CN102031260A - 促进皮肤伤口无疤痕愈合的siRNA及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了促进皮肤伤口无疤痕愈合的siRNA分子、靶向多个伤口无疤痕愈合相关基因的多个siRNA分子的鸡尾酒组合、以siRNA分子或者其鸡尾酒组合作为有效成分的药物组合物,通过细胞实验以及小鼠和猪皮肤创伤模型证明了该药物组合物可以促进因外伤、外科手术、或糖尿病皮肤溃疡等造成的皮肤伤口达到无疤痕愈合,其中siRNA分子可以靶向那些造成伤口病理性修复或不良反应的基因,siRNA双链有不同的长度和不同的末端,可以靶向人、小鼠、及猪细胞同一基因的同源序列,鸡尾酒组合中的多个siRNA能同时抑制伤口炎症和血管再生的各种相关基因,药效更显著;药物组合物中组氨酸-赖氨酸聚合物、树枝状聚合物或脂质体等药物载体能以纳米颗粒的形式增强siRNA导入皮肤组织。
Description
技术领域
本发明涉及促进皮肤伤口无疤痕愈合的siRNA分子、靶向多个伤口无疤痕愈合相关基因的多个siRNA分子的鸡尾酒组合、以siRNA分子或者其鸡尾酒组合作为有效成分的药物组合物。
背景技术
皮肤是机体最大的器官,由下层的内皮层(真皮)和外部的上皮层(表皮)组成,皮肤的基本功能是机体对外界环境的保护屏障。当机体皮肤的完整性由于受伤或疾病而大面积缺损后,可因其主要屏障功能的丧失而导致机体死亡。在美国,每年有超过125万烧伤患者和650万因挤压、静脉淤滞或糖尿病引起的慢性皮肤溃疡患者。伤口治疗的首要目标是快速的愈合并恢复功能,同时尽量减少疤痕面积、恢复美观。近期细胞和分子生物学发展迅猛,极大增强了我们对伤口修复和组织再生的生物学过程的理解,也提升了伤口护理的水平。
伤口修复:皮肤损伤的快速反应
受伤后组织恢复完整性的过程,是一项系统发育过程中形成的基本而重要的功能,也是宿主的天然免疫反应过程。高等脊椎动物的组织重构能力不如低等脊椎动物,后者组织损坏后还能重构,而前者快速修复后会形成纤维化的疤痕。无论是创伤、微生物感染或外来物质造成的损伤,均会发生一系列事件,包括凝结、炎症、上皮再生、形成肉芽组织、基质和组织重塑等,这些事件在时间先后上有部分重叠。修复过程主要是由细胞因子等信号分子相互作用来介导的,这种相互作用以多级放大的模式来激活和调节细胞活性。一般通过人工构建模拟皮肤损伤过程的皮肤伤口模型来研究受伤后的反应。凝结反应发生在损伤初期,随后是局部的急性炎症反应,接着间叶细胞富集、增殖,基质合成。炎症处理不当将导致慢性不愈的伤口、不可控制的基质累积(经常通过各种细胞因子通路),从而导致额外的疤痕和纤维化等后遗症。细胞因子的功能鉴别方面的不断进步,为探索通过抑制/增强细胞因子来控制或调节病理修复过程提供了可能性。
胚胎伤口的无疤痕快速愈合
伤口愈合是一个动态的相互作用过程,涉及可溶性介质、血细胞、细胞间质和实质细胞。伤口愈合过程包括在时间先后上有重叠的三个阶段——炎症、组织形成和组织重塑。在胚胎皮肤形成阶段,单细胞繁殖形成基底层后产生的角质细胞,经生长停滞期后,在分化程序的严格控制下由下向上迁移成为形态学完全不同的表皮层。使用类似的程序,表皮在有机体的整个生命过程中不断更新。表皮形成后,成年哺乳动物皮肤也有快速修复损伤的能力。然而,如果追求快速伤口愈合和防止感染,则会导致伤口愈合不完美,常伴有表皮层和真皮层的疤痕出现。
相对于成年人的皮肤伤口修复,妊娠早期胎儿的伤口是通过再生过程修复的,其真皮和表皮能够进行完美的无疤痕重建。与成年人相比,胎儿伤口在修复上有下述几点显著差异:胎儿伤口修复得比较快,并且很少或者不出现炎症反应,其细胞因子/生长因子表达谱不同,表达量通常是较低的。
TGF-β抗体可部分地减少疤痕形成量
有大量证据表明伤口修复受细胞因子、生长因子及其它们的受体等一系列因子的调节(5-7)。这些调节因子通过一种复杂但有序的模式影响细胞的迁移、生长和增生,同时与嗜中性白细胞及巨噬细胞的浸润、血管生成、纤维素增生、基质沉积、伤疤形成和表皮再植等有关。在伤口修复过程中,除了血小板与巨噬细胞,成纤维细胞是细胞因子或生长因子的主要来源。早期妊娠胎儿皮肤伤口的无疤痕修复主要是特定的细胞因子或生长因子作用的结果。
在众多因子中,转化生长因子β(TGF-β)在皮肤伤口愈合过程中的作用已经得到广泛研究,对疤痕的形成起着重要的作用。TGF-β的主要功能是调控细胞增殖和分化,刺激细胞外基质如胶原的合成。在正常无疤痕胎儿的伤口中外源添加TGF-β可导致疤痕形成,同时还观察到类似于成年人的炎症反应。在成年鼠皮肤伤口使用TGF-β抗体中和能导致伤口部位疤痕数量的部分地减少,表明TGF-β具有促纤维化的特性。TGF-β刺激产生的Ⅰ型胶原是成年机体皮肤主要的胶原类型。但另一方面,TGF-β中和抗体并不能完全阻止成人皮肤疤痕形成,因而近期有一些研究对最为主要的疤痕形成因子的TGF-β的功能提出了质疑(8-15)。
研究发现动物在胚胎期第16天(E16)受伤时,TGF-β1和β2表达的下降和快速清除伴随着TGF-β3水平的升高和半衰期的延长,并发生相互交叉网状的胶原沉积。相反,在胚胎期第19天(E19)的损伤模型中,增加和延长TGF-β1和β2的表达会导致TGF-β3表达的下降和延缓,同时伴随细束有序的胶原结构。这意味着TGF-β1和β2表达的增加,TGF-β3表达的下降是晚期妊娠胎儿伤口疤痕形成的主要原因。这些观察结果对于理解TGF-β促进内源伤口愈合反应具有广泛的意义,说明过量表达TGF-β1和β2很可能是机体的快速有效保护应急反应的正常组分。然而,无感染的情况下,减少这一过量表达、炎症和角化细胞抑制,可以减少疤痕产生。
COX-2抑制剂减少疤痕组织形成和提高组织拉伸强度
在对胎儿伤口修复过程所涉及的白介素IL-6、IL-8和IL-10进行研究的过程中,近来因为COX-2(环加氧酶-2)参与炎症失调性疾病的发生,如类风湿病、骨关节炎、心血管疾病和癌症形成等,因而受到了广泛的关注。COX-2参与炎症早期的上调反应,如伤口炎症反应。COX-2指导合成的前列腺素参与调控炎症反应的多个方面,包括血管渗透、促炎细胞的浸润和活化。研究者对成人伤口修复过程中COX-2途径和其它途径的炎症反应的兴趣逐渐增加,因为这些早期事件也调节修复的效果。由于COX-2参与炎症反应,以及近期的一些研究阐明它在多个方面参与伤口修复,一些工作对COX-2在胎儿伤口愈合中的作用进行了总结,表明COX-2酶在妊娠胎儿伤口修复过程的早期和晚期的表达存在差异。
此外,COX-2的酶促产物前列腺素E2(PGE2)也参与了许多反应过程,在早期胎儿的伤口使用PGE2后,出现修复过程延缓,最终形成伤疤的现象。在无疤痕修复中增加PGE2水平后,使无伤疤的修复过程转为生成伤疤的修复,更突出表明了COX-2通路在伤疤形成中的作用。尽管没有研究指出PGE2是否对胶原沉积物或胶原纤维有作用,但在胎儿伤口中使用后PGE2可以诱导炎症反应。PEG2在具体情况下究竟是具有免疫抑制或抗炎症的特性,还是作为一种促炎分子,有可能的是由PEG2受体表达或活性的差异来决定的。有几个看似合理的关于PGE2介导胎儿伤口形成伤疤的机制:PGE2能够增强急性炎症反应,除了已知的能干扰无疤痕愈合,还通过募集或活化炎性细胞间接地促进疤痕的形成。PGE2处理既能延缓伤口修复,也能通过增加促纤维化因子TGF-β使疤痕组织沉积。在Smad3缺失型小鼠中,TGF-β信号途径被阻断能够加快修复的速率。大量的数据表明抑制TGF-β3水平对无伤疤的修复也是至关重要的。最后,有数据表明成纤维细胞在有PGE2的情况下繁殖加速,表明PGE2能够直接促进纤维细胞的增生,促进胶原形成和伤疤产生。之前的各种研究表明接触PGE2后,胶原沉积和成纤维细胞繁殖均增加,也支持了这一观点。这些实质性的数据意味着低水平COX-2和PGE2的表达对于胎儿皮肤无疤痕修复是必需的,PGE2诱导胎儿皮肤疤痕形成的事实进一步支持了COX-2途径在疤痕产生中的作用。用COX-2抑制剂celecoxib(赛来考昔)治疗切割伤口的研究表明,COX-2的功能是否被抑制是伤口部位炎症反应强度的显著参数之一。伤口修复过程中早期炎症反应的降低对之后的整个修复过程产生极重要的影响,能够在减少疤痕组织形成的同时,不损坏再上皮化过程及不降低抗拉强度。
HoxB13 KO小鼠皮肤伤口愈合更快、疤痕组织形成更少
由于能在器官形成中精确地指导分化功能,进化保守的Hox转录因子家族一直被认为是调节致死性皮肤再生的极具吸引力的候选靶标。研究确认Hox蛋白家族中一个特殊成员——HoxB13——是中期妊娠皮肤来源的原代培养细胞中表达的主要Hox基因。随后使用中期胚胎(该阶段伤口可无疤痕愈合)皮肤和成年皮肤进行的伤口愈合研究表明HoxB13在胎儿和成年人体内的表达水平不一致。有趣的是,与非伤口对照相比,HoxB13在胎儿伤口组织中的表达水平较低;而成年人体内HoxB13的表达水平在伤口和非伤口组织中几乎没有显著区别。综上所述,HoxB13的低水平表达在胎儿无疤痕伤口修复的过程中是不可或缺的,也使通过降低或去除成人皮肤的HoxB13来促进伤口愈合的可能性增加。
在HoxB13基因敲除(KO)的成年鼠皮肤切除或切割伤口展开的愈合研究表明,与其野生型(WT)相比,HoxB13 KO的伤口显示了一些早期胚胎皮肤伤口的特征,包括快速愈合、组织抗拉强度的增加以及真皮层伤疤的减少。生化鉴定显示表皮与真皮中的透明质酸(HA)在未受伤的成年HoxB13 KO皮肤中的表达水平明显高于WT皮肤。组织学对比研究表明HoxB13 KO皮肤切割伤口的愈合能力较强,真皮层修复也比WT伤口完整,其皮肤切除伤口也比WT伤口愈合得更快。在HoxB13 KO伤口中,胶原聚集得比较松弛,大部分交织成网状结构,类似于未受过伤的皮肤,说明HoxB13 KO伤口中的胶原重塑后将重新组成正常的真皮结构。利用生物芯片分析成年WT和HoxB13 KO小鼠整个皮肤中的基因表达谱,结果表明几个表皮分化指标在未受伤的HoxB13 KO成年鼠皮肤中明显低于未受伤的WT成年鼠皮肤。对HoxB13 KO小鼠的伤口修复研究进一步证实了HoxB13是促进伤口无疤痕愈合的一个潜在靶标基因(29-31)。
伤口愈合过程涉及的其他因素
胚胎皮肤损伤后的反应与成人极大不同,成人只有微弱的炎症反应和很少量的成纤维细胞增殖,而且有重要的胶原蛋白沉积。因为血小板衍生生长因子(PDGF)在成人伤口愈合调控过程中起到重要作用,有研究着重观察了PDGF对于胚胎伤口处细胞和细胞外基质的影响。将硅酮弹性体型填充物(SILASTIC,Dow Corning Corp.)移植到子宫内1、3或5天后收集样本,用标准的免疫组化程序处理后进行评估。移植损伤PDGF治疗组的急性炎症反应、成纤维细胞聚集和透明质酸沉积显著增多。这些差异在很大程度上是时间和PDGF剂量依赖性的,数据显示胚胎修复是在无PDGF条件下开始的。
胚胎伤口无疤痕愈合的关键特征是没有炎症反应,而较晚期胚胎和成人皮肤伤口愈合过程中有强烈的炎症反应,并最终在伤口区域形成永久性疤痕。白介素IL-6和IL-8在胚胎伤口修复中的作用已经被研究清楚,但伤口修复中的其他一些炎症介导因子的作用还不清楚。Smad3蛋白参与TGF-β超家族介导的细胞内信号转导,对细胞增殖、分化、迁移以及详细阐明皮肤伤口修复基质中枢具有重要作用。体外Smad3和激素信号相互作用的研究表明这是控制细胞活性的重要机制,但是还未能在体内观察到相同的机制。Ashcroft GS等体内研究发现,Smad3在雄激素抑制伤口愈合过程中发挥作用,而不参与雌激素调节反应。野生型和Smad3缺陷型雌鼠卵巢切除后愈合延缓,并可用雌激素替代疗法恢复愈合速度。相反,阉割能够加速野生型雄鼠的愈合,并可被外源性的雄激素逆转。而调节Smad3缺陷型鼠中雄激素的水平,伤口愈合反应没有明显变化。突变型单核细胞能够被脂多糖刺激,以与野生型细胞类似的方式产生特异的促炎介质(巨噬细胞单核细胞抑制因子),对雄激素介导的刺激反应缓和,而能维持雌激素诱导的巨噬细胞抑制因子的正常反应。这些数据意味着Smad3在一般的伤口愈合反应的雌激素信号转导中发挥作用,也表明Smad3参与调节雌激素介导的炎症细胞活性。
纤粘连蛋白(fibronectin,FN)是一个多功能的粘性蛋白,参与伤口修复的多个步骤。目前,有足够的证据表明FN蛋白的多样性受RNA剪辑调控,而转录和RNA加工过程是受到发育、衰老以及组织/细胞类型调控的。FN基因的表达、调控和生物学功能,以及各种剪辑形式仍然不清楚。分别在胚胎期(怀孕21-23天)、断乳幼畜(4-6周)和成年兔(>6个月)的气管和皮肤部位切割形成伤口,通过mRNA差异表达分析,克隆cDNA测序后经实时荧光定量PCR(real-tmie PCR)分析基因表达谱。在刚断乳幼兔气管粘膜伤口中,纤维连接蛋白1(Fn1)和Homo sapiens splicing factor,arginine/serine-rich 3(Sfrs3)转录水平升高并维持高水平超过48个小时。鼻下气管粘膜伤口中这两个基因表达上升比在皮肤伤口更显著,表明Fn1和Sfrs3两个基因在鼻下气管粘膜伤口中的作用是组织特异性的。有证据表明SR蛋白20(SRp20)确实参与FN的替代性剪辑,在成人伤口修复过程中出现的是FN的变体。研究发现,鼻下气管粘膜伤口愈合的早期,Sfrs3分子活性增强与FN基因表达的调控相关,后者通过不同的剪辑机制调控。
靶向siRNA组成
RNA干扰(RNA interference,RNAi)是一种序列特异性的RNA降解过程,为生物医学研究人员提供了一种理论上可以简便而直接抑制或沉默任何基因表达的方式。在自然发生的RNA干扰中,双链RNA被RNA酶Ⅲ/解旋酶蛋白Dicer剪切成为小的干扰RNA分子(siRNA),这是一种19-23个碱基对长度的、3’末端有2个碱基突出的双链RNA(dsRNA)。这些siRNA整合进入一个名为RNA诱导的沉默复合物(RISC)的多组分核糖核酸酶,siRNA中的一条链(引导链,ss-siRNA)保持与RISC结合,并将复合物导向与ss-siRNA序列互补的同源RNA。该siRNA指导核酸内切酶消化RNA,从而使之降解失活。有研究显示利用化学合成的21-25个碱基对的siRNA在哺乳动物中显示了RNAi效果,且siRNA结合(末端或中间)的热力学稳定性在分子功能上起到了关键性的作用。
重要的是,目前研究者还不可能确保潜在靶向疾病基因mRNA序列的候选siRNA一定会显示有效的RNAi活性。相反,每一个合成的候选siRNA必须在培养的哺乳动物细胞中进行检测,以确定是否发生对靶基因的干扰。siRNA独特的优势是可以在一项治疗中联合多个siRNA靶向多个致病基因,因为所有的siRNA来源相同,制备过程一样,具有化学同源性。
总之,有关成人皮肤伤口无疤痕愈合所涉及的分子靶标,比如促纤维化因子TGF-β、促炎因子COX-2和分化调节因子Hoxb13等已经得到充分的确证和评估,应该可以作为siRNA药物治疗的靶标;并将针对各个靶标的最有效的siRNA整合成多靶标鸡尾酒药物同时使用的话,可以成为满足未来临床皮肤伤口治疗需要的一种新型有效的治疗手段。因此,使用多靶标RNAi治疗来促进各种皮肤伤口的愈合符合当前的发展趋势。
发明内容
本发明的第一个目的是提供可促进皮肤伤口无疤痕愈合的各种siRNA分子,其靶向的基因选自损伤皮肤组织细胞中的促炎症通路基因、促血管新生通路基因和促细胞增殖通路基因,如TGF-β基因、COX-2基因和HoxB13基因;
本发明的第二个目的是提供多种上述的siRNA分子的组合物,该组合物可以靶向多个伤口愈合的相关基因;
本发明的第三个目的是提供上述的各种siRNA分子或者其组合物在制备促进皮肤伤口无疤痕愈合的药物中的应用;
本发明的第四个目的是提供以上述的各种siRNA分子或者其组合物作为有效成分,并包含有药物载体和/或赋形剂的药物组合物。该药物组合物作为治疗皮肤伤口、促进伤口无疤痕愈合的新型治疗药物,皮肤伤口可以因物理损伤、烧伤、过敏、糖尿病、炎症或肿瘤引起,这些伤口的基本特征是有炎症或新生血管形成。siRNA的治疗原理是利用siRNA分子或者多种siRNA分子的鸡尾酒组合能特异地抑制影响皮肤伤口局部炎症反应和新生血管形成的一些基因,从而改变皮肤伤口愈合的生物学进程,达到无疤痕愈合的效果。
采用双链寡聚核苷酸构成的siRNA在细胞内能与作为靶标的特异单链RNA结合,然后将其降解来达到特异性抑制某一基因功能的效果。本发明所靶向的单链RNA分子可以是编码多肽或蛋白质的mRNA,也可以是一种调控分子microRNA(miRNA)分子。作为靶标的基因选自促炎通路基因、促血管新生通路基因和促细胞增殖通路基因。这些靶标基因的产物参与促进炎症、伤口愈合或皮肤组织疤痕形成等生物学过程。而且,首选的siRNA序列应该能靶向和抑制至少小鼠和人两个物种的同一同源基因。
siRNA分子序列如表1-6列出所示,这些siRNA分子长度为19-27个碱基对。分子可以是两端同为平末端,同为粘性末端,或者一端为平末端另一端为粘性末端。siRNA分子可以在单个核苷酸水平进行修饰,或者对整个寡聚核苷酸骨架修饰,也可以不经修饰。见下述具体实施方式中的实际应用。
在下述的具体实施方式中,siRNA分子被特异设计成不但能与人类mRNA分子结合,也与同源的小鼠mRNA结合,这些mRNA在各自的种内编码同样或类似的蛋白质,这样做的目的是使经动物实验所筛选出的siRNA能直接转换成适用于人体的药物。
我们采用以下步骤来鉴别挑选有效siRNA分子:(1)针对靶标单链RNA序列,用电脑软件程序设计一系列与靶标单链RNA序列不同部位互补的siRNA分子。优先选择那些同时与小鼠和人的同一基因都能互补结合的siRNA序列作为候选,这样候选siRNA一旦在小鼠筛选成功就可直接进入人体试验;(2)在体外选择能最有效降解靶分子RNA的siRNA分子;(3)将选定的siRNA分子与一种药学上可接受的载体混合配制成药用纳米颗粒,并对纳米颗粒进行物理化学性质鉴定;(4)在动物伤口模型中评估所选定的siRNA纳米药物组合物;(5)选择在模型中最有效的siRNA-纳米颗粒作为推向临床试验应用的药物组合物。在上述第(4)步,首先采用的动物伤口模型是小鼠背部皮肤切割伤口模型,这些小动物模型主要用于快速鉴定和筛选。采用动物模型是因为体内组织是由不同类型细胞组成的,靶基因在不同类型细胞中的表达常常大相径庭。因此,相对于体外单一细胞检测,动物疾病模型更适于各种siRNA分子及多种siRNA分子的鸡尾酒组合的治疗效果的筛选鉴定。另外,在小动物模型上获得的结果需要在其他动物模型上做进一步的评估,为的是从不同的侧面对特定siRNA及鸡尾酒组合的效力进行确认,增强实验结果真实度。
可促进皮肤伤口无疤痕愈合的药物组合物可以包括一种siRNA分子作为有效成分以及药用载体和/或赋形剂,也可以包括至少二种siRNA分子作为有效成分以及药用载体和/或赋形剂,这些siRNA分子所靶向的基因选自促炎通路基因、促血管新生通路基因和促细胞增殖通路基因。组合使用的siRNA混合物为“siRNA鸡尾酒”。鸡尾酒中的每一siRNA特异针对某一基因的mRNA。因此,鸡尾酒中的几个不同siRNA可以同时抑制多个伤口愈合相关基因的表达,比如下述具体实施方式中对TGF-β1和COX-2二个基因所实施的同时抑制。
在下述具体实施方式中,鸡尾酒混合物中的siRNA分子可选自表5中所列的序列。一个鸡尾酒可以包含多种siRNA分子,如:
一个能与编码人和小鼠Cox-2蛋白的mRNA分子相结合的siRNA双链分子:
正义链:5′-gucuuuggucuggugccuggucuga-3′,
反义链:5’-ucagaccaggcaccagaccaaagac-3’;
和一个能与编码人和小鼠TGFβ-1蛋白的mRNA分子相结合siRNA双链分子:
正义链:5′-ccccggaggugauuuccaucuacaa-3′,
反义链:5’-uuguagauggaaaucaccuccgggg-3’。
或者,一个能与编码人和小鼠TGFβ-1蛋白的mRNA分子相结合siRNA双链分子:
正义链:5′-ccccggaggugauuuccaucuacaa-3′,
反义链:5’-uuguagauggaaaucaccuccgggg-3’。
和一个能与编码人和小鼠HoxB13蛋白的mRNA分子相结合siRNA双链分子:
正义链:5′-gucuuuggucuggugccuggucuga-3′,
反义链:5’-ucagaccaggcaccagaccaaagac-3’。
其他siRNA鸡尾酒的组成以此类推,详见后文的各表格。
体外研究中,上述每一个siRNA分子能与编码对应蛋白质的mRNA配对结合,通过促进mRNA降解来达到抑制某一基因功能的目的。但要在体内达到这一目的,不仅取决于靶标的选定和活性siRNA分子序列的鉴定,更重要的是在于siRNA药物在体内导入靶组织和进入细胞的效率。因此,siRNA分子需要与药学上可接受的载体形成药物组合物,经药用载体的运载在相应的器官组织局部达到治疗所需要的浓度并维持足够长的半衰期。
本发明所采用的药物载体为临床批准的有效载体,可以增强siRNA鸡尾酒导入疾病组织和细胞的效率。在下述具体实施方式中所采用的各种药物组合物中,药物载体可由一个或多个成分组成,这些组成成分除了可从盐溶液、糖溶液、多聚物、脂质、乳剂、凝胶和胶束材料等组成材料中选择之外,组成载体的材料更多的是来自包括多聚阳离子结合试剂,阳离子脂质,阳离子胶束,阳离子多肽,亲水性接枝共聚物,非天然阳离子聚合物,阳离子聚甲醛,亲水性接枝聚甲醛,配体功能化的阳离子聚合物,配体功能化的亲水性接枝共聚物,生物可降解聚酯纤维,如聚乳酸(PLA)、聚乙醇酸(PGA)、聚乳酸乙醇酸(PGLA)和聚乙二胺树枝状聚合物(PAMAM Dendrimer)。具体实施方式中应用的组合物之一所用载体是组氨酸-赖氨酸聚合物,在与siRNA分子混合后可形成包含siRNA的纳米颗粒,颗粒直径为100-400nm。其他临床上行之有效的药物载体还包括包括咪喹莫特乳膏(imiquimod,5%)、聚乙二醇化的PEI和PAMAM树枝状聚合物(Dendrimer)等。
上述纳米药物组合物在赋型之后可以是软膏、喷剂、透皮贴剂,或者其他临床常用的剂型。药物赋形剂可以选用羧甲基纤维素,可作为制剂辅料、乳化剂、悬浮剂或增稠剂。纳米药物组合物的应用为伤口局部(local)和表面(topical)给药。
为了使siRNA鸡尾酒获得最佳协同效应,本发明也提供了制备每种组合物的最佳比例的方法。在这些实施例中,当采用包含三种siRNA的鸡尾酒时,其中siRNA的比例可以为1∶1∶1,或者1∶1.5∶0.5,或者0.5∶0.5∶2,比例也可以依据每种siRNA的效力和应用时的治疗要求而确定。
附图说明
图1.A.小鼠VEGF、VEGFR1和VEGFR2mRNA靶序列的位置。B.体外转染siRNA后mRNA被降解的情况。检测结果显示,我们所选择的候选siRNA能显著抑制相应基因的表达。
图2.将含有甲基化胞嘧啶-鸟嘌呤二核苷酸小岛的寡核苷酸链(CpG-ODN)的小药粒植入小鼠眼角膜能诱导局部血管增生。而局部导入靶向VEGF通路的siRNA能够抑制这一血管增生。A.用药后第4和第7天对新生血管生成所作的定量测定。B.受试小鼠眼睛的镜下照片。统计结果显示,在用药后第4天,鸡尾酒组合的siRNA对靶基因的抑制效果显著优于单个siRNA。能抑制CpG-ODN所诱导的眼底血管增生。
图3.a.用于体内siRNA导入的HK聚合物。左图显示扫描电子显微镜所观察到的图像,为HKP和siRNA在水溶液中混合后所形成的纳米颗粒。b.针对Raf-1的siRNA经HK聚合物介导进入肿瘤内后抑制肿瘤生长,表明HKP具有高效运载siRNA的能力。
图4.正常嘴唇和背部皮肤的苏木素-伊红(HE)染色(比例尺=50μm)。
图5.野生型和Hoxb13敲除型伤口活组织检查观察到的胶原结构(比例尺=50μm)。A列.低倍镜(目镜为10×或20×)下观察野生型小鼠伤口活体组织检查;B列.高倍镜(目镜为100×)下观察野生型小鼠伤口活体组织检查;C.低倍镜(目镜为10×或20×)下观察Hoxb13 KO型小鼠伤口活体组织检查;D.高倍镜(目镜为100×)下观察Hoxb13 KO型小鼠伤口活体组织检查。第1排:未受伤的正常组织;第2排:第20天的伤口活体组织检查;第3排:第30天的伤口活体组织检查;第4排:第60天的伤口活体组织检查。箭头所指为印度墨水染色位置。
图6.TGFβ-1、COX-2、和HoxB13mRNA在前列腺癌PC3细胞中表达量的检测及引物有效性的确证。特异引物用于检测PC3细胞总RNA中的三种mRNA。左下标明的是用于RT-PCR分析的引物名称,特异性siRNA的名称标于泳道的上方。结果显示,这三种基因在PC3细胞都有很好的表达,是本研发项目的一个理想实验系统。
图7.纳米颗粒-TGFβ1-siRNA通过沉默靶基因达到治疗效果。RT-PCR分析表明,TGFβ-1特异性的siRNA或包含TGFβ-1特异性siRNA的siRNA鸡尾酒能引起了TGFβ-1特异性沉默。底端表示的是持家基因表达情况。
图8.TGFβ-2siRNA能够显著抑制PC3细胞中靶基因的表达。用于RT-PCR分析的引物标于左下第二列,特异性siRNA标于左下第一列。
图9.COX-1siRNA能够显著抑制PC3细胞中靶基因的表达。用于RT-PCR分析的引物标于左下第二列,特异性siRNA标于左下第一列。
图10.HoxB13siRNA能够显著抑制PC3细胞中靶基因的表达。用于RT-PCR分析的引物标于左下第二列,特异性siRNA标于左下第一列。
图11.三个基因的siRNA在人和小鼠两个种属细胞中的筛选。A.TGF-β的三种siRNA在PC-3和C166细胞中筛选;B.Cox-2三种siRNA在PC-3细胞中筛选;C.HoxB13三种siRNA在PC-3细胞中筛选。
图12.小鼠皮肤切割损伤模型。在Balb/c小鼠背部中线两侧制造一对直径为5mm的全层皮肤切割伤口。siRNA治疗后第1、3、5天的伤口对比。
图13.伤口愈合的小鼠皮肤伤口修复模型。共十只小鼠,每只背部两个切口。对每个伤口的直径进行测量,并用相机拍照保存每个伤口图片信息。
图14.伤口愈合速度的统计处理结果。用Scion Image for Windows软件对小鼠皮肤切除伤口愈合速度进行分析。结果分析表明,我们选定的三种siRNA/HKP纳米药物能加速皮肤伤口的愈合,其中以TGFβ1-siRNA/HKP纳米药物的治疗效果最为明显。
图15.经siRNA/HKP纳米药物治疗后愈合之皮肤的组织化学研究。图中所示为Masson′s三色染色图像。使用三种不同放大倍数。结果表明,在组织学水平,三种siRNA/HKP纳米药物均能够在大体水平促进伤口愈合的同时,改善伤口中的新生真皮结构,胶原纤维形成与正常的皮肤相似的交织松散的结构。
图16.对各种siRNA鸡尾酒组合/HKP纳米药物促进伤口愈合效果进行评价的组织化学研究。图像为愈合皮肤组织切片的Masson′s三色染色图。三种siRNA鸡尾酒组合分别为TGFβ-1/Cox-2、TGFβ-1/HoxB13、HoxB13/Cox-2。染色结果显示,TGFβ-1/Cox-2组合(右上)的治疗效果最佳,伤口中的真皮组织以恢复成类似于正常的组织结构(左上)。TGFβ1/HoxB13的治疗效果次之。
图17.STP705用于猪表皮损伤的治疗效果。STP705为TGF-β1/COX-2的siRNA鸡尾酒组合药物。A为模型伤口制备过程,将太湖猪背部两侧皮肤全层切除,形成边长为2cm的切割伤口,每组6个伤口。B显示使用不同的药物治疗,在不同的时间的治疗效果。从左到右依次为非相关siRNA治疗组(阴性对照)、磺胺嘧啶银治疗组(阳性对照)、无治疗组、Cox-2siRNA治疗组、TGF-β1治疗组和STP705治疗组,结果显示STP705治疗效果最好,伤口恢复快且疤痕最小。
图18.治疗后猪表皮损伤处活检组织的组织化学染色分析。猪表皮伤口使用不同的药物治疗后,在41天对疤痕处组织进行活检,用Masson′s三色染色法对活检组织切片所做的染色分析显示,STP705治疗效果显著,损伤处的皮肤结构恢复接近正常,STP705为TGF-β1/COX-2的siRNA鸡尾酒组合药物。
具体实施方式
实验程序:
完成制备siRNA药物组合物的方法包括以下步骤:
(a)针对靶标单链RNA分子,设计创建一个与之互补的siRNA优选序列库,这里所说的siRNA的靶标RNA链包括各种与皮肤伤口愈合有关的信使核苷酸序列mRNA以及相关的调节性microRNA;
(b)通过体外研究,选择出针对靶标分子具备最佳沉默效果的siRNA双链;
(c)将siRNA和分支型组氨酸-赖氨酸多肽(HKP)等药物载体混合后,形成实验药物组合物。对药物组合物的物理化学性质进行鉴定,包括纳米大小,表面形状,zeta电位(ζ电位)等数据;
(d)用动物模型评价选定的siRNA-载体药物组合物;并在动物模型中选出效果最优的siRNA药物组合物。
实施例1.以小鼠眼球新生血管形成模型研究过程为例,表明如何筛选具备抑制
活性的siRNA来组成多靶标siRNA鸡尾酒的流程
组织中新生血管形成参与许多病理过程,比如:肿瘤的扩增、类风湿性关节炎、眼底黄斑退行性病变、以及皮肤创伤的肉芽肿和疤痕的生成,等等。因此,我们用siRNA药物抑制新生血管生成作为siRNA治疗的示范系统。具体流程如本实施例所示:1.靶标基因选择,2.siRNA在电脑中的设计,3.体内体外的测试。
1.靶标基因选择。
许多基因参与新生血管生成的调节,例如血管内皮细胞生长因子(VEGF)及其受体(VEGFR)。根据文献追踪和当前市场同一类药物的调查,我们选择的靶标基因包括:mVEGF-A(XM_192823)、mVEGFR-1(D88689)和mVEGFR-2(MN_010612)。
2.siRNA设计。
我们通过电脑计算程序设计出如下siRNA序列:
mVEGF-A (1)AAGCCGUCCUGUGUGCCGCUG;
(2)AACGAUGAAGCCCUGGAGUGC;
mVEGFR-1 (1)AAGUUAAAAGUGCCUGAACUG;
(2)AAGCAGGCCAGACUCUCUUUC;
mVEGFR-2 (1)AAGCUCAGCACACAGAAAGAC;
(2)AAUGCGGCGGUGGUGACAGUA。
根据萤火虫荧光酶素基因(Luc,AF434924)设计选择两种siRNA序列作为非相关对照:
Luc (1)AAGCUAUGAAACGAUAUGGGC;
(2)AACCGCUGGAGAGCAACUGCA。
通过BLAST分析这些siRNA和相应靶标序列的特异性,而mVEGF-A设计成可同时靶向各种mVEGF-A的异构体。所有的siRNA按常规的21个碱基对(nt)双链RNA寡聚核苷酸设计。
3.siRNA化学合成。
siRNA的主体为19个配对的碱基对,每条RNA单链的3’末端有两个脱氧胸腺嘧啶核苷酸(dTdT)的突出结构。
4.体外RT-PCR检测mRNA被siRNA降解的效果。
使用RNAwiz试剂盒(Ambion,#9736)根据操作数明书纯化细胞质RNA,并用DNase处理,用特定的引物进行RT-PCR分析。用于逆转录反应的mRNA特异性反向引物(下游引物,Dn)均为47个碱基对的寡聚核苷酸,5’端有30个碱基的通用序列(称为“TS1”序列,用大写表示),连接着一个17个碱基的mRNA分子特异性的序列(小写字母表示)。这些引物分别是(从5’到3’端):
1)mVEGF-A Dn:
GAACATCGATGACAAGCTTAGGTATCGATAcaagctgcctcgccttg;
2)mVEGFR-1 Dn:
GAACATCGATGACAAGCTTAGGTATCGATAtagattgaagattccgc;
3)mVEGFR-2 Dn:
GAACATCGATGACAAGCTTAGGTATCGATAggtcactgacagaggcg。
逆转录(RT)之后,用同一个反向引物TS1进行PCR检测,其序列为:GAACATCGATGACAAGCTTAGGTATCGATA。然而每个基因的30个碱基长度的正向引物(上游引物,Up)序列却不相同:
1)mVEGF-A Up:GATGTCTACCAGCGAAGCTACTGCCGTCCG;
2)mVEGFR-1 Up:GTCAGCTGCTGGGACACCGCGGTCTTGCCT;
3)mVEGFR-2 Up:GGCGCTGCTAGCTGTCGCTCTGTGGT TCTG。
持家基因GAPDH进行RT-PCR作为RS-PCR(ribo spacer PCR)中mRNA定量的对照。脱氧胸腺嘧啶(dT)寡聚核苷酸(19nt)用于GAPDH的逆转录实验。随后用于PCR的引物为20nt的寡聚核苷酸:
1)GAPDH Up:CCTGGTCACCAGGGCTGCTT;
2)GAPDH Dn:CCAGCCTTCTCCATGGTGGT。
图1显示,筛选出的3种siRNA均能有效降低相应基因的mRNA表达量。
5.用体内动物模型来进一步评估包含三种siRNA的鸡尾酒的效力。
我们在前期的一项小鼠模型预研究中报道,将含未甲基化的CpG寡聚核苷酸(Oligodeoxynucleotide,ODN)的水溶性药丸植入角膜层间后,能诱导VEGF介导的血管增生。因而这一动物模型可用于检测siRNA制剂在局部导入后的抑制效果。该siRNA鸡尾酒制剂所靶向的是VEGF及其受体(VEGFR1和VEGFR2)。在之后的实验中,我们用这一眼部血管增生小鼠模型检测HKP介导的体内导入效果。siNRA的使用为单一剂量,10微克(μg),并与一定量的HKP混合成纳米颗粒。纳米颗粒通过结膜下给药完成siRNA局部导入。在CpG寡核苷酸药丸植入后24小时结膜下注射给药。将三种单个siRNA(siVEGFA、siVEGFR1和siVEGFR2)与三者1∶1∶1的混合物进行对比检测。药丸植入后第4天和第7天监测角膜缘新血管生成的情况。如图2所示,药丸植入后第4天,与对照组siLacZ(靶向半乳糖苷酶基因的siRNA)相比,三种siRNA(siVEGFA、siVEGFR1和siVEGFR2)均显著抑制了角膜血管增生(P<0.05)。三种siRNA联合起来更有效,抑制超过60%的血管增生(P<0.01)。使用这一眼部血管增生模型证实了多靶标siRNA鸡尾酒具有协同效应。
实施例2.HKP聚合物能增强siRNA的局部导入
化学合成的组氨酸-赖氨酸聚合物(HKP)已经被用于siRNA的体内外导入。图3a右图显示的是HKP的结构序列:在三聚赖氨酸骨架上接有四条多聚氨基酸支链。多聚氨基酸支链由组氨酸、赖氨酸或天门冬酰胺按照固定排列和长度重复。研究中使用的两类HKP为具有(R)K(R)-K(R)-(R)K(X)结构的H3K4b和PT73,其中H3K4b中的R=KHHHKHHHKHHHKHHHK,而PT73的R=KHHHKHHHNHHHNHHHN,X=C(O)NH2,K=赖氨酸,H=组氨酸,N=天门冬酰胺。图3a左图为扫描电镜图像。当HKP水溶液与siRNA以质量比为4∶1质量比进行混合时,自动形成平均直径为100-200nm的纳米微粒。HKP-siRNA水溶液为半透明的,没有明显的沉淀聚集现象,并且可以在4℃的条件下储存至少三个月。初步研究中我们同时使用了H3K4b和PT73用于siRNA药物在皮肤伤口的中的传递。
HKP通过与siRNA形成纳米颗粒而介导后者的体内传递首先是在上述实施例1中体现的。HKP-siRNA的局部导入能够取得显著的抗血管增生活性,如图2。图3b所示为HKP-siRNA纳米颗粒在体内抗肿瘤治疗的体现。在这一独立实验中,用HKP可以提高siRNA导入肿瘤内,使靶标基因表达明显下降。肿瘤生长曲线显示特异siRNA经HKP体内传递后具备显著的抗肿瘤活性。其体程序:在哺乳动物乳房脂肪垫内注射MDA-MB-435乳腺癌细胞。10天后,将产生可见肿瘤的小鼠分成多个实验组,每组包含四只小鼠八个肿瘤,测量肿瘤的长宽并计算大小。将4μg的siRNA通过瘤内注射到每个肿瘤内,每5天注射一次。将肿瘤小鼠分成未治疗组、对照组β-半乳糖苷酶siRNA和丝氨酸/苏氨酶(Raf-1)siRNA三个组。如图3b所示,用HKP将Raf-1siRNA导入肿瘤内后可抑制肿瘤生长,HKP已经被确证为局部导入siRNA的高效载体。由于皮肤伤口同样为局部给药,这使我们得出结论,在剂型合适的情况下,HKP可以帮助siRNA进入皮肤伤口。
上述的具体实施例1和2主要介绍了如何筛选具备抑制活性的siRNA来组成siRNA药物组合物以及多靶标siRNA鸡尾酒的流程,并提出了HKP聚合物可以作为帮助siRNA进入皮肤伤口的高效载体。
下面的实施例则具体说明如何制备用于治疗伤口愈合之siRNA药物的具体步骤。
实施例3.HoxB13 KO小鼠显示快速的伤口愈合和较少的疤痕形成
HoxB13 KO小鼠(由Dr.Mario R.Capecchi馈赠)是验证HoxB13基因功能的有效平台。为追踪皮肤组织在损伤后修复过程中组织结构的动态变化,我们在HoxB13 KO小鼠建立了唇手术割裂模型来模拟兔唇裂颚。正常嘴唇皮肤通过苏木素-伊红(HE)染色如图4所示。在一般的麻醉和无菌条件下,在HoxB13KO和野生型小鼠(8-16周龄)皮肤和前排牙齿处制造单个的0.5cm的全层皮肤切割伤口,接着用6.0的尼龙缝合伤口,以此模拟兔唇裂颚。在损伤后的第20、30和60天对皮肤伤口进行活组织检测,用Masson Trichrome染色分析胶原结构,如图5。第20天(B-Day20)和第30天(B-Day30),WT小鼠比HoxB13KO小鼠胶原染色更密集,伤口收缩更明显。事实上,第20天和第30天时,由于野生型小鼠胶原收缩过于强烈,致使我们无法同时看清楚收缩的胶原和周围的组织结构。到第60天,野生型小鼠胶原依然致密,但是已经不如第20和30天时那么明显了。相反,伤口组织活检表明HoxB13 KO小鼠在第20、30和60天时胶原结构均较松散,意味着KO小鼠唇部疤痕形成减少,这与我们在上背部伤口所观察到的结果一致。说明HoxB13蛋白的存在能促进皮肤伤口的疤痕形成。
实施例4.设计同时靶向人和小鼠基因的25nt的siRNA
我们将上述实施例1和实施例2的成功范例应用于皮肤伤口无疤痕愈合的项目。我们首先根据文献追踪和当前市场同一类药物的调查,选择TGF-β1、COX-2和HoxB13等基因为靶标基因。采用电脑计算程序,设计25nt的siRNA,设计出的序列同时针对人和小鼠同源基因序列,能同时靶向人和小鼠TGF-β1基因的序列。
表1、表2和表3分别列出了已通过鉴定能分别抑制TGF-β1、COX-2或HoxB13基因表达的siRNA序列。每个序列同时能靶向人和小鼠相应的基因。因此,从小鼠细胞中确定的有效序列经确证后也能用于人细胞。如果两种细胞内的检测均证明siRNA有效,则小鼠动物模型中获得的沉默活性理论上也能在人体内有相似的效果。用这一方法,可以解决如单克隆抗体类抑制剂药物的种属特异性问题。此外,作为siRNA治疗候选药物,从小鼠模型研究中获取的效率和毒性数据能够非常容易扩展应用到人体。
因此,本发明提供了一种新的选择siRNA靶向序列的方法,该方法有三个不同于其他方法的重要方面:
(1)siRNA靶向的序列是人和小鼠同类基因的同源序列,这意味着每一个siRNA可以抑制人或小鼠中的同一基因的表达。例如,一个有效的特异性针对TGF-β1的siRNA可以抑制人TGF-β1的表达,也可以抑制小鼠TGF-β1和猪TGF-β1的表达。
(2)序列有三种不同的长度:21nt、23nt和25nt。用不同的模型系统鉴别靶向特定序列的siRNA的最佳长度。
(3)此处使用的siRNA寡聚核苷酸可以是平末端或粘性末端,其中的“寡聚核苷酸”或类似的术语是与天然产生的短的寡聚核苷酸相似,也涉及合成或修饰的寡聚核苷酸,这与前面段落的描述一致。寡聚核苷酸长度可以是19nt,或者更长为20-27nt,甚至可以为超过35nt的长度。
寡聚核苷酸可以是19-35nt之间的任意长度的siRNA,优先选择siRNA的长度在19-27nt之间。siRNA可以两端均为平末端,或者均为粘性末端,或者一端为平末端另一端为粘性末端,粘性末端可以有1-4个或者更多的碱基突出。
在优选的实施例中,本发明提供的siRNA为21、23和25nt的平末端结构,“多聚核苷酸”和“寡聚核苷酸”在此作为同义词使用。
表1.靶向人和小鼠TGF-β1基因的siRNA序列
表2.靶向人和小鼠Cox-2基因的siRNA序列
表3.靶向人和小鼠HoxB13基因的siRNA序列
实施例5.体外筛选能有效抑制TGF-β、Cox-2、HoxB13基因表达的siRNA
1.挑选出具备最佳抑制效应的siRNA:对每一个靶标mRNA根据表1、2、3准备三种25nt的平末端siRNA序列,并化学合成所选择的siRNA序列。
hmTF-25-1:正义链5’-r(GGAUCCACGAGCCCAAGGGCUACCA)-3’
反义链5’-r(UGGUAGCCCUUGGGCUCGUGGAUCC)-3’
hmTF-25-2:正义链5’-r(CCCAAGGGCUACCAUGCCAACUUCU)-3’
反义链5’-r(AGAAGUUGGCAUGGUAGCCCUUGGG)-3’
hmTF-25-3:正义链5’-r(GAGCCCAAGGGCUACCAUGCCAACU)-3’
反义链5’-r(AGUUGGCAUGGUAGCCCUUGGGCUC)-3’
hmCX-25-1:正义链5’-r(GGUCUGGUGCCUGGUCUGAUGAUGU)-3’
反义链5’-r(ACAUCAUCAGACCAGGCACCAGACC)-3’
hmCX-25-2:正义链5’-r(GAGCACCAUUCUCCUUGAAAGGACU)-3’
反义链5’-r(AGUCCUUUCAAGGAGAAUGGUGCUC)-3’
hmCX-25-3:正义链5’-r(CCUCAAUUCAGUCUCUCAUCUGCAA)-3’
反义链5’-r(UUGCAGAUGAGAGACUGAAUUGAGG)-3’
hmHX-25-1:正义链5’-r(GGUGGCUGGAACAGCCAGAUGUGUU)-3’
反义链5’-r(AACACAUCUGGCUGUUCCAGCCACC)-3’
hmHX-25-2:正义链5’-r(GCUGGAACAGCCAGAUGUGUUGCCA)-3’
反义链5’-r(UGGCAACACAUCUGGCUGUUCCAGC)-3’
hmHX-25-3:正义链5’-r(CGCCAGAUUACCAUCUGGUUUCAGA)-3’
反义链5’-r(UCUGAAACCAGAUGGUAAUCUGGCG)-3’
2.设置一个对照序列:
Lu25-a:正义链5’-r(GAGGAGCCUUCAGGAUUACAAGAUU)-3’
反义链5’-r(AAUCUUGUAAUCCUGAAGGCUCCUC)-3’
3.合成制备相应的PCR引物,分别用于检测人和小鼠TGF-β基因和COX-2基因的cDNA序列:
hCxup:5’-CGGGCTGGGCCATGGGGTGGA-3’;
hCxdn:5’-CCTATCAGTATTAGCCTGCTT-3’;
mCxup:5’-GGAAGCCTTCTCCAACCTCT-3’;
mCxdn:5’-GGATACACCTCTCCACCAAT-3’;
hTGb2up:5’-GAGTACTACGCCAAGGAGGTT-3’;
hTGb2dn:5’-CCATTCATGAACAGCATCAGT-3’;
mTGb2up:5’-CTACTGTGTGCTGAGCACCTT-3’;
mTGb2dn:5’-CGCTGCTCGGCCACTCTGGCT-3’。
hHxup:5’-GCCTCTCGGAGCGCCAGATT-3’
hHxdn:5’-CTAGTACTGGTTATCGTGAT-3’
mHxup:5’-CTCCAGCTCCTGTGCCTTAT-3’
mHxdn:5’-ACTGGCCATAGGCTGGTATG-3’
(h-用于人类同源基因,m-用于小鼠同源基因)
体外筛选过程简述如下:
人前列腺癌细胞PC-3是一株多个靶标基因能同时高效表达TGF-β1、Cox-2、和HoxB13的细胞株,如图6,因此是一株能用于针对这三个靶基因之候选siRNA筛选的理想细胞系。将siRNA转染进入这一细胞系,然后对mRNA和蛋白水平的变化进行检测来确定各个siRNA对于基因表达抑制的效果。为检测选定针对TGF-β1的siRNA在小鼠细胞中的活性水平可,同样可用LipofectAmine 2000将siRNA转入小鼠胚胎内皮细胞(MEEC),然后对mRNA和蛋白水平的变化进行分析以确定各个siRNA抑制TGF-β基因表达的效率。
这些实验确定了每个siRNA的基因抑制效率,为选择最有效siRNA提供了初步的信息。结果如图7、8、9、10和11所示,可以看出,某些siRNA转染后,RT-PCR检测到的相应基因表达显著下降,而且不仅对人同时对小鼠的同一基因也有抑制效应,而各种对照(非靶向)siRNA对表达没有影响。
实施例6.siRNA鸡尾酒组合的选备
疾病过程往往受多基因影响。本发明因此提供了在同一治疗方案中靶向多个疾病控制基因的siRNA鸡尾酒治疗方法。本发明提供的RNAi制剂,如siRNA寡聚核苷酸,具有相同的化学性质:它们均是由四种碱基组成的不同序列,来源相同,制备过程类似。发明提供了促进伤口无疤痕愈合的siRNA鸡尾酒,该鸡尾酒靶向参与伤口愈合的基因,包括TGF-β、COX-2和HoxB13。
本发明规定了实验和治疗中siRNA鸡尾酒及其应用的两个非常重要的特征:
1.siRNA鸡尾酒包括至少靶向二个基因的二种siRNA(不是靶向同一基因的二种序列),根据治疗要求选取合适的比例。
2.组合中的每一个siRNA鸡尾酒靶向的每个基因的功能应具有系统生物学网络背景,例如这些基因在同一信号通路或不同信号通路起作用。
表4.靶向TGF-β1和COX-2,或TGF-β1和HoxB13的各种siRNA鸡尾酒(只
列出正义序列):
以下实施例进一步显示筛选出来的siRNA组合物在皮肤无疤痕愈合方面的治疗效果。
实施例7.在小鼠皮肤切除伤口模型,siRNA鸡尾酒药物能加速伤口愈合并减少
疤痕
1.皮肤切除伤口模型。使用六至八周大的Balb/c小鼠(Taconic,NY),腹腔注射三溴乙醇(0.4-0.6mg/kg)麻醉,将小鼠背部去毛后,在中心线两侧形成一对5mm直径的全层皮肤切除的伤口模型,如图12。结果显示的是TGF-β、Cox-2和HoxB13三种基因在皮肤伤口组织表达的情况,图12-C。
2.STP705药物的配制。简单描述:siRNA-HKP现以1∶4重量比形成纳米颗粒,然后与1.5%的甲基纤维素溶液混合成膏样涂剂。
3.取8-10周小鼠10只,腹腔注射三溴乙醇(0.4-0.6mg/kg)麻醉,背部剃毛,酒精消毒,上提背部中线处皮肤,利用活检穿孔器同时制备两个直径为5mm创面。同时制备的两个创面中的一个作为实验组,利用药物进行治疗,另外一个不做任何处理用于对照。根据伤口闭合的情况,靶基因的敲除的结果,以及组织病理学的改变,观察对照组和治疗组之间伤口修复的区别。使用RT-PCR检测技术来评估鼠愈合皮肤组织中siRNA介导的靶基因TGF-β1、Cox-2和HoxB13表达抑制的程度。比较两处创面的恢复情况,进行统计处理。
图13所示为两组伤口愈合动态过程的大体图像。可见TGF-β1-siRNA/HKP纳米药物处理组的伤口愈合明显加速于未处理组。
图14为另一试验结果的统计分析。用于分析的电脑软件为Scion公司的Scion Image for Windows.分析结果表明,抑制这三个靶基因的表达能显著加速皮肤伤口的愈合。
而且这一大体观察结果也得到显微组织学研究的证实,图15所示,其中TGF-β1-siRNA的效果最佳,组织结构的恢复更接近正常。
实施例8.多靶标siRNA鸡尾酒较单个siRNA具有更强的治疗效果
1.在小鼠CpG-OND诱导的眼部血管生成模型中我们已证实,靶向VEGF及其两个受体VEGFR1和VEGFR2的siRNA鸡尾酒,有较好的治疗效果。图1和2显示单个siRNA双链化合物都显现出了有效的角膜新血管形成抑制作用(P<0.05),但是siRNA鸡尾酒药物具有更强的抑制作用,在10μg的同剂量条件下,血管生成抑制率达到60%(P<0.01)。通过HKP纳米粒子经结膜下给药实现siRNA的局部转导。在这个血管生成模型中,多靶标siRNA鸡尾酒被证明具有协同(累积)效应。
2.由于皮肤伤口愈合过程牵涉多个疾病相关基因,因此将靶向不同基因siRNA制成鸡尾酒药物,比如TGF-β1/Cox-2,或TGF-β1/HoxB13等组合,应当可以在伤口修复过程中有更好的治疗效果,使伤疤形成更少。
我们首先在小鼠皮肤切除伤口模型进行了测试。试验方法如上述实施例7所述。结果显示,TGF-β1/Cox-2组合的效果最佳,同时TGF-β1/HoxB13组合也有显著效果。用药组的组织提前恢复并接近正常,而且这两组组合用药的药效明显优于单独使用和其他组合的药效,如图16。
实施例9.挑选能有效抑制人、小鼠、猪同一基因的siRNA鸡尾酒组合
由于猪皮肤结构与人之相似,因此通过猪模型得到的结果应该更具说服力。所以我们通过对在小鼠模型上所获得的体外筛选检测结果进行了生物信息学的分析。我们从上述有效候选siRNA中挑选出能在人、小鼠、猪三个种属同时靶向COX-2基因和TGF-β1基因的siRNA序列,见表5和表6。
表5.同时能抑制人、小鼠、猪COX-2基因表达的siRNA序列
表6.同时能抑制人、小鼠、猪TGF-β1基因表达的siRNA序列
从表5、表6,我们发现其中hmCX-1和hmTF-2是已在小鼠模型测试过的候选siRNA。因此,由这两个siRNA组成的siRNA鸡尾酒也就顺理成章的成为在下述猪创伤模型上测试的候选。
实施例10.TGF-β1/COX-2的siRNA鸡尾酒组合药物能加快伤口愈合并有效减
少疤痕形成。
应用上述针对TGF-β1/COX-2的siRNA鸡尾酒药物,我们在猪皮肤切除伤口模型上也获得了同样的显著治疗结果,如图17、18。
我们按下述步骤进行猪皮肤创伤治疗的试验:购得15公斤重太湖猪一头,首先用氯胺酮及戊巴比妥钠将动物麻醉。剔去背部毛发,用电手术刀切出2cmx2cm的皮肤全层伤口,每组为6个伤口,分别做如下处理:未处理、无关siRNA对照、阳性对照、COX-2处理、TGF-β1对照、和TGF-β1/COX-2鸡尾酒处理,如图17A。所有siRNA/HKP纳米药物进一步与甲基纤维素赋型成为糊状涂剂。将STP705与其他处理药物一样涂抹在伤口表面,每天一次,连续15天。每周拍照两次记录伤口愈合的过程,如图17B。分别于第45天和第65天活检伤口组织进行组织化学染色,HE和Masson’s三色染色,观察对比皮下胶原纤维的排列结构,以及皮下组织附件恢复的情况,如图18。
结果显示,由TGF-β1/COX-2的siRNA鸡尾酒组成的药物,STP705在促进伤口无疤痕愈合上具有明显优良的药效,图17、18结果表明,经STP705治疗的伤口处的皮下组织中,不但伤口愈合加速,而且已难觅胶原纤维的疤痕性沉积,皮下胶原纤维的排列已基本恢复正常,并可见到皮脂腺样结构。
Claims (12)
1.siRNA分子,其靶向的基因选自损伤皮肤组织细胞中的促炎症通路基因、促血管新生通路基因和促细胞增殖通路基因。
2.siRNA分子,其靶向的基因选自损伤皮肤组织细胞中的TGF-β基因、COX-2基因和HoxB13基因。
3.如权利要求1或2所述的siRNA分子,其中该siRNA分子的核苷酸长度为19个碱基对,或者为20-27个碱基对,或者为超过35个碱基对,所述siRNA分子的两末端均为平末端,或者均为粘性末端,或者一末端为平末端另一末端为粘性末端,所述粘性末端有1-4个或者更多的碱基突出。
4.如权利要求2所述的siRNA分子,其中该siRNA分子包括选自表1、表2或表3中的序列。
5.siRNA分子的组合物,包括至少两种如权利要求1或2所述的siRNA分子,至少两种所述的siRNA分子靶向多个基因。
6.如权利要求5所述的组合物,其中在所述至少两种siRNA分子,其中一种siRNA分子用于靶向TGF-β1基因,另外一种siRNA分子用于靶向COX-2基因或者HoxB13基因。
7.如权利要求6所述的组合物,包括选自表1和表2、或表1和衰3中的siRNA分子的组合。
8.如权利要求6所述的组合物,包括选自表4中的siRNA分子的组合。
9.如权利要求6所述的组合物,包括选自表5和表6中的siRNA分子的组合。
10.如权利要求4所述的siRNA分子或者如权利要求7或8或9所述的组合物在制备促进皮肤伤口无疤痕愈合的药物中的应用。
11.药物组合物,包括如权利要求4所述的siRNA分子或者如权利要求7或8或9所述的组合物以及药用载体和/或赋形剂。
12.如权利要求11所述的药物组合物,其中所述药物载体包括组氨酸-赖氨酸的氨基酸多聚物、脂质体、树枝状多聚体或它们的类似物。
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