WO2012105467A1 - オリゴ核酸組成物及び抗アレルギー剤 - Google Patents

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peptide
oligonucleic
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弘晃 岡田
貴憲 金沢
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Definitions

  • the present invention relates to an oligonucleic acid composition
  • an oligonucleic acid composition comprising an oligonucleic acid having an antiallergic action or an antimicrobial action, a pharmaceutical composition or preparation useful for the prevention and / or treatment of allergic diseases or infectious diseases, and an antiallergic agent (and Microbial agent or anti-infective agent).
  • Allergic diseases interfere with physical activity, mental activity, and social activity, and significantly reduce QOL.
  • hay fever and allergic rhinitis have rapidly increased in number of patients, and it is essential to develop safe and effective inhalants that can be easily administered.
  • siRNA In recent years, with the advance of biotechnology, new drugs for treating diseases by controlling gene expression have been actively developed, and one of them is siRNA.
  • siRNA has strong binding affinity with a single target gene and has a strong inhibitory effect on diseases mainly caused by increased expression of a single gene.
  • SiRNA is also expected as a gene therapy with few side effects because it can specifically suppress the expression of genes related to diseases. Therefore, siRNA is expected as a novel therapeutic agent for effective allergic diseases and infectious diseases.
  • siRNA is a water-soluble polymer, and is easily degraded by an enzyme by nucleolytic enzymes in body fluids. Therefore, in order to enable practical use in animals and humans, it is highly stable and highly targeted. Development of a non-invasive siRNA administration system that combines introduction efficiency and a safe carrier has become the biggest issue.
  • JP-A-2006-111151 Patent Document 1 describes a composition in which the decoy nucleic acid is composed of cationic cholesterol, polyoxyethylene sorbitan monooleate 80, and folic acid-polyethylene glycol-distearoyl phosphatidylethanolamine. Stabilized formulations that are included in the product are disclosed. This document describes that it is useful for allergic skin diseases. However, introduction of this stabilized preparation into cells is greatly restricted by the expression level of the folate receptor on the cell surface.
  • JP 2007-137891 A reports that a skin administration preparation containing a decoy nucleic acid of NF- ⁇ B, which is a transcription factor, is effective against atopic dermatitis.
  • JP 2007-523658 reports that the use of siRNA against STAT6 is effective for airway allergic diseases such as asthma and rhinitis.
  • siRNA can be efficiently introduced into cells, and a highly efficient intracellular introduction vector and a technique for passing through a mucosal barrier and skin to reach the cells are not disclosed. .
  • Non-patent Document 1 Non-patent Document 1
  • an object of the present invention is to provide an oligonucleic acid composition having high stability of oligonucleic acid and high cell permeability; useful for the prevention and / or treatment of allergic diseases and infectious diseases.
  • the object is to provide a pharmaceutical composition or preparation capable of introducing a nucleic acid into a target cell and an antiallergic agent.
  • Another object of the present invention is an oligonucleic acid having high skin and mucosal barrier permeability and capable of efficiently delivering the oligonucleic acid to the epidermis and submucosa under the presence of many target deep tissue cells and immune system cells. It is an object of the present invention to provide a composition, a pharmaceutical composition or preparation capable of effectively expressing antiallergic activity and antimicrobial activity, and an antiallergic agent.
  • Still another object of the present invention is to further improve the oligonucleic acid stability and enhance the oligonucleic acid activity, an oligonucleic acid composition, a pharmaceutical composition or formulation capable of effectively expressing anti-allergic activity and antimicrobial activity, and anti-antimicrobial activity. To provide allergic agents.
  • the present inventors have combined (1) a short oligonucleic acid and a cell-permeable peptide capable of delivering the short oligonucleic acid into a cell or nucleus, Improves skin and mucosal permeability and cell transmissibility, (2) When a complex in which a short oligonucleic acid and a cell-penetrating peptide are electrostatically bound to each other is formed, the oligonucleic acid can be stabilized as a complex.
  • the oligonucleic acid is stabilized as a complex outside the cell, and the intracellular reducing environment Below, the short oligonucleic acid can be efficiently dissociated from the complex, and the pharmacological activity of the oligonucleic acid can be effectively expressed at the target site. When modified, the above effect is further enhanced.
  • skin and mucosal permeability and cell introduction can be further improved, and prevention and / or treatment of allergic diseases and infectious diseases. It was found useful for the present invention, and the present invention was completed.
  • the oligonucleic acid pharmaceutical composition of the present invention comprises (a) a short oligonucleic acid having antiallergic activity or antimicrobial activity, and (b) a cell-penetrating peptide.
  • the short oligonucleic acid may be at least one selected from siRNA, ribozyme, decoy nucleic acid, aptamer, antisense, and miRNA.
  • the short oligonucleic acid may be a short ribonucleic acid having a single-stranded or double-stranded structure and a length of 5 to 85 bases, and a short chain having a length of 10 to 30 bases. Ribonucleic acid may also be used.
  • a preferred short oligonucleic acid is an oligonucleic acid capable of suppressing the expression of the transcription factor NF- ⁇ B, for example, at least one NF- ⁇ B subunit selected from NF- ⁇ B1, NF- ⁇ B2, RelA, RelB and c-Rel It may be an oligonucleic acid capable of suppressing the expression of.
  • the short oligonucleic acid may be an oligonucleic acid capable of suppressing the expression of RelA.
  • the cell-penetrating peptide may be a peptide consisting of arginine 2 to 12 residues, histidine 1 to 8 residues, and cysteine 1 to 4 residues, arginine 2 to 6 residues, histidine 1 to 4 residues, It may be a peptide consisting of 1 to 3 residues of cysteine.
  • the cell-penetrating peptide may be a Tat peptide (48-57) or a modified form thereof, and the amino acid sequence of SEQ ID NO: 6 (Cys-His-His-Arg-Arg-Arg-Arg-His-His- Cys) may be included.
  • the short oligonucleic acid and the cell-penetrating peptide may be electrostatically bound to form a complex.
  • the cell penetrating peptide may be modified with higher fatty acids such as saturated or unsaturated C 8-24 higher fatty acids. Moreover, the cell penetrating peptide may have a disulfide bond. The complex may form a disulfide bridged complex by this disulfide bond.
  • composition of the present invention may further contain (c) a tight junction opening peptide.
  • the tight junction opening peptide may be AT1002.
  • the oligonucleic acid pharmaceutical composition is composed of (a) an oligonucleic acid that specifically suppresses the expression of NF- ⁇ B RelA, and (b) arginine, histidine, and cysteine, and the amino group is saturated. Or a cell-permeable peptide that may be modified with an unsaturated C 12-20 higher fatty acid, and (c) a tight junction opening peptide for enhancing mucosal permeability, and (b) the cell-permeable peptide is a disulfide bond You may have.
  • Oligonucleic acid pharmaceutical composition may be administrable to the skin and / or mucous membrane of mammals including humans.
  • the present invention relates to a pharmaceutical composition comprising the oligonucleic acid pharmaceutical composition and a pharmaceutically acceptable carrier; for example, a preparation applied to the skin or mucous membrane, wherein the oligonucleic acid pharmaceutical composition, (A) a short oligonucleic acid having anti-allergic activity, (b) a cell-permeable peptide, and (c) a tight junction opening peptide for enhancing mucosal permeability, if necessary.
  • the antiallergic agent containing is also included.
  • the present invention provides a pharmaceutical composition for treating and / or preventing allergic diseases or inflammatory diseases, comprising (a) a short oligonucleic acid having antiallergic activity, and (b) a saturated amino group.
  • a pharmaceutical composition comprising a cell-penetrating peptide modified with an unsaturated higher fatty acid and (c) an optional tight junction opening peptide is also included.
  • the delivery system may be in the form of a solution, semi-solid formulation or propellant.
  • this delivery system is composed of (a) an oligonucleic acid that specifically suppresses the expression of NF- ⁇ B RelA, and (b) arginine, histidine, and cysteine, and the amino group is saturated or unsaturated C It may contain a cell-penetrating peptide which may be modified with 12-20 higher fatty acids, and (c) a tight junction opening peptide if necessary.
  • the delivery system of the present invention can be applied to allergic diseases selected from allergic rhinitis, hay fever, and bronchial asthma.
  • the present invention relates to, for example, a short oligonucleic acid (for example, NF- ⁇ B, particularly a short ribonucleic acid that specifically suppresses the expression of RelA of its subunit), an arginine residue, and a histidine residue.
  • Oligonucleic acid composition comprising a complex of a cytoplasm-sensitive peptide vector composed of a group and a cysteine residue and modified with a fatty acid, and a tight junction opening peptide, diseases of allergic diseases or infectious diseases such as skin and mucous membranes It relates to a delivery system that can be administered to a site or a non-disease site.
  • base is used for a single-stranded nucleic acid
  • base or base pair (bp) is used for a double-stranded nucleic acid.
  • base in a double-stranded nucleic acid, it means that 30 bases and 30 base pairs are the same length.
  • base is used to indicate the length of both the single-stranded nucleic acid and the double-stranded nucleic acid.
  • the oligonucleic acid can be stably delivered to the target cell while maintaining the stability of the oligonucleic acid and having high cell introduction ability.
  • the stability of the oligonucleic acid can be greatly improved by forming a complex of the oligonucleic acid and the cell-penetrating peptide.
  • the stability of the oligonucleic acid can be further improved, the delivery efficiency to the target cell can be further increased, and the activity of the oligonucleic acid can be enhanced.
  • FIG. 1 is a graph showing the results of the RelA mRNA expression suppression test in Example 1.
  • FIG. 2 is a graph showing the results of the RNase A resistance test of Example 3.
  • FIG. 3 is a view showing the results of an intracellular reduction environment responsiveness test of Example 4.
  • FIG. 4 is a graph showing the results of the cytotoxicity test of Example 5.
  • FIG. 5 is a graph showing the results of a test for measuring the efficiency of introduction into dendritic cells of Example 6.
  • FIG. 6 is a graph showing the results of a treatment test using the allergic rhinitis model mouse of Example 7.
  • FIG. 7 is a diagram showing skin permeability in a siRNA single administration group, a siRNA / Tat complex, and an AT1002 combined administration group.
  • FIG. 8 is a graph showing the results of administration schedule, ear thickening and clinical score.
  • the oligonucleic acid composition (or composite composition) of the present invention contains at least (a) a short oligonucleic acid having antiallergic activity or antimicrobial activity, and (b) a cell-penetrating peptide.
  • Such oligonucleic acid compositions (or composite compositions) are advantageous for delivering oligonucleic acids into cells of the dermis or epidermis, for example in the skin. Therefore, the present invention can also be said to be a delivery system for delivering an oligonucleic acid to a predetermined site.
  • Short-chain oligonucleic acids have antiallergic activity (for example, the function or action of suppressing the expression of allergic factor control genes in target cells, ie, transcription factor inhibitory action) or antimicrobial activity (the function of suppressing the growth of viruses and bacteria or It is not particularly limited as long as it has an action, that is, an infectious disease treatment effect, and may be a short RNA antisense and its active derivative, a ribozyme, or a short double-stranded RNA (dsRNA).
  • the short oligonucleic acid include siRNA, ribozyme, decoy nucleic acid, aptamer, antisense, miRNA and the like.
  • the short oligonucleic acid may have a single-stranded structure or a double-stranded structure.
  • miRNA may be contained as a single strand, or may be contained as a double-stranded RNA (a miRNA precursor, for example, a precursor of around 70 bases).
  • the length of the short oligonucleic acid is, for example, about 5 to 85 bases, preferably about 8 to 60 bases (for example, 8 to 50 bases), more preferably about 10 to 30 bases (for example, 12 to 28 bases).
  • the short oligonucleic acid may be a short ribonucleic acid or a short deoxyribonucleic acid (particularly a short ribonucleic acid).
  • short oligonucleic acids can be used as components of allergies, causes or related factors such as transcription factors (eg NF- ⁇ B) and cytokines (eg TNF- ⁇ ; IL-1,4,6,8,10, It may have an action (transcription factor inhibitory action) of suppressing at least one expression selected from IL-1 to 18 such as 13, 18).
  • transcription factors eg NF- ⁇ B
  • cytokines eg TNF- ⁇ ; IL-1,4,6,8,10
  • a preferred short oligonucleic acid suppresses the expression of NF- ⁇ B, which is promoted by macrophages and dendritic cells in the skin dermis, and can prevent or treat allergic diseases.
  • an action of suppressing the expression of at least one of five subtypes of NF- ⁇ B (NF- ⁇ B1, NF- ⁇ B2, RelA, RelB, c-Rel), particularly an action of suppressing the expression of RelA]
  • NF- ⁇ B1, NF- ⁇ B2, RelA, RelB, c-Rel an action of suppressing the expression of RelA]
  • siRNA having antiviral activity for example, HBV, RSV and the like have already been clinically tested. Oligos that directly act on viral RNA or DNA and specifically suppress their growth. It is a nucleic acid. Similarly, an oligonucleic acid that effectively suppresses genes such as bacteria and fungi can also be used.
  • short-chain oligonucleic acids are subject to various chemical modifications (partially altering or modifying the chemical structure) in order to improve in vivo stability (enzyme stability) and target selectivity and to avoid off-target effects. You may give it.
  • short-chain oligonucleic acids are oligonucleic acids in which modified bases are introduced in part, oligonucleic acids in which the phosphate ester bond part is modified (for example, oligos in which the oxygen atom of the phosphate ester bond part is replaced with a sulfur atom) Nucleic acid, etc.), oligonucleic acid introduced with a halogen atom (such as a fluorine atom) or an alkoxy group (C 1-4 alkoxy group such as a methoxy group) at the 2′-position of the ribose ring (the -F form of ribose, —OMe) ), Oligonucleic acid in which oxygen atom in pentose is replaced with sulfur atom (4'-thionucleic acid), oligonucleic acid in which ribose ring is cleaved, oligonucleic acid in which side chain is introduced in a circular manner (ribose is alky,
  • siRNA specifically suppresses RelA expression of NF- ⁇ B. That is, siRNA binds to an RNA-induced silencing complex (RISC) in a cell, and this siRNA / RISC complex binds to a complementary sequence of the target mRNA, thereby degrading the target mRNA and sequence-specifically. It can suppress gene expression.
  • RISC RNA-induced silencing complex
  • the siRNA can be appropriately selected depending on the type of the target mRNA. For example, an siRNA that suppresses the expression of NF- ⁇ B (particularly RelA) mRNA may act in a complementary manner with the subunit mRNA.
  • siRNA examples thereof include double-stranded RNAs represented by 7 and 8, double-stranded RNAs represented by SEQ ID NOs: 9 and 10, which will be described later, or RNA molecules having a sequence complementary to these sequences.
  • siRNA part and most of the sense strand and antisense strand may be oligo DNA.
  • siRNAs can be used alone or in combination of two or more. As described in JP-A-2005-254966 and the like, a synergistic effect can be obtained by using siRNAs having different action sites in combination.
  • siRNA may be synthesized artificially or may be produced using cells.
  • the siRNA has at least 60% (for example, 60 to 99.9%), preferably at least 70% (for example, 75 to 99.9%), more preferably, relative to the SEQ ID NO: or its complementary sequence. Also included are nucleic acids having a sequence homology of at least 80% (eg, 85-99%), especially at least 90% (eg, 95-99%).
  • RNA and the like form a complex electrostatically with a cell-permeable peptide, they often have a positive or negative charge, particularly a negative charge.
  • an oligonucleic acid can be combined with a cell-permeable peptide to improve skin and mucosal permeability, and to effectively act the pharmacological activity of the oligonucleic acid on the target site.
  • a cell-penetrating peptide-oligonucleic acid complex is formed by electrostatic action (a complex in which the above components are electrostatically bound)
  • the oligonucleic acid is protected from enzymatic degradation and delivered to the target site while stabilizing. it can.
  • the present invention can be said to be a delivery system (especially drug delivery system DDS) having oligonucleic acid as an active ingredient and having high skin and mucosal permeability and cell introduction ability.
  • a delivery system especially drug delivery system DDS
  • Cell-penetrating peptides (peptide vectors, cytoplasm-sensitive peptide vectors, or basic peptide carriers) have cell membrane permeability for specific introduction into target cells and electrostatically interact with short oligonucleic acids.
  • the complex can be formed and the degradation of the short oligonucleic acid by the in vivo degrading enzyme can be suppressed to improve the stability, and the short oligonucleic acid can be efficiently delivered into the cell or nucleus while suppressing inactivation.
  • Such cell penetrating peptides may be negatively or positively charged, but are stable by electrostatically interacting (electrostatically bound) with negatively charged short oligonucleic acids.
  • a preferred cell-permeable peptide is a basic peptide having a positive charge (basic cell-permeable peptide).
  • a cell-penetrating peptide having a histidine residue has an ability to escape endosome.
  • a preferred cell penetrating peptide further contains a cysteine residue Cys. That is, the cell penetrating peptide can usually be composed of arginine, histidine and cysteine. Furthermore, a cell-permeable peptide having a cysteine residue (a cell-permeable peptide of the above-mentioned complex) can stabilize an oligonucleic acid as a complex outside the cell by forming a disulfide bond. Under a reducing environment, a short oligonucleic acid can be efficiently dissociated or released from the complex by breaking a disulfide bond.
  • a short oligonucleic acid can be effectively delivered to the target site and pharmacological activity can be effectively expressed.
  • the total number of amino acid residues of the cell-penetrating peptide is, for example, about 3 to 30 residues, preferably 4 to 25 residues, and more preferably 5 to 20 residues (for example, 5 to 12 residues).
  • one molecule of a cell-penetrating peptide is composed of an arginine residue, a histidine residue, and a cysteine residue, even if it contains about 2 to 12 residues (preferably 2 to 6 residues) of arginine residues, It may contain about 1 to 8 histidine residues (preferably 1 to 4 residues, usually 2 to 6 residues), and 1 to 4 residues (preferably 1 to 3 residues) of cysteine residues. In general, it may contain about 2 to 4 residues).
  • Cell-penetrating peptides (such as basic peptide carriers or vectors) usually have cysteine residues Cys at both ends, and cysteine residues Cys at the amino terminal and carboxyl terminal have histidine residues His and histidine residues.
  • the group His or the arginine residue Arg may be successively adjacent.
  • the basic peptide vector (cell-permeable peptide) is, for example, the following formula (1) Cys-His-X- (Z) nY-His-Cys (1) (Wherein X and Y are the same or different and each represents His or Arg, and Z represents an amino acid residue or peptide residue (particularly His and / or Ar) composed of Cys, His or Arg (particularly His and / or Arg).
  • Peptide residues composed of Arg and n represents 0 or an integer of 1 to 6).
  • Z may be His and / or Arg, in particular Arg. Specific examples thereof include, but are not limited to, peptides shown in SEQ ID NOS: 1 to 6 described below.
  • the cell penetrating peptide may be a natural or synthetic Tat peptide (48-57) or a modified form thereof, and SEQ ID NO: 6: Cys-His-His-Arg-Arg-Arg-Arg-His-His-Cys.
  • SEQ ID NO: 6 Cys-His-His-Arg-Arg-Arg-Arg-His-His-Cys.
  • it may be a peptide having a sequence represented by the sequence CH2R4H2C (C is Cys, H is His, and R is Arg).
  • the cell-penetrating peptide has 50 to 99.9% (for example, 70 to 99%, preferably 80 to 98% or more, more preferably 85% to at least one sequence of SEQ ID NOs: 1 to 6). Also included are peptides having sequence homology of the order of ⁇ 95%, especially 90-95%.
  • the cell-permeable peptide is preferably modified with a higher fatty acid in order to improve the permeability of the cell membrane.
  • higher fatty acids include highly lipophilic fatty acids such as saturated or unsaturated fatty acids having about 8 to 24 carbon atoms, and examples of higher fatty acids include saturated higher fatty acids (for example, caprylic acid, capric acid, lauric acid, myristic acid). , Palmitic acid, stearic acid, behenic acid, etc.) and unsaturated higher fatty acids (for example, oleic acid, elaidic acid, linoleic acid, linolenic acid, eleostearic acid, etc.).
  • the higher fatty acids are usually saturated or unsaturated C 10-24 fatty acids (such as myristic acid, palmitic acid, stearic acid, oleic acid), preferably saturated or unsaturated C 12-20 fatty acids, more preferably saturated or unsaturated C 14-18 fatty acids (eg, C 16-18 fatty acids such as stearic acid).
  • Preferred higher fatty acids may be saturated fatty acids (eg, saturated C 14-18 fatty acids such as stearic acid).
  • the cell-penetrating peptide modified with higher fatty acid can be represented by, for example, the following formula (2).
  • oligonucleic acids can strongly stabilize oligonucleic acids and enhance the ability of cells to respond to the environment (such as the release of oligonucleic acids by disulfide bonds and their cleavage). Does not show cytotoxicity.
  • the cell uptake ability of the oligonucleic acid can be improved, the pharmacological activity of the oligonucleic acid can be enhanced, and allergic action and infection can be suppressed over a long period of time.
  • the cell-penetrating peptide can be obtained by a conventional method, for example, by modifying the amino group of the cell-penetrating peptide with a higher fatty acid (for example, stearic acid) using an amide bond forming reaction.
  • a higher fatty acid for example, stearic acid
  • the higher fatty acid only needs to modify the amino group of the peptide and may modify the amino group of the side chain branched from the peptide chain, but at least the amino terminal of the peptide chain is often modified.
  • the ratio of the cell penetrating peptide can be selected, for example, from the range of about 0.01 to 50 parts by weight, for example, 0.1 to 30 parts by weight, preferably 1 to 20 parts per 1 part by weight of the short oligonucleic acid. It may be about 5 to 15 parts by weight, more preferably about 5 to 15 parts by weight.
  • the oligonucleic acid composition (or composite composition) of the present invention further comprises (a) a tight junction opening peptide (a tight junction opening substance having a permeation promoting action) in order to promote mucosal permeability of short oligonucleic acids. May be included.
  • the therapeutic effect can be improved by temporarily opening the tight junction of the mucous membrane with the tight junction opening peptide and improving the permeability to the deep part through the cell gap. That is, short oligonucleic acid can be delivered into the skin dermis and then efficiently delivered into target cells such as dendritic cells, Langerhans cells, macrophages, mast cells, and various lymphocytes in the dermis.
  • the short-chain ribonucleic acid is efficiently permeated through the epidermis and mucous membrane while stabilizing the short-chain ribonucleic acid. It can be efficiently delivered to dermal target cells.
  • the type of tight junction opening peptide having an action of promoting permeation into the skin or mucous membrane is not particularly limited.
  • AT1002 SEQ ID NO: 11 described later
  • claudin acting on ZO-1 supporting tight junction And derivatives thereof can be used alone or in combination of two or more.
  • a preferred tight junction opening peptide comprises AT1002.
  • the ratio of the tight junction opening peptide is, for example, about 0.01 to 200 parts by weight, preferably 0.01 to 150 parts by weight, and more preferably about 0.01 to 100 parts by weight with respect to 1 part by weight of the short oligonucleic acid. It may be.
  • the ratio can be selected from the range of about 0.01 to 50 parts by weight, for example, 0.1 to 30 parts by weight, preferably 1 to 20 parts by weight, more preferably about 5 to 15 parts by weight. Also good.
  • the oligonucleic acid composition (or composite composition) of the present invention may contain (a) a short oligonucleic acid and (b) a cell-penetrating peptide, and (c) a tight junction opening peptide. May be.
  • the oligonucleic acid composition may be a simple mixture of the components (a) and (b) or a simple mixture of the components (a) to (c).
  • the oligonucleic acid composition (a) It is preferable that the short oligonucleic acid and (b) the cell-penetrating peptide are electrostatically bound to form a complex.
  • the composite may be in the form of particles (or fine particles).
  • the average particle size of the composite particles (or fine particles) may be, for example, about 10 nm to 10 ⁇ m (for example, 25 nm to 5 ⁇ m), preferably about 50 nm to several ⁇ m (for example, 50 nm to 3 ⁇ m).
  • the cell-permeable peptide may have a disulfide bond.
  • a cell-penetrating peptide having a disulfide bond has a function of cleaving a disulfide bond and releasing a short oligonucleic acid in a reducing environment in the cell and nucleus while protecting the oligonucleic acid in the complex.
  • a cell-penetrating peptide having a disulfide bond can also be called a cytoplasm-sensitive peptide.
  • thiol groups of a plurality of cysteine residues for example, cysteine residues located at both ends of the cell-penetrating peptide) easily form disulfide bonds in an acidic environment.
  • the oligonucleic acid composition (or composite composition) of the present invention is useful as a delivery system because (a) a short oligonucleic acid can be delivered into a cell or nucleus.
  • a short oligonucleic acid can be delivered into a cell or nucleus.
  • it can act in a complementary manner to a predetermined site in the cell or nucleus (for example, transcription factor mRNA as a target gene) to degrade the transcription factor
  • A The pharmacological activity of the short oligonucleic acid can be used effectively.
  • the oligonucleic acid composition (or composite composition) combined with the tight junction opening peptide can improve the permeability of skin and mucous membranes, so that (a) the pharmacological activity of the short oligonucleic acid is effectively expressed. it can. Therefore, the present invention provides a pharmaceutical composition (therapeutic) comprising (a) a short oligonucleic acid and (b) a cell-permeable peptide, and (c) a tight junction opening peptide, if necessary, and a pharmaceutically acceptable carrier. Or a prophylactic composition) or a formulation (therapeutic or prophylactic agent).
  • this pharmaceutical composition or formulation is a pharmaceutical composition or formulation (therapeutic or preventive agent) for preventing and / or treating allergic diseases or infectious diseases It can also be called an antiallergic agent or an antimicrobial agent (antiinfective agent).
  • the pharmaceutically acceptable carrier can be selected according to the form (dosage form), dosage form, use, etc. of the pharmaceutical composition (or preparation).
  • the dosage form is not particularly limited, and is a solid preparation (powder, powder, granule (granule, fine granule, etc.), pill, pill, tablet, capsule, dry syrup, suppository, etc., semi-solid preparation ( Ointments (including creams and gels), gummi, etc.), liquids (solutions, suspensions, emulsions, syrups, elixirs, injections, etc.) may be used.
  • the preparation may be an oral administration preparation, a parenteral administration preparation or an absorbent (mucosal absorbent such as nasal drops and inhalants, transdermal absorbent such as transdermal preparation).
  • the preparation is a topical preparation, for example, a solution such as an injection (aqueous injection, non-aqueous injection, etc.), a suspension, an absorption agent (ointment, a patch (including a patch), and the like.
  • the liquid crystal preparation may be composed of lipids and the like, and may contain a liquid crystal that improves absorption promotion.
  • Preferred preparations of the present invention are in the form of non-solid preparations such as liquids (solutions, suspensions, etc.), semi-solid preparations (gels, ointments, etc.), sprays (sprays including inhalants, etc.). In many cases, it is an absorbent that absorbs a pharmacologically active ingredient transdermally or transmucosally.
  • the preferred preparation of the present invention is a parenteral preparation, particularly a preparation applied to the skin or mucous membrane, such as a skin administration preparation (or transdermal administration preparation, transdermal absorption agent) or a mucosal administration preparation (mucosal absorption agent).
  • Mucosal preparations can be applied to mucous membranes such as nasal mucosa, lung mucosa, ocular mucosa, intestinal mucosa, oral mucosa, genital mucosa (eg vaginal mucosa).
  • the formulation can typically be administered by, for example, the intranasal, dermal, or respiratory route.
  • the preparation may be a preparation with controlled drug release rate (sustained release preparation, immediate release preparation).
  • the carrier examples include, in addition to the pharmacopoeia, (1) Pharmaceutical Additive Handbook, Maruzen Co., Ltd., (1989), (2) “Pharmaceutical Additives Dictionary 2000” (Pharmaceutical Daily Report, published in March 2002), (3) “Pharmaceutical Additives Dictionary 2005” (Pharmaceutical Daily Report, published in May 2005), (4) Pharmacy, Revised 5th Edition, Nanedo (1997), and (5) Pharmaceutical Additives Standard 2003 Among the components (for example, excipients, binders, disintegrants, lubricants, coating agents, etc.) listed in (Pharmaceutical Daily, August 2003), depending on the route of administration and formulation application, as appropriate You can choose.
  • a carrier for a solid preparation at least one carrier selected from excipients, binders and disintegrants is often used, and additives such as lipids may be used.
  • excipient examples include sugars such as lactose, sucrose, mannitol, sorbitol, and sugar alcohols; starch; polysaccharides such as crystalline cellulose (including microcrystalline cellulose); light anhydrous silicic acid, synthetic aluminum silicate, and the like. It can be illustrated.
  • Binders include soluble starch; polysaccharides such as gum arabic and sodium alginate; synthetic polymers such as polyvinylpyrrolidone, polyvinyl alcohol, carboxyvinyl polymer, polyacrylic acid polymer, polylactic acid, and polyethylene glycol; methylcellulose, ethylcellulose, carboxy Examples thereof include cellulose ethers such as methylcellulose, sodium carboxymethylcellulose, hydroxyethylcellulose, hydroxypropylcellulose, and hydroxypropylmethylcellulose.
  • Disintegrants include calcium carbonate, carboxymethylcellulose or salts thereof (carmellose, carmellose sodium, carmellose calcium, croscarmose sodium, etc.), cross-linked polyvinyl pyrrolidone (cross-linked polyvinyl pyrrolidone (crospovidone), croscopovidone, etc.), low Substitution degree hydroxypropyl cellulose etc. can be illustrated.
  • the carrier may be a biocompatible substance, such as a bioabsorbable polymer or a biodegradable polymer (polylactic acid, polyglycolic acid, lactic acid-glycolic acid copolymer (PLGA), polybutylene succinate, etc.), polymer An aqueous gel can also be used. These carriers can be used alone or in combination of two or more.
  • the coating agent examples include saccharides, cellulose derivatives such as ethyl cellulose and hydroxymethyl cellulose, polyoxyethylene glycol, cellulose acetate phthalate, hydroxypropyl methylcellulose phthalate, and Eudragit (methacrylic acid / acrylic acid copolymer). It is done.
  • the coating agent may be an enteric component or a gastric component.
  • the preparation may also be a capsule containing these enteric components and gastric components in the skin.
  • oily carriers include animal and vegetable oils (vegetable oils such as jojoba oil, olive oil, palm oil, and cottonseed oil; animal oils such as squalane) and mineral oils (liquid paraffin, silicone oil, etc.) Etc. can be exemplified.
  • aqueous carrier examples include water (purified or sterile water, distilled water for injection, etc.), physiological saline, Ringer's solution, glucose solution, water-soluble organic solvents [lower aliphatic alcohols such as ethanol and isopropanol; (poly) alkylene glycols ( Ethylene glycol, diethylene glycol, polyethylene glycol and the like); glycerin and the like], dimethylisosorbide, dimethylacetamide and the like.
  • the semi-solid carrier may be selected from the solid pharmaceutical carrier and / or the liquid carrier. Furthermore, the carrier of the semi-solid preparation may contain a lipid.
  • Lipids include waxes (beeswax, carnauba wax, lanolin, paraffin, petrolatum, etc.), long chain fatty acid esters (esters of fatty acids and polyhydric alcohols (glycerides, etc.)), hardened oils, higher alcohols, higher fatty acids ( Examples thereof include linoleic acid, linolenic acid, stearic acid, oleic acid and the like, and metal soaps (for example, fatty acid metal salts such as sodium coconut oil fatty acid and calcium stearate).
  • the preparation may contain an additive.
  • additives include lubricants (eg, magnesium stearate), disintegration aids, antioxidants or antioxidants, emulsifiers (eg, various surfactants such as nonionic surfactants), Dispersant, suspending agent, solubilizer, solubilizer, thickener (water-soluble polymer such as carboxyvinyl polymer, polyvinyl alcohol, carrageenan, gelatin; cellulose ethers such as carboxymethylcellulose), pH adjuster or Buffer (citric acid-sodium citrate buffer, etc.), stabilizer, preservative or preservative (parabens such as methylparaben, butylparaben), bactericides or antibacterial agents (benzoic acids such as sodium benzoate), Antistatic agent, corrigent or masking agent (for example, sweetener), colorant (for example, dye and pigment such as Bengala), Deodorant or perfume (such as fragrances), fresheners, defoamers, isot
  • additives can be used alone or in combination of two or more.
  • the additive can be selected depending on the application.
  • a solubilizer, a solubilizer, a suspending agent, a buffer, a stabilizer, a preservative and the like may be used as the additive.
  • topical preparations such as inhalants and transdermal absorption agents, dissolution aids, stabilizers, buffers, suspending agents, emulsifiers, preservatives and the like may usually be used.
  • the pharmaceutical composition (formulation) or delivery system of the present invention can be applied to mammals including humans, and can be administered to the skin and / or mucous membrane as described above. That is, the pharmaceutical composition (formulation) or delivery system of the present invention can be noninvasively administered to a patient in various forms as a skin or mucosa-applied preparation and into mucous membranes such as skin, nose and lung.
  • the administration site may be a disease site, for example, an onset site of an allergic disease and / or a microbial infection, or a non-disease site.
  • the oligonucleic acid composition (or composite composition) is useful for the treatment of inflammatory diseases and is useful for the treatment of atopic dermatitis.
  • the pharmaceutical composition (formulation) of the present invention is not only for treating inflammatory diseases (such as rheumatoid arthritis) and atopic dermatitis, but also for treating and preventing various diseases in the skin and mucous membranes, particularly allergic diseases and infectious diseases. Useful. Examples of allergic diseases include allergic rhinitis, hay fever and bronchial asthma.
  • the pharmaceutical composition (formulation) of the present invention is also effective for treating inflammatory diseases of the skin and mucous membranes, microbial infections such as viruses, bacteria, and protozoa.
  • compositions or preparations (including an antiallergic agent) containing a cell-penetrating peptide modified with a higher fatty acid can greatly improve the stability of the oligonucleic acid and can enhance the pharmacological activity of the oligonucleic acid. Therefore, compositions or preparations (including antiallergic agents) or delivery systems that contain cell-penetrating peptides modified with higher fatty acids are suitable for inflammatory diseases (such as rheumatoid arthritis) and allergic diseases (atopic dermatitis, psoriasis, allergic) Treatment and / or prevention can be greatly improved for diseases such as rhinitis, hay fever and bronchial asthma.
  • inflammatory diseases such as rheumatoid arthritis
  • allergic diseases atopic dermatitis, psoriasis, allergic
  • the pharmaceutical compositions and preparations of the present invention are highly safe and are human and non-human animals, usually mammals (eg, humans, mice, rats, rabbits, dogs, cats, cows, horses, pigs, monkeys, etc.), Especially safe for humans.
  • the dosage of the pharmaceutical composition and preparation is appropriately selected depending on the subject of administration, age of the subject, body weight, sex and condition (general condition, medical condition, presence of complications, etc.), administration time, dosage form, administration method, etc. Any pharmaceutically effective amount can be used.
  • administering a pharmaceutically effective amount to a patient means that an appropriate level of drug for treating various diseases is administered to the patient.
  • the dosage (for example, the dosage for humans) may be, for example, 0.0001 to 1000 mg, preferably 0.0001 to 100 mg, more preferably 0.001 to 10 mg per kg body weight as oligonucleic acid.
  • the number of administrations of the pharmaceutical composition or preparation (preventive and / or therapeutic agent) of the present invention can be selected according to the patient's symptoms and the like, for example, once or multiple times (about 2 to 6 times) per day it can.
  • a nucleic acid delivery system (a composition, a pharmaceutical composition or a preparation (including an antiallergic agent) containing at least an oligonucleic acid and a cell-penetrating peptide) is medically effective for a patient in need of treatment. Also encompassed are methods of administering and treating allergic diseases or microbial infections, uses for treating allergic diseases or microbial infections, and use in the manufacture of pharmaceutical compositions (or formulations).
  • STR-CH 2 R 4 H 2 C Peptide shown in SEQ ID NO: 6 modified with stearic acid
  • the cells were washed twice with phosphate buffered saline (PBS), 1 mL of DMEM medium without serum was added to each well, and then siRelA1 (SEQ ID NOs: 7 and 8 described later) or siRelA2 (described later). 0.1 ⁇ g and 1 ⁇ g of SEQ ID NO: 9, 10) were added, and the cells were transfected for 24 hours under conditions of 37 ° C. and 5% CO 2 . Thereafter, each cell was washed twice with PBS, detached from the flask with 0.05% trypsin-EDTA, and DMEM containing serum was added to stop the activity of trypsin-EDTA.
  • PBS phosphate buffered saline
  • the cell suspension was collected in an Eppendorf tube, centrifuged at 1,500 rpm for 5 minutes, further washed once with PBS, and centrifuged under the same conditions. This was incubated at room temperature for 5 minutes and centrifuged at 7500 ⁇ g at 4 ° C. After removing the supernatant, it was air-dried for about 10 minutes and dissolved in water containing no nuclease to obtain an RNA solution. Primers were added to the cDNA solution obtained by reverse transcription of this RNA solution and mixed to prepare a PCR reaction solution. The reaction solution was subjected to RT-PCR to measure the amount of intracellular mRNA. The relative amount of RelA mRNA in untreated cells was taken as 1, and the relative amount was determined, and the suppression of RelA mRNA expression by siRelA was measured.
  • siRelA1 and siRelA2 show a dose-dependent suppression of mRelA expression.
  • siRelA1 having high activity was used.
  • Tat / siRelA complex was added with 6.4 ⁇ g of Tat per 1 ⁇ g of siRelA and incubated for 30 minutes.
  • STR-CH 2 R 4 H 2 C / siRelA complex was prepared by adding 9.9 ⁇ g of STR-CH 2 R 4 H 2 C to 1 ⁇ g of siRelA and incubating for 24 hours.
  • Example 3 RNase A resistance test (experiment) Each of the complex solutions prepared by the method of Example 2 was diluted with RNase-free water to obtain a solution corresponding to 1 ⁇ g of siRelA, which was defined as 0 hour. Next, RNase A solution (10 ng for 1 ⁇ g of siRelA) was added to each sample. Then, after 0.25, 0.5, 1, 2, 5, 10, 24 hours, siRelA solution (1 ⁇ g / 50 ⁇ L) was collected. All samples were stored at ⁇ 40 ° C. after aliquoting.
  • siRelA was determined with time by measuring the fluorescence intensity using a microplate reader (Safore Microplate Reader, manufactured by TECAN, JAPAN).
  • siRelA 0.1 ⁇ g 10 ⁇ L of each sample (siRelA 0.1 ⁇ g) was set in a 15% polyacrylamide gel electrophoresis apparatus (Page Run, AE-6531, manufactured by ATTO Co.) and electrophoresis was performed. After the electrophoresis, the gel was immersed in a SYBR Green I solution, and 30 minutes later, the fluorescence band of siRelA was observed using a UV transilluminator (MINI-TRANSILLUMINATOR, NTM-10, manufactured by Funakoshi Co., Ltd.).
  • siRelA was observed by electrophoresis in naked siRelA.
  • siRelA when a peptide vector was used to form a complex (siRelA / STR-CH 2 R 4 H 2 C complex), siRelA was a stable complex, and no band was observed.
  • siRelA was released from the peptide vector by treating this complex in a solution prepared to a glutathione intracellular concentration that cleaves the disulfide bridge of the peptide vector. What is important is that the extracellular GSH concentration is 1/100 to 1/1000 of the intracellular concentration.
  • siRelA can exist stably as a complex. From this result, the peptide vector of the present invention can maintain a high intracellular environment response capability.
  • Example 5 Cytotoxicity test of bronchial epithelial cells (BEAS2B) of complex of siRelA and peptide vector (STR-CH 2 R 4 H 2 C) (experiment) BEAS2B cells suspended in a medium containing serum were seeded in a 96-well plate at 2 ⁇ 10 4 cells / well and cultured at 37 ° C. under 5% CO 2 for 24 hours. After the cells were washed twice with PBS, siRNA complex solution diluted with medium without serum was added and transfected for 24 hours. After adding WST-8 reagent and incubating under light-shielding conditions for 4 hours, absorbance at 450 nm was measured with a microplate reader. The cell viability of the control was taken as 1, and the relative cell viability was calculated.
  • FIG. 4 shows that STR—CH 2 R 4 H 2 C does not show any cytotoxicity up to an N / P ratio of 20.
  • Example 6 Test for measuring the efficiency of introduction of a complex of a fluorescence-labeled siRNA and a peptide vector (Tat or STR-CH 2 R 4 H 2 C) into dendritic cells (experiment) JAWSII cells (mouse bone marrow-derived dendritic cells) were tested using FBS ( (+) Suspended in ⁇ -MEM medium and seeded onto a 24 well plate at 2 ⁇ 10 5 cells / 1 mL. After 24 hours, the plate was washed twice with 1 mL of PBS, and 900 ⁇ L / well of OptiMEM was added.
  • FBS (+) Suspended in ⁇ -MEM medium and seeded onto a 24 well plate at 2 ⁇ 10 5 cells / 1 mL. After 24 hours, the plate was washed twice with 1 mL of PBS, and 900 ⁇ L / well of OptiMEM was added.
  • FAM-siRNA / Tat complex or FAM-siRNA / STR-CH 2 R 4 H 2 C complex was added and transfected for 4 hours. After transfection, the cells were washed twice with 1 mL of PBS, added with 300 ⁇ L of 0.05% trypsin-EDTA, incubated at 37 ° C. under 5% CO 2 for 3 minutes, and then added with 700 ⁇ L of ⁇ -MEM to detach the cells. . The detached cell suspension was transferred to an Eppendorf tube, centrifuged at 1000 rpm for 5 minutes, and the supernatant was removed.
  • Example 7 Treatment test of siRelA and peptide vector (STR-CH 2 R 4 H 2 C) complex in allergic rhinitis model mice (sneezing, nasal scratching) (Experiment) Preparation of allergic rhinitis model mouse (1)
  • Antigen sensitization 1 mg of OVA was dissolved in 1.1 mL of physiological saline to prepare an OVA solution.
  • This solution and Adjuvant's Imject (registered trademark) Alum were mixed, and a sensitive antigen solution was prepared so as to be 24 ⁇ g of OVA and 2.7 mg of aluminum hydroxide in 120 ⁇ L. Thereafter, the prepared sensitive antigen solution was mixed by inverting at 37 ° C. for 30 minutes, so that OVA and aluminum hydroxide were mixed.
  • a sensitive antigen solution was prepared at the time of use, and intraperitoneally administered 120 ⁇ L per BALB / c mouse on the administration start date (day 1) and day 15 using a 1 mL syringe and 26 G injection needle.
  • a control group received an adjuvant-only solution without OVA.
  • OVA was dissolved in physiological saline to prepare a 600 ⁇ g / 20 ⁇ L OVA solution, which was used as an antigen solution for exposure. From the 29th day, 10 ⁇ L of the antigen solution for exposure was administered to the left and right nasal cavities with a micropipette.
  • siRNA solution was administered to the left and right nasal cavity three times on the 28th, 31st and 34th days.
  • water for genetic engineering was administered.
  • the siRNA solution was administered 5 hours before OVA administration.
  • the evaluation items were the number of nasal scratches and the number of sneezing, which are clinical scores over time.
  • the mouse was placed in a transparent cage, and the number of times of sneezing and sneezing for 5 minutes after OVA nasal exposure was measured.
  • Example 8 Permeability test of siRelA in atopy model mouse ear by using AT1002 (experiment) Method for preparing atopy model mouse (1)
  • Antigen sensitization 5% picryl chloride solution using volume ratio 4/1 (ethanol / acetone) as solvent was used as a sensitive solution.
  • NC / Nga mice were anesthetized by intraperitoneal administration of Nembutal injection, and then the chest and abdomen were depilated, and 150 ⁇ L of the prepared sensitive solution was applied to the chest, abdomen, and foot pad.
  • siRNA which is a hydrophilic polymer exhibits high skin permeability by using AT1002 or a cell permeable peptide.
  • Example 9 Treatment test of siRelA in atopic model mice with AT1002 (experiment) An atopy model was produced by the same operation as in Example 8.
  • siRNA administration the siRelA solution was administered six times in total three times a week from the 11th day after the start of the experiment.
  • the evaluation items were measurement of auricle thickness and clinical score (redness, bleeding, thickening, deformation, and dryness were evaluated as 5 items, and each item had a symptom as one point, and the total was measured).
  • the present invention is useful for the treatment and prevention of various diseases in the skin and mucous membranes, especially allergic diseases (allergic rhinitis, hay fever, bronchial asthma, etc.) and infectious diseases.
  • the delivery system of the present invention containing a cell-penetrating peptide modified with a higher fatty acid can prevent inflammatory diseases (such as rheumatoid arthritis) and allergic diseases (atopic dermatitis, psoriasis, allergic rhinitis, hay fever, bronchial asthma, etc.) It is also effective for the treatment and / or prevention of diseases such as

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Abstract

　オリゴ核酸組成物は、抗アレルギー活性及び抗微生物活性を有するオリゴ核酸（転写因子ＮＦ－κＢを抑制するｓｉＲＮＡなど）と、細胞透過性ペプチド（アルギニン、ヒスチジンおよび両末端のシステインを含み、高級脂肪酸で修飾された塩基性ペプチド）と、必要によりタイトジャンクション開口ペプチドとを含む。細胞透過性ペプチドは、静電気的にオリゴ核酸と複合体を形成してもよく、ジスルフィド結合して架橋複合体を形成してもよい。オリゴ核酸組成物は、オリゴ核酸の安定性が高く、高い皮膚及び粘膜透過性を有し、標的細胞にオリゴ核酸を送達できるため、皮膚又は粘膜投与によりアレルギー性疾患及び感染症を有効に治療できる。

Description

オリゴ核酸組成物及び抗アレルギー剤
　本発明は、抗アレルギー作用又は抗微生物作用を有するオリゴ核酸を含むオリゴ核酸組成物、アレルギー性疾患又は感染症の予防及び／又は治療に有用な医薬組成物又は製剤、並びに抗アレルギー剤（及び抗微生物剤又は抗感染症剤）に関する。
　アレルギー疾患は、肉体活動、精神活動および社会活動を妨げ、ＱＯＬを著しく低下させる。現在、アレルギー疾患に対する根治療法はほとんど無く、新しい作用機序を有する新規治療法の開発が期待されている。また、花粉症やアレルギー性鼻炎は、近年患者数が急増しており、容易に投与でき、安全で有効な吸入剤などの開発が必須である。
　ＨＩＶ、カンジダ、ＨＣＶ、ＨＢＶ、インフルエンザなどの感染症については、有効な低分子治療薬が未だ見出されておらず、薬剤の使用により耐性が生じることが欠点として知られており、新規治療法の開発が期待されている。
　近年、バイオテクノロジーの進歩に伴い遺伝子発現を制御することで病気を治療する新しい医薬品の開発が盛んに行われており、その１つとしてｓｉＲＮＡが挙げられる。
　ｓｉＲＮＡは、単一の標的遺伝子と結合親和性が強く、単一遺伝子の発現亢進が主原因である疾患に対して強い抑制効果があることがin vivoの実験系でつぎつぎに報告されている。また、ｓｉＲＮＡは、疾患に関連する遺伝子の発現を特異的に抑制できるため、副作用の少ない遺伝子治療薬としても期待されている。そのためｓｉＲＮＡは有効なアレルギー疾患、感染症に対する新規治療薬として期待されている。
　しかし、ｓｉＲＮＡは水溶性の高分子であり、体液中の核酸分解酵素によってエンザイムで容易に分解するため、動物やヒトへの実用化を可能とするには、安定化と標的細胞内への高い導入効率を有し、かつ安全なキャリアを組み合わせた非侵襲的なｓｉＲＮＡ投与システムの開発が最大の課題となっている。例えば、特開２００６－１１１５９１号公報（特許文献１）には、デコイ核酸が、カチオン性のコレステロール、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート８０および葉酸－ポリエチレングリコール－ジステアロイルフォスファチジルエタノールアミンからなる組成物に包含されている安定化製剤が開示されている。この文献には、アレルギー性の皮膚疾患に有用であることが記載されている。しかし、この安定化製剤は、細胞表面の葉酸受容体の発現量によって、細胞内への導入が大きく制約される。
　アレルギー疾患の治療に向けた標的遺伝子としては、転写因子が有効であることが報告されている。例えば、特開２００７－１３７８９１号公報（特許文献２）には、転写因子であるＮＦ-κＢのデコイ核酸を含む皮膚投与製剤が、アトピー性皮膚炎に対して有効であることが報告されている。また、特開２００７－５２３６５８号公報（特許文献３）には、ＳＴＡＴ６に対するｓｉＲＮＡを用いることで喘息や鼻炎のような気道のアレルギー性疾患に有効であることが報告されている。
　しかし、これらの文献では、ｓｉＲＮＡを細胞内に効率よく導入できるか否か不明であり、効率の高い細胞内導入ベクターおよび細胞に到達するための粘膜バリアや皮膚を通過させる技術は開示されていない。
　第２５回日本ＤＤＳ学会（２００９年７月４日）では、「2-C-11 機能性ペプチドＡＴ１００２およびＴａｔを用いたＮＦκＢ標的ｓｉＲＮＡのアトピー性皮膚炎（ＡＤ）治療効果」（非特許文献１）と題して、ＮＦκＢ構成タンパク質であるＲｅｌＡ標的ｓｉＲＮＡとＴａｔの複合体をＡＴ１００２と混合してアトピー性マウスに経皮投与すると、アトピー治療薬となりうることが示唆されたと報告されている。
特開２００６－１１１５９１号公報（特許請求の範囲） 特開２００７－１３７８９１号公報（特許請求の範囲） 特開２００７－５２３６５８号公報（特許請求の範囲）
第２５回日本ＤＤＳ学会「2-C-11 機能性ペプチドＡＴ１００２およびＴａｔを用いたＮＦκＢ標的ｓｉＲＮＡのアトピー性皮膚炎（ＡＤ）治療効果」
　従って、本発明の目的は、オリゴ核酸の安定性が高く、高い細胞透過性を有するオリゴ核酸組成物；アレルギー性疾患、感染症の予防及び／又は治療に有用であり、効率よく有効成分のオリゴ核酸を標的細胞に導入できる医薬組成物又は製剤並びに抗アレルギー剤を提供することにある。
　本発明の他の目的は、高い皮膚及び粘膜バリア透過性を有し、標的となる深部の組織細胞や免疫系細胞が多く存在する表皮下および粘膜上皮下にオリゴ核酸を効率よく送達できるオリゴ核酸組成物、抗アレルギー活性及び抗微生物活性を有効に発現できる医薬組成物又は製剤並びに抗アレルギー剤を提供することにある。
　本発明のさらに他の目的は、オリゴ核酸の安定性をさらに改善し、オリゴ核酸の活性を増強できるオリゴ核酸組成物、抗アレルギー活性及び抗微生物活性を有効に発現できる医薬組成物又は製剤並びに抗アレルギー剤を提供することにある。
　本発明者らは、前記課題を達成するため鋭意検討した結果、（１）短鎖オリゴ核酸と、この短鎖オリゴ核酸を細胞内又は核内に送達可能な細胞透過性ペプチドとを組み合わせると、皮膚および粘膜透過性、細胞導入性を向上できること、（２）短鎖オリゴ核酸と細胞透過性ペプチドとが静電気的に結合した複合体を形成すると、オリゴ核酸を複合体として安定化でき、皮膚及び粘膜透過性、細胞導入性を向上できること、（３）細胞透過性ペプチドがジスルフィド結合してジスルフィド架橋型複合体を形成すると、細胞外ではオリゴ核酸を複合体として安定化させ、細胞内の還元環境下では短鎖オリゴ核酸を複合体から効率よく解離でき、標的部位でオリゴ核酸の薬理活性を有効に発現できること、（４）細胞透過性ペプチドを高級脂肪酸で修飾すると、上記効果がさらに増強されること、（５）さらにタイトジャンクション開口ペプチドと組み合わせると、皮膚および粘膜透過性、細胞導入性をさらに向上でき、アレルギー性疾患及び感染症の予防及び／又は治療に有用であることを見いだし、本発明を完成した。
　すなわち、本発明のオリゴ核酸医薬組成物は、（ａ）抗アレルギー活性又は抗微生物活性を有する短鎖オリゴ核酸と、（ｂ）細胞透過性ペプチドとを含む。短鎖オリゴ核酸は、ｓｉＲＮＡ、リボザイム、デコイ核酸、アプタマー、アンチセンス、及びｍｉＲＮＡから選択された少なくとも１種であってもよい。また、短鎖オリゴ核酸は、一本鎖又は二本鎖構造を有し、５～８５塩基の長さを有する短鎖リボ核酸であってもよく、１０～３０塩基の長さを有する短鎖リボ核酸であってもよい。好ましい短鎖オリゴ核酸は、転写因子ＮＦ－κＢの発現を抑制可能なオリゴ核酸、例えば、ＮＦ－κＢ１、ＮＦ－κＢ２、ＲｅｌＡ、ＲｅｌＢ及びｃ－Ｒｅｌから選択された少なくとも一種のＮＦ－κＢサブユニットの発現を抑制可能なオリゴ核酸であってもよい。例えば、短鎖オリゴ核酸は、ＲｅｌＡの発現を抑制可能なオリゴ核酸であってもよい。細胞透過性ペプチドは、アルギニン２～１２残基、ヒスチジン１～８残基、及びシステイン１～４残基からなるペプチドであってもよく、アルギニン２～６残基、ヒスチジン１～４残基、システイン１～３残基からなるペプチドであってもよい。また、細胞透過性ペプチドは、Ｔａｔペプチド（４８-５７）又はその修飾体であってもよく、配列番号６のアミノ酸配列（Cys-His-His-Arg-Arg-Arg-Arg-His-His-Cys）を含有するペプチドであってもよい。前記短鎖オリゴ核酸と細胞透過性ペプチドとは静電気的に結合して複合体を形成してもよい。
　細胞透過性ペプチドは、高級脂肪酸、例えば、飽和又は不飽和Ｃ８－２４高級脂肪酸で修飾されていてもよい。また、細胞透過性ペプチドは、ジスルフィド結合を有していてもよい。このジスルフィド結合により、前記複合体はジスルフィド架橋型複合体を形成してもよい。
　本発明の組成物は、さらに、（ｃ）タイトジャンクション開口ペプチドを含んでいてもよい。タイトジャンクション開口ペプチドは、ＡＴ１００２などであってもよい。
　より具体的には、オリゴ核酸医薬組成物は、（ａ）ＮＦ－κＢのＲｅｌＡの発現を特異的に抑制するオリゴ核酸と、（ｂ）アルギニン、ヒスチジン及びシステインで構成され、かつアミノ基が飽和又は不飽和Ｃ１２－２０高級脂肪酸で修飾されていてもよい細胞透過性ペプチドと、（ｃ）粘膜透過性を高めるためのタイトジャンクション開口ペプチドとを含み、（ｂ）細胞透過性ペプチドがジスルフィド結合を有していてもよい。
　オリゴ核酸医薬組成物は、ヒトを含む哺乳動物の皮膚及び／又は粘膜に投与可能であってもよい。本発明は、前記オリゴ核酸医薬組成物と、薬学的に許容可能な担体とを含む医薬組成物；例えば、皮膚又は粘膜に適用される製剤であって、前記オリゴ核酸医薬組成物と、薬学的に許容可能な担体とを含む製剤；（ａ）抗アレルギー活性を有する短鎖オリゴ核酸と、（ｂ）細胞透過性ペプチドと、（ｃ）必要により粘膜透過性を高めるためのタイトジャンクション開口ペプチドとを含む抗アレルギー剤も包含する。さらに、高級脂肪酸で修飾された細胞透過性ペプチドは、オリゴ核酸の安定性をさらに高めるとともに、オリゴ核酸の薬理活性を増強する。そのため、本発明は、アレルギー性疾患又は炎症性疾患を治療及び／又は予防するための医薬組成物であって、（ａ）抗アレルギー活性を有する短鎖オリゴ核酸と、（ｂ）アミノ基が飽和又は不飽和高級脂肪酸で修飾された細胞透過性ペプチドと、（ｃ）必要によりタイトジャンクション開口ペプチドとを含む医薬組成物も包含する。（ａ）短鎖オリゴ核酸と、（ｂ）細胞透過性ペプチドと、（ｃ）必要によりタイトジャンクション開口ペプチドとを組み合わせると、標的細胞又は標的部位にオリゴ核酸を有効に送達できる。そのため、これらの医薬組成物、製剤及び抗アレルギー剤は、オリゴ核酸を所定部位に送達するための送達システムということもできる。
　この送達システムは、液剤、半固形製剤又は噴霧剤の形態であってもよい。具体的には、この送達システムは、（ａ）ＮＦ－κＢのＲｅｌＡの発現を特異的に抑制するオリゴ核酸と、（ｂ）アルギニン、ヒスチジン及びシステインで構成され、アミノ基が飽和又は不飽和Ｃ１２－２０高級脂肪酸で修飾されていてもよい細胞透過性ペプチドと、（ｃ）必要によりタイトジャンクション開口ペプチドとを含んでいてもよい。
　本発明の送達システムは、アレルギー性鼻炎、花粉症、及び気管支喘息から選択されたアレルギー性疾患に適用できる。
　より具体的には、本発明は、例えば、短鎖オリゴ核酸（例えば、ＮＦ-κＢ、特にそのサブユニットのＲｅｌＡの発現を特異的に抑制する短鎖リボ核酸）と、アルギニン残基、ヒスチジン残基及びシステイン残基で構成され、かつ脂肪酸で修飾された細胞質感受性ペプチドベクターとの複合体と、タイトジャンクション開口ペプチドとを含むオリゴ核酸組成物、皮膚や粘膜などのアレルギー性疾患又は感染症の疾患部位又は非疾患部位に投与可能な送達システムに関する。
　なお、本明細書中、塩基の長さの単位に関し、１本鎖核酸の場合は「塩基」を用い、２本鎖核酸の場合は「塩基」又は「塩基対（ｂｐ）」を用いる。例えば、２本鎖核酸において、３０塩基と３０塩基対とは同じ長さであることを意味する。特に、１本鎖核酸及び２本鎖核酸の双方の塩基の長さを表すときには、「塩基」を用いる。
　本発明では、オリゴ核酸と細胞透過性ペプチドと組み合わせているため、オリゴ核酸の安定性を保ち、高い細胞導入能を有しており、効率よく有効成分であるオリゴ核酸を標的細胞に送達できる。また、オリゴ核酸と細胞透過性ペプチドとの複合体を形成することにより、オリゴ核酸の安定性を大きく向上できる。特に、高級脂肪酸で修飾した細胞透過性ペプチドを用いると、オリゴ核酸の安定性をさらに改善できるとともに、標的細胞への送達効率をさらに高め、オリゴ核酸の活性を増強できる。また、タイトジャンクション開口ペプチドと併用すると、高い皮膚及び粘膜バリア透過性を有するため、標的となる上皮細胞免疫系細胞が多く存在する表皮下および粘膜上皮下に効率よく送達できるため、高い薬理効果を発揮できる。
図１は実施例１のＲｅｌＡ ｍＲＮＡ発現抑制試験の結果を示すグラフである。 図２は実施例３のＲＮａｓｅＡ耐性試験の結果を示すグラフである。 図３は実施例４の細胞内還元環境応答性試験の結果を示す図である。 図４は実施例５の細胞傷害性試験の結果を示すグラフである。 図５は実施例６の樹状細胞内への導入効率測定試験の結果を示すグラフである。 図６は実施例７のアレルギー性鼻炎モデルマウスを用いた治療試験の結果を示すグラフである。 図７はｓｉＲＮＡ単独投与群とｓｉＲＮＡ／Ｔａｔ複合体及びＡＴ１００２併用投与群における皮膚透過性を示す図である。 図８は投与スケジュール、耳の肥厚および臨床スコアの結果を示すグラフである。
　本発明のオリゴ核酸組成物（又は複合組成物）は、少なくとも（ａ）抗アレルギー活性又は抗微生物活性を有する短鎖オリゴ核酸と、（ｂ）細胞透過性ペプチドとを含んでいる。このようなオリゴ核酸組成物（又は複合組成物）は、例えば、皮膚では、真皮又は表皮の細胞内にオリゴ核酸を送達するのに有利である。そのため、本発明は、オリゴ核酸を所定部位に送達するための送達システムと言うこともできる。
　［（ａ）短鎖オリゴ核酸］
　短鎖オリゴ核酸は、抗アレルギー活性（例えば、標的細胞においてアレルギー因子の制御遺伝子の発現を抑制する機能又は作用、すなわち転写因子阻害作用）又は抗微生物活性（ウイルスおよびバクテリアの増殖を抑制する機能又は作用、すなわち感染症治療効果）を有する限り、特に限定されず、短鎖のＲＮＡのアンチセンスおよびその活性誘導体、リボザイム、さらには短鎖の二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）であってもよい。短鎖オリゴ核酸としては、例えば、ｓｉＲＮＡ、リボザイム、デコイ核酸、アプタマー、アンチセンス、ｍｉＲＮＡなどが例示できる。
　また、短鎖オリゴ核酸は、一本鎖構造を有していてもよく、二本鎖構造を有していてもよい。例えば、ｍｉＲＮＡは、一本鎖として含まれていてもよく、２本鎖ＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ前駆体、例えば、７０塩基前後の前駆体）として含まれていてもよい。短鎖オリゴ核酸の長さは、例えば、５～８５塩基、好ましくは８～６０塩基（例えば、８～５０塩基）、さらに好ましくは１０～３０塩基（例えば、１２～２８塩基）程度であってもよく、短鎖オリゴ核酸は、短鎖リボ核酸又は短鎖デオキシリボ核酸（特に、短鎖リボ核酸）であってもよい。
　さらに、短鎖オリゴ核酸は、アレルギーの構成因子、原因又は関連因子、例えば、転写因子（例えば、ＮＦ－κＢ）及びサイトカイン（例えば、ＴＮＦ－α；ＩＬ－１，４，６，８，１０，１３，１８などのＩＬ－１～１８など）から選択された少なくとも一つの発現を抑制する作用（転写因子阻害作用）を有していてもよい。好ましい短鎖オリゴ核酸は、皮膚真皮中のマクロファージや樹状細胞などで亢進しているＮＦ－κＢの発現を抑制しアレルギー疾患を予防・治療できる点から、ＮＦ－κＢの発現を抑制する作用［例えば、ＮＦ－κＢの５つのサブタイプ（ＮＦ－κＢ１、ＮＦ－κＢ２、ＲｅｌＡ、ＲｅｌＢ、ｃ－Ｒｅｌ）の少なくともいずれか一つの発現を抑制する作用、特に、ＲｅｌＡの発現を抑制する作用］を有している。
　抗ウイルス活性（抗微生物活性）を有するｓｉＲＮＡとしては、例えば、ＨＢＶ、ＲＳＶなどですでに臨床試験がなされているが、ウイルスのＲＮＡあるいはＤＮＡに直接作用してその増殖を特異的に抑制させるオリゴ核酸である。同様に細菌や真菌などの遺伝子に対しても有効に抑制するオリゴ核酸を用いることもできる。
　なお、短鎖オリゴ核酸は、生体内安定性（酵素安定性）や標的選択性を向上させ、オフターゲット効果を回避するために、種々の化学修飾（部分的に化学構造を改変又は修飾）を施してもよい。例えば、短鎖オリゴ核酸は、その一部に修飾塩基が導入されたオリゴ核酸、リン酸エステル結合部が改変されたオリゴ核酸（例えば、リン酸エステル結合部の酸素原子を硫黄原子に置換したオリゴ核酸など）、リボース環の２’－位にハロゲン原子（フッ素原子など）又はアルコキシ基（メトキシ基などのＣ１－４アルコキシ基）基が導入されたオリゴ核酸（リボースの－Ｆ体、－ＯＭｅ体など）、五炭糖中の酸素原子を硫黄原子に置換したオリゴ核酸（４’－チオ核酸）、リボース環が開裂したオリゴ核酸、環状に側鎖が導入されたオリゴ核酸（リボースがアルキル鎖でリング状に結合されたオリゴ核酸）であってもよい。
　これらの短鎖オリゴ核酸は単独で又は二種以上組み合わせて使用できる。これらの短鎖オリゴ核酸のうち、ｓｉＲＮＡが好ましい。ｓｉＲＮＡは、ＮＦ－κＢのＲｅｌＡの発現を特異的に抑制する。すなわち、ｓｉＲＮＡは細胞内でＲＮＡ誘導型サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）と結合し、このｓｉＲＮＡ／ＲＩＳＣ複合体が標的ｍＲＮＡの相補的配列に結合することにより、標的ｍＲＮＡを分解し、配列特異的に遺伝子の発現を抑制できる。ｓｉＲＮＡは、標的ｍＲＮＡの種類に応じて適宜選択でき、例えば、ＮＦ－κＢ（特にＲｅｌＡ）ｍＲＮＡの発現を抑制するｓｉＲＮＡとしては、サブユニットのｍＲＮＡと相補的に作用すればよく、後述の配列番号７及び８で示される二本鎖ＲＮＡ、後述の配列番号９及び１０で示される二本鎖ＲＮＡ、またはそれらの配列に対して相補的な配列を有するＲＮＡ分子などが例示できる。ｓｉＲＮＡにおいては、センス鎖及びアンチセンス鎖の一部及び大部分がオリゴＤＮＡであってもよい。これらのｓｉＲＮＡは、単独で又は二種以上組み合わせて使用できる。なお、特開２００５－２５４９６６号公報などに記載されているように、作用部位の異なるｓｉＲＮＡを併用することで相乗的な効果を得ることができる。ｓｉＲＮＡは、人工的に合成してもよく、細胞を利用して産生させてもよい。
　なお、ｓｉＲＮＡには、前記配列番号又はその相補的配列に対して少なくとも６０％（例えば、６０～９９．９％）、好ましくは少なくとも７０％（例えば、７５～９９．９％）、さらに好ましくは少なくとも８０％（例えば、８５～９９％）、特に少なくとも９０％（例えば、９５～９９％）程度の配列相同性を有する核酸も含まれる。
　短鎖オリゴ核酸（ｓｉＲＮＡなど）は、細胞透過性ペプチドと静電気的に複合体を形成するため、正又は負の電荷、特に負の電荷を帯びている場合が多い。
　［（ｂ）細胞透過性ペプチド］
　一般に、オリゴ核酸からなる医薬製剤を皮膚又は粘膜（鼻、肺などの粘膜）に適用すると、（１）生体内の多くの酵素によって分解を受ける、（２）角質、表皮、粘膜上皮などの障壁を突破し標的細胞まで送達させることは非常に困難なため、オリゴ核酸からなる医薬製剤は、投与部位として魅力的な皮膚又は粘膜投与が極めて困難である。本発明では、このようなオリゴ核酸であっても、細胞透過性ペプチドと組み合わせることにより、皮膚及び粘膜透過性を向上させ、標的部位にオリゴ核酸の薬理活性を有効に作用させることができる。特に、静電気的作用により細胞透過性ペプチドとオリゴ核酸との複合体（前記成分が静電気的に結合した複合体）を形成すると、酵素的分解からオリゴ核酸を保護して安定化しつつ標的部位に送達できる。例えば、負の電荷を帯びた短鎖オリゴ核酸と塩基性ペプチドとを組み合わせると、オリゴ核酸が安定化された複合体（又は複合体微粒子）を生成でき、標的部位に送達できる。そのため、本発明は、オリゴ核酸を有効成分とし、かつ高い皮膚及び粘膜透過性、細胞導入能を有するデリバリーシステム（特に、ドラッグデリバリーシステムDDS）と言うこともできる。
　細胞透過性ペプチド（ペプチドベクター、細胞質感受性ペプチドベクター又は塩基性ペプチドキャリア）は、標的の細胞に特異的に導入するため細胞膜の透過性を有するとともに、短鎖オリゴ核酸と静電的に相互作用して複合体を形成でき、生体内の分解酵素による短鎖オリゴ核酸の分解を抑制して安定性を向上させ、失活を抑制しつつ短鎖オリゴ核酸を細胞内又は核内に効率よく送達できる。このような細胞透過性ペプチドは、負又は正の電荷を帯びていてもよいが、負の電荷を帯びた短鎖オリゴ核酸と静電的に相互作用して（静電気的に結合して）安定な複合体を形成するため、少なくとも塩基性アミノ酸残基（例えば、ヒスチジン残基Ｈｉｓ及び／又はアルギニン残基Ａｒｇ）を含んでいるのが好ましい。すなわち、好ましい細胞透過性ペプチドは、正電荷を有する塩基性ペプチド（塩基性細胞透過性ペプチド）である。なお、ヒスチジン残基を備えた細胞透過性ペプチドは、エンドソーム脱出能を有する。
　好ましい細胞透過性ペプチドは、さらにシステイン残基Ｃｙｓを含んでいる。すなわち、細胞透過性ペプチドは、通常、アルギニン、ヒスチジン及びシステインで構成できる。さらに、システイン残基を有する細胞透過性ペプチド（前記複合体の細胞透過性ペプチド）は、ジスルフィド結合を形成することにより、細胞外ではオリゴ核酸を複合体として安定化でき、細胞内および核内の還元環境下では、ジスルフィド結合を分解して短鎖オリゴ核酸を複合体から効率よく解離又は放出できる。そのため、前記複合体において細胞透過性ペプチドをジスルフィド結合させてジスルフィド架橋型複合体を形成すると、短鎖オリゴ核酸を標的部位に有効に送達でき、薬理活性を有効に発現できる。
　細胞透過性ペプチドのアミノ酸残基の総数は、例えば、３～３０残基、好ましくは４～２５残基、さらに好ましくは５～２０残基（例えば、５～１２残基）程度である。細胞透過性ペプチド１分子が、アルギニン残基とヒスチジン残基とシステイン残基とで構成される場合、アルギニン残基を２～１２残基（好ましくは２～６残基）程度含んでいても、ヒスチジン残基を１～８残基（好ましくは１～４残基、通常、２～６残基）程度含んでいてもよく、システイン残基を１～４残基（好ましくは１～３残基、通常、２～４残基）程度含んでいてもよい。
　細胞透過性ペプチド（塩基性ペプチドキャリア又はベクターなど）は、通常、システイン残基Ｃｙｓが両末端に位置し、アミノ末端及びカルボキシル基末端のシステイン残基Ｃｙｓには、ヒスチジン残基Ｈｉｓと、ヒスチジン残基Ｈｉｓ又はアルギニン残基Ａｒｇとが順次隣接していてもよい。上記塩基性ペプチドベクター（細胞透過性ペプチド）は、例えば、下記式（１）
　　Ｃｙｓ－Ｈｉｓ－Ｘ－（Ｚ）ｎ－Ｙ－Ｈｉｓ－Ｃｙｓ　（１）
（式中、Ｘ及びＹは同一又は異なってＨｉｓ又はＡｒｇを示し、ＺはＣｙｓ、Ｈｉｓ又はＡｒｇ（特にＨｉｓ及び／又はＡｒｇ）で構成されたアミノ酸残基又はペプチド残基（特にＨｉｓ及び／又はＡｒｇで構成されたペプチド残基）を示し、ｎは０又は１～６の整数を示す）で表すことができる。ＺはＨｉｓ及び／又はＡｒｇ、特にＡｒｇであってもよい。具体的には、特に限定されないが、後述の配列番号１～６に示すペプチドが例示できる。
　細胞透過性ペプチドは、天然又は合成のＴａｔペプチド（４８-５７）又はその修飾体であってもよく、配列番号６：Cys-His-His-Arg-Arg-Arg-Arg-His-His-Cys（すなわち、配列CH2R4H2Cで表される配列（ＣはCys、ＨはHis、ＲはArgを示す））を有するペプチドであってもよい。
　なお、細胞透過性ペプチドには、配列番号１～６の配列の少なくとも一つの配列に対して５０～９９．９％（例えば、７０～９９％、好ましくは８０～９８％以上、さらに好ましくは８５～９５％、特に、９０～９５％）程度の配列相同性を有するペプチドも含まれる。
　細胞透過性ペプチドは、細胞膜の透過性を向上させるため、高級脂肪酸で修飾されているのが好ましい。高級脂肪酸は、親油性の高い脂肪酸、例えば、炭素数８～２４程度の飽和又は不飽和脂肪酸が例示でき、高級脂肪酸としては、飽和高級脂肪酸（例えば、カプリル酸、カプリン酸、ラウリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、ベヘン酸など）、不飽和高級脂肪酸（例えば、オレイン酸、エライジン酸、リノール酸、リノレン酸、エレオステアリン酸など）が例示できる。高級脂肪酸は、通常、飽和又は不飽和Ｃ１０－２４脂肪酸（ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、オレイン酸など）、好ましくは飽和又は不飽和Ｃ１２－２０脂肪酸、さらに好ましくは飽和又は不飽和Ｃ１４－１８脂肪酸（例えば、ステアリン酸などのＣ１６－１８脂肪酸）である。好ましい高級脂肪酸は、飽和脂肪酸（例えば、ステアリン酸などの飽和Ｃ１４－１８脂肪酸）であってもよい。
　高級脂肪酸で修飾された細胞透過性ペプチドは、例えば、下記式（２）で表すことができる。
　　　Ｒ１－Ｃｙｓ－Ｈｉｓ－Ｘ－（Ｚ）ｎ－Ｙ－Ｈｉｓ－Ｃｙｓ　（２）
（式中、Ｒ１はＣｙｓの末端アミノ基とアミド結合した高級脂肪酸残基を示し、Ｘ、Ｙ、Ｚ、ｎは前記に同じ）
　高級脂肪酸で修飾した細胞透過性ペプチドを用いると、オリゴ核酸を強力に安定化できるとともに、細胞内での環境応答能力（ジスルフィド結合とその開裂によるオリゴ核酸の放出など）を高めることができ、しかも細胞毒性を示さない。さらに、オリゴ核酸の細胞取り込み能を向上できると共に、オリゴ核酸の薬理活性を増強でき、長期間に亘りアレルギー作用及び感染症を抑制できる。
　細胞透過性ペプチドは、慣用の方法、例えば、アミド結合生成反応を利用して細胞透過性ペプチドのアミノ基を高級脂肪酸（例えば、ステアリン酸）で修飾することにより行うことができる。なお、高級脂肪酸は、ペプチドのアミノ基を修飾すればよく、ペプチド鎖から分岐した側鎖のアミノ基を修飾してもよいが、少なくともペプチド鎖のアミノ末端を修飾する場合が多い。
　細胞透過性ペプチドの割合は、短鎖オリゴ核酸１重量部に対して、例えば、０．０１～５０重量部程度の範囲から選択でき、例えば、０．１～３０重量部、好ましくは１～２０重量部、さらに好ましくは５～１５重量部程度であってもよい。
　［（ｃ）タイトジャンクション開口ペプチド］
　本発明のオリゴ核酸組成物（又は複合組成物）には、さらに、（ａ）短鎖オリゴ核酸の粘膜透過性を促進させるため、タイトジャンクション開口ペプチド（透過促進作用を有するタイトジャンクション開口物質）を含んでいてもよい。タイトジャンクション開口ペプチドにより、粘膜のタイトジャンクションを一時的に開口させ、細胞間隙を通じて深部への透過性を向上させることによって、治療効果を向上できる。すなわち、短鎖オリゴ核酸を皮膚真皮内に送達した後、その真皮中の樹状細胞、ランゲルハンス細胞、マクロファージ、マスト細胞、種々のリンパ細胞などの標的細胞内へ効率よく送り込むことができる。特に、細胞透過性ペプチド（塩基性ペプチドベクターなど）とタイトジャンクション開口ペプチドとを組み合わせることにより、短鎖リボ核酸を安定化しつつ、短鎖リボ核酸を表皮及び粘膜を効率よく透過させ、表皮下又は真皮の標的細胞に効率的に送達できる。
　皮内又は粘膜内への透過促進作用を有するタイトジャンクション開口ペプチドの種類は特に限定されず、例えば、ＡＴ１００２（後述の配列番号１１）及びその誘導体、タイトジャンクションを支えるＺＯ－１に作用するクローディン及びその誘導体などが挙げられる。これらのタイトジャンクション開口ペプチドは単独で又は二種以上組み合わせて使用できる。好ましいタイトジャンクション開口ペプチドは、ＡＴ１００２を含む。
　タイトジャンクション開口ペプチドの割合は、短鎖オリゴ核酸１重量部に対して、例えば、０．０１～２００重量部、好ましくは０．０１～１５０重量部、さらに好ましくは０．０１～１００重量部程度であってもよい。また、上記割合は、０．０１～５０重量部程度の範囲から選択でき、例えば、０．１～３０重量部、好ましくは１～２０重量部、さらに好ましくは５～１５重量部程度であってもよい。
　　［オリゴ核酸組成物］
　本発明のオリゴ核酸組成物（又は複合組成物）は、前記（ａ）短鎖オリゴ核酸と（ｂ）細胞透過性ペプチドとを含んでいればよく、さらに（ｃ）タイトジャンクション開口ペプチドを含んでいてもよい。オリゴ核酸組成物は、前記成分（ａ）（ｂ）の単なる混合物又は前記成分（ａ）～（ｃ）の単なる混合物であってもよいが、前記のように、好ましい態様では、前記（ａ）短鎖オリゴ核酸と（ｂ）細胞透過性ペプチドとが静電気的に結合して複合体を形成しているのが好ましい。また、複合体は粒子状（又は微粒子状）の形態であってもよい。この複合体粒子（又は微粒子）の平均粒子径は、例えば、１０ｎｍ～１０μｍ（例えば、２５ｎｍ～５μｍ）、好ましくは５０ｎｍ～数μｍ（例えば、５０ｎｍ～３μｍ）程度であってもよい。
　さらに、前記のように、（ｂ）細胞透過性ペプチドは、ジスルフィド結合を有していてもよい。（ｂ）ジスルフィド結合を有する細胞透過性ペプチドは、複合体のオリゴ核酸を保護しつつ、細胞内および核内の還元環境下で、ジスルフィド結合が開裂し、短鎖オリゴ核酸を放出する機能をも有する。そのため、ジスルフィド結合を有する細胞透過性ペプチドは、細胞質感受性ペプチドと言うこともできる。なお、複数のシステイン残基（例えば、細胞透過性ペプチドの両末端に位置するシステイン残基など）のチオール基は、酸性環境下で容易にジスルフィド結合を形成する。
　　［医薬組成物又は製剤］
　本発明の前記オリゴ核酸組成物（又は複合組成物）は、（ａ）短鎖オリゴ核酸を細胞内又は核内に送達できるため、送達システムとして有用である。特に、（ａ）短鎖オリゴ核酸の分解を抑制しつつ、細胞内又は核内の所定の部位（例えば、標的遺伝子としての転写因子ｍＲＮＡ）に相補的に作用して転写因子を分解できるため、（ａ）短鎖オリゴ核酸の薬理活性を有効に利用できる。さらに、（ｃ）タイトジャンクション開口ペプチドを併用したオリゴ核酸組成物（又は複合組成物）は、皮膚及び粘膜透過性を向上できるため、より一層（ａ）短鎖オリゴ核酸の薬理活性を有効に発現できる。そのため、本発明は、前記（ａ）短鎖オリゴ核酸及び（ｂ）細胞透過性ペプチドと、必要により（ｃ）タイトジャンクション開口ペプチドと、薬学的に許容可能な担体とを含む医薬組成物（治療又は予防組成物）又は製剤（治療又は予防剤）も包含する。この医薬組成物又は製剤は、オリゴ核酸が抗アレルギー活性及び／又は抗微生物活性を有するため、アレルギー性疾患又は感染症を予防及び／又は治療するための医薬組成物又は製剤（治療又は予防剤）、抗アレルギー剤又は抗微生物剤（抗感染症剤）と言うこともできる。
　医薬組成物又は製剤、抗アレルギー剤又は抗微生物剤において、薬学的に許容可能な担体は、医薬組成物（又は製剤）の形態（剤形）、投与形態、用途などに応じて選択できる。剤形は、特に制限されず、固形製剤（粉剤、散剤、粒剤（顆粒剤、細粒剤など）、丸剤、ピル、錠剤、カプセル剤、ドライシロップ剤、座剤など）、半固形製剤（軟膏剤（クリーム剤、ゲル剤を含む）、グミ剤など）、液剤（溶液剤、懸濁剤、乳剤、シロップ剤、エリキシル剤、注射剤など）などであってもよい。また、噴霧剤又は噴射剤（前記粉剤及び／又は液剤などのスプレー剤、エアゾール剤など）も含まれる。なお、エアゾール剤は、吸入剤としても利用できる。さらに、製剤は経口投与製剤であってもよく、非経口投与製剤又は吸収剤（点鼻剤、吸入剤などの粘膜吸収剤、経皮投与製剤などの経皮吸収剤など）であってもよい。さらに、製剤は局所投与製剤、例えば、注射剤（水性注射剤、非水性注射剤など）などの溶液剤、懸濁剤、吸収剤（軟膏剤、貼付剤（パップ剤を含む）などの経皮投与製剤、点鼻剤、吸入剤などの粘膜投与製剤、液晶製剤）であってもよい。液晶製剤は、脂質などで構成され、吸収促進を改善する液晶を含んでいてもよい。本発明の好ましい製剤は、非固形製剤、例えば、液剤（溶液剤、懸濁剤など）、半固形製剤（ゲル剤、軟膏剤など）、噴霧剤（吸入剤を含むスプレー剤など）の形態であり、経皮的又は経粘膜的に薬理活性成分を吸収する吸収剤である場合が多い。
　また、本発明の好ましい製剤は、非経口投与製剤、特に、皮膚又は粘膜に適用される製剤、例えば、皮膚投与製剤（又は経皮投与製剤、経皮吸収剤）又は粘膜投与製剤（粘膜吸収剤）である。粘膜投与製剤は、鼻粘膜、肺粘膜、眼粘膜、耳粘膜、腸粘膜、口腔粘膜、生殖器粘膜（膣粘膜など）などの粘膜に適用できる。製剤は、代表的には、例えば、鼻腔内、皮膚、経気道吸入のルートで投与できる。なお、製剤は、薬剤の放出速度が制御された製剤（徐放性製剤、速放性製剤）であってもよい。
　前記担体は、例えば、局方の他、（１）医薬品添加物ハンドブック、丸善（株）、（１９８９）、（２）「医薬品添加物辞典２０００」（薬事日報社、２００２年３月発行）、（３）「医薬品添加物辞典２００５」（薬事日報社、２００５年５月発行）、（４）薬剤学、改訂第５版、（株）南江堂（１９９７）、及び（５）医薬品添加物規格２００３（薬事日報社、２００３年８月）に収載されている成分（例えば、賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、コーティング剤など）の中から、投与経路及び製剤用途に応じて適宜選択できる。例えば、固形製剤の担体としては、賦形剤、結合剤及び崩壊剤から選択された少なくとも一種の担体を使用する場合が多く、脂質などの添加剤を用いてもよい。
　前記賦形剤としては、乳糖、ショ糖、マンニトール、ソルビトールなどの糖類又は糖アルコール類；デンプン；結晶セルロース（微結晶セルロースも含む）などの多糖類；軽質無水ケイ酸、合成ケイ酸アルミニウムなどが例示できる。結合剤としては、可溶性デンプン；アラビアゴム、アルギン酸ナトリウムなどの多糖類；ポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコール、カルボキシビニルポリマー、ポリアクリル酸系ポリマー、ポリ乳酸、ポリエチレングリコールなどの合成高分子；メチルセルロース、エチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロースなどのセルロースエーテル類などが例示できる。崩壊剤としては、炭酸カルシウム、カルボキシメチルセルロース又はその塩（カルメロース、カルメロースナトリウム、カルメロースカルシウム、クロスカルメースナトリウムなど）、架橋ポリビニルピロリドン（架橋ポリビニルピロリドン（クロスポピドン）、クロスコポビドンなど）、低置換度ヒドロキシプロピルセルロースなどが例示できる。さらに、担体としては、生体適合性物質、例えば、生体吸収性ポリマー又は生分解性ポリマー（ポリ乳酸、ポリグリコール酸、乳酸－グリコール酸共重合体（PLGA）、ポリブチレンサクシネートなど）、高分子水性ゲルなども使用できる。これらの担体は、単独で又は二種以上組み合わせて使用できる。
　なお、前記コーティング剤としては、例えば、糖類、エチルセルロース、ヒドロキシメチルセルロースなどのセルロース誘導体、ポリオキシエチレングリコール、セルロースアセテートフタレート、ヒドロキシプロピルメチルセルロースフタレート、オイドラギット（メタアクリル酸・アクリル酸共重合物）などが用いられる。コーティング剤は、腸溶性成分であってもよく、胃溶性成分であってもよい。また、製剤は、これらの腸溶性成分や胃溶性成分を剤皮に含むカプセル剤であってもよい。
　液剤の担体のうち油性担体としては、動植物系油剤（ホホバ油、オリーブ油、やし油、綿実油などの植物系油剤；スクアランなどの動物系油剤など）、鉱物系油剤（流動パラフィン、シリコーンオイルなど）などが例示できる。水性担体としては、水（精製又は無菌水、注射用蒸留水など）、生理食塩水、リンゲル液、ブドウ糖液、水溶性有機溶媒［エタノール、イソプロパノールなどの低級脂肪族アルコール；（ポリ）アルキレングリコール類（エチレングリコール、ジエチレングリコール、ポリエチレングリコールなど）；グリセリンなど］、ジメチルイソソルビド、ジメチルアセトアミドなどが挙げられる。また、半固形剤の担体は、前記固形製剤の担体及び／又は液剤の担体から選択してもよい。さらに、半固形剤の担体は、脂質を含んでいてもよい。
　脂質としては、ワックス類（蜜ろう、カルナバろう、ラノリン、パラフィン、ワセリンなど）、長鎖脂肪酸エステル（脂肪酸と多価アルコールとのエステル（グリセライドなど）など）、硬化油、高級アルコール、高級脂肪酸（リノール酸、リノレイン酸、ステアリン酸、オレイン酸など）、金属石鹸類（例えば、ヤシ油脂肪酸ナトリウム、ステアリン酸カルシウムなどの脂肪酸金属塩など）などが例示できる。
　さらに、製剤は、添加剤を含んでいてもよい。添加剤としては、例えば、滑沢剤（例えば、ステアリン酸マグネシウムなど）、崩壊補助剤、抗酸化剤又は酸化防止剤、乳化剤（例えば、非イオン性界面活性剤などの各種界面活性剤など）、分散剤、懸濁化剤、溶解剤、溶解補助剤、増粘剤（カルボキシビニルポリマー、ポリビニルアルコール、カラギーナン、ゼラチンなどの水溶性高分子；カルボキシメチルセルロースなどのセルロースエーテル類など）、ｐＨ調整剤又は緩衝剤（クエン酸－クエン酸ナトリウム緩衝剤など）、安定剤、防腐剤又は保存剤（メチルパラベン、ブチルパラベンなどのパラベン類など）、殺菌剤又は抗菌剤（安息香酸ナトリウムなどの安息香酸類など）、帯電防止剤、矯味剤又はマスキング剤（例えば、甘味剤など）、着色剤（ベンガラなどの染顔料など）、矯臭剤又は香料（芳香剤など）、清涼化剤、消泡剤、等張化剤、無痛化剤などが挙げられる。これらの添加剤は単独で又は二種以上組み合わせて使用できる。添加剤は用途に応じて選択でき、例えば、注射剤では、通常、前記添加物として、溶解剤、溶解補助剤、懸濁化剤、緩衝剤、安定剤、保存剤などを用いてもよい。また、吸入剤、経皮吸収剤などの局所投与剤では、通常、溶解補助剤、安定剤、緩衝剤、懸濁化剤、乳化剤、保存剤などを用いてもよい。
　本発明の医薬組成物（製剤）又は送達システムは、ヒトを含む哺乳動物に適用でき、前記のように、皮膚及び／又は粘膜に投与可能である。すなわち、本発明の医薬組成物（製剤）又は送達システムは、皮膚又は粘膜適用製剤として、種々の形態で、皮膚や鼻、肺などの粘膜に非侵襲的に患者に投与できる。投与部位は、疾患部、例えば、アレルギー性疾患及び／又は微生物感染症の発症部位、若しくは非疾患部位であってもよい。
　前記オリゴ核酸組成物（又は複合組成物）は、炎症性疾患の治療に有用であること、アトピー性皮膚炎の治療に有用であることが報告されている。本発明の医薬組成物（製剤）は、炎症性疾患（関節リュウマチなど）及びアトピー性皮膚炎のみならず、皮膚や粘膜での様々な疾患、特にアレルギー性疾患および感染症疾患の治療及び予防に有用である。アレルギー性疾患としては、アレルギー性鼻炎、花粉症、気管支喘息などが例示できる。
　本発明の医薬組成物（製剤）は、皮膚や粘膜の炎症性疾患、ウイルス、バクテリア、原虫などの微生物感染症の治療にも有効である。
　特に、高級脂肪酸で修飾した細胞透過性ペプチドを含む組成物又は製剤（抗アレルギー剤を含む）は、オリゴ核酸の安定性を大きく改善できるとともに、オリゴ核酸の薬理活性を増強できる。そのため、高級脂肪酸で修飾した細胞透過性ペプチドを含む組成物又は製剤（抗アレルギー剤を含む）若しくは送達システムは、炎症性疾患（関節リュウマチなど）及びアレルギー疾患（アトピー性皮膚炎、乾癬、アレルギー性鼻炎、花粉症、気管支喘息などを含む）などの疾患に対しても治療及び／又は予防を大きく向上できる。
　本発明の医薬組成物及び製剤は、安全性が高く、ヒト及び非ヒト動物、通常、哺乳動物（例、ヒト、マウス、ラット、ウサギ、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ブタ、サルなど）、特にヒトに対し、安全に用いられる。医薬組成物及び製剤の投与量は、投与対象、投与対象の年齢、体重、性別及び状態（一般的状態、病状、合併症の有無など）、投与時間、剤形、投与方法等により、適宜選択でき、医薬的有効量であればよい。なお、「医薬的に有効量を患者に投与する」とは、各種疾患を治療するのに適切なレベルの薬剤を患者に投与することを意味する。投与量（例えば、ヒトに対する投与量）は、オリゴ核酸として、例えば、体重１ｋｇ当たり、０．０００１～１０００ｍｇ、好ましくは０．０００１～１００ｍｇ、さらに好ましくは０．００１～１０ｍｇでよい。また、本発明の医薬組成物又は製剤（予防及び／又は治療剤）の投与回数も患者の症状などに応じて選択でき、例えば、１日当たり、１回又は複数回（２～６回程度）投与できる。
　なお、本発明は、核酸送達システム（少なくともオリゴ核酸及び細胞透過性ペプチドを含む組成物、医薬組成物又は製剤（抗アレルギー剤を含む））を、治療を必要とする患者に医学上有効量を投与して、アレルギー疾患又は微生物感染症を治療する方法、アレルギー疾患又は微生物感染症を治療するための使用、医薬組成物（又は製剤）の製造への使用をも包含する。
　以下に、実施例に基づいて本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例によって限定されるものではない。
　なお、以下の実施例において、略号は慣用の意味で用いられ、例えば、下記略号の意味は次の通りである。
　　ＳＴＲ－ＣＨ２Ｒ４Ｈ２Ｃ：ステアリン酸を修飾した配列番号６に示すペプチド
　実施例１
　ＲｅｌＡに対するｓｉＲＮＡ（ｓｉＲｅｌＡ）のＲｅｌＡ ｍＲＮＡ発現抑制試験
　（実験）
　マウス表皮角化細胞であるＰＡＭ２１２細胞を、血清を含むＤＭＥＭ培地に懸濁し、１×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように、２４穴プレートに播種し２４時間前培養した。２４時間後、細胞をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で２回洗浄し、血清を含まないＤＭＥＭ培地１ｍＬを各ウェルに加えた後、ｓｉＲｅｌＡ１（後述の配列番号７，８）あるいはｓｉＲｅｌＡ２（後述の配列番号９，１０）の０．１μｇおよび１μｇを添加して３７℃、５％ＣＯ２条件下で２４時間トランスフェクションした。その後、各細胞をＰＢＳで２回洗浄し、０．０５％トリプシン－ＥＤＴＡによりフラスコから細胞を剥離し、血清を含むＤＭＥＭを添加し、トリプシン－ＥＤＴＡの活性をとめた。細胞懸濁液をエッペンドルフチューブに回収し、１，５００ｒｐｍ、５分間遠心分離し、さらにＰＢＳで１回洗浄し、同条件下で遠心分離した。これを室温で５分間インキュベーションし、４℃、７，５００×ｇで遠心分離した。上清を除去後、約１０分間風乾し、ヌクレアーゼを含まない水に溶解し、ＲＮＡ溶液とした。このＲＮＡ溶液を逆転写することで得られたｃＤＮＡ溶液にプライマーを添加して混合し、ＰＣＲ反応液を調製した。この反応液をＲＴ－ＰＣＲすることで、細胞内ｍＲＮＡ量を測定した。未処理の細胞のＲｅｌＡ ｍＲＮＡ量を１として、これに対する相対量を求め、ｓｉＲｅｌＡによるＲｅｌＡ ｍＲＮＡの発現抑制について測定した。
　（結果）
　図１に示すように、ｓｉＲｅｌＡ１及びｓｉＲｅｌＡ２は投与量依存的なｍＲｅｌＡ発現の抑制が認められる。以降の実験には活性が高かったｓｉＲｅｌＡ１を用いた。
　実施例２
　ｓｉＲｅｌＡとペプチドベクター（Ｔａｔ又はＳＴＲ－ＣＨ ２ Ｒ ４ Ｈ ２ Ｃ）との複合体形成方法
　複合体形成方法：Ｔａｔ／ｓｉＲｅｌＡ複合体はｓｉＲｅｌＡ １μｇに対してＴａｔ ６．４μｇを加え、３０分間インキュベーションし、ＳＴＲ－ＣＨ２Ｒ４Ｈ２Ｃ／ｓｉＲｅｌＡ複合体はｓｉＲｅｌＡ １μｇに対して、ＳＴＲ－ＣＨ２Ｒ４Ｈ２Ｃ ９．９μｇを加えて、２４時間インキュベーションすることでそれぞれ調製した。
　実施例３
　ＲＮａｓｅＡ耐性試験
　（実験）
　実施例２の方法で調製した複合体溶液をそれぞれＲＮａｓｅ－ｆｒｅｅ水で希釈後のｓｉＲｅｌＡ １μｇ相当の溶液を分取し、これを０時間とした。次に、各サンプルにＲＮａｓｅＡ溶液を（ｓｉＲｅｌＡ １μｇに対して１０ｎｇ）加えた。その後、０．２５、０．５、１、２、５、１０、２４時間後ｓｉＲｅｌＡ溶液（１μｇ／５０μＬ）を分取した。すべての試料は、分取後－４０℃で保存した。解凍した試料（５０μＬ）に、最終濃度１ｍＭとなるように２ｍＭデキストラン硫酸溶液５０μＬを加え、３０分間室温でインキュベーションし、ｓｉＲｅｌＡをベクターから遊離させた。次に、各試料１００μＬを９６ｗｅｌｌプレートに移し、ＲＮａｓｅ－ｆｒｅｅ水で１０００倍希釈したＳＹＢＲ　ＧｒｅｅｎＩ溶液５０μＬを添加後、３０分間室温でインキュベーションした。その後、マイクロプレートリーダー（Safore Microplate Reader、テカンジャパン（TECAN、JAPAN）（株）製）を用いて蛍光強度を測定することでｓｉＲｅｌＡ量を経時的に求めた。
　（結果）
　図２に示すように、ｎａｋｅｄ　ｓｉＲｅｌＡに比べ、Ｔａｔ又はＳＴＲ－ＣＨ２Ｒ４Ｈ２Ｃを添加することでｓｉＲｅｌＡのＲＮａｓｅＡによる分解を抑制することができた。特に、本発明で得られたＳＴＲ－ＣＨ２Ｒ４Ｈ２Ｃを用いることで強力なｓｉＲｅｌＡ安定化が可能となることが示された。
　実施例４
　ｓｉＲｅｌＡとペプチドベクター（ＳＴＲ－ＣＨ ２ Ｒ ４ Ｈ ２ Ｃ）との複合体の細胞質環境下でのｓｉＲＮＡの放出性試験（細胞内還元環境応答性試験）
　効果的なサイレンシング効果を得るためには、ｓｉＲｅｌＡを細胞内へ導入後、細胞質内で積極的にベクターからｓｉＲｅｌＡを遊離させる必要がある。本実施例では、細胞質内の代表的な還元酵素であるグルタチオン（ＧＳＨ）で処理した際のｓｉＲｅｌＡの遊離を電気泳動により観察した。
　（実験）
　電気泳動のサンプルとして３種類、すなわち、ｎａｋｅｄ　ｓｉＲｅｌＡ、ｓｉＲｅｌＡ／ＳＴＲ－ＣＨ２Ｒ４Ｈ２Ｃ複合体、ｓｉＲｅｌＡ／ＳＴＲ－ＣＨ２Ｒ４Ｈ２Ｃ複合体にグルタチオン（ＧＳＨ）とデキストラン硫酸を加え、ｓｉＲｅｌＡをＳＴＲ－ＣＨ２Ｒ４Ｈ２Ｃから遊離させたものを用いた。ｓｉＲｅｌＡ／ＳＴＲ－ＣＨ２Ｒ４Ｈ２Ｃ複合体からのｓｉＲｅｌＡの遊離はグルタチオン（ＧＳＨ）２０ｍＭで２時間、さらにデキストラン硫酸１ｍＭで３０分間処理することによって行った。各サンプル１０μＬ（ｓｉＲｅｌＡ ０．１μｇ）を１５％ポリアクリルアミドゲルの電気泳動装置（Ｐａｇｅ　Ｒｕｎ、ＡＥ－６５３１、アトー（ATTO Co.）（株）製）にセットし電気泳動を行った。泳動後、ＳＹＢＲ　Ｇｒｅｅｎ　Ｉ溶液にゲルを浸し、３０分後ＵＶトランスイルミネーター（ＭＩＮＩ－ＴＲＡＮＳＩＬＬＵＭＩＮＡＴＯＲ、ＮＴＭ－１０、フナコシ（株）製）を用いてｓｉＲｅｌＡの蛍光バンドを観察した。
　（結果）
　図３より、ｎａｋｅｄ　ｓｉＲｅｌＡではｓｉＲｅｌＡが電気泳動により観察された。それに対してペプチドベクターを用いて複合体（ｓｉＲｅｌＡ／ＳＴＲ－ＣＨ２Ｒ４Ｈ２Ｃ複合体）とした場合、ｓｉＲｅｌＡは、安定な複合体となり、バンドは観察されなかった。しかし、この複合体をペプチドベクターのジスルフィド架橋を切断するグルタチオン細胞内濃度に調製した溶液中で処理することで、ｓｉＲｅｌＡはペプチドベクターより遊離することが示された。重要なのは細胞外のＧＳＨ濃度は細胞内濃度の１／１００～１／１０００であり、たとえば体液・血液中ではｓｉＲｅｌＡは複合体のまま安定に存在できる。この結果より、本発明のペプチドベクターは、高い細胞内環境応答能力を保持できる。
　実施例５
　ｓｉＲｅｌＡとペプチドベクター（ＳＴＲ－ＣＨ ２ Ｒ ４ Ｈ ２ Ｃ）との複合体の気管支上皮細胞（ＢＥＡＳ２Ｂ）における細胞傷害性試験
　（実験）
　血清を含む培地に懸濁したＢＥＡＳ２Ｂ細胞を９６穴プレートに２×１０４ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌとなるように播種し、３７℃、５％ＣＯ２条件下で２４時間培養した。細胞をＰＢＳで２回洗浄した後、血清を含まない培地で希釈したｓｉＲＮＡ複合体溶液を添加し、２４時間トランスフェクションした。ＷＳＴ－８試薬を加え、遮光条件下で４時間インキュベーション後、マイクロプレートリーダーで４５０ｎｍの吸光度を測定した。コントロールの細胞生存率を１とし、相対的な細胞生存率を算出した。
　（結果）
　図４より、ＳＴＲ－ＣＨ２Ｒ４Ｈ２ＣはＮ／Ｐ比２０までは細胞傷害性を全く示さないことが示された。
　実施例６
　蛍光標識ｓｉＲＮＡとペプチドベクター（Ｔａｔ又はＳＴＲ－ＣＨ ２ Ｒ ４ Ｈ ２ Ｃ）との複合体の樹状細胞内への導入効率測定試験
　（実験）ＪＡＷＳII細胞（マウス骨髄由来樹状細胞）をＦＢＳ（＋）α－ＭＥＭ培地に懸濁し、２×１０５個／１ｍＬとなるように２４ｗｅｌｌプレートへ播種した。２４時間後、ＰＢＳ１ｍＬで２回洗浄し、ＯｐｔｉＭＥＭ ９００μＬ／ｗｅｌｌを添加した。そこに、ＦＡＭ－ｓｉＲＮＡ／Ｔａｔ複合体又はＦＡＭ－ｓｉＲＮＡ／ＳＴＲ－ＣＨ２Ｒ４Ｈ２Ｃ複合体１００μＬ（ＦＡＭ－ｓｉＲＮＡ、１μｇ／ｗｅｌｌ）を加え、４時間トランスフェクションした。トランスフェクション後、細胞をＰＢＳ１ｍＬで２回洗浄し、０．０５％トリプシン－ＥＤＴＡ ３００μＬを加え、３７℃、５％ＣＯ２条件下で３分間インキュベーションした後、α－ＭＥＭ ７００μＬを加え細胞を剥離した。剥離した細胞懸濁液をエッペンチューブに移し、１０００ｒｐｍ、５分間遠心分離後、上清を除いた。そこにＰＢＳ１ｍＬを加え、再度１０００ｒｐｍ、５分間遠心分離し、上清を除き、ＰＢＳ５００μＬを加え、２００メッシュのナイロン網でろ過し細胞懸濁液を回収した。この細胞懸濁液について細胞１万個あたりのＦＩＴＣの蛍光強度をFlowcytometry（FACSCanto、ベクトン・ディッキンソン社（Becton Dickinson）製）にて測定することで、細胞に接着、または取り込まれたＦＡＭ－ｓｉＲＮＡ量を評価した。前方光散乱光に対して、側方光散乱光を表示したプロット上で細胞集団にゲートをかけ、目的細胞群のコントロールにおける蛍光強度に対する細胞数のプロットで９５％の細胞が含まれる範囲をＰ１領域とし、それよりも蛍光強度の強い範囲をＰ２領域とした。ＦＡＭ－ｓｉＲＮＡが細胞に吸着または取り込まれるとＰ２領域の細胞数が増大するため、細胞集団中のＰ２領域に含まれる細胞の割合をＦＡＭ－ｓｉＲＮＡの取り込みの指標とした。
　（結果）
　図５より、ＪＡＷＳII細胞での蛍光標識したｓｉＲＮＡの取り込みはＳＴＲ－ＣＨ２Ｒ４Ｈ２Ｃの添加濃度に依存して増加し、市販のリポソームベクター（lipotrust）に匹敵する値を示した。この結果より、ＳＴＲ－ＣＨ２Ｒ４Ｈ２Ｃは高い細胞取り込み能を有することが示された。
　実施例７
　ｓｉＲｅｌＡとペプチドベクター（ＳＴＲ－ＣＨ ２ Ｒ ４ Ｈ ２ Ｃ）との複合体のアレルギー性鼻炎モデルマウスにおける治療試験（くしゃみ、鼻掻き回数）
　（実験）アレルギー性鼻炎モデルマウスの作製
　（１）抗原感作：ＯＶＡ １ｍｇを生理食塩水１．１ｍＬに溶解させ、ＯＶＡ溶液を調製した。この溶液とアジュバントのＩｍｊｅｃｔ（登録商標）Ａｌｕｍを混合し、１２０μＬ中にＯＶＡ ２４μｇ、水酸化アルミニウム２．７ｍｇとなるように感作用抗原溶液を調製した。その後、調製した感作用抗原溶液を３７℃で３０分間転倒混和し、ＯＶＡと水酸化アルミニウムをなじませた。感作用抗原溶液は用時調製し、投与開始日（１日目）と１５日目にＢＡＬＢ／ｃマウス１匹に対して１２０μＬを１ｍＬシリンジ、２６Ｇの注射針を用いて腹腔内投与した。コントロール群にはＯＶＡを含まないアジュバントのみの溶液を投与した。
　（２）抗原曝露：ＯＶＡを生理食塩水に溶解させ、６００μｇ／２０μＬのＯＶＡ溶液を調製し、曝露用抗原溶液とした。２９日目から曝露用抗原溶液を左右の鼻腔に１０μＬずつマイクロピペットで投与した。
　（実験）治療効果の評価方法
　ｓｉＲＮＡ溶液は、２８日目、３１日目、３４日目の３回、左右の鼻腔に投与した。なお、未処置コントロール群では遺伝子工学用水を投与した。２８日目においては採血後、３１日目、３４日目においては、ＯＶＡ投与５時間前にｓｉＲＮＡ溶液を投与した。評価項目は、経時的な臨床スコアである鼻掻き回数とくしゃみの回数とした。透明なケージにマウスを入れＯＶＡ経鼻曝露後、５分間の鼻を掻く回数、くしゃみの回数を計測した。
　（結果）
　図６より、くしゃみの回数、鼻掻き回数はｓｉＲｅｌＡを投与することで未処置コントロール群に比べて有意に改善した。また、ＳＴＲ－ＣＨ２Ｒ４Ｈ２Ｃと併用することで、その効果を増強させることに成功した。また、ＲｅｌＡを抑制しないｓｉＭｏｃｋ投与によっては両症状の抑制効果はみられなかったが、ｎａｋｅｄ　ｓｉＲｅｌＡおよびＴａｔ／ｓｉＲｅｌＡでは顕著な抑制が得られた。鼻粘膜は面積が広く、マクロファージなどのリンパ系の発達した粘膜であるところから、高い細胞内取り込みによる鼻炎症状の軽減が両製剤でも見られたものと考えられる。しかし、７日間の両症状の検討においてはＳＴＲ－ＣＨ２Ｒ４Ｈ２Ｃを添加した場合に有意な高い抑制を示していた。
　実施例８
　ＡＴ１００２の併用によるｓｉＲｅｌＡのアトピーモデルマウス耳での透過性試験
　（実験）アトピーモデルマウスの作製方法
　（１）抗原感作：体積比４／１（エタノール／アセトン）を溶媒とした５％塩化ピクリル溶液を感作用溶液とした。実験開始日に、ＮＣ／Ｎｇａマウスをネンブタール注射液の腹腔内投与により麻酔した後、胸・腹部を除毛し、調製した感作用溶液１５０μＬを胸・腹・フットパットに塗布した。
　（２）１重量％塩化ピクリル／食用オリーブ油溶液を調製し、暴露用溶液とした。
　実験開始日から４日目以降１週間ごとに、ＮＣ／Ｎｇａマウスの左耳の表裏に暴露用溶液を２０μＬ塗布した。
　（実験）蛍光標識ｓｉＲＮＡのアトピーモデルマウスでの耳介皮膚透過性評価
　アトピーモデルマウスに、ＰＢＳのみ、蛍光標識ｓｉＲＮＡ単独、蛍光標識ｓｉＲＮＡ／Ｔａｔ複合体とＡＴ１００２の混合溶液２０μＬ（FAM-siRNA：５μｇ、Ｔａｔ誘導体：３２μｇ、ＡＴ１００２：４００μｇ）を、それぞれ麻酔下左耳介の表裏にピペットチップの腹を使い塗布した。さらに１５分後２０μＬのオリーブ油を塗布した。１０時間後、耳を摘出し、凍結切片を作製後、共焦点レーザー顕微鏡を用いて、耳介皮膚組織に透過した蛍光標識ｓｉＲＮＡを観察した。
　（結果）
　図７より、ｓｉＲＮＡ単独投与群では、蛍光は表皮のみに観察された。一方ＡＴ１００２およびＴａｔを用いた場合は、表皮にさらに強い傾向が見られ、さらに真皮においても明らかな蛍光が観察された。よって親水性高分子であるｓｉＲＮＡは、ＡＴ１００２や細胞透過性ペプチドを用いることで高い皮膚透過性を示すことが明らかとなった。
　実施例９
　ＡＴ１００２の併用によるｓｉＲｅｌＡのアトピーモデルマウスにおける治療試験
　（実験）
　実施例８と同じ操作によってアトピーモデルを作製した。ｓｉＲＮＡの投与は、実験開始から１１日目以降１週間に３回計６回ｓｉＲｅｌＡ溶液を投与した。評価項目は、耳介厚の測定、臨床スコア（発赤、出血、肥厚、変形、乾燥の５項目を評価、各項目で症状が見られた場合を１点とし、その総計）を測定した。
　（結果）
　図８より、未治療群では、実験開始から１１日目以降、耳の肥厚、臨床スコアが著しく増大し、症状の急激な悪化が認められ、２５日目付近では、耳介は瘡蓋に覆われ、厚さ１ｍｍ以上に達した。一方ｓｉＲｅｌＡ投与群では、耳の肥厚、臨床スコアの増大は著しく抑制され、特に、ＴａｔとＡＴ１００２群において臨床スコアの有意な改善が認められた。よって、本発明の複合体にＡＴ１００２を併用することで抗アレルギー効果が増大できる。本実験においてもこれらの症状の抑制はｎａｋｅｄ　ｓｉＲｅｌＡでも強く効果が得られた。これはアトピーモデルマウスの耳介における角質層の顕著な乱れが見られ角質バリアの低減によるベクターとの差が少なくなかったものと思われる。しかし、塩化ピクリル感作から２５日目の耳介中の炎症性サイトカインＴＮＦ－α、ＩＬ－４の濃度、血中ＩｇＥの濃度においてはＴａｔ／ＡＴ１００２群では顕著で有意な低下が確認できており人におけるアトピー（それほど表皮の変化がない症例）での効果の発現にはこれらの機能性ペプチドの効果が必要であると思われる。
　本発明は、皮膚や粘膜での様々な疾患、特に、アレルギー性疾患（アレルギー性鼻炎、花粉症、気管支喘息など）および感染症疾患の治療及び予防に有用である。また、高級脂肪酸で修飾した細胞透過性ペプチドを含む本発明の送達システムは、炎症性疾患（関節リュウマチなど）及びアレルギー疾患（アトピー性皮膚炎、乾癬、アレルギー性鼻炎、花粉症、気管支喘息などを含む）などの疾患の治療及び／又は予防にも有効である。

Claims (25)

  1. 　（ａ）抗アレルギー活性又は抗微生物活性を有する短鎖オリゴ核酸と、（ｂ）細胞透過性ペプチドとを含むオリゴ核酸組成物。
  2. 　短鎖オリゴ核酸が、ｓｉＲＮＡ、リボザイム、デコイ核酸、アプタマー、アンチセンス、及びｍｉＲＮＡから選択された少なくとも１種である請求項１記載のオリゴ核酸組成物。
  3. 　短鎖オリゴ核酸が、一本鎖又は二本鎖構造を有し、５～８５塩基の長さを有する短鎖リボ核酸である請求項１又は２記載のオリゴ核酸組成物。
  4. 　短鎖オリゴ核酸が、１０～３０塩基の長さを有する短鎖リボ核酸である請求項１～３のいずれかに記載のオリゴ核酸組成物。
  5. 　短鎖オリゴ核酸が、転写因子ＮＦ－κＢの発現を抑制可能なオリゴ核酸である請求項１～４のいずれかに記載のオリゴ核酸組成物。
  6. 　短鎖オリゴ核酸が、ＮＦ－κＢ１、ＮＦ－κＢ２、ＲｅｌＡ、ＲｅｌＢ及びｃ－Ｒｅｌから選択された少なくとも一種のＮＦ－κＢサブユニットの発現を抑制可能なオリゴ核酸である請求項１～５のいずれかに記載のオリゴ核酸組成物。
  7. 　短鎖オリゴ核酸が、ＲｅｌＡの発現を抑制可能なオリゴ核酸である請求項１～６のいずれかに記載のオリゴ核酸組成物。
  8. 　細胞透過性ペプチドが、アルギニン２～１２残基、ヒスチジン１～８残基、及びシステイン１～４残基からなる請求項１～７のいずれかに記載のオリゴ核酸組成物。
  9. 　細胞透過性ペプチドが、アルギニン２～６残基、ヒスチジン１～４残基、システイン１～３残基からなる請求項１～８のいずれかに記載のオリゴ核酸組成物。
  10. 　細胞透過性ペプチドが、Ｔａｔペプチド（４８-５７）又はその修飾体である請求項１～９のいずれかに記載のオリゴ核酸組成物。
  11. 　細胞透過性ペプチドが、配列番号６のアミノ酸配列を含有するペプチドである請求項１～１０のいずれかに記載のオリゴ核酸組成物。
  12. 　細胞透過性ペプチドが、飽和又は不飽和Ｃ８－２４高級脂肪酸で修飾されている請求項１～１１のいずれかに記載のオリゴ核酸組成物。
  13. 　細胞透過性ペプチドが、ジスルフィド結合を有している請求項１～１２のいずれかに記載のオリゴ核酸組成物。
  14. 　さらに、（ｃ）タイトジャンクション開口ペプチドを含む請求項１～１３のいずれかに記載のオリゴ核酸組成物。
  15. 　タイトジャンクション開口ペプチドとして、ＡＴ１００２を含む請求項１～１４のいずれかに記載のオリゴ核酸組成物。
  16. 　（ａ）ＮＦ－κＢのＲｅｌＡの発現を特異的に抑制するオリゴ核酸と、（ｂ）アルギニン、ヒスチジン及びシステインで構成され、かつアミノ基が飽和又は不飽和Ｃ１２－２０高級脂肪酸で修飾されていてもよい細胞透過性ペプチドと、（ｃ）粘膜透過性を高めるためのタイトジャンクション開口ペプチドとを含み、（ｂ）細胞透過性ペプチドがジスルフィド結合を有している請求項１～１５のいずれかに記載のオリゴ核酸組成物。
  17. 　ヒトを含む哺乳動物の皮膚及び／又は粘膜に投与可能である請求項１～１６のいずれかに記載のオリゴ核酸組成物。
  18. 　請求項１～１６のいずれかに記載のオリゴ核酸組成物と、薬学的に許容可能な担体とを含む医薬組成物。
  19. 　アレルギー性疾患又は炎症性疾患を治療及び／又は予防するための医薬組成物であって、（ａ）抗アレルギー活性を有する短鎖オリゴ核酸と、（ｂ）アミノ基が飽和又は不飽和高級脂肪酸で修飾された細胞透過性ペプチドとを含む医薬組成物。
  20. 　皮膚又は粘膜に適用される製剤であって、請求項１～１６のいずれかに記載のオリゴ核酸組成物と、薬学的に許容可能な担体とを含む製剤。
  21. 　液剤、半固形製剤又は噴霧剤の形態である請求項２０記載の製剤。
  22. 　（ａ）抗アレルギー活性を有する短鎖オリゴ核酸と、（ｂ）細胞透過性ペプチドとを含む抗アレルギー剤。
  23. 　さらに、（ｃ）粘膜透過性を高めるためのタイトジャンクション開口ペプチドを含む請求項２２記載の抗アレルギー剤。
  24. 　（ａ）ＮＦ－κＢのＲｅｌＡの発現を特異的に抑制するオリゴ核酸と、（ｂ）アルギニン、ヒスチジン及びシステインで構成され、アミノ基が飽和又は不飽和Ｃ１２－２０高級脂肪酸で修飾されていてもよい細胞透過性ペプチドとを含む請求項２２又は２３記載の抗アレルギー剤。
  25. 　アレルギー性鼻炎、花粉症、及び気管支喘息から選択されたアレルギー性疾患に適用される請求項２２～２４のいずれかに記載の抗アレルギー剤。
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