CN103501793A - 反义寡核苷酸 - Google Patents

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CN103501793A CN201280015038.5A CN201280015038A CN103501793A CN 103501793 A CN103501793 A CN 103501793A CN 201280015038 A CN201280015038 A CN 201280015038A CN 103501793 A CN103501793 A CN 103501793A
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Abstract

本发明的实施方案一般性地涉及用于治疗肌肉萎缩症，特别是杜兴氏肌营养不良(DMD)的反义化合物和组合物。在一个实施方案中，本发明涉及反义寡核苷酸分子、包含所述反义寡核苷酸分子的药物组合物和制剂，以及治疗肌肉萎缩症相关疾病和病症的方法，其中所述反义寡核苷酸分子包含选自SEQ ID NO：5-8、10、12、14、16、24、27、28、34、35、37、40、42、44-46、79、97、100、101和116及其组合的碱基序列。

Description

反义寡核苷酸
联邦政府资助的研究或开发
本发明是在由美国国立卫生研究院国家神经病症和中风研究院(National Institute Of Neurological Disorders And Stroke of the NationalInstitutes of Health)(NIH/NINDS)授予的基金No.U01NS062709下由美国政府支持而进行的。美国政府在本发明中具有一定的权利。
发明背景
杜兴氏肌营养不良(DMD)是肌营养不良症的最常见和最严重的形式。每3500个新生男孩中有1个受DMD影响，其是由人DMD基因的无义突变和异读框突变(out of frame mutation)引起的严重x连锁肌萎缩疾病。DMD患者到10至12岁时通常需要轮椅并且在其少年晚期至30岁出头死亡。
DMD是由阻碍功能性蛋白质合成的肌营养不良蛋白基因的突变引起的。肌营养不良蛋白基因是人基因组中最大的基因之一，其包含79个外显子，覆盖超过230万个碱基对。一般而言，通过除去整个外显子或复制一个或多个外显子，或引入终止密码子引起阅读框的改变的肌营养不良蛋白基因的任何外显子部分中的突变具有破坏功能性肌营养不良蛋白的产生的潜能,这可导致DMD。
近年来，研究已显示基于反义寡核苷酸(AO)的疗法可提供对遗传相关疾病（包括DMD）的有前景的治疗。具体地，已开发了显示对靶向基因表达的特异性的反义寡核苷酸(AO)。例如，已显示反义寡核苷酸诱导特异性外显子跳读，从而恢复阅读框和功能性肌营养不良蛋白的表达。通过跳读肌营养不良蛋白基因的异读框突变，阅读框可被恢复并且表达截短的但具有功能的Becker-样肌营养不良蛋白。
人细胞的体外研究和疾病动物模型的体内研究已证明外显子跳读原理作为DMD的潜在疗法。最近已进行了使用两种不同的AO化学药品(磷酰二胺吗啉代寡聚物(PMO)和硫代磷酸酯-连接的2'-.β.-甲基RNA(2'OMePS))的初步临床试验，取得了令人鼓舞的结果。Deutekom等人已报导了肌营养不良蛋白的表达在注射了针对外显子51的2'OMePSAO的4名DMD患者的TA肌肉的恢复。
确定特定外显子的靶向去除对恢复肌营养不良蛋白阅读框的作用的一个至关重要的因素是特定反义寡核苷酸的鉴定。由于反义寡核苷酸通常具有仅有20-30个核苷酸的序列，对于靶向每一个外显子肌营养不良蛋白外显子，可有上百个或更多个潜在的候选AO。实际上，许多反义寡核苷酸不产生高效的外显子跳读。因此，为了有效地除去外显子以恢复肌营养不良蛋白阅读框来治疗DMD，需要对靶向每一个人肌营养不良蛋白外显子的反义寡核苷酸进行筛选和选择。然而，还没有规则来应用以选择最有效的靶向单个外显子的AO。此外，所有先前的技术都鉴定仅在细胞培养物中显示外显子跳读效应的AO，这与DMD患者中肌纤维的最终靶向细胞极不相同。在细胞培养中选择的单个AO的生物学作用可与在体内肌肉中的潜在作用显著不同。
因此，仍然存在对改进的反义寡核苷酸的需要，其引起肌营养不良蛋白基因的靶向外显子中的高效外显子跳读。
发明概述
本发明的实施方案一般性地涉及用于治疗肌肉萎缩症，特别是杜兴氏肌营养不良(DMD)的反义化合物和组合物。
在一个实施方案中，本发明涉及反义寡核苷酸分子、包含反义寡核苷酸分子的药物组合物和制剂以及用于治疗肌肉萎缩症相关疾病和病症的方法，其中反义寡核苷酸分子包含选自如下序列及其类似物和组合的碱基序列：
GCTGGGAGAGAGCTTCCTGTAGCTTCAC(SEQ ID NO：5);
TGTTACCTACCCTTGTCGGTCCTTGTAC(SEQ ID NO：6);
CTGCTGTCTTCTTGCTATGAATAATGTC(SEQ ID NO：7);
GGCGTTGCACTTTGCAATGCTGCTGTCT(SEQ ID NO：8);
TTGGAAATCAAGCTGGGAGAGAGCTTCC(SEQ ID NO：10)；
CTACCCTTGTCGGTCCTTGTACATTTTG(SEQ ID NO：12),
GTCAATCCGACCTGAGCTTTGTTGTAGA(SEQ ID NO：14);
CTTGCTATGAATAATGTCAATCCGACC(SEQ ID NO：16);
TATATGTGTTACCTACCCTTGTCGGTCC(SEQ ID NO：24);
GCCCAATGCCATCCTGGAGTTCCTG(SEQ ID NO：27);
CCAATGCCATCCTGGAGTTCCT(SEQ ID NO：28);
CCCAATGCCATCCTGGAGTTCCTGTAAGA(SEQ ID NO：34);
CCGCTGCCCAATGCCATCCTGGAGTTCC(SEQ ID NO：35);
CCCAATGCCATCCTGGAGTTCCTGTAAGAT(SEQ ID NO：37);
CCGCTGCCCAATGCCATCCTGGAGTTCCTG(SEQ ID NO：40);
TGCCCAATGCCATCCTGGAGTTCCTGTAAG(SEQ ID NO：42);
CCCAATGCCATCCTGGAGTTCCTGTAAG(SEQ ID NO：44)；
TGCCCAATGCCATCCTGGAGTTCCTGTA(SEQ ID NO：45);
GCTGCCCAATGCCATCCTGGAGTTCCTG(SEQ ID NO：46)
AACUUCCUCUUUAACAGAAAAGCAUAC(SEQ ID NO：79);
GGGAUCCAGUAUACUUACAGGCUCC(SEQ ID NO：97);
CTCCAACATCAAGGAAGATGGCATTTCT(SEQ ID NO：100)；
CATCAAGGAAGATGGCATTTCTAGT(SEQ ID NO：101)；和
CAACTGTTGCCTCCGGTTCTGAAG(SEQ ID NO：116)
并且其中所述分子可结合靶位点以引起肌营养不良蛋白基因中的外显子跳读。预期在每一个末端多或少1或2个核苷酸的这些序列具有类似的作用，因此也可用于肌营养不良蛋白基因中的靶向外显子跳读。
本发明的实施方案的其它方面涉及用于反义寡核苷酸分子的增强的细胞递送的聚合物。在一个实施方案中，本发明提供了一类聚合物，其为泊洛沙姆和聚乙烯亚胺(PEI)的缀合物。泊洛沙姆包含聚氧化丙烯(聚(氧化丙烯))的中央疏水链和聚氧乙烯(聚(氧化乙烯)的两条侧翼亲水链。
附图的数个视图的简述
在以一般性术语这样描述本发明后，现参考附图，所述附图不一定按比例绘制，并且其中：
图1-6是显示使用根据本发明的实施方案的反义寡核苷酸分子的各种外显子跳读的蛋白质印迹的图像；和
图7显示在递送根据本发明的实施方案的反义寡核苷酸分子中使用的聚合物的结构化学。
发明详述
现将参考附图在下文中更全面地描述本发明，其中显示了本发明的一些但非全部实施方案。的确，这些发明可体现在许多不同的形式中，并且不应当被解释为限制于本文中所示的实施方案；相反地，提供了这些实施方案以便本公开内容将满足适用的法律要求。在整个说明书中，同样的数字是指同样的元件。
本发明的实施方案涉及能够结合特定靶标以诱导外显子跳读的一种或多种反义分子。本发明的某些实施方案还涉及治疗营养不良相疾病包括杜兴氏肌营养不良(DMD)的方法。
根据本发明的实施方案的反义分子包括能够诱导在人肌营养不良蛋白基因中诱导外显子43、外显子45、外显子50,外显子51和外显子53中的至少一个的外显子跳读的寡核苷酸序列。
希望地，根据本发明的实施方案的反义寡核苷酸具有高的诱导靶向序列中外显子跳读的效率。在一个实施方案中，反义寡核苷酸分子可以以至少20%，更优选至少40%，更优选至少50%，仍然更优选至少60%，更优选至少80%的效率引起外显子跳读。
在一个实施方案中，本发明涉及能够诱导肌营养不良蛋白基因的外显子43的外显子跳读的反义寡核苷酸分子。用于靶向外显子43的反义寡核苷酸分子可包括下列序列的一个或多个及其类似物：
GCTGGGAGAGAGCTTCCTGTAGCTTCAC(SEQ ID NO：5);
TGTTACCTACCCTTGTCGGTCCTTGTAC(SEQ ID NO：6);
CTGCTGTCTTCTTGCTATGAATAATGTC(SEQ ID NO：7);
GGCGTTGCACTTTGCAATGCTGCTGTCT(SEQ ID NO：8);
TTGGAAATCAAGCTGGGAGAGAGCTTCC(SEQ ID NO：10);
CTACCCTTGTCGGTCCTTGTACATTTTG(SEQ ID NO：12),
GTCAATCCGACCTGAGCTTTGTTGTAGA(SEQ ID NO：14);
CTTGCTATGAATAATGTCAATCCGACC(SEQ ID NO：16)；和
TATATGTGTTACCTACCCTTGTCGGTCC(SEQ ID NO：24)。
在其它实施方案中，本发明涉及能够诱导肌营养不良蛋白基因的外显子45的外显子跳读的反义寡核苷酸分子。根据本发明用于靶向外显子45的反义寡核苷酸分子可包括下列序列的一个或多个及其类似物：
GCCCAATGCCATCCTGGAGTTCCTG(SEQ ID NO：27);
CCAATGCCATCCTGGAGTTCCT(SEQ ID NO：28);
CCCAATGCCATCCTGGAGTTCCTGTAAGA(SEQ ID NO：34);
CCGCTGCCCAATGCCATCCTGGAGTTCC(SEQ ID NO：35);
CCCAATGCCATCCTGGAGTTCCTGTAAGAT(SEQ ID NO：37);
CCGCTGCCCAATGCCATCCTGGAGTTCCTG(SEQ ID NO：40);
TGCCCAATGCCATCCTGGAGTTCCTGTAAG(SEQ ID NO：42);
CCCAATGCCATCCTGGAGTTCCTGTAAG(SEQ ID NO：44)；
TGCCCAATGCCATCCTGGAGTTCCTGTA(SEQ ID NO：45)；和
GCTGCCCAATGCCATCCTGGAGTTCCTG(SEQ ID NO：46)。
在另一个实施方案中，本发明涉及能够诱导肌营养不良蛋白基因的外显子50的外显子跳读的反义寡核苷酸分子。根据本发明的实施方案的用于靶向外显子50的反义寡核苷酸分子可包括下列序列的一个或多个及其类似物：
AACUUCCUCUUUAACAGAAAAGCAUAC(SEQ ID NO：79);和
GGGAUCCAGUAUACUUACAGGCUCC(SEQ ID NO：97)。
本发明的实施方案还涉及能够诱导肌营养不良蛋白基因的外显子51的外显子跳读的反义寡核苷酸分子。用于靶向外显子51的反义寡核苷酸分子可包括下列序列的一个或多个及其类似物：
CTCCAACATCAAGGAAGATGGCATTTCT(SEQ ID NO：100)；和
CATCAAGGAAGATGGCATTTCTAGT(SEQ ID NO：101)。
本发明的实施方案还涉及能够诱导肌营养不良蛋白基因的外显子53的外显子跳读的反义寡核苷酸分子。用于靶向外显子53的反义寡核苷酸分子可包括下列序列的一个或多个及其类似物：
CAACTGTTGCCTCCGGTTCTGAAG(SEQ ID NO：116)。
还应当认可，本发明还包括前述寡核苷酸序列的类似物。在本发明中，术语本发明寡核苷酸序列的“类似物”可包括其中一个或多个胸腺嘧啶(T)碱基被尿嘧啶(U)碱基取代以及反之的序列。例如，两种碱基中的任一种在序列中的存在通常仍然允许所述分子结合肌营养不良蛋白基因的前体-mRNA，因为其为互补序列。因此，两种碱基中的任一种在分子中的存在通常将诱导外显子跳读。分子的上述序列可包含全部胸腺嘧啶、全部尿嘧啶或两者的组合。如本领域技术人员已知的，在序列中选择T或U可至少部分基于用于产生所述分子的化学药品。例如，如果所述分子是磷酰二胺吗啉代寡核苷酸(PMO)，则X可期望地是T，因为当产生PMO时使用该碱基。备选地，如果所述分子是硫代磷酸酯连接的2'-O-甲基寡核苷酸(2'OMePS)，则X可期望地是U，因为当产生2'OMePS时使用该碱基。
本发明的寡核苷酸序列的另外的类似物可包括这样的序列，在所述序列中至多两个碱基被缺失或被其它碱基取代，条件是所述分子能够诱导靶向外显子的外显子跳读。根据本发明的其它类似物可包括具有添加至序列的一个或两个末端的额外碱基，或其中序列的一个或多个相反末端处的一个碱基被缺失的寡核苷酸序列。例如，CTGCTGTCTTCTTGCTATGAATAATGTC(SEQ ID NO.7)的类似物可包括下列序列：
XCTGCTGTCTTCTTGCTATGAATAATGTCX’(SEQ ID NO119)
其中X和X’独立地是C、T、G、U和A之一；
TGCTGTCTTCTTGCTATGAATAATGTC(SEQ ID NO120)
CTGCTGTCTTCTTGCTATGAATAATGT(SEQ ID NO121)；和
TGCTGTCTTCTTGCTATGAATAATGT(SEQ ID NO122)。
根据本发明的反义寡核苷酸分子可以是任何类型的分子，只要其具有所选的碱基序列并且可结合肌营养不良蛋白前体-mRNA的靶位点以引起外显子跳读。例如，所述分子可以是寡脱氧核糖核苷酸、寡核糖核苷酸、磷酰二胺吗啉代寡核苷酸(PMO)或硫代磷酸酯-连接的2'-O-甲基寡核苷酸(2'OMePS)。优选地，寡核苷酸是PMO。优选地，所述分子被分离从而其不含其它化合物或污染物。
在一个实施方案中，根据本发明的反义寡核苷酸分子包括PMO和肽核酸(PNA)。码啉代寡聚物是具有支持能够与典型的多核苷酸氢键合的碱基的骨架的多聚体分子，其中所述聚合物缺少戊糖骨架部分，更具体地是缺少核苷酸及核苷通常所有的通过磷酸二酯键连接的核糖骨架，而是包含环氮(ring nitrogen)(通过环中的氮偶联)。适当的码啉代寡聚物的实例包括磷酰二胺吗啉代寡聚物。可用于本发明的实施的吗啉代寡聚物的实例更详细地描述于美国专利号5,698,685、5,217,866、5,142,047、5,034,506、5,166,315、5,185,444、5,521,063、5,506,337、6,124,271、6,784,291、7,049,431、7,582,615和7,625,873中。
肽核酸聚合物(PNA)也可在本发明的实施中被用作反义寡聚物。PNA具有在结构上与脱氧核糖骨架同形的骨架，并且由其中附着核碱基的N-(2-氨乙基)甘氨酸单元组成。已研究了PNA作为反义寡聚物靶向与人疾病相关的基因的潜能。PNA与带正电荷的聚合物在一起容易的合成使得PNA及其缀合物作为癌症、遗传病症及其它疾病的实验性疗法的药物被广泛地测试。
在某些实施方案中，可使多种不同的带正电荷的聚合物与根据本发明的反义寡核苷酸分子、特别是吗啉代寡聚物和PNA相缀合。带正电荷的聚合物的实例包括肽，例如富含精氨酸的肽(可用于实施本发明的带正电荷的肽的实例包括R9F2C；(RXR)4XB（其中X可以是任意氨基酸)；R5F2R4C；(RFF)3；Tat蛋白，例如TAT序列CYGRKKRRQRRR；和(RFF)3R)、阳离子聚合物，例如树状八胍（dendrimeric octaguanindine）聚合物以及本领域已知的用于缀合至反义寡核苷酸化合物的其它带电正电荷的分子。在一个实施方案中，所述反义寡核苷酸与包含具有为约1,000至20,000道尔顿，优选约5,000至10,000道尔顿的分子量的聚合物的带正电荷的聚合物缀合。带正电荷的聚合物的另一个实例是在其分枝链或无分枝链(unbranched chain)中具有多个带正电荷的胺基的聚乙烯亚胺(PEI)。PEI另外地被广泛用作基因和寡聚物递送媒介物。
本发明的实施方案还涉及用于治疗DMD，特别是改善DMD的影响的药物制剂和组合物。个体(例如，哺乳动物例如人)或细胞的“治疗”或“医治”可包括在试图改变个体或细胞的天然过程中使用的任何类型的干预。治疗包括但不限于药物组合物的施用，并且可预防性地进行或在病理学事件开始之后或与病原体接触之后进行。治疗包括对与肌营养不良蛋白相关的疾病或病况(如在肌肉萎缩症的某些形式中)的症状或病理学的任何所需的影响，可包括例如被治疗的疾病或病况的一个种或多种可测量的标志物的最小改变或改进。还包括的是“预防性”治疗，其可用于减小被治疗的疾病或病况的进展速度，延迟该疾病或病况的发作，或减轻其发作的严重度。“治疗”或“预防”不一定表示疾病或病况或其相关症状的完全根除、治愈或防止。
具体地，包括通过向有需要的受试者施用本发明的一种或多种反义寡核苷酸(例如，SEQ ID NO：5-8、10、12、14、16、24、27、28、34、35、37、40、42、44、45、46、79、97、100、101和116及其类似物和组合)(任选地作为药物制剂或剂型的一部分)来治疗肌肉萎缩症例如DMD和BMD的方法。还包括的是通过施用一种或多种反义寡聚物来诱导受试者中的外显子跳读的方法，其中所述外显子是来自人肌营养不良蛋白基因的外显子42、44、45、50、51和53之一及其组合。如本文中所用的，“受试者”包括显示症状(所述症状可利用本发明的反义化合物来治疗)，或处于显示症状的风险中的任何动物，例如患有下述或处于患有下述的风险中的受试者：DMD或BMD或与这类病况相关的任何症状(例如肌纤维损失)的受试者。适当的受试者(患者)包括实验室动物(例如小鼠、大鼠、兔或豚鼠)、农畜和家养动物或宠物(例如猫或狗)，只要此类受试者包含本发明的互补序列。包括非人灵长类动物，优选人患者。
包含根据本发明的反义寡核苷酸分子的药物制剂可以在任何方便的生理上可接受的媒介物中被施用。标准的药学上可接受的载体的实例包括盐水、磷酸缓冲盐溶液(PBS)、水、含水乙醇、乳剂例如油/水乳剂、甘油三酯乳剂、湿润剂、片剂和胶囊。应当认可，适当的生理上可接受的载体的选择将根据所选的施用模式而变化。
在一个实施方案中，药物组合物可包含多种本发明的分子，每一种分子针对不同外显子中的外显子跳读。备选地，药物组合物可包含多种本发明的分子，每一种分子针对相同外显子中的外显子跳读。
可通过任何适当的方式将本发明的药物组合物提供给靶细胞，包括直接施用(例如，通过添加至培养基中体外施用，或通过在治疗位点注射或局部施用来在动物中体内局部施用)或全身性施用(例如，胃肠外或口服或静脉内、皮下施用)。在一个实施方案中，化合物和组合物包含部分生理上可接受的溶液从而除了将所需的试剂递送至靶细胞外，溶液不另外地不利地影响细胞或组织或受试者的电解质和/或体积和/或代谢。
本发明中使用的药物组合物和化合物可通过鼻内、口服、吸入、经肠、局部、子宫内、阴道内、舌下、经直肠、肌内、胸膜内、心室内、腹膜内、经眼、静脉内或皮下方式来施用。在优选的实施方案中，通过静脉内注射提供药物溶液。
根据本发明的药物组合物可以以液体或固体形式被供应。根据本发明的组合物还可包括溶剂、稀释剂、赋形剂、防腐剂、乳化剂、用于调节气味、味道、pH等的化合物。一般而言，除了活性化合物外，本发明的药物组合物可包含适当的赋形剂和助剂，其促进将活性化合物加工和递送成为至可药用的制剂。适当的赋形剂包括填充剂例如糖，例如乳糖、蔗糖、甘露糖或山梨醇、纤维素制剂、磷酸钙以及粘合剂例如淀粉、明胶、甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、羧甲基纤维素钠和/或聚乙烯吡咯烷酮。如果需要，可添加崩解剂，例如上述的淀粉以及羧甲基淀粉、交联聚乙烯吡咯烷酮、琼脂、海藻酸或其盐。助剂包括流动调节剂(flow-regulating agent)和润滑剂例如，硅土、滑石、硬脂酸或其盐和/或聚乙二醇。
可通过口服、全身性注射、经皮、经粘膜或其它常用途径，伴有或不伴有其它的载体或稀释剂而施用制剂。根据本发明的药物制剂可以以锭剂、片剂、颗粒、粒剂或粉剂的形式口服施用。
本发明还提供了通过向有需要的患者施用治疗有效量和/或预防量的上述药物制剂来治疗和/或改善一种或多种医学病况的影响的方法。根据本发明，本发明的化合物、组合或药物组合物“治疗有效量”是足以实现所需的药理学效应的量。通常地，提供有效量的组合物所需的并且可由本领域技术人员调整的剂量，将取决于接受者的年龄、健康、身体状况、性别、体重及疾病的程度而变化。此外，所述剂量可由治疗频率以及所需效应的性质和范围来决定。
药物制剂中反义寡核苷酸分子的典型剂量(dosage amount)范围可为约0.05至1000mg/kg体重，特别是约5至500mg/kg体重。在一个实施方案中，所述剂量为约50至300mg/kg体重(以每2周1次，每周1次或每周2次，或实现治疗效果所需的任何频率)。
施用的剂量当然将取决于用途和已知的因素例如活性成分的药效动力学特征；接受者的年龄、健康和体重；症状的性质和程度、并行治疗的种类、治疗频率以及所需的效果而变化。接受者可以是任何类型的哺乳动物，但优选为人。在一个实施方案中，本发明药物组合物的剂型(组成)可包含约1微克至20,000微克的活性成分/单位，特别是约10至1000微克的活性成分/单位(如果在此处单位意指用于一次注射的小瓶或一个包装的话，则其将更高得多，如果患者的体重为50kg，则直至15g)。对于静脉内递送，药物制剂的单位剂量将通常包含0.5至500微克/kg体重，优选将包含约5至300微克，特别是10、15、20、30、40、50、100、200或300微克/kg体重(μg/kg体重)的反义寡核苷酸分子。优选的静脉内剂量范围为10ng至2000μg，优选3至300μg，更优选10至100μg的金属/kg的体重。备选地，单位剂量可包含2至20微克的反义寡核苷酸分子，并按需施用多次以提供前述日剂量。在这些药物组合物中，反义寡核苷酸分子将通常以基于组合物的总重量按重量计约0.5-95%的量存在。
在一个具体的实施方案中，应当认可剂量可基于个体患者的反应升高或降低。应理解，所使用的反义寡核苷酸分子的实际量将根据被使用的具体反义寡核苷酸分子、配制的具体组合物、应用模式和施用的具体位点而变化。
对于口服施用，当组合物为片剂或胶囊的形式时，可将活性成分与口服、无毒、药学上可接受的惰性载体相组合，所述载体包括但不限于乳糖、淀粉、蔗糖、葡萄糖、甲基纤维素、硬脂酸镁、磷酸二钙、硫酸钙、甘露醇、山梨醇等。此外，当需要或必需时，还可将适当的粘合剂、润滑剂、崩解剂和着色剂掺入混合物中。适当的粘合剂可包括淀粉、明胶、天然糖例如葡萄糖或β-乳糖、玉米甜味剂、天然及合成树胶例如阿拉伯树胶、黄蓍胶或海藻酸钠、羧甲基纤维素、聚乙二醇、蜡等。用于此类剂型的润滑剂可包括油酸钠、硬脂酸钠、硬脂酸镁、苯甲酸钠、醋酸钠、氯化钠等。崩解剂包括但不限于淀粉、甲基纤维素、琼脂、皂粘土(bentonite)、黄原胶等。
在一些实施方案中，还可将本发明的反义寡核苷酸分子制剂与可溶性聚合物如可靶向的药物载体偶联。此类聚合物可包括例如聚乙烯吡咯烷酮、吡喃共聚物、聚羟丙基甲基丙烯酰胺-苯酚、聚羟基乙基天冬酰胺苯酚或用棕榈酰残基取代的聚氧化乙烯-多聚赖氨酸或泊洛沙姆和聚乙烯亚胺(PEI)，或泊洛沙姆与PEI的缀合聚合物。泊洛沙姆可以是任何泊洛沙姆例如L44、L64、P85、P123和F127。在这方面，图7显示了可用于根据本发明的某些实施方案的细胞递送的聚合物。
在一个实施方案中，可将根据本发明的反义寡核苷酸分子制剂偶联至一类可用于实现药物的受控释放的生物可降解的聚合物，例如，聚乳酸、聚乙醇酸、聚乳酸与聚乙醇酸的共聚物、聚ε己内酯、聚羟基丁酸、聚原酸酯、聚缩醛、聚二氢吡喃、聚氰基丙烯酸酯、泊洛沙姆与PEI的缀合聚合物以及水凝胶的交联的或两亲性嵌段共聚物。
本文中描述的组合物可作为缓释制剂(即，在施用后实现调节剂的缓慢释放的制剂例如胶囊或树脂或海绵)的部分被施用。此类制剂通常可使用公知的技术来制备，并通过例如口服、经直肠或皮下植入，或通过在所需的靶位点植入来施用。缓释制剂可包含分散在载体基质中和/或包含在被速率控制膜包围的储库中的调节剂。用于此类制剂中的载体是生物相容性的，并且还可以是生物可降解的；优选地所述制剂提供相对恒定水平的调节剂释放。
应当指出，对人的治疗通常比对小鼠或本文中例举的其它实验动物更长。因此，治疗的长度通常可与疾病或病理生理过程的长度或强度或先前的持续时间成比例，并且还可取决于动物品种、药物功效以及需要的或推荐的效果程度。剂量可以是1天、1周、1年至整个生命期的时期内的单次剂量或多重剂量。
在一个实施方案中，局部施用本发明的药物组合物和化合物，尤其是当治疗的靶标包括局部应用容易接触的区域或器官时，包括眼、皮肤或下肠道(lower intestinal tract)的疾病。局部应用还可容易地用于将本发明的组合、化合物和组合物施用至皮肤下的组织例如肌肉。可制备用于此类区域或器官的每一种的适当的局部制剂。
可以以直肠栓剂制剂或以适当的灌肠剂制剂实现下肠道的局部应用。也可使用局部透皮贴剂。对于局部应用，可在包含悬浮或溶解在一种或多种载体中的活性组分的适当软膏剂中配制药物组合物。用于本发明的化合物的局部应用的载体包括但不限于矿物油、液体矿脂、白凡士林、丙二醇、聚氧乙烯、聚氧丙烯化合物、乳化蜡和水。备选地，可在包含悬浮或溶解在一种或多种药学上可接受的载体中的活性组分的适当的洗剂或乳膏中配制药物组合物。适当的载体包括但不限于矿物油、脱水山梨醇单硬脂酸酯、聚山梨酯60、十六烷基酯蜡、鲸蜡醇、2-辛基十二烷醇、苯甲醇和水。
对于眼使用，可将药物组合物在经pH调整的等渗无菌盐水中配制为微粒化的悬浮液，或优选地，在经pH调整的等渗无菌盐水中配制为溶液，所述悬浮液或溶液含有或不含有防腐剂例如氯化苯甲烃铵(benzylalkonium chloride)。备选地，对于眼使用，可在软膏剂例如矿脂中配制药物组合物。
适用于对眼的局部应用的制剂还包括滴眼剂，其中将活性成分溶解或悬浮于用于活性成分的适当载体，尤其是含水溶剂中。活性成分优选以0.5至20%，有利地0.5至10%，特别地约1.5%w/w的浓度存在于此类制剂中。
可使用局部施用递送本发明的药物制剂、通过经皮通道将活性试剂施用到患者的体循环(systemic circulation)中。皮肤位点包括用于经皮肤施用药物的解剖区域例如前臂、腹部、胸部、背部、臀部、大腿和耳后区域。通过将包含化合物的局部制剂或施用化合物的经皮肤药物递送装置置于皮肤上而向皮肤施用所述化合物。在任一实施方案中，设计运载工具(delivery vehicle)，塑造其形状，确定其尺寸以及对其进行改造以使其容易放置和舒适地保留在皮肤上，或将制剂以处方规定的量和时间安排直接施用在皮肤上。
适用于局部应用的制剂包括适合用于穿透通过皮肤的液体或半液体制剂(例如，搽剂、洗剂、软膏、乳膏剂、凝胶或糊剂)和适合用于向眼、耳或鼻施用的滴剂。预期本发明的化合物的活性成分的适当的局部剂量与通过任何其它局部和全身性途径使用的剂量相似。
当以软膏剂配制时，可将反义寡核苷酸与石蜡性或与水混溶的软膏基质一起使用。备选地，可用乳化的乳膏基质将反义寡核苷酸配制于乳膏中。如需要，乳膏基质的水相可包括例如至少30%w/w的多元醇例如丙二醇、丁烷-1,3-二醇、甘露醇、山梨醇、甘油、聚乙二醇及其混合物。局部制剂可期望地包括增强活性成分通过皮肤或其它受影响区域的吸收或穿透的化合物。此类皮肤空穿透增强剂的实例包括美索巴莫(methocarbamol)、长链醇、二甲基亚砜及相关类似物。
可将多种经皮肤药物递送装置用于本发明的药物制剂。例如，可制备包含基底材料和丙烯酸酯胶粘剂的简单贴附贴剂(adhesive patch)。可将药物和任何穿透增强剂配制成粘附浇铸液(adhesive casting solution)。所述粘附浇铸液可被直接浇铸至基底材料上或可被应用至皮肤以形成粘附层。
可使用具有储库和多孔膜类型或固体基质种类的贴剂来实现经皮肤施用。在任一情况下，将活性剂通过膜从储库或微胶囊连续地递送进入活性剂可透过的胶粘剂，所述胶粘剂与或接受者的皮肤或粘膜相接触。如果活性剂通过皮肤被吸收，则活性试剂的受控和预定的流被施用至接受者。在微胶囊的情况下，包封试剂也可作为膜起作用。
在其它实施方案中，使用贮液器系统药物递送装置来递送本发明的化合物。这些系统通常包含基底材料、膜、基于丙烯酸酯的胶粘剂以及释放衬里。用膜密封基底以形成储库。随后将药物或化合物以及任何媒介物、增强剂、稳定剂、胶凝剂等掺入储库中。
还可将包含基底、药物/穿透增强剂基质、膜和胶粘剂的基质贴剂用于经皮肤递送本发明的化合物。基基材料通常可包含聚氨酯泡沫。可将药物、任何增强剂、媒介物、稳定剂等与泡沫前体组合。使泡沫固化以产生可直接附着至基底材料的胶粘的弹性体基质。
还包括在本发明中的是用于向皮肤局部应用的制剂，其包含本发明的化合物(通常以在约0.001%至10%的范围内的浓度)和无毒的药学上可接受的局部载体。这类局部制剂可通过将根据本发明的活性成分与在局部干燥、液体和乳膏制剂中常用的常规药物稀释剂和载体相组合来进行制备。软膏剂和乳膏剂可以例如利用添加有适当的增稠剂和/或胶凝剂的水性或油性基底来配制。此类基底可包括水和/或油，例如液体石蜡或植物油，例如花生油或蓖麻油。可根据基底的性质使用的增稠剂包括软石蜡、硬脂酸铝、鲸蜡硬脂醇、丙二醇、聚乙二醇、羊毛脂、氢化羊毛脂、蜂蜡等。
洗剂可利用水性或油性基底来配制，并且通常还将包括如下试剂的一种或多种：稳定剂、乳化剂、分散剂、悬浮剂、增稠剂、着色剂、调味剂、着色剂、香料等。粉剂可借助于任何适当的粉末基质例如滑石、乳糖、淀粉等来形成。滴剂可利用也包含一种或多种分散剂、悬浮剂、增溶剂、调味剂、着色剂等的水性基底或非水性基底来配制。
本发明的乳剂的油相可以以已知的方式从已知的成分构成。虽然所述相可以仅仅包含乳化剂，但其可包含至少一种乳化剂与脂肪或油或与脂肪和油二者的混合物。优选地，将亲水性乳化剂与用作稳定剂的亲脂性乳化剂包括在一起。还优选地包括油和脂肪二者。综上所述，具有或不具有稳定剂的乳化剂形成所谓的乳化蜡，所述蜡与油和脂肪一起形成了形成乳膏制剂的油性分散相的所谓乳化膏基底。适合用于本发明的制剂的乳化剂和乳剂稳定剂包括单独的或与蜡或本领域公知的其它材料一起的TWEENTM60、SPANTM80、鲸蜡硬脂醇、肉豆蔻醇、单硬脂酸甘油酯、十二烷基硫酸钠、甘油二硬脂酸酯。
用于所述制剂的适当的油或脂肪的选择基于实现所需的化妆品性质，因为活性化合物在大多数可能用于药物乳剂制剂中的油中的溶解度非常低。因此，乳膏应当优选为具有适当的稠度以避免从管或其它容器渗漏的不油腻的(non-greasy)、不着色、可清洗的产品。可使用直链或支链单或二元烷基酯例如二-异己二酸酯、异鲸蜡硬脂酸酯、椰子脂肪酸的丙二醇二酯、异丙基豆蔻酸酯、油酸癸酯、棕榈酸异丙酯、硬脂酸丁酯、2-乙基己基棕榈酸酯或支链酯的混合物。取决于需要的性质，可单独或组合地使用此类酯。备选地，可使用高熔点脂质例如白软石蜡和/或液体石蜡或其它矿物油。
根据本发明的局部药物组合物还可包括一种或多种防腐剂或抑菌剂例如甲基羟苯酸酯、丙基羟苯酸酯、氯甲酚、苯扎氯铵等。局部药物组合物还可包含其它活性成分例如抗微生物剂，特别是抗生素、麻醉剂、镇痛药和止痒药以及抗真菌剂。还可包括给组合物赋予气味且它们通过蒸发“沉积”或干燥局部制剂/应用的香精或挥发性试剂。
本发明的药物组合物还可通过粘膜进行递送。经粘膜(即，舌下、颊和阴道)药物递送提供了活性物质至体循环的高效进入，并且减少被肝和肠壁菌丛(intestinal wall flora)立即代谢。经粘膜药物剂型(例如，片剂、栓剂、软膏剂、子宫托、膜和粉剂)通常与粘膜保持接触，并且快速崩解和/或溶解以允许立即全身吸收。
在一个实施方案中，所述方法通过给受试者施用反义寡核苷酸，特别是被选择用以靶向特定基因区域(目的在于恢复特定基因表达或转换基因的同种型)的吗啉代寡聚物来进行。一般而言，所述方法包括在适当的药物载体中给受试者施用有效干扰完整性(integrety)、转录或剪接，从而抑制或恢复蛋白质的正常表达，或转换不同同种型的表达的量的反义寡核苷酸分子。在优选的实施方案中，所述方法导致蛋白质的显性失活(dominant negative)变体的表达。在本发明的一个方面，受试者是人受试者。为了用于抗病毒治疗，可使用各种全身性递送途径，包括口服和胃肠外途径，例如静脉内、皮下、腹膜内和肌内途径以及吸入、经皮肤和局部递送。
通常地，通常以规则的间隔，优选每日一次至每月一次施用一个或多个剂量的反义寡核苷酸分子。用于口服施用的优选剂量为约1mg/kg的体重的反义寡核苷酸分子至约600mg反义寡核苷酸分子/kg的体重，更优选约30mg/kg的体重的反义寡核苷酸分子至约300mg反义寡核苷酸分子/kg的体重。对于IV施用，优选的剂量与上述剂量相似。剂量将根据这类因素如患者的年龄、健康、性别、尺寸和重量、施用途径以及反义寡核苷酸分子对于特定疾病状态的效力而变化。
使用本发明的反义寡核苷酸的有效体内治疗方案将根据施用频率和途径以及处于治疗中的受试者的状况而变化。对于给定途径的最佳剂量可通过根据本领域内已知的方法的常规实验来测定。这样的体内疗法通常通过适合于特定类型的被治疗的病痛的测试来监控，并且可进行剂量或治疗方案的相应调整以实现最佳治疗效果。
在另一个方面，本发明提供了用于改善患者的DMD的试剂盒，所述试剂盒包括本发明的分子及其使用说明书。在一个实施方案中，所述试剂盒可包含多种用于在相同外显子或多个外显子中引起外显子跳读的分子。
实施例
在下列实施例中，使用了3个不同的体外和体内模型来测试反义寡核苷酸分子的效力：1)DMD成肌细胞；2)正常人成肌细胞；和3)人源化DMD(hDMD)小鼠(包含完整人肌营养不良蛋白基因，其表达接近正常水平的肌营养不良蛋白)。将这3个模型用于筛选靶向特定人肌营养不良蛋白外显子的反义寡聚物。
使DMD成肌细胞和正常人成肌细胞生长在24孔板中，对于每一种反义寡核苷酸，以一式二份将2.5μM PMO或2'-O-甲基寡核苷酸(2'OMePS)用于初步筛选。AO处理24小时后，随后将细胞培养在分化培养基中再培养2天。
对于在hDMD小鼠中的测试，在40μl盐水中制备了20μg PMO反义寡核苷酸，以一式两份通过肌内注射施用。将反义寡核苷酸与包含泊洛沙姆与聚乙烯亚胺(PEI)的缀合物，或缀合有树状八胍聚合物的PMO的聚合物一起递送，以帮助肌纤维递送。泊洛沙姆包含聚氧化丙烯(聚(氧化丙烯))的中央疏水链和聚氧乙烯(聚(氧化乙烯)的两条侧翼亲水链。参见图7。
在单次注射后7天收集经处理的肌肉，将肌肉在液氮冷却的异戊烷中快速冷冻，并-80℃贮存。从所述肌肉切取切片，将其收集在微量离心管中，随后提取RNA用于RT-PCR。
每一个模型系统中的外显子跳读效率通过DMD-来源细胞和人成肌细胞的RT-PCR和巢氏-PCR以及通过hDMD小鼠的RT-PCR来测定。使用下列程序：按照制造商的说明书，利用TriZol试剂(Invitrogene,Carlsbad,CA)提取来自经寡聚物处理的细胞或肌肉组织的RNA。将RNA于-80℃贮存以待以后使用。利用RT-Fidelitaq MasterMix(USB,Cleveland,OH)进行RT-PCR以扩增目标序列。将100ng的模板RNA用于每一个25μl RT-PCR反应。PCR条件为在43℃进行15分钟，在94℃进行2分钟，随后进行30次循环(在94℃进行30秒，在65℃进行30秒，以及在68℃进行1分钟)。用于巢式PCR的条件为在94℃进行2分钟，随后进行30次循环(在94℃进行30秒，在55℃进行30秒，在72℃进行1分钟)，以及在72℃进行5分钟。
将下列引物对用于RT-PCR和巢式PCR：
RT-PCR引物1：
正向引物：Ex47/48F3,5’–GTGGATAAAGGTTTCCAGAGC–3’
反向引物：Ex53/52R3,5’–GAATTCTTTCAATTCGATCCGTA–3’
巢式PCR引物1：
正向引物：Ex48F2,5’–TCTGCTGCTGTGGTTATCTC–3’；
反向引物：Ex52R2,5’–TTTTGGGCAGCGGTAATGAG–3’
RT-PCR引物2：
正向引物：E43F6206/6230,5’-TGGAAAGGGTGAAGCTACAGGAAG-3’
反向引物：E46-47R6780/67755’-CAACTCTTCCACCAGTAACTTGACT-3’
巢式PCR引物2：
正向引物：E43F6265/6290,5’-AACAAAATGTACAAGGACCGACAAGG-3’
反向引物：E46R6732/6708,5’-CTGCTCTTTTCCAGGTTCAAGTGG-3’
RT-PCR引物3：
正向引物：E43F6206/6230,5’-TGGAAAGGGTGAAGCTACAGGAAG-3’
反向引物：E49R7111/7137,5’-CACATCCGGTTGTTTAGCTTGAACTGC-3’
巢式PCR引物3：
正向引物：E43F6265/6290,5’-AACAAAATGTACAAGGACCGACAAGG-3’
反向引物：E48R7034/7017,5’-CTAATAGGAGATAACCACAGCAGCAGA-3’
RT-PCR引物4：
hDysEx41F1：GGGAAATTGAGAGCAAATTTGC;
hDysEx45R1：GAGGATTGCTGAATTATTTCTTCC
巢式PCR引物4：
hDysEx41/42F2：CAACTTTGCACAAATTCACAC;
hDysEx45R2：CAATGTTCTGACAACAGTTTGCCG
通过在2%琼脂糖凝胶上进行电泳来检查PCR产物。利用NIH成像J1.42软件来测量通过溴化乙锭染色显示的PCR产物的强度。
一般而言，将代表有靶向外显子的跳读的mRNA的PCR产物与代表没有靶向外显子的跳读的mRNA的PCR产物相比较。来自2个条带的总信号强度将被认为是100%。因此，如果具有靶向外显子跳读的转录物的信号强度等于没有外显子跳读的正常mRNA的信号强度，则外显子跳读的效率将被认为是50%。另一个实例是如果具有靶向外显子跳读的转录物的信号强度为代表具有和没有靶向外显子跳读的两种转录物的总信号强度的90%，则外显子跳读效率将被认为是90%。
所制备和评价的反义寡核苷酸序列的结果被总结在下文的表中。
Figure BDA0000386861390000191
Figure BDA0000386861390000201
Figure BDA0000386861390000211
*显示具有外显子43和外显子44二者的缺失的转录物以及仅具有外显子43的缺失的转录物。**高水平的具有外显子43和外显子44二者的缺失的转录物以及仅具有外显子43的缺失的转录物。在于细胞培养物中与于体内肌肉中之间，单个AO序列的靶向外显子跳读的效率的差异明显存在。在一个实施方案中，用于靶向肌营养不良蛋白外显子43的优选AO序列包括HE43(+156-10)、HE43(+26+53)、HE43(+40+67)、HE43(+14+42)、HE43(+31+57)、HE43(+108+135)、HE43(+150-4)、HE43(+59+86)、HE43(+162-16)；SEQ.ID NO5、6、7、8、14、16和24，其外显子跳读效率在体内肌肉中达到30%或更高。
Figure BDA0000386861390000231
Figure BDA0000386861390000241
Figure BDA0000386861390000251
Figure BDA0000386861390000261
Figure BDA0000386861390000271
在一个实施方案中，用于靶向肌营养不良蛋白外显子45的优选序列包括：HE45(-3+22)、HE45(-2+20)、HE45(-8+21)、HE45(-1+27)、HE45(-9+21)、HE45(-3+27)、HE45(-7+23)、HE45(-7+21)、HE45(-5+23)、HE45(-3+25)；SEQ ID NO27、27、34、35、37、40、42、44、45、46。
Figure BDA0000386861390000311
Figure BDA0000386861390000321
在一个实施方案中，用于靶向肌营养不良蛋白外显子50的优选AO序列：HE50(-19+8)(79)、HE50(+103-18)(SEQ ID NO97)。
在一个实施方案中，用于靶向肌营养不良蛋白外显子51的优选AO序列包括：HE51(+68+95)、(100)HE51(+65+89)(SEQ ID NO101)。
Figure BDA0000386861390000361
在一个实施方案中，用于靶向肌营养不良蛋白外显子50的优选AO序列包括：HE53(+42+65)(SEQ ID NO116)。
本发明所属的领域内的技术人员将想起本文中所示的发明的许多修饰和其它实施方案，其具有上述描述和相关附图中呈现的教导的益处。因此，应理解本发明不限于所公开的特定实施方案，并且修饰和其它实施方案意欲被包括在所附权利要求的范围内。虽然本文中采用了特定术语，但它们仅在一般性和描述性意义上被使用而不是为了限制目的。
Figure IDA0000386861460000011
Figure IDA0000386861460000021
Figure IDA0000386861460000031
Figure IDA0000386861460000041
Figure IDA0000386861460000051
Figure IDA0000386861460000061
Figure IDA0000386861460000071
Figure IDA0000386861460000081
Figure IDA0000386861460000091
Figure IDA0000386861460000101
Figure IDA0000386861460000111
Figure IDA0000386861460000121
Figure IDA0000386861460000131
Figure IDA0000386861460000141
Figure IDA0000386861460000151
Figure IDA0000386861460000161
Figure IDA0000386861460000171
Figure IDA0000386861460000181

Claims (21)

1.一种用于治疗DMD的反义寡核苷酸分子，所述反义寡核苷酸分子包含选自下组的碱基序列及其类似物和组合：
GCTGGGAGAGAGCTTCCTGTAGCTTCAC(SEQ ID NO：5);
TGTTACCTACCCTTGTCGGTCCTTGTAC(SEQ ID NO：6);
CTGCTGTCTTCTTGCTATGAATAATGTC(SEQ ID NO：7);
GGCGTTGCACTTTGCAATGCTGCTGTCT(SEQ ID NO：8);
TTGGAAATCAAGCTGGGAGAGAGCTTCC(SEQ ID NO：9)；
CTACCCTTGTCGGTCCTTGTACATTTTG(SEQ ID NO：12);
GTCAATCCGACCTGAGCTTTGTTGTAGA(SEQ ID NO：14);
CTTGCTATGAATAATGTCAATCCGACC(SEQ ID NO：16);
TATATGTGTTACCTACCCTTGTCGGTCC(SEQ ID NO：24);
GCCCAATGCCATCCTGGAGTTCCTG(SEQ ID NO：27);
CCAATGCCATCCTGGAGTTCCT(SEQ ID NO：28);
CCCAATGCCATCCTGGAGTTCCTGTAAGA(SEQ ID NO：34);
CCGCTGCCCAATGCCATCCTGGAGTTCC(SEQ ID NO：35);
CCCAATGCCATCCTGGAGTTCCTGTAAGAT(SEQ ID NO：37);
CCGCTGCCCAATGCCATCCTGGAGTTCCTG(SEQ ID NO：40);
TGCCCAATGCCATCCTGGAGTTCCTGTAAG(SEQ ID NO：42);
CCCAATGCCATCCTGGAGTTCCTGTAAG(SEQ ID NO：44)；
TGCCCAATGCCATCCTGGAGTTCCTGTA(SEQ ID NO：45);
GCTGCCCAATGCCATCCTGGAGTTCCTG(SEQ ID NO：46)
AACUUCCUCUUUAACAGAAAAGCAUAC(SEQ ID NO：79);
GGGAUCCAGUAUACUUACAGGCUCC(SEQ ID NO：97);
CTCCAACATCAAGGAAGATGGCATTTCT(SEQ ID NO：100)；
CATCAAGGAAGATGGCATTTCTAGT(SEQ ID NO：101)；和
CAACTGTTGCCTCCGGTTCTGAAG(SEQ ID NO：116)
并且其中所述分子可结合靶位点以引起肌营养不良蛋白基因的外显子的外显子跳读。
2.权利要求1的反义寡核苷酸分子，其中在其处引起外显子跳读的肌营养不良蛋白基因的外显子选自外显子43、45、50、51和53。
3.权利要求1的反义寡核苷酸分子，其中将所述反义寡核苷酸分子与不同的化学实体缀合或复合。
4.权利要求1的反义寡核苷酸分子，其中所述反义寡核苷酸分子是磷酰二胺吗啉代寡核苷酸(PMO)。
5.权利要求1的反义寡核苷酸分子，其中所述反义寡核苷酸分子是能够结合其互补RNA序列的寡聚物。
6.权利要求1的反义寡核苷酸分子，其中所述反义寡核苷酸分子在其任一末端包含1至2个额外的核苷酸碱基，或在序列的末端缺失1至2个核苷酸碱基，并且其中所述1至2个核苷酸碱基可与其靶序列互补和/或不与其靶序列互补。
7.一种用于治疗DMD的药物组合物，所述组合物包含根据权利要求1的反义寡核苷酸分子和药学上可接受的载体、佐剂或媒介物。
8.一种药物组合物，其包含与聚合物缀合以增强反义寡核苷酸的递送和反义作用的反义寡核苷酸，其中所述反义寡核苷酸选自：
GCTGGGAGAGAGCTTCCTGTAGCTTCAC(SEQ ID NO：5);
TGTTACCTACCCTTGTCGGTCCTTGTAC(SEQ ID NO：6);
CTGCTGTCTTCTTGCTATGAATAATGTC(SEQ ID NO：7);
GGCGTTGCACTTTGCAATGCTGCTGTCT(SEQ ID NO：8);
TTGGAAATCAAGCTGGGAGAGAGCTTCC(SEQ ID NO：9)；
CTACCCTTGTCGGTCCTTGTACATTTTG(SEQ ID NO：12),
GTCAATCCGACCTGAGCTTTGTTGTAGA(SEQ ID NO：14);
CTTGCTATGAATAATGTCAATCCGACC(SEQ ID NO：16);
TATATGTGTTACCTACCCTTGTCGGTCC(SEQ ID NO：24);
GCCCAATGCCATCCTGGAGTTCCTG(SEQ ID NO：27);
CCAATGCCATCCTGGAGTTCCT(SEQ ID NO：28);
CCCAATGCCATCCTGGAGTTCCTGTAAGA(SEQ ID NO：34);
CCGCTGCCCAATGCCATCCTGGAGTTCC(SEQ ID NO：35);
CCCAATGCCATCCTGGAGTTCCTGTAAGAT(SEQ ID NO：37);
CCGCTGCCCAATGCCATCCTGGAGTTCCTG(SEQ ID NO：40);
TGCCCAATGCCATCCTGGAGTTCCTGTAAG(SEQ ID NO：42);
CCCAATGCCATCCTGGAGTTCCTGTAAG(SEQ ID NO：44)；
TGCCCAATGCCATCCTGGAGTTCCTGTA(SEQ ID NO：45);
GCTGCCCAATGCCATCCTGGAGTTCCTG(SEQ ID NO：46);
AACUUCCUCUUUAACAGAAAAGCAUAC(SEQ ID NO：79);
GGGAUCCAGUAUACUUACAGGCUCC(SEQ ID NO：97);
CTCCAACATCAAGGAAGATGGCATTTCT(SEQ ID NO：100)；
CATCAAGGAAGATGGCATTTCTAGT(SEQ ID NO：101)；和
CAACTGTTGCCTCCGGTTCTGAAG(SEQ ID NO：116)
及其类似物和组合。
9.权利要求8的组合物，其中所述反义寡核苷酸包含具有约15至40个碱基配对单元(单体)的吗啉代寡聚物或PNA寡聚物。
10.权利要求8的组合物，其中所述吗啉代寡聚物包括二硫代磷酸酯-连接的吗啉代寡聚物。
11.权利要求8的组合物，其中所述聚合物是肽。
12.权利要求8的组合物，其中所述聚合物是阳离子聚合物。
13.权利要求8的组合物，其中所述聚合物是树状八胍聚合物。
14.一种治疗受试者的肌肉萎缩症的方法，包括向所述受试者施用有效量的反义寡核苷酸分子，所述反义寡核苷酸分子选自：
GCTGGGAGAGAGCTTCCTGTAGCTTCAC(SEQ ID NO：5);
TGTTACCTACCCTTGTCGGTCCTTGTAC(SEQ ID NO：6);
CTGCTGTCTTCTTGCTATGAATAATGTC(SEQ ID NO：7);
GGCGTTGCACTTTGCAATGCTGCTGTCT(SEQ ID NO：8);
TTGGAAATCAAGCTGGGAGAGAGCTTCC(SEQ ID NO：9)；
CTACCCTTGTCGGTCCTTGTACATTTTG(SEQ ID NO：12),
GTCAATCCGACCTGAGCTTTGTTGTAGA(SEQ ID NO：14);
CTTGCTATGAATAATGTCAATCCGACC(SEQ ID NO：16);
TATATGTGTTACCTACCCTTGTCGGTCC(SEQ ID NO：24);
GCCCAATGCCATCCTGGAGTTCCTG(SEQ ID NO：27);
CCAATGCCATCCTGGAGTTCCT(SEQ ID NO：28);
CCCAATGCCATCCTGGAGTTCCTGTAAGA(SEQ ID NO：34);
CCGCTGCCCAATGCCATCCTGGAGTTCC(SEQ ID NO：35);
CCCAATGCCATCCTGGAGTTCCTGTAAGAT(SEQ ID NO：37);
CCGCTGCCCAATGCCATCCTGGAGTTCCTG(SEQ ID NO：40);
TGCCCAATGCCATCCTGGAGTTCCTGTAAG(SEQ ID NO：42);
CCCAATGCCATCCTGGAGTTCCTGTAAG(SEQ ID NO：44)；
TGCCCAATGCCATCCTGGAGTTCCTGTA(SEQ ID NO：45);
GCTGCCCAATGCCATCCTGGAGTTCCTG(SEQ ID NO：46)
AACUUCCUCUUUAACAGAAAAGCAUAC(SEQ ID NO：79);
GGGAUCCAGUAUACUUACAGGCUCC(SEQ ID NO：97);
CTCCAACATCAAGGAAGATGGCATTTCT(SEQ ID NO：100)；
CATCAAGGAAGATGGCATTTCTAGT(SEQ ID NO：101)；和
CAACTGTTGCCTCCGGTTCTGAAG(SEQ ID NO：116)
及其类似物和组合。
15.权利要求14的方法，其中所述肌肉萎缩症是杜兴氏肌肉萎缩症(DMD)。
16.权利要求14的方法，其中所述肌肉萎缩症是贝克肌肉萎缩症(BMD)。
17.权利要求14的方法，其中所述序列选自SEQ ID NO：5、6、7、8、10、12、14、16和24并且所述外显子是外显子43。
18.权利要求14的方法，其中所述序列选自SEQ ID NO：27、28、34、35、37、40、42、44、45和46并且所述外显子是外显子45。
19.权利要求14的方法，其中所述序列选自SEQ ID NO：79和97，并且所述外显子是外显子50。
20.权利要求14的方法，其中所述序列选自SEQ ID NO：100和101，并且所述外显子是外显子51。
21.权利要求14的方法，其中所述序列是SEQ ID NO.116并且所述外显子是外显子53。
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