KR20170120617A - 수포성 표피 박리증 치료를 위한 col7a1 엑손 73에 대응하는 올리고뉴클레오타이드 - Google Patents

수포성 표피 박리증 치료를 위한 col7a1 엑손 73에 대응하는 올리고뉴클레오타이드 Download PDF

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프로큐알 테라퓨틱스 Ⅱ 비.브이.
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Abstract

인간 COL7A1 mRNA 내로의 엑손 73 내포를 방지 또는 감소시킬 수 있는 안티센스 올리고뉴클레오티드는 다양한 방식으로 특징화된다 : (a) 올리고뉴클레오타이드의 서열은 최대 2 개의 CpG 서열을 포함하고; (b) 올리고뉴클레오타이드는 24개 이하의 뉴클레오타이드 길이를 지니며; (c) 올리고뉴클레오타이드는 엑손 73에서 (SRp40/SC35 결합 / ESE) 엘레멘트에 어닐링할 수 있다. 이들 올리고뉴클레오티드는 예를 들면 포스포로티오에이트 결합과 같은 변형된 뉴클레오사이드 결합을 지니는 올리고리보뉴클레오티드일 수 있다.

Description

수포성 표피 박리증 치료를 위한 COL7A1 엑손 73에 대응하는 올리고뉴클레오타이드 {Oligonucleotides matching COL7A1 exon 73 for epidermolysis bullosa therapy}
본 출원은 2015년 3월 11일자로 출원된 영국 특허 출원 제1504124.7호의 우선권을 주장하며, 그 전체 내용은 모든 목적으로 본 명세서 내에 참고문헌으로 통합되어 있다.
본 발명은 인간 질환의 치료에 사용하기 적합한 올리고뉴클레오타이드에 관한 것이다. 보다 상세하게는 본 발명은 이영양성 수포성 표피 박리증의 치료에 적합한 안티센스 올리고뉴클레오타이드에 관한 것이다.
수포성 표피 박리증(Epidermolysis Bullosa, EB)은 만성 취약성과 피부 및 점막의 수포로 특징되는 유전성 피부병의 그룹이다. 하위 유형에 따라 EB의 증상 범위는 매우 넓다. 피부의 약한 피부 상태에서 일반적인 합병증이 있는 매우 심각한 증상에 이르기까지 다양하다. 전 세계적으로 약 35만 명의 환자가 영향을 받고 있다. 일부 EB 형태에서는 손톱, 머리카락, 치아가 포함될 수 있다. EB의 주된 유형은 단순성 수포성 표피 박리증(EBS), 연접부 수포성 표피 박리증(JEB), 이영양성 수포성 표피 박리증(DEB) 및 킨들러 증후군(KS)을 포함한다.
이영양성 수포성 표피 박리증은 수포성 표피 박리증 환자의 약 25%를 점하며 우성 또는 열성 유전성이 있을 수 있으며 제 Ⅶ형 콜라겐(COL7A1, omim 120120)의 결함이 있다. 콜라겐 Ⅶ의 α-1 사슬을 암호화하는 COL7A1. 콜라겐 Ⅶ는 치밀판(기저막의 일부)에 대한 진피 상부의 고정 원섬유(anchoring fibril)로서 작용한다. 후-번역 변형 후 3개의 동일한 α-1 사슬은 콜라겐성 3중 나선 도메인과 함께 폴딩된다. 이어서 고정 원섬유를 형성하도록 정렬되는 역평행 이량체가 형성된다. 콜라겐 Ⅶ는 각질세포와 피부 섬유아세포에 의해 피부에서 합성된다. 이영양성 수포성 표피 박리증 질환의 심각성은 대개 기저막 영역에서의 제 Ⅶ형 콜라겐 발현량과 관련이 있다.
우성 이영양성 수포성 표피 박리증(DDEB)의 특징에는 손, 발, 팔꿈치 및 무릎에 국한되며 일반화된 수포가 포함된다. 흔한 발견으로는 흉터, 비립종, 점막 침범, 비정상적이거나 결핍된 손톱이 있다. 열성 이영양성 수포성 표피 박리증(RDEB)는 일반적으로 우성 이영양성 수포성 표피 박리증보다 더 일반화되고 심각하다. 우성 이영양성 수포성 표피 박리증의 증상 외에도 열성 이영양성 수포성 표피 박리증의 다른 흔한 증상으로는 영양 실조, 빈혈, 골다공증, 식도 협착, 성장 지연, 웨빙(webbing) 또는 손가락과 발가락의 융합(의사합지증), 근육 수축의 진전, 치아의 기형, 소구증 및 눈의 흉터 등이 있다. 편평 상피암의 위험은 이 그룹에서 크게 증가할 뿐만 아니라 전이성 편평 세포 암으로 인한 사망도 크게 증가한다.
유전자 COL7A1에는 400 가지 이상의 다른 변이가 알려져 있다. 가장 유력한 영향을 받는 엑손 중 하나(18%의 환자)는 약 40 개의 알려진 변이를 지닌 엑손 73이며 대부분 미성숙 종결 코돈(PTC)과 글리신 대체를 유도하는 과오변이 또는 변이가 가장 흔하다.
현재 DEB에 대한 치료법은 없으며 완화적 치료만 적용된다. RDEB의 심각한 형태는 사회의 의료 예산에 높은 비용을 부과하는 것이다. 드레싱 및 약물 치료의 평균 비용은 환자 당 연간 약 20만 유로이다.
프랑스 국립 보건 의료 연구원(INSERM)의 WO 2013/053819는 엑손 73을 표적으로 하는 2개의 안티센스 올리고뉴클레오타이드를 개시하고 있으며 전체 엑손이 mRNA로부터 스킵핑되게 한다. 엑손-73-결핍 mRNA는 야생형 단백질보다 짧으나 야생형 콜라겐 Ⅶa와 매우 유사한 행태를 보이는 기능성 폴리펩타이드로 번역된다. 알려진 하나의 올리고뉴클레오타이드 길이는 25 뉴클레오타이드 길이이며, 69%의 스킵핑 효율을 나타내고 다른 하나의 길이는 30 뉴클레오타이드 길이이고 93%의 스킵핑 효율을 나타낸다.
WO2013/053819에 개시된 더 긴 엑손 스킵핑 안티센스 올리고뉴클레오타이드(AON)는 만족스런 엑손 스킵핑 효율을 나타내는 것처럼 보이지만 그 길이 및 또 다른 특성으로 인간 치료용으로 상기 분자를 개발하는 것이 덜 바람직하게 보인다. 더욱이 상기 올리고뉴클레오타이드는 야생형과 엑손 73이 없는 mRNA 모두를 대표할 수 없는 중간 밴드를 생성하는 것으로 보인다. 이러한 밴드의 임상적 관련성은 알려지지 않았으나 제품의 생산은 규제 및 안전 측면에서 덜 바람직하다. 따라서 DEB를 치료하기 위한 치료법의 추가적 개선이 필요하다.
따라서, 본 발명은 상기 mRNA가 포유동물 세포에서 pre-mRNA로부터 스플라이싱에 의해 생성될 때 인간 COL7A1 mRNA 내로의 엑손 73 내포를 예방 또는 감소시킬 수 있는 안티센스 올리고뉴클레오타이드를 제공한다; (a) 올리고뉴클레오타이드의 서열은 최대 2개의 CpG 서열을 포함하고 및/또는 (b) 올리고뉴클레오타이드는 24 뉴클레오타이드 이하의 길이를 지니는 것을 특징으로 한다. 바람직하게는 올리고뉴클레오타이드는 특성 (a) 및 (b) 모두를 지닌다.
본 발명은 또한 상기 mRNA가 포유동물 세포에서 pre-mRNA로부터 스플라이싱에 의해 생성될 때, 인간 COL7A1 mRNA로의 엑손 73 내포를 예방 또는 감소시킬 수 있는 안티센스 올리고뉴클레오타이드를 제공한다. 상기 올리고뉴클레오타이드는 서열 5'-UUUCCUGG-3'(서열번호: 4)에 의해 특징화된 엑손 73 내의 엘레멘트에 어닐링(SRp40/SC35 결합 / ESE)할 수 있는 특징을 지닌다. 이 올리고뉴클레오타이드는 상기한 바와 같은 특성 (a) 및/또는 (b)를 지닐 수 있다.
본 발명의 올리고 뉴클레오티드는 유용하게는 변형된 뉴클레오사이드간 결합 예를 들면 포스포로티오에이트 결합을 지니는 올리고리보뉴클레오타이드일 수 있다. 그들은 또한 변형된 당류 예를 들면 2'-O-메틸 치환된 당 모이어티를 지닐 수 있다. 올리고뉴클레오타이드의 이들 및 다른 세부 사항은 이하에서 논의된다.
도 1은 5' 및 3' 인접 인트론 경계(서열번호: 2 및 3; 소문자)를 지니는 인간 Col7A1 엑손 73(서열번호: 1, 대문자)을 나타낸다.
도 2는 엑손 73에서 SR 단백질 결합 부위의 위치와 AON의 위치를 나타낸다.
도 3은 일차 인간 섬유아세포(HPF) 세포에서 엑손 스킵핑에 대한 lab-on-a-chip 결과를 나타낸다. 전체 길이 mRNA는 350bp 까지의 밴드를 생성하는 반면 엑손 73이 제거된 mRNA는 150bp 까지이다.
도 4는 생체 외 돼지 피부 모델을 사용하여 PBS로 제제화 된 mh-AON1의 전달에 대한 조직학적 결과를 나타낸다. 도 4a 및도 4b는 24시간 동안 손상되지 않은 피부 상에 25 μg의 mh-AON을 지니는 결과를 도시하고, 도 4c 내지 4f는 완전한 표피가 제거된 물집같은 피부 상에 25 μg의 mh-AON1을 지니는 결과를 나타낸다. C-D : 24 시간 동안 배양. E-F : 48 시간 동안 배양. mh-AON1은 염색되어 있다(적색). 스케일 바는 100 μm를 나타낸다.
도 5는 도 4에서와 동일한 생체 외 돼지 피부 모델을 사용하여 3가지 상이한 하이드로겔로 제형화된 mh-AON1의 전달의 조직학적 결과를 나타낸다. 도 5a 및 도 5b는 (A) 손상되지 않은 표피, (B) 제거된 표피를 지닌 돼지 피부를 식염수 대조군으로 처리한 결과를 나타낸다. 도 5c 및 도 5d는 (C) 손상되지 않은 표피, (D) 제거된 표피를 지닌 돼지 피부를 Flaminal™ 내에 혼합된 50 μg mh-AON1-cy5로 처리한 결과를 나타낸다. 도 5e 및 도 5f는 (E) 손상되지 않은 표피, (F) 제거된 표피를 지닌 돼지 피부를 카보머 하이드로겔 내에 혼합된 50 μg mh-AON1-cy5로 처리한 결과를 나타낸다. 도 5g 및 도 5h는 (G) 손상되지 않은 표피, (H) 제거된 표피를 지닌 돼지 피부를 히프로멜로오스 하이드로겔 내에 혼합된 50 μg mh-AON1-cy5로 처리한 결과를 나타낸다. 스케일 바는 100 μm를 나타낸다. mh-AON1은 염색되어 있다(적색).
도 6은 mh-AON1 또는 대조군 올리고로 스크램블 변이체(SCRM)와 함께 처리시킨 후 COL7A1 mRNA의 스플라이싱 생성물에 대한 lab-on-a-chip 결과를 나타낸다. 본 발명자들은 100nM 올리고뉴클레오타이드와 함께 두 가지 다른 세포 유형(HeLa와 HPF)을 24시간(좌측 4개 레인) 또는 40시간(우측 4개 레인) 동안 시험하였다. mh-AON1 또는 대조군 올리고(엑손 73 포함 및 제외)로 처리한 후에 다른 COL7A1 mRNA 생성물이 형성된다. 상이한 mRNA 생성물의 길이를 분석하였다; 350개 단편은 야생형 전체길이를 나타내며 mRNA 및 150개 뉴클레오타이드 단편은 조절된 mRNA 생성물을 나타낸다.
도 7은 ddPCR 분석을 위한 프라이머 디자인을 나타낸다. 두 가지 상이한 프라이머 조합이 PCR을 위해 설계되었다. 야생형 생성물(상부) 또는 Δexon 73 생성물(하부)을 나타낸다. 상부 열: 야생형을 위한 프라이머 쌍; 하부 열: 엑손 73이 스킵핑된 타입을 위한 프라이머 쌍.
도 8은 변형되지 않은 COL7A1 서열을 운반하는 HPF 세포 내에서 엑손 73을 포함하거나 엑손 73을 포함하지 않는 COL7A1 mRNA 전사체의 절대 정량치(총 복사의 %, y-축)를 나타낸다. 용량-응답 반응이 50, 100 및 200 nM의 mh-AON1(x-축)로 수행되었다. 결과는 올리고뉴클레오타이드로 트랜스펙션시킨 후 24시간(좌측) 또는 40시간(우측)을 나타낸다. 흑색 바는 전체 길이의 생성물을 나타내며 회색 바는 전사체 Δ73을 나타낸다.
도 9는 인간 PBMC에서 mh-AON1의 면역원성 및 면역독성 평가 결과를 나타낸다.
(a) 식염수로 처리한 인간 PBMS와 비교하여 mh-AON1(10nM, 100nM 또는 1μM) 또는 양성 대조군 폴리(I:C)(1μg/ml), CpG(10μg/ml), LPS(100ng/ml) 및 R848(1μM)로 처리한 인간 PBMS의 24시간 자극 후 배양 상등액 내의 유의미한 사이토카인 수준을 나타내는 히트 맵이다. 모든 정사각형은 각각 측정된 사이토카인에 대한 처리 조건(각각 3회 측정한 5명의 인간 공여자의 기하학적 평균)에 대해 도달된 유의미한 수준을 나타낸다.
(b) 식염수로 처리한 PBMC와 비교하여 mh-AON1 또는 양성 대조군으로 PBMC의 24시간 자극 후에 배양 상등액 내에서 IFN-α2 농도의 폴드 변화를 나타낸다. 바는 인간 공여자 당 3회 측정의 평균과 표준편차를 나타낸다(다른 회색 톤). 1의 점선은 식염수 처리된 PMBC의 상대적 사이토카인 농도를 나타낸다. Dunn의 post-hoc 시험법과 Friedman 시험법을 사용하여 (a)와 (b)의 P 값을 측정하였다.
(c) mh-AON1 또는 양성 대조군에 24시간 노출된 식염수 처리된 PBMC와 비교한 레조루핀 형광의 폴드 변화로 표시되는 생존 가능한 PBMC의 상대 수를 나타낸다. 생존 세포 평가는 CellTiter-Blue 키트를 사용하여 수행되었다. 모든 개별 생물학적 레플리케이트에 대해 폴드 변화는 측정된 RFU를 대응되는 트리플리케이트 식염수 대조군의 기하학적 평균에 대하여 정규화함으로써 계산되었다. 결과는 개별 공여자 당 3중 폴드 변화의 평균±표준편차로 나타내며 대응되는 식염수 대조군의 평균에 대하여 정규화하였다(점선). Dunnett 시험법을 이용한 반복된 측정 일원 분산 분석(one-way ANOVA)을 다중 보정(식염수와 비교)을 위해 수행하였다(* P <0.05, ** P≤ 0.01, **** P <0.001).
도 10은 인간 Ramos-Blue 세포에서 mh-AON1 및 AON73.24.5의 면역원성 및 면역독성 평가 결과를 나타낸다. (a) mh-AON1 또는 AON73.24.5(다양한 농도) 및 TLR 작용물질(agonist) 폴리(I:C)(1μg/ml), CpG(10μg/ml), LPS(100ng/ml) 및 R848(1μM)과 함께 24 시간 배양 후 Ramos-Blue 세포에서 NF-kB/AP-1 활성을 나타낸다. (b) mh-AON1, AON73.45.5 또는 양성 대조군에 24시간 노출된 후 식염수 처리된 Ramos-Blue 세포에 대해 레조루핀 형광의 폴드 변화로 표시되는 생존 가능한 Ramos-Blue 세포의 상대 수를 나타낸다.
생존 세포 평가는 CellTiter-Blue 키트를 사용하여 수행하였다. 모든 개별 생물학적 레플리케이트에 대해 배수 변화는 측정 된 O.D(a) 또는 RFU(b)를 대응되는 트리플리케이트 식염수 대조군의 기하학적 평균에 대해 정규화 함으로써 계산되었다. 결과는 트리플리케이트 폴드 변화의 평균±표준편차로 나타내며 대응되는 식염수 대조군의 평균에 대해 정규화 하였다(점선). Dunnett 시험법을 이용한 반복된 측정 일원 분산 분석(one-way ANOVA)을 다중 보정(식염수와 비교)을 위해 수행하였다(* P <0.05, ** P≤ 0.01, **** P <0.001). 반복 측정 Dunnett 테스트를 통한 일원 분산 분석(배수 변화와 비교)은 배수 변경 값에 대해 수행되었습니다. (**** P <.0001).
놀랍게도 본 발명자들은 안티센스 올리고뉴클레오타이드(AON)를 통해 인간 질병, 특히 이영양성 수포성 표피박리증(DEB)을 치료하기 위한 치료제로서의 개발 요건을 충족시킬 수 있는 안티센스 올리고뉴클레오타이드를 디자인 할 수 있음을 발견했다.
WO 2013/053819에 개시된 AON 73.3은 COL7A1 mRNA 내 엑손 73 함유물을 감소시키는데 만족스러운 것으로 간주되지만 이 올리고뉴클레오타이드는 30 뉴클레오타이드 길이로 불필요하게 길며 이는 제조 가능성, CMC 및 상품 비용의 점에서 덜 바람직하다. 더욱이, INSERM 올리고뉴클레오타이드는 면역원성 관점에서 바람직하지 않은 다수의 CpG 반복을 포함한다. CpGs, 특히 그것의 반복은 TLR9 수용체와 상호 작용하여 성능에 해를 끼치거나 및/또는 올리고뉴클레오타이드로 처리된 조직에 해를 입힐 수 있는 치료된 개체 내에서 면역 반응을 야기하는 것으로 알려져 있다.
본 발명의 바람직한 AON은 길이가 25개 이하, 바람직하게는 24개 이하이며, 엑손 73을 높은 효율로 COL7A1 mRNA에 내포시키는 것을 방지하거나 또는 적어도 감소시킬 수 있으며, 선행 기술에 비해 기능성을 방해할 수 있는 구조 또는 서열을 거의 포함하지 않는 것(바람직하게는 미포함)이다.
본 발명의 AON을 사용한 처리의 결과로서 전체 엑손 73이 결실된 단축된 mRNA는 더 짧지만 기능적인 COL Ⅶ 단백질을 번역할 수 있을 것이다.
본 발명의 AON은 HeLa 세포에서 측정했을 때 60% 이상(예를 들면 70% 이상, 이상적으로는 75% 이상 또는 80% 이상, 바람직하게는 85% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상)의 엑손 스킵핑 효율을 달성하면서 2개 이하(바람직하게는 오직 하나, 또는 전혀 없음)의 CpG 서열 및/또는 16 내지 24 뉴클레오타이드 범위 길이를 포함하는 것이다.
본 발명의 다른 실시형태에서 AON은 지금까지는 엑손 73에 인접한 5 스플라이싱 수용체 부위의 선택에 중요하지 않다고 여겨지는 8-머 모티프에 어닐링할 수 있도록 고안되었다. 이 8-머 모티프는 이전에 간과한 엑손 스플라이싱 인핸서(ESE)로 COL7A1 mRNA에 엑손 73 내포를 방지하거나 적어도 감소시킬 수 있다.
본 발명자들은 새롭게 인식된 추정 ESE의 위치를 결정하기 위해 마이크로워크 기술을 사용하여 전체 모티프 또는 모티프의 일부에 어닐링할 수 있는 AON을 이용한 서로 다른 AON을 설계하였다. 또한 이때 엑손 스킵핑이 전체적으로 소실될 때까지 이 모티브와의 오버랩을 축소시키기 위해 점진적으로 AON을 결실 절단시켰다. 이에 따라 본 발명자들은 COL7A1 mRNA에 내포된 엑손 73의 예방 또는 적어도 감소를 야기하는 탁월한 새로운 AON 표적을 형성할 수 있는 엑손 73의 5'-영역(도 1 참조)에서 5'-UUUCCUGG-3' 모티프(서열번호: 4)를 분리 확인하였다.
본 발명의 추가의 실시형태에서 마우스 및 인간 모두에서 COL7A1 mRNA에 엑손 73 내포를 효율적으로 예방하거나 또는 적어도 감소시킬 수 있는 AON을 개시한다. 이 AON(m-h AON1)은 마우스와 인간모두에서 pre-mRNA 표적과 완전히 상보적이다. 이 AON은 인간 치료용으로 개발될 수 있는 분자와 정확히 동일한 분자를 사용함으로써 마우스에서 컨셉 연구 및 독성 연구의 행동 결과를 사용할 수 있다는 장점이 있다.
본 발명에 따른 AON 중 어느 것도 인터미디어트 밴드를 생성하는 것으로 보이지 않는다. 야생형 mRNA에 상응하는 밴드 또는 엑손 73 결실 전체길이 mRNA 에 상응하는 밴드는 본 발명에 따른 AON으로 처리된 세포에서 생성된 것으로 나타난다.
본 발명에 따른 AON의 또 다른 바람직한 특성은 G-테트라드 또는 다중 G(3 또는 그 이상의 연속적인 구아노신)를 함유하지 않기 때문에 다중체 형성 및/또는 용해도와 관련된 문제점을 회피할 수 있다는 것이다.
표 1은 각각의 AON에 대해 HeLa 세포에서 엑손 73의 스킵핑 효율, 본 발명에 따른 바람직한 AON(AON1 내지 AON25 및 m-hAON1), 새로운 ESE 모티프를 확인하기 위한 마이크로워크에 사용된 AON(AON26-30), 여전히 만족스러운 엑손 스킵핑 효율을 나타내는 반면 G-테트라드와 같은 바람직하지 않은 구조를 결실시킨 ESE-모티프와 결합하는 것으로 발견된 절단 결실된 형태의 AON(AON24.1 내지 24.5)의 뉴클레오타이드 서열 및 서열번호를 나타낸다. AON에 관한 추가적 상세, 다른 세포 내에서 효율 및 선행기술의 AON과의 비교는 실시예 1에 나타내었다.
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하나의 실시형태에 따르면 올리고뉴클레오타이드 서열은 특성 (a) 및/또는 (b) 중 하나 이상을 지님을 특징으로 하는 mRNA가 포유동물 세포에서 pre-mRNA로부터 스플라이싱에 의해 생성될 때 포유동물(바람직하게는 인간) COL7A1 mRNA 내로의 엑손 73 내포를 방지 또는 감소시킬 수 있는 안티센스 올리고뉴클레오타이드를 제공하는 것이다. (a) 최대 2 개의 CpG 서열을 포함하고; 및/또는 (b) 길이가 24 개 이하인 뉴클레오타이드이다. 특성 (a)에 있어서, 올리고뉴클레오타이드는 바람직하게는 하나 이상의 CpG 서열을 포함하지 않으며 하나만을 포함할 수 있다.
다른 실시형태에 따르면 올리고뉴클레오타이드는 엑손 73 의 5' 업스트림 부분에서 서열 모티프 5'-UUUCCUGG-3'(서열번호: 4)에 어닐링할 수 있는 것을 특징으로 하는(도 1) mRNA가 포유동물 세포에서 pre-mRNA로부터 스플라이싱에 의해 생성될 때 포유동물(바람직하게는 인간) COL7A1 mRNA 내로의 엑손 73 내포를 방지 또는 감소시킬 수 있는 안티센스 올리고뉴클레오타이드를 제공하는 것이다. 이론의 근거와는 관계없이 상기 모티프는 SRp40/SC35 결합 엑손 스플라이싱 인핸서(ESP) 엘레멘트를 나타내는 것으로 추정된다.
이 실시형태에 따른 AON은 바람직하게는 올리고뉴클레오타이드 서열이 전술 한 바와 같은 특성 (a) 및/또는 (b) 중 하나 또는 둘 모두를 지니는 것을 특징으로 한다. 최적 효과를 얻기 위해 올리고뉴클레오타이드는 전체 8-머 모티프에 어닐링 되어야 한다. 60% 미만의 엑손 스킵핑 효율이 특정 시나리오에서 허용될 수 있다면, 8-머 모티프의 6 또는 7-머 대부분의 5-머 뉴클레오티드에 어닐링이 허용될 수 있다.
본 발명에 따른 또 다른 바람직한 AON는 올리고뉴클레오타이드가 하나 이하의 CpG를 포함함을 특징으로 하는 특성 (a) 및/또는 올리고뉴클레오타이드가 24-머 이하의 뉴클레오타이드 길이, 바람직하게는 12 내지 24-머 뉴클레오타이드, 더욱 바람직하게는 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 또는 24-머 뉴클레오타이드와 같은 16 내지 24-머 뉴클레오타이드, 더욱 바람직하게는 23 뉴클레오타이드 이하, 더욱 바람직하게는 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 뉴클레오타이드와 같은 16 내지 23 뉴클레오타이드임을 특징으로 하는 특성 (b)를 지니는 것이다.
본 발명의 가장 바람직한 실시형태에 따르면, 올리고뉴클레오타이드는 (a) 최대 2 개의 CpG 서열, 바람직하게는 1개 이하, 예를 들면 하나의 CpG; 및 (b) 24개 이하의 뉴클레오타이드, 바람직하게는 12 내지 24개 뉴클레오타이드, 더욱 바람직하게는 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 또는 24개 뉴클레오타이드와 같은 16 내지 24개 뉴클레오타이드, 더욱 바람직하게는 23 뉴클레오타이드 이하, 더욱 바람직하게는 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 뉴클레오타이드와 같은 16 내지 23 뉴클레오타이드;의 두 가지 특성을 모두 지니는 것이다.
본 발명에 따른 AON의 선택적 추가적 특성은 그의 서열이 3개 이상의 연속적인 구아노신의 스트레치를 지니지 않는다는 것이다.
본 발명의 바람직한 AON은 표 1에 나타난 바와 같은 뉴클레오타이드 서열 AON1, AON2, AON3, AON4, AON20, AON21, AON22, AON23, AON24, AON24.1, AON24.2, AON24.3, AON24.3, AON.24.4, AON.24.5, AON25 및 mh-AON1을 지닌다. 보다 바람직하게는 이들 올리고에 대해 모든 리보스 잔기는 2'O-메틸화되고 실질적으로 모든 뉴클레오사이드간 연결은 포스포로티오에이트이다.
본 발명의 모든 실시형태에서, "엑손 내포를 방지 또는 적어도 감소시킴" 및 "엑손 스킵핑"라는 용어는 동의어이다. COL7A1과 관련하여 "엑손 내포를 방지 또는 적어도 감소시킴" 또는 "엑손 스킵핑"은 인간 COL7A1 mRNA로부터 엑손 73(서열번호: 1 또는 이의 대립형질)을 배제하는 것으로 해석되어야 한다(도 1 참조).
엑손 스킵핑이란 용어는 본 명세서에서 엑손 스킵핑을 지니지 않는 성숙 mRNA에 존재할 수 있는 특정 엑손을 함유하지 않는 성숙한 mRNA의 세포 내에서의 유도로서 정의된다.
엑손 스킵핑은 예를 들면 스플라이싱의 생화학적 과정을 허용하는데 요구되는 스플라이스 공여체 또는 스플라이스 수용체 서열을 간섭할 수 있는 분자; 또는 성숙한 mRNA에 포함될 엑손으로서 뉴클레오타이드의 스트레치의 인식에 필요한 엑손 삽입 신호를 간섭할 수 있는 분자;를 지닌 상기 성숙한 mRNA의 pre-mRNA를 발현시키는 세포를 제공하는 것으로 달성될 수 있다. 여기에서 이와 같은 분자들을 엑손 스킵핑 분자로서 칭한다.
pre-mRNA라는 용어는 전사에 의해 세포 내에서 DNA 주형으로부터 합성되는 비-처리 또는 부분적으로 처리된 전구체 mRNA를 의미한다.
용어 "안티센스 올리고뉴클레오타이드"는 pre-mRNA 분자, hnRNA(이종 핵 RNA) 또는 mRNA 분자에서 표적 뉴클레오타이드 서열에 상보적인 뉴클레오타이드 서열을 의미하는 것으로 이해되며 따라서 그의 상응하는 목적 서열과 어닐링할 수 있다.
본 출원에 사용된 용어 "상보적"은 "완전히 상보적"및 "실질적으로 상보적"을 포함하며 이는 일반적으로 올리고뉴클레오타이드와 그의 상응하는 표적 서열 사이에 80% 이상, 바람직하게는 85% 이상의 상보성을 지닌 것이며 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상이다. 예를 들어 20개 길이 뉴클레오타이드 길이 중 그의 서열과 표적 서열 사이에서 하나의 미스매치를 지니는 올리고뉴클레오타이드에 있어서 상보성의 정도는 95%이다.
안티센스 서열의 상보성 정도는 바람직하게는 안티센스 서열을 포함하는 분자가 생리적 조건 하에서 RNA 분자 내의 표적 뉴클레오타이드 서열에 어닐링할 수 있는 안티센스 서열을 포함하는 분자이며 엑손 스킵핑을 용이하게 한다. 다른 것에 비해서 AON과 표적 서열 사이의 용융 온도 또는 Tm의 관점에서 표현된 바와 같이 특정 미스 매치가 결합 강도에 적은 영향을 미치기 때문에 특정 미스 매치는 다른 것에 비해 허용 가능하다는 것은 당업자에게 잘 알려져 있다.
특정 비-상보적 염기쌍은 사실상 미스매치보다 어느 정도까지 전체 결합을 파괴하는 "워블(wobble)"을 형성할 수 있다. AON의 길이는 또한 결합의 강도에 있어서 중요한 역할을 하며 더 긴 길이의 AON은 더 짧은 길이 AON에 비해서 높은 용융 온도를 지닌다. 또한 올리고뉴클레오타이드의 G/C 함량은 결합의 강도를 결정하는 요소이며 어떠한 길이에서도 G/C의 높은 함량은 높은 용융온도를 나타낸다.
본 발명에 의해 고려되는 핵산염기 또는 당-인산 골격의 특정 화학적 변형은 또한 결합 강도에 영향을 미칠 수 있기 때문에 상보성의 정도는 본 발명에 따른 올리고뉴클레오타이드를 설계할 때 고려되어야할 오직 하나의 요소이다.
하나의 올리고뉴클레오타이드에서 하나의 CpG 또는 다수(2개 이상)의 CpG가 존재하면 일반적으로 상기 올리고뉴클레오타이드의 증가된 면역원성과 관련이 있다(Dorn 및 Kippenberger, 2008). 이 증가된 면역원성은 치료될 조직, 즉 피부(진피 및/또는 표피)의 손상을 유도할 수 있기 때문에 바람직하지 않다.
본 발명은 수용 가능한 RNA 결합 동역학 및/또는 열역학 특성을 지니는 올리고뉴클레오타이드를 설계할 수 있게 한다. RNA 결합 동역학 및/또는 열역학 특성은 올리고뉴클레오타이드의 용융 온도(Tm; 기본 Tm과 가장 가까운 이웃 모델을 사용한 단일 가닥 RNA에 대한 올리고뉴클레오타이드 특성 계산기(www.unc.edu/~cail/biotool/oligo/index.html)를 이용하여 계산됨) 및/또는 AON-표적 엑손 복합체의 자유 에너지(RNA 구조 버전 4.5를 사용)에 의해 적어도 부분적으로 결정된다.
Tm이 너무 높으면 올리고뉴클레오타이드는 덜 특이적일 것으로 예상된다. 수용 가능한 Tm 및 자유 에너지는 올리고뉴클레오타이드의 서열, 골격의 화학적 특성(포스포디에스테르, 포스포로티오에이트, 포스포로아미데이트, 펩타이드-핵산 등), 당 모이어티의 특성(리보스, 데옥시리보스, 치환된 리보스, 분자 내 브릿지) 및 핵산염기의 화학적 변형에 의존한다. 따라서, Tm의 범위는 광범위하게 변할 수 있다.
본 발명의 하나의 실시형태에 따르면, AON으로 엑손 73의 5' 영역을 마이크로워킹 함으로써 새로운 AON이 본 발명에 따라 제공된다. 따라서 본 발명에 따른 AON을 디자인하기 위한 적합한 표적을 형성하는 신규 8 뉴클레오타이드 모티프(추정 ESE)를 확인 동정하였다.
본 발명자들에 의해 선택된 올리고의 길이는 16 내지 24 뉴클레오타이드이지만 상이한 길이도 가능하다. 표적 RNA와의 안정한 상호 작용 및 표적 서열에 대한 특이성을 허용하기에 충분한 길이를 지닌 것이 바람직하나 더욱 긴 올리고뉴클레오타이드는 높은 제조비용과 분석 측면에서 더 복잡하기 때문에 반드시 더 긴 길이가 필요한 것은 아니다.
엑손 73의 5' 영역을 엑손 스킵핑 분자를 위한 프로브로 사용함으로써 실시예에 예시된 바와 같이 엑손 스킵핑 효능에 대한 시험관 내 에세이 시험을 통해 일련의 오버랩핑 올리고뉴 클레오타이드를 제조하였다. 만족스러운 엑손 스킵핑 유효성을 수립하기 위한 AON을 제조 가능성, 면역원성 및 본 명세서 내에서 제공되는 다른 이용 기준에 기초하여 더욱 선별하였다.
반대의 전략도 가능하다. 이 전략에 따라 올리고는 제조 가능성, 면역원성 및 본 발명에 의해 제공되는 다른 유용성 기준에 기초하여 우선적으로 설계되고 이어서 엑손 스킵핑 효능을 시험한다. 상기 올리고뉴클레오타이드의 기능적 활성은 엑손 73(서열번호: 1)의 스킵핑을 특정 정도까지 유도 및/또는 적어도 부분적으로 mRNA를 포함하는 엑손 73의 생성을 감소시키는 것이 바람직하다. 따라서 야생형보다 더 짧은 기능성 콜라겐 단백질의 생성이 증가된다.
엑손 스킵핑 백분율 또는 스킵핑의 효율성은 증폭된 야생형 밴드의 농도를 결정하고 증폭된 더 짧아진(엑손 73-제거) 밴드의 농도로 나누어 계산된다. 주어진 프라이머 세트에 대하여 주어진 PCR 사이클 횟수와 100% 시간 경과 후, 증폭이 여전히 대수적 상태 내에 존재하도록 사이클 수를 제공한다. 정량화는 Bioanalyzer DNA1000 기구를 사용하여 수행한다.
본 발명에 따른 바람직한 AON은 RT-PCR 분석에 의해 측정된 바와 같이 처리되지 않은 세포와 비교하여 AON-처리된 세포에서 70% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상의 스킵핑 비율을 나타내는 것이다.
바람직하게는 서열번호: 1에 나타난 바와 같은 뉴클레오타이드 서열에 상보적인 서열을 포함하는 본 발명에 따른 AON은 상보적인 부분이 적어도 80% 이상, 바람직하게는 적어도 90% 이상, 더욱 바람직하게는 95% 이상, 가장 바람직하게는 100%인 표적 서열에 대한 상보적인 서열이다.
따라서 상보성 영역의 모든 염기가 대응 가닥의 염기와 혼성화될 수 있는 것을 절대적으로 요구하지는 않는다. 예를 들어 올리고뉴클레오타이드를 설계할 때 상보적 가닥 상의 염기와 염기쌍을 이루지 않는 잔기를 통합시킬 수 있다. 미스 매치는 어느 정도까지는 허용될 수 있으며 세포 내 여건에 따라 뉴클레오타이드의 스트레치가 상보적인 부분에 충분히 혼성화될 수 있다.
이러한 맥락에서 '충분히'는 본 발명에 따른 AON이 엑손 73의 엑손 스킵핑을 유도할 수 있다는 것을 의미한다. 목적 엑손을 스킵핑하는 것은 RT-PCR에 의해 편리하게 평가될 수 있다. 상보적 영역은 결합될 때 pre-mRNA 내의 엑손에 특이성을 지니도록 설계하는 것이 바람직하다.
이러한 특이성은 시스템의 다른 (pre-) mRNA 분자의 실제 서열에 의존하기 때문에 다양한 길이의 상보적인 영역으로 생성될 수 있다. 올리고뉴클레오타이드가 하나 이상의 다른 pre-mRNA 분자와 혼성화할 수 있는 가능성은 올리고뉴클레오타이드의 크기가 증가함에 따라 감소한다. 또한 제조 가능성, 정제 및/또는 분석 문제를 야기시킬 수 있도록 너무 긴 길이를 지니지 않아야 한다.
상보성 영역에서 미스 매치를 포함하지만 pre-mRNA 내의 표적화 영역에 혼성화 및/또는 결합하는 능력을 보유하는 올리고뉴클레오타이드가 본 발명에서 사용될 수 있음은 명백하다. 그러나 적어도 상보적 부분은 미스매치를 포함하지 않는 것이 바람직하며 이는 하나 이상의 상보적 영역에서 이러한 미스매치를 지니는 뉴클레오타이드보다 높은 효율성 및 높은 특이성을 지니기 때문이다. 보다 높은 혼성화 강도(즉 대응 가닥과의 상호작용의 수를 증가시킴)는 시스템의 스플라이싱 기작을 저해하는 프로세스를 증가시키는데 바람직한 것으로 생각된다. 바람직하게는 상보성은 90% 내지 100%이다. 일반적으로 이는 20개 뉴클레오타이드의 올리고뉴클레오타이드에서 1 또는 2개의 미스매치를 허용하는 것이다.
본 발명의 엑손 스킵핑 분자는 바람직하게는 서열번호: 1에 상보적인 (안티센스) 올리고뉴클레오타이드이다.
바람직하게는 올리고뉴클레오타이드의 상보적인 부분의 길이는 올리고뉴클레오타이드의 길이와 동일하며, 이는 표적 RNA와 염기쌍을 형성하지 않는 올리고의 5' 또는 3' 말단이 존재하지 않음을 의미한다. 따라서 본 발명의 올리고뉴클레오타이드의 바람직한 길이는 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 또는 24 개의 뉴클레오타이드와 같은 24-머 뉴클레오티드 또는 그 이하이다.
16 내지 24 개의 뉴클레오타이드 길이를 갖는 AON으로 특히 우수한 결과가 얻어졌다.
본 발명에 따른 엑손 스킵핑 분자는 하기에서 상세하게 설명하는 바와 같이 하나 이상의 DNA 잔기(결과적으로 RNA "u" 잔기는 DNA 대응관계로서 "t" 잔기가 된다), 또는 하나 이상의 RNA 잔기, 및/또는 하나 이상의 뉴클레오타이드 유사체 또는 균등물을 함유할 수 있다. 서열번호: 5~35 및 서열번호: 39~43은 RNA 서열이나 본 발명은 또한 이들 각각 서열의 DNA 형태, 또한 이들 서열의 DNA/RNA 혼성체를 포함한다.
본 발명의 엑손 스킵핑 분자는 뉴클레아제 내성을 증가시키거나 및/또는 목적 서열에 대한 안티센스 올리고뉴클레오타이드의 친화성을 증가시키기 위해 변형된 하나 이상의 잔기를 포함하는 것이 바람직하다. 따라서 바람직한 실시형태에서 안티센스 뉴클레오타이드 서열은 적어도 하나의 뉴클레오타이드 유사체 또는 균등물을 포함하며, 여기서 뉴클레오티드 유사체 또는 균등물은 변형된 염기 및/또는 변형된 골격 및/또는 비-천연 인터뉴클레오사이드 결합 또는 이들의 조합을 포함한다.
바람직한 실시형태에서 뉴클레오타이드 유사체 또는 균등물은 변형된 골격을 포함한다. 이러한 골격의 예는 모르폴리노 골격, 카바메이트 골격, 실록산 골격, 설파이드, 설폭사이드 및 설폰 골격, 포름아세틸 및 티오포름아세틸 골격, 메틸렌포름아세틸 골격, 리보아세틸 골격, 알켄 함유 골격, 설파메이트, 설포네이트 및 설폰아미드 골격, 메틸렌이미노 및 메틸렌히드라지노 골격 및 아미드 골격을 들 수 있다.
포스포로디아미데이트 모르폴리노 올리고머는 이전에 안티센스 작용제로 연구된 변형된 골격 올리고뉴클레오타이드이다. 모르폴리노 올리고뉴클레오타이드는 DNA의 데옥시리보스 당이 6원 고리로 대체되고 포스포디에스테르 결합이 포스포로디아미데이트 결합으로 대체된 전하를 지니지 않는 골격을 지닌다. 모르폴리노 올리고뉴클레오타이드는 효소 분해에 내성을 지니며 RNase H를 활성화시키는 것보다는 번역을 정지시키거나 pre-mRNA 스플라이싱을 간섭함으로써 안티센스 작용제로 기능하는 것으로 보인다.
모르폴리노 올리고뉴클레오타이드는 세포막을 물리적으로 파괴하는 방법으로 조직 배양 세포에 성공적으로 전달되었으며, 이러한 몇 가지 방법을 비교한 한 연구는 스크랩(scrape) 로딩이 가장 효율적인 전달 방법이라는 것을 발견하였다. 그러나 모르폴리노 골격은 전하를 지니지 않기 때문에 양이온성 지질은 세포에서 모르폴리노 올리고뉴클레오타이드 흡수의 효과적인 매개자가 아니다.
본 발명에 실시형태에 있어서, 단사슬 알킬 또는 시클로알킬 인터뉴클레오사이드 결합, 혼성 헤테로 원자 및 알킬 또는 시클로알킬 인터뉴클레오사이드 결합, 또는 하나 또는 그 이상의 단사슬 헤테로 원자 또는 헤테로사이클릭 뉴클레오사이드 결합으로 형성된 결합과 같은 골격 내의 잔기 사이의 결합은 인 원자를 포함하지 않는 것이 바람직하다.
바람직한 뉴클레오타이드 유사체 또는 균등물은 변형된 폴리아미드 골격을 지니는 펩타이드 핵산(PNA)을 포함한다(Nielsen 등, (1991) Science 254, 1497-1500). PNA 기반 분자는 염기-쌍 인식의 관점에서 DNA 분자의 진정한 모방품(mimic)이다. PNA의 골격은 펩타이드 결합에 의해 연결된 N-(2-아미노에틸)-글리신 단위로 구성되며, 핵산염기는 메틸렌 카르보닐 결합에 의해 골격에 연결된다.
대안적인 골격은 1-탄소 연장된 피롤리딘 PNA 단량체를 포함한다(Govindaraju 및 Kumar (2005) Chem. Commun, 495-497). PNA 분자의 골격은 전하를 지니는 인산염 그룹을 포함하지 않기 때문에 PNA-RNA 혼성화는 각각 RNA-RNA 또는 RNA-DNA 혼성화보다 일반적으로 안정하다(Egholm 등, (1993) Nature 365, 566-568).
본 발명의 또 다른 실시형태에 있어서, 골격은 리보오스 또는 데옥시리보스 당이 6-원 모르폴리노 고리로 치환된 모르폴리노 뉴클레오타이드 유사체 또는 균등물을 포함하는 것이다. 가장 바람직한 뉴클레오타이드 유사체 또는 균등물은 리보스 또는 데옥시리보스 당이 6-원 모르폴리노 고리로 치환되고 인접한 모르폴리노 고리 사이의 음이온성 포스포디에스테르 결합이 비이온성 포스포로디아미데이트 결합으로 대체된 포스포로디아미데이트 모르폴리노 올리고머(PMO)를 포함한다.
또 다른 실시형태에서, 본 발명의 뉴클레오타이드 유사체 또는 균등물은 포스포디에스테르 결합에서 비-가교 산소 중 하나의 치환을 포함한다. 이 변형은 염기쌍을 약간 불안정하게 만들지만 뉴클레아제 분해에 대한 상당한 저항성을 부여한다.
바람직한 뉴클레오타이드 유사체 또는 균등물은 포스포로티오에이트, 키랄 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트, 포스포트리에스테르, 아미노알킬포스포트리에스테르, H-포스포네이트, 3'-알킬렌 포스포네이트, 5'-알킬렌 포스포네이트 및 키랄 포스포네이트를 포함하는 메틸 및 다른 알킬 포스포네이트, 포스피네이트, 3'-아미노포스포르아미데이트 및 아미노알킬포스포르아미데이트를 포함하는 포스포르아미데이트, 티오노포스포르아미데이트, 티오노알킬포스포네이트, 티오노알킬포스포트리에스테르, 셀레노포스페이트 또는 보라노포스페이트를 포함한다.
본 발명의 더욱 바람직한 뉴클레오타이드 유사체 또는 균등물은 -OH와 같이 2', 3' 및/또는 5' 위치에서 1치환 또는 2치환된 하나 이상의 당 모이어티; -F; 치환 또는 비치환된 하나 이상의 헤테로원자에 의해 방해될 수 있는 선형 또는 분지형 저급(C1-C10) 알킬, 알케닐, 알키닐, 알크아릴, 알릴 또는 아르알킬; O-, S- 또는 N-알킬; O-, S- 또는 N-알케닐; O-, S- 또는 N-알키닐; O-, S- 또는 N-알릴; O-알킬-O-알킬, -메톡시, -아미노프로폭시; 메톡시에톡시; -디메틸아미노옥시에톡시; 및 -디메틸아미노에톡시에톡시 등을 포함한다.
당 모이어티는 퓨라노스 또는 이의 유도체, 또는 데옥시라노스 또는 이의 유도체, 바람직하게는 리보스 또는 이의 유도체, 또는 데옥시리보스 또는 유도체일 수 있다.
바람직한 유도체화 당 모이어티는 2'-탄소 원자가 당 고리의 3 ' 또는 4' 탄소 원자에 연결되어 바이사이클릭 당 모이어티를 형성하는 잠금 핵산(Locked Nucleic Acid, LNA)을 포함한다. 바람직한 LNA는 2'-O, 4'-C-에틸렌 가교 핵산을 포함한다(Morita 등, 2001. Nucleic Acid Res Supplement No. 1 : 241-242). 이러한 치환은 뉴클레오타이드 유사체 또는 균등물에 RNase H 및 뉴클레아제 내성을 부여하고 표적 RNA에 대한 친화성을 증가시킨다.
당업자는 안티센스 올리고뉴클레오타이드 내의 모든 인터뉴클레오사이드 결합이 변형될 필요는 없다는 것을 이해한다. 예를 들어 특정의 인터뉴클레오사이드 결합이 변형되지 않는 반면에 다른 인터뉴클레오사이드 결합은 변형될 수 있다.
AON의 길이에 따라 분포된 일정하거나 일정하지 않은 (변형된) 인터뉴클레오사이드 결합 중 하나의 형태, (변형된) 인터뉴클레오사이드 결합 중 다수의 형태로 구성된 골격을 포함하는 AON은 모두 본 발명의 범위에 포함된다. 더욱이 골격 변형(일정한, 일정하지 않은, 모노-형태 또는 다수 형태 및 그의 모든 순열)의 모든 형태는 당의 어떠한 형태 또는 뉴클레오사이드 변형 또는 하기 언급되는 동족체와 결합할 수 있다.
본 발명에 따른 AON에 대한 특히 바람직한 골격은 균일한 (모든) 포스포로티오에이트(PS) 골격이다.
또 다른 실시형태에서 본 발명의 뉴클레오타이드 유사체 또는 균등물은 하나 이상의 염기 변형 또는 치환을 포함한다. 변형된 염기는 합성 또는 천연 염기를 포함하며 이는 이노신, 크산틴, 하이포크산틴 및 다른 -아자, 데아자, -하이드록시, -할로, -티오, 티올, -알킬, -알케닐, -알키닐, 피리미딘의 티오알킬 유도체 및 또는 당 업계에 공지된 퓨린 염기이다.
당업자는 안티센스 올리고뉴클레오타이드의 모든 위치가 균일하게 변형될 필요는 없다는 것을 이해한다. 또한 하나 이상의 안티센스 올리고뉴클레오타이드 또는 안티센스 올리고뉴클레오타이드 내의 단일 위치에 전술한 유사체 또는 균등물 중 하나 이상을 혼입시킬 수 있다. 특정 실시형태에서 본 발명의 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 2종 이상의 상이한 유형의 유사체 또는 균등물을 지닌다.
또 다른 실시형태에 따르면 본 발명에 따른 AON은 2'-O-메틸 변형 리보스 (RNA), 2'-O-메톡시에틸 변형 리보스, 2'-O-에틸 변형 리보스, 2'-O-프로필 변형 리보스 및/또는 예를 들면 할로겐화 유도체와 같은 이들 변형체의 치환된 유도체와 같은 2'-O 알킬(바람직하게는 저급 알킬) 포스포로티오에이트 안티센스 올리고뉴클레오타이드를 포함한다.
본 발명에 따른 효과적이고 바람직한 안티센스 올리고뉴클레오타이드 형태는 바람직하게는 실질적으로 모든 리보스 모이어티가 2'-O-메틸이고 실질적으로 모든 뉴클레오시드간 결합이 포스포로티오에이트 결합인 포스포로티오에이트 골격을 지니는 2'-O-메틸 변형 리보스 모이어티를 포함한다.
또한 상이한 안티센스 올리고뉴클레오타이드가 COL7A1 유전자의 엑손 73을 효율적으로 스킵핑하기 위해 결합될 수 있음을 당업자는 이해할 것이다. 2개의 안티센스 올리고뉴클레오타이드, 예를 들면 본 발명의 방법에 사용될 수 있는 2개의 안티센스 올리고뉴클레오타이드의 조합은 2개의 안티센스 올리고뉴클레오타이드, 3개의 상이한 안티센스 올리고뉴클레오타이드, 4개의 상이한 안티센스 올리고뉴클레오타이드, 또는 5개의 상이한 안티센스 올리고뉴클레오타이드와 같으며 적어도 하나의 AON이 본 발명에 따른 것이라면 이는 엑손 73의 동일하거나 상이한 영역을 표적으로 한다(도 1).
안티센스 올리고뉴클레오타이드는 세포, 바람직하게는 피부 세포에서 안티센스 올리고뉴클레오타이드의 흡수를 증가시키는 모이어티에 연결될 수 있다. 상기 모이어티의 예로는 콜레스테롤, 탄수화물, 비타민, 비오틴, 지질, 인지질, 안테나페디아(antennapedia)를 포함하나 이에 한정되지는 않는 세포-침투 펩타이드, TAT, 트랜스포르탄(transportan) 및 올리고아르기닌, 폴리-아르기닌, 올리고라이신 또는 폴리라이신과 같은 양 전하를 지닌 아미노산, 항체에 의해 제공되는 것과 같은 항원-결합 도메인, 항체의 Fab 단편, 또는 카멜리드 단일 도메인 항원-결합 도메인과 같은 단일 사슬 항원 결합 도메인을 들 수 있다.
본 발명에 따른 엑손 스킵핑 분자는 네이키드 (gymnotic) 안티센스 올리고뉴클레오타이드 또는 벡터(벡터화된 AON)로부터 발현되거나 컨쥬게이트 형태이다.
본 발명에 따른 엑손 스킵핑 분자는 당업계에 공지된 적절한 수단을 사용하여 투여될 수 있다. 엑손 스킵핑 분자가 벡터화된 AON인 경우, 예를 들면 개체 또는 상기 개체의 세포, 조직 또는 기관에 발현 벡터의 형태로 제공될 수 있으며 이때 발현 벡터는 상기 올리고뉴클레오타이드를 포함하는 전사체를 코딩하는 것이다.
발현 벡터는 바람직하게는 유전자 전달 비히클을 통해 세포, 조직, 기관 또는 개체 내로 도입된다. 바람직한 실시형태에서 본 발명에서 확인된 바와 같은 엑손 스킵핑 분자의 발현 또는 전사를 유도하는 발현 카세트 또는 전사 카세트를 포함하는 바이러스성 발현 벡터가 제공된다.
따라서 본 발명은 엑손 스킵핑 분자의 발현을 유도하는 조건하에서 본 발명에 따른 엑손 스킵핑 분자를 발현하는 바이러스 벡터를 제공한다. 세포는 엑손 73 내포에 필수적이거나 적어도 유도할 수 있는 서열을 간섭하는 엑손 스킵핑 분자가 공급될 수 있으며 예를 들면 플라스미드-유래 안티센스 올리고뉴클레오타이드 발현 또는 아데노바이러스 또는 아데노-관련 바이러스 기반 벡터에 의한 바이러스 발현을 통해 상기 간섭은 COL7A1 mRNA 내로 엑손 73의 내포를 방지하거나 적어도 감소시킬 수 있다.
발현은 U1, U6 또는 U7 RNA 프로모터와 같은 중합효소 Ⅲ 프로모터에 의해 유도될 수 있다. 바람직한 전달 비히클은 아데노-관련 바이러스 벡터(AAV)와 같은 바이러스 벡터 또는 렌티 바이러스 벡터와 같은 레트로 바이러스 벡터 등을 들 수 있다.
또한 플라스미드, 인공 염색체, 표적 동종 재조합 및 세포의 인간 게놈에서의 통합에 사용할 수 있는 플라스미드는 본원에서 정의된 올리고뉴클레오타이드의 전달에 적합하게 적용될 수 있다. 현재 발명에서 바람직한 것은 전사가 PolⅢ 프로모터로부터 유도되는 벡터이고, 및/또는 전사체는 U1 또는 U7 전사체와의 융합 형태로 존재하며, 작은 전사체 전달에 양호한 결과를 제공하는 벡터이다.
적합한 전사체를 설계하는 것은 당업자의 기술범위 내에 존재한다. 바람직하게는 PolⅢ로 유도된 전사체이다. 바람직하게는 U1 또는 U7 전사체를 지니는 융합 전사체의 형태로 존재한다. 그러한 융합은 기술된 바와 같이 생성될 수 있다(Gorman L 등, 1998 또는 Suter D 등, 1999).
하나의 바람직한 안티센스 올리고뉴클레오타이드 발현 시스템은 아데노바이러스 관련 바이러스(AAV)-기반 벡터이다. 단일 사슬 및 이중 사슬 AAV-기반 벡터가 개발되어 COL7A1 엑손 73의 고효율 스킵핑을 위한 안티센스 뉴클레오타이드 서열의 연장된 발현에 사용될 수 있다.
예를 들면 바람직한 AAV-기반 벡터는 중합효소 Ⅲ-프로모터(PolⅢ)에 의해 구동되는 발현 카세트를 포함한다. 바람직한 PolⅢ 프로모터는 예를 들면 U1, U6 또는 U7 RNA 프로모터이다.
따라서 본 발명은 또한 COL7A1 엑손 73의 스킵핑을 유도하기 위한 본 발명의 안티센스 올리고뉴클레오타이드의 발현을 위한 Pol Ⅲ-프로모터 구동 발현 카세트를 포함하는 바이러스성 벡터를 제공한다.
본 발명에 따른 AAV 벡터는 재조합 AAV 벡터이며, 본 명세서의 다른 곳에 도시된 바와 같은 AAV 혈청형으로부터 유래된 캡시드 단백질의 단백질 쉘 내에 캡시드화된 본 발명에 따른 코드화된 엑손 스킵핑 분자를 포함하는 AAV 게놈의 일부를 포함하는 AAV 벡터를 지칭한다. AAV 게놈의 일부는 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV8, AAV9 등과 같은 아데노-관련 바이러스 혈청형에서 유래된 인버트 말단 반복(ITR)을 포함할 수 있다.
캡시드 단백질로 구성된 단백질 쉘은 AAV1, 2, 3, 4, 5, 8, 9 등과 같은 AAV 혈청형으로부터 유래될 수 있다. 단백질 쉘은 또한 캡시드 단백질 쉘로 명명될 수 있다. AAV 벡터는 하나 또는 바람직하게는 모든 야생형 AAV 유전자가 결실되어 있으나 여전히 기능적 ITR 핵산 서열을 포함할 수 있다. 기능적 ITR 서열은 AAV 비리온의 복제, 복구(rescue) 및 패키징에 필요하다.
ITR 서열은 야생형 서열이거나 야생형 서열과 적어도 80%, 85%, 90%, 95% 또는 100% 서열 상동성을 지닌 서열이거나, 그의 기능을 유지하는 한 예를 들면 뉴클레오타이드의 삽입, 변이, 결실 또는 치환에 의해 변경될 수 있다. 상기 설명에서 기능성은 게놈의 캡시드 쉘에게로 직접적 패키징이 가능한 능력을 의미하며 감염된 숙주 세포 또는 목적 세포 내의 발현을 가능하게 하는 것이다. 본 발명과 관련하여 캡시드 단백질 쉘은 AAV 벡터 게놈 ITR과 상이한 혈청형일 수 있다.
따라서 본 발명에 따른 AAV 벡터는 예를 들어 AAV 혈청형 2와 같은 하나의 AAV 혈청형의 캡시드 단백질(VP1, VP2 및/또는 VP3)을 포함하는 캡시드 단백질 쉘, 즉 20 면체 캡시드로 구성될 수 있다. 이때 AAV5 벡터에 포함된 ITR 서열은 AAV2 벡터를 포함하는 상기에서 기재된 임의의 AAV 혈청형 중 하나일 수 있다. "AAV2 벡터"는 AAV 혈청형 2의 캡시드 단백질 쉘을 포함하는 반면에 "AAV5 벡터"는 AAV 혈청형 5의 캡시드 단백질 쉘을 포함하며 이로써 본 발명에 따른 어떠한 AAV 벡터 게놈 ITR도 캡시드화 할 수 있다.
바람직하게는 본 발명에 따른 재조합 AAV 벡터는 AAV 혈청형 2, 5, 8 또는 AAV 혈청형 9의 캡시드 단백질 쉘을 포함하며 상기 AAV 벡터에 존재하는 AAV 게놈 또는 ITR은 AAV 혈청형 2, 5, 8 또는 AAV 혈청형 9로부터 유래된 것이다. 이러한 AAV 벡터는 AAV2/2, AAV 2/5, AAV2/8, AAV2/9, AAV5/2, AAV5/5, AAV5/8, AAV 5/9, AAV8/2, AAV 8/5, AAV8/8, AAV8/9, AAV9/2, AAV9/5, AAV9/8 또는 AAV9/9 벡터로서 언급된다.
더욱 바람직하게는, 본 발명에 따른 재조합 AAV 벡터는 피부 및 표피 세포에 대한 국소적 적용이 가능하고 AAV 혈청형 5 또는 8의 캡시드 단백질 쉘을 포함한다. 상기 벡터에 존재하는 AAV 게놈 또는 ITR은 예를 들면 AAV 혈청형 2와 동일하거나 상이한 혈청형으로부터 유래될 수 있으며 상기 벡터를 AAV 2/5 또는 AAV 2/8 벡터라고 한다. 혈청형 5 캡시드를 지니는 AAV는 기저 및 상부 기저 각질 및 피부 섬유아세포와 같은 피부 및 표피 세포에 대한 국소 적용증을 지닌다. 5형 캡시드를 지니는 AAV 벡터는 2형 캡시드를 지니는 AAV와 비교하여 훨씬 높은 형질도입 효율을 나타낸다(Keswani 등, Wound Repair Regen., 20 (4) : 592-600).
유사하게, 혈청형 8의 캡시드를 지니는 AAV는 진피 섬유아세포 및 (주로) 상부 기저 각질세포에 국소 적용증을 지닌다. 더욱이, AAV 2/8은 AAV 2/5보다 포유동물 바람직하게는 인간의 피부 및 표피 세포를 형질 도입하는데 보다 효율적이다. 그러나 전환 효율은 상처 치유 중 투여의 타이밍에 의존하는 것으로 보이며, AAV 2/2는 그보다 더 이후 시점에서 AAV 2/5 및 AAV 2/8보다 높은 형질 전환 효율을 나타낸다 (Keswani 등, 상기 문헌).
따라서, 본 발명에 따른 AON을 전달하기 위해서는 AAV 2/2, AAV x/5 및 AAV x/8이 선호되는 AAV이고, 이들의 선택은 투여 시간 및 표적화 될 세포 유형을 고려하여 결정될 수 있다. 이러한 세부 사항은 전임상 또는 임상 연구에서 당업자가 용이하게 실시할 수 있다.
선택된 핵산 서열에 의해 나타내어지는 본 발명에 따른 엑손 스킵핑 분자를 코딩하는 핵산 분자는 바람직하게는 상기에서 확인된 바와 같이 AAV 게놈 또는 ITR 서열 사이에 바람직하게 삽입되며 예를 들면 코딩 서열 및 3' 종결 서열에 작동 가능하게 연결된 발현 조절 요소를 포함하는 발현 컨스트럭트이다.
"AAV 헬퍼 기능"은 일반적으로 전환 중에(in trans) AAV 벡터에 공급된 AAV 복제 및 패키징에 필요한 상응 AAV 기능을 나타낸다. AAV 헬퍼 기능은 AAV 벡터에서 누락된 AAV 기능을 보완하지만 AAV 벡터 게놈에 의해 제공되는 AAV ITR은 결핍되어 있다. AAV 헬퍼 기능은 AAV의 2개의 주요 ORF, 즉 rep 코딩 영역 및 cap 코딩 영역 또는 이들의 기능적으로 실질적으로 동일한 서열을 포함한다.
Rep 및 Cap 영역은 당 업계에 잘 공지되어 있으며 예를 들어 문헌 Chiorini 등.(1999, J. of Virology, Vol 73(2): 1309-1319) 또는 미국 특허 제5,139,941호에 기술되어 있고 본 명세서 내에 통합되어 있다. AAV 헬퍼 기능은 플라스미드일 수 있는 AAV 헬퍼 컨스트럭트 상에 제공될 수 있다. 헬퍼 구조의 숙주 세포로의 도입은 예를 들면 형질 전환, 형질 감염 또는 형질 도입에 의해 본 명세서에서 확인된 바와 같은 AAV 벡터에 존재하는 AAV 게놈의 도입 이전에 또는 동시에 도입될 수 있다.
본 발명의 AAV 헬퍼 컨스트럭트는 한편으로는 AAV 벡터 캡시드 단백질 혈청형의 원하는 조합을 생성하도록 선택될 수 있으며 다른 한편으로는 AAV 벡터 복제 및 패키징에 존재하는 AAV 게놈을 위한 원하는 혈청형의 조합을 생성하도록 선택될 수 있다.
"AAV 헬퍼 바이러스"는 AAV 복제 및 패키징에 필요한 추가 기능을 제공한다. 적합한 AAV 헬퍼 바이러스는 아데노 바이러스, 헤르페스 심플렉스 바이러스(예를 들면 HSV 유형 1 및 2) 및 백시니아 바이러스를 포함한다. 헬퍼 바이러스에 의해 제공되는 추가 기능은 또한 본 명세서 내에 참고문헌으로 통합된 미국 특허 제6,531,456호에 기재된 바와 같이 벡터를 통해 숙주 세포 내로 도입될 수 있다.
바람직하게는 본 발명에 따른 재조합 AAV 벡터에 존재하는 AAV 게놈은 AAV의 rep(복제) 또는 cap(캡시드) 유전자와 같은 바이러스 단백질을 코딩하는 임의의 뉴클레오타이드 서열을 포함하지 않는다. AAV 게놈은 항생제 내성 유전자, 형광 단백질(예, gfp) 또는 당업계에 알려진 화학적으로 효소적으로 또는 기타 검출 가능한 및/또는 선택 가능한 생성물(예를 들어 lacZ , aph 등)을 코딩하는 유전자와 같은 마커 또는 리포터 유전자를 추가로 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 바람직한 AAV 벡터는 AAV 벡터, 바람직하게는 AAV2/5, AAV2/8, AAV2/9 또는 AAV2/2 벡터이며 안티센스 올리고뉴클레오타이드를 포함하는 본 발명에 따른 엑손 스킵핑 분자를 발현한다. 이때 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 상기 표 1에 나타난 바와 같이 AON1, AON2, AON3, AON4, AON20, AON21, AON22, AON23, AON24, AON24.1, AON24.2, AON24.3, AON24.3, AON.24.4, AON.24.5, AON25 및 mh-AON1로 구성된 군으로부터 선택된 서열을 포함하거나 서열로 구성된다.
본 발명에 따른 엑손 스킵핑 분자로 개체 또는 세포, 조직, 상기 개체의 기관을 제공하는 수단의 개선은 이미 지금까지 달성된 개량을 고려하여 예상될 수 있다. 이러한 미래의 개선은 물론 본 발명의 방법을 사용하여 mRNA의 재구성에 대한 언급된 효과를 달성하기 위해 통합될 수 있다. 본 발명에 따른 엑손 스킵핑 분자는 그대로 상기 개체의 개체, 세포, 조직 또는 기관에 전달될 수 있다. 본 발명에 따른 엑손 스킵핑 분자를 투여할 때 상기 분자는 전달 방법과 배합 가능한 용액에 용해되는 것이 바람직하다.
짐노틱 AON은 생체 내에서 거의 모든 세포에 의해 회수될 수 있으며 등장성 (생리식염수) 용액 내에 본 발명의 AON을 통상 녹일 수 있어 예를 들면 피부 (진피 및 표피) 세포와 같은 표적 세포에 충분히 도달시킬 수 있다. 한편으로는 본 발명의 짐노틱 AON은 약제학적으로 허용 가능한 부형제, 첨가제, 안정화제, 용매, 색소 등과 같은 물질로 제형화시킬 수 있다. 더욱이 짐노틱 AON은 하기 언급하는 트랜스펙션 보조제와 함께 제형화시킬 수 있다.
피부 (진피 및 표피) 세포는 등장성 (생리식염수) 용액과 같은 수용액에서 플라스미드를 제공함으로써 안티센스 올리고뉴클레오타이드 발현을 위한 플라스미드를 제공할 수 있다. 대안적으로 플라스미드는 공지된 트랜스펙션 제제를 사용하여 트랜스펙션 시킬 수 있다.
정맥 내, 피하, 근육 내, 경막내 및/또는 피내 투여를 위해 용액은 등장성 (생리식염수) 용액인 것이 바람직하다. 본 발명에서 특히 바람직한 것은 세포 및/또는 세포, 바람직하게는 피부 (진피 및 표피) 세포에 본 발명에서 정의된 바와 같은 각각의 성분 전달을 위한 부형제 또는 트랜스펙션 제제를 사용할 수 있다. 세포막을 통해 소포체 또는 리포솜에 복합화 되거나 포획된 본 발명에서 정의된 바와 같은 각각의 성분을 전달하는 복합체, 나노 입자, 마이셀, 비시클 및/또는 리포솜을 형성할 수 있는 부형제 또는 트랜스펙션 제제를 사용할 수 있다.
이들 부형제 중 많은 것이 당 업계에 공지되어 있다. 적합한 부형제 또는 트랜스펙션 제제는 폴리에틸렌이민(PEI; ExGen500 (MBI Fermentas)), LipofectAMINE 2000(Invitrogen) 또는 이의 유도체, 폴리프로필렌이민 또는 폴리에틸렌이민 공중합체(PEC) 및 유도체를 포함하는 유사 양이온성 고분자, 합성 양친매성 물질(SAINT-18), 리포펙틴, DOTAP 및/또는 피부 (진피 및 표피) 세포 내로 본 발명에 정의된 바와 같이 각각의 조성을 전달할 수 있는 입자 내로의 자가 조립이 가능한 바이러스 캡시드 단백질을 포함한다.
이러한 부형제는 피부 (진피 및 표피) 세포를 비롯한 다양한 배양 세포에 안티센스 핵산과 같은 올리고뉴클레오타이드를 효율적으로 전달하는 것으로 나타났다. 이들의 높은 트랜스펙션 가능성은 전반적인 세포 생존의 관점에서 허용될 수 있을 정도의 경미한 내지 중간 정도의 독성과 결합된다. 추가적 변형 및 이들의 추가적인 (생체 내) 핵산 전달 특성 및 독성 분석을 가능하게 하는데 구조적 변형을 용이하게 적용할 수 있다.
리포펙틴은 리포좀성 트랜스펙션 제제의 예를 나타낸다. 그것은 2개의 지질 성분으로 구성되어 있으며 이는 양이온성 지질인 N-[1-(2,3 디올레오일옥시)프로필]-N,N,N-트리메틸암모늄 클로라이드(DOTMA)(메틸황산염인 DOTAP와 비교)와 중성 지질인 디올레오일포스파티딜에탄올아민(DOPE)이다. 중성 요소는 세포 내 방출을 매개한다. 또 다른 전달 시스템의 그룹은 중합체성 나노 입자이다.
DNA 트랜스펙션 시약으로 잘 알려져 있는 디에틸아미노에틸아미노에틸(DEAE)-덱스트란과 같은 폴리 양이온(Polycation)은 세포막을 가로질러 세포 내로 본 발명에 정의된 바와 같은 각각의 조성, 바람직하게는 올리고뉴클레오타이드를 전달할 수 있는 양이온성 나노입자를 제조하기 위한 부틸시아노아크릴레이트(PBCA)와 헥실시아노아크릴레이트(PHCA)와 결합할 수 있다.
이러한 일반적인 나노 입자 물질 외에도 양이온성 펩타이드 프로타민은 올리고뉴클레오타이드를 콜로이드로 제형화 하기 위한 대안적인 접근법을 제공한다. 이 콜로이드성 나노 입자 시스템은 소위 프로티클(proticle)이라고 불리는 입자를 형성할 수 있으며 이는 올리고뉴클레오타이드의 세포 내 방출을 패키지화하고 조절하는 간단한 자가-조립 과정에 의해 제조될 수 있다.
당업자는 본 발명에서 사용하기 위한 엑손 스킵핑 분자를 패키지화하고 전달하기 위한 상기한 것 또는 상업적으로 이용 가능한 다른 부형제 및 전달 시스템 중 임의의 것을 선택하고 적용할 수 있으며 이는 COL7A1 유전자 내의 엑손 73 변이에 관련된 질병 또는 상태의 예방, 치료 또는 지연을 목적으로 이를 전달하기 위한 것이다.
또한 본 발명에 따른 엑손 스킵핑 분자는 세포(특히 피부(진피) 세포), 세포질 및/또는 그의 핵으로의 흡수를 용이하게 하도록 특별히 고안된 표적 리간드에 공유 결합 또는 비공유 결합될 수 있다. 이러한 리간드는 (i) 세포 내 흡수를 촉진시키는 세포, 조직 또는 기관 특이 엘레멘트를 인식하는 화합물(펩타이드 유사 구조를 포함하나 이에 한정하지는 않음) 및/또는 (ii) 예를 들면 엔도좀 또는 라이소좀과 같은 비시클로부터 올리고뉴클레오타이드의 세포로 및/또는 세포 내로 방출되는 것의 흡수를 용이하게 할 수 있는 화학적 화합물을 포함할 수 있다.
따라서 바람직한 실시형태에서 본 발명에 따른 엑손 스킵핑 분자는 조성물 또는 약제 또는 조성물 내에 제형화되어 있으며 적어도 부형제 및/또는 전달을 위한 목적 리간드 및/또는 세포로의 전달 및/또는 그의 세포 내 전달 강화를 위한 기구와 함께 제공될 수 있다.
바람직한 전달은 국소 투여를 통해 이루어진다. 첨부된 실시예에 개시된 바와 같이 (1) 환자 치료에 이미 사용되고 있는 하이드로겔인 Flaminal hydro, (2) 히프로멜로오스 하이드로겔 또는 (3) 카보머 하이드로겔과 같은 약제학적으로 허용 가능한 하이드로겔의 사용을 들 수 있다.
본 발명의 올리고뉴클레오타이드의 국소 전달에 사용될 수 있는 국소 제제는 다음과 같다 :
- 수중유 또는 유중수 에멀젼으로 제형화 된 크림; 후자는 보다 미용에 적합하여 화장품으로 수용 가능하다. 예는 Softisan 기반 크림 또는 세토마크로골 크림이다.
- 겔 : 액상에 균일하게 분포된 겔 화제를 포함하는 용액 또는 현탁액. 히프로멜로오스, 카보머 및 알지네이트를 포함하나 이에 한정되지 않는 하이드로겔이 그 예이다.
- 연고. 이들은 보통 비히클로서 20% 미만의 물과 50% 이상의 탄화수소, 왁스 또는 폴리올을 함유한다. 그들은 크림보다 더 기름기 많은 피부 질감을 지니고 있다.
- 페이스트 : 견고한 고형분을 고밀도로 함유하고 있다.
- 현탁액 : 액체 비히클에 분산되는 고형 입자를 포함하는 액체 제제이다. 일부는 로션으로 분류할 수 있다.
- 로션 : 이들은 현탁액, 저점도 겔 및 용액과 많은 특성을 공유하는 다소 점성이 강한 (에멀젼) 제제이다.
- 폼 : 분별 시 푹신한 일관성을 지니는 에멀젼이다.
- 스프레이 : 노즐로 생성되는 미세한 액적이다.
- 용액 : 일반적으로 수성이지만 알코올과 같은 다른 용매를 함유 할 수 있는 액상 생성물이다.
조성물이 본 발명에서 후술하는 부가 화합물와 같은 부가적인 조성을 포함하는 경우, 조성물의 각 조성은 하나의 단일 조합 또는 조성물 또는 제제로 제형화될 필요가 없다는 것을 이해해야 한다. 그들의 제형에 따라 당업자는 본 발명에서 정의된 바와 같이 각각의 성분에 대해 어느 유형의 제제가 가장 적합한지를 인지할 수 있다. 바람직한 실시형태에서 본 발명은 본 발명에 따른 엑손 스킵핑 분자 및 본 발명에서 후술하는 추가의 부가 화합물을 포함하는 키트 형태인 조성물 또는 제형을 제공할 수 있다.
필요에 따라 본 발명에 따른 엑손 스킵핑 분자 또는 본 발명에 따른 엑손 스킵핑 분자를 발현하는 벡터, 바람직하게는 바이러스 벡터는 약제학적으로 허용 가능한 담체를 첨가함으로써 약제학적으로 활성인 혼합물로 통합될 수 있다.
따라서 본 발명은 조성물, 바람직하게는 본 발명에 따른 엑손 스킵핑 분자를 포함하는 약제학적 조성물, 본 발명에 따른 엑손 스킵핑 분자, 예를 들어 짐노틱 AON 또는 본 발명에 따른 바이러스 벡터 및 약제학적으로 허용 가능한 부형제를 제공하는 것이다. 이러한 조성물은 본 발명에 따른 단일 엑손 스킵핑 분자를 포함할 수 있으며 본 발명에 따른 다수의 별개의 엑손 스킵핑 분자를 또한 포함할 수 있다.
이러한 제약 조성물은 담체, 충전제, 방부제, 보조제, 용해제 및/또는 희석제를 비롯한 임의의 약제학적으로 허용 가능한 부형제를 포함할 수 있다. 이러한 약제학적으로 허용 가능한 담체, 충진제, 방부제, 보조제, 용해제 및/또는 희석제는 예를 들어 Remington, 2000에서 찾을 수 있다. 상기 조성물의 각 특징은 앞서 본 발명에 정의되어 있다.
본 발명에 따른 다수의 별개의 엑손 스킵핑 분자가 사용되는 경우, 본 발명에서 정의된 농도 또는 용량은 사용된 모든 올리고뉴클레오타이드의 총 농도 또는 투여량 또는 사용되거나 첨가된 개별 엑손 스킵핑 분자의 농도 또는 투여량을 지칭할 수 있다. 따라서 하나의 실시형태에서 사용된 본 발명에 따른 엑손 스킵핑 분자의 개별 또는 총 함량은 0.0001 내지 100 mg/kg, 바람직하게는 0.001 내지 50 mg/kg 범위의 양으로 투여되는 조성물이 제공되며, 가장 바람직하게는 0.01 내지 20 mg/kg이다.
본 발명에 따른 바람직한 엑손 스킵핑 분자는 개체의 DEB 또는 더욱 일반적으로 변이 COL7A1 엑손 73 관련 질환 또는 상태의 치료를 위한 것이다. 본 발명의 모든 실시형태에서 "치료"라는 용어는 질환 또는 상태의 예방 및/또는 지연을 포함하는 것으로 이해된다. 본 발명에 따른 엑손 스킵핑 분자를 사용하여 치료될 수 있는 개체는 이미 DEB 또는 COL7A1 엑손 73 관련 질환 또는 상태를 지니는 것으로 진단되었을 수 있다.
대안적으로 본 발명에 따른 엑손 스킵핑 분자를 사용하여 치료될 수 있는 개체는 아직 진단되지 않았을 수 있으나 그 또는 그녀의 주어진 유전적 배경으로 인해 미래에 DEB 또는 COL7A1 엑손 73 관련 질환 또는 상태를 발달시킬 수 있는 증가된 위험을 지니는 개체일 수 있다. 바람직하게는 개체는 인간이다. 바람직한 실시형태에서 변이 COL7A1 엑손 73 관련 질환 또는 상태는 DEB이다.
본 발명은 AON 또는 본 발명의 바이러스 벡터와 같은 AON을 코드화시킨 벡터를 DEB 치료에 사용하기 위한 더욱 일반적으로는 COL7A1 엑손 73 유전자의 변이와 관련된 질병 또는 개체의 증상(상기한 바와 같은)을 치료하기 위한 의약으로서의 용도를 지닌 AON 또는 본 발명의 바이러스 벡터와 같은 AON을 코드화시킨 벡터를 포함하는 조성물과 같은 본 발명에 따른 엑손 스킵핑 분자를 더욱 제공하는 것이다.
본 발명은 AON 또는 본 발명의 바이러스 벡터와 같은 AON을 코드화시킨 벡터를 DEB 치료에 사용하기 위한 더욱 일반적으로는 COL7A1 엑손 73 유전자의 변이와 관련된 질병 또는 개체의 증상(상기한 바와 같은)을 치료하기 위한 의약을 제조하기 위한 AON 또는 본 발명의 바이러스 벡터와 같은 AON을 코드화시킨 벡터를 포함하는 조성물과 같은 본 발명에 따른 엑손 스킵핑 분자의 용도를 더욱 제공하는 것이다.
또한 본 발명은 DEB를 포함하는 질병 또는 장애의 원인이 되는 COL7A1 유전자의 엑손 73 내의 게놈 변이를 지니는 포유동물(바람직하게는 인간)의 치료 방법을 제공하는 것으로, AON, (바이러스) 벡터 또는 본 발명에 따른 약제학적 조성물을 포유동물(인간)에게 투여하는 방법을 포함하는 것이다. 이 환자들은 DEB 또는 관련된 질병으로 고통받을 수 있다.
관련 장애, 질병 또는 증상은 콜라겐 Ⅶ 결핍 또는 피부 또는 인간의 다른 기관의 이상으로 인해 발생할 수 있는 COL7A1 유전자 엑손 73의 변이와 관련된 예를 들면 피부암(편평 세포암종) 또는 다른 암종을 포함할 수 있다.
본 발명의 또 다른 실시형태는 AON, AON을 암호화하는 바이러스 벡터 및 COL7A1 유전자의 엑손 73에서 변이를 그의 게놈 내에서 지니는 포유동물(바람직하게는 인간)을 치료하기 위한 의약으로서 사용하기 위한 본 발명에 따른 AON을 포함하는 약제학적 조성물이다.
본 발명에 따른 엑손 스킵핑 분자는 (수성) 용액, 현탁액, (오일-인-워터) 에멀젼, 연고, 로젠지, 필 등의 형태로 삼킴, 주사, 흡입, 주입, 분무에 의해 경구, 안구 내, 폐 내, 비강 내, 근육 내, 피하, 피내, 직장 내로 전체적 부분적 국소적으로 투여될 수 있다.
투약 용량은 투여 경로와 환자의 필요에 따라 매일, 주간, 월간, 분기 별, 1년에 한 번일 수 있다.
질병의 조기 발병으로 인해 DEB를 포함한 COL7A1 유전자의 변이된 엑손 73에 의해 유발된 질병, 장애 또는 증상을 앓고 있거나 증상이 나타날 위험이 있는 환자는 자궁 내에서(in utero), 출생 직후에, 1, 2, 3, 6개월령 부터, 1세 부터, 3세 부터, 5세 부터 치료할 수 있으며 증상이 나타나기 전 또는 직후에 질병의 증상을 완화, 발달 지연, 중지 또는 역전시킬 수 있다.
본 발명에 따른 치료 방법 및 용도는 1주일 이상, 1개월 이상, 몇 개월 이상, 1년 이상, 2, 3, 4, 5, 6년 이상 또는 환자의 일생동안 지속된다. 본 발명의 용도에 따른 본 발명에서 정의된 엑손 스킵핑 분자 또는 엑손 스킵핑 올리고뉴클레오타이드 또는 이의 균등물은 변이 COL7A1 엑손 73 관련 장애, 질병 또는 증상에 이미 영향을 받거나 또는 발병 위험이 있는 개체의 생체 내에서 세포, 조직 및/또는 기관에 직접 투여하기에 적합할 수 있으며 생체 내, 생체 외 또는 시험관 내로 직접 투여될 수 있다.
본 발명의 올리고뉴클레오타이드, 조성물, 화합물 또는 보조 화합물의 투여 빈도는 환자의 연령, 엑손 스킵핑 분자의 특성(예를 들면 gymnotic AON 또는 벡터화 AON, 즉 AAV 또는 AON 발현 렌티바이러스 벡터), 투여량, 상기 분자의 제형 등을 포함하는 여러 요소에 의해 결정된다.
엑손 스킵핑 분자, 바람직하게는 본 발명에 따른 올리고뉴클레오타이드의 투여량 범위는 엄격한 프로토콜 요건이 존재하는 임상 시험(생체 내 사용)에서 요구하는 투여량 연구에 기초하여 바람직하게 설계된다. 본 발명에서 정의된 올리고뉴클레오타이드는 0.0001 내지 20 mg/kg, 바람직하게는 0.001 내지 20 mg/kg의 투여량 범위에서 사용될 수 있다. 투여량 및 치료 방법은 많은 요인에 의해 다양하게 변화할 수 있으며 이는 투여 경로(예를 들어 전신 대 국소), 올리고가 gymnotic AON으로 또는 벡터화된 AON으로 투여되는지의 여부, 투약 요법, 환자의 연령 및 체중 등을 포함하며 이에 한정되지는 않는다.
바람직한 실시형태에서 본 발명에 따른 분자를 위한 전달 비히클로서의 바이러스 벡터, 바람직하게는 본 발명에서 이전에 개시된 바와 같은 AAV 벡터는 주사 당 1×109 ~ 1×1017 바이러스 입자, 바람직하게는 1×1010 ~ 1×1014, 가장 바람직하게는 1×1010 ~ 1×1012 바이러스 입자의 범위로 투여된다.
본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 올리고뉴클레오타이드(들)의 서열 및 화학적 성질, 투여 경로, 제형, 투여량, 투약 요법, 형태(바이러스 벡터 또는 gymnotic 올리고뉴클레오타이드), 환자의 연령 및 체중, 질병의 단계 등과 같은 요인에 따라 치료의 세부지침이 수립되어야 한다는 것이 명백할 것이며 추가적 비-임상적 및 임상적 조사를 필요로 할 수 있다.
본 발명은 세포, 바람직하게는 피부 세포(진피 섬유아세포)를 gymnotic AON 또는 본 발명에 따른 AON을 암호화하는 (바이러스) 벡터와 같은 본 발명에 따른 엑손 스킵핑 분자 또는 본 발명에 따른 조성물과 접촉시키는 단계를 포함하는 세포에서 COL7A1 엑손 73의 내포를 방지하거나 적어도 감소시키는 방법을 추가로 제공한다. 이 측면의 특징은 바람직하게는 본 발명에서 앞서 정의된 특징이다.
다르게 지시되지 않는 한, 본 발명에 기재된 바와 같은 각각의 실시형태는 본 발명에 기술된 다른 실시형태와 결합될 수 있다.
본 발명에 따른 AON 또는 상기 AON을 코딩하는 (바이러스) 벡터와 같은 엑손 스킵핑 분자의 COL7A1 유전자가 포유류(바람직하게는 인간) 세포에서 발현될 때 변이 COL7A1 엑손 73 내포를 방지하거나 적어도 감소시키는 능력 및 5' 스플라이스 수용체의 선택에 영향을 미치는 영역에서 생리학적 조건 하에서 포유동물(인간) COL7A1 pre-mRNA에 결합함으로써 변이된 엑손 73의 COL7A1 mRNA로의 내포를 감소시키는 능력은 본 명세서의 실험 섹션에 개시된 분석을 사용하여 편리하게 평가할 수 있다.
특히 엑손 스킵핑 분자는 엑손 73을 포함하는 mRNA의 세포에 의한 생산을 감소시키는 능력을 평가하기 위해 COL7A1 유전자의 엑손 73(반드시 변이는 아님)을 함유하는 세포와 함께 인큐베이션시킬 수 있다. 예를 들면 실험 섹션 및 실시예에 개시된 바와 같이 RT-PCR(Bioanalyzer 장치를 사용하여 정량화될 수 있음)에 의해 수행된다.
본 명세서의 실험 섹션 및 실시예에 나타난 바와 같이, RNA 수준에서 COL7A1 유전자의 엑손 73을 표적으로 하는 본 발명에 따른 다양한 AON의 첨가는 엑손 73이 결여된 mRNA를 통해 더 짧지만 기능적 콜라겐 Ⅶ 단백질의 생성을 유도한다.
섬유아세포(피부 세포에서 유도될 수 있음)에서는 콜라겐 Ⅶ이 풍부하게 발현된다. 따라서 DEB 환자의 배양된 섬유아세포에 AON을 첨가하면 웨스턴 블롯에서 검출 가능한 짧지만 기능성인 콜라겐 Ⅶ 단백질의 양이 증가할 것으로 예상되며 따라서 AON 기반 치료법은 COL7A1 mRNA의 스플라이싱을 리디렉션할 뿐만 아니라 콜라겐 Ⅶ 기능 회복을 유도할 것이라는 것이 예견된다.
"아데닌", "구아닌", "시토신", "티민", "우라실" 및 하이포크산틴(이노신의 핵산염기)이라는 용어는 핵산염기를 의미한다.
아데노신, 구아노신, 시티딘, 티미딘, 우리딘 및 이노신이라는 용어는 (데 옥시) 리보스 당과 연결된 핵산염기를 의미한다.
"뉴클레오사이드"라는 용어는 (데옥시) 리보스 당에 연결된 핵산염기를 의미한다.
본 명세서와 그 청구항에서 "~을 포함한다"라는 동사와 그의 활용은 그 단어 뒤에 오는 항목이 포함되지만 특별히 언급되지 않은 항목은 제외되지 않는다는 것을 의미하는 제한적이지 않은 의미로 사용된다. 또한 부정관사 "a"또는 "an"에 의한 하나의 요소에 대한 언급은 문맥 상 하나의 요소만이 명백하게 요구되는 경우를 제외하고는 하나 이상의 요소가 존재할 가능성을 배제하지 않는다. 따라서 부정관사 "a"또는 "an"은 일반적으로 "적어도 하나"를 의미한다.
"포함하다"라는 단어와 그의 모든 시제와 활용법은 "포함하지만 이에 한정되지 않음"으로 해석되어야 한다.
"엑손 스킵핑 분자"라는 단어는 gymnotic AON과 벡터화된 AON을 포함하는 것을 의미하며 호환 가능한 세포에서 AON을 발현할 수 있는 바이러스 벡터를 포함한다.
수치(예를 들어, 약 10)와 관련하여 사용되는 "약" 또는 "대략"이라는 단어는 값이 소정 수치(10)의 ±5% 일 수 있음을 의미한다.
본 명세서에 제공된 서열 정보는 잘못 식별된 염기를 포함할 수 있도록 너무 좁지 않게 해석하여야 한다. 당업자는 이러한 잘못 식별된 염기를 식별할 수 있으며 이러한 오류를 수정하는 방법을 알고 있다. 서열 오류의 경우, 폴리펩타이드를 코딩하는 핵산 서열을 함유하는 서열번호: 1에 존재하는 유전자의 발현에 의해 수득 가능한 폴리펩타이드의 서열이 우선하여야 한다.
실시예
(실시예 1) 엑손 73의 mRNA 분석
COL7A1의 mRNA에서 엑손 73 mRNA의 존재를 검출하기 위해 HeLa 세포 및 인간 프라이머리 섬유아세포(HPF) 모두의 mRNA를 추출하였다. 세포의 배양은(a) HeLa에 대해 10% 우태아 혈청(FBS)이 보충된 Dulbecco 변형 이글 배지(DMEM) 또는 (b) HPF 세포에 대해 20% FBS 및 1% 피루브산 나트륨이 보충된 DMEM AQE에서 수행하였다. 모든 세포는 37℃ 5% CO2에서 배양하였다.
상기한 AON의 엑손 스킵핑 효율을 결정하기 위해 세포를 12-웰 플레이트에 60.000 세포/웰(HeLa) 또는 6-웰 플레이트에 150.000 세포/웰(HPF)로 시드 접종하였다. 세포 성장을 허용한 지 24시간 후에 세포를 100nm AON-maxPei 복합체로 트랜스펙션 시켰다. ReliaPrep RNA Cell Miniprep 시스템(Promega)으로 RNA 분리를 수행한 후 Thermo Scientific Verso 키트를 사용하여 cDNA를 제조하였다. 엑손 73에 대한 PCR은 엑손 71-72 경계에 위치한 정방 프라이머(5'-GCTGGCATCAAGGCATCT-3'; 서열번호: 51) 및 엑손 74 내에 위치한 역방 프라이머(5'-TCCTTTCTCTCCCCGTTCTC-3', 서열번호: 52)로 수행하였다. PCR 생성물은 DNA1000 칩을 사용하는 Bioanalyzer로 시각화하였으며 소프트웨어 Expert 2100은 생성물 길이 분석을 위해 사용되었다.
스킵핑 효율성은 표 2에 나타내었으며 도 3은 lab-on-a-chip 결과를 나타낸다. AON1 내지 AON4, AON20 내지 AON25(AON 24.1 내지 24.5 포함) 및 m-h AON1로 명명된 본 발명에 따른 AON은 70% 이상의 mRNA가 엑손 73이 제거된 상태로 가장 높은 효율을 나타내었다. 효과적인 AON은 pre-mRNA의 5' 말단을 표적으로 한다.
Figure pct00002
Figure pct00003

만족스러운 엑손 스킵핑 효율을 나타내는 AON 중 2개는 바람직하지 않은 G-테트라드가 발생하는 것을 방지하기 위해 3' 말단에서 다양한 수의 뉴클레오타이드를 절단 제거하였다. 이러한 AON은 표 3에 나타내었다.
Figure pct00004
이러한 AON 효율성은 COL7A1 mRNA의 엑손 73 내 내포를 감소시킨다(표 1 참조). 반면 제조 가능성, 정제 및 분석 관점에서 덜 바람직한 서열을 포함하지 않거나 멀티플렉싱으로 인해 기능이 전반적으로 상실될 가능성을 감소시킨다.
엑손 73이 제거된 콜라겐 Ⅶ의 기능은 문헌에 기술된 몇 가지 시험관 내 방법을 사용하여 확인할 수 있다:
1. 단백질 분석, 웨스턴 블로팅을 사용한 α1-콜라겐 사슬의 크기와 정확한 조립(Titeux 등, 2010). 주목할 것은 스킵핑된 엑손의 크기는 작고 야생형 단백질의 크기는 크기 때문에 단백질 크기의 명백한 차이가 나타나지 않을 수도 있다.
2. 비환원 조건에서 웨스턴 블로팅을 사용하여 콜라겐 Ⅶ 호모트리머의 열 안정성 분석. 야생형 콜라겐 Ⅶ는 3개의 α1- 콜라겐 사슬로 구성되며 41℃의 Tm을 지닌다(Mecklenbeck 등, 2002).
3. 콜로이드성 금 또는 스크래치 분석을 이용한 세포 이동 분석. 야생형 콜라겐 Ⅶ를 절단하는 섬유아세포 및/또는 각질 세포의 운동성을 엑손 73이 제거된 절단된 단백질과 비교한다(Chen 등, 2002).
4. 예를 들면 콜라겐 Ⅵ, laminin-332, laminin-1 또는 피브로넥틴과 같은 다양한 세포 외 매트릭스 성분에 대한 세포 접착으로 평가할 수 있다(Chen 등, 2002).
본 발명자들은 포유류(바람직하게는 인간) COL7A1 mRNA 내로의 엑손 73 내포를 예방하거나 또는 적어도 감소시키는 관점에서 AON이 콜라겐 Ⅶ 작용기의 관점에서 상기한 선행 기술의 방법을 사용하여 이미 평가된 바와 같이 만족스러운 결과를 나타낼 것이라고 예측한다. 더욱이, CpG를 2개 이하(바람직하게는 1개 이하) 포함하는 AON은 생체 내 면역원성의 관점에서 우수하게 기능할 것이다.
따라서, 본 발명의 가장 바람직한 AON은 COL7A1 유전자의 엑손 73의 변이와 관련된 이영양성 수포성 표피박리증을 앓고 있거나 또는 이로부터 고통받을 위험이 있는 사람의 치료에 적합한 치료제로서 개발할 수 있는 후보 물질이다.
(실시예 2) 생체 외 돼지 피부 모델을 이용한 mh-AON1의 국소 전달
DEB 환자의 현재 상처 관리는 주로 상처 치료, 가려움증 및 통증 관리 및 편평 세포암의 조기 진단에 초점을 맞추고 있다. 상처 치료에는 (염화물) 수욕을 통한 상처의 세척 및 살균, 살균제로 사용되는 클로르헥시딘 및 기타 항균 크림이 포함된다. 또한 상처는 하이드로겔을 사용하여 통증과 가려움을 줄이기 위해 수화되고 보습된다.
마지막으로 상처 치료는 피부의 마찰을 줄이고 보호하며 오염을 방지하고 물질의 고착을 방지하며 상처로부터 액체를 흡수하여 물집이 생성되지 않도록 다양한 형태의 드레싱/실리콘 폼으로 붕대 감기를 포함하여 처치한다. 물집은 내부 압력을 감소시키기 위해 구멍나고 배수된다.
mh-AON1의 국소 전달은 두 가지 이점을 제공하는데, 첫째로 국소 전달로 인해 표적 세포, 각질 세포 및 섬유아세포에 직접 전달될 것이다. 둘째로 국소 투여로 인해 전신 흡수는 경미하여 전반적인 독성이 낮아진다(Wraight 및 White, Pharmacol Ther 2001 Apr; 90 (1) : 89-104). 마지막으로 올리고뉴클레오타이드의 국소 투여 후 진피 및 표피의 국소 농도는 전신 투여 후 보다 150배(진피용) 및 4000배(표피용) 높을 수 있다(Metha 등, J Invest Dermatol. 2000 Nov; 115 (5) : 805-12).
mh-AON1의 국소 투여를 조사하기 위해 사육 중 생체 내 돼지 피부 모델을 수립하였다. 돼지 피부는 각질층의 동일한 표피 두께와 장벽 특성을 지녀 인간의 피부와 매우 유사한 것으로 간주된다. 전달 연구를 위해 돼지 생체 외 피부를 수득하였으며 0.8에서 1.4 mm 사이의 두께로 자르고 상부는 공기에 노출된 상태로 공기-액체 인터페이스에서 배양하였다. DEB 환자의 상처는 표피와 진피가 완전히 분리되어 있기 때문에 이러한 상처는 표피를 기계적으로 완전히 제거함으로써 모방되었다.
손상되지 않은 또는 물집과 유사한 생체 외 돼지 피부로의 mh-AON1의 피부 침투를 평가하기 위해 올리고뉴클레오타이드를 PBS 또는 DEB 표준 상처 치료 방법의 하나인하이드로겔로 제형화시켰다. mh-AON1에 노출시킨 후, 피부 조각은 4% 포르말린에 고정화 되었으며 형태 분석을 위한 대조 염색으로서 헤마톡실린을 사용하여 조직학적 평가를 위해 처리되고 파라핀에 함침시켰다. 올리고뉴클레오타이드가 Cy5 표지에 컨쥬게이트 되었기 때문에 mh-AON1 부위는 형광 현미경에 의해 가시화될 수 있었다.
PBS에 제형화된 mh - AON1
손상되지 않은 물집과 같은 생체 외 돼지 피부 조각을 24시간 동안 PBS에 제형화시킨 mh-AON1 25μg과 함께 인큐베이션시킨 후 분석을 위해 처리하였다. 결과는 손상되지 않은 돼지 피부 조각에 첨가된 mh-AON1이 각질층에 침투되지 않음을 나타낸다(도 4a-b). 그러나 mh-AON1 제제를 물집과 같은 돼지 피부에서 배양한 경우에 올리고뉴클레오타이드가 진피에 침투한 것으로 관찰되었다(도 4c-f).
하이드로겔로 제형화된 mh - AON1
환자 상처에 적용하기 위해 mh-AON1을 연고 또는 젤에 통합시키는 것이 유리하다. DEB 환자가 상처 치료의 일부로서 하이드로겔을 사용하기 때문에 예를 들면 상처를 보습하고 통증과 가려움을 완화하기 위해 mh-AON1을 하이드로겔에 혼입시킬 수 있는지 여부를 테스트했다. 이 목적을 위해 3개의 상이한 하이드로겔이 사용되었다 :
(1) 환자 치료에 이미 사용된 하이드로겔인 flaminal, (2) 히프로멜로오스 하이드로겔 및 (3) 실험실 내에서 제조된 카보머 하이드로겔.
모든 하이드로겔은 이미 임상 환경에서 일반적으로 사용되는 것이다. 하이드로겔 제형을 올리고뉴클레오타이드를 포함 또는 비포함시켜 제조하고 피부 조각에 도포하였다. 25㎍의 mh-AON1을 각각의 피부 조각에 대해 50mg의 겔에 제형화시켜 최종 농도 0.5mg/ml의 올리고뉴클레오타이드를 제조하였다.
flaminal 히프로멜로오스 또는 카보머 하이드로겔에 제형화시킨 mh-AON1은 생체 내 돼지 피부 조각의 손상되지 않은 각질층을 전혀 침투할 수 없다는 것이 관찰되었다(도 5a, c, e, g). 그러나 세 가지 하이드로겔은 표피가 제거된 물집 모양의 돼지 피부의 진피에 올리고뉴클레오타이드를 전달할 수 있다(도 5b, d, f, h).
하이드로겔의 최적화가 진행 중이며 최종 제제의 선택은 피부 침투 깊이, 국소 내성, mh-AON1 조합의 pH, mh-AON1 하이드로겔 제형의 안정성 및 하이드로겔로부터의 mh-AON1로부터의 방출에 기초할 것이다.
결론
DEB 환자는 물집, 상처 및 궤양으로 인해 연약한 피부로 고통받는다. 또한 지속적인 상처 치료가 필요하다. 따라서 mh-AON1은 국소 전달 경로를 통해 평가되었다. DEB 환자 피부를 모방한 각질층을 포함하여 표피를 제거함으로써 물집과 유사한 피부를 생성하였다. PBS 나 하이드로겔에서 제형화된 mh-AON1은 물집과 유사한 피부에 침투하여 진피에 도달할 수 있음이 입증되었다.
이 결과는 환자의 피부 상처에 대한 국소 투여가 mh-AON1을 피부의 표적 세포에 전달할 수 있는 가능한 접근법이라는 것을 지지한다. 더욱이 이러한 연구 결과는 EB 표준과 유사한 제형이 mON AON1의 전달에 적합하다는 것을 뒷받침한다.
(실시예 3) mRNA 수준에서 효능 시험
mh-AON1의 효능을 평가하기 위해 두 종류의 세포 유형을 사용하였다 : (1) HeLa 및 (2) 건강한 사람의 피부에서 유래된 사람의 프라이머리 섬유아세포(HPF). 두 세포 유형 모두 COL7A1 mRNA를 발현하고 콜라겐 Ⅶ 형 단백질을 생성한다.
본 명세서에 개시된 mh-AON1은 엑손 73을 COL7A1 mRNA로부터 제거하고 따라서 전사체로부터 변이를 제거하도록 고안되었다. mh-AON1이 스플라이싱 과정을 표적으로 하기 때문에 효능의 가장 직접적인 측정 가능한 결과는 mh-AON1의 첨가 또는 미첨가시 COL7A1 전사체(야생형 및 Δ73)의 프로파일링 및 정량화이다.
중합효소 연쇄 반응( PCR )을 통한 COL7A1 mRNA 레벨의 프로파일링 및 정량화
PCR은 특정 DNA(cDNA) 서열의 대수적 증폭을 가능하게 하는 직접적인 기술이다. 엑손 73에 인접한 COL7A1 서열 특이적 프라이머를 사용하여 PCR 반응을 수행하였다. 그 후 형성된 생성물은 상이한 단편 길이 생성물의 식별 및 수율에 기반한 정량화 분석을 가능하게 하는 lab-on-a-chip 기술을 사용하여 시각화되었다.
엑손 73 스킵핑 실험을 위해, HPF 및 HeLa 세포를 트랜스펙션 비히클로서 폴리에틸렌이민(Poly I : C)을 사용하여 100 nM의 농도로 mh-AON1으로 트랜스펙션 시켰다. 트랜스펙션 24시간 또는 40시간 후에 세포를 채취하고 전체 mRNA를 분리하고, cDNA를 합성하고, 엑손 69에서 1개, 엑손 74에서 1개씩의 COL7A1 특이 프라이머를 사용하여 PCR 수행하였다. 음성 대조군으로서 스크램블(SCRM) 버전의 mh -AON1 올리고뉴클레오타이드를 사용하였다.
결과는 PCR에 의해 평가된 바와 같이 mh-AON1으로 처리하면 SCRM 처리 세포와 비교하여 COL7A1 mRNA로부터 엑손 73을 효율적으로 제거한다는 것을 나타낸다(도 6). 또한 미처리 세포에서 야생형 mRNA의 수준은 처리된 세포에서 총 COL7A1 mRNA의 수준과 유사했다. PCR/bioanalyzer 방법은 유익하지만 절대적 정량성을 지니지 않기 때문에 핵산 단편을 매우 정확하고 절대적으로 정량화하는 액적 디지털 PCR 분석법을 사용하여 이러한 초기 결과를 추적 관찰하였다.
액적 디지털 PCR 로 COL7A1 mRNA 전사체의 프로파일링 및 정량화
액적 디지털 PCR (ddPCR)은 PCR 샘플을 수 천 방울로 나누어 핵산을 매우 정확하고 절대적으로 정량화한다. COL7A1 mRNA/cDNA PCR 입력은 각 방울이 하나의 COL7A1 cDNA 분자를 포함하거나 또는 전혀 포함하지 않도록 조정되었다. 주형의 검출을 허용하기 위해 야생형 또는 Δ73 COL7A1에 특이적인 프로브를 PCR 혼합물에 첨가하였다. 이 프로브의 위치는 도 7에 나타나 있다.
다른 프로브는 Δ73 COL7A1 생성물에만 특이적인 반면 프로브 중 하나는 야생형 생성물에 특이적이다. 이 프로브는 주형과의 결합시 가수 분해되어 형광을 나타냄으로 PCR 증폭 후 표적 서열을 포함하는 형광 액적을 계산할 수 있다. 양성과 음성 방울 수에 대한 Poisson 통계 분석을 사용하여 표본에서 야생형 또는 Δ73 COL7A1 mRNA 분자의 절대 정량을 계산할 수 있다.
mh-AON1에 대한 용량-반응 프로파일을 확립하기 위해 HeLa 세포를 50, 100 또는 200nM mh-AON1로 트랜스펙션 시켰다. 트랜스펙션 후 24시간 후의 결과는 mh-AON1 처리가 COL7A1 야생형 전사체 및 Δ엑손 73 전사체 모두를 유도한다는 것을 나타낸다. 이 결과는 PCR에서 관찰된 것을 입증한다. 50nM의 용량은 이미 24시간 후에 최대 효과를 거의 나타낸다. 40시간 후, 50nM 및 200nM 트랜스펙션에 대한 Δ 엑손 73 전사체 %의 작은 증가가 관찰되었다(도 8).
(실시예 4) 시험관 내 면역원성 시험
올리고뉴클레오타이드는 척추동물의 선천성 면역계의 패턴 인식 수용체 (PRR) 활성화를 일으킬 가능성이 있다. PRR 수용체의 가장 잘 연구된 패밀리는 톨-유사 수용체(toll-like receptors, TLRs)이다. TLR은 타고난 면역 체계에서 중요한 역할을 하는 단백질의 한 종류이다. 그들은 미생물로부터 유래된 구조적으로 보존된 분자를 인식하는 대식세포 및 수지상 세포에서 통상적으로 발현되는 단일, 막-스패닝, 비-촉매성 수용체이다. 서로 다른 유형의 핵산에 의해 활성화되는 TLR은 엔도좀에 위치한다. TLR 3(이중 가닥 RNA를 인식); TLR7/8(이중 및 단일 가닥 RNA를 인식); 및 TLR9(CpG-DNA를 인식)이다.
PRR에 의해 이러한 성분이 인식되면 특정 '항균성' 면역 반응이 유도된다. TLR 활성화는 활성화된 B 세포(NF-κB), 인터페론 조절 인자 3(IRF-3) 및 활성화 인자 1(AP-1)의 핵 인자 카파-라이트-체인-인핸서의 활성화를 초래한다. AP-1, IRF-3 및 NF-κB의 활성화는 염증성 사이토카인, Ⅰ형 인터페론 및 선천성 면역 반응의 다른 매개체를 생성시킨다. 이 과정은 염증과 같은 즉각적인 숙주 방어 반응을 유발할 뿐만 아니라 항원 특이적인 적응성 면역 반응을 준비하고 조율한다.
mh-AON1에 대한 프라이머리 인간 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)의 시험관 내 노출을 이용하여 약물-특이적 면역 반응 및 면역 독성을 평가하였다. PBMC를 이용한 시험관 내 분석은 전신 면역 반응의 대용 표지자로서 (염증성) 사이토카인의 생성을 이용한 확립된 전임상 시험이다. PBMC 분석은 시험 화합물의 면역원성 및 알레르기성 잠재성의 요소로서 내성 예측을 가능하게 하고 이들 화합물에 대한 안전한 투여 범위의 추정을 가능하게 한다.
mh-AON1의 연구에서 실험실에서 분리된 PBMC가 사용되었고 건강한 혈액 은행 기증자의 연막(buffy coat)에서 수득하였다. 배양 상등액에서 중요한 프로-염증성 사이토카인의 생성은 10 nM 내지 1 μM 농도 범위의 mh-AON1로 24시간 자극한 후에 평가되었다. 또한 NF-κB 및/또는 AP-1에 의해 유도 가능한 분비된 배아 알칼라인 포스파타아제 레포터 컨스트럭트의 염색체 통합을 지니는 Ramos-Blue(Invivogen, 인간 B 세포) 레포터 세포주를 사용하여 PPR-매개 면역 활성화를 평가하였다.
Ramos-Blue 세포는 TLR3, -7/8 및 -9를 비롯한 관련 TLR 세트를 발현한다. 활성화 NF-κB 및/또는 AP-1은 10 nM 내지 1 μM 범위의 mh-AON1 또는 AON73.25.4로 24시간 자극한 후에 평가되었다.
또한, mh-AON1 처리 후 PBMC와 Ramos-Blue의 생존력은 mh-AON1의 잠재적인 세포 독성 효과를 평가하기 위해 배양 상등액의 형광성 레조루핀을 측정하여 분석하였다. 살아있는 세포는 비-형광 레자주린을 형광 레조루핀으로 변환시킨다.
인간 PBMC 에서의 결과
양성 대조군 LPS(TLR4 작용제) 및 R848(TLR7/8 작용제)을 사용한 인간 PBMC의 자극은 배양 상등액에서 IL-3를 제외한 모든 측정된 사이토카인의 농도를 유의미하게 증가시켰다. 더욱이 CpG DNA(TLR9 작용제) 또는 폴리 (I:C) (TLR3 작용제) 자극은 비슷한 정도의 사이토카인 패턴을 유도하였으나 그 정도는 낮았다. mh-AON1 또는 양성 대조군으로 자극한 후 배양 상등액에서 사이토카인 농도의 유의미한 수준을 나타내는 히트 맵을 생리식엄수-처리한 인간 PBMC와 비교하여 도 9a에 나타내었다.
중요하게도 10nM에서 1μM 범위의 mh-AON1 농도를 가진 인간 PBMC의 자극은 가장 낮은 농도의 mh-AON1에서 IFN-α2를 제외하고 배양 상등액에서 측정된 사이토카인의 농도를 증가시키지 않았다(도 9a). 그러나 mh-AON1에 의한 자극 후 상등액 내의 IFN-α2 농도의 증가는 투여량에 의존하지 않기 때문에 이는 실험적 아웃라이어 또는 기술적 오류로 간주되었다(도 9b).
마지막으로, mh-AON1으로 처리한 24시간 후에 세포 독성의 징후는 나타나지 않았다(도 9c). 대조적으로 R848, 또는 10nM 및 100nM m-AON1으로 처리한 후에 생존률의 경미한 증가가 나타났으며 이는 증가된 세포 생존, 증가된 세포 대사 또는 심지어 증가된 세포 증식/분화를 의미하는 것이다.
Ramos -Blue 세포에서의 결과
인간 Ramos-Blue 세포주에서 수행된 면역원성 분석의 결과는 10 nM 내지 1 μM 농도 범위의 mh-AON1 또는 AON73.24.5로 24시간 처리한 후 NF-κB 및/또는 AP-1의 활성을 나타내지 않았다(도 10a). 대조적으로 양성 대조군인 폴리 (I:C) (μg/ml), CpG (10μg/ml) 및 R848(1μM)은 NF-κB 및/또는 AP-1의 활성화를 유도하였다.
TLR4가 Ramos-Blue에서 발현되지 않았기 때문에 LPS는 효과를 나타내지 않았다. 또한 MH-AON1으로 처리한 24시간 후에 세포 독성의 징후는 나타나지 않았으며 이는 인간 PBMC에서 수득된 결과를 확인하는 것이다(도 10b).
본 발명은 단지 예로써 설명되었지만 본 발명의 범위 및 사상 내에서 변형이 이루어질 수 있음이 이해될 것이다.
SEQUENCE LISTING <110> PROQR THERAPEUTICS II B.V. <120> OLIGONUCLEOTIDES MATCHING COL7A1 EXON 73 FOR EPIDERMOLYSIS BULLOSA THERAPY <130> P065922WO <140> PCT/EP2016/______ <141> 2016-03-11 <150> GB-1504124.7 <151> 2015-03-11 <160> 52 <170> SeqWin2010, version 1.0 <210> 1 <211> 201 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 1 ggccccatcg gctttcctgg agaacgcggg ctgaagggcg accgtggaga ccctggccct 60 caggggccac ctggtctggc ccttggggag aggggccccc ccgggccttc cggccttgcc 120 ggggagcctg gaaagcctgg tattcccggg ctcccaggca gggctggggg tgtgggagag 180 gcaggaaggc caggagagag g 201 <210> 2 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Homo sapiens <400> 2 agcattctct cttccactcc tgcag 25 <210> 3 <211> 25 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 3 gtgaggctgg gggctggcca ggaga 25 <210> 4 <211> 8 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 4 uuuccugg 8 <210> 5 <211> 24 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antisense oligonucleotide <400> 5 ucuccaggaa agccgauggg gccc 24 <210> 6 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial 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oligonucleotide <400> 29 ccaggaaagc cgauggggcc cugc 24 <210> 30 <211> 24 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antisense oligonucleotide <400> 30 aggaaagccg auggggcccu gcag 24 <210> 31 <211> 24 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antisense oligonucleotide <400> 31 gaaagccgau ggggcccugc agga 24 <210> 32 <211> 24 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antisense oligonucleotide <400> 32 aagccgaugg ggcccugcag gagu 24 <210> 33 <211> 24 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antisense oligonucleotide <400> 33 gccgaugggg cccugcagga gugg 24 <210> 34 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antisense oligonucleotide <400> 34 gauggggccc ugcaggagug gaa 23 <210> 35 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antisense oligonucleotide <400> 35 cguucuccag gaaagccgau g 21 <210> 36 <211> 22 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antisense oligonucleotide <400> 36 ccugagggcc agggucucca cg 22 <210> 37 <211> 30 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antisense oligonucleotide <400> 37 ucuccacggu cgcccuucag cccgcguucu 30 <210> 38 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antisense oligonucleotide <400> 38 ucuccacggu cgcccuucag cccgc 25 <210> 39 <211> 18 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antisense oligonucleotide <400> 39 uccaggaaag ccgauggg 18 <210> 40 <211> 17 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antisense oligonucleotide <400> 40 uccaggaaag ccgaugg 17 <210> 41 <211> 16 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antisense oligonucleotide <400> 41 uccaggaaag ccgaug 16 <210> 42 <211> 18 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antisense oligonucleotide <400> 42 cuccaggaaa gccgaugg 18 <210> 43 <211> 18 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antisense oligonucleotide <400> 43 ucuccaggaa agccgaug 18 <210> 44 <211> 10 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antisense oligonucleotide <400> 44 uccaggaaag 10 <210> 45 <211> 18 <212> RNA <213> 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Claims (15)

  1. 인간 COL7A1 mRNA로 엑손 73의 내포를 예방 또는 감소시킬 수 있는 안티센스 올리고뉴클레오타이드에 있어서, 상기 mRNA는 포유동물 세포 내에서 pre-mRNA로부터 스플라이싱에 의해 생성되고 (a) 올리고뉴클레오타이드의 서열은 최대 2개의 CpG 서열을 지님 및/또는 (b) 올리고뉴클레오타이드는 24개 이하 뉴클레오타이드 길이를 지님을 특징으로 하는 안티센스 올리고뉴클레오타이드.
  2. 제 1항에 있어서, 특성 (a)는 올리고뉴클레오타이드가 최대 한 개의 CpG 서열을 지님을 특징으로 하는 안티센스 올리고뉴클레오타이드.

  3. 제 1항 또는 제 2항에 있어서, 특성 (b)는 올리고뉴클레오타이드가 23개 이하 뉴클레오타이드 길이를 지님을 특징으로 하는 안티센스 올리고뉴클레오타이드.
  4. 제 1항 또는 제 2항에 있어서, 특성 (b)는 올리고뉴클레오타이드가 16개 내지 24개 뉴클레오타이드 길이를 지님을 특징으로 하는 안티센스 올리고뉴클레오타이드.
  5. 제 1항 또는 제 2항에 있어서, 특성 (b)는 올리고뉴클레오타이드가 16개 내지 23개 뉴클레오타이드 길이를 지님을 특징으로 하는 안티센스 올리고뉴클레오타이드.
  6. 선행항 중 어느 한 항에 있어서, 특성 (b)는 올리고뉴클레오타이드의 서열이 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 또는 24개로 구성된 군에서 선택된 어느 하나의 뉴클레오타이드 길이를 지님을 특징으로 하는 안티센스 올리고뉴클레오타이드.
  7. 선행항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 올리고뉴클레오타이드는 특성 (a) 및 (b) 모두를 지님을 특징으로 하는 안티센스 올리고뉴클레오타이드.
  8. 선행항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 올리고리보뉴클레오타이드임을 특징으로 하는 안티센스 올리고뉴클레오타이드.
  9. 선행항 중 어느 한 항에 있어서, 뉴클레오사이드 간의 결합은 바람직하게는 포스포로티오에이트-결합인 화학적으로 변형된 결합임을 특징으로 하는 안티센스 올리고뉴클레오타이드.
  10. 선행항 중 어느 한 항에 있어서, 올리고뉴클레오타이드의 당 모이어티는 저급 2'-O-알킬, 바람직하게는 2'-O-메틸 치환 당 모이어티임을 특징으로 하는 안티센스 올리고뉴클레오타이드.
  11. 선행항 중 어느 한 항에 있어서, 올리고뉴클레오타이드는 70% 이상, 바람직하게는 75% 이상, 더욱 바람직하게는 80% 이상, 더욱 바람직하게는 85% 이상, 더욱 더 바람직하게는 90% 이상 HeLa 세포 또는 그로부터 유래된 샘플로부터 측정된 엑손 73의 내포 감소가 가능한 올리고뉴클레오타이드임을 특징으로 하는 안티센스 올리고뉴클레오타이드.
  12. 인간 COL7A1 mRNA로 엑손 73의 내포를 예방 또는 감소시킬 수 있는 안티센스 올리고뉴클레오타이드에 있어서, 상기 mRNA는 포유동물 세포 내에서 pre-mRNA로부터 스플라이싱에 의해 생성되고 상기 올리고뉴클레오타이드는 서열 5'-UUUCCUGG-3'(서열번호: 4)로 특징화되는 엑손 73 내의 (SRp40/SC35 결합 / ESE) 엘레멘트에 어닐링될 수 있음을 특징으로 하는 안티센스 올리고뉴클레오타이드.
  13. 제 12항에 있어서, 올리고뉴클레오타이드는 최대 한 개의 CpG 서열을 지님을 특징으로 하는 안티센스 올리고뉴클레오타이드.
  14. 제 12항 또는 제 13항에 있어서, 올리고뉴클레오타이드는 24개 이하 뉴클레오타이드 길이를 지님을 특징으로 하는 안티센스 올리고뉴클레오타이드.
  15. 인간 COL7A1 mRNA로 엑손 73의 내포를 예방 또는 감소시킬 수 있는 안티센스 올리고뉴클레오타이드에 있어서, 상기 mRNA는 포유동물 세포 내에서 pre-mRNA로부터 스플라이싱에 의해 생성되고, 올리고뉴클레오타이드는 서열번호: 5, 6, 7, 8, 24, 25, 26, 27, 28, 39, 40, 41, 42, 43, 29 및 35의 안티센스 올리고뉴클레오타이드로 구성된 군에서 선택된 올리고뉴클레오타이드임을 특징으로 하는 안티센스 올리고뉴클레오타이드.
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