CN101426914A - 促进皮肤的无疤痕伤口痊愈的siRNA组合物以及用于伤口治疗的方法 - Google Patents

Abstract

本发明描述了在疤痕形成期间，使用siRNA靶向在受伤组织的细胞中表达的各种基因以促进无疤痕伤口愈合的组合物和方法。

Description

促进皮肤的无疤痕伤口痊愈的siRNA组合物以及用于伤口治疗的方法

本申请要求美国临时申请60/755,549的利益，并以其全部公开内容引入这里作为参考。

发明领域

本发明涉及在伤口愈合过程期间，使用siRNA试剂敲减促进皮肤疤痕形成的基因表达，用于预防和最小化皮肤疤痕形成的构思，组合物和方法。siRNA试剂可以单个双链体或多个双链体(混合物)使用，其靶向单个基因或多个基因，具有或没有转染载体。当转染试剂与其他的皮肤护理材料一起应用时，它们包括，但不限于，合成聚合物，脂质体和糖，等等。siRNA试剂还可以与其他的试剂如小分子和单克隆抗体抑制剂，免疫调节剂和其它类型的低聚物一起用于同样的应用中。siRNA试剂的注射，体表和经皮给药都可用于皮肤组织创伤和皮肤移植以后的伤口愈合过程。本发明是一种增强来自由灼伤，慢性皮肤溃疡，普通外科手术，整形外科和意外割伤引起的伤口的皮肤无疤痕痊愈的新的治疗。本发明可用于药物和药用化妆品工业。

发明背景

皮肤的主要功能是用作对抗环境的保护屏障。由于创伤或疾病而致的大部分皮肤完整性的丧失可能导致重大残疾乃至死亡。美国每年超过125万人具有灼伤，而且65万人患有由压力，静脉淤滞或糖尿病引起的慢性皮肤溃疡。伤口治疗的主要目标是快速伤口闭合，和功能性和审美上令人满意的疤痕。细胞和分子生物学的最新发展已经大大地扩展了我们对伤口修复和组织再生中所涉及的生物过程的了解，并导致了伤口护理方面的改进。伤口愈合是一个动态的、相互作用的过程，其包括可溶性介质，血细胞，胞外基质和实质细胞。伤口愈合具有三个阶段-发炎，组织形成和组织重塑-其在时间上部分重叠(1-3)。

已知皮肤伤口愈合过程在胎儿和成人皮肤之间是不同的。成人皮肤中的伤口修复开始于急性炎症期并结束于永久性疤痕形成。相反，早期妊娠胎儿伤口(妊娠头三个月和中三个月)以接近完美的方式愈合，快速而且不产生疤痕。对表征负责从无疤痕愈合转换到妊娠中三个月以后的皮肤典型的成人样，产生疤痕的表型的关键因素非常感兴趣。确定两种类型的愈合中的差异，可以鉴定促进疤痕组织生成的因素。鉴定为在无疤痕愈合中减少的因素与抑制成人伤口中的那些因素以减少疤痕形成之间的这种相关性已经特别符合于转化生长因子-β(TGF-β)。该细胞因子是被发现在无疤痕愈合中差异调节的第一介质之一，并当引入到无疤痕伤口中时，显示促进疤痕组织沉积(4-7)。由于这些发现和涉及纤维化中的TGF-β的其他发现的结果，在成人皮肤中测试了下调这种分子的影响，并发现减少了疤痕形成(8-15)。

胎儿对皮肤创伤的反应与成人显著不同，仅仅发生最小程度的发炎，最小程度的成纤维细胞增殖，和仅仅必需的胶原蛋白沉积。已经研究了血小板衍生生长因子(PDGF)对胎儿伤口部位的细胞和胞外基质事件的作用，因为已知PDGF在成人伤口愈合调节中起重要作用。在1，3或5天以后，在子宫内收获硅化橡胶伤口移植物。对样本进行标准的组织学处理，并进行评估。PDGF处理的移植物具有急性炎症，成纤维细胞征集，以及胶原蛋白和透明质酸沉积的显著增加。这些差异看来是很大程度上时间依赖的和PDGF剂量依赖的，数据表明胎儿修复在缺乏PDGF的情况下进行(16)。

无疤痕胎儿愈合的一个关键特征看来是缺乏对伤口事件作出反应的炎症。相反，晚期胎儿和成人皮肤中伤口愈合的早期阶段的特征在于强炎症反应，和最终在伤口区域的永久性疤痕。虽然已经在胎儿伤口修复中研究了白细胞介素IL-6(17)和IL-8(18)，但是其他典型的炎症介质在无疤痕愈合中的作用还是未知的。

花生四烯酸级联的代谢产物和酶，包括环加氧酶-2(Cox-2)和它的酶促产物前列腺素E2(PGE2)，已知是炎症反应的关键介质(19-22)。Cox-2最近已经受到了许多关注，因为它参与与调节异常的炎症状况相关的疾病，如类风湿和骨关节炎，心血管疾病，和致癌过程。Cox-2对炎症刺激如伤口作出反应而经历立即早期上调。它通过产生前列腺素而发挥作用，该前列腺素控制产生的炎症的许多方面，包括诱导血管通透性和炎性细胞的渗入和激活。对Cox-2途径以及炎症的其他方面在成人伤口修复过程中的作用的关注正在增加，因为这些早期事件已经显示调节修复的结果。基于Cox-2与炎症有关和它有助于成人伤口修复的几个方面的最新证据，我们检验了Cox-2在胎儿伤口愈合过程中的作用。这些研究证明了Cox-2酶在早期和晚期妊娠胎儿伤口中的差异表达。而且，PGE2，一种显示介导皮肤中的许多过程的Cox-2产物，当引入到早期胎儿伤口中时，导致愈合的延迟和疤痕的产生。这些数据增进了我们对无疤痕愈合与正常修复之间的基本差异的了解，而且表明了Cox-2参与疤痕组织的产生(23-28)。

与成人皮肤伤口修复相反，早期妊娠胎儿皮肤伤口通过再生过程愈合，几乎没有疤痕。研究表明，Hox转录因子高度保守家族的一个成员，HoxB13蛋白的下调，在胎儿无疤痕伤口愈合期间发生(29-30)。成人伤口中没有发现下调。当评价Hoxb13敲除(KO)小鼠中的成人皮肤伤口愈合时，张力测量术被用于测量60天时程内切割的伤口的抗拉强度。总的说来，Hoxb13KO伤口显著地强于野生型(WT)。切割的伤口的组织学评估表明，7日龄的Hoxb13KO伤口显著较小，而且相较于WT伤口，60日龄的Hoxb13KO伤口显示更正常的胶原构造。切割的伤口在Hoxb13KO小鼠中以较快的速度闭合。生化和组织学分析表明，Hoxb13KO皮肤包含显著升高水平的乙酰透明质酸。由于较高水平的乙酰透明质酸和增强的伤口愈合是胎儿皮肤的特征，因此，结论是Hoxb13的丧失在成人皮肤中产生更胎儿样的状态(31)。

Smad3蛋白参与通过转化生长因子-β超家族的成员介导细胞内信号递送，并在细胞增殖，分化，迁移，和对皮肤伤口愈合关键性的基质加工中起决定性作用。Smad3和体外激素信号传导之间的串扰已经被建议作为一种重要的调节细胞活性的调控机制；不过，它在体内的相关性是未知的。Ashcroft GS等报道了Smad3在体内雄激素介导的伤口愈合抑制中，而不是对雌激素调节作出反应中起作用(30)。野生型和Smad3雌性裸鼠显示卵巢切除术以后延迟的愈合，其可以通过雌激素替代而逆转。相反，阉割加快了野生型雄性小鼠中的愈合，而且是通过外源雄激素处理可逆的。引起兴趣地，在Smad3裸鼠中，调节雄激素水平在愈合反应中没有产生可辨别的干扰。可以对突变单核细胞进行脂多糖刺激，以类似于野生型细胞的方式，产生特异性的促炎剂(巨噬细胞单核细胞抑制因子)，但是显示对雄激素介导的刺激沉默的反应，而对雌激素诱导的巨噬细胞抑制因子抑制保持正常的反应。这些数据表明，Smad3在正常伤口愈合反应期间，在介导雄激素信号传导中起作用，而且使Smad3牵连到雄激素对炎性细胞活性的调节中。

纤连蛋白(FN)是一种多功能的粘着蛋白并参与伤口愈合过程的多个步骤。强有力的证据表明，FN蛋白多样性通过可变RNA剪接；发育，年龄和组织/细胞类型调节的协同转录和RNA加工来调控。FN基因和这种模式中不同的剪接形式的表达，调节和生物学功能是未知的。在胎儿(妊娠天数为21-23天)，刚断奶的(4-6周)和成人的(>6个月)兔子中造成气道和皮肤切割伤口。使用mRNA差别显示获得表达分布图，对目标cDNA进行克隆，测序，并通过实时PCR证实。增加水平的Fn1和Sfrs3转录物在刚断奶的气道粘膜伤口中持续长达48小时。出生后的气道粘膜伤口中这两个基因的增强比皮肤伤口中的更显著，这表明Sfrs3和Fn1基因参与出生后的气道粘膜伤口是组织特异性的(31)。文献提供了SRp20确实参与FN的可变剪接，而且胚胎的FN变体在成人伤口愈合期间再现的证据。提议了在出生后的气道粘膜伤口修复早期事件期间，增强的Sfrs3分子活性与通过可变剪接调节FN基因表达之间的联系。DoviJV等报道了在嗜中性白细胞耗尽的小鼠中观察到加快的伤口闭合(32)。

RNA干扰(RNAi)抑制剂，即中等的短干扰RNA寡核苷酸(siRNA)，提供了一种独特的益处，用于在相同的治疗中联合使用多个siRNA双链体来靶向多个致病基因，因为所有的siRNA双链体都是化学同源的，其具有相同的来源和相同的制造过程(33)。发明人相信，许多类型的人类疾病，包括癌症，炎症性不适，自身免疫疾病和传染病，能够使用这种毒性最低而且安全的有效的siRNA抑制剂治疗，而且具有好得多的临床功效。基于RNA干扰是用于沉默特定基因表达的有吸引力的技术(34)，siRNA疗法可代表一种预防外科手术或其他伤口中疤痕形成的一种吸引人的和有效的方法。

发明概述

本发明提供了靶向多核苷酸，如siRNA，其靶向损伤皮肤组织的细胞中存在的炎症调节或炎症效应基因。这些多核苷酸可以是单链线性，双链线性或发夹结构。这些靶向多核苷酸的序列可以来源于表1-9中所列的序列(参见下文)。

本发明还提供了一种皮肤伤口愈合过程期间抑制疤痕形成的方法，是通过使受伤的组织或细胞，在外科手术，伤口治疗，损伤恢复或皮肤移植的同时，与包含本发明的靶向多核苷酸的组合物接触。在一个实施方案中，体表应用该组合物。在另一个实施方案中，定位注射该组合物。本发明的方法在伤口愈合过程期间，能有效下调或抑制炎症调节或炎症效应基因。被包含靶向多核苷酸的组合物接触的组织可以与皮肤区域有关。被该组合物接触的组织可以已经因灼烧，化学制品，激光，整形手术，皮肤移植，外科手术或物理切割而受到损伤。被该组合物接触的细胞包括，但不限于，上皮细胞，脉管内皮，血管平滑肌细胞，心肌层(心脏)和伤口愈合时存在于皮肤组织中的过客白细胞。本发明的方法可用于治疗人或非人哺乳动物。

用于接触受损组织或细胞的组合物可包括本发明的许多靶向多核苷酸，而且这些多核苷酸可靶向许多基因序列。该组合物可进一步包含PolyTran聚合物溶液，TargeTran纳米颗粒溶液，小分子药物，单克隆抗体药物或其他的免疫调节剂。组合物中发现的靶向多核苷酸可靶向下列基因的序列，如表1-7中发现的Cox-2，纤连蛋白，Hoxb13，IL-6，IL-8，Sfrs3和TGF-β1(参见下文)。靶向多核苷酸可包括针对一种或多种下列基因序列的一种或多种siRNA双链体，如Cox-2/TGF-β1/IL-8，Cox-2/TGF-β1/IL-6，Cox-2/TGF-β2/IL-8，Cox-2/TGF-β2/IL-6，Cox-2/Hoxb13/IL-6，Cox-2/Hoxb13/IL-8，Hoxb13/TGF-β1/Sfrs3，Cox-2/TGF-β1/纤连蛋白，Cox-2/TGF-β2/纤连蛋白，Cox-2/TGF-β1/Smad3和三种或多种基因序列的其他组合。本发明的多核苷酸可以相同或不同比例混合。

附图简述

图1是一个示意图，显示了本发明的多核苷酸的某些实施方案，其具有由轻微阴影区表示的靶向序列。多核苷酸的长度可以为1到200个核苷酸。A画面显示线性多核苷酸，B画面显示发夹环形多核苷酸。公开的靶序列被标记为“SEQ”，而与这些序列互补的序列被标记为“COMPL”。在A，b)画面中，多核苷酸和SEQ区周围较黑的阴影上方的水平线表示完全靶向序列(TARGET)比SEQ表示的序列长并包含SEQ表示的序列。在A，c)画面中，片段≥15表示靶向序列长度介于15个核苷酸与1个核苷酸之间，而且小于公开的参考序列。在A，d)画面中，较黑的垂直条表示至多5个核苷酸可能不同于公开的参考序列。

发明详述

本发明公开了使用一种或多种siRNA治疗剂来抑制对外科手术和创伤皮肤伤口的炎症反应，从而促进无疤痕愈合。治疗性多核苷酸针对一个或多个下列靶：TGF-β-1(GenBank登录号CR601792)，TGF-β-2(GenBank登录号Y00083)，Cox-2(GenBank登录号M90100)，IL-6(GenBank登录号M18403)，IL-8(GenBank登录号NM_000584)，Hoxb13(GenBank登录号BC070233)，纤连蛋白(U42594)，Smad3(U68019)和Sfrs3(GenBank登录号AF107405)。

如这里使用的，“寡核苷酸”和基于此的类似术语，指由天然存在的核苷酸组成的短聚合物，以及由合成的或修饰的核苷酸组成的聚合物，如这里紧接的前段中所述的。寡核苷酸的长度可以为10个或更多个核苷酸，或长度为15，或16，或17，或18，或19，或20或更多个核苷酸，或长度为21，或22，或23，或24或更多个核苷酸，或长度为25，或26，或27，或28，或29，或30或更多个核苷酸，长度为35或更多，40或更多，45或更多，直到大约50个核苷酸。为siRNA的寡核苷酸可以具有15到30个核苷酸之间的任何数量的核苷酸。在许多实施方案中，siRNA可以具有19到25个核苷酸之间的任何数量的核苷酸(35)。

术语“多核苷酸”和“寡核苷酸”在这里同义使用。

小干扰RNA

根据本发明，炎症调节或炎症效应基因靶的基因表达被RNA干扰减弱。炎症调节或炎症效应基因的表达产物被特异性双链siRNA核苷酸序列靶向，该特异性双链siRNA核苷酸序列与炎症调节或炎症效应基因靶序列的至少一个片段互补，该靶序列包含15到30个之间的任何数量的核苷酸，或在很多情况下，包含21到25个核苷酸之间的任何数量的核苷酸。靶可以存在于5′非翻译(UT)区，编码序列，或3′UT区。参见，例如，PCT申请WO00/44895，WO99/32619，WO01/75164，WO01/92513，WO01/29058，WO01/89304，WO02/16620和WO02/29858，每个都以其全部内容引入这里作为参考。

根据本发明的方法，使用siRNA抑制炎症调节或炎症效应基因表达，和从而由于对皮肤组织损伤的初始炎症反应的疤痕形成。本发明的靶向多核苷酸包括siRNA寡核苷酸。这种siRNA也可以通过化学合成与想要的序列相同或类似的核苷酸序列来制备(36)。作为选择，使用靶向多核苷酸序列，例如通过消化无细胞体系如，但不限于果蝇提取物中的炎症调节或炎症效应物核糖多核苷酸序列，或通过转录重组双链cRNA，获得靶向siRNA。

用由同样长度的16-30nt有义链和16-30nt反义链组成的siRNA双链体，通常观察到有效的沉默。在许多实施方案中，siRNA配对双链体的每条链另外具有一个位于3′末端的突出，其可以是1nt，或2nt，或3nt，或4nt长的；通常3′突出是2nt长的。2-nt3′突出的序列对siRNA靶识别的特异性产生额外的小贡献。在一个实施方案中，3′突出中的核苷酸是核糖核苷酸。在一个供选择的实施方案中，3′突出中的核苷酸是脱氧核糖核苷酸。使用3′脱氧核苷酸提供了增强的细胞内稳定性。

本发明的重组表达载体，当引入到细胞内时，进行处理以提供包括靶向细胞内的炎症调节或炎症效应基因的siRNA序列的RNA。这种载体是克隆到表达载体中的DNA分子，该表达载体包括炎症调节或炎症效应基因靶向序列旁邻的，以允许表达的方式可操作连接的调节序列。从该载体，靶RNA反义的RNA分子通过第一个启动子(例如，克隆的DNA3′的启动子序列)转录，RNA靶有义链的RNA分子通过第二个启动子(例如，克隆的DNA5′的启动子序列)转录。有义链和反义链然后体内杂交，以产生靶向炎症调节或炎症效应基因序列的siRNA构建体。作为选择，可以利用两个构建体以产生siRNA构建体的有义链和反义链。更进一步地，克隆的DNA可以编码具有二级结构的转录物，其中一个转录物同时具有来自靶基因或基因的有义序列和互补的反义序列。在这个实施方案的一个实例中，发夹RNAi产物与靶基因的全部或一部分类似。在另一个实例中，发夹RNAi产物是siRNA。炎症调节或炎症效应基因序列旁邻的调节序列可以是相同的或不同的，以便它们的表达可以独立地调节，或以瞬时或空间方式调节。

在某些实施方案中，通过把炎症调节或炎症效应基因序列克隆到载体中，来细胞内转录siRNA，该载体包含，例如，来自较小核RNA(snRNA)U6或人RNA酶P RNAH1的RNA pol III转录单元。载体系统的一个实例是GeneSuppressorTM RNA干扰试剂盒(可从Imgenex购买)。U6和H1启动子是III型Pol III启动子的成员。U6样启动子的+1核苷酸总是鸟嘌呤核苷，而H1启动子的+1是腺嘌呤核苷。这些启动子的终止信号规定为5个连续胸腺嘧啶核苷。转录物一般在第二个尿嘧啶核苷后面被切割。这个位置上的切割在表达的siRNA中产生了3′UU突出，其与合成的siRNA的3’突出类似。长度小于400个核苷酸的任何序列都可以通过这些启动子转录，因此它们理论上适于在例如大约50到100个核苷酸的RNA茎环转录物中，表达大约15到30个核苷酸的siRNA。已经对RNAi和影响siRNA功效的因子的特性进行了研究(37)。

第一个方面，本发明提供了一种分离的多核苷酸，其长度为200或更少，和15或更多的任何数量的核苷酸。多核苷酸包括第一核苷酸序列，其靶向存在于受伤组织的皮肤细胞中，而且这里鉴定为靶的基因序列。在该多核苷酸中，任何T(胸腺嘧啶核苷)或任何U(尿嘧啶核苷)任选可以被另一个置换。另外，在该多核苷酸中，第一核苷酸序列由a)长度为15到30的任何数量的核苷酸的序列，或b)a)中提供的序列的互补体。这种多核苷酸这里称为线性多核苷酸。一条链的多核苷酸经常是双链siRNA的一条链。

在相关的方面中，如上所述的多核苷酸进一步包括第二核苷酸序列，其通过环序列与第一核苷酸序列隔开，以便第二核苷酸序列

a)具有基本上与第一核苷酸序列相同的长度，和

b)基本上与第一核苷酸序列互补。

在后面的结构中，其称为发夹，第一核苷酸序列与第二核苷酸序列杂交以形成发夹，其互补序列通过环序列连接。发夹多核苷酸进行细胞内消化以形成双链siRNA。

在线性多核苷酸和发夹多核苷酸的许多实施方案中，第一个是

a)靶向序列，其靶向选自下面的表1a到9b中提供序列的序列；

b)比a)项中提供序列长的靶向序列，其中靶向序列靶向选自表1a-9b的序列，

c)a)或b)提供序列的片段，其中该片段由长度为至少15个核苷酸的连续碱基，而且比选择的序列至少短1个碱基的序列组成。

d)其中高达5个核苷酸不同于a)-c)提供的序列的靶向序列，或

e)a)到d)中提供的任何序列的互补体。

表1：

表1a.人Cox-2(19mer)：

 

1.siRNA_371	371	CCCUUCCUUCGAAAUGCAA
			2.siRNA_372	372	CCUUCCUUCGAAAUGCAAU
3.siRNA_468	468	GCUGGGAAGCCUUCUCUAA
			4.siRNA_512	512	CCUCCUGUGCCUGAUGAUU
5.siRNA_562	562	GCAGCUUCCUGAUUCAAAU
			6.siRNA_1102	1102	GCAACACUUGAGUGGCUAU
7.siRNA_1461	1461	GCUUUAUGCUGAAGCCCUA
			8.siRNA_1602	1602	CCAUCUUUGGUGAAACCAU
9.siRNA_1776	1776	GCUGUCCCUUUACUUCAUU
			10.siRNA_2853	2853	CCCAAAUUAUUGGUUCCAA

表1b.人Cox-2(25mer)：

 

1.stealth_394	394	GAGUUAUGUGUUGACAUCCAGAUCA
			2.stealth_412	412	CAGAUCACAUUUGAUUGACAGUCCA
3.stealth_473	473	GAAGCCUUCUCUAACCUCUCCUAUU
			4.stealth_534	534	CGACUCCCUUGGGUGUCAAAGGUAA
5.stealth_690	690	CAGAUCAUAAGCGAGGGCCAGCUUU
			6.stealth_849	849	CAGUCAAAGAUACUCAGGCAGAGAU
7.stealth_1041	1041	UCCAGACAAGCAGGCUAAUACUGAU
			8.stealth_1103	1103	CAACACUUGAGUGGCUAUCACUUCA
9.stealth_1455	1455	GCAAACGCUUUAUGCUGAAGCCCUA
			10.stealth_1459	1459	ACGCUUUAUGCUGAAGCCCUAUGAA

表2：

表2a.人纤连蛋白(19mer)：

 

1.siRNA_121	121	CCUGCGAUUCACCAACAUU
			2.siRNA_580	580	GGUCAGCAUCGUUGCUCUU
3.siRNA_603	603	GCAGAGAGGAAAGUCCCUU
			4.siRNA_719	719	GCUGUCACAGUGAGAUAUU
5.siRNA_801	801	GCAAGUCUACAGCUACCAU
			6.siRNA_890	890	GCAAGCAGCAAGCCAAUUU
7.siRNA_894	894	GCAGCAAGCCAAUUUCCAU
			8.siRNA_897	897	GCAAGCCAAUUUCCAUUAA
9.siRNA_919	919	CCGAACAGAAAUUGACAAA
			10.siRNA_1076	1076	GGUCCAGAUCAAACAGAAA

表2b.人纤连蛋白(25mer)：

 

1.stealth_199	199	CCUGGUGCGUUACUCACCUGUGAAA
			2.stealth_614	614	AGUCCCUUAUUGAUUGGCCAACAAU
3.stealth_726	726	CAGUGAGAUAUUACAGGAUCACUUA
			4.stealth_820	820	CAGCGGCCUUAAACCUGGAGUUGAU
5.stealth_837	837	GAGUUGAUUAUACCAUCACUGUGUA
			6.stealth_888	888	CCGCAAGCAGCAAGCCAAUUUCCAU
7.stealth_892	892	AAGCAGCAAGCCAAUUUCCAUUAAU
			8.stealth_893	893	AGCAGCAAGCCAAUUUCCAUUAAUU
9.stealth_1112	1112	CAGCCCACAGUGGAGUAUGUGGUUA
			10.stealth_1119	1119	CAGUGGAGUAUGUGGUUAGUGUCUA

表3：

表3a.人Hoxb13(19mer)：

 

1.siRNA_99	99	CCGGCAAUUAUGCCACCUU
			2.siRNA_126	126	CCAAGGAUAUCGAAGGCUU
3.siRNA_269	269	CCAAAGCAAUGCCACCCAU
			4.siRNA_321	321	CCGUGCCUUAUGGUUACUU
5.siRNA_789	789	GGGAGUAUGCGGCUAACAA
			6.siRNA_895	895	GGUCAAAGAGAAGAAGGUU
7.siRNA_1181	1181	CCCAGUCAUAAUCAUUCAU
			8.siRNA_1239	1239	CCAUGAUCGUUAGCCUCAU
9.siRNA_1282	1282	GCACUUUAGAAACCGCUUU
			10.siRNA_1296	1296	GCUUUCAUGAAUUGAGCUA

表3b.人Hoxb13(25mer)：

 

1.stealth_332	332	GGUUACUUUGGAGGCGGGUACUACU
			2.stealth_788	788	CGGGAGUAUGCGGCUAACAAGUUCA
3.stealth_791	791	GAGUAUGCGGCUAACAAGUUCAUCA
			4.stealth_902	902	GAGAAGAAGGUUCUCGCCAAGGUGA
5.stealth_1167	1167	CCCAAAGAACCUGGCCCAGUCAUAA
			6.stealth_1183	1183	CAGUCAUAAUCAUUCAUCCUGACAG
7.stealth_1193	1193	CAUUCAUCCUGACAGUGGCAAUAAU
			8.stealth_1268	1268	UAGAGCUCUGUAGAGCACUUUAGAA
9.stealth_1280	1280	GAGCACUUUAGAAACCGCUUUCAUG
			10.stealth_1294	1294	CCGCUUUCAUGAAUUGAGCUAAUUA

表4：

表4a.人IL-6(19mer)：

 

1.siRNA_250	250	GCAUCUCAGCCCUGAGAAA
			2.siRNA_258	258	GCCCUGAGAAAGGAGACAU
3.siRNA_360	360	GGAUGCUUCCAAUCUGGAU
			4.siRNA_364	364	GCUUCCAAUCUGGAUUCAA
5.siRNA_375	375	GGAUUCAAUGAGGAGACUU
			6.siRNA_620	620	GCAGGACAUGACAACUCAU
7.siRNA_706	706	GGCACCUCAGAUUGUUGUU
			8.siRNA_768	768	GCACAGAACUUAUGUUGUU
9.siRNA_949	949	GGAAAGUGGCUAUGCAGUU
			10.siRNA_950	950	GAAAGUGGCUAUGCAGUUU

表4b.人IL-6(25mer)：

 

1.stealth_256	256	CAGCCCUGAGAAAGGAGACAUGUAA
			2.stealth_359	359	UGGAUGCUUCCAAUCUGGAUUCAAU
3.stealth_429	429	GAGGUAUACCUAGAGUACCUCCAGA
			4.stealth_446	446	CCUCCAGAACAGAUUUGAGAGUAGU
5.stealth_631	631	CAACUCAUCUCAUUCUGCGCAGCUU
			6.stealth_705	705	GGGCACCUCAGAUUGUUGUUGUUAA
7.stealth_762	762	CACUGGGCACAGAACUUAUGUUGUU
			8.stealth_767	767	GGCACAGAACUUAUGUUGUUCUCUA
9.stealth_768	768	GCACAGAACUUAUGUUGUUCUCUAU
			10.stealth_1002	1002	UGGAAAGUGUAGGCUUACCUCAAAU

表5：

表5a.人IL-8(19mer)：

 

1.siRNA_1341	1341	UACUCCCAGUCUUGUCAUU
			2.siRNA_1342	1342	ACUCCCAGUCUUGUCAUUG
3.siRNA_1345	1345	CCCAGUCUUGUCAUUGCCA
			4.siRNA_1346	1346	CCAGUCUUGUCAUUGCCAG
5.siRNA_1364	1364	GCUGUGUUGGUAGUGCUGU
			6.siRNA_1371	1371	UGGUAGUGCUGUGUUGAAU
7.siRNA_1372	1372	GGUAGUGCUGUGUUGAAUU
			8.siRNA_1373	1373	GUAGUGCUGUGUUGAAUUA
9.siRNA_1378	1378	GCUGUGUUGAAUUACGGAA
			10.siRNA_1379	1379	CUGUGUUGAAUUACGGAAU

表5b.人IL-8(25mer)：

 

1.stealth_1364	1364	GCUGUGUUGGUAGUGCUGUGUUGAA
			2.stealth_1366	1366	UGUGUUGGUAGUGCUGUGUUGAAUU
3.stealth_1372	1372	GGUAGUGCUGUGUUGAAUUACGGAA
			4.stealth_1374	1374	UAGUGCUGUGUUGAAUUACGGAAUA
5.stealth_1375	1375	AGUGCUGUGUUGAAUUACGGAAUAA
			6.stealth_1377	1377	UGCUGUGUUGAAUUACGGAAUAAUG
7.stealth_1378	1378	GCUGUGUUGAAUUACGGAAUAAUGA

表6：

表6a.人Sfrs3(19mer)：

 

1.siRNA_28	28	GGAAAGCGGGAAGACUCAU
			2.siRNA_109	109	CCUGUCCAUUGGACUGUAA
3.siRNA_114	114	CCAUUGGACUGUAAGGUUU
			4.siRNA_509	509	GCUGUCUCGGGAGAGAAAU
5.siRNA_612	612	GGUGUACAGGAAAUUACUU
			6.siRNA_749	749	GGUGUAAUUCUCUAUGGUU
7.siRNA_785	785	GGCAUGUAAUACCAAGAAU
			8.siRNA_1452	1452	CCUAUUGGAAGCCAUACUU
9.siRNA_1612	1612	GGCACUAUGGAUUAGUCUU
			10.siRNA_1976	1976	GCAGGUGUUGUAAUUUCAA

表6b.人Sfrs3(25mer)：

 

1.stealth_82	82	CCCUAGAUCUCGAAAUGCAUCGUGA
			2.stealth_108	108	UCCUGUCCAUUGGACUGUAAGGUUU
3.stealth_109	109	CCUGUCCAUUGGACUGUAAGGUUUA
			4.stealth_558	558	CGUAGUCGAUCUAGGUCAAAUGAAA
5.stealth_601	601	GCAAGAGAAGUGGUGUACAGGAAAU
			6.stealth_743	743	CACAAAGGUGUAAUUCUCUAUGGUU
7.stealth_1422	1422	GAGCUUGGUACCAAGUCCAGGUAUA
			8.stealth_1448	1448	CAUUCCUAUUGGAAGCCAUACUUAU
9.stealth_1567	1567	AAGCAGUUGGUUACACGAUUCUUAU
			10.stealth_1611	1611	AGGCACUAUGGAUUAGUCUUCUGAA

表7：

表7a.人TGF-b1(19mer)：

 

1.siRNA_1380	1380	CCAGAAAUACAGCAACAAU
			2.siRNA_1391	1391	GCAACAAUUCCUGGCGAUA
3.siRNA_1538	1538	CCUGUGACAGCAGGGAUAA
			4.siRNA_1569	1569	GGACAUCAACGGGUUCACU
5.siRNA_1610	1610	CCACCAUUCAUGGCAUGAA
			6.siRNA_1631	1631	GGCCUUUCCUGCUUCUCAU
7.siRNA_1702	1702	GCCCUGGACACCAACUAUU
			8.siRNA_1754	1754	GGCAGCUGUACAUUGACUU
9.siRNA_1888	1888	GCCCUGUACAACCAGCAUA
			10.siRNA_1889	1889	CCCUGUACAACCAGCAUAA

表7b.人TGF-b1(25mer)：

 

1.stealth_1363	1363	CAGCACGUGGAGCUGUACCAGAAAU
			2.stealth_1366	1366	CACGUGGAGCUGUACCAGAAAUACA
3.stealth_1372	1372	GAGCUGUACCAGAAAUACAGCAACA
			4.stealth_1435	1435	AGCGACUCGCCAGAGUGGUUAUCUU
5.stealth_1436	1436	GCGACUCGCCAGAGUGGUUAUCUUU
			6.stealth_1547	1547	GCAGGGAUAACACACUGCAAGUGGA
7.stealth_1558	1558	ACACUGCAAGUGGACAUCAACGGGU
			8.stealth_1564	1564	CAAGUGGACAUCAACGGGUUCACUA
9.stealth_1625	1625	UGAACCGGCCUUUCCUGCUUCUCAU
			10.stealth_1708	1708	GACACCAACUAUUGCUUCAGCUCCA

表8：

表8a.人TGF-b2(19mer)：

 

1.siRNA_249	249	CCUGCAGCACACUCGAUAU
			2.siRNA_727	727	GCGCUACAUCGACAGCAAA
3.siRNA_1088	1088	GCUUUGGAUGCGGCCUAUU
			4.siRNA_1093	1093	GGAUGCGGCCUAUUGCUUU
5.siRNA_1131	1131	GCUGCCUACGUCCACUUUA
			6.siRNA_1134	1134	GCCUACGUCCACUUUACAU
7.siRNA_1135	1135	CCUACGUCCACUUUACAUU
			8.siRNA_1194	1194	CCAAAGGGUACAAUGCCAA
9.siRNA_1267	1267	GGUCCUGAGCUUAUAUAAU
			10.siRNA_1317	1317	GCUGCGUGUCCCAAGAUUU

表8b.人TGF-b2(25mer)：

 

1.stealth_697	697	CAAGUCCAAAGAUUUAACAUCUCCA
			2.stealth_784	784	CGAUGUAACUGAUGCUGUUCAUGAA
3.stealth_916	916	ACUAGAAGCAAGAUUUGCAGGUAUU
			4.stealth_1162	1162	GAGGGAUCUAGGGUGGAAAUGGAUA
5.stealth_1193	1193	CCCAAAGGGUACAAUGCCAACUUCU
			6.stealth_1204	1204	CAAUGCCAACUUCUGUGCUGGAGCA
7.stealth_1267	1267	GGUCCUGAGCUUAUAUAAUACCAUA
			8.stealth_1321	1321	CGUGUCCCAAGAUUUAGAACCUCUA
9.stealth_1327	1327	CCAAGAUUUAGAACCUCUAACCAUU
			10.stealth_1371	1371	CACCCAAGAUUGAACAGCUUUCUAA

表9：

表9a.靶向Smad3 siRNA(19mer)：

 

1.siRNA_176	176	GCCUGGUCAAGAAACUCAA
			2.siRNA_428	428	GCGUGAAUCCCUACCACUA
3.siRNA_822	822	GCCAUCCAUGACUGUGGAU
			4.siRNA_827	827	CCAUGACUGUGGAUGGCUU
5.siRNA_1079	1079	GCAACCUGAAGAUCUUCAA
			6.siRNA_1182	1182	CCGCAUGAGCUUCGUCAAA
7.siRNA_1250	1250	GGAUUGAGCUGCACCUGAA
			8.siRNA_1325	1325	GCUGUUCCAGUGUGUCUUA
9.siRNA_1411	1411	GGAACUCUACUCAACCCAU
			10.siRNA_1540	1540	CCAAACACAUUUACCCUUU

表9b.靶向Smad3 siRNA(25mer)：

 

1.stealth_447	447	CCAGAGAGUAGAGACACCAGUUCUA
			2.stealth_632	632	GAGAAACCAGUGACCACCAGAUGAA
3.stealth_707	707	CAGCACAUAAUAACUUGGACCUGCA
			4.stealth_1070	1070	CACCAGGAUGCAACCUGAAGAUCUU
5.stealth_1331	1331	CCAGUGUGUCUUAGAGACAUCAAGU
			6.stealth_1332	1332	CAGUGUGUCUUAGAGACAUCAAGUA
7.stealth_1444	1444	AAGAAAUCUUUCUCCCUCAACUGAA
			8.stealth_1499	1499	CGAGCAAACCCAGAGGUGGAUGUUA
9.stealth_1500	1500	GAGCAAACCCAGAGGUGGAUGUUAU
			10.stealth_1511	1511	GAGGUGGAUGUUAUGAACAGCUGUG

在线性多核苷酸或发夹多核苷酸的各个实施方案中，第一核苷酸序列的长度是21到25的任何数量的核苷酸。在许多实施方案中，线性多核苷酸或发夹多核苷酸包括靶向选自表1a-9b的序列的靶向序列，而且任选包括与选择序列的3’结合的二核苷酸突出。仍然在线性多核苷酸或发夹多核苷酸的另外的实施方案中，位于第一核苷酸序列3′末端的二核苷酸是TT，TU，UT，或UU，而且包括任何核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸或两者。在各个进一步的实施方案中，线性或发夹多核苷酸可以是DNA，或者它可以是RNA，或者它可以由脱氧核糖核苷酸和核糖核苷酸组成。

在另外的方面中，本发明提供了一种双链多核苷酸，其包括如上所述的第一条线性多核苷酸链，和与第一条链的至少第一核苷酸序列互补，并与其杂交以形成双链siRNA组合物的第二条多核苷酸链。

图1提供了本发明多核苷酸的某些实施方案的示意图。本发明公开了靶序列，或在某些情况下与靶序列稍微错配的siRNA序列，所有的都提供于表1a-9b中。其中公开的序列长度为19个核苷酸到25个核苷酸。靶向序列通过图1中轻微阴影区表示。图1，画面A，a)举例说明了一个实施方案，其中显示为“SEQ”的公开序列可以任选地包括在一个较大的多核苷酸中，该较大的多核苷酸的全长可以为多达200个核苷酸。

本发明另外提供了，在靶向多核苷酸中，针对选自表1a-9b的靶序列的靶向序列，可以是较长的靶向序列的部分，以便靶向多核苷酸靶向比SEQ所示的第一核苷酸序列更长的序列。这在图1，画面A，b)中进行了举例说明，其中完全靶向序列通过多核苷酸上面的水平线，和通过SEQ区周围的较深阴影表示。如同在多核苷酸的所有实施方案中，这种较长的序列可以任选包括在长度为200或较少碱基的更长多核苷酸中(图1，画面A，b))。

本发明进一步提供了一种靶向序列，其是任何上述靶向序列的片段，以便该片段靶向表1a-9b中提供的序列，其长度为至少15个核苷酸(而且比参考序列短至多1个碱基；图1，画面A，c)中举例说明)，以及一种靶向序列，其中至多5个核苷酸可能不同于与表1a-9b中提供的靶序列互补(图1，画面A，d)中举例说明，表明，在该实例中，3个较深的垂直条表示3个碱基变体)。

本发明仍然进一步提供了一种序列，其与任何上述序列互补(图1，画面A，e)中所示，并指定为“COMPL”)。任何这些序列包括在本发明的寡核苷酸或多核苷酸中。本发明的任何线性多核苷酸可以由仅仅上述a)-e)中所述的序列组成，或者可任选地包括多达200个核苷酸极限的另外的碱基。由于RNA干扰需要双链RNA，因此靶向多核苷酸本身可以是双链的，包括与至少表1a-9b提供的序列互补并与其杂交的第二条链，或可依赖于细胞内处理以产生互补链。

因此，多核苷酸可以是单链的，或者它可以是双链的。仍然在进一步的实施方案中，多核苷酸仅仅包含脱氧核糖核苷酸，或它仅仅包含核糖核苷酸，或它包含脱氧核糖核苷酸和核糖核苷酸。在这里描述的多核苷酸的重要实施方案中，靶序列由长度为15个核苷酸(nt)，或16nt，或17nt，或18nt，或19nt，或20nt，或21nt，或22nt，或23nt，或24nt，或25nt，或26nt，或27nt，或28nt，或29，或30nt组成。仍然在另外的有利的实施方案中，靶向序列可与靶序列的互补体有至多5个碱基不同。

在本发明的几个实施方案中，多核苷酸是由靶向序列组成的siRNA，其任选包括这里描述的3’二核苷酸突出。

作为选择，按照RNA干扰中双链RNA的需要，可以制备寡核苷酸或多核苷酸以形成分子内发夹环双链分子。这种分子由前段任何实施方案中所述的第一个序列形成，其后面是短的环序列，然后其依次接着是与第一个序列互补的第二个序列。这种结构形成想要的分子内发夹。而且，公开的这种多核苷酸还具有200个核苷酸的最大长度，以便列举的3个需要的结构可以任何寡核苷酸或多核苷酸组成，其具有高达200个核苷酸的任何全长。发夹环多核苷酸如图1，画面B中例举的。

用各种制剂提高局部siRNA递送

本发明提供了通过引入RNA干扰(siRNA)沉默或下调靶基因表达，预防伤口愈合过程期间由于对皮肤组织损伤的炎症反应而致的疤痕形成的方法。在本发明的一种方法中，在痊愈过程期间，应用或施用siRNA或siRNA混合物到皮肤伤口的区域。可以为人，或非人哺乳动物提供这种治疗。由于细胞和分子生物学的新发展，我们已经大大扩展我们对参与伤口修复和组织再生的生物过程的理解，而且已经获得了伤口护理方面的改善。伤口愈合是一种动态的，相互作用过程，其包括可溶性介质，血细胞，胞外基质和实质细胞，而且许多基因在那些细胞中发挥功能。我们相信，使用siRNA抑制剂调节某些炎症激活因子导致表达，如，TGF-β1，2，Cox-2，IL-6，IL-8，Hoxb13，纤连蛋白，Smad3和Sfrs3，等等，单独使用或组合使用，将导致理想的伤口愈合过程，同时具有较少的疤痕形成。这种最佳方式的siRNA介导的处理，将最小化炎症，增强皮肤组织形成和组织重塑，其是伤口愈合过程的3个主要步骤。

药物组合物

如这里使用的，“药学上可接受的载体”，涉及药物组合物，意图包括与药物施用相容的任何和所有的溶剂，分散介质，涂层，抗菌剂和抗真菌剂，等渗剂和吸收延迟剂，等等。适合的载体描述于教科书如Remington′s Pharmaceutical Sciences，Gennaro AR(Ed.)20^thedition(2000)Williams & Wilkins PA，USA，和Wilson andGisvold′s Textbook of Organic Medicinal and PharmaceuticalChemistry，by Delgado and Remers，Lippincott-Raven，将其引入这里作为参考。可用于这种载体和稀释剂中的组分的优选实例包括，但不限于，水，盐水，磷酸盐，羧酸盐，氨基酸溶液，生理盐水，右旋糖(葡萄糖的同义词)溶液，和5％人血清白蛋白。作为非限制性实例，右旋糖可以5％或10％水溶液使用。脂质体和无水的载体如固定油类也可能使用。将这些介质和试剂用于药学活性物质是本领域熟知的。增补的活性化合物也可以掺入到组合物中。

本发明的药物组合物配制成与它的预定给药途径相容。给药途径的实例包括肠胃外，例如，静脉内，皮内，皮下，口服，鼻，吸入，经皮(局部的)，经粘膜和直肠给药。用于肠胃外，静脉内，皮内或皮下应用的溶液或混悬液可包括下列组分：无菌稀释剂如注射用水，盐溶液，固定油类，聚乙二醇，甘油，丙二醇或其他的合成溶剂；抗菌剂如苯甲醇或羟苯甲酸甲酯；抗氧化剂如抗坏血酸或亚硫酸氢钠；螯合剂如乙二胺四乙酸；缓冲液如醋酸盐，柠檬酸盐或磷酸盐，和用于调节张力的试剂如氯化钠或右旋糖。

对于通过吸入给药，化合物以来自加压容器，或分配器，其包含适合的抛射剂例如气体如二氧化碳，或喷雾器的气溶胶喷射的形式递送。

在一个实施方案中，用将保护化合物以防从机体快速消除的载体，如控释制剂，包括植入物和微囊递送系统来制备活性化合物。持续释放制品的适合的实例包括含有抗体的固体疏水聚合物的半渗透基质，该基质以成形的制品的形式，例如，薄膜或微胶囊。持续释放基质的实例包括聚酯，水凝胶(例如，聚(2-羟乙基-异丁烯酸酯)，或聚(乙烯醇)，聚交酯(美国专利3,773,919)，L-谷氨酸和γ乙基-L-谷氨酸的共聚物，不可降解的乙烯-醋酸乙烯酯，可降解的乳酸-羟基乙酸共聚物如LUPRON DEPOT^TM(由乳酸-羟基乙酸共聚物和醋酸亮丙瑞林组成的可注射微球)，和聚-D-(-)-3-羟丁酸。虽然聚合物如乙烯-醋酸乙烯酯和乳酸-羟基乙酸能释放分子超过100天，但是某些水凝胶在较短的时间周期释放药物活性剂。有利的聚合物是生物可降解的，或生物相容的。脂质体混悬液(包括靶向受感染细胞的脂质体，其具有抗病毒抗原的单克隆抗体)，也可用作药学上可接受的载体。这些可以根据本领域技术人员已知的方法，例如，美国专利4,522,811中所述的方法制备。具有有利形式如微球的持续释放制品，可以从如上所述的那些材料制备。

本发明的siRNA多核苷酸可插入到载体中，并用作基因治疗载体。基因治疗载体可以通过任何途径，例如，如美国专利5,703,055描述的途径，递送给个体。递送因此也可以包括，例如，静脉内注射，局部施用(参见，美国专利5,328,470)或立体定向注射(参见，例如，Chenet al.(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91：3054-3057)。基因治疗载体的药物制品，可以包括处于可接受的稀释剂中的基因治疗载体，或者可以包括缓释基质，其中包埋有基因递送载体。作为选择，当可以完整的从重组细胞生产完全的基因递送载体，例如，逆转录病毒载体时，药物制品可以包括生产该基因递送系统的一个或多个细胞。

药物组合物可以包括在试剂盒中，例如，容器，包装，或分配器中，与给药的说明书一起。

用来制备包含siRNA抑制剂的制剂或药物组合物的各种载体可用于通过体表应用，局部注射或经皮施用，提高siRNA治疗剂的局部递送。在几个实施方案中，本发明的siRNA多核苷酸，通过脂质体介导的转染，例如通过使用商业可获得的试剂或技术，例如，Oligofectamine^TM，LipofectAmine^TM试剂，LipofectAmine 2000^TM(Invitrogen)，以及通过电穿孔，和类似的技术，被递送到培养中的细胞中，或目的细胞中。包含siRNA的药物组合物包括另外的组分，其保护siRNA的稳定性，延长siRNA寿命，增强siRNA功能，或使siRNA靶向特定的组织/细胞。这些包括各种可生物降解的聚合物，阳离子聚合物(如聚乙烯亚胺)，阳离子共聚肽如组氨酸-赖氨酸(HK)多肽，参见，例如，Mixson等的PCT公开WO 01/47496，Biomerieux的WO02/096941，和麻省理工学院的WO 99/42091)，聚乙二醇化阳离子多肽，和配体掺入的聚合物，等等。带正电荷的多肽，PolyTran溶液(HK聚合物和多糖如天然多糖的盐或水溶液，亦称为硬葡聚糖)，TargeTran(由配合的RGD-PEG-PEI聚合物组成的纳米颗粒的盐或水悬浮液，其包括靶向配体)，表面活性剂(Infasurf；ForestLaboratories，Inc.；ONY Inc.)，和阳离子聚合物(如聚乙烯亚胺)(37-39)。

(calfactant)是一种分离自小牛肺，用于气管内滴注的天然肺表面活性剂；它包含磷脂，中性类脂，和疏水表面活性剂缔合的蛋白质B和C。聚合物可以是一维的或多维的，也可以是直径小于20微米，20到100微米之间，或者100微米以上的微粒或纳米颗粒(40-42)。所述的聚合物可以携带受体特异性的配体分子，或特定组织或细胞的分子，因此用于siRNA的靶向递送。siRNA多核苷酸也可通过基于阳离子脂质体的载体，如DOTAP，DOTAP/胆固醇(Qbiogene，Inc.)，及其他类型的脂质水溶液递送。包含siRNA抑制剂的天然乳剂能局部应用于伤口组织表面，以增强无疤痕伤口愈合。

RT-PCR以评估siRNA介导的基因敲减

为了评估siRNA抑制剂体外和体内的基因敲减效率，一种较好的方法是使用定量逆转录PCR(QRT-PCR)来测定siRNA处理之前和之后的mRNA水平。在各个实施方案中，用于QRT-PCR的引物被设计成专门用于测定来自从细胞培养实验收集的总RNA样品和小鼠，兔和猪模型的皮肤组织样品的TGF-β1，2，Cox-2，IL-6，IL-8，Hoxb13，纤连蛋白，Smad3和Sfrs3等等的mRNA水平。

用于TGF-β1mRNA的QRT-PCR测定的引物：

逆转录引物(1289-1268)：5′-CGGAGCTCTGATGTGTTGAAGA-3′

上游引物(881-902)：5′-GGCTGCGGCTGCTGCCGCTGCT-3′

下游引物(1181-1160)：5′-GCGTAGTAGTCGGCCTCAGGCT-3′。

用于TGF-β2mRNA的QRT-PCR测定的引物：

逆转录引物(868-846)：5′-GCAGCAGGGACAGTGTAAGCTT-3′

上游引物(440-461)：5′-GCCGCCTGCGAGCGCGAGAGGA-3′

下游引物(742-721)：5′-GCTGTCGATGTAGCGCTGGGTT-3′。

用于Cox-2mRNA的QRT-PCR测定的引物：

逆转录引物(1012-991)：5′-CTCCTGTTTAAGCACATCGCAT-3′

上游引物(564-585)：5′-GCTTCCTGATTCAAATGAGATT-3′

下游引物(835-814)：5′-CTCTCCATCAATTATCTGATAT-3′。

用于Hoxb13mRNA的QRT-PCR测定的引物：

逆转录引物(1150-1138)：5′-GCTGTCACATGGGGTTCCGTCT-3′

上游引物(701-722)：5′-GGGCAGCACCCTCCTGACGCCT-3′

下游引物(1025-1004)：5′-CCCAGCCTGGGCTTGGCAGGTT-3′。

用于纤连蛋白mRNA的QRT-PCR测定的引物：

逆转录引物(1032-1011)：5′-GTGGTTACTCTGTAACCAGTAA-3′

上游引物(561-582)：5′-CTCCAGGCACAGAGTATGTGGT-3′

下游引物(872-860)：5′-CAGTGACAGCATACACAGTGAT-3′。

用于Sfrs3mRNA的QRT-PCR测定的引物：

逆转录引物(1060-1039)：5′-GCAGCATTTCGTTTTCCCTGAT-3′

上游引物(571-592)：5′-GGTCAAATGAAAGGAAATAGAA-3′

下游引物(880-859)：5′-GGTTTATTATCAGTCTGTGCAT-3′。

用于IL-6mRNA的QRT-PCR测定的引物：

逆转录引物(965-986)：5′-CTGCATAGCCACTTTCCATTAT-3′

上游引物(301-322)：5′-GCAGCAAAGAGGCACTGGCAGA-3′

下游引物(599-621)：5′-CAGCTTCGTCAGCAGGCTGGCA-3′。

用于IL-8mRNA的QRT-PCR测定的引物：

逆转录引物(870-848)：5′-GGGTTGCCAGATTTAACAGAAA-3′

上游引物(428-449)：5′-GAATCAGTGAAGATGCCAGTGA-3′

下游引物(744-723)：5′-CCTGAAATTAAAGTTCGGAT-3′。

用于Smad3mRNA的QRT-PCR测定的引物：

逆转录引物(910-888)：5′-CTGCATTCCTGTTGACATTGGA-3′

上游引物(310-332)：5′-GGGCTCCCTCATGTCATCTACT-3′

下游引物(781-759)：5′-CGTAGTAGGAGATGGAGCACCA-3′。

siRNA混合物组成

除了使用siRNA双链体靶向每个特定的基因靶，如TGF-β1，2，Cox-2，IL-6，IL-8，Hoxb13，纤连蛋白，Smad3和Sfrs3，等等，使用可注射的溶液或者乳剂体表或皮下局部应用，用于改善皮肤伤口愈合而没有疤痕形成，本发明提供了使用siRNA寡混合物(siRNA-OC)，选择性靶向3个或更多个那些基因的构思，方法和组合物，作为治疗剂，由于无疤痕伤口愈合的较好临床结果。这种siRNA寡混合物包含靶向至少3个mRNA靶的至少3个双链体。本发明是基于两个重要方面：第一，siRNA双链体是一种很有效的基因表达抑制剂，而且每个siRNA分子由具有相同化学性质的短双链RNA寡聚物(21-23nt，或24-25nt，或26-29nt)组成；第二，皮肤伤口愈合过程包括可溶性介质，血细胞，胞外基质和实质细胞，同时多个因子在炎症，组织形成和组织重塑中发挥功能。因此，使用靶向多个致病基因的siRNA-OC，代表一种有益的治疗方法，由于siRNA双链体的化学一致性，和来自多个致病基因的下调协同作用。本发明限定了，siRNA-OC是靶向至少3个基因的siRNA双链体的组合，以各种比例，各种物理形式(溶液或粉末)，而且同时通过相同的途径，或不同的途径和时间(如在损伤恢复期间)应用到疾病组织中。

伤口愈合过程可以表征为三个阶段-炎症，组织形成和组织重塑。

组织损伤导致血管的破裂和血液组分的外渗。许多的血管活性介质和趋化因子，通过凝结和激活的补体途径，以及通过损伤的或激活的实质细胞产生。这些物质把炎性白细胞恢复到损伤部位。浸润嗜中性白细胞净化外来颗粒和细菌的受伤区域，然后与痂皮一起排出，或被巨噬细胞吞噬。在对特定趋化物，如胞外基质蛋白的片段，转化生长因子b，和单核细胞趋化蛋白1的反应中，单核细胞也浸润伤口部位，并变成释放生长因子如血小板衍生生长因子和血管内皮生长因子的活化巨噬细胞，其启动肉芽组织形成。巨噬细胞通过它们的整联蛋白受体与胞外基质的特定蛋白结合，一种通过巨噬细胞刺激微生物和胞外基质片段的吞噬作用的作用。附着到胞外基质也刺激单核细胞蜕变成炎性或修复的巨噬细胞。附着诱导单核细胞和巨噬细胞表达集落刺激因子1，一种单核细胞和巨噬细胞存活所需的细胞因子；肿瘤坏死因子a，一种有效的炎性细胞因子；和血小板衍生生长因子，一种成纤维细胞的有效趋化物和分裂素。单核细胞和巨噬细胞表达的其他重要细胞因子是转化生长因子a，白细胞介素-1，转化生长因子b，和胰岛素样生长因子I。单核细胞和巨噬细胞来源的生长因子几乎确定是起始和繁殖伤口中新组织形成所必需的，因为巨噬细胞使具有缺陷的伤口修复的动物衰竭。因此，巨噬细胞显示在炎症和修复之间的转换中具有关键的作用。明显地，最初的炎性阶段包括多种因子，特别是那些炎症前细胞因子和生长因子。因此，下调负责疤痕形成的那些炎症前细胞因子和生长因子，如TGF-β1，2，IL-6，IL-8和Cox-2，使用siRNA寡混合物(在组合中)将是很有益的。组合包括，但不限于，TGF-β1/Hoxb13/IL-8，TGF-β2/Hoxb13/IL-8，TGF-β1/Sfrs3/IL-8，TGF-β1/Cox-2/IL-8，TGF-β2/Hoxb13/IL-8和TGF-β1/Smad3/IL-6。

混合物可以从全部19mer，或者全部25mer，或者19或25mer寡聚物制备。

混合物可以从靶向选自这里鉴定的基因靶的任何2个基因，或任何3个基因，或任何4个基因，或任何5个基因，或更多个基因制备。

siRNA混合物可以与其他的药物一起应用，如抗生素，抗体，小分子，抑制剂，可的松，天然乳剂，草本乳剂及其他消炎药。

除非另有说明，这里使用的所有技术和科学术语，具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常所理解的相同的含义。示例性的方法和材料如下所述，但是与这里描述的那些方法和材料类似或等效的方法和方法，也可用于实施或检验本发明。这里提到的所有出版物及其他参考文献以其内容引入这里作为参考。在矛盾的情况中，本说明书，包括定义，将对照。虽然这里引用了许多文献，这种引用不构成任何这些文献形成本领域普通常识的部分的许可。在整个本说明书和权利要求书中，单词“comprise”，或变体如“comprises”或“comprising”应理解为包含所述的整数或整数组，但是不排除任何其他的整数或整数组。材料，方法和实例仅仅是示例性的，而不是为了限制。

实施例1：TGF-β1/TGF-β2/Cox-2的组合

下列3种靶向指定序列的寡核苷酸以等量(w/w/w)组合：

siRNA序列(T1-19-1)：CCCUUCCUUCGAAAUGCAA，

靶向Cox-2，

siRNA序列(T7-19-1)：CCAGAAAUACAGCAACAAU，

靶向TGF-β1，

siRNA序列(T8-19-1)：CCUGCAGCACACUCGAUAU，

靶向TGF-β2。

它们在水溶液中制备，或用于局部应用或皮下注射的合适的载体中配制。作为选择，上面鉴定的3个靶向寡核苷酸以各种不同的比例在溶液中组合，或者在用于局部应用或皮下注射的合适载体中配制，以促进疤痕形成的有益最小化。一般来说，将其他的siRNA寡核苷酸(靶向相同的3个基因的其他序列)混合作为混合物用于治疗应用。这种靶向寡核苷酸包括靶向来自表1.1和表1.2的Cox2序列的siRNA；靶向来自表7.1和表7.2的TGF-β1序列的siRNA和靶向来自于表8.1和表8.2的TGF-β2序列的siRNA。

实施例2：TGF-β1/Hoxb13/Cox-2组合

下列3种靶向指定序列的寡核苷酸以等量(w/w/w)组合：

siRNA序列(T1-19-1)：CCCUUCCUUCGAAAUGCAA，

靶向Cox-2，

siRNA序列(T7-19-1)：CCAGAAAUACAGCAACAAU，

靶向TGF-β1，

siRNA序列(T3-19-1)：CCGGCAAUUAUGCCACCUU，

靶向Hoxb13。

它们在水溶液中制备或在用于局部应用或皮下注射的合适的载体中配制。作为选择，上面鉴定的3个靶向寡核苷酸以各种不同的比例在溶液中组合，或者在用于局部应用或皮下注射的合适载体中配制，以促进疤痕形成的有益最小化。一般来说，将其他的siRNA寡核苷酸(靶向相同的3个基因的其他序列)混合作为混合物用于治疗应用。这种靶向寡核苷酸包括，靶向来自表1.1和表1.2的Cox2序列的siRNA；靶向来自表7.1和表7.2的TGF-β1序列的siRNA和靶向来自表3.1和表3.2的Hoxb13序列的siRNA。

实施例3：TGF-β1/Hoxb13/Sfrs3

下列3种靶向指定序列的寡核苷酸以等量(w/w/w)组合：

siRNA序列(T6-19-1)：GGAAAGCGGGAAGACUCAU，

靶向Sfrs3，

siRNA序列(T7-19-1)：CCAGAAAUACAGCAACAAU，

靶向TGF-β1，

siRNA序列(T3-19-1)：CCGGCAAUUAUGCCACCUU，

靶向Hoxb13。

它们在水溶液中制备或在用于局部应用或皮下注射的合适的载体中配制。作为选择，上面鉴定的3个靶向寡核苷酸以各种不同的比例在溶液中组合，或者在用于局部应用或皮下注射的合适载体中配制，以促进疤痕形成的有益最小化。一般来说，将其他的siRNA寡核苷酸(靶向相同的3个基因的其他序列)混合作为混合物用于治疗应用。这种靶向寡核苷酸包括，靶向来自表6.1和表6.2的Sfrs3序列的siRNAs；靶向来自表7.1和表7.2的TGF-β1序列的siRNA和靶向来自表3.1和表3.2的Hoxb13序列的siRNA。

实施例4：TGF-β1/Hoxb13/IL-6的组合

下列3种靶向指定序列的寡核苷酸以等量(w/w/w)组合：

siRNA序列(T4-19-1)：GCAUCUCAGCCCUGAGAAA，

靶向IL-6，

siRNA序列(T7-19-1)：CCAGAAAUACAGCAACAAU，

靶向TGP-β1，

siRNA序列(T3-19-1)：CCGGCAAUUAUGCCACCUU，

靶向Hoxb13。

它们在水溶液中制备或在用于局部应用或皮下注射的合适的载体中配制。作为选择，上面鉴定的3个靶向寡核苷酸以各种不同的比例在溶液中组合，或者在用于局部应用或皮下注射的合适载体中配制，以促进疤痕形成的有益最小化。一般来说，将其他的siRNA寡核苷酸(靶向相同的3个基因的其他序列)混合作为混合物用于治疗应用。这种靶向寡核苷酸包括，靶向来自表4.1和表4.2的IL-6序列的siRNA；靶向来自表7.1和表7.2的TGF-β1序列的siRNA和靶向来自表3.1表3.2的Hoxb13序列的siRNA。

文献

1.Singer AJ，Clark RA：Cutaneous wound healing.NEngl J Med 1999，341：738-746.

2.Martin P：Wound healing：aiming for perfect skinregeneration.Science 1997，276：75-81.

3.Rowlatt U：Intrauterine wound healing in a 20 weekhuman fetus.Virchows Arch A Pathol Anat Histol 1979，381：353-361.

4.Lin RY，et al.Exogenoustrans forming growthfactor-beta amplifies its own expression and inducesscar formation in a model of human fetal skin repair.Ann Surg 1995，222：146-154.

5.Cowin AJ，et al.Expression of TGF-beta and itsreceptors in murine fetal and adult dermal wounds.EurJ Dermatol 2001，11：424-431.

6.Krummel TM，et al.Transforming growth factor beta(TGF-beta)induces fibrosis in a fetal wound model.JPediatr Surg 1988，23：647-652.

7.Lanning DA，et al.TGF-betal alters the healing ofcutaneous fetal excisional wounds.J Pediatr Surg 1999，34：695-700.

8.Soo C，et al.Ontogenetic transition in fetalwound transforming growth factor-beta regulationcorrelates with collagen organization.Am J Pathol2003，163：2459-2476.

9.Sullivan KM，et al.A model of scarless humanfetal wound repair is deficient in transforming growthfactor beta.J Pediatr Surg 1995，30：198-202202-193.

10.Stelnicki EJ，et al.A new in vivo model for thestudy of fetal wound healing.Ann Plast Surg 1997，39：374-380.

11.Whitby DJ and Ferguson MW：Immunohistochemicallocalization of growth factors in fetal wound healing.Dev Biol 1991，147：207-215.

12.Roberts AB，et al.Transforming growth factor typebeta：rapid induction of fibrosis and angiogenesis invivo and stimulation of collagen formation in vitro.Proc Natl Acad Sci USA 1986，83：4167-4171.

13.Shah M，et al.Neutralising antibody to TGF-beta1，2 reduces cutaneous scarring in adult rodents.JCell Sci 1994，107：1137-1157.

14.Shah M，et al.Control of scarring in adult woundsby neutralising antibody to transforming growth factorbeta.Lancet 1992，339：213-214.

15.Choi BM，et al，Control of scarring in adultwounds using antisense transforming growth factor-beta1 oligodeoxynucleotides.Immunol Cell Biol 1996，74：144-150.

16.Haynes JH，et al.Platelet-derived growth factorinduces fetal wound fibrosis.J Pediatr Surg 1994，29：1405-1408.

17.Liechty KW，et al，Diminished interleukin 6(IL-6)production during scarless human fetal wound repair.Cytokine 2000，12：671-676.

18.Liechty KW，et al.Diminished interleukin-8(IL-8)production in the fetal wound healing response.J SurgRes 1998，77：80-84.

19.Wu KK：Cyclooxygenase 2 induction：molecularmechanism and pathophysiologic roles.J Lab Clin Med1996，128：242-245.

20.Wilgus TA，et al.Topical application of aselective cyclooxygenase inhibitor suppresses UVBmediated cutaneous inflammation.Prostaglandins OtherLipid Mediat 2000，62：367-384.

21.Sun WH，et al.Cyclooxygenase-2 inhibitorssuppress epithelial cellk inetics and delay gastricwound healing in rats.J Gastroenterol Hepatol 2000，15：752-761.

22.Guo JS，et al.Antiangiogenic effect of a highlyselective cyclooxygenase-2 inhibitor on gastric ulcerhealing in rats.Toxicol Appl Pharmacol 2002，183：41-45.

23.Simon AM，et al.Cyclooxygenase 2 function isessential for bone fracture healing.J Bone Miner Res2002，17：963-976.

24.Kampfer H，et al.Cyclooxygenase-1-coupledprostaglandin biosynthesis constitutes an essentialprerequisite for skin repair.J Invest Dermatol 2003，120：880-890.

25.Blomme EA，et al.Selective cyclooxygenase-2inhibition does not affect the healing of cutaneousfull-thickness incisional wounds in SKH-1 mice.Br JDermatol 2003，148：211-223.

26.Muller-Decker K，et al.The effects ofcyclooxygenase isozyme inhibition on incisional woundhealing in mouse skin.J Inve stDermatol 2002，119：1189-1195.

27.Muscara MN，et al.Wound collagen deposition inrats：effects of an NO-NSAID and a selective COX-2inhibitor.Br JPharmacol 2000，129：681-686.

28.Futagami A，et al.Wound healing involvesinduction of cyclooxygenase-2 expression in rat skin.Lab Invest 2002，82：1503-1513.

29.Wilgus TA，et al.Reduction of scar formation infull-thickness wounds with topical celecoxib treatment.Wound Repair Regen 2003，11：25-34.

30.Ashcroft GS，et al.Mice lacking Smad3 showaccelerated wound healing and an impaired localinflammatory response.Nat Cell Biol 1999，1：260-266.

31.Li-Korotky HS，et al.Identification of a pre-mRNAsplicing factor，arginine/serine-rich 3(sfrs3)，andit8 co-expression with fibronectin in fetal andpostnatal rabbit airway mucosal and skin wounds.Biochim Biophys Acta.2005 1762(1)：34-45.

32.Dovi JV，et al.Accelerated wound closure inneutrophil-depleted mice.J Leukoc Biol 2003，73：448-455.

33.Manus，M.T.and P.A.Sharp(2002)Gene silencingin mammals by small interfering RNAs.Nature Review，Genetics.3(10)：737-747.

34.Lu，P.Y.et al.(2003)siRNA-mediatedantitumorigenesis for drug target validation andtherapeutics.Current Opinion in MolecularTherapeutics.5(3)：225-234.

35.Kim，B.et al.(2004)Inhibition of ocularangiogenesis by siRNA targeting vascular endothelialgrowth factor-pathway genes；therapeutic strategy forherpetic stromal keratitis.Am.J.Pathol.165(6)：2177-85.

36.Tuschl，Zamore，Lehmann，Bartel and Sharp(1999)，Genes & Dev.13：3191-3197.

37.Elbashir，Lendeckel and Tuschl(2001).Genes &Dev.15：188-200.

38.Lu，P.Y.and M.Woodle(2005)Delivering siRNA invivo For functional genomics can novel therapeutics.InRNAIn terference Technology.Cambridge UniversityPress.P 303-317.

39.Lu，P.Y.et al.(2005)Modulation of angiogenesiswith siRNA inhibitors for noveltherapeut ics.TRENDSinMolecular Medicine.11(3)，104-13.

40.Lu PY，Xie F，Woodle MC.(2005)In vivoapplication of RNA interference：from functionalgenomics to therapeutics.Adv Genet.54：117-42.

41.Woodle，MC and PY Lu，Nanoparticles for RNAiTherapy.Nanotoday，August 2005，34-41.

42.Xie，Y.F.，M.Woodle and PY Lu.Harnessing in vivosiRNA delivery for functional genomics and noveltherapeutics.Drug Discovery Today，January 2006.

43.Li B.J.et al，2005，Nature Medicine，11，944-951.

Claims (46)

1.一种靶特异性多核苷酸(例如siRNA)，其靶向损伤皮肤组织的细胞中存在的炎症调节或炎症效应基因。

2.权利要求1中所述的靶向多核苷酸，其中多核苷酸是单链线性多核苷酸，双链线性多核苷酸，或发夹多核苷酸。

3.权利要求1中所述的靶向多核苷酸，其包括靶向选自表1-9中公开的序列的序列的第一核苷酸序列。

4.一种抑制皮肤伤口愈合期间疤痕形成的方法，包括使受伤的组织或细胞，在外科手术，伤口处理，损伤恢复或皮肤移植时，与包含权利要求1中所述的靶向多核苷酸的组合物接触。

5.权利要求4中所述的方法，其中靶向多核苷酸描述于权利要求2中。

6.权利要求4中所述的方法，其中靶向多核苷酸描述于权利要求3中。

7.权利要求4中所述的方法，其中接触包括组合物的定位应用。

8.权利要求4中所述的方法，其中接触包括组合物的定位注射。

9.权利要求4中所述的方法，其中组合物包括多个权利要求1中描述的靶向多核苷酸。

10.权利要求4中所述的方法，其中接触受伤的皮肤组织在处理中的伤口愈合过程期间有效下调炎症调节或炎症效应基因。

11.权利要求4中所述的方法，其中多核苷酸抑制组织细胞中靶基因的表达。

12.权利要求4中所述的方法，其中所述组织与皮肤区域相关。

13.权利要求4中所述的方法，其中所述组织由于灼伤受伤害。

14.权利要求4中所述的方法，其中所述组织由于化学制品受伤害。

15.权利要求4中所述的方法，其中所述组织由于激光受伤害。

16.权利要求4中所述的方法，其中所述组织由于整形手术受伤害。

17.权利要求4中所述的方法，其中所述组织为进行皮肤移植受伤害。

18.权利要求4中所述的方法，其中所述组织由于外科手术受伤害。

19.权利要求4中所述的方法，其中所述组织由于物理切割受伤害。

20.权利要求4中所述的方法，其中所述细胞是上皮细胞，血管内皮，血管平滑肌细胞，心肌(心脏)和伤口愈合时存在于皮肤组织中的过客白细胞。

21.权利要求4中所述的方法，其中所述处理用于人，或非人哺乳动物。

22.权利要求6中所述的方法，其中靶向多核苷酸靶向选自表1a和表1b中所列序列的Cox-2(环加氧酶-2)序列。

23.权利要求6中所述的方法，其中靶向多核苷酸靶向选自表2a和表2b中所列序列的纤连蛋白序列。

24.权利要求6中所述的方法，其中靶向多核苷酸靶向选自表3a和表3b中所列序列的Hoxb13基因序列。

25.权利要求6中所述的方法，其中靶向多核苷酸靶向选自表4a和表4b中所列序列的IL-6(白细胞介素-6)序列。

26.权利要求6中所述的方法，其中靶向多核苷酸靶向选自表5a和5b中所列序列的IL-8(白细胞介素-8)序列。

27.权利要求6中所述的方法，其中靶向多核苷酸靶向选自表6a和6b中所列序列的Sfrs3(剪接因子，富含精氨酸/丝氨酸3)序列。

28.权利要求6中所述的方法，其中靶向多核苷酸靶向选自表7a和7b中所列序列的TGF-β1(转化生长因子β1)序列。

29.权利要求4中所述的方法，其中组合物进一步包括PolyTran聚合物溶液。

30.权利要求4中所述的方法，其中组合物进一步包TargeTran纳米颗粒溶液。

31.权利要求4中所述的方法，其中所述siRNA包括针对一个或多个基因序列的一个或多个siRNA双链体。

32.权利要求4中所述的方法，其中靶向多核苷酸与小分子药物，单克隆抗体药物或其他的免疫调节剂一起组合应用。

33.权利要求4中所述的方法，其中组合物包括多个靶向多核苷酸，而且其中所述多核苷酸靶向多个基因序列。

34.权利要求31中所述的方法，其中靶向多核苷酸靶向Cox-2，TGF-β1和IL-8基因序列。

35.权利要求31中所述的方法，其中靶向多核苷酸靶向Cox-2，TGF-β1和IL-6基因序列。

36.权利要求31中所述的方法，其中靶向多核苷酸靶向Cox-2，TGF-β2和IL-8基因序列。

37.权利要求31中所述的方法，其中靶向多核苷酸靶向Cox-2，TGF-β2和IL-6基因序列。

38.权利要求31中所述的方法，其中靶向多核苷酸靶向Cox-2，Hoxb13和IL-8基因序列。

39.权利要求31中所述的方法，其中靶向多核苷酸靶向Cox-2，Hoxb13和IL-6基因序列。

40.权利要求31中所述的方法，其中靶向多核苷酸靶向Hoxb13，TGF-β1和Sfrs3基因序列。

41.权利要求31中所述的方法，其中靶向多核苷酸靶向Cox-2，TGF-β1和纤连蛋白基因序列。

42.权利要求31中所述的方法，其中靶向多核苷酸靶向Cox-2，TGF-β2和纤连蛋白基因序列。

43.权利要求31中所述的方法，其中靶向多核苷酸靶向Cox-2，TGF-β1和Smad3基因序列。

44.权利要求31中所述的方法，其中靶向多核苷酸靶向三个基因序列的其他组合。

45.权利要求31中所述的方法，其中靶向多核苷酸靶向超过三个基因序列。

46.权利要求31中所述的方法，其中靶向多核苷酸可以根据治疗结果，以相等比例或不同比例混合。

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