JP2018509903A - 表皮水疱症治療のためのｃｏｌ７ａ１エクソン７３とマッチするオリゴヌクレオチド - Google Patents

Abstract

エクソン７３がヒトＣＯＬ７Ａ１ ｍＲＮＡに含まれるのを妨げるか、または低減することができるアンチセンスオリゴヌクレオチドは、以下のさまざまな方法で特徴づけられる：（ａ）オリゴヌクレオチドの配列が最大２つのＣｐＧ配列を含む；（ｂ）オリゴヌクレオチドが２４ヌクレオチド以下の長さを有する；（ｃ）オリゴヌクレオチドがエクソン７３の（ＳＲｐ４０／ＳＣ３５結合／ＥＳＥ）エレメントとアニーリングすることができる。これらのオリゴヌクレオチドは、有用なことには修飾ヌクレオシド間結合、例えば、ホスホロチオエート結合を有するオリゴリボヌクレオチドであってもよい。

Description

本出願は、２０１５年３月１１日に出願された英国特許出願第１５０４１２４．７号の利益を主張し、その完全な内容は、あらゆる目的のために参照によって本明細書に組み込まれる。

発明の分野
本発明は、ヒトの疾患を処置する際に使用するのに適したオリゴヌクレオチドに関する。特に、本発明は、ジストロフィー型表皮水疱症の処置に適したアンチセンスオリゴヌクレオチドに関する。

表皮水疱症（ＥＢ）は、遺伝性皮膚疾患のグループであり、皮膚および粘膜の慢性的な脆弱性および水疱形成を特徴とする。亜型によりＥＢの症状の範囲は非常に広く、極わずかな皮膚の脆弱性から全身的合併症を伴う極めて重篤な症状にまで及ぶ。世界中で約３５０，０００人の患者が冒されている。ＥＢの一部の型では、爪、髪および歯も関連する場合もある。ＥＢの主な型としては、ＥＢ単純型（ＥＢＳ）、接合部型ＥＢ（ＪＥＢ）、ジストロフィー型ＥＢ（ＤＥＢ）およびキンドラー症候群（ＫＳ）が挙げられる。

ＤＥＢは、ＥＢ患者の約２５％を冒し、優性遺伝性または劣性遺伝性のいずれかの可能性があり、ＶＩＩ型コラーゲン（ＣＯＬ７Ａ１、ｏｍｉｍ １２０１２０）の欠損を伴う。ＣＯＬ７Ａ１は、ＶＩＩ型コラーゲンのアルファ−１鎖をコードする。ＶＩＩ型コラーゲンは、真皮の上側部分の緻密層（基底膜の一部）との係留線維として働く。翻訳後修飾後に、３つの同一のアルファ−１鎖がコラーゲンの三重らせんドメインと一緒に折り畳まれる。その後、整列し係留線維を形成する逆平行二量体が形成される。ＶＩＩ型コラーゲンは、皮膚でケラチノサイトおよび皮膚線維芽細胞によって合成される。ＤＥＢ疾患の重症度は、基底膜領域におけるＶＩＩ型コラーゲン発現の量とおおむね相関する。

優性ジストロフィー型ＥＢ（ＤＤＥＢ）の特徴としては、手、足、肘および膝に局在するか、または全身性である場合もある水疱形成が挙げられる。一般的な所見としては、瘢痕化、稗粒腫、粘膜合併症、および異常な爪または爪がないことが挙げられる。劣性ジストロフィー型ＥＢ（ＲＤＥＢ）は、一般にＤＤＥＢよりも全身性で重篤である。ＤＤＥＢの所見に加えて、その他のＲＤＥＢの一般的な症状としては、栄養不良、貧血、骨粗鬆症、食道狭窄、発育遅延、ミトン状変形（mitten deformity）（偽合指症（pseudosyndactyly））の原因となる水かき（webbing）、または手足の指の癒着、筋拘縮の発症、歯の形成異常、小口症および眼の瘢痕化が挙げられる。このグループでは扁平上皮がんならびに転移性扁平上皮がんによる死亡のリスクが大幅に増加する。

遺伝子ＣＯＬ７Ａ１内に４００を超えるさまざまな突然変異が知られている。最も一般的な影響を及ぼすエクソンの１つ（患者の１８％）は、約４０の既知の突然変異を有するエクソン７３であり、最も多いのはミスセンス突然変異または未成熟終止コドン（ＰＴＣ）に至る突然変異およびグリシン置換である。

現在ＤＥＢに対する治療法はなく、緩和ケアが行われるだけである。ＲＤＥＢの重度の型は社会の医療のための予算に高いコストを課し、被覆材および薬剤の平均コストは、年間患者一人当たり約２００，０００ユーロである。

Ｉｎｓｔｉｔｕｔ Ｎａｔｉｏｎａｌ ｄｅ ｌａ Ｓａｎｔｅ ｅｔ ｄｅ ｌａ Ｒｅｃｈｅｒｃｈｅ Ｍｅｄｉｃａｌｅ（ＩＮＳＥＲＭ）の国際公開第２０１３／０５３８１９号パンフレットは、エクソン７３を対象とし、このエクソン全体をｍＲＮＡからスキップさせる２つのアンチセンスオリゴヌクレオチドについて開示している。エクソン７３欠損ｍＲＮＡは、ｗｔタンパク質よりも短いが、野生型ＶＩＩａ型コラーゲンと非常に似た挙動をとる機能的なポリペプチドに翻訳される。開示されているオリゴヌクレオチドの一方は２５ヌクレオチド長であり、６９％のスキッピング効率を示し、他方は３０ヌクレオチド長であり、９３％のスキッピング効率を示す。

国際公開第２０１３／０５３８１９号パンフレットの長いエクソンスキッピングＡＯＮは十分なエクソンスキッピング効率を示すようだが、その長さおよびいくつかの他の特徴により、ヒトの治療的使用のためのそのような分子を開発する観点からそのＡＯＮがあまり好ましくない。さらに、このオリゴヌクレオチドは、野生型ｍＲＮＡまたはエクソン７３を含まないｍＲＮＡのいずれにも対応しない中間のバンドも生成するようである。これらのバンドが臨床的関連性を有するかどうかはわかっていないが、副生成物の生成は、規制および安全性の観点からあまり好ましくない。したがって、ＤＥＢを処置するためのさらなる改良された療法が依然とし必要とされている。

したがって、本発明は、哺乳動物細胞においてｐｒｅ−ｍＲＮＡからのスプライシングによってヒトＣＯＬ７Ａ１ ｍＲＮＡが生成されるときに、エクソン７３が前記ｍＲＮＡに含まれるのを妨げるか、または低減することができるアンチセンスオリゴヌクレオチドであって（ａ）オリゴヌクレオチドの配列が最大２つのＣｐＧ配列を含む、かつ／または（ｂ）オリゴヌクレオチドが２４ヌクレオチド以下の長さを有することを特徴とするアンチセンスオリゴヌクレオチドを提供する。本オリゴヌクレオチドは、特性（ａ）および（ｂ）の両方を有することが有利である。

本発明はまた、哺乳動物細胞においてｐｒｅ−ｍＲＮＡからのスプライシングによってヒトＣＯＬ７Ａ１ ｍＲＮＡが生成されるときに、エクソン７３が前記ｍＲＮＡに含まれるのを妨げるか、または低減することができるアンチセンスオリゴヌクレオチドであって、配列５’−ＵＵＵＣＣＵＧＧ−３’（配列番号４）によって特徴づけられるエクソン７３の（ＳＲｐ４０／ＳＣ３５結合／ＥＳＥ）エレメントとアニーリングすることができることを特徴とするアンチセンスオリゴヌクレオチドを提供する。このオリゴヌクレオチドは、上記のとおりの特性（ａ）および／または（ｂ）を有してもよい。

本発明のオリゴヌクレオチドは、有用なことには修飾ヌクレオシド間結合、例えば、ホスホロチオエート結合を有するオリゴリボヌクレオチドであってもよい。これはまた、例えば、２’−Ｏ−メチル置換糖部分を有する修飾糖を有してもよい。オリゴヌクレオチドのこれらおよびその他の詳細については下で述べる。

イントロンの境界に隣接する５’および３’（配列番号２および３、小文字）を伴うヒトＣＯｌ７Ａ１エクソン７３（配列番号１、大文字）を示す図である。 エクソン７３にあるＳＲタンパク質結合部位の位置およびＡＯＮの位置を示す図である。 初代ヒト線維芽（ＨＰＦ）細胞に対するエクソンスキッピングのラボオンチップの結果を示す図である。完全長型ｍＲＮＡは約３５０ｂｐにバンドを示すのに対して、エクソン７３が排除されたｍＲＮＡは約１５０ｂｐである。 ｅｘ ｖｉｖｏブタ皮膚モデルを使用した、ＰＢＳ中に製剤化したｍｈ−ＡＯＮ１の送達の組織学的結果を示す図である。４Ａ〜４Ｂは、２５μｇのｍｈ−ＡＯＮを無傷の皮膚に２４時間に付けた結果を示し、４Ｃ〜４Ｆは、２５μｇのｍｈ−ＡＯＮ１を完全に表皮が除去された水疱様の皮膚に付けた結果を示す。Ｃ〜Ｄ：２４時間のインキュベーション。Ｅ〜Ｆ：４８時間のインキュベーション。ｍｈ−ＡＯＮ１は着色されている（赤）。スケールバーは１００μｍである。 図４と同じｅｘ ｖｉｖｏブタ皮膚モデルを使用した、３つの異なるハイドロゲル中に製剤化したｍｈ−ＡＯＮ１の送達の組織学的結果を示す図である。５Ａ〜５Ｂは、生理的食塩水対照により処置されたブタ皮膚の結果を、（Ａ）表皮が無傷の場合、および（Ｂ）表皮が除去された場合について示す。５Ｃ〜５Ｄは、Ｆｌａｍｉｎａｌ（商標）中に混合された５０μｇのｍｈ−ＡＯＮ１−ｃｙ５により処置されたブタ皮膚を、（Ｃ）表皮が無傷の場合、（Ｄ）表皮が除去された場合について示す。５Ｅ〜５Ｆは、カルボマーハイドロゲル中に混合された５０μｇのｍｈ−ＡＯＮ１−ｃｙ５により処置されたブタ皮膚の結果を、（Ｅ）表皮が無傷の場合、および（Ｆ）表皮が除去された場合について示す。５Ｇ〜５Ｈは、ヒプロメロースハイドロゲル中に混合された５０μｇのｍｈ−ＡＯＮ１−ｃｙ５により処置されたブタ皮膚の結果を、（Ｇ）皮膚が無傷の場合、および（Ｈ）表皮が除去された場合について示す。スケールバーは、１００μｍを示す。ｍｈ−ＡＯＮ１は着色されている（赤）。 ｍｈ−ＡＯＮ１による処理または対照オリゴとしてのスクランブルバリアント（ＳＣＲＭ）による処理後のＣＯＬ７Ａ１ ｍＲＮＡのスプライシング産物のラボオンチップの結果を示す図である。２４時間（左４レーン）または４０時間（右４レーン）のいずれかで、ともに１００ｎＭのオリゴヌクレオチドを用いて２つの異なる細胞タイプ（ＨｅＬａおよびＨＰＦ）を試験した。ｍｈ−ＡＯＮ１または対照オリゴ（エクソン７３を含むおよび含まない）による処理後、異なるＣＯＬ７Ａ１ ｍＲＮＡ産物が形成されている。異なるｍＲＮＡ産物を長さに関して分析した。３５０フラグメントは完全長の野生型ｍＲＮＡを表し、１５０ヌクレオチドのフラグメントは調整されたｍＲＮＡ産物を表す。 ｄｄＰＣＲアッセイのためのプライマー設計を示す図である。野生型産物（上側）またはΔエクソン７３産物（下側）のいずれかのみのＰＣＲに対する２つの異なるプライマーの組合せを設計した。上の行：野生型のためのプライマーの組、下の行：スキンピングされたエクソン７３のためのプライマーの組。 未変更のＣＯＬ７Ａ１配列をもつＨＰＦ細胞におけるエクソン７３を含むＣＯＬ７Ａ１ ｍＲＮＡ転写物、およびエクソン７３を含まないＣＯＬ７Ａ１ ｍＲＮＡ転写物の絶対的な定量（全コピーのうちの％、ｙ軸）を示すグラフである。用量−反応が５０、１００および２００ｎＭ（ｘ軸）でｍｈ−ＡＯＮ１を用いて行われた。オリゴヌクレオチドのトランスフェクション後２４時間（左）または４０時間（右）の結果を示す。黒いバーは完全長型産物を表し、灰色のバーは転写物Δ７３を表す。 ヒトＰＢＭＣにおけるｍｈ−ＡＯＮ１の免疫原性および免疫毒性評価の結果を示す図である。（ａ）生理的食塩水で処理したヒトＰＢＭＣと比較した、ｍｈ−ＡＯＮ１（１０ｎＭ、１００ｎＭもしくは１μＭ）または陽性対照ポリ（Ｉ：Ｃ）（１μｇ／ｍｌ）、ＣｐＧ（１０μｇ／ｍｌ）、ＬＰＳ（１００ｎｇ／ｍｌ）およびＲ８４８（１μＭ）によるヒトＰＢＭＣの２４時間の刺激後の培養上清中のサイトカイン濃度の有意水準を示すヒートマップ。どの正方形も測定した各サイトカインに関して処理条件（それぞれ３回の測定を行った５人のヒトドナーの幾何平均）毎の達した有意水準を示す。（ｂ）生理的食塩水で処理したＰＢＭＣと比較した、ｍｈ−ＡＯＮ１または陽性対照によるＰＢＭＣの２４時間の刺激後の培養上清中のＩＦＮ−α２濃度の変化倍率。バーは、各ヒトドナーあたりの３回の測定のＳＥＭを伴う平均を示す（異なる灰色の色調）。１にある点線は、生理的食塩水で処理したＰＭＢＣの相対的なサイトカイン濃度を示す。（ａ）および（ｂ）のＰ値は、ダンの事後検定とともにフリードマン検定を使用して求めた。（ｃ）生理的食塩水で処理したＰＢＭＣと比較した、ｍｈ−ＡＯＮ１または陽性対照への２４時間の曝露後のレゾルフィン蛍光の変化倍率として表した生存ＰＢＭＣの相対的な数。生存細胞評価は、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｂｌｕｅキットを使用して行った。すべての個々の生物学的再現のために、変化倍率は、測定したＲＦＵを対応する３回の生理的食塩水対照の幾何平均に対して標準化することによって算出した。その対応する生理的食塩水対照の平均（点線）に対して標準化された３つの変化倍率の平均±ＳＥＭとして個々のドナー毎の結果を示す。複数の補正（生理的食塩水と比較）のためにダネット検定とともに対応ありの一元配置分散分析法（Repeated measures One-way ANOVA）を行った。（＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ≦０．０１、＊＊＊＊Ｐ＜０．００１）。 ヒトＲａｍｏｓ−Ｂｌｕｅ細胞におけるｍｈ−ＡＯＮ１およびＡＯＮ７３．２４．５の免疫原性および免疫毒性評価の結果を示すグラフである。（ａ）Ｒａｍｏｓ−Ｂｌｕｅ細胞においてｍｈ−ＡＯＮ１またはＡＯＮ７３．２４．５（いくつかの濃度）およびＴＬＲアゴニスト、ポリ（Ｉ：Ｃ）（１μｇ／ｍｌ）、ＣｐＧ（１０μｇ／ｍｌ）、ＬＰＳ（１００ｎｇ／ｍｌ）およびＲ８４８（１μＭ）とともに２４時間インキュベーションした後のＮＦ−ｋＢ／ＡＰ−１活性化。（ｂ）生存Ｒａｍｏｓ−Ｂｌｕｅ細胞の相対的な数は、生理的食塩水で処理したＲａｍｏｓ−Ｂｌｕｅ細胞と比較した、ｍｈ−ＡＯＮ１、ＡＯＮ７３．４５．５または陽性対照への２４時間の曝露後のレゾルフィン蛍光の変化倍率として表した。生存細胞評価は、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｂｌｕｅキットを使用して行った。すべての個々の生物学的再現のために、変化倍率は、対応する３回の生理的食塩水対照の幾何平均に対して測定したＯ．Ｄ（ａでは）またはＲＦＵ（ｂでは）を標準化することによって算出した。結果は、その対応する生理的食塩水対照の平均（点線）に対して標準化された３つの変化倍率の平均±ＳＥＭとしてそれぞれ示す。変化倍率の値に対して複数の補正（生理的食塩水と比較）のためにダネット検定とともに対応ありの一元配置分散分析法を行った。（＊＊＊＊Ｐ＜．０００１）。

驚くべきことに、ここで、ＡＯＮをヒトの疾患、特にジストロフィー型表皮水疱症（ＤＥＢ）を処置するための治療薬（therapeutic）に発展させるためのＡＯＮに対する要件を満たすアンチセンスオリゴヌクレオチドを設計することができることが発明者らによって見出された。

国際公開第２０１３／０５３８１９号パンフレットにおいて開示されているＡＯＮ７３．３は、エクソン７３がＣＯＬ７Ａ１ ｍＲＮＡに含まれるのを低減することに関しては十分であるようだが、このオリゴヌクレオチドの３０ｎｔの長さは、必要以上に長く、これは製造性、ＣＭＣおよび商品原価の観点からあまり好ましくない。さらに、ＩＮＳＥＲＭオリゴヌクレオチドは、複数のＣｐＧリピートを含み、このことは、免疫原性の観点からあまり好ましくない。ＣｐＧ、とりわけ、そのリピートは、ＴＬＲ９レセプターと相互作用し、それにより、処置される個体において免疫応答を引き起こし、免疫応答はオリゴヌクレオチドにより処置される組織の機能を害する、かつ／またはそれを傷つける可能性もあることが知られている。

本発明の好ましいＡＯＮは、２５ヌクレオチド長未満、好ましくは２４ヌクレオチド長未満であり、高い効率でエクソン７３がＣＯＬ７Ａ１ ｍＲＮＡに含まれるのを妨げるか、または少なくとも低減することができ、先行技術と比較して、機能性を妨げる可能性のある構造または配列が少ない（好ましくはない）。

本発明のＡＯＮを使用した処置の結果としてエクソン７３全体がない短縮されたｍＲＮＡは、短いが機能的なＣＯＬ ＶＩＩタンパク質に翻訳されることになる。

本発明のＡＯＮは、ＨｅＬａ細胞で測定される場合に６０％を超える（例えば、７０％を超える、理想的には７５％または８０％を超える、好ましくは８５％を超える、およびさらにより好ましくは９０％を超える）エクソンスキッピング効率を達成すると同時に、好ましくは２つ以下（好ましくは１つのみ、さらには含まない）ＣｐＧ配列（複数可）を含み、かつ／または１６から２４ヌクレオチドの間の長さの範囲を含む。

本発明のさまざまな態様において、現在までに、エクソン７３に隣接する５’スプライシングアクセプター部位の選択に重要だと認識されていなかった８ｍｅｒのモチーフとアニーリングすることができるＡＯＮが設計された。この８ｍｅｒのモチーフは、エクソン７３がＣＯＬ７Ａ１ ｍＲＮＡに含まれるのを妨げるか、または少なくとも低減するために標的とされ得る、以前には見過ごされていたエクソン内スプライシング促進配列（exonic splicing enhancer）（ＥＳＥ）であると仮定される。本発明者らは、モチーフ全体またはモチーフの一部とアニーリングすることができるＡＯＮを使用し、エクソンスキッピングが完全に失われるまでこのモチーフと重なる部分を短くするために段階的にトランケートされたさまざまなＡＯＮを設計して、この新たに認識された推定上のＥＳＥの位置を決定するためにマイクロウォーク（microwalk）技術を使用した。そうすることにより、本発明者らは、エクソン７３がＣＯＬ７Ａ１ ｍＲＮＡに含まれるのを妨げるか、または少なくとも低減させるためのＡＯＮに対する優れた新規の標的を形成する５’−ＵＵＵＣＣＵＧＧ−３’モチーフ（配列番号４）をエクソン７３の５’領域（図１を参照）に特定した。

本発明の別の実施形態において、マウスおよびヒトの両方においてエクソン７３がＣＯＬ７Ａ１ ｍＲＮＡに含まれるのを効率的に妨げるか、または少なくとも低減することができるＡＯＮが開示されている。このＡＯＮ（ｍ−ｈＡＯＮ１）は、マウスおよびヒトの両方におけるｐｒｅ−ｍＲＮＡ標的と完全に相補的である。このＡＯＮは、最終的にヒトへの治療的使用のために開発されることになる分子と厳密に同じ分子を使用したマウスにおける概念研究および毒性学研究の証明を行うために使用することができるという利点を有する。

本発明によるどのＡＯＮも中間のバンドを生成しないようであり、本発明によるＡＯＮにより処理された細胞ではｗｔ ｍＲＮＡに対応するバンドまたはエクソン７３全体がないｍＲＮＡに対応するバンドのみが形成されるようである。

本発明によるＡＯＮのさらに好ましい特性は、本ＡＯＮがＧ−テトラド（tetrad）または複数のＧ配列（３つ以上の連続的なグアノシン）を含まないことにより、多重鎖（multiplex）形成および／または溶解度と関連する問題を回避することである。

表１は、各ＡＯＮに対するＨｅＬａ細胞におけるエクソン７３のスキッピング効率、本発明による好ましいＡＯＮ（ＡＯＮ１〜ＡＯＮ２５およびｍ−ｈＡＯＮ１）、新規のＥＳＥモチーフを特定するためのマイクロウォークに使用されたＡＯＮ（ＡＯＮ２６〜３０）、および依然として十分なエクソンスキッピング効率を示すと同時にＧ−テトラドなどの望ましくない構造がない、このＥＳＥモチーフと結合することがわかったＡＯＮのトランケート型バージョン（ＡＯＮ２４．１から２４．５）のヌクレオチド配列および配列番号を示す。ＡＯＮについてのさらなる詳細、他の細胞におけるそれらの有効性、および先行技術ＡＯＮとの比較については、実施例１に示す。

一実施形態によると、哺乳動物細胞においてｐｒｅ−ｍＲＮＡからのスプライシングによってＣＯＬ７Ａ１ ｍＲＮＡが生成されるときに、エクソン７３が哺乳動物（好ましくは、ヒト）の前記ｍＲＮＡに含まれるのを妨げるか、または低減することができるアンチセンスオリゴヌクレオチドであって、オリゴヌクレオチドの配列が特性（ａ）および／または（ｂ）：（ａ）最大２つのＣｐＧ配列を含む、かつ／または（ｂ）２４ヌクレオチド以下の長さを有する、のうちの少なくとも１つを有することを特徴とするアンチセンスオリゴヌクレオチドが提供される。特性（ａ）に関して、本オリゴヌクレオチドは、好ましくは、１つ以下のＣｐＧ配列を含み、１つのみ含んでもよい。

別の実施形態によると、哺乳動物細胞においてｐｒｅ−ｍＲＮＡからのスプライシングによってＣＯＬ７Ａ１ ｍＲＮＡが生成されるときに、エクソン７３が哺乳動物（好ましくは、ヒト）の前記ｍＲＮＡに含まれるのを妨げるか、または低減することができるアンチセンスオリゴヌクレオチドであって、エクソン７３の５’上流部分にある配列モチーフ５’−ＵＵＵＣＣＵＧＧ−３’（配列番号４）（図１）とアニーリングすることができることを特徴とするアンチセンスオリゴヌクレオチドが提供される。理論に束縛されることを望まないが、このモチーフは、ＳＲｐ４０／ＳＣ３５結合エクソン内スプライシング促進配列（ＥＳＥ）エレメントであると仮定される。この実施形態によるＡＯＮは、好ましくは、オリゴヌクレオチドの配列が上記のとおりの特性（ａ）および／または（ｂ）の一方または両方を有することを特徴とする。最適な効果があるようにするためには、本オリゴヌクレオチドは、８ｍｅｒのモチーフ全体とアニーリングすべきである。任意の特定のシナリオに対して６０％未満のエクソンスキッピング効率が許容される場合には、８ｍｅｒのモチーフの６または７つの大半の５’ヌクレオチドとのアニーリングが許容できる。

本発明によるさらに好ましいＡＯＮが、特徴（ａ）は、本オリゴヌクレオチドが１つ以下のＣｐＧを含むことを特徴とする、かつ／または特徴（ｂ）は、本オリゴヌクレオチドが、２４ヌクレオチド以下、好ましくは、１２から２４ヌクレオチドの間、より好ましくは、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３もしくは２４ヌクレオチドなどの１６から２４ヌクレオチドの間、さらにより好ましくは、２３ヌクレオチド未満、さらにより好ましくは、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３ヌクレオチドなど１６から２３ヌクレオチドの間の長さを有することを特徴とするＡＯＮである。本発明の最も好ましい実施形態によると、本オリゴヌクレオチドは、特性（ａ）最大２つのＣｐＧ配列、好ましくは、１つなどの１つ以下のＣｐＧおよび（ｂ）２４ヌクレオチド以下、好ましくは１２から２４ヌクレオチドの間、より好ましくは、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３もしくは２４ヌクレオチドなどの１６から２４ヌクレオチドの間、さらにより好ましくは、２３ヌクレオチド未満、さらにより好ましくは、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３ヌクレオチドなど１６から２３ヌクレオチドの間の長さの両方を有することを特徴とする。

本発明によるＡＯＮの任意のさらなる特徴は、それらの配列にひと続きの３つ以上の連続的なグアノシンがないことである。

本発明の特定の好ましいＡＯＮは、上記表１に開示されているヌクレオチド配列ＡＯＮ１、ＡＯＮ２、ＡＯＮ３、ＡＯＮ４、ＡＯＮ２０、ＡＯＮ２１、ＡＯＮ２２、ＡＯＮ２３、ＡＯＮ２４、ＡＯＮ２４．１、ＡＯＮ２４．２、ＡＯＮ２４．３、ＡＯＮ２４．３、ＡＯＮ．２４．４、ＡＯＮ．２４．５、ＡＯＮ２５およびｍｈ−ＡＯＮ１を有する。これらのオリゴに関して、すべてのリボース部分が２’−Ｏ−メチル化されており、実質的にすべてのヌクレオシド間結合がホスホロチオエートであることがより好ましい。

本発明のすべての実施形態において、「エクソンが含まれるのを妨げるか、または少なくとも低減すること」および「エクソンスキッピング」という用語は同義である。ＣＯＬ７Ａ１に関して、「エクソンが含まれるのを妨げるか、または少なくとも低減すること」または「エクソンスキッピング」は、エクソン７３（配列番号１またはそのアレル型）のヒトＣＯＬ７Ａ１ ｍＲＮＡ（図１を参照）からの排除と解釈されるべきである。エクソンスキッピングという用語は、本明細書において、エクソンスキッピングされていない成熟ｍＲＮＡに存在することになろう特定のエクソンを含まない成熟ｍＲＮＡを細胞内で誘導することと定義される。エクソンスキッピングは、スプライシングの生化学的プロセスを可能にするために必要とされる、例えば、スプライスドナー配列もしくはスプライシングアクセプター配列などの配列を妨害することができる分子を用いて、またはひと続きのヌクレオチドを成熟ｍＲＮＡに含まれるべきエクソンと認識するために必要とされるエクソン選択シグナル（exon inclusion signal）を妨害することができる分子を用いて前記成熟ｍＲＮＡのｐｒｅ−ｍＲＮＡを発現する細胞をもたらすことによって達成される。そのような分子は、本明細書においてはエクソンスキッピング分子と呼ばれる。

ｐｒｅ−ｍＲＮＡという用語は、転写によって細胞でＤＮＡ鋳型から合成されるプロセシングされていないか、または部分的にプロセシングされた前駆体ｍＲＮＡを指す。

「アンチセンスオリゴヌクレオチド」という用語は、ｐｒｅ−ｍＲＮＡ分子、ｈｎＲＮＡ（ヘテロ核ＲＮＡ）またはｍＲＮＡ分子中の標的ヌクレオチド配列と相補的であり、その結果、その対応する標的配列とアニーリングすることができるヌクレオチド配列を指すものと理解される。

「相補的な」という用語は、本明細書中で使用される場合、「完全に相補的な」と、通常、オリゴヌクレオチドとその対応する標的配列との間の相補性の程度が８０％超、好ましくは８５％超、さらにより好ましくは９０％超、最も好ましくは９５％超になることを意味する「実質的に相補的な」とを含む。例えば、その配列とその標的配列との間に１つのミスマッチを含む２０ヌクレオチド長のオリゴヌクレオチドに対する、相補性の程度は９５％である。

アンチセンス配列の相補性の程度は、アンチセンス配列を含む分子が生理的条件下においてＲＮＡ分子中の標的ヌクレオチド配列とアニーリングすることができ、それによりエクソンスキッピングを促進するようにされることが好ましい。特定のミスマッチは、他のものよりも融解温度すなわちＴｍを単位として表されるＡＯＮと標的配列との間の結合の強度に対する影響が小さいため、特定のミスマッチは他のものより許容されることが当業者にはよく知られている。特定の非相補的な塩基対は、真のミスマッチほどではないにせよ全体的な結合を妨げる、いわゆる「ゆらぎ」を生じる場合もある。ＡＯＮの長さも結合の強度に影響を与え、長いＡＯＮは、通例、短いＡＯＮよりも高い融解温度を有し、オリゴヌクレオチドのＧ／Ｃ含有量も結合の強度を決定する要素であり、Ｇ／Ｃ含有量が高いと任意の所与の長さに対する融解温度がより高くなる。本発明によって意図されるとおりのヌクレオベースまたは糖・リン酸骨格の特定の化学修飾も結合の強度に影響を与える可能性があるため、相補性の程度は、本発明によるオリゴヌクレオチドを設計するときに考慮すべき一要素に過ぎない。

オリゴヌクレオチド中の１つＣｐＧまたは多数（２つ以上）のＣｐＧの存在は、通常、前記オリゴヌクレオチドの免疫原性の増加と関連づけられる（Dorn & Kippenberger, 2008）。この免疫原性の増加は、処置される組織、すなわち、皮膚（真皮および／または表皮）に損傷を引き起こす可能性もあるため望ましくない。

本発明は、許容できるＲＮＡ結合動態および／または熱力学的特性を有するオリゴヌクレオチドを設計することを可能にする。ＲＮＡ結合動態および／または熱力学的特性は、オリゴヌクレオチドの融解温度（Ｔｍ、基礎のＴｍおよび最隣接モデルを使用して単鎖ＲＮＡに対するオリゴヌクレオチド特性計算機（ｗｗｗ．ｕｎｃ．ｅｄｕ／〜ｃａｉｌ／ｂｉｏｔｏｏｌ／ｏｌｉｇｏ／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍｌ）により算出される）および／またはＡＯＮ標的エクソン複合体の自由エネルギー（ＲＮＡ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅバージョン４．５を使用）によって少なくとも部分的に決定される。Ｔｍが高すぎると、オリゴヌクレオチドは、あまり特異的でなくなることが予想される。許容できるＴｍおよび自由エネルギーは、オリゴヌクレオチドの配列、骨格（ホスホジエステル、ホスホロチオエート、ホスホルアミデート、ペプチド−核酸など）の化学的性質、糖部分の性質（リボース、デオキシリボース、置換リボース、分子内架橋）およびヌクレオベースの化学修飾により決まる。したがって、Ｔｍの範囲は、広く変化する場合がある。

本発明の一態様によると、ＡＯＮを用いたエクソン７３の５’領域のマイクロウォーキングによって本発明による新規のＡＯＮが提供される。したがって、本発明によるＡＯＮを設計するために適した標的を形成する新規の８ヌクレオチドのモチーフ（推定上のＥＳＥ）が特定された。

本発明者らが選択したオリゴの長さは１６から２４ヌクレオチドの間であったが、別の長さも可能である。長いオリゴヌクレオチドほど、製造するために費用がかかり、分析的な観点からさらに複雑であるため、標的ＲＮＡとの安定した相互作用および標的配列に対する特異性を可能にするだけ十分に長いが、必要以上には長くない長さを有することが好ましい。例に示されるとおり、エクソン７３の５’領域は、エクソンスキッピングのそれらの効果に関してｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイにおいて試験される一連の重複オリゴヌクレオチドを作製することによって有効なエクソンスキッピング分子に関して精査されてもよい。満足のいくエクソンスキッピング効果を証明したＡＯＮは、その後、製造性、免疫原性および本明細書において示されるその他の有用性基準に基づいてさらに選択される。

逆の方策も可能である。この方策によると、製造性、免疫原性および本発明によって提供されるその他の有用性基準に基づいてまずオリゴが設計され、その後、エクソンスキッピング効果に関して試験される。前記オリゴヌクレオチドの機能活性は、好ましくは、一定の程度まで、および／または少なくとも部分的にエクソン７３含有ｍＲＮＡの生成を低減するエクソン７３（配列番号１）のスキッピングを誘導し、それにより、野生型よりも短いが機能的なコラーゲンタンパク質の産生を増加させる。

エクソンスキッピングパーセンテージまたは効率は、サイクル数が、増幅が依然として指数関数的段階にあるような条件で、任意の所与のプライマーセットに関して、所与の数のＰＣＲサイクル後の増幅された短縮型（エクソン７３を含まない）バンドの濃度で割り、１００％を掛けた増幅された野生型バンドの濃度を求めることによって算出されてもよい。定量化は、Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ ＤＮＡ１０００装置を使用して行ってもよい。

本発明による好ましいＡＯＮは、ＲＴ−ＰＣＲ分析によって測定される場合に、非処置細胞と比較してＡＯＮ処置した細胞において７０％超、より好ましくは８０％超、さらにより好ましくは９０％超のスキッピングパーセンテージを示すものである。

好ましくは、配列番号１に示されるとおりのヌクレオチド配列と相補的な配列を含む本発明によるＡＯＮは、相補的な部分が、標的配列と少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％、さらにより好ましくは少なくとも９５％、最大１００％相補的であるようにされる。したがって、相補性の領域にあるすべての塩基が対向する鎖にある塩基と対形成することができることが絶対に必要とされる訳ではない。例えば、オリゴヌクレオチドを設計するとき、例えば、相補的な鎖にある塩基と塩基対にならない残基を組み込むことを望むこともできる。細胞の環境下において、ひと続きのヌクレオチドが相補的な部分と十分にハイブリダイズすることができるなら、ミスマッチは、ある程度許容される場合もある。この文脈において、「十分に」は、本発明によるＡＯＮがエクソン７３のエクソンスキッピングを誘導することができることを意味する。標的とされるエクソンのスキッピングは、好都合にもＲＴ−ＰＣＲによって評価することができる。相補的な領域は、組み合わされる場合、ｐｒｅ−ｍＲＮＡのエクソンに特異的であるよう設計されることが好ましい。そのような特異性は、この系の他の（ｐｒｅ−）ｍＲＮＡ分子にある実際の配列に依存するため、さまざまな長さの相補的な領域を用いて作り出すことができる。オリゴヌクレオチドのサイズを増加させることでオリゴヌクレオチドが１つ以上の他のｐｒｅ−ｍＲＮＡ分子ともハイブリダイズすることができてしまうリスクは低下するが、長さは製造性、精製および／または分析に関する問題の原因となるほど長過ぎてはならない。

相補性の領域にミスマッチを含むが、ｐｒｅ−ｍＲＮＡの標的とされる領域（複数可）とハイブリダイズする能力および／または結合する能力を保持するオリゴヌクレオチドを本発明に使用することができることは明らかである。しかしながら、相補的な部分は、一般に１つ以上の相補的な領域にそのようなミスマッチを有するオリゴヌクレオチドよりも高い効率および高い特異性を有するため、少なくとも相補的な部分は、そのようなミスマッチを含まないことが好ましい。さらに高いハイブリダイゼーション強度（すなわち、対向する鎖との相互作用の数を増加させる）は、系のスプライシング機構を妨害するプロセスの効率を増加させる際に有利であると考えられる。好ましくは、相補性は、９０％から１００％である。一般に、これは、２０ヌクレオチドのオリゴヌクレオチドに１もしくは２つのミスマッチを許容する。

本発明のエクソンスキッピング分子は、好ましくは、配列番号１と相補的な（アンチセンス）オリゴヌクレオチドである。

好ましくは、オリゴヌクレオチドの相補的な部分の長さは、オリゴヌクレオチドの長さと同じであり、これは、標的ＲＮＡと塩基対を形成しないオリゴの５’末端または３’末端がないことを意味する。したがって、本発明のオリゴヌクレオチドに関する好ましい長さは、２４ヌクレオチド以下、例えば、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３または２４ヌクレオチドである。

１６から２４ヌクレオチドの間の長さを有するＡＯＮを用いると特に良好な結果が得られた。

本発明によるエクソンスキッピング分子は、１つ以上のＤＮＡ残基（したがって、ＲＮＡ「ｕ」残基がＤＮＡ対応物として「ｔ」残基になる）、もしくは１つ以上のＲＮＡ残基、および／または本明細書の下でさらに詳述されることになる１つ以上のヌクレオチドアナログもしくは等価物を含んでもよい。配列番号５〜３５および３９〜４３はＲＮＡ配列であるが、本発明は、ＤＮＡ形態のこれらの各配列、およびこれらの配列のＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドも包含する。

本発明のエクソンスキッピング分子は、ヌクレアーゼ耐性を高めるため、および／または標的配列に対するアンチセンスオリゴヌクレオチドの親和性を高めるために修飾された１つ以上の残基を含むことが好ましい。ゆえに、好ましい実施形態において、本アンチセンスヌクレオチド配列は、少なくとも１つのヌクレオチドアナログまたは等価物を含み、ヌクレオチドアナログまたは等価物は、修飾塩基、および／または修飾骨格、および／または非天然のヌクレオシド間結合あるいはこれらの修飾の組合せを有する残基と定義される。

好ましい実施形態において、本ヌクレオチドアナログまたは等価物は、修飾骨格を含む。そのような骨格の例は、モルフォリノ骨格、カルバメート骨格、シロキサン骨格、スルフィド、スルホキシドおよびスルホン骨格、ホルムアセチル（formacetyl）およびチオホルムアセチル骨格、メチレンホルムアセチル骨格、リボアセチル（riboacetyl）骨格、アルケン含有骨格、スルファメート、スルホネートおよびスルホンアミド骨格、メチレンイミノおよびメチレンヒドラジノ骨格、およびアミド骨格によって提供される。ホスホロジアミデートモルフォリノオリゴマーは、アンチセンス薬剤として以前に調査された修飾骨格オリゴヌクレオチドである。モルフォリノオリゴヌクレオチドは、ＤＮＡのデオキシリボース糖が六員環で置換され、ホスホジエステル結合がホスホロジアミデート結合で置換された無荷電骨格を有する。モルフォリノオリゴヌクレオチドは、酵素分解に耐性があり、ＲＮａｓｅ Ｈを活性化することよりむしろ翻訳を阻止すること、またはｐｒｅ−ｍＲＮＡスプライシングを妨げることによってアンチセンス薬剤として働くようである。モルフォリノオリゴヌクレオチドは、細胞膜を物理的に破壊する方法によって首尾よく組織培養細胞に送達され、こうしたいくつかの方法を比較した研究の１つは、スクレープローディング（scrape loading）が最も効率的な送達の方法であることを見出したが、モルフォリノ骨格は荷電していないため、カチオン性脂質は、細胞へのモルフォリノオリゴヌクレオチド取り込みの有効なメディエーターではない。

本発明の一実施形態によると、骨格の残基間の結合は、リン原子を含まず、これは例えば、短鎖アルキルによって形成される結合またはシクロアルキルヌクレオシド間結合、混合したヘテロ原子とアルキルもしくはシクロアルキルヌクレオシド間結合、または１つ以上の短鎖ヘテロ原子結合もしくは複素環式ヌクレオシド間結合である。

この実施形態によると、好ましいヌクレオチドアナログまたは等価物は、修飾ポリアミド骨格を有するペプチド核酸（ＰＮＡ）を含む（Nielsen, et al. (1991) Science 254, 1497-1500）。ＰＮＡベースの分子は、塩基対の認識に関してＤＮＡ分子の真の模倣物である。ＰＮＡの骨格は、ペプチド結合によって連結されたＮ−（２−アミノエチル）−グリシン単位から構成され、ヌクレオベースは、メチレンカルボニル結合によって骨格と連結される。代替的な骨格は、炭素１つ伸長したピロリジンＰＮＡモノマーを含む（Govindaraju and Kumar (2005) Chem. Commun, 495-497）。ＰＮＡ分子の骨格は荷電したリン酸基を含まないため、ＰＮＡ−ＲＮＡハイブリッドは、通常、それぞれＲＮＡ−ＲＮＡハイブリッドまたはＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッドよりも安定している（Egholm et al. (1993) Nature 365, 566-568）。

本発明の別の実施形態によると、骨格は、モルフォリノヌクレオチドアナログまたは等価物を含み、その中のリボースまたはデオキシリボース糖がモルフォリノ六員環（6-membered morpholino ring）で置換されている。最も好ましいヌクレオチドアナログまたは等価物は、ホスホロジアミデートモルフォリノオリゴマー（ＰＭＯ）を含み、その中のリボースまたはデオキシリボース糖がモルフォリノ六員環で置換されており、隣接するモルフォリノ環間のアニオン性ホスホジエステル結合が非イオン性ホスホロジアミデート結合によって置換されている。

さらに別の実施形態において、本発明のヌクレオチドアナログまたは等価物は、ホスホジエステル結合にある１つの非橋架酸素の置換を含む。この修飾は、塩基対合をやや不安定にするが、ヌクレアーゼ分解に対する著しい耐性を付加する。好ましいヌクレオチドアナログまたは等価物は、ホスホロチオエート、キラルホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、リン酸トリエステル、アミノアルキルリン酸トリエステル、Ｈ−ホスホネート、メチルホスホネートおよび３’−アルキレンホスホネート、５’−アルキレンホスホネートおよびキラルホスホネートを含むその他のアルキルホスホネート、ホスフィネート、３’−アミノホスホロアミデートおよびアミノアルキルホスホロアミデートを含むホスホロアミデート、チオノホスホロアミデート、チオノアルキルホスホネート、チオノアルキルリン酸トリエステル、セレノリン酸またはボラノリン酸を含む。

本発明のさらに好ましいヌクレオチドアナログまたは等価物は、例えば、−ＯＨ；−Ｆ；１つ以上のヘテロ原子の割り込みがあってもよい置換または非置換、直鎖または分岐の低級（Ｃ１〜Ｃ１０）アルキル、アルケニル、アルキニル、アルカリール、アリル、またはアラルキル；Ｏ−、Ｓ−、またはＮ−アルキル；Ｏ−、Ｓ−、またはＮ−アルケニル；Ｏ−、Ｓ−またはＮ−アルキニル；Ｏ−、Ｓ−、またはＮ−アリル；Ｏ−アルキル−Ｏ−アルキル、−メトキシ、−アミノプロポキシ；メトキシエトキシ；−ジメチルアミノオキシエトキシ；および−ジメチルアミノエトキシエトキシにより２’、３’および／または５’位において一置換または二置換された１つ以上の糖部分を含む。糖部分は、フラノースもしくはその誘導体、またはデオキシフラノースもしくはその誘導体、好ましくは、リボースもしくはその誘導体またはデオキシリボースもしくはその誘導体であってもよい。好ましい誘導体化糖部分は、ロックド核酸（ＬＮＡ）を含み、その中の２’−炭素原子が糖環の３’または４’炭素原子と連結され、それにより二環式の糖部分を形成する。好ましいＬＮＡは、２’−Ｏ、４’−Ｃ−エチレン−架橋化核酸を含む（Morita et al. 2001. Nucleic Acid Res Supplement No. 1: 241-242）。これらの置換は、ヌクレオチドアナログまたは等価物をＲＮａｓｅ Ｈおよびヌクレアーゼ耐性にし、標的ＲＮＡに対する親和性を高める。

アンチセンスオリゴヌクレオチドのすべてのヌクレオシド間結合が必ずしも修飾されている必要がないことは当業者に理解される。例えば、一部のヌクレオシド間結合が無修飾であってもよいのに対し、その他のヌクレオシド間結合が修飾されている。一形態の（修飾）ヌクレオシド間結合、ＡＯＮの長さ方向に沿って均一または不均一に分散した複数の形態の（修飾）ヌクレオシド間結合からなる骨格を含むＡＯＮはすべて本発明によって包含される。さらに、骨格修飾（均一、不均一、一形態もしくは複数形態およびそれらのすべての変形）の任意の様式を、下で言及される糖もしくはヌクレオシド修飾またはアナログの任意の形態と組み合わされてもよい。

本発明によるＡＯＮに特に好ましい骨格は、均一な（すべて）ホスホロチオエート（ＰＳ）骨格である。

別の実施形態において、本発明のヌクレオチドアナログまたは等価物は、１つ以上の塩基修飾または置換を含む。修飾塩基は、イノシン、キサンチン、ヒポキサンチンおよび当該技術分野において知られているか、または知られることになるピリミジン塩基およびプリン塩基の他の−アザ、デアザ、−ヒドロキシ、−ハロ、−チオ、チオール、−アルキル、−アルケニル、−アルキニル、チオアルキル誘導体などの合成および天然の塩基を含む。

アンチセンスオリゴヌクレオチドのすべての位置が均一に修飾されている必要はないことが当業者に理解される。さらに、上記のアナログまたは等価物の１つ超が、１つのアンチセンスオリゴヌクレオチドまたはさらにはアンチセンスオリゴヌクレオチド内の１つの位置に組み込まれてもよい。特定の実施形態において、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、少なくとも２つの異なる種類のアナログまたは等価物を有する。

別の実施形態によると、本発明によるＡＯＮは、２’−Ｏ（好ましくは、低級）アルキルホスホロチオエートアンチセンスオリゴヌクレオチド、例えば、２’−Ｏ−メチル修飾リボース（ＲＮＡ）、２’−Ｏ−メトキシエチル修飾リボース、２’−Ｏ−エチル修飾リボース、２’−Ｏ−プロピル修飾リボース、および／またはハロゲン化誘導体などのこれらの修飾の置換誘導体を含む。

本発明による有効で好ましいアンチセンスオリゴヌクレオチド様式は、ホスホロチオエート骨格を伴う２’−Ｏ−メチル修飾リボース部分を含み、好ましくは、実質的にすべてのリボース部分が２’−Ｏ−メチルであり、実質的にすべてのヌクレオシド間結合がホスホロチオエート結合である。

ＣＯＬ７Ａ１遺伝子のエクソン７３の効率的なスキッピングのためにさまざまなアンチセンスオリゴヌクレオチドを組み合わせることができることも当業者には理解されるであろう。少なくとも１つＡＯＮが本発明によるＡＯＮである限り、エクソン７３（図１）の同じ領域または異なる領域を標的とする２つのアンチセンスオリゴヌクレオチド、例えば、２つのアンチセンスオリゴヌクレオチド、３つの異なるアンチセンスオリゴヌクレオチド、４つの異なるアンチセンスオリゴヌクレオチド、または５つの異なるアンチセンスオリゴヌクレオチドの組合せが本発明の方法に使用されてもよい。

アンチセンスオリゴヌクレオチドは、細胞、好ましくは、皮膚細胞へのアンチセンスオリゴヌクレオチドの取り込みを高める部分に連結されてもよい。そのような部分の例は、コレステロール、炭水化物、ビタミン、ビオチン、脂質、リン脂質、細胞透過性ペプチドであり、以下に限定されるものではないが、アンテナペディア、ＴＡＴ、トランスポータンおよびオリゴアルギニン（oligoarginine）、ポリアルギニン、オリゴリジン（oligolysine）またはポリリジンなどの正電荷アミノ酸、抗体によってもたらされるものなどの抗原結合ドメイン、抗体のＦａｂフラグメント、またはラクダ科動物のシングルドメイン抗原結合ドメインなどの単鎖抗原結合ドメインを含む。

本発明によるエクソンスキッピング分子は、ネイキッド（naked）（裸の（gymnotic））アンチセンスオリゴヌクレオチドもしくは複合体の形態であってもよく、またはベクターから発現されてもよい（ベクターにより運ばれる（vectored）ＡＯＮ）。本エクソンスキッピング分子は、当該技術分野において既知の適した手段を使用して投与することができる。エクソンスキッピング分子がベクターにより運ばれるＡＯＮである場合、ＡＯＮは、例えば、前記オリゴヌクレオチドを含む転写物をコードする発現ベクターの形態で個体または前記個体の細胞、組織もしくは臓器に与えられてもよい。発現ベクターは、好ましくは細胞、組織、臓器または個体にウイルスベクターなどの遺伝子送達媒体により導入される。好ましい実施形態において、本明細書において特定されるエクソンスキッピング分子の発現または転写を駆動する発現カセットまたは転写カセット（transcription cassette）を含むウイルスベースの発現ベクターが提供される。したがって、本発明は、エクソンスキッピング分子の発現を促す条件下に置かれたときに本発明によるエクソンスキッピング分子を発現させるウイルスベクターを提供する。細胞は、例えば、プラスミドによるアンチセンスオリゴヌクレオチド発現またはアデノウイルスもしくはアデノ随伴ウイルスベースのベクターによってもたらされるウイルス発現によって、エクソン７３が含まれるために必須の、または少なくともそれを促す配列を妨害することができるエクソンスキッピング分子が与えられてもよく、その結果、そのような妨害が、エクソン７３がＣＯＬ７Ａ１ ｍＲＮＡに含まれるのを妨げるか、少なくとも低減する。発現は、Ｕ１、Ｕ６、またはＵ７ ＲＮＡプロモーターなどのポリメラーゼＩＩＩプロモーターによって駆動されてもよい。好ましい送達媒体は、アデノ随伴ウイルスベクター（ＡＡＶ）などのウイルスベクター、またはレンチウイルスベクターなどのレトロウイルスベクターなどである。また、プラスミド、人工染色体、標的相同組換えおよび細胞の哺乳動物（好ましくは、ヒト）ゲノムへの組み込みに使用可能なプラスミドが、本明細書中で定義されるオリゴヌクレオチドの送達に適切に利用されてもよい。転写がＰｏｌＩＩＩプロモーターから行われ、かつ／または転写物がＵ１またはＵ７転写物との融合物の形態であるそうしたベクターが本発明に好ましく、これが小さな転写物の送達に関して良好な結果をもたらす。適した転写物を設計することは技術のある技術者の範囲内にある。ＰｏｌＩＩＩによる転写物が好ましい。Ｕ１またはＵ７転写物との融合転写物の形態が好ましい。そのような融合物は、当該技術分野において記載されているとおりに作り出すことができる（例えばGorman L et al., 1998またはSuter D et al., 1999を参照）。

好ましいアンチセンスオリゴヌクレオチド発現系の１つは、アデノウイルス随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベースのベクターである。ＣＯＬ７Ａ１エクソン７３の極めて効率的なスキッピングためのアンチセンスヌクレオチド配列の長期の発現のために使用することができる単鎖および二重鎖ＡＡＶベースのベクターが開発された。

好ましいＡＡＶベースのベクターは、例えば、ポリメラーゼＩＩＩプロモーター（Ｐｏｌ ＩＩＩ）によって駆動される発現カセットを含む。好ましいＰｏｌ ＩＩＩプロモーターは、例えば、Ｕ１、Ｕ６、またはＵ７ ＲＮＡプロモーターである。

したがって、本発明は、ＣＯＬ７Ａ１エクソン７３のスキッピングを誘導するための本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドの発現のためのＰｏｌ ＩＩＩプロモーター駆動発現カセットを含むウイルスベースのベクターも提供する。

本発明によるＡＡＶベクターは組換えＡＡＶベクターであり、本明細書中の別の場所で示したＡＡＶ血清型由来のカプシドタンパク質のタンパク質の殻に包まれた本発明によるコード化エクソンスキッピング分子を含むＡＡＶゲノムの部分を含むＡＡＶベクターを指す。ＡＡＶゲノムの部分は、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９およびその他などのアデノ随伴ウイルス血清型由来の末端逆位配列（ＩＴＲ）を含んでもよい。カプシドタンパク質から構成されるタンパク質の殻は、ＡＡＶ１、２、３、４、５、８、９およびその他などのＡＡＶ血清型由来のものであってもよい。タンパク質の殻は、カプシドタンパク質の殻と呼ばれる場合もある。ＡＡＶベクターは、野生型ＡＡＶ遺伝子の１つまたは好ましくはすべてが除去されていてもよいが、依然として機能的なＩＴＲ核酸配列を含んでもよい。機能的なＩＴＲ配列は、ＡＡＶビリオンの複製、レスキューおよびパッケージングに必要である。ＩＴＲ配列は、機能的なままである限り、野生型配列であってもよく、または野生型配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５、もしくは１００％の配列同一性を有してもよく、または例えば、ヌクレオチドの挿入、突然変異、欠失もしくは置換によって改変されていてもよい。この状況において、機能性とは、カプシドの殻へのゲノムのパッケージングを指示し、その結果、感染した宿主細胞または標的細胞における発現を可能にさせる能力を指す。本発明の状況において、カプシドタンパク質の殻は、ＡＡＶベクターゲノムＩＴＲと異なる血清型のものであってもよい。したがって、本発明によるＡＡＶベクターは、カプシドタンパク質の殻、すなわち、正二十面体のカプシドから構成されてもよく、それが、１つのＡＡＶ血清型、例えば、ＡＡＶ血清型２のカプシドタンパク質（ＶＰ１、ＶＰ２、および／またはＶＰ３）を含み、一方、ＡＡＶ５ベクターに含まれるＩＴＲ配列は、ＡＡＶ２ベクターを含む任意の上記のＡＡＶ血清型であってもよい。したがって、「ＡＡＶ２ベクター」は、ＡＡＶ血清型２のカプシドタンパク質の殻を含み、例えば、「ＡＡＶ５ベクター」は、ＡＡＶ血清型５のカプシドタンパク質の殻を含み、それにより、どちらも本発明による任意のＡＡＶベクターゲノムＩＴＲを包んでもよい。

好ましくは、本発明による組換えＡＡＶベクターは、ＡＡＶ血清型２、５、８またはＡＡＶ血清型９のカプシドタンパク質の殻を含み、前記ＡＡＶベクターに存在するＡＡＶゲノムまたはＩＴＲは、ＡＡＶ血清型２、５、８またはＡＡＶ血清型９に由来する。そのようなＡＡＶベクターは、それぞれＡＡＶ２／２、ＡＡＶ２／５、ＡＡＶ２／８、ＡＡＶ２／９、ＡＡＶ５／２、ＡＡＶ５／５、ＡＡＶ５／８、ＡＡＶ５／９、ＡＡＶ８／２、ＡＡＶ８／５、ＡＡＶ８／８、ＡＡＶ８／９、ＡＡＶ９／２、ＡＡＶ９／５、ＡＡＶ９／８、またはＡＡＶ９／９ベクターと呼ばれる。

本発明による組換えＡＡＶベクターは、真皮細胞および上皮細胞に対する指向性を有し、ＡＡＶ血清型５または８のカプシドタンパク質の殻を含むことがより好ましい。前記ベクターに存在するＡＡＶゲノムまたはＩＴＲは、同じ血清型またはＡＡＶ血清型２などの異なる血清型由来のものであってもよく、そのようなベクターは、ＡＡＶ２／５ベクターまたはＡＡＶ２／８ベクターと呼ばれる。血清型５のカプシドを有するＡＡＶは、基底角化細胞およびそれより上の角化細胞（basilar and suprabasilar keratinocyte）ならびに皮膚線維芽細胞などの真皮細胞および上皮細胞に対して指向性を有する。５型カプシドを有するＡＡＶベクターは、２型カプシドを有するＡＡＶよりもはるかに高いトランスダクション効率を示す（Keswani et al. Wound Repair Regen. 2012 ; 20(4): 592-600）。同様に、血清型８のカプシドを有するＡＡＶは、皮膚線維芽細胞および（主に）基底角化細胞よりも上の角化細胞に対して指向性を示す。さらに、ＡＡＶ２／８は、哺乳動物、好ましくは、ヒトの真皮細胞および上皮細胞に形質導入する際、ＡＡＶ２／５よりも効率的な傾向がある。ただし、トランスダクション効率は、創傷の治癒過程の投与のタイミングによって左右されるようであり、後の時点ではＡＡＶ２／２がＡＡＶ２／５およびＡＡＶ２／８よりも高いトランスダクション効率を示す（Keswani et al.,上記）。

したがって、ＡＡＶ２／２、ＡＡＶｘ／５およびＡＡＶｘ／８が本発明によるＡＯＮを送達するために好ましいＡＡＶであり、それらの選択は、投与の時期および標的となる細胞タイプを考慮して決定することができる。これらの詳細は、当業者によって前臨床的試験または臨床試験において容易に決めることができる。

最適な核酸配列によって表される本発明によるエクソンスキッピング分子をコードする核酸分子は、好ましくは、上で特定したＡＡＶゲノムまたはＩＴＲ配列、例えば、コード配列と機能可能に連結された発現調節エレメントおよび３’終結配列を含む発現コンストラクトの間に挿入される。

「ＡＡＶヘルパー機能」とは、一般に途中でＡＡＶベクターに与えられるＡＡＶ複製およびパッケージングに必要とされる対応するＡＡＶの機能を指す。ＡＡＶヘルパー機能は、ＡＡＶベクターに欠けているＡＡＶの機能を補完するが、（ＡＡＶベクターゲノムによってもたらされる）ＡＡＶ ＩＴＲがない。ＡＡＶヘルパー機能は、ＡＡＶの２つの主要なＯＲＦ、すなわち、ｒｅｐコード領域およびｃａｐコード領域またはそれらの機能的な実質的に同一の配列を含む。Ｒｅｐ領域およびＣａｐ領域は、当該技術分野において周知であり、例えば、参照によって本明細書に組み込むＣｈｉｏｒｉｎｉら（1999, J. of Virology, Vol 73(2): 1309-1319）または米国特許第５，１３９，９４１号明細書を参照。ＡＡＶヘルパー機能が、ＡＡＶヘルパーコンストラクトに与えられてもよく、これは、プラスミドであってもよい。ヘルパーコンストラクトの宿主細胞への導入は、例えば、本明細書において特定されるＡＡＶベクターに存在するＡＡＶゲノムの導入の前またはそれと同時のトランスフォーメーション、トランスフェクション、またはトランスダクションによって行われてもよい。したがって、本発明のＡＡＶヘルパーコンストラクトは、一方でＡＡＶベクターのカプシドタンパク質の殻に関して、他方で前記ＡＡＶベクター複製およびパッケージングにおいて存在するＡＡＶゲノムに関して血清型の所望の組合せをもたらすように選択されてもよい。

「ＡＡＶヘルパーウイルス」は、ＡＡＶ複製およびパッケージングに必要とされる付加的な機能を提供する。適したＡＡＶヘルパーウイルスとしては、アデノウイルス、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ１型および２型など）およびワクチニアウイルスが挙げられる。参照によって本明細書に組み込む米国特許第６，５３１，４５６号明細書に記載されているとおり、ヘルパーウイルスによってもたらされる付加的な機能も、ベクターにより宿主細胞に導入することができる。

好ましくは、本発明による組換えＡＡＶベクターに存在するＡＡＶゲノムは、ＡＡＶのｒｅｐ（複製）遺伝子またはｃａｐ（カプシド）遺伝子などのウイルスタンパク質をコードする任意のヌクレオチド配列を含まない。ＡＡＶゲノムは、例えば、抗生物質耐性遺伝子、蛍光タンパク質（例えば、ｇｆｐ）をコードする遺伝子あるいは当該技術分野において既知の化学的に、酵素的にもしくは別の方法で検知可能なおよび／または選択可能な産生物をコードする遺伝子（例えば、ｌａｃＺ、ａｐｈなど）などのマーカー遺伝子あるいはレポーター遺伝子をさらに含んでもよい。

本発明による好ましいＡＡＶベクターは、アンチセンスオリゴヌクレオチドを含む本発明によるエクソンスキッピング分子を発現させるＡＡＶベクター、好ましくは、ＡＡＶ２／５、ＡＡＶ２／８、ＡＡＶ２／９またはＡＡＶ２／２ベクターであり、前記アンチセンスオリゴヌクレオチドは、上記表１に開示されているＡＯＮ１、ＡＯＮ２、ＡＯＮ３、ＡＯＮ４、ＡＯＮ２０、ＡＯＮ２１、ＡＯＮ２２、ＡＯＮ２３、ＡＯＮ２４、ＡＯＮ２４．１、ＡＯＮ２４．２、ＡＯＮ２４．３、ＡＯＮ２４．３、ＡＯＮ２４．４、ＡＯＮ２４．５、ＡＯＮ２５およびｍｈ−ＡＯＮ１からなる群から選択される配列を含むか、またはそれからなる。

個体または前記個体の細胞、組織、臓器に本発明によるエクソンスキッピング分子を与える手段の改善は、これまでに既に成し遂げられた進歩を考慮して予想される。そのような将来的な改善は、当然、本発明の方法を使用したｍＲＮＡの再構築に関して言及した効果を達成するために組み込まれてもよい。本発明によるエクソンスキッピング分子は、そのまま個体、前記個体の細胞、組織もしくは臓器に送達されてもよい。本発明によるエクソンスキッピング分子を投与するとき、分子を送達方法と適合した溶液に溶解させることが好ましい。

裸のＡＯＮは、ｉｎ ｖｉｖｏにおいて大半の細胞に容易に取り込まれ、通常、本発明によるＡＯＮの等張（生理的食塩水）溶液への溶解で皮膚（真皮および表皮）細胞などの標的細胞に達するのに十分であろう。あるいは、本発明の裸のＡＯＮは、薬学的に許容される賦形剤、添加物、安定剤、溶媒、着色料などを使用して製剤化されてもよい。それに加えて、またはそれの代わりに、裸のＡＯＮは、下で言及される任意のトランスフェクション補助剤（transfection aid）を用いて製剤化されてもよい。

皮膚（真皮および表皮）細胞は、等張（生理的食塩水）溶液などの水溶液にプラスミドを与えることによってアンチセンスオリゴヌクレオチド発現のためのプラスミドを与えられてもよい。あるいは、既知のトランスフェクション剤（transfection agent）を使用したトランスフェクションによってプラスミドが与えられてもよい。

静脈内、皮下、筋肉内、くも膜下腔内および／または皮内投与に対して、溶液は等張（生理的食塩水）溶液であることが好ましい。本発明において特に好ましいのは、本明細書中で定義される各成分の細胞へおよび／または細胞、好ましくは、皮膚（真皮および表皮）細胞中への送達を助けることになる賦形剤またはトランスフェクション剤の使用である。本明細書中で定義される複合体を形成した各成分、またはベシクルもしくはリポソームに閉じ込められた各成分を細胞膜を通して送達する複合体、ナノ粒子、ミセル、ベシクルおよび／またはリポソームを形成することができる賦形剤またはトランスフェクション剤が好ましい。こうした賦形剤の多くは、当該技術分野において知られている。適した賦形剤またはトランスフェクション剤は、本明細書中で定義される各成分を細胞、好ましくは、皮膚（真皮または表皮）細胞に送達することができる粒子に自己集合することができるポリエチレンイミン（ＰＥＩ；ＥｘＧｅｎ５００（ＭＢＩ Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ））、ＬｉｐｏｆｅｃｔＡＭＩＮＥ（商標）２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）もしくはその誘導体、またはポリプロピレンイミンもしくはポリエチレンイミンコポリマー（ＰＥＣ）および誘導体を含む類似のカチオン性ポリマー、合成の両親媒性物質（ＳＡＩＮＴ−１８）、ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎ（商標）、ＤＯＴＡＰおよび／またはウイルスカプシドタンパク質を含む。そのような賦形剤は、皮膚（真皮および表皮）細胞を含む多種多様の培養細胞にアンチセンス核酸などのオリゴヌクレオチドを効率的に送達することが示された。それらの高いトランスフェクション潜在性は、全細胞生存に関して低から中程度の許容できる毒性と組み合わされる。構造変更の容易さが、さらなる変更ならびにそれらのさらなる（ｉｎ ｖｉｖｏ）核酸運搬特性および毒性の分析を可能にするために使用されてもよい。

Ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎは、リポソームトランスフェクション剤の例である。これは、カチオン性脂質Ｎ−［１−（２，３ジオレオイルオキシ）プロピル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＴＭＡ）（メチル硫酸塩であるＤＯＴＡＰと比較）および中性脂質ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）の２つの脂質構成成分からなる。中性構成成分が細胞内放出を仲介する。送達システムの別のグループは高分子ナノ粒子である。

本明細書中で定義される各成分、好ましくは、オリゴヌクレオチドを、細胞膜を越えて細胞中に送達することができるカチオン性ナノ粒子を製剤化するために、ＤＮＡトランスフェクション試薬として周知のジエチルアミノエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）デキストランのようなポリカチオンが、シアノアクリル酸ブチル（ＰＢＣＡ）およびシアノアクリル酸ヘキシル（ＰＨＣＡ）と組み合わされてもよい。

こうした一般的なナノ粒子材料に加えて、カチオン性ペプチドプロタミンが、コロイドを用いてオリゴヌクレオチドを製剤化するための代替的なアプローチを提供する。このコロイドナノ粒子系は、いわゆる、プロティクル（proticle）を形成することができ、これは、単純な自己集合プロセスによって作製することができ、オリゴヌクレオチドをパッケージングし、オリゴヌクレオチドの細胞内放出を仲介することができる。当業者は、エクソンスキッピング分子をＣＯＬ７Ａ１遺伝子の突然変異したエクソン７３と関連した疾患または状態の予防、処置または遅延のために送達すべく本発明に使用するためのエクソンスキッピング分子をパッケージングおよび送達するために任意の上記またはその他の商業的に入手可能な代替的賦形剤および送達システムを選択し、適合させることができる。

本発明によるエクソンスキッピング分子は、細胞（とりわけ、皮膚（真皮）細胞）、細胞質および／またはその核への取り込みを促進するよう設計された標的リガンドと特異的に共有結合的または非共有結合的に連結されてもよいであろう。そのようなリガンドは、（ｉ）細胞取り込みを促進する、細胞、組織もしくは臓器に特異的なエレメントを認識する化合物（それに限定されるものではないがペプチド（様）構造を含む）ならびに／あるいは（ｉｉ）細胞への取り込みおよび／またはベシクル、例えば、エンドソームもしくはリソソームからのオリゴヌクレオチドの細胞内放出を促進することができる化学的化合物を含んでもよいであろう。

したがって、好ましい実施形態において、本発明によるエクソンスキッピング分子は、組成物または薬剤、あるいは少なくとも、細胞への送達および／もしくはその送達デバイスのためならびに／または細胞内送達を向上させるための賦形剤および／または標的化リガンドとともに提供される組成物として製剤化される。

好ましい送達は局所投与による。付随の実施例において概要が示されるとおり、そのようなものは、患者のケアに既に使用されているハイドロゲルであるＦｌａｍｉｎａｌ ｈｙｄｒｏ（商標）、（２）ヒプロメロースハイドロゲルまたは（３）カルボマーハイドロゲルなどの薬学的に許容されるハイドロゲルの使用によってでもよい。本発明のオリゴヌクレオチドの局所送達に使用することができる局所用製剤は、以下のものである。
− クリーム。油中水型エマルジョンまたは水中油型エマルジョンのいずれかとして製剤化され、後者が美容上および審美的により許容できる。例は、Ｓｏｆｔｉｓａｎベースのクリームまたはセトマクロゴールクリームである。
− ゲル：液相全体に均一に分散したゲル化剤を含む溶液または懸濁液。例は、以下に限定されるものではないがヒプロメロース、カルボマーおよびアルギン酸塩を含むハイドロゲルである。
− 軟膏。これらは、通常、＜２０％の水およびビヒクルとして＞５０％の炭化水素、ワックスまたはポリオールを含む。これらは、クリームよりも脂っこい皮膚感触を有する。
− ペースト：これらは、硬練りで高いパーセンテージの細かく分散した固体を含む。
− 懸濁液。これは、液体ビヒクルに分配された固体粒子を含む液体調製物である。一部は、ローションと呼ばれる場合もある。
− ローション。これらは、流体でやや粘性のある（エマルジョン）製剤であり、懸濁液、低粘度のゲルおよび溶液と多くの特徴を共有する。
− フォーム。これは、分注されるときにふわふわした堅さを有するエマルジョンである。
− スプレー。これは、ノズルによって形成される液体の微細な液滴である。
− 溶液。これは、通常、水性であるが、アルコールなどのその他の溶媒を含んでもよい液体生成物である。

組成物が本明細書で定義される補助的な化合物などの付加的な成分を含む場合、組成物の各成分は、１つの単一の組合せまたは組成物または調製物として製剤化されてもよい。それらの素性に応じて、当業者は、どの製剤のタイプが本明細書中で定義される各成分に最も適切であるかがわかるであろう。一実施形態によると、本発明は、本発明によるエクソンスキッピング分子、さらに本明細書で定義される補助的な化合物を含むキット・オブ・パーツの形態である組成物または調製物を提供する。

必要とされる場合、本発明によるエクソンスキッピング分子または本発明によるエクソンスキッピング分子を発現させるベクター、好ましくは、ウイルスベクターは、薬学的に許容される担体を添加することによって薬学的に活性な混合物に組み込まれてもよい。

したがって、本発明はまた、裸のＡＯＮなどの本発明によるエクソンスキッピング分子、または本発明によるウイルスベクターおよび薬学的に許容される賦形剤を含む組成物、好ましくは、医薬組成物を提供する。そのような組成物は、１つの本発明によるエクソンスキッピング分子を含んでもよいが、複数の異なる本発明によるエクソンスキッピング分子を含んでもよい。そのような医薬組成物は、担体、増量剤、保存料、補助薬、可溶化剤および／または希釈剤を含む任意の薬学的に許容される賦形剤を含んでもよい。そのような薬学的に許容される担体、増量剤、保存料、補助薬、可溶化剤および／または希釈剤は、例えば、Remington, 2000において見つけることができる。前記組成物のそれぞれの特徴は、本明細書の前で定義した。

本発明による複数の異なるエクソンスキッピング分子が使用される場合、本明細書において定義される濃度または用量は、使用されたすべてのオリゴヌクレオチドの合計濃度もしくは用量または使用されたか、もしくは添加されたそれぞれのエクソンスキッピング分子の濃度もしくは用量を指してもよい。したがって、一実施形態において、使用される本発明によるエクソンスキッピング分子のそれぞれの量または合計量が、０．０００１から１００ｍｇ／ｋｇ、好ましくは、０．００１から５０ｍｇ／ｋｇ、さらにより好ましくは、０．０１から２０ｍｇ／ｋｇの間の範囲の量で投与される組成物が提供される。

本発明による好ましいエクソンスキッピング分子は、個体のＤＥＢ、さらに一般には、突然変異したＣＯＬ７Ａ１エクソン７３関連疾患または状態の処置のためのものである。本発明のすべての実施形態において、「処置」という用語は、疾患または状態の予防および／または遅延を含むものと理解される。本発明によるエクソンスキッピング分子を使用して処置することができる個体は、既にＤＥＢまたはＣＯＬ７Ａ１エクソン７３関連疾患または状態を有すると診断されていてもよい。あるいは、本発明によるエクソンスキッピング分子を使用して処置することができる個体は、まだ診断されていなくてもよいが、固体の遺伝的背景を考慮にいれると将来的にＤＥＢまたはＣＯＬ７Ａ１エクソン７３関連疾患または状態を発症するリスクが高い個体であってもよい。好ましい個体はヒトである。好適な実施形態において、突然変異したＣＯＬ７Ａ１エクソン７３関連疾患または状態は、ＤＥＢである。

本発明は、例えば、（上記のとおり）個体のＤＥＢ、またはさらに一般には、突然変異したＣＯＬ７Ａ１エクソン７３関連疾患もしくは状態を処置する際に使用するための医薬として使用するための、ＡＯＮなどの本発明によるエクソンスキッピング分子、または本発明によるＡＯＮをコードするウイルスベクターなどのベクター、または本発明によるＡＯＮ、もしくはＡＯＮをコードするベクターを含む組成物をさらに提供する。

本発明は、（上記のとおり）個体のＤＥＢ、もしくはさらに一般には、突然変異したＣＯＬ７Ａ１エクソン７３関連疾患もしくは状態を処置するための薬剤の製造へのＡＯＮなどの本発明によるエクソンスキッピング分子、または本発明によるＡＯＮをコードするウイルスベクターなどのベクター、または本発明によるＡＯＮ、もしくはＡＯＮをコードするベクターを含む組成物の使用をさらに提供する。

本発明は、ゲノムにおいてＣＯＬ７Ａ１遺伝子のエクソン７３にＤＥＢを含む疾患または障害の原因となる突然変異がある哺乳動物（好ましくは、ヒト）を処置するための方法であって、哺乳動物（ヒト）に本発明のＡＯＮ、（ウイルス）ベクター、または医薬組成物を投与することを含む方法をさらに提供する。これらの患者は、ＤＥＢもしくは関連障害を患っていてもよく、または発症するリスクがあってもよい。関連障害、疾患または状態は、例えば、ＣＯＬ７Ａ１遺伝子のエクソン７３における突然変異が原因となるか、またはそれと関連するＶＩＩ型コラーゲン欠損または個体の皮膚もしくはその他の臓器の異常の結果として生じる可能性のある皮膚がん（扁平上皮がん）、またはその他の癌腫も包含する。

本発明の別の実施形態は、ゲノムにおいてＣＯＬ７Ａ１遺伝子のエクソン７３に突然変異がある哺乳動物（好ましくは、ヒト）を処置するための医薬として使用するための本発明によるＡＯＮ、ＡＯＮをコードするウイルスベクター、およびＡＯＮを含む医薬組成物である。

本発明によるエクソンスキッピング分子は、飲み込むこと、注射すること、吸入、注入、噴霧することによる経口、眼内、肺内、鼻腔内、筋肉内、皮下、皮内、直腸へ投与により（水）溶液、懸濁液、（水中油型）エマルジョン、軟膏、トローチ、丸剤などの形態で全身的に、局部的に、局所的に患者に投与されてもよい。

投薬は、投与経路および患者の必要性に応じて毎日、週に１回、月に１回、年に４回、年に１回であってもよい。

早くに疾患が発症するため、ＤＥＢを含むＣＯＬ７Ａ１遺伝子の突然変異したエクソン７３が原因となるか、またはそれと関連した疾患、障害もしくは状態を有するか、またはそれを発症するリスクのある患者は、疾患の症状を緩和する、発症を遅らせる、止める、または逆行させるなどのために、症状の発症前または後に、子宮内で、出生直後に、１、２、３、６か月齢から、１歳から、３歳から、５歳から処置されてもよい。

本発明による使用または方法における処置は、少なくとも１週間、少なくとも１カ月、少なくとも数カ月、少なくとも１年、少なくとも２、３、４、５、６年または長期的にさらに患者の一生涯の間である。本発明による使用のための本明細書中で定義されるとおりのエクソンスキッピング分子またはエクソンスキッピングオリゴヌクレオチドまたはその等価物のそれぞれは、突然変異したＣＯＬ７Ａ１エクソン７３関連障害、疾患または状態に既に冒されているか、またはそれを発症するリスクがある個体の細胞、組織および／または臓器へのｉｎ ｖｉｖｏにおける直接投与に適していてもよく、ｉｎ ｖｉｖｏ、ｅｘ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて直接投与されてもよい。本発明のオリゴヌクレオチド、組成物、化合物または補助的な化合物の投与の頻度は、患者の年齢、エクソンスキッピング分子の性質（例えば、裸の（gymnotic）ＡＯＮまたはＡＡＶベクターもしくはレンチウイルスベクターにより発現させるＡＯＮなどの、ベクターにより運ばれる（vectored）ＡＯＮ）、用量、および前記分子の配合などのいくつかのパラメータにより左右される可能性もある。

本発明によるエクソンスキッピング分子、好ましくは、オリゴヌクレオチドの用量範囲は、好ましくは、厳しい手順要件が存在する臨床試験の用量漸増試験（ｉｎ ｖｉｖｏにおける使用）に基づいて設計される。本明細書中で定義されるとおりのオリゴヌクレオチドは、０．０００１から１００ｍｇ／ｋｇ、好ましくは、０．０１から２０ｍｇ／ｋｇの用量範囲で使用されてもよい。用量および処置計画は、以下に限定されるものではないが、投与経路（例えば、全身的対局所的）、オリゴが裸のＡＯＮまたはベクターにより運ばれるＡＯＮとして投与されるのかどうか、投与計画、患者の年齢および体重などを含む多くの要素により大きく変化することもある。

好ましい実施形態において、本発明による分子のための送達媒体として、本明細書の前に記載されているウイルスベクター、好ましくは、ＡＡＶベクターは、１回の注射当たり１×１０^９〜１×１０^１７ウイルス粒子、より好ましくは、１回の注射あたり１×１０^１０〜１×１０^１４ウイルス粒子、最も好ましくは１×１０^１０〜１×１０^１２ウイルス粒子の範囲の用量で投与される。

処置の詳細は、オリゴヌクレオチド（複数可）の配列および化学的性質、投与経路、配合、用量、投与計画、様式（ウイルスベクターまたは裸のオリゴヌクレオチド）、患者の年齢および体重、疾患のステージなどのような要素に従い、それらに応じて確立される必要があり、これは、さらなる非臨床試験および臨床試験を必要とする場合もあることは、本発明が属する技術分野の当業者には明らかになろう。

本発明は、細胞においてＣＯＬ７Ａ１エクソン７３が含まれるのを妨げるか、または少なくとも低減することための方法であって、細胞、好ましくは、皮膚細胞（皮膚線維芽細胞）を裸のＡＯＮなどの本発明によるエクソンスキッピング分子または本発明によるＡＯＮをコードする（ウイルス）ベクターまたは本発明による組成物と接触させることを含む方法をさらに提供する。この態様の特徴は、好ましくは、本明細書の前で定義されたものである。

別に指示がある場合を除いて、本明細書に記載されている各実施形態は、本明細書に記載されている別の実施形態と組み合わされてもよい。

本発明によるＡＯＮなどのエクソンスキッピング分子、またはそのようなＡＯＮをコードする（ウイルス）ベクターの、ＣＯＬ７Ａ１遺伝子が哺乳動物（好ましくは、ヒト）の細胞において発現するときに、突然変異したＣＯＬ７Ａ１エクソン７３が含まれるのを妨げるか、または少なくとも低減する能力、および５’スプライシングアクセプターの選択に影響を及ぼす領域において生理的条件下で哺乳動物（ヒト）のＣＯＬ７Ａ１ ｐｒｅ−ｍＲＮＡと結合して、それによりＣＯＬ７Ａ１ ｍＲＮＡに突然変異したエクソン７３が含まれるのを低減する能力は、好都合にも本明細書の実験のセクションに開示されているアッセイを使用して評価することができる。特に、本エクソンスキッピング分子は、ＣＯＬ７Ａ１遺伝子のエクソン７３（必ずしも突然変異している訳ではない）を含む細胞とインキュベートして、エクソン７３を含むｍＲＮＡの細胞による産生を低減するその能力を例えば、実験のセクションおよび実施例において本明細書に記載されるとおり（Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ装置を使用して定量することができる）ＲＴ−ＰＣＲによって評価することができる。

本明細書の実験のセクションおよび実施例においてＲＮＡレベルで確認できるとおり、ＣＯＬ７Ａ１遺伝子のエクソン７３を標的とする本発明によるさまざまなＡＯＮの添加は、実際に、エクソン７３のないｍＲＮＡをもたらし、これが、短いが機能的なＶＩＩ型コラーゲンタンパク質の産生につながる。

（皮膚の真皮部分由来であってもよい）線維芽細胞では、ＶＩＩ型コラーゲンが豊富に発現され。ゆえに、ＤＥＢ患者からの培養線維芽細胞へのＡＯＮの添加は、ウエスタンブロットにおいて検出可能な短縮されているが機能的なＶＩＩ型コラーゲンタンパク質の量を増加させることになることが予想され、したがって、ＡＯＮに基づく療法が、ＣＯＬ７Ａ１ ｍＲＮＡのスプライシングを再指示するだけでなくＶＩＩ型コラーゲンの機能性も回復させることになることを実証することになる。

「アデニン」、「グアニン」、「シトシン」、「チミン」、「ウラシル」およびヒポキサンチン（イノシンのヌクレオベース）という用語は、それ自体ヌクレオベースを指す。

アデノシン、グアノシン、シチジン、チミジン、ウリジンおよびイノシンという用語は、（デスオキシ）リボシル糖と連結されたヌクレオベースを指す。

「ヌクレオシド」という用語は、（デオキシ）リボシル糖と連結されたヌクレオベースを指す。

本文書において、およびその特許請求の範囲において、「含むこと（to comprise）」という動詞およびその活用型は、その語に引き続く項目が含まれるが、具体的に言及されていない項目も除外しないことを意味するためにその非限定的な意味で使用される。さらに、文脈が明らかに１つおよび１つだけのエレメントが存在することを必要としない限り、不定冠詞「ａ」または「ａｎ」による要素の言及は、１つ超の要素が存在する可能性を排除するものではない。不定冠詞「ａ」または「ａｎ」は、したがって、通常は「少なくとも１つ」を意味する。

「含む（include）」という語ならびにその時制および活用型のすべては、「含むが、以下に限定されるものではない」と解釈されるべきである。

「エクソンスキッピング分子」という語は、裸のＡＯＮ、および適合した細胞でＡＯＮを発現させることができるウイルスベクターを含むベクターにより運ばれるＡＯＮを含むことが意図される。

数値（例えば、約１０）と関連して使用される場合、「約」または「およそ」という語は、好ましくは、値が、所与の値（１０の）プラスまたはマイナス５％の値であってもよいことを意味する。

本明細書で提供した配列情報は、エラーを伴って特定された塩基を含める必要があるほど狭く解釈されるべきではない。当業者は、エラーを伴って特定されたそのような塩基を特定することができ、そのようなエラーの正し方を知っている。配列のエラーの場合、ポリペプチドをコードする核酸配列を含む配列番号１に存在する遺伝子の発現によって得られるポリペプチドの配列が優先されるものとする。

エクソン７３のｍＲＮＡ分析
ＣＯＬ７Ａ１のｍＲＮＡにあるエクソン７３のｍＲＮＡの存在を検出するために、ＨｅＬａ細胞およびヒト初代線維芽細胞（ＨＰＦ）の両方の抽出ｍＲＮＡを使用した。（ａ）ＨｅＬａについては１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）を加えたダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）において、または（ｂ）ＨＰＦ細胞については２０％ＦＢＳおよび１％ピルビン酸ナトリウムを加えたＤＭＥＭ ＡＱＥにおいて細胞の培養を行った。すべての細胞を３７℃、５％ＣＯ_２で増殖させた。

記載のＡＯＮのエクソンスキップ効率を求めるために、細胞を６０，０００細胞／ウェル（ＨｅＬａ）で１２ウェルプレートに、または１５０，０００細胞／ウェル（ＨＰＦ）で６ウェルプレートに播いた。細胞を増殖させた２４時間後、細胞に１００ｎｍのＡＯＮ−ｍａｘＰＥＩ複合体をトランスフェクションした。ＲｅｌｉａＰｒｅｐ（商標）ＲＮＡ Ｃｅｌｌ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いてＲＮＡ単離を行った後、ｃＤＮＡをＴｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｖｅｒｓｏキットを使用して作製した。エクソン７１〜７２の境界に位置するＦＷプライマー（５’−ＧＣＴＧＧＣＡＴＣＡＡＧＧＣＡＴＣＴ−３’、配列番号５１）およびエクソン７４内に位置するＲＶプライマー（５’−ＴＣＣＴＴＴＣＴＣＴＣＣＣＣＧＴＴＣＴＣ−３’、配列番号５２）を用いてエクソン７３に対するＰＣＲを行った。ＰＣＲ産物を、ＤＮＡ１０００チップを使用したＢｉｏａｎａｌｙｚｅｒを用いて視覚化し、産生物の長さの分析のためにソフトウェアＥｘｐｅｒｔ ２１００を使用した。

スキッピング効率を表２に示し、図３はラボオンチップの結果を示している。ＡＯＮ１からＡＯＮ４、ＡＯＮ２０からＡＯＮ２５（ＡＯＮ２４．１から２４．５を含む）およびｍ−ｈＡＯＮ１と指定した本発明によるＡＯＮは、エクソン７３が除去されたｍＲＮＡが＞７０％で最高の効率を有する。有効なＡＯＮは、ｐｒｅ−ｍＲＮＡの５’末端を標的とする。

望ましくないＧ−テトラドの発生を避けるために、十分なエクソンスキッピング効率を示した２つのＡＯＮを３’末端のさまざまな数のヌクレオチドを除去することによってトランケートした。これらのＡＯＮを表３に示す。

これらのＡＯＮは、エクソン７３がＣＯＬ７Ａ１ ｍＲＮＡに含まれるのを効率的に低減した（表１を参照）と同時に、製造性、精製および分析的な観点から、または多重鎖化（multiplexing）による全般的な機能の低下の可能性からあまり望ましくないいかなる配列もない。

エクソン７３のないＶＩＩ型コラーゲンの機能性は、以下の文献に記載されているいくつかのｉｎ ｖｉｔｒｏにおける方法を使用して対処することができる。
１．ウエスタンブロッティングを使用したα１−コラーゲン鎖のサイズおよび正確な構築の両方のタンパク質分析（Titeux et al 2010）。留意すべきことには、スキッピングされたエクソンのタンパク質の小さなサイズおよび野生型タンパク質の大きなサイズによる、タンパク質サイズの明らかな差は見つからない可能性がある。
２．非還元条件でのウエスタンブロッティングを使用することによるＶＩＩ型コラーゲンホモ三量体の熱安定性分析。野生型のＶＩＩ型コラーゲンは、３つのα１−コラーゲン鎖から構成され、４１℃のＴｍを有する（Mecklenbeck et al., 2002）。
３．コロイド金またはスクラッチアッセイを使用した細胞移動分析。エクソン７３を含まないトランケート型タンパク質に対して、野生型のＶＩＩ型コラーゲンを発現する線維芽細胞および／または角化細胞の運動性を比較する（Chen et al. 2002）。
４．さまざまな細胞外基質構成要素、例えば、ＩＶ型コラーゲン、ラミニン−３３２、ラミニン−１またはフィブロネクチンとの細胞接着を評価することができる（Chen et al. 2002）。

本発明者らは、エクソン７３が哺乳動物（好ましくは、ヒト）のＣＯＬ７Ａ１ ｍＲＮＡに含まれるのを妨げるか、または少なくとも低減することに関して最も良く機能することを示すＡＯＮがＶＩＩ型コラーゲンの機能性に関して十分な結果をもたらすことになると仮定し、これは、先行技術の上記の方法を使用して容易に評価することができる。さらに、２つ以下（好ましくは、１つなどの１つ以下）のＣｐＧを含むＡＯＮは、ｉｎ ｖｉｖｏにおける免疫原性に関して十分に機能するであろう。したがって、本発明の最も好ましいＡＯＮが、ＣＯＬ７Ａ１遺伝子のエクソン７３にある突然変異と関連するジストロフィー型表皮水疱症の型を患っているか、または患うリスクのあるヒトの治療に適した治療薬への開発の候補である。

ｅｘ ｖｉｖｏブタ皮膚モデルを使用したｍｈ−ＡＯＮ１の局所送達
ＤＥＢ患者に対する現在の創傷管理は、創傷ケア、かゆみおよび疼痛の管理ならびに扁平上皮がんの早期診断に主に焦点を合わせている。創傷ケアとしては、（塩化物）浴の手段、消毒剤としてクロルヘキシジンおよびその他の抗菌クリームの使用による創傷の洗浄および殺菌が挙げられる。さらに、疼痛およびかゆみを低減するために創傷に、ハイドロゲルを使用して水分を補給し、潤いを与える。最後に、創傷ケアには、皮膚を保護し、皮膚との摩擦を低減し、汚染を防ぎ、材料の付着を防ぎ、創傷からの液体を吸収し、水疱のサイズが増大するのを防ぐためにさまざまな種類の被覆材／シリコーンフォームを当てることが含まれ、水疱は、内部からの圧力を低下させるために穿刺し、排液する。

ｍｈ−ＡＯＮ１の局所送達は、２、３の利益を提供する。第一に、局所送達であるため、標的細胞、角化細胞および線維芽細胞に直接送達されることになる。第二に、局所投与であるため、全身的な吸収がほんのわずかだけで、全身毒性が低い（Wraight & White Pharmacol Ther 2001 Apr;90(1):89-104）。最後に、オリゴヌクレオチドの局所投与後の真皮および表皮における局所濃度が、全身投与後よりも最大（真皮に関して）１５０および（表皮に関して）４０００倍高い可能性があることが示されている（Metha et al., J Invest Dermatol. 2000 Nov;115(5):805-12）。

ｍｈ−ＡＯＮ１の局所送達を調査するために、社内でｅｘ ｖｉｖｏブタ皮膚モデルを確立した。ブタの皮膚は、ヒトの皮膚と極めて類似していると考えられ、同等の上皮の厚さおよび角質層のバリア特性を有する。送達試験のために、ブタｅｘ ｖｉｖｏ皮膚を０．８から１．４ｍｍの間の厚さに切断し、頂部が空気に曝露した空気−液体界面で培養した。ＤＥＢ患者の創傷では、表皮が真皮から完全に分離しているため、表皮を機械的に完全に除去することによってこうした創傷を模した。ｍｈ−ＡＯＮ１の無傷または水疱様のｅｘ ｖｉｖｏブタ皮膚への皮膚浸透を評価するために、本オリゴヌクレオチドを、ＤＥＢの標準的な創傷ケアの一部であるＰＢＳまたはハイドロゲル中のいずれかに製剤化した。ｍｈ−ＡＯＮ１への曝露後に皮膚小片を、形態の対比染色としてヘマトキシリンを使用した組織学的評価のために４％ホルマリン中で固定し、処理し、パラフィンに包埋した。オリゴヌクレオチドはＣｙ５標識と複合体を形成したため、ｍｈ−ＡＯＮ１の部位を蛍光顕微鏡によって視覚化することができた。

ＰＢＳ中に製剤化したｍｈ−ＡＯＮ１
無傷および水疱様のｅｘ ｖｉｖｏブタ皮膚小片を２５μｇのＰＢＳ中に製剤化したｍｈ−ＡＯＮ１とともに２４時間インキュベートした後、それらを分析のために処理した。結果は、無傷のブタ皮膚小片に添加したｍｈ−ＡＯＮ１は角質層に浸透しないことを示している（図４ａ〜ｂ）。しかしながら、ｍｈ−ＡＯＮ１製剤を水疱様のブタ皮膚においてインキュベートした場合、オリゴヌクレオチドが真皮に浸透したことが観察された（図４ｃ〜ｆ）。

ハイドロゲル中に製剤化したｍｈ−ＡＯＮ１
患者の創傷に適用するためには、ｍｈ−ＡＯＮ１を軟膏またはゲルに組み込むことが有益である。ＤＥＢ患者は、例えば、創傷に潤いを与え、それにより疼痛およびかゆみを低減させるために創傷ケアの一部としてハイドロゲルを使用するため、ｍｈ−ＡＯＮ１をハイドロゲルにも組み込むことができるかどうか試験した。このために以下の３つの異なるハイドロゲルを使用した：（１）患者のケアに既に使用されているハイドロゲルであるｆｌａｍｉｎａｌ（商標）、ともに社内で配合した（２）ヒプロメロースハイドロゲルおよび（３）カルボマーハイドロゲル。どのハイドロゲルも既に臨床の現場で一般的に使用されている。オリゴヌクレオチドを含むハイドロゲル製剤、およびオリゴヌクレオチドを含まないハイドロゲル製剤を調製し、皮膚小片に薄く塗った。各皮膚小片のために２５μｇのｍｈ−ＡＯＮ１を５０ｍｇのゲルに製剤化し、０．５ｍｇ／ｍｌのオリゴヌクレオチドの最終濃度を得た。

ｆｌａｍｉｎａｌ（商標）、ヒプロメロースまたはカルボマーハイドロゲルのいずれに製剤化したｍｈ−ＡＯＮ１もｅｘ−ｖｉｖｏブタ皮膚小片の無傷の角質層には浸透できなかったことが確認された（図５ａ、ｃ、ｅ、ｇ）。しかしながら、３つすべてのハイドロゲルは、表皮が除去された水疱様のブタ皮膚の真皮にオリゴヌクレオチドを送達することができた（図５ｂ、ｄ、ｆ、ｈ）。ハイドロゲルの最適化は進行中であり、最終製剤の選択は、皮膚の浸透の深さ、局所的忍容性、ｍｈ−ＡＯＮ１の組合せのｐＨ、ｍｈ−ＡＯＮ１ハイドロゲル製剤の安定性およびハイドロゲルからのｍｈ−ＡＯＮ１の放出に基づくことになる。

結 論
ＤＥＢ患者は、水疱、創傷および潰瘍のために自身の弱い皮膚に非常に苦しんでいる。さらに、患者は、常時創傷ケアが必要である。したがって、送達の局所経路によりｍｈ−ＡＯＮ１を評価した。ＤＥＢの患者の皮膚を模した水疱様の皮膚は、角質層を含む表皮を除去することによって作り出した。ＰＢＳ中またはハイドロゲル中のいずれに製剤化したｍｈ−ＡＯＮ１も水疱様の皮膚に浸透することができ、真皮に到達することが証明された。これらの結果は、患者の皮膚創傷への局所投与が、ｍｈ−ＡＯＮ１を皮膚にある標的細胞に送達するのに適したアプローチであることを裏付けている。さらに、これらの発見は、ＥＢ標準治療に類似した製剤が、ｍｈ−ＡＯＮ１の送達に適しているようであることを裏付けている。

ｍＲＮＡレベルにおける有効性試験
ｍｈ−ＡＯＮ１の有効性を評価するために以下の２つの異なる細胞タイプを使用した：（１）ＨｅＬａおよび（２）健康な個人の皮膚由来のヒト初代線維芽細胞（ＨＰＦ）。両細胞タイプともＣＯＬ７Ａ１ ｍＲＮＡを発現し、ＶＩＩ型コラーゲンタンパク質を産生する。本明細書中で開示されるとおりのｍｈ−ＡＯＮ１は、ＣＯＬ７Ａ１ ｍＲＮＡからエクソン７３を排除するよう、したがって、転写物から突然変異を排除するよう設計した。ｍｈ−ＡＯＮ１は、スプライシングプロセスを標的とし、最も直接的で測定可能な有効性の結果は、ｍｈ−ＡＯＮ１を添加した、およびしていないＣＯＬ７Ａ１転写物（野生型およびΔ７３）のプロファイリングおよび定量化である。

ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によるＣＯＬ７Ａ１ ｍＲＮＡレベルのプロファイリングおよび定量化
ＰＣＲは、特異的なＤＮＡ（ｃＤＮＡ）配列の対数増幅を可能にする直接的な技術である。エクソン７３に隣接するＣＯＬ７Ａ１配列に特異的なプライマーを使用して、ＰＣＲ反応を行った。その後、形成された産物を、ラボオンチップ技術を使用して視覚化し、これは、異なるフラグメント長さの産物の識別および収率に基づく定量分析を可能にする。

エクソン７３スキップ実験のために、ＨＰＦ細胞およびＨｅＬａ細胞に、トランスフェクション媒体としてポリエチレンイミン（ポリＩ：Ｃ）を使用して１００ｎＭの濃度でｍｈ−ＡＯＮ１をトランスフェクションした。トランスフェクションの２４または４０時間後、その細胞を回収し、全ｍＲＮＡを単離し、ｃＤＮＡを合成し、１つはエクソン６９におよび１つはエクソン７４にあるＣＯＬ７Ａ１に特異的なプライマーを使用してＰＣＲを行った。陰性対照として、ｍｈ−ＡＯＮ１オリゴヌクレオチドのスクランブル（ＳＣＲＭ）バージョンを用いた。

結果は、ＰＣＲによって測定される場合、ｍｈ−ＡＯＮ１による処理は、ＳＣＲＭ処理された細胞と比較してＣＯＬ７Ａ１ ｍＲＮＡからのエクソン７３の効率的な排除をもたらすことを示している（図６）。さらに、未処理細胞における野生型ｍＲＮＡのレベルを、処理細胞における全ＣＯＬ７Ａ１ ｍＲＮＡのレベルと比較することができた。ＰＣＲ／ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ法は、情報を与えるが、絶対的に定量的ではないため、これらの最初の発見を、核酸フラグメントの極めて正確で、絶対的な定量化を提供する液滴デジタルＰＣＲ（droplet digital PCR）アッセイを使用することによって引き続き調査した。

液滴デジタルＰＣＲを用いたＣＯＬ７Ａ１ ｍＲＮＡ転写物のプロファイリングおよび定量化
液滴デジタルＰＣＲ（ｄｄＰＣＲ）は、ＰＣＲサンプルを数千の液滴に分割することにより核酸の極めて正確で絶対的な定量化を提供する。ＣＯＬ７Ａ１ ｍＲＮＡ／ｃＤＮＡ ＰＣＲの投入は、各液滴が１つのＣＯＬ７Ａ１ ｃＤＮＡ分子を含むか、または含まないかのいずれかになるように調節した。鋳型の検出を可能にするために、野生型ＣＯＬ７Ａ１またはΔ７３ＣＯＬ７Ａ１に特異的なプローブをＰＣＲミックスに添加した。これらのプローブの位置を図７に示す。一方のプローブは野生型産物に特異的であり、他方のプローブはΔ７３ＣＯＬ７Ａ１産物にのみ特異的である。このプローブは鋳型との結合時に加水分解され、蛍光になり、その結果、ＰＣＲ増幅が行われた後に、標的配列を含む蛍光液滴をカウントすることができる。陽性の液滴および陰性の液滴の数のポアソン統計分析を使用して、サンプル中の野生型またはΔ７３ＣＯＬ７Ａ１ ｍＲＮＡ分子の絶対的な量を評価することができる。

ｍｈ−ＡＯＮ１に関する用量−反応プロファイルを確立するために、５０、１００または２００ｎＭのいずれかのｍｈ−ＡＯＮ１をＨｅＬａ細胞にトランスフェクションした。トランスフェクションの２４時間後の結果は、ｍｈ−ＡＯＮ１による処理が、ＣＯＬ７Ａ１の野生型転写物およびΔエクソン７３転写物の両方をもたらすことを示している。これらの結果は、ＰＣＲで確認された観察結果を裏付ける。５０ｎＭの用量は、２４時間後に既にほぼ最大の効果をもたらす。４０時間後に５０ｎＭおよび２００ｎＭのトランスフェクションに関してΔエクソン７３転写物の％に小さな増加が観察された（図８）。

ｉｎ ｖｉｔｒｏにおける免疫原性試験
オリゴヌクレオチドは、脊椎動物の自然免疫系のパターン認識レセプター（ＰＲＲ）の活性化を引き起こす可能性がある。ＰＲＲレセプターの最も良く研究されたファミリーは、トール様受容体（ＴＬＲ）である。ＴＬＲは、自然免疫系において重要な役割を果たすタンパク質のクラスである。これは、微生物由来の構造的に保存された分子を認識する、通常マクロファージおよび樹状細胞で発現する単一の膜貫通非触媒型レセプターである。異なるタイプの核酸によって活性化されるＴＬＲは、エンドソームに位置するものである：ＴＬＲ３（二重鎖ＲＮＡを認識する）、ＴＬＲ７／８（二重鎖ＲＮＡおよび単鎖ＲＮＡを認識する）、およびＴＬＲ９（ＣｐＧ−ＤＮＡを認識する）。

ＰＲＲによるこうした成分の認識時に、特異的な「殺菌性の」免疫応答が誘導される。ＴＬＲ活性化は、活性化Ｂ細胞の核内因子カッパ軽鎖エンハンサー（ＮＦ−κＢ）、インターフェロン制御因子３（ＩＲＦ−３）およびアクチベータータンパク質１（ＡＰ−１）の活性化をもたらす。ＡＰ−１、ＩＲＦ−３およびＮＦ−κＢの活性化は、炎症性サイトカイン、Ｉ型インターフェロンおよび自然免疫応答のその他のメディエーターの産生をもたらす。こうしたプロセスは、炎症などの即時の宿主防御応答を誘導するだけでなく、抗原特異的な適応免疫応答を刺激および統合もする。

初代ヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）のｍｈ−ＡＯＮ１へのｉｎ ｖｉｔｒｏ曝露を使用して（全身的性）薬物特異的免疫応答および免疫毒性を評価した。ＰＢＭＣを使用したｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイは、全身性免疫応答の代替マーカーとして（炎症性）サイトカインの産生を使用した確立された前臨床試験である。ＰＢＭＣアッセイは、調査化合物の免疫原性およびアレルゲン性の可能性の因子として、忍容性を予想することを可能にし、これらの化合物に関する安全な投薬範囲の推定を可能にするであろう。

ｍｈ−ＡＯＮ１の試験のために、健康な血液バンクドナーのバフィーコートから得た社内で単離したＰＢＭＣを使用した。培養上清における重要な炎症性サイトカインの産生を、１０ｎＭから１μＭの範囲の濃度のｍｈ−ＡＯＮ１による刺激の２４時間後に評価した。さらに、ｍｈ−ＡＯＮ１およびＡＯＮ７３．２４．５による一般的なＰＰＲが関係する免疫活性化を評価するために、ＮＦ−κＢおよび／またはＡＰ−１により誘導可能な分泌型胎盤アルカリホスファターゼ（secreted embryonic alkaline phosphatase）レポーターコンストラクトが染色体へ組み込まれたＲａｍｏｓ−Ｂｌｕｅ（Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ、ヒトＢ細胞）レポーター細胞株を使用した。Ｒａｍｏｓ−Ｂｌｕｅ細胞は、ＴＬＲ３、ＴＬＲ７／８およびＴＬＲ９を含む関連したセットのＴＬＲを発現する。活性化ＮＦ−κＢおよび／またはＡＰ−１を、１０ｎＭから１μＭの範囲の濃度のｍｈ−ＡＯＮ１またはＡＯＮ７３．２５．４による刺激の２４時間後に測定した。さらに、ｍｈ−ＡＯＮ１の細胞毒性効果の可能性を評価するために、ｍｈ−ＡＯＮ１による処理後のＰＢＭＣおよびＲａｍｏｓ−Ｂｌｕｅの生存率を、培養上清中の蛍光レゾルフィンを測定することによって分析した。生細胞は、非蛍光レサズリンを蛍光レゾルフィンに変換する。

ヒトＰＢＭＣにおける結果
陽性対照ＬＰＳ（ＴＬＲ４アゴニスト）およびＲ８４８（ＴＬＲ７／８アゴニスト）によるヒトＰＢＭＣの刺激は、ＩＬ−３を除いて、培養上清中の測定したすべてのサイトカインの濃度を大幅に増加させた。さらに、ＣｐＧ ＤＮＡ（ＴＬＲ９アゴニスト）またはポリ（Ｉ：Ｃ）（ＴＬＲ３アゴニスト）による刺激は、それほどではないが類似のパターンのサイトカインを誘導した。生理的食塩水で処理したヒトＰＢＭＣと比較したｍｈ−ＡＯＮ１または陽性対照による刺激後の培養上清中のサイトカイン濃度の有意水準を示すヒートマップを図９ａに示す。重要なことに、１０ｎＭから１μＭの範囲のｍｈ−ＡＯＮ１濃度によるヒトＰＢＭＣの刺激は、最も低い濃度のｍｈ−ＡＯＮ１におけるＩＦＮ−α２を除いて、培養上清中の測定したいかなるサイトカインの濃度も増加させなかった（図９ａ）。ただし、ｍｈ−ＡＯＮ１による刺激後の上清中のＩＦＮ−α２の濃度の増加は用量依存的ではないため、これは実験的異常値または技術的誤差と見なした（図９ｂ）。最後に、ｍｈ−ＡＯＮ１による処理の２４時間後に細胞毒性の形跡はなかった（図９ｃ）。対照的に、Ｒ８４８、または１０ｎＭおよび１００ｎＭのｍｈ−ＡＯＮ１による処理後に生存率のわずかな増加が確認され、これは、細胞生存の向上、細胞代謝の増加またはさらに増殖／分化の増加を示唆する。

Ｒａｍｏｓ−Ｂｌｕｅ細胞における結果
ヒトＲａｍｏｓ Ｂｌｕｅ細胞株において行った免疫原性アッセイの結果は、１０ｎＭから１μＭの範囲の濃度のｍｈ−ＡＯＮ１またはＡＯＮ７３．２４．５による２４時間の処理後にＮＦ−κＢおよび／またはＡＰ−１の活性化を示さなかった（図１０ａ）。対照的に、陽性対照ポリ（Ｉ：Ｃ）（１μｇ／ｍｌ）、ＣｐＧ（１０μｇ／ｍｌ）およびＲ８４８（１μＭ）は、ＮＦ−κＢおよび／またはＡＰ−１の活性化を誘導した。Ｒａｍｏｓ−ＢｌｕｅではＴＬＲ４が発現しないため、ＬＰＳは効果がなかった。さらに、ＭＨ−ＡＯＮ１による処理の２４時間後に細胞毒性の形跡はなく（図１０ｂ）、これはヒトＰＢＭＣにおいて得られた結果を裏付けた。

当然のことながら、本発明は、例の目的としてのみ上で記載されており、本発明の範囲および趣旨内にありながら改変がなされてもよい。

Claims (15)

1. 哺乳動物細胞においてｐｒｅ−ｍＲＮＡからのスプライシングによってヒトＣＯＬ７Ａ１ ｍＲＮＡが生成されるときに、エクソン７３が前記ｍＲＮＡに含まれるのを妨げるか、または低減することができるアンチセンスオリゴヌクレオチドであって、（ａ）前記オリゴヌクレオチドの配列が最大２つのＣｐＧ配列を含む、かつ／または（ｂ）前記オリゴヌクレオチドが２４ヌクレオチド以下の長さを有することを特徴とするアンチセンスオリゴヌクレオチド。
2. 特性（ａ）は、前記オリゴヌクレオチドが最大１つのＣｐＧ配列を含むことを特徴とする、請求項１に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
3. 特性（ｂ）は、２３ヌクレオチド以下の長さを有することを特徴とする、請求項１または２に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
4. 特性（ｂ）は、前記オリゴヌクレオチドが１６から２４ヌクレオチドの間の長さを有することを特徴とする、請求項１または２に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
5. 特性（ｂ）は、前記オリゴヌクレオチドが１６から２３ヌクレオチドの間の長さを有することを特徴とする、請求項１または２に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
6. 特性（ｂ）は、前記オリゴヌクレオチドの配列が１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３または２４ヌクレオチドからなる群から選択される長さを有することを特徴とする、請求項１〜５のいずれか一項に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
7. 特性（ａ）および（ｂ）の両方を有することを特徴とする、請求項１〜６のいずれか一項に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
8. オリゴリボヌクレオチドであることを特徴とする、請求項１〜７のいずれか一項に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
9. ヌクレオシド間結合が、化学的に修飾されており、好ましくは、ホスホロチオエート結合であることを特徴とする、請求項１２に記載のアンチセンスオリゴリボヌクレオチド。
10. 前記オリゴヌクレオチドの糖部分が低級２’−Ｏ−アルキル、好ましくは２’−Ｏ−メチル置換糖部分であることを特徴とする、請求項１〜９のいずれか一項に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
11. ＨｅＬａ細胞またはそれ由来のサンプルにおいて測定可能な形で、エクソン７３が含まれるのを７０％超、好ましくは７５％超、さらにより好ましくは８０％超、より好ましくは８５％超、さらに９０％超低減することができることを特徴とする、請求項１〜１０のいずれか一項に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
12. 哺乳動物細胞においてｐｒｅ−ｍＲＮＡからのスプライシングによってヒトＣＯＬ７Ａ１ ｍＲＮＡが生成されるときに、エクソン７３が前記ｍＲＮＡに含まれるのを妨げるか、または低減することができるアンチセンスオリゴヌクレオチドであって、配列５’−ＵＵＵＣＣＵＧＧ−３’（配列番号４）によって特徴づけられるエクソン７３の（ＳＲｐ４０／ＳＣ３５結合／ＥＳＥ）エレメントとアニーリングすることができることを特徴とするアンチセンスオリゴヌクレオチド。
13. １つ以下のＣｐＧ配列を有することを特徴とする、請求項１２に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
14. その配列が２４ヌクレオチド以下の長さを有することを特徴とする、請求項１２または１３に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
15. 哺乳動物細胞においてｐｒｅ−ｍＲＮＡからのスプライシングによってヒトＣＯＬ７Ａ１ ｍＲＮＡが生成されるときに、エクソン７３が前記ｍＲＮＡに含まれるのを妨げるか、または低減することができるアンチセンスオリゴヌクレオチドであって、配列番号５、６、７、８、２４、２５、２６、２７、２８、３９、４０、４１、４２、４３、２９および３５のＡＯＮからなる群から選択されることを特徴とするアンチセンスオリゴヌクレオチド。