CN104302299A - 活化干细胞的rna干扰 - Google Patents

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焦万纳·马拉齐
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Universite Pierre et Marie Curie Paris 6
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Abstract

本发明涉及沉默PW1表达的干扰RNA具体地在再生医学的情形下用以体外或体内活化成体干细胞的用途。

Description

活化干细胞的RNA干扰
技术领域
本发明涉及通过RNA干扰选择性降低(knockdown)PW1表达以体内和体外调控哺乳动物干细胞，所述调控特别适用于组织修复和再生医学的情形。
背景技术
干细胞是由连续自我更新并且产生其所在位置的组织的分化子代的能力所定义。干细胞占总细胞结构的小百分比。例如，在小肠中，在小于300个细胞的总的小囊群体中，在小囊底部附近或许最多存在10个干细胞。在骨骼肌中，卫星(干)细胞构成所有细胞核的约5％，但是在骨髓中，多潜能造血干细胞稀有得多，其频率为，在所有骨髓细胞中，在10,000个中或许有1个。在不同的假定器官特异性干细胞的基因表达谱之间存在可观的重叠，这经常与自我更新、细胞存活和细胞粘附有关。将干细胞常规地用于修复由损伤或疾病损害的几种易对这样的方法做出响应的组织和器官已有三十多年，所述组织和器官最值得注意地包括骨髓(Fernand等,1989)和皮肤(Green等,1989)。成体干细胞对于组织内稳态和创伤修复是重要的，并且存在于保持增殖和再生潜能的具体的小生态环境中，并因此用作旨在体内提高再生潜能的小分子或生物治疗剂的有前途的目标。
本发明人先前已经在针对早期肌肉干细胞的假定调节子的筛选中分离了PW1。他们发现PW1是在早期胚胎形成期间表达，并且在所有早期谱系中都会强烈地表达，在后来的胎儿发育期间衰退，并且限于成体的肌肉干细胞。此外，用PW1进行的研究阐明了成体骨骼肌中驻留干细胞的新型群体。PW1报告小鼠的产生已经允许容易地追踪內源PW1表达，导致观察到在所有成体干细胞中都表达PW1。
发明内容
本发明提供沉默PW1/PEG3的用于体内或体外活化成体干细胞的干扰RNA(interferent RNA)。
具体地，干扰RNA可以选自siRNA、shRNA、反义RNA和miRNA。
在具体实施方式中，干扰RNA是siRNA，其包含一起形成RNA双链体的有义RNA链和互补性反义RNA链，其中所述有义RNA链包含序列SEQ ID NO:3或由序列SEQ ID NO:3组成。
在另一具体实施方式中，干扰RNA是优选地由慢病毒载体携带的shRNA，所述shRNA包含SEQ ID NO:14或由SEQ ID NO:14组成。
本发明提供沉默PW1/PEG3的干扰RNA，其用于治疗罹患可由再生医学治疗的疾病的患者，所述疾病包括心力衰竭、骨髓疾病、皮肤病、烧伤、退行性疾病如糖尿病、阿茲海默氏病、帕金森氏病，以及癌症。
本发明进一步提供一种在对象中对抗皮肤衰老的方法，所述方法包括向对象施用如本文定义的沉默PW1/PEG3的干扰RNA。
本发明的另一主题是一种在对象中预防脱发或促进毛发生长的方法，所述方法包括向对象施用如本文定义的沉默PW1/PEG3的干扰RNA。
本发明进一步提供一种活化成体干细胞的体外方法，所述方法包括使成体干细胞或包含成体干细胞的组织与如本文定义的沉默PW1/PEG3的干扰RNA接触。
附图说明
图1示出了在沉默PW1的、H1的人启动子的控制下表达shRNA(SEQ ID NO:12，对应于以下来自Sigma的参考：TRCN0000075397NM_008817.2-4305s1c1，图中名为shPW1)的慢病毒载体(名为Pw1shRNA)的图谱。
图2示出了感染PW1shRNA(下图)或感染GFP对照慢病毒(上图)的表皮干细胞的免疫荧光。BF：明视场，用DAPI(蓝色)对细胞核进行复染色，抗PW1抗体(Relaix等,1998)免疫染色的细胞呈红色，GFP发出绿色。
图3是示出用20nM或50nM杂乱siRNA(Ambion)或用PW1siRNA(Ambion，siRNA ID号s71469)转染的神经干细胞上的免疫荧光结果的图。使用Relaix等,1998中所述的抗PW1抗体并且用DAPI对细胞核进行复染色。
图4示出了通过特异性靶向干细胞来激活毛发生长周期。在对照shRNA或Pw1shRNA注射后4周获取皮肤的组织切片。
图5示出了使用Pw1shRNA、通过使用对照慢病毒或Pw1shRNA对皮肤切片进行免疫荧光染色以激活细胞周期。使用K15标记(红色)对干细胞免疫染色，使用Ki67(绿色)揭露增殖。用DAPI(蓝色)对细胞核复染色。
图6示出了PW1siRNA(Ambion，siRNA ID号s71469)诱导肌肉干细胞增殖的增加。以相同的原始密度涂铺细胞并且如通过DAPI染色(细胞核)示出。
具体实施方式
本发明人现已示出干扰PW1功能会引起干细胞增殖。
本发明因此提供沉默PW1的用于活化干细胞的干扰RNA。
Pw1/Peg3
Pw1/Peg3(“父本表达的基因3”)在本文中指定为“Pw1”，是母本印记基因，其主要在胚胎形成期间并且在小鼠的成体卵巢、睾丸、肌肉和脑部表达。在本发明中，术语“Pw1”或“Peg3”是指小鼠Pw1基因或在任何其它动物物种、具体地在人中的直系同源基因。
哺乳动物印记调节生长和亲本培育行为的建立，但是其出现的详细分子机制还不完全知道。Pw1会介导体外细胞应激和促存活(pro-survival)路径，以及体内肌肉萎缩和干细胞数目。Kim等,(2000)将小鼠Pw1/Peg3基因绘图到近端染色体7，并且确定所述基因含有13个外显子，其中最后4个来源于祖先的ZIM2基因(Kim等,2000)。起始密码子位于外显子3中。因为在哺乳动物中印记通常是保守的，并且印记域通常涵盖几个邻接基因，所以Peg3的人对应物的表达模式和染色体环境受到关注。Kim等,(1997)将人PW1/PEG3基因定位在19q的端粒近端的约2Mb处，在已知携带大量串联集簇的含Kruppel型锌指(ZNF)的基因的区域内(Kim等,1997)。
将由Pw1基因编码的蛋白质命名为“PW1蛋白”。这种蛋白质在进化期间一直是保守的。估计在人和小鼠之间，PW1蛋白的序列同一性为63.9％。在本发明中，术语“PW1”是指小鼠Pw1蛋白或在任何其它动物物种、具体地在人中的直系同源基因。
将小鼠PW1蛋白序列示为SEQ ID NO:1(也可作为NP_032843.2得到)，并且将人PW1蛋白序列示为SEQ ID NO:2(也可作为NP_001139656.1、NP_001139658.1、NP_001139659.1、NP_006201.1得到)。
RNA干扰：
可以使用各种RNA干扰手段。在本发明的上下文中，RNA干扰(RNAi)包括小核酸分子，如微RNA(miRNA)、短发夹RNA(shRNA)和/或短或小的干扰性RNA(siRNA)。进一步涵盖反义RNA。
能够介导RNA干扰的优选分子将目标蛋白质表达有利地下调至少60％、优选地至少70％、优选地至少80％、甚至更优选至少90％。
优选地，以合成RNA双链体(ds-siRNA)的形式使用siRNA，即siRNA是包含与目标同源的有义链以及结合于目标mRN的反义链的siRNA双链体。然而，单链siRNA(ss-siRNA)也有用。
根据本发明的siRNA是具有通过沃森-克里克键成对的有义和反义链的小的双链RNA，并且其中有义链的序列是由PW1/PEG3的核苷酸序列的14至30个、有利地15至29个、16至28个、17至27个、18至25个、18至23个、或18至21个邻接核苷酸的片段组成，或包含所述片段。
已知具有由30％至50％鸟嘌呤和胞嘧啶组成的序列的siRNA比具有较高比例的鸟嘌呤和胞嘧啶的序列更有效。因此，根据本发明的siRNA有利地具有由30％至50％鸟嘌呤和胞嘧啶组成的序列。
应了解，根据本发明的siRNA可同等地包含两个互补性单链RNA分子，或其中两个互补性部分通过沃森-克里克键而成对并且在一侧通过发夹型结构共价连接的单链RNA分子(其是更具体地称为“短发夹RNA”的shRNA)，可将其视为siRNA的子类。在整个说明书中，除非另有规定，否则术语siRNA应以广义理解，包括shRNA。在一个有利的实施方式中，根据本发明的siRNA包含两个互补性单链RNA分子。在另一有利的实施方式中，根据本发明的siRNA包含以下或由以下组成：单链RNA的单个分子，其中两个互补性部分通过沃森-克里克键成对并且在一侧通过发夹型结构共价连接，也就是说，其为shRNA。
siRNA中所含的目标核苷酸序列和与其互补的序列优选地彼此完全互补。然而，在除siRNA中央以外的位置存在碱基突变下，RNA干扰的裂解活性不会完全损失，而可保持部分活性。另一方面，在siRNA中心的碱基突变具有重要影响，其重要程度为可极端地降低RNA干扰的mRNA裂解活性。
此外，具体地当根据本发明的siRNA包含两个互补性单链RNA分子时，有义和/或反义RNA链可进一步包含2至4个核苷酸的3'悬垂片段。将本文所用的表述“2至4个核苷酸的3'悬垂片段”理解为意指在RNA双链体的至少一链中存在不与在所述链的3'远端的互补链成对的2至4个核苷酸。3'悬垂片段中使用的核苷酸可为天然核苷酸(核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸)，或修饰的核苷酸如LNA(锁核酸)，其在核糖的2'和4'位置之间包含亚甲基桥(Soutschek等,2004)。3'悬垂片段还可经历以下段落中所述的、用于根据本发明的siRNA的有义RNA链和/或反义RNA链的所有类型的化学修饰。有利地，3'悬垂片段是由2个核苷酸组成。在这种情况下，3'悬垂片段的优选序列是“TT(其中T表示脱氧胸苷)”或“UU(其中U表示尿嘧啶)”。同样有利地，根据本发明的siRNA的两个互补链都包含3'悬垂片段。在这种情况下，两个3'悬垂片段的长度和序列可相同或不同。有利地，根据本发明的siRNA的两个互补链各自都包含相同的具有序列“TT”的、2个核苷酸的3'悬垂片段。
能够特异性抑制PW1表达的反义核酸的实例包括：A)核酸，其包含：与编码PW1的mRNA(成熟mRNA或初始转录产物)的核苷酸序列互补的核苷酸序列或其具有12个碱基以上长度的部分序列；(B)包含满足以下各项的核苷酸序列的核酸：具有12个碱基以上的长度、可与作为治疗对象的动物(优选为人)的细胞中编码PW1的mRNA(成熟mRNA或初始转录产物)特异性杂交，并且在杂交状态下能够抑制向PW1多肽的转译；等。
与反义核酸中的目标mRNA杂交的部分的长度不受特别限制，只要可特异性抑制PW1表达即可；长度通常是约12个碱基以上，并且最多与mRNA(成熟mRNA或初始转录产物)的全长序列具有相同长度。考虑到杂交特异性，长度优选是约15个碱基以上、更优选地18个碱基以上。考虑到合成容易性、抗原性问题等，与目标mRNA杂交的部分的长度通常是约200个碱基以下、优选地约50个碱基以下、更优选地约30个碱基以下。因此，与目标mRNA杂交的部分的长度是例如约12至约200个碱基、优选地约15至约50个碱基、更优选地约18至约30个碱基。
反义核酸的目标核苷酸序列不受特别限制，只要可特异性阻遏或抑制PW1表达即可；序列可为PW1的mRNA(成熟mRNA或初始转录产物)的全长序列或其部分序列(例如约12个碱基以上、优选地约15个碱基以上、更优选地约18个碱基以上)，或初始转录产物的内含子部分。
与反义核酸中的目标mRNA杂交的部分的核苷酸序列根据目标序列的碱基组成而变化，并且对目标序列的互补序列具有通常为约90％以上(优选地95％以上、最优选地100％)的同一性，以便能够在生理条件下与PW1的mRNA杂交。
此外，反义核酸可以不仅能够与PW1的mRNA或初始转录产物杂化以抑制转译，而且能够结合于作为双链DNA的PW1基因以形成三链体并且抑制向mRNA的转录。
此外，根据本发明的干扰RNA如siRNA或反义RNA，有义RNA链和/或反义RNA链还可在其糖部分、其核碱基部分或其核苷酸间骨架中包含至少一种化学修饰。这些修饰可值得注意地使得能够抑制体内核酸酶对siRNA的分解。将可提高根据本发明的siRNA的稳定性和体内生物利用率的所有化学修饰都因此包括在本发明的范围中。在对糖部分的有利修饰中，尤其可提及在以下位置进行的修饰：核糖的2'位置，如2'-脱氧、2'-氟代、2'-氨基、2'-硫基或2'-O-烷基，以及特别地2'-O-甲基，置换核糖核苷酸上的正常2'-OH基团，或在核糖的2'和4'位置之间存在亚甲基桥(LNA)。对于核碱基，可能使用修饰碱基，尤其如5-溴代-尿苷、5-碘代-尿苷、N.sup.3-甲基-尿苷、2,6-二氨基嘌呤(DAP)、5-甲基-2'-脱氧胞苷、5-(1-丙炔基)-2'-脱氧-尿苷(pdU)、5-(1-丙炔基)-2'-脱氧胞苷(pdC)或与胆固醇连接的碱基。最后，核苷酸间骨架的有利修饰包括由硫代磷酸酯、甲基膦酸酯、磷二酰胺(phosphorodiamidate)基置换骨架中的磷酸二酯基，或使用由用肽键连接的N-(2-氨基乙基)-甘氨酸单元组成的骨架(PNA，肽核酸)。明显可将各种修饰(碱基、糖、骨架)组合得到修饰的吗啉代型核酸(碱基固定于吗啉环并且通过磷二酰胺基连接)或修饰的PNA(碱基固定于用肽键连接的N-(2-氨基乙基)-甘氨酸单元)。
干扰RNA如siRNA根据本发明是“分离的”，这是指其不处于天然状态，而是已经通过涉及人干预的任何手段而获得。值得注意地，可能已经通过纯化已经存在的siRNA、通过化学合成、通过聚合酶链反应(PCR)扩增期望的核苷酸序列，或通过重组合成获得了根据本发明的siRNA。许多公司也提供定制的siRNA合成，值得注意的公司如Eurogentec、Ambion、Dharmacon或Qiagen。
可通过以下步骤制备能够特异性抑制PW1表达的siRNA和反义核酸：根据PW1的mRNA序列或染色体DNA序列确定目标序列，并且使用可商购获得的自动化DNA/RNA合成仪(Applied Biosystems、Beckman等)合成与其与互补的核苷酸序列。可通过以下步骤制备siRNA：使用自动化DNA/RNA合成仪分别合成有义链和反义链，并且在适当的退火缓冲液中在约90℃至约95℃下使所述链变性约1分钟，并然后在约30℃至70℃下进行退火约1至约8小时。可通过以下步骤制备更长的双链聚核苷酸：以彼此重叠的方式合成互补性寡核苷酸链、将所述链退火，并然后用连接酶进行连接。可例如从Ambion商购获得设计成沉默PW1基因的siRNA寡核苷酸。
在一个优选实施方式中，本发明利用了示出选自SEQ ID NO:3至SEQ ID NO:8的核苷酸序列的优选地呈双链体形式的siRNA。
可通过DICER将相应的shRNA裂解以合成或制造siRNA分子。可从包含相应核酸序列的载体制造这些shRNA。
本领域任何技术人员可容易地设计沉默PW1的其它siRNA序列。
下文示出感兴趣的siRNA的实例：
下文示出感兴趣的shRNA的实例：
SIGMA
shRNA3'utr
TRCN0000075393  CCGGCCTCTTAGATAGTCCTGTGAACTCGAGTTCACAGGACTATC
                TAAGAGGTTTTTG(SEQ ID NO:9)
TRCN0000075395  CCGGCCCTAATGACAAGCTGAAATTCTCGAGAATTTCAGCTTGTC
                ATTAGGGTTTTTG(SEQ ID NO:10)
TRCN0000075396  CCGGGCCGAGTCATACCAGAATGTTCTCGAGAACATTCTGGTATG
                ACTCGGCTTTTTG(SEQ ID NO:11)
TRCN0000075397  CCGGCCACTGTACGAATGCAAAGATCTCGAGATCTTTGCATTCG
                TACAGTGGTTTTTG(SEQ ID NO:12)
TRCN0000075394  CCGGCCTCCATTTATATCCCAGATACTCGAGTATCTGGGATATAA
                ATGGAGGTTTTTG(SEQ ID NO:13)
序列CTGTACGAATGCAAAGAT(SEQ ID NO:14)是SEQ ID NO:12内对PW1具有特异性的部分。
载体：
在优选实施方式中，由表达载体携带干扰RNA。在表达载体中，上述siRNA或反义核酸或编码其的核酸(优选为DNA)已经被可操作连接到能够在哺乳动物(优选为人)的细胞中显示启动子活性的启动子。
可使用能够在作为施用对象的哺乳动物的细胞中起作用的任何启动子。适用的启动子包括pol I启动子、pol II启动子、pol III启动子等。具体地，使用病毒启动子如SV40源性初始启动子和巨细胞病毒LTR、哺乳动物结构蛋白基因启动子如β-肌动蛋白基因启动子、RNA启动子如tRNA启动子等。更具体地，可以使用H1的人启动子，具体地用于控制shRNA表达。
当意图表达siRNA时，优选将pol III启动子用作启动子。pol III启动子的实例包括U6启动子、H1启动子、tRNA启动子等。
已知至少三种体内产生RNAi介导性基因沉默的方法，并且其可用于本发明的情形中(Dykxhoorn等,2003中有回顾)：
可从质粒或病毒载体使用以下各项以体内表达具有单一序列特异性的siRNA：
-表达单个的siRNA有义链和反义链的串联聚合酶III启动子，所述siRNA有义链和反义链以反式结合；
-表达短发夹RNA(shRNA)的单个聚合酶III启动子；
-表达由DICER处理而得到成熟miRNA的不完全双链体发夹RNA(前miRNA)的单个聚合酶II启动子。
表达载体优选含有转录终止信号，即终止子区域，位于上述聚核苷酸或其编码核酸的下游。此外，可进一步包括用于选择转化细胞的选择标记基因(例如赋予对药物如四环素、氨苄西林和卡那霉素的抗性的基因、补偿营养缺陷型突变的基因，等)。虽然对适用于本发明的表达载体的选择没有限制，但是适用于向哺乳动物如人施用的载体包括病毒载体如逆转录病毒、慢病毒、腺病毒和腺相关病毒。腺病毒特别地具有如基因转移效率极高并且可转移到非分裂细胞的优势。因为将转基因整合到宿主染色体中是极罕见的，所以基因表达然而是暂时的并且通常仅持续约4周。
考虑到治疗效果的持久性，使用腺相关病毒也是优选的，所述腺相关病毒提供相对高的基因转移效率，其也可转移到非分裂细胞，并且其可通过反向末端重复序列(ITR)整合到染色体中。
在优选实施方式中，干扰RNA优选是由在包装细胞系中产生慢病毒转导颗粒的慢病毒载体携带的shRNA。
活化干细胞
本发明的干扰RNA适用于活化成体干细胞，即引发或增强其增殖。
在本发明的上下文中，术语“成体干细胞”包括诱导型多能干细胞，其以人工方式来源于非多能细胞，典型地成体体细胞。
细胞可以属于任何组织，包括血液、骨髓、造血系统、皮肤、毛囊、肌肉、神经系统、心脏、肠、胸腺、胰腺、睾丸、眼睛、肾、肝、肺、脾、舌、骨、牙髓、乳房、卵巢、子宫和胎盘。
可以体外或体内使用本发明的干扰RNA。
在一个实施方式中，可以体外使用所述RNA以繁殖干细胞用于再生疗法。干细胞可以体外扩增并然后直接施用于患者。
在另一实施方式中，可以将干扰RNA施用于患者以体内繁殖干细胞。
在组织修复方面，本发明的干扰RNA受到关注，其可适合用于治疗神经退化性疾病，包括中风和阿茲海默氏病，用于脊髓损伤以及心血管疾病，具体地心肌梗塞。再生医学的另一领域是皮肤修复，具体地烧伤或遗传性疾病的皮肤修复。其可能特别地用于预防衰老或减缓细胞衰老，特别是皮肤衰老。本发明的干扰RNA还可能适用于促进毛发生长。
患者或对象可为任何人或非人动物、优选地哺乳动物，包括啮齿动物、绵羊、山羊、牛、马、狗、猫、灵长类动物。
药物组合物或美容组合物：
本发明进一步涉及用作药物或化妆品的根据本发明的干扰RNA。
本发明的另一目的是包含至少一种根据本发明的干扰RNA以及可接受的载体的组合物。将本文所用的术语“可接受的载体”理解为指本领域技术人员已知的在美容术领域或药理学上可接受的载体。
涵盖任何常规的施用途径，包括经口、经肺、腹膜内(ip)、静脉内(iv)、肌肉内(im)、皮下(sc)、透皮、经口腔、经鼻、舌下、经眼、经直肠和经阴道。另外，可以设想向期望成体干细胞在那里增殖的组织进行直接施用。通过本领域已知方法配制干扰RNA。可将用于经口、经直肠、胃肠外或局部应用的组合物制备成片剂、囊剂、颗粒、栓剂、植入物(implantage)、无菌可注射水性或油性溶液、悬液或乳液、气雾剂、油膏、乳膏或凝胶、缓释制剂或缓释植入物(implantate)的形式。还可以通过可植入计量系统或通过输注施用干扰RNA。
在具体实施方式中，根据本发明的组合物意图用于皮肤或毛发的美容性处理和/或治疗性治疗，因此有利地进行局部施用。
可以将根据本发明的用于局部施用的组合物配制成惯用于局部施用的任何格林制剂形式(galenic form)，如水溶液、白色或着色乳膏、软膏剂、乳剂、洗剂、凝胶、油膏、精华、糊剂、水包油或油包水乳液，或泡沫的形式。可能将其以气雾剂形式施用于皮肤。其还可能以粉状或非粉状的固体形式，例如以条状物的形式存在。当意图施用于毛发或头皮时，组合物可以呈例如洗发精、洗剂、凝胶或泡沫的形式。
对本领域技术人员显而易见的是，提供治疗效果的任何施用剂量或频率都适用于本发明。例如，治疗有效量可为体外约10nM至100nM以及体内约0.01μg/g组织至约25μg/g组织。
另外，可采用标准的药物方法以控制作用持续时间。其为本领域所熟知并且包括控制释放制剂并且可包括适当的大分子，例如聚合物、聚酯、聚氨基酸、聚乙烯、吡咯烷酮、乙烯乙酸乙烯酯、甲基纤维素、羧甲基纤维素或硫酸鱼精蛋白。
药物组合物可以进一步含有用于核酸转移以促进核酸转移到细胞中的试剂。
适用的核酸转移试剂包括阳离子脂质如Lipofectin、Lipofectamine、Lipofectamine RNAiMAX、Invivofectamine、DOGS(Transfectam)、DOPE、DOTAP、DDAB、DHDEAB、HDEAB、聚凝胺和聚(乙烯亚胺)(PEI)。当将逆转录病毒用作表达载体时，可将重组人纤维连接蛋白(retronectin)、纤连蛋白、聚凝胺等用作转移试剂。
使用电穿孔、压力、机械按摩等，物理技术也可增加特定组织位点处的RNA摄取。RNA的末端修饰可提升其对血清和组织中核酸外切酶降解的抗性。此外，用合适的配体修饰可实现靶向递送。除传统的阳离子脂质体和阳离子聚合物系统以外，已经为RNA开发出几种类型的用于药物递送的载体。还与RNA递送用载体组合使用超声波和微泡或脂质体气泡。具有独特特性的新型材料如碳纳米管、金纳米粒子和金纳米棒已经引起关注以作为RNA的创新性载体。关于最新的回顾，参见Higuchi等,2010。
根据本发明的组合物可进一步包含任何种类的本领域技术人员已知的媒介物，从而使得可能改善根据本发明的干扰RNA的递送和生物利用率。
可与干扰RNA一起使用的具体媒介物尤其包含能够穿过细胞膜的脂质体和肽(称为CPP，即“细胞渗透性肽”)。将本文所用的表述CPP理解成指能够内在化并然后到达活细胞的细胞质和/或核区室的肽。这些CPP的实例包括肽Penetratine、Transportan、Tat、MAP和SynB1。其它载体可以用聚合纳米粒子或微粒、脂质体和胶束的形式使用(Allen等,2004；Farokhzad等,2009)。
在具体实施方式中，将RNA配制于纳米粒子中。一般地说，基于纳米粒子的递送系统是将siRNA压缩到质量为大约100,000,000道尔顿的最优尺寸范围为数百纳米的粒子中的递送试剂。主要的包装策略在于利用siRNA骨架的阴离子电荷作为与递送试剂的静电相互作用的支架。在体外细胞处理或体内全身性施用之前，将可有利地与胆固醇组合的阳离子脂质、阳离子聚合物和阳离子肽用于接合带负电的磷酸二酯骨架并且将大量的RNA分子组织成纳米颗粒结构(Whitehead等,2009。也参见例如WO2010/080724；US2006/0240554和US2008/0020058)。
除形成干扰RNA纳米粒子需要的阳离子模体以外，将附加模体应用于递送试剂。可使多种脂质、细胞靶向配体、抗体和细胞穿透肽等共价连接于阳离子包装模体，因此所形成的所得纳米粒子将具有细胞递送性质(Whitehead等,2009)。
也可将天然微粒如病原体(细菌、病毒载体系统)和人细胞用于递送核酸片段(关于回顾，参见Yoo等,2011)。
其它团队已经开发出适用的聚合物药物偶联物，其允许特异性细胞靶向并且提供剂量控制、高的释放效率和低的毒性，如基于透明质酸(HA)的可注射水凝胶(Oommen等,2009)。
本发明还涉及根据本发明的至少一种干扰RNA或组合物作为活化成体干细胞的美容试剂或药物试剂的用途。
可使用干扰RNA以体内或体外成体活化干细胞。
当治疗具体疾病时，当期望干细胞活化或扩增时，干扰RNA可能适用。这些疾病可以含可由再生疗法治疗的疾病，包括心力衰竭、骨髓疾病、皮肤病、烧伤、退行性疾病如糖尿病、阿茲海默氏病、帕金森氏病等以及癌症。
因此描述了一种通过施用至少一种本文所述的干扰RNA以活化成体干细胞来治疗这些疾病的方法。
本发明还涉及一种用于对抗皮肤衰老或脱发的美容处理方法，其包括优选地局部施用根据本发明的组合物。
实施例和图说明本发明，而不限制其范围。
实施例
实施例1：使用干扰RNA减少PW1蛋白
1.1.使用表达shRNA的慢病毒减少PW1蛋白
本发明人已经使用由Vectalys提供，并且表达shRNA(SEQ ID NO:12，对应于以下来自Sigma的参考：TRCN0000075397NM_008817.2-4305s1c1)的慢病毒颗粒，所述shRNA有效沉默PW1蛋白表达。图1中示出慢病毒颗粒的图谱。
已经用成体突起源性皮肤干细胞获得结果。对感染这种Pw1shRNA慢病毒或GFP对照慢病毒的这些表皮干细胞进行免疫荧光实验(图2)。在37℃下在50μl去除血清的生长培养基中，用Pw1shRNA(MOI200)感染20,000个新鲜分离的来源于成体突起的皮肤干细胞，持续30分钟。将细胞涂铺在含有血清的生长培养基中并且进行免疫荧光实验。
新鲜收集的皮肤干细胞的Pw1shRNA慢病毒感染实现了较高频率的无性系群落形成并且所得的群落较大。当直接分析群落时，观察到PW1的表达水平降低。
这些结果证明干扰RNA造成的PW1表达减小会通过刺激细胞增殖‘动员’干细胞。
1.2.使用siRNA以减少PW1蛋白
图3示出了用显示SEQ ID NO:3作为有义序列的siRNA s71469(Ambion)转染的神经干细胞中PW1蛋白的减少。
在第0天以20000个细胞/500μl的密度，在由invitrogen提供的没有抗生素的OPTIMEM1培养基中涂铺细胞。在第1天，使用正向转染：Lipofectamine RNAiMAX invitrogen，按照制造商说明书转染细胞。使用20nM或50nM siRNA。50nM允许在转染3天之后下调60％。
实施例2：激活毛发生长周期
通过在真皮和表皮之间局部注射Pw1shRNA(100μl含病毒400MOI的PBS)，在出生后(P21)的野生型小鼠的背部下调PW1。在感染之后7天，收集在注射点周围的2cm2并且通过组织学进行分析。用慢病毒对照物(杂乱)进行相同的实验。注射PW1shRNA使得毛囊干细胞得到明显的活化(参见图4)。效果具有高度特异性，以使构成组织的大部分的非干细胞不受影响。
实施例3：活化皮肤干细胞
本发明人然后体内试验了Pw1shRNA慢病毒直接对小鼠皮肤的影响。在21天龄野生型小鼠的背部进行PW1shRNA(在PBS中MOI300)的皮内感染。在4周之后，观察到小囊的明显活化，其对应于如通过使分裂中细胞变亮的ki67检测的细胞周期的特异性激活(图5)。效果具有高度特异性并且仅干细胞(表达PW1)和其直接的子代得到动员。
实施例4：肌肉干细胞增的增殖
本发明人已经进一步示出了针对PW1的siRNA使得用PW1siRNA转染的小鼠肌肉干细胞中的PW1明显下调，如在图6中通过使用免疫荧光(PW1抗体)检测不到的信号所证明。用PW1siRNA转染导致增殖水平提高，从而引起细胞密度增大。
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Claims (9)

1.一种沉默PW1/PEG3的用于体内活化成体干细胞的干扰RNA。
2.根据权利要求1所述的沉默PW1/PEG3的用于活化成体干细胞的干扰RNA，其中所述干扰RNA选自siRNA、shRNA、反义RNA和miRNA。
3.根据权利要求1或2所述的用于活化成体干细胞的干扰RNA，其为siRNA，所述siRNA包含一起形成RNA双链体的有义RNA链和互补性反义RNA链，其中所述有义RNA链包含序列SEQ ID NO:3或由序列SEQ ID NO:3组成。
4.根据权利要求1或2所述的用于活化成体干细胞的干扰RNA，其为shRNA。
5.根据权利要求4所述的用于活化成体干细胞的干扰RNA，其为包含序列SEQ ID NO:14或由序列SEQ ID NO:14组成的shRNA。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的用于活化成体干细胞的干扰RNA，其用于治疗罹患心力衰竭、骨髓疾病、皮肤病、烧伤、退行性疾病如糖尿病、阿茲海默氏病、帕金森氏病以及癌症的患者。
7.一种在对象中对抗皮肤衰老的方法，所述方法包括向所述对象施用如权利要求1至5中任一项所述的沉默PW1/PEG3的干扰RNA。
8.一种在对象中预防脱发或促进毛发生长的方法，所述方法包括向所述对象施用如权利要求1至5中任一项所述的沉默PW1/PEG3的干扰RNA。
9.一种活化成体干细胞的体外方法，所述方法包括使成体干细胞或包含成体干细胞的组织与如权利要求1至5中任一项所述的沉默PW1/PEG3的干扰RNA接触。
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