，其与以上描述一起以非限制性方式说明本发明的一些实施例。
材料及方法
材料：
数种抗体(第二型兔抗胶原蛋白、ab34712及小鼠抗人纤维蛋白、ab58207)从Abcam获得。
绿色荧光蛋白质粒(pmax-GFP)从Amaxa获得。
从BASF获得分子量为12.6千道尔顿的F127泊洛沙姆(P407)。
根据国际专利申请公开号WO2011/073991中描述的程序，通过丙烯酰化F127泊洛沙姆制备F127泊洛沙姆二丙烯酸酯(F127-DA)。
纤维蛋白原(人；TisseelTM)从Baxter获得。
PolyJetTM转染剂从SignaGen获得。
PEI(聚乙烯亚胺)转染试剂(25千道尔顿，线性)从瑞典乌普萨拉大学获得。
三(2-羧乙基)膦盐酸盐从Sigma获得。
细胞繁殖：
将原代绵羊软骨细胞解冻并以单层接种并在所述软骨细胞标准培养基(高葡萄糖的DMEM，10％胎牛血清，100单位/毫升青霉素/链霉素，非必需氨基酸，抗坏血酸)的存在下培养至汇合。收获2个至6个用于实验的单层软骨细胞。
使用生长培养基(高葡萄糖的DMEM，补充有10％胎牛血清及2.5％HEPES，pH 7.4，及抗生素(青霉素/链霉素))传代C2C12成肌细胞。在每个基因递送实验之前，细胞在100％汇合的生长培养基中的数个平板上生长24小时，然后用胰蛋白酶消化、离心并收集在15毫升的数根管中。数个细胞用于传代至第11代。
F127泊洛沙姆二丙烯酸酯(F127-DA)与纤维蛋白原的缀合
使用国际专利申请公开号WO2011/073991中描述的所述方法的一修改，将F127-DA与纤维蛋白原共轭以获得F127纤维蛋白原的一共轭物(在本文中也可互换地称为「GelrinV」)的溶液。
将含有8摩尔的尿素的150毫摩尔的磷酸盐缓冲盐水(PBS)中的一9.26毫克/毫升的人类纤维蛋白原溶液，以1.5：1的TCEP HCl与纤维蛋白原半胱氨酸的一摩尔比，补充三(2-羧乙基)膦盐酸盐(TCEP HCl)。溶解后，使用1摩尔的氢氧化钠将所述溶液的pH值调节至8.0。在加入PBS及8摩尔的尿素(146.7毫克/毫升)的一溶液中的F127-DA并且在室温下反应3小时。合成聚合物与纤维蛋白原半胱氨酸的所述摩尔比为1：1。3小时后，将所述反应溶液转移到具有一12千道尔顿至14千道尔顿截止值(CelluSep)的一透析管中，并且在4℃下对PBS(pH7.4)进行透析，以除去所述尿素。使用一标准BCATM蛋白质测定法(PierceBiotechnology)测定净纤维蛋白原浓度，并且比较总共轭产物(干重)与纤维蛋白原含量(BCA值)的相对量。
如图1所示。所述GelrinV在一生理温度(37℃)下表现为一凝胶，在室温(22℃)下表现为一粘性液体(可通过一细针容易地注射)。
荧光标记F127纤维蛋白原(GelrinV)：
将6毫升的F127纤维蛋白原溶液(GelrinV)置于具有一12千道尔顿至14千道尔顿截止值的一透析管(CelluSep)中，并且在室温下，插入含有0.025毫克/毫升的NHS-FITC(N-羟基琥珀酰亚胺-荧光素异硫氰酸酯；Thermo Scientific)的一PBS溶液中，反应8小时。在标记所述纤维蛋白原胺基团后，将所述透析管插入一4,000毫升的PBS(磷酸盐缓冲盐水)溶液中以从GelrinV中除去游离的NHS-FITC分子。
剪切储能模量(G')的测量：
使用配备有一恒温循环控制器基座(Peltier plate temperature-controlledbase)的一AR-G2流变仪(TA仪器)进行温控流变的测量。在所有实验中使用20毫米的不锈钢板几何形状。用0.2毫升的样品进行每次的测量。所述流变学测量的所述测试条件是在2.5赫兹的一振荡频率下的2％应变。
摩擦系数测量：
根据Singh等人[Nat Mater 2014,13：988-995]描述的程序进行摩擦系数(CoF；μ)的测量。使用配备有一恒温循环控制器基座的一AR-G2流变仪(TA仪器)，将0.5毫升的测试样品置于一平坦的聚四氟乙烯模具台(直径为25毫米)上。将附着在20毫米不锈钢几何形状的一上部的一聚四氟乙烯环(环形几何形状，15毫米外径和9毫米内径)降低，直到施加0.01牛顿至0.02牛顿的法向力。在每次测试期间，测量扭矩(τ)及法向力(N)，并且使用以下等式确定μk(动摩擦系数)的瞬时测量值：μk＝τmax/(Reff*N)。静摩擦系数使用以下等式确定：μs＝τmax/(Reff*N)，在所述测试的所述启动阶段期间发现的所述最大扭矩值。用于所述计算的所述环形几何形状的所述有效半径(Reff)为13.1毫米。
异常性疼痛评估：
基于大鼠对校准细丝(Bioseb，法国)应用于所述足部的反应，使用所述von Frey方法评估机械异常性疼痛(由一刺激引起的疼痛通常不会激起疼痛)。通过表示所述力度的log10(mg×10)的一数字来识别细丝。在基线评估之前，使大鼠习惯于一测试架三次(45分钟至60分钟)。测试开始于将所述4.31细丝三次施用于左后爪及右后爪。当大鼠对所述毛发的所述压力有一明显反应时记录一反应，通常表现为后爪从所述炉排上抬起以减轻所述压力。记录每种细丝尺寸的三个应用，并记录反应数(0-3)。如果大鼠对细丝没有反应或仅响应一次，则应用试剂盒中的下一个较大的细丝并重复所述过程，直到大鼠对三个应用中的至少两个有反应。
如果大鼠对4.31毛发反应两次或三次，则施加所述标准范围(3.61)中的最小头发，之后如上所述继续所述过程。数据输入所述「PsychoFit」计划(Harvey LO，科罗拉多大学博尔德分校)，产生一50％的缩爪阈值。这个数值以克为单位转换为力，并且报告为所述绝对阈值。在第7、10、24及35天进行测量，其分别对应于第一次关节内注射测试材料的日子，第一次注射后3天、第二次注射后3天及14天。
步态分析：
通过将墨水施加到所述足部的所述腹侧表面并记录大鼠在纸张上移动(足迹)期间的负重来进行步态分析。将大鼠的后足放入墨水中，然后将大鼠置于纸上并使其以全长行走。必要时重复所述过程以产生4个清晰、均匀着墨的足迹对，表示步态的所述整体模式。从0到6以视觉方式评分步态，其中「0」表示正常负重、「6」表示跳跃，即腿部负载(轻微跛行/疼痛＝1、轻度跛行/疼痛＝2、中度跛行/疼痛＝3、明显跛行/疼痛＝4、严重跛行/疼痛＝5)。使用ImageJ处理程序以数值方式分析步态、分析足迹，以在300解析度的黑白扫描上测量墨水的面积。所述图像是平滑的，然后将所述阈值设置为0(低)及254(高)。分析粒子函数用于所述实际的测量，尺寸设置为0至无限及圆度设置为0至1。以平方英寸报告所述值，并且将所述右足迹的所述面积除以两个足迹的所述平均值以确定每对印迹的所述步态不足。
缺陷百分比近似于所述分数描述的所述临床表现如下：0％至5％＝0；6％至15％＝1；16％至30％＝2；31％至50％＝3；51％至75％＝4；76％至99％＝5；100％＝6。
DNA纳米复合物的形成：
将PolyJetTM转染剂(PolyJetTM，SignaGen)以1：4的比例(1微克的质粒及4微升的PolyJetTM)添加至商业pmax-GFP质粒中。在室温下温育15分钟后，在无血清培养基中形成纳米复合物。在一些情况下，将PolyJetTM与LABEL IT-CyTM3以1：4的比例混合(0.5微克的非标记质粒及0.5微克的LABELIT-CyTM3及4微升的PolyJetTM)。如上所述形成纳米复合物。
将PEI(聚乙烯亚胺)转染剂以一1:20N/P的比率加入到LABEL IT-CyTM 3的质粒及未标记的质粒中，并且每次转染从每个质粒加入0.5微克的所述转染剂。在室温下温育15分钟后，在无血清培养基中形成纳米复合物。
显微成像：
数张图像是使用Nis-Elements F3.00软件(Nikon)及得自X-荧光照明系统(EXFO)的一Eclipse TS100倒置荧光显微镜(Nikon)的一数位视线数码相机(Nikon)所拍摄的。
统计分析：
使用Microsoft Excel统计分析软件进行统计分析。使用一学生的T检验(双尾，相等方差)进行两种治疗之间的比较。p值<0.05被认为是统计学上显着的。
实施例1
F127纤维蛋白原共轭物与受损软骨表面的结合
使用一手术刀及3毫米的钢活检穿孔器从新鲜屠宰的牛的股骨关节中制备圆形软骨外植体。然后使用一1.5毫米的钢活检穿孔器在所述外植体的所述表面上进行圆形磨损。然后将所述外植体在1毫升的软骨形成培养基(高葡萄糖DMEM(Dulbecco改良的Eagle培养基)+0.2％牛血清白蛋白)中培养3天，所述培养基含有0.2毫升的FITC标记的F127纤维蛋白原，如材料及方法部分所述所制备。将外植体在PBS中洗涤3次(在1毫升的PBS中洗涤两次、在25毫升的PBS中洗涤一次，持续5小时)，然后在4％甲醛中固定。然后使用相差及荧光显微镜观察外植体。
如图2A及图2B所示，荧光标记的F127纤维蛋白原特异性地与受损的软骨表面(擦伤)相关联，而不是与完整的软骨表面相关联。
这些结果表明聚合蛋白共轭物对受损的软骨表面具有一特异性亲和力。
实施例2
F127纤维蛋白原对发炎软骨的软骨细胞沉淀模型的影响
培养绵羊软骨细胞(如上所述)，并使用收获的单层软骨细胞(每个颗粒含有0.5×106个细胞)制备沉淀物。将数个细胞以1000rpm(每分钟转数)离心5分钟、计数，并在软骨形成培养基(高葡萄糖DMEM，10％胎牛血清、青霉素/链霉素、210微摩尔的抗坏血酸(40微克/毫升)、10-7摩尔的地塞米松、10奈克/毫升的TGF-β3)中以106个细胞/毫升的一浓度重悬，并且分装成15毫升的数根锥形管(每管0.5毫升)。将数根管以2000rpm(500克)离心10分钟。然后将数个管盖半开放以在一3周温育期间(37℃、5％CO 2)进行气体交换，每3天至4天进行一次培养基更换。在3周结束时，将成熟的沉淀物用于随后的实验。
对于一体外炎症模型，将沉淀物在PBS中洗涤两次，并将无血清培养基中的0.5奈克/毫升的IL-1β(白细胞介素-1β)以3种剂量加入到成熟沉淀物中。在无血清培养基中加入一第一剂量4天后以产生初始炎症。在存在或不存在F127纤维蛋白原(如上文所述制备)的情况下以2天间隔添加所述第二及所述第三剂量。为了用F127纤维蛋白原处理沉淀，将F127纤维蛋白原(60微升)分层在每个沉淀的顶部，接着补充含有IL1-β(一最终浓度为0.5奈克/毫升)的无血清培养基(120微升)。阴性对照样品接收180微升含有0.5奈克/毫升的IL1-β的培养基。在移除先前的培养基后以相同的方式添加所述第二及所述第三剂量并用一移液管进行凝胶。
通过二甲基亚甲基蓝(DMMB)测定法定量sGAG(硫酸化糖胺聚糖)的水平，并根据Hoemann等人[Anal Biochem 2002,300：1-10]描述的方法将其标准化为DNA含量。使用针对第二型胶原蛋白或人类纤维蛋白的数种抗体染色所述固定的组织学横切面。
如图3所示，F127纤维蛋白原在所述沉淀周围形成一层紧密粘附在所述沉淀表面上的一层(因为它对大量洗涤具有抗性)。
如图4所示，IL-1诱导第二型胶原蛋白(软骨ECM的一种成分)的一减少，所述第二型胶原蛋白被F127纤维蛋白原逆转，但不被Synvisc-粘弹性补充剂逆转。
此外，如图5所示，F127纤维蛋白原完全逆转了所述IL-1β介导的sGAG水平的降低。
这些结果表所述明聚合蛋白共轭物提供针对炎症的保护(通过形成一保护层)，所述保护不是由基于透明质酸的粘弹性补充剂提供的。
实施例3
F127纤维蛋白原对透明质酸稀释及降解的影响
在F127纤维蛋白原、Synvisc-交联透明质酸粘弹性补充剂、非交联透明质酸粘弹性补充剂及F127纤维蛋白原与Synvisc-或粘弹性补充剂以1：1的比例混和的混合物之间比较水分的摄取。
将0.3毫升的测试材料置于一1.5毫升的离心管中并记录所述初始的质量。将所述数根管在37℃的一培养箱中放置15分钟以使凝胶化。形成一凝胶后，向各管中加入1毫升的PBS(pH7.4,37℃)，然后密封所述数根管。温育之后，倒出PBS并记录所述最终的凝胶质量。使用以下等式计算所述水分吸收的百分比：100×质量(最终)/质量(初始)。如材料及方法部分中所述测量剪切储能模量(G')。
在一些样品中，加入透明质酸酶以评估F127纤维蛋白原在所述透明质酸酶存在下的所述作用，透明质酸酶使透明质酸分裂并与滑膜炎症相关[Nagaya等人，Ann Rheum Dis1999,58：186-188]。
如图6A及图6B所示，在相同条件下(图6A中的水分吸收为-13％，图6B中的水分吸收为-1％)，交联及非交联的基于透明质酸的粘弹性补充剂在体温下在PBS中培育48小时后表现出显着的水分吸收，而F127纤维蛋白原表现出没有水份吸收或负的水分吸收(即排出水分)。如其中进一步显示的，与单独的基于透明质酸的粘弹性补充剂相比(纯交联粘弹性补充剂的水分吸收为50％，交联粘弹性补充剂的水分吸收为25％)，F127纤维蛋白原与任一类型的基于透明质酸的粘弹性补充剂的混合物导致水分吸收的显着降低(对于具有交联的粘弹性补充剂的混合物，水分吸收为11％，对于具有非交联的粘弹性补充剂的混合物，水分吸收为9％)。
如图7所示，F127纤维蛋白原与Synvisc-的一混合物表现出与纯Synvisc-类似的一初始(t＝0)G'Max，但48小时后，与纯Synvisc-相比，所述混合物的所述G'Max仅减少25％，纯Synvisc-则减少了57％。
如其中进一步显示的，在透明质酸酶存在下，纯Synvisc-的所述G'Max降低了98％，而F127-纤维蛋白原/Synvisc-混合物的所述G'Max降低了72％。
这些结果表明所述聚合蛋白共轭物减少了粘弹性补充剂的稀释以及由于稀释或酶降解所导致的粘弹性补充剂的机械性质的降低。
实施例4
F127纤维蛋白原对摩擦系数的影响
通过使用上文材料及方法部分中描述的程序比较F127纤维蛋白原及Synvisc-粘弹性补充物的摩擦系数(CoF；μ)以评估聚合蛋白共轭物的润滑。
如图8所示，F127纤维蛋白原表现出一静态CoF(μ＝0.043)，所述静态CoF小于Synvisc-粘弹性补充剂(μ＝0.256)所显示的20％。
如Ludwig等人[Arthritis Rheum 2012,64：3963-3971]及Ballard等人[J BoneJoint Surg Am 2012,94：e64])报道的，上述F127纤维蛋白原的静态CoF非常接近正常滑液的所述值(μ～0.02)。
类似地，如图9所示，在所有测量的滑动速度下，F127纤维蛋白原显示出一动力学CoF，所述动力学CoF显着低于Synvisc-粘弹性补充剂的CoF。
这些结果表明，与常规的粘弹性补充剂相比，聚合蛋白共轭物表现出更大的润滑性。
不受任何特定理论的束缚，据信所述共轭物分子中的蛋白质(例如：纤维蛋白原)部分促进对软骨表面的所述粘附，特别是受损的软骨表面(例如：如上文举例说明的)，并且所述合成聚合物(例如：F127泊洛沙姆)部分提供增强的润滑功效，如图10所示，从而提供了粘合剂及润滑性能的一协同组合。
实施例5
F127纤维蛋白原对软骨退化及体内疼痛的影响
使用罹患骨关节炎的一体内大鼠模型(内侧半月板撕裂)以评估F127纤维蛋白原在罹患关节炎的关节的所述作用。在这个模型中(35天的持续时间)，对所述半月板的损伤诱导进行性软骨退化及骨赘形成，其模拟自发性骨关节炎中所发生的变化。
用异氟烷麻醉动物并准备所述右膝区域以用于手术。在所述膝盖的所述内侧面上切开一皮肤切口，通过钝性解剖暴露所述内侧副韧带，然后横切。将所述内侧半月板切成所述全厚度以模拟一完全撕裂。用4-0缝线封闭皮肤及皮下组织。所述模型动物在所述胫骨中发生软骨退化。手术后7天，对所述动物(通过关节内注射)进行给药，并如下表1及图11中所示进行评估。在第35天牺牲所述动物并取组织进行组织学检查。在所述组织病理学完成之前，治疗信息是未知的。
表1：不同实验组的治疗
三天后，在10％的甲酸中将所述操作的关节在所述正面切成两个大致相等的半边，并且包埋在石蜡中。从每个右膝以约200微米的步长切下三个切片并用甲苯胺蓝染色。从每个左膝切下一个切片。用显微镜分析组织。确定每张载玻片上两个半边的所述最坏情况，并且用于评估。然后在所述三个部分中对每个参数的所述值进行平均，以确定每只动物的总体值。
在损伤处于最严重形式(「实质」)的位置测量所述退化软骨的宽度，即最大胶原蛋白及蛋白多糖的损失。
通过超过所述软骨厚度的50％延伸软骨细胞及蛋白聚糖的损失来鉴定显着的软骨退化，并且通过目镜测微计测量退化软骨的所述精确宽度。通常，对于该参数，所述胶原蛋白损伤是轻微的(25％深度)或更大，但软骨细胞及蛋白多糖的损失延伸至软骨深度的至少50％或更大，表示发生永久性结构变化的数个区域。
如图12及图13所示，用F127纤维蛋白原处理的动物的实质性软骨退化的所述宽度低于对照(PBS处理的)动物(通过13％)及Synvisc-处理的动物(通过11％)的宽度。
另外，如图14所示，F127纤维蛋白原在体内与软骨表面结合形成一层。
上述结果表示所述聚合蛋白共轭物可以减少软骨的退化，并且表示这种效果可以通过在受损软骨上形成一粘附层来介导，其可以润滑软骨及/或作为促炎细胞因子的一屏障。
通过评估机械性异常性疼痛(由通常不会引起疼痛的一刺激所引起的疼痛)及动物步态分析(量化为步态评分及步态不足百分比)来评估所述治疗对所述大鼠疼痛的影响，如材料及方法部分中所描述的(在图11中指示的所述时间点)。
如图15所示，Synvisc-粘弹性补充剂及F127纤维蛋白原均降低对手术关节继发性疼痛的敏感性，这可通过第7天至第35天的阈值增加来证明。
如图16A及图16B所示，与对照动物及Synvisc-治疗的动物相比，F127纤维蛋白原减少了步态评分及步态不足，表示一受伤腿上的负重增加。
这些结果表明聚合蛋白共轭物减少了与关节炎关节相关的疼痛，并且在这方面比基于透明质酸的粘弹性补充剂更有效。
实施例6
F127纤维蛋白原与血液成分混合物的性质
富含血小板的血浆(PRP)及缺乏血小板的血浆(PPP)根据Nagata等人[Eur J Dent2010,4：395-402]描述的方法制备。简言之，将来自一健康志愿者的3毫升新鲜血液样品与柠檬酸钠在室温下以160克离心6分钟。然后移取0.6毫升的PPP(顶层)。接下来，在将所述中间部件与所述管的下部部件分开的所述线的下方2毫米处做出标记。将所述标记以上的所有含量(约0.7毫升)移液并包含所述PRP组分。
对于流变测量，在低于20℃的温度下将150微升的PRP或PPP与150微升的GelrinV(10毫克/毫升纤维蛋白原)混合，以获得保持在冰上的一均匀溶液。混合时不发生沉淀或凝结。作为一对照，将GelrinV与PBS以1：1的比例混合。将200微升的所述混合物样品用于温度依赖性的流变测量。
如图17所示，当以1：1的比例与血液部分(未活化的富含血小板的血浆及缺乏血小板的血浆)混合时，F127纤维蛋白原表现出逆向热凝胶化性质(在较高温度下显着增加的G'值)。如其中进一步显示的，所述混合物与血液部分的逆向热凝胶化的特征在于较高的G'值及较低的凝胶化温度，而不是与PBS的所述混合物的逆向热凝胶化，表示所述F127纤维蛋白原与血液部分之间的相互作用增强了凝胶化。
这些结果表明，包含聚合蛋白共轭物的所述组成物可以用作血液部分(例如：自体血液部分)的一载体，例如：用于允许从包封的血小板中连续释放的数种生长因子(例如：以促进软骨修复)。
实施例7
使用F127纤维蛋白原组成物的基因递送
为了证明DNA纳米复合物在一聚合蛋白共轭物组成物中随时间的保留，将4微升的GelrinV(8毫克/毫升的纤维蛋白原)在4℃下与由PolyJetTM或PEI转染制备的DNA纳米复合物与如上所述的具有未标记及Cy3标记的质粒的试剂，或与具有裸质粒DNA(100微升中1微克的质粒)的试剂混和。然后将含有DNA的GelrinV与一C2C12细胞沉淀(含有106个细胞)混合，并且在37℃下在48孔组织培养板中温育40分钟，然后加入生长培养基。在本文指出的每个时间点，使用一荧光显微镜拍摄数张图像。
如图18所示，裸露的Cy3质粒DNA从所述凝胶中扩散出来，而用PolyJetTM及PEI转染试剂制备的纳米复合物在包封后48小时保留在所述凝胶中。
如上文材料及方法部分中所述制备DNA纳米复合物(纳米丛)，使用GFP质粒(绿色荧光蛋白)，并与GelrinV混合(图19A中所示)，并且在各种条件下评估使用所述GelrinV质粒混合物进行基因递送。
为了进行3D(包封细胞)基因递送，在一些情况下，将C2C12成肌细胞与DNA纳米复合物预先温育20分钟，在室温下与GelrinV混合(5×106个细胞/毫升的凝胶)，然后在37℃下，温育40分钟后形成一凝胶(图19B)。在其他情况下，将数个细胞与纳米复合物混合而不与GelrinV预先温育，并且如上所述形成凝胶(图19C)。
为了进行2D(相邻细胞)基因递送，在一些情况下，将含有GelrinV的纳米丛层叠在预先粘附于组织培养塑料的数个细胞上(图19D)。在其他情况下，将GelrinV凝胶与纳米丛混合，在15毫升的管中或在非粘附性组织培养板中以37℃预先聚合40分钟，并将细胞接种在顶部(图19E)。
通过使用具有异硫氰酸荧光素滤光片的标准荧光显微镜的显微镜观察评估GFP质粒的递送。
如图19B至图19F中所示，使用用于DNA纳米复合物递送的一F127纤维蛋白原组成物实现成功的2D(图19B及图19C)及3D(图19D至图19F)基因递送，如通过一相对大量的GFP表达证明的数个细胞。
将含有GFP质粒纳米复合物的GelrinV样品(100微升)用PBS进行两次洗涤(每次5毫升)，然后以2D构型(如上所述)进行细胞接种。
如图20所示，洗涤不会降低所述转染效率。这个结果表明所述基因递送不是由于爆发释放的纳米复合物，而是由于包封的纳米复合物。
这些结果表明聚合蛋白共轭物适于促进基因递送。重要的是，GelrinV在2D构型中将质粒DNA递送至数个细胞的所述能力有利于GelrinV在一无细胞构型中体内使用。
实施例8
F127纤维蛋白原组成务对骨囊肿的影响
将GelrinV组成物(如上所述制备)注射到一骨囊肿中(在一人类对象中)，任选地为一软骨下骨囊肿。所述骨囊肿区域的计算机断层扫描(CT)成像任选地在注射之前及注射后几个月进行，以评估囊肿的填充。此外，疼痛的评估任选地在注射前及注射后几个月通过一可接受的技术进行，例如：使用一11点数字的视觉模拟评分法(VAS)。骨囊肿填充的增强及/或疼痛的减轻(例如：相对于对照组)是量化的。
尽管已经结合本发明的具体实施例描述了本发明，但显然许多替代、修改及变化对于本领域技术人员来说是显而易见的。因此，旨在涵盖落入所附权利要求的精神及广泛范围内的所有这些替代、修改及变化。
本说明书中提及的所有出版物、专利及专利申请均通过引用整体并入本说明书中，其程度如同每个单独的出版物、专利或专利申请被具体地及单独地指出通过引用并入本文。此外，本申请中任何参考文献的引用或标识不应被解释为承认这样的参考文献可用作本发明的现有技术。在使用章节标题的范围内，它们不应被解释为必要限制。

Claims (50)

1.一种组成物，其特征在于：所述组成物包括：一共轭物，所述共轭物包括一多肽，所述多肽具有附接至所述多肽的至少两个聚合物部分，至少一个所述聚合物部分表现一逆向热凝胶化，所述组成物用于治疗关于关节软骨的退化及/或软骨下骨的骨质流失的一病症。
2.如权利要求1所述的组成物，其特征在于：所述治疗包括关节内施用所述组成物。
3.如权利要求2所述的组成物，其特征在于：所述施用包括关节内注射。
4.如权利要求1至2任一项所述的组成物，其特征在于：所述退化与在所述关节软骨的一表面处的一摩擦相关联。
5.如权利要求4所述的组成物，其特征在于：所述组成物的一静摩擦系数小于0.2。
6.如权利要求1至5任一项所述的组成物，其特征在于：所述关节软骨的退化及/或所述软骨下骨的骨质流失与一发炎相关联。
7.如权利要求1至6任一项所述的组成物，其特征在于：所述病症与一软骨下骨囊肿相关联。
8.如权利要求7所述的组成物，其特征在于：所述治疗包括注射所述组成物至所述骨囊肿。
9.如权利要求1至8任一项所述的组成物，其特征在于：所述组成物在37℃的一温度下与一含水液体一起温育48小时后的一水分吸收小于20重量百分比。
10.如权利要求1至9任一项所述的组成物，其特征在于：所述组成物包括所述共轭物的一水溶液。
11.如权利要求10所述的组成物，其特征在于：所述组成物在32℃至37℃的一范围的一温度下形成一水凝胶。
12.如权利要求1至11任一项所述的组成物，其特征在于：所述组成物能够进行一逆向热凝胶化。
13.如权利要求1至12任一项所述的组成物，其特征在于：所述组成物进一步包括至少一个附加的治疗活性剂。
14.如权利要求13所述的组成物，其特征在于：所述附加的治疗活性剂是选自于由一透明质酸、一抗炎剂、一镇痛剂、一生长因子、一血液部分、一核酸及一细胞所组成的群组。
15.如权利要求1至14任一项所述的组成物，其特征在于：所述病症是关节炎。
16.如权利要求15所述的组成物，其特征在于：所述关节炎是骨性关节炎。
17.如权利要求1至16任一项所述的组成物，其特征在于：所述关节软骨及/或所述软骨下骨的至少一部分是在一滑膜关节内。
18.如权利要求1至17任一项所述的组成物，其特征在于：所述多肽是至少20个胺基酸的长度。
19.如权利要求1至18任一项所述的组成物，其特征在于：所述多肽能够黏附于软骨。
20.如权利要求19所述的组成物，其特征在于：所述多肽对受损软骨表现出比未受损软骨更大的亲和力。
21.如权利要求1至20任一项所述的组成物，其特征在于：所述多肽包括一蛋白质或所述蛋白质的一片段。
22.如权利要求21所述的组成物，其特征在于：所述多肽是选自于由纤维蛋白原、胶原蛋白、纤维连接蛋白、弹性蛋白、原纤蛋白、腓骨蛋白、层粘连蛋白、白蛋白、温韦伯氏因子及明胶及其的数个片段所组成的群组。
23.如权利要求1至22任一项所述的组成物，其特征在于：每一个所述聚合物部分表现一逆向热凝胶化。
24.如权利要求1至23任一项所述的组成物，其特征在于：所述聚合部分包括一合成聚合物。
25.如权利要求23或24所述的组成物，其特征在于：至少一个所述聚合物部分包括一泊洛沙姆(聚(环氧乙烷-环氧丙烷)共聚物)。
26.如权利要求1至25任一项所述的组成物，其特征在于：至少一个所述聚合物部分进一步包括能够在体内使所述共轭物与一蛋白质共价交联的至少一个交联部分。
27.一种医药的组成物，其特征在于：所述组成物包括：
一共轭物，所述共轭物包括一多肽，所述多肽具有附接至所述共轭物的至少两个聚合物部分，至少一个所述聚合物部分表现一逆向热凝胶化；以及至少一个附加的治疗活性剂，选自于由一透明质酸、一抗炎剂、一镇痛剂、一生长因子、一血液部分、一核酸及一细胞所组成的群组；
其中所述组成物是一水性组成物，所述水性组成物在32℃至37℃的一范围的一温度下形成一水凝胶。
28.如权利要求27所述的组成物，其特征在于：至少一个所述附加的治疗活性剂是选自于由一透明质酸、一血液部分及一核酸所组成的群组。
29.如权利要求27或28所述的组成物，其特征在于：所述组成物在37℃的一温度下与一含水液体一起温育48小时后的水分吸收小于20重量百分比。
30.如权利要求27至29任一项所述的组成物，其特征在于：所述水凝胶的一剪切储能模量为至少15帕斯卡。
31.如权利要求27至30任一项所述的组成物，其特征在于：所述组成物能够进行一逆向热凝胶化。
32.如权利要求27至31任一项所述的组成物，其特征在于：所述组成物的至少20％重量是所述血液部分。
33.如权利要求27至32任一项所述的组成物，其特征在于：所述血液部分是选自于由一富含血小板的血浆及一缺乏血小板的血浆所组成的群组。
34.如权利要求27至33任一项所述的组成物，其特征在于：所述多肽是至少20个胺基酸的长度。
35.如权利要求27至34任一项所述的组成物，其特征在于：所述多肽包括一蛋白质或所述蛋白质的一片段。
36.如权利要求35所述的组成物，其特征在于：所述多肽是选自于由一纤维蛋白原、一胶原蛋白、一纤维连接蛋白、一弹性蛋白、一原纤蛋白、一腓骨蛋白、一层粘连蛋白、一白蛋白、一温韦伯氏因子及一明胶及其数个片段所组成的群组。
37.如权利要求27至36任一项所述的组成物，其特征在于：每一个所述聚合物部分表现一逆向热凝胶化。
38.如权利要求27至37任一项所述的组成物，其特征在于：所述聚合物部分包括一合成聚合物。
39.如权利要求37或38所述的组成物，其特征在于：所述聚合物部分包括一泊洛沙姆(聚(环氧乙烷-环氧丙烷)共聚物)。
40.如权利要求27至39任一项所述的组成物，其特征在于：至少一个所述聚合物部分进一步包括能够在体内使所述共轭物与一蛋白质共价交联的至少一个交联部分。
41.如权利要求27至40任一项所述的组成物，其特征在于：所述组成物是一可注射的组成物。
42.如权利要求27至41任一项所述的组成物，其特征在于：所述组成物能够持续释放所述治疗活性剂。
43.如权利要求27至42任一项所述的组成物，其特征在于：所述组成物用于治疗可由所述治疗活性剂治疗的一病症。
44.如权利要求43所述的组成物，其特征在于：所述病症通过局部施用所述治疗活性剂来治疗，并且所述治疗包括局部施用所述组合物。
45.如权利要求43至44任一项所述的组成物，其特征在于：所述至少一种治疗活性剂包括所述血液部分，并且所述病症是选自于由关节炎、神经损伤、肌腱炎、肌肉损伤、骨损伤及手术损伤所组成的群组。
46.如权利要求43至44任一项所述的组成物，其特征在于：所述治疗包括将由所述核酸组成的一基因递送至数个细胞，其中所述病症可通过在体内表现的所述基因来治疗。
47.如权利要求43至44任一项所述的组成物，其特征在于：所述至少一种治疗活性剂包括所述透明质酸，以及所述病症是关节炎。
48.一种实现递送基因的方法，其特征在于：所述方法使至少一个细胞与如权利要求27至42任一项所述的组成物接触，所述组成物包括所述核酸，并且所述核酸包括所述基因，从而实现将所述基因递送至所述至少一个细胞。
49.如权利要求48所述的方法，其特征在于：所述方法在体外实现。
50.如权利要求48或49所述的组成物，其特征在于：所述至少一个细胞被所述组成物包围及/或在所述组成物的一表面上培养。
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