CN109311919A

CN109311919A - 用于肌肉萎缩症的外显子跳跃寡聚体

Info

Publication number: CN109311919A
Application number: CN201780038876.7A
Authority: CN
Inventors: D.E.弗兰克; R.K.贝斯特维克
Original assignee: SA Leputa Medical Co
Current assignee: SA Leputa Medical Co; Sarepta Therapeutics Inc
Priority date: 2016-06-30
Filing date: 2017-06-29
Publication date: 2019-02-05
Also published as: AU2017290231A1; TW201811807A; BR112019000006A2; KR20190024977A; CA3025575A1; MX2018016052A; EP3478697A1; US20190262375A1; IL263892A; SG11201810143PA; US20210187003A1; WO2018005805A1; JP2019525742A; CO2018014029A2; MA45618A

Abstract

描述了与人抗肌肉萎缩蛋白基因中选定的靶位点互补以诱导外显子45跳跃的反义寡聚体。

Description

用于肌肉萎缩症的外显子跳跃寡聚体

相关申请

本专利申请要求于2016年6月30日提交的美国临时专利申请序列号62/356,923和2016年6月30日提交的美国临时专利申请序列号62/357,072的权益。上面引用的临时专利申请的全部内容通过引用并入本文。

序列表

本申请包含序列表，该序列表已经以ASCII格式电子提交，并且其全部内容通过引用并入本文。在2017年6月27日创建的所述ASCII副本被命名为AVN-025PC_SL.txt，大小为2,597字节。

技术领域

本公开涉及适用于人抗肌萎缩蛋白基因的外显子45跳跃的新型反义寡聚体及其药物组合物。本公开还提供了使用该新型反义寡聚体诱导外显子45跳跃的方法，在具有适合于外显子45跳跃的抗肌萎缩蛋白基因突变的受试者中产生抗肌萎缩蛋白的方法，以及治疗具有适合外显子45跳跃的抗肌萎缩蛋白基因突变的受试者的方法。

背景技术

正在开发反义技术，使用一系列化学物质来影响各种不同水平的基因表达(转录，剪接，稳定性，翻译)。大部分研究都集中在使用反义化合物来纠正或补偿各种适应症中的异常或疾病相关基因。反义分子能够以特异性抑制基因表达，因此，许多关于寡聚体作为基因表达调节剂的研究工作集中于抑制靶基因的表达或顺式作用元件的功能。反义寡聚体通常针对RNA，或有义链(例如mRNA)，或在一些病毒RNA靶标的情况下为负链。为了实现特定基因下调的期望效果，寡聚体通常促进靶mRNA的衰变，阻断mRNA的翻译或阻断顺式作用RNA元件的功能，从而有效地防止靶蛋白的从头合成或病毒RNA的复制。

然而，当目的是上调天然蛋白质的产生或补偿诱导翻译过早终止的突变(例如无义或移码突变)时，这些技术是无用的。在这些情况下，缺陷基因转录物不应进行靶向降解或空间抑制，因此反义寡聚体化学不应促进靶mRNA衰变或阻断翻译。

在各种遗传疾病中，突变对基因最终表达的影响可以通过在剪接过程中靶向外显子跳跃的过程来调节。剪接过程由复杂的多组分机制引导，其使前mRNA中的相邻外显子-内含子连接点紧密接近，并在内含子的末端进行磷酸二酯键的切割，随后在待拼接在一起的外显子之间进行重组。这种复杂且高度精确的过程由前mRNA中的序列基序介导，所述序列基序是相对较短的半保守RNA区段，其随后参与剪接反应的各种核剪接因子结合。通过改变剪接机器读取或识别前mRNA加工中涉及的基序的方式，可以产生差异剪接的mRNA分子。现在已经认识到，在正常基因表达期间，大多数人类基因是可变剪接的，尽管尚未鉴定出所涉及的机制。Bennett等人(美国专利号6,210,892)描述了使用不诱导RNA酶H介导的靶RNA切割的反义寡聚体类似物对野生型细胞mRNA加工的反义调节。这可用于产生缺少特异性外显子的可变剪接mRNA(例如，如(Sazani，Kole等人，2007)所述，用于产生缺乏编码跨膜结构域的外显子的可溶性TNF超家族受体。

如果正常功能蛋白由于其中的突变而过早终止，通过反义技术恢复某些功能性蛋白质生产的方法已被证明可以通过在剪接过程中进行干预，并且如果与引起疾病的突变有关的外显子可以从某些基因中特异性地删除，有时可以产生缩短的蛋白质产物，其具有与天然蛋白质相似的生物学特性或具有足够的生物活性以改善由与外显子相关的突变引起的疾病(参见例如Sierakowska，Sambade等人1996；Wilton，Lloyd等人，1999；vanDeutekom，Bremmer-Bout等人，2001；Lu，Mann等人，2003；Aartsma-Rus，Janson等人，2004)。Kole等人(美国专利号5,627,274；5,916,808；5,976,879和5,665,593)公开了使用不促进靶向前mRNA的衰变的修饰的反义寡聚体类似物来对抗异常剪接的方法。Bennett等人(美国专利号6,210,892)描述了野生型细胞mRNA加工的反义调节，其也使用不诱导RNA酶H介导的靶RNA切割的反义寡聚体类似物。

靶向外显子跳跃的过程可能在其中存在许多外显子和内含子、其中外显子的遗传构成存在冗余或者其中蛋白质能够在没有一个或多个特定外显子的情况下起作用的长基因中特别有用。为了治疗与各种基因突变引起的截短相关的遗传疾病，重新定向基因加工的努力集中在使用反义寡聚体，其中：(1)与剪接过程中涉及的元件完全或部分重叠；或者(2)在足够接近该元件的位置与前mRNA结合，以破坏通常介导在该元件处发生的特定剪接反应的剪接因子的结合和功能。

Duchenne肌肉萎缩症(DMD)由蛋白质抗肌萎缩蛋白的表达缺陷引起。编码该蛋白质的基因含有79个外显子，分布在超过200万个DNA核苷酸上。改变外显子的阅读框架、或引入终止密码子、或特征在于删除整个框外外显子或外显子或者重复一个或多个外显子的任何外显子突变有可能破坏功能性抗肌萎缩蛋白的产生，导致DMD。

Becker肌肉萎缩症(BMD)是一种不太严重的肌肉萎缩症，它已被发现其中突变通常是一个或多个外显子的缺失，导致沿整个抗肌肉萎缩蛋白转录的正确阅读框架，从而将mRNA翻译为蛋白质不会过早终止。如果在突变的抗肌肉萎缩蛋白前mRNA的加工中上游和下游外显子的连接保持基因的正确阅读框架，则结果是编码具有短内部缺失的蛋白质的mRNA，其保留一些活性，导致Becker表型。

多年来，已知不改变抗肌肉萎缩蛋白的阅读框架的一个或多个外显子的缺失将产生BMD表型，而引起移码的外显子缺失将产生DMD(Monaco，Bertelson等，1988)。通常，抗肌肉萎缩蛋白突变包括点突变和外显子缺失，其改变阅读框架并因此中断正确的蛋白质翻译导致DMD。还应注意，一些BMD和DMD患者具有覆盖多个外显子的外显子缺失。

已经在体外和体内报道了用反义寡核糖核苷酸调节突变型抗肌肉萎缩蛋白前mRNA剪接(参见例如Matsuo，Masumura等人1991；Takeshima，Nishio等人1995；Pramono，Takeshima等人1996；Dunckley，Eperon等人1997；Dunckley，Manoharan等人1998；Wilton，Lloyd等人1999；Mann，Honeyman等人2002；Errington，Mann等人2003)。

反义寡聚体已被专门设计用于靶向前mRNA的特定区域，通常是外显子，以诱导DMD基因突变的跳跃，从而框内恢复这些框外突变，从而使内部缩短但功能性的抗肌肉萎缩蛋白产生。已知这种反义寡聚体靶向完全在外显子(所谓的外显子内部序列)内或在剪接供体或剪接受体连接处，其从外显子穿过进入内含子的一部分。

这种用于DMD的反义寡聚体的发现和开发已成为先前研究的领域。这些发展包括以下那些：(1)西澳大利亚大学和Sarepta Therapeutics(本申请的受让人)：WO 2006/000057；WO 2010/048586；WO 2011/057350；WO 2014/100714；WO2014/153240；WO 2014/153220；(2)Academisch Ziekenhuis Leiden/Prosensa Technologies(现为BioMarinPharmaceutical)：WO 02/24906；WO 2004/083432；WO 2004/083446；WO 2006/112705；WO2007/133105；WO 2009/139630；WO2009/054725；WO 2010/050801；WO 2010/050802；WO2010/123369；WO2013/112053；WO 2014/007620；(3)Carolinas Medical Center：WO 2012/109296；(4)Royal Holloway：要求美国序列号61/096,073和61/164,978的权益并包括其的专利和申请；(4)JCR Pharmaceuticals和Matsuo：US 6,653,466；要求JP2000-125448的权益并包括其的专利和申请，例如US 6,653,467；要求JP2000-256547的权益并包括其的专利和申请，例如US 6,727,355；WO2004/048570；(5)Nippon Shinyaku：WO2012/029986；WO2013/100190；WO2015/137409；WO 2015/194520；(6)伯尔尼大学/皮埃尔和玛丽居里大学//University of la Recherche Scientifique/Synthena AG：WO2010/115993；WO 2013/053928。

尽管取得了这些成功，仍然需要改进靶向外显子45的反义寡聚体和相应的药物组合物，其可能用于产生抗肌肉萎缩蛋白和治疗DMD的治疗方法。

发明内容

在一个方面，本公开提供了长度为22-30个亚基的反义寡聚体，其能够结合选定的靶标以诱导人抗肌肉萎缩蛋白基因中的外显子跳跃，其中反义寡聚体包含与选自由H45A(-06+20)、H45A(-03+19)、H45A(-09+16)、H45A(-09+19)和H45A(-12+16)组成的组中的外显子45靶区域互补的碱基序列，其中寡聚体的碱基与吗啉代环结构相连，并且其中吗啉代环结构通过含磷的亚基间键连接而将一个环结构的吗啉代氮连接到相邻环结构的5'环外碳上。在一个实施方式中，反义寡聚体包含命名为SEQ ID NO：1-5的碱基序列。在另一个实施方式中，反义寡聚体的长度为约22至28个亚基或长度为约22至24个亚基。

在另一方面，本公开提供了式(I)的反义寡聚体：

或其药学上可接受的盐，其中：

每个Nu是一个核碱基，它们一起形成靶向序列；

Z是20至26的整数；

T是选自以下的部分：

其中R³是C₁-C₆烷基；并且

R²选自H，乙酰基，三苯甲基和4-甲氧基三苯甲基，

其中靶向序列与选自由H45A(-06+20)、H45A(-03+19)、H45A(-09+16)、H45A(-09+19)和H45A(-12+16)组成的组中的外显子45靶区域互补。

在一些实施方式中，包括例如式(I)的反义寡聚体的实施方式，靶向外显子45的示例性反义寡聚体包括具有以下鉴定的靶向序列的那些：

a)H45A(-06+20)SEQ ID NO：1(5'-CCAATGCCATCCTGGAGTTCCTGTA A-3')，其中Z是24；

b)H45A(-03+19)SEQ ID NO：2(5'-CAATGCCATCCTGGAGTTCCTG-3')，其中Z是20；

c)H45A(-09+16)SEQ ID NO：3(5'-TGCCATCCTGGAGTTCCTGTAAGAT-3')，其中Z是23；

d)H45A(-09+19)SEQ ID NO：4(5'-CAATGCCATCCTGGAGTTCCTGTAA GAT-3')，其中Z是26；以及

e)H45A(-12+16)SEQ ID NO：5(5'-TGCCATCCTGGAGTTCCTGTAAGAT ACC-3')，其中Z是26。

在某些实施方式中，尿嘧啶碱基可以取代胸腺嘧啶碱基。

在某些实施方式中，T是在一些实施方式中，R²是H。在一些实施方式中，Z是24。在一些实施方式中，Z是20。在一些实施方式中，Z是23。在一些实施方式中，Z是26。

在进一步的实施方式中，T是R²是H，并且Z是24。在一些实施方式中，T是R²是H，并且Z是20。在其它实施方式中，T是R²是H，并且Z是23。在实施方式中，T是R²是H，并且Z是26。

在一些实施方式中，包括例如式(I)的反义寡聚体的实施方式，T是靶向序列是SEQ ID NO：1(5'-CCAATGCCATCCTGGAGTTCCTGTAA-3')并且Z是24。在其它实施方式中，T是靶向序列是SEQ ID NO：2(5'-CAATGCCATCCTGGAGTTCCTG-3')并且Z是20。在其它实施方式中，T是靶向序列是SEQ ID NO：3(5'-TGCCATCCTGGAGTTCCTGTAAGAT-3')并且Z是23。在一些实施方式中，T是靶向序列是SEQ ID NO：4(5'-CAATGCCATCCTGGAGTTCCTGTAAGAT-3')并且Z是26。在其它实施方式中，T是靶向序列是SEQ ID NO：5(5'-TGCCATCCTGGAGTTCCTGTAAGATACC-3')并且Z是26。

在另一方面，本公开提供了一种反义寡聚体或其药学上可接受的盐，其选自由以下组成的组：

其中从1至26的每个Nu和5'至3'是：

和

其中从1至22的每个Nu和5'至3'是：

和

其中从1至25的每个Nu和5'至3'是：

和

其中从1至28的每个Nu和5'至3'是：

和

其中从1至28的每个Nu和5'至3'是：

其中，对于化合物1至5的每一个，A是C是G是并且T是

在一些实施方式中，T是

在一个实施方式中，本公开提供了反义寡聚体SRP-4045(casimersen)的结构：

为清楚起见，本公开的结构(包括例如上述的casimersen结构)从5'至3'是连续的，并且为了便于以紧凑的形式描绘整个结构，已包括标有“BREAKA”和“BREAK B”的各种图示中断。如本领域技术人员所理解的，例如，“BREAK A”的每个指示示出了在这些点处的结构图示的继续。本领域技术人员理解，对于上述结构中的“BREAK B”的每个实例也是如此。然而，没有任何图示中断旨在表明且技术人员也不会理解为它们意味着上述结构的实际中止。

在另一个实施方式中，本公开涉及长度为22至30个亚基的反义寡聚体，包括与指定为退火位点的抗肌肉萎缩蛋白基因的选自由H45A(-06+20)，H45A(-03+19)，H45A(-09+16)，H45A(-09+19)和H45A(-12+16)组成的组中的外显子45靶区域互补的至少10，11，12，15，17，20，22，25，26，28或30个连续碱基，其中反义寡聚体与诱导外显子45跳跃的退火位点互补。

在另一方面，本公开涉及长度为22至30个亚基的反义寡聚体，包括选自由SEQ IDNO：1-5组成的组中的序列的至少10，11，12，15，17，20，22，25，26，28或30个连续碱基，其中反义寡聚体与抗肌肉萎缩蛋白基因的外显子45靶区域互补并诱导外显子45跳跃。在一个实施方式中，SEQ ID NO：1-5中的胸腺嘧啶碱基任选地为尿嘧啶。

本公开包括靶向外显子45的示例性反义寡聚体，例如具有以下鉴定的靶向序列的那些。

a)H45A(-06+20)SEQ ID NO：1(5'-CCAATGCCATCCTGGAGTTCCTGTA A-3')；

b)H45A(-03+19)SEQ ID NO：2(5'-CAATGCCATCCTGGAGTTCCTG-3')；

c)H45A(-09+16)SEQ ID NO：3(5'-TGCCATCCTGGAGTTCCTGTAAGAT-3')；

d)H45A(-09+19)SEQ ID NO：4(5'-CAATGCCATCCTGGAGTTCCTGTAA GAT-3')

e)H45A(-12+16)SEQ ID NO：5(5'-TGCCATCCTGGAGTTCCTGTAAGAT ACC-3')。

在一个实施方式中，反义寡聚体与退火位点H45A(-06+20)互补，例如SEQ ID NO：1。在另一个实施方式中，反义寡聚体与退火位点H45A(-03+19)互补，例如SEQ ID NO：2。在另一个实施方式中，反义寡聚体与退火位点H45A(-09+16)互补，例如SEQ ID NO：3。在另一个实施方式中，反义寡聚体与退火位点H45A(-09+19)互补，例如SEQ ID NO：4。在另一个实施方式中，反义寡聚体与退火位点H45A(-12+16)互补，例如SEQ ID NO：5。

在另一方面，本公开提供了药物组合物，其包含上述反义寡聚体和药学上可接受的载体。在一些实施方式中，本公开提供了药物组合物，其包含上述反义寡聚体，以及包含磷酸盐缓冲液的盐溶液。

在另一方面，本公开提供了治疗患有遗传性疾病的患者的方法，其中编码特定蛋白质的基因存在突变，并且通过外显子跳跃可以消除突变的影响，包括以下步骤：(a)根据本文所述的方法选择反义分子；以及(b)将该分子施用于需要这种治疗的患者。本公开还涉及本公开的纯化和反义寡聚体在制备用于治疗遗传疾病的药物中的用途。

在另一方面，本公开提供了治疗以肌肉萎缩症为特征的病症的方法，例如杜氏肌肉萎缩症(DMD)或贝克型肌肉萎缩症，其包括向患者施用有效量的本公开的适当设计的反义寡聚体，其与该患者的特定遗传病变相关。此外，本公开提供了通过向患者施用有效量的反义寡聚体或包含一种或多种这些生物分子的药物组合物来预防性地治疗患者以预防或最小化肌肉萎缩症的方法，例如杜氏肌肉萎缩症或贝克型肌肉萎缩症。

在一些实施方式中，本公开提供了在有需要的受试者中治疗杜氏肌肉萎缩症(DMD)的方法，其中受试者具有适合于外显子45跳跃的抗肌肉萎缩蛋白基因突变，该方法包括向受试者施用本公开的反义寡聚体。

在另一方面，本公开提供了在受试者中产生抗肌肉萎缩蛋白的方法，受试者具有适合于外显子45跳跃的抗肌肉萎缩蛋白基因突变，该方法包括向受试者施用本公开的反义寡聚体。

在另一方面，本公开还提供了用于治疗遗传疾病的试剂盒，该试剂盒包含至少一种本公开的反义寡聚体，包装在合适的容器中以及其使用说明书。

当结合附图阅读本公开的以下详细描述时，将更全面地理解这些和其它目的和特征。

附图说明

图1描绘了正常抗肌肉萎缩蛋白前mRNA的一部分。

图2描绘了异常抗肌肉萎缩蛋白前mRNA的一部分(DMD的实例)。

图3描绘了eteplirsen，设计用于跳跃外显子51，恢复前mRNA的“框内”读数。

具体实施方式

本公开的实施方式一般涉及改进的反义化合物及其使用方法，其特别设计用于诱导人抗肌肉萎缩基因中的外显子跳跃。抗肌肉萎缩蛋白在肌肉功能中起重要作用，并且各种肌肉相关疾病的特征在于该基因的突变形式。因此，在某些实施方式中，本文所述的改进的反义化合物以人抗肌肉萎缩蛋白基因的突变形式诱导外显子跳跃，例如在杜氏肌肉萎缩症(DMD)和贝克型肌肉萎缩症(BMD)中发现的突变的抗肌肉萎缩蛋白基因。

由于突变引起的异常mRNA剪接事件，这些突变的人抗肌肉萎缩蛋白基因表达缺陷型抗肌肉萎缩蛋白或者根本不表达可测量的抗肌肉萎缩蛋白，这种情况导致各种形式的肌肉萎缩症。为了弥补这种情况，本公开的反义化合物与突变的人抗肌肉萎缩蛋白基因的预处理RNA的选定区域杂交，诱导外显子跳跃和差异剪接，否则异常剪接的抗肌肉萎缩蛋白mRNA，从而允许肌细胞产生编码功能性抗肌肉萎缩蛋白的mRNA转录物。在某些实施方式中，所得的抗肌肉萎缩蛋白不一定是抗肌肉萎缩蛋白的“野生型”形式，而是抗肌肉萎缩蛋白的截短但功能性或半功能性形式。

通过增加肌肉细胞中功能性抗肌肉萎缩蛋白的水平，这些和相关的实施方式可用于预防和治疗肌肉萎缩症，尤其是以肌肉萎缩症例如DMD和BMD存在的那些形式，其特征在于由于mRNA的剪接异常使缺陷型抗肌肉萎缩蛋白表达。本文所述的特定寡聚体进一步提供了比使用中的其它寡聚体更好的抗肌肉萎缩蛋白-外显子特异性靶向，从而提供了优于治疗相关形式的肌肉萎缩的替代方法的显著和实用的优点。

因此，本公开涉及长度为22至30个亚基的反义寡聚体，其能够结合选定的靶标以诱导人抗肌肉萎缩蛋白基因中的外显子跳跃，其中反义寡聚体包含与选自由H45A(-06+20)、H45A(-03+19)、H45A(-09+16)、H45A(-09+19)和H45A(-12+16)组成的组中的外显子45靶区域互补的碱基序列，其中寡聚体的碱基与吗啉代环结构相连，并且其中吗啉代环结构通过含磷的亚基间键连接而将一个环结构的吗啉代氮连接到相邻环结构的5'环外碳上。在一个实施方式中，反义寡聚体包含称为SEQ ID NO：1-5的碱基序列。

本公开还涉及长度为22至30个亚基且包含至少10，12，15，17，20或更多个与指定为退火位点的抗肌肉萎缩蛋白基因的选自由H45A(-06+20)、H45A(-03+19)、H45A(-09+16)、H45A(-09+19)和H45A(-12+16)组成的组中的外显子45靶区域互补的连续碱基的反义寡聚体。

本公开的其它反义寡聚体的长度为22至30个亚基，并且包括SEQ ID NO：1-5的至少10，12，15，17，20或更多个连续碱基。在一些实施方式中，SEQ ID NO：1-5中的胸腺嘧啶碱基任选地是尿嘧啶。

本公开的示例性反义寡聚体如下所示：

a)H45A(-06+20)SEQ ID NO：1(5'-CCAATGCCATCCTGGAGTTCCTGTA A-3')；

b)H45A(-03+19)SEQ ID NO：2(5'-CAATGCCATCCTGGAGTTCCTG-3')；

c)H45A(-09+16)SEQ ID NO：3(5'-TGCCATCCTGGAGTTCCTGTAAGAT-3')；

d)H45A(-09+19)SEQ ID NO：4(5'-CAATGCCATCCTGGAGTTCCTGTAA GAT-3')；

e)H45A(-12+16)SEQ ID NO：5(5'-TGCCATCCTGGAGTTCCTGTAAGAT ACC-3')。

除非另外定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本公开所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。尽管与本文描述的那些类似或等同的任何方法和材料可用于本公开的实践或测试，但描述了优选的方法和材料。出于本公开的目的，以下术语定义如下。

I.定义

“约”是指数量，水平，数值，数字，频率，百分比，尺寸，大小，量，重量或长度变化多达参考数量，水平，数值，数字，频率，百分比，尺寸，大小，量，重量或长度的30，25，20，15，10，9，8，7，6，5，4，3，2或1％。

如本文所用，关于受试者或患者的“适合于外显子45跳跃”旨在包括在抗肌肉萎缩蛋白基因中具有一个或多个突变的受试者和患者，其中没有抗肌肉萎缩蛋白基因的外显子45跳跃，导致阅读框架超出框架，从而破坏前mRNA的翻译，导致受试者或患者不能产生抗肌肉萎缩蛋白。抗肌肉萎缩蛋白基因的下列外显子中的突变的非限制性实例适合于外显子45跳跃，包括例如缺失以下外显子：外显子7-44，外显子12-44，外显子18-44，外显子44，外显子46，外显子46-47，外显子46-48，外显子46-49，外显子46-51，外显子46-53，外显子46-55，外显子46-57，外显子46-59，外显子46-60，外显子46-67，外显子46-69，外显子46-75，或外显子46-78。确定患者是否具有适合于外显子跳跃的抗肌肉萎缩蛋白基因突变完全在本领域技术人员的能力范围内(参见例如Aartsma-Rus等人(2009)Hum Mutat.30:293-299，Gurvich等人，Hum Mutat.2009；30(4)633-640，和Fletcher等人(2010)Molecular Therapy18(6)1218-1223.)。

术语“反义寡聚体”和“寡聚体”可互换使用，是指通过亚基间连接而连接的环状亚基序列，每个环状亚基由以下组成：(i)核糖或其衍生物；和(ii)与其结合的碱基配对部分，使得碱基配对部分的顺序通过Watson-Crick碱基配对形成与核酸(通常为RNA)中的靶序列互补的碱基序列，以形成核酸：靶序列内的寡聚体异源双链体。在某些实施方式中，寡聚体是PMO。在其它实施方式中，反义寡聚体是2'-O-甲基硫代磷酸酯。在其它实施方式中，本公开的反义寡聚体是肽核酸(PNA)，锁核酸(LNA)或桥接核酸(BNA)，例如2'-O，4'-C-乙烯桥接核酸(ENA)。以下描述另外的示例性实施方式。

先前以其代号“SPR-4045”已知的“Casimersen”是具有碱基序列5'-CAATGCCATCCTGGAGTTCCTG-3'(SEQ ID NO：2)的PMO。Casimersen在CAS登记号1422959-91-8下注册。化学名称包括：所有-P-ambo-[P,2',3'-三脱氧-P-(二甲基氨基)-2',3'-亚氨基-2',3'-开环](2'a→5')(CAATGCCATCCTGGAGTTCCT-G)5'-[4-({2-[2-(2-羟基乙氧基)乙氧基]乙氧基}羰基)-N,N-二甲基哌嗪-1-膦酰胺]。Casimersen具有以下化学结构：

其中从1至22的每个Nu和5'至3'是：

和

序列5'-CAATGCCATCCTGGAGTTCCTG-3'如SEQ ID NO：2所示。

术语“互补”和“互补性”是指通过Watson-Crick碱基配对规则彼此相关的两个或更多个多核苷酸(即核苷酸序列)。例如，序列“T-G-A(5'→3')，”与序列“A-C-T(3'→5')”互补。互补性可以是“部分的”，其中根据碱基配对规则，少于给定靶向多核苷酸的所有核酸碱基与靶多核苷酸匹配。或者，在给定靶向多核苷酸和靶多核苷酸之间可能存在“完全的”或“完美的”(100％)互补性以继续该实例。核酸链之间的互补程度对核酸链之间的杂交效率和强度具有显著影响。

“有效量”或“治疗有效量”是指施用于哺乳动物受试者的治疗性化合物(例如反义寡聚体)的量，作为单剂量或作为一系列剂量的一部分，其有效产生期望的治疗效果。对于反义寡聚体，通常通过抑制所选靶序列的翻译或天然剪接加工来实现这种效果。

对于反义寡聚体，通常通过抑制所选靶序列的翻译或天然剪接加工，或产生临床上有意义量的抗肌肉萎缩蛋白(统计显著性)来实现这种效果。在一些实施方式中，有效量是至少20mg/kg的包含反义寡聚体的组合物，以在一段时间内治疗受试者。在一些实施方式中，有效量是至少20mg/kg的包含反义寡聚体的组合物，以将受试者中抗肌肉萎缩蛋白阳性纤维的量增加至正常的至少20％。在某些实施方式中，有效量是至少20mg/kg的包含反义寡聚体的组合物，以稳定、维持或改善患者相对于健康同伴的20％缺少的步行距离，例如6MWT。在各种实施方式中，有效量为至少20mg/kg至约30mg/kg，约25mg/kg至约30mg/kg，或约30mg/kg至约50mg/kg。在一些实施方式中，有效量为约30mg/kg或约50mg/kg。另一方面，有效量为至少20mg/kg，约25mg/kg，约30mg/kg，或约30mg/kg至约50mg/kg，持续至少24周，至少36周，或至少48周，从而将受试者中抗肌肉萎缩蛋白阳性纤维的量增加至正常的至少20％，约30％，约40％，约50％，约60％，约70％，约80％，约90％，约95％，并稳定或改善患者相对于健康同伴的20％缺少的步行距离，例如6MWT。在一些实施方式中，治疗将患者的抗肌肉萎缩蛋白阳性纤维的量增加至正常的20-60％或30-50％。

“增强”或“增强了”、“增加”或“增加了”或“刺激”或“刺激了”通常是指一种或多种反义化合物或药物组合物与由无反义化合物或对照化合物引起的反应相比，产生或引起细胞或受试者中更大生理反应的能力(即下游效应)。可测量的生理反应可以包括抗肌肉萎缩蛋白的功能形式的表达增加，或肌肉组织中抗肌肉萎缩蛋白相关的生物活性增加，以及从本领域的理解和本文的描述中显而易见的其它反应。还可以测量增加的肌肉功能，包括增加或改善肌肉功能约1％，2％，3％，4％，5％，6％，7％，8％，9％，10％，11％，12％，13％，14％，15％，16％，17％，18％，19％，20％，25％，30％，35％，40％，45％，50％，55％，60％，65％，70％，75％，80％，85％，90％，95％或100％。还可以测量表达功能性抗肌肉萎缩蛋白的肌纤维的百分比，包括增加的抗肌肉萎缩蛋白表达在肌纤维的约1％，2％，％，15％，16％，17％，18％，19％，20％，25％，30％，35％，40％，45％，50％，55％，60％，65％，70％，75％，80％，85％，90％，95％或100％。例如，已经表明，如果25-30％的纤维表达抗肌肉萎缩蛋白，则可以发生约40％的肌肉功能改善(参见例如DelloRusso等人，Proc Natl Acad SciUSA 99：12979-12984，2002)。“增加”或“增强”量通常是“统计上显著”的量，并且可以包括增加由没有反义化合物(不存在药剂)或对照化合物产生的量的1.1，1.2，2，3，4，5，6，7，8，9，10，15，20，30，40，50或更多倍(例如500，1000倍)(包括其间且超过1的所有整数和小数点，例如1.5，1.6，1.7，1.8等)。

如本文所用，术语“功能”和“功能性”等是指生物学、酶学或治疗功能。

“功能性”抗肌肉萎缩蛋白通常指具有足够生物活性的抗肌肉萎缩蛋白，以减少肌肉组织的进行性降解，这是肌肉萎缩症的其它特征，通常与存在于某些患有DMD或BMD的受试者中的抗肌肉萎缩蛋白的改变或“缺陷”形式相比。在某些实施方式中，根据本领域的常规技术测量，功能性抗肌肉萎缩蛋白可具有野生型抗肌肉萎缩蛋白的体外或体内生物活性的约10％，20％，30％，40％，50％，60％，70％，80％，90％或100％(包括其间的所有整数)。作为一个实例，体外肌肉培养物中的抗肌肉萎缩蛋白相关活性可以根据肌管大小，肌原纤维组织(或解体)，收缩活性和乙酰胆碱受体的自发聚集来测量(参见例如Brown等人，Journal ofCell Science.112:209-216，1999)。动物模型也是研究疾病发病机理的宝贵资源，并提供了测试抗肌肉萎缩蛋白相关活性的方法。用于DMD研究的两种最广泛使用的动物模型是mdx小鼠和金毛猎犬肌肉萎缩症(GRMD)狗，两者都是抗肌肉萎缩蛋白阴性的(参见例如Collins&Morgan，Int J Exp Pathol84:165-172，2003)。这些和其它动物模型可用于测量各种抗肌肉萎缩蛋白的功能活性。包括截短形式的抗肌肉萎缩蛋白，例如由本公开的某些外显子跳跃反义化合物产生的那些形式。

术语“错配”或“错配有”是指根据碱基配对规则与靶多核苷酸不匹配的多核苷酸序列中的一个或多个核苷酸(无论是连续的还是分开的)。虽然通常需要完美的互补性，但是一些实施方式可以包括相对于靶RNA的一个或多个但优选为6，5，4，3，2或1个错配。包括寡聚体内任何位置的变化。在某些实施方式中，本公开的反义寡聚体包括内部末端变体附近的序列变异，并且如果存在，通常在5'和/或3'末端的约6，5，4，3，2或1个核苷酸内。

术语“吗啉代”，“吗啉代寡聚体”或“PMO”是指以下一般结构的二氨基磷酸酯吗啉代寡聚体：

并且如Summerton，J.等人，Antisense&Nucleic Acid Drug Development，7:187-195(1997)的图2中所述。如本文所述的吗啉代旨在涵盖前述一般结构的所有立体异构体和构型。吗啉代寡聚体的合成、结构和结合特征详述于美国专利号5,698,685，5,217,866，5,142,047，5,034,506，5,166,315，5,521,063，5,506,337，8,076,476和8,299,206中，所有这些专利均通过引用并入本文。

在某些实施方式中，吗啉代在寡聚体的5'或3'末端与“尾部”部分缀合以增加其稳定性和/或溶解度。示例性尾部包括：

短语“药学上可接受的”是指物质或组合物必须在化学和/或毒理学上与包含制剂的其它成分和/或用其治疗的受试者相容。

本文所用的短语“药学上可接受的载体”是指无毒的惰性固体，半固体或液体填充剂，稀释剂，包封材料或任何类型的制剂助剂。可用作药学上可接受的载体的材料的一些实例是糖，例如乳糖，葡萄糖和蔗糖；淀粉，例如玉米淀粉和马铃薯淀粉；纤维素及其衍生物，例如羧甲基纤维素钠，乙基纤维素和醋酸纤维素；粉末黄蓍草；麦芽；明胶；滑石；辅料，例如可可脂和栓剂蜡；油类，例如花生油，棉籽油，红花油，芝麻油，橄榄油，玉米油和豆油；二醇类，例如丙二醇；酯类，例如油酸乙酯和月桂酸乙酯；琼脂；缓冲剂，例如氢氧化镁和氢氧化铝；海藻酸；无热原水；等渗盐水；林格溶液；乙醇和磷酸盐缓冲溶液，以及其它无毒相容润滑剂，例如十二烷基硫酸钠和硬脂酸镁，以及着色剂，脱模剂，涂层剂，甜味剂，调味剂和芳香剂，防腐剂和抗氧化剂也可以根据配制者的判断存在于组合物中。

抗肌肉萎缩蛋白合成或产生的术语“恢复”通常是指在用本文所述的反义寡聚体处理后肌肉萎缩症患者中抗肌肉萎缩蛋白的产生，包括截短形式的抗肌肉萎缩蛋白。在一些实施方式中，治疗导致患者中新型抗肌肉萎缩蛋白产生增加1％，5％，10％，20％，30％，40％，50％，60％，70％，80％，90％或100％(包括其间的所有整数)。在一些实施方式中，治疗将受试者的抗肌肉萎缩蛋白阳性纤维的量增加至正常的至少20％，约30％，约40％，约50％，约60％，约70％，约80％，约90％或约95％至100％。在其它实施方式中，治疗将受试者的抗肌肉萎缩蛋白阳性纤维的量增加至正常的约20％至约60％，或约30％至约50％。治疗后患者的抗肌肉萎缩蛋白阳性纤维的百分比可以通过使用已知技术的肌肉活组织检查来确定。例如，肌肉活组织检查可以取自合适的肌肉，例如患者的肱二头肌。

阳性抗肌肉萎缩蛋白纤维的百分比的分析可以在治疗前和/或治疗后或在整个治疗过程中的时间点进行。在一些实施方式中，治疗后活组织检查取自治疗前活组织检查的对侧肌肉。可以使用任何合适的抗肌肉萎缩蛋白测定进行治疗前和治疗后抗肌肉萎缩蛋白表达研究。在一些实施方式中，使用作为抗肌肉萎缩蛋白标记物的抗体，例如单克隆或多克隆抗体，对来自肌肉活组织检查的组织切片进行免疫组织化学检测。例如，可以使用MANDYS106抗体，其是抗肌肉萎缩蛋白的高度敏感标记物。可以使用任何合适的二抗。

在一些实施方式中，抗肌肉萎缩蛋白阳性纤维的百分比通过将阳性纤维的量除以计数的总纤维来计算。正常肌肉样本具有100％抗肌肉萎缩蛋白阳性纤维。因此，抗肌肉萎缩蛋白阳性纤维的百分比可表示为正常的百分比。为了控制预处理肌肉和回复纤维中痕量水平的抗肌肉萎缩蛋白的存在，可以使用来自每位患者的治疗前肌肉的部分来设定治疗后肌肉中抗肌肉萎缩蛋白阳性纤维的基线。这可以用作在该患者的治疗后肌肉的切片中计数抗肌肉萎缩蛋白阳性纤维的阈值。在其它实施方式中，抗体染色的组织切片也可以使用Bioquant图像分析软件(Bioquant Image Analysis Corporation，Nashville，TN)用于抗肌肉萎缩蛋白定量。总抗肌肉萎缩蛋白荧光信号强度可以报告为正常的百分比。此外，用单克隆或多克隆抗肌肉萎缩蛋白抗体的Western印迹分析可用于确定抗肌肉萎缩蛋白阳性纤维的百分比。例如，可以使用来自Novacastra的抗肌肉萎缩蛋白抗体NCL-Dys1。抗肌肉萎缩蛋白阳性纤维的百分比也可以通过测定肌聚糖复合物(β，γ)和/或神经元NOS的组分的表达来分析。

在一些实施方式中，用本公开的反义寡聚体进行的治疗减缓或减少了DMD患者的进行性呼吸肌功能障碍和/或失败，其在没有治疗的情况下是预期的。在一些实施方式中，用本公开的反义寡聚体进行的治疗可以减少或消除对未经治疗预期的通气辅助的需要。在一些实施方式中，用于跟踪疾病进程的呼吸功能的测量以及潜在治疗干预的评估包括最大吸气压力(MIP)，最大呼气压力(MEP)和强制肺活量(FVC)。MIP和MEP分别测量人在吸气和呼气期间可产生的压力水平，并且是呼吸肌力量的敏感度量。MIP是膈肌无力的衡量标准。

在一些实施方式中，MEP可在其它肺功能测试(包括MIP和FVC)的变化之前下降。在某些实施方式中，MEP可以是呼吸功能障碍的早期指标。在某些实施方式中，FVC可用于测量在最大吸气之后强制呼气期间排出的空气总体积。在DMD患者中，FVC随着身体发育而增加，直到青少年时期。然而，随着生长缓慢或因疾病进展而停滞不前，肌肉无力进展，肺活量进入下降阶段，并在10至12岁后以每年平均约8％至8.5％的速度下降。在某些实施方式中，预测的MIP百分比(针对体重调整的MIP)，预测的MEP百分比(针对年龄调整的MEP)和预测的FVC百分比(针对年龄和身高调整的FVC)是支持性分析。

如本文所用，“受试者”包括表现出症状或有风险表现症状的任何动物，其可以用本公开的反义化合物治疗，例如具有或有风险具有DMD或BMD的受试者，或与这些病症相关的任何症状(例如肌纤维损失)。合适的受试者(患者)包括实验动物(例如小鼠，大鼠，兔或豚鼠)，农场动物和家畜或宠物(例如猫或狗)。包括非人灵长类动物，优选人类患者。还包括在具有适合于外显子45跳跃的抗肌肉萎缩蛋白基因突变的受试者中产生抗肌肉萎缩蛋白的方法。

受试者(例如哺乳动物，例如人)或细胞的“治疗”是用于试图改变受试者或细胞的自然进程的任何类型的干预。治疗包括但不限于施用寡聚体或其药物组合物，并且可以预防性地或在病理事件开始后或与病原体接触后进行。治疗包括对与抗肌肉萎缩蛋白相关的疾病或病症的症状或病理学的任何期望的作用，如在某些形式的肌肉萎缩症中，并且可包括例如正在治疗的疾病或病症的一种或多种可测量的标志物的最小变化或改善。还包括“预防性”治疗，其可以用于降低所治疗的疾病或病症的进展速率，延迟该疾病或病症的发作，或降低其发病的严重程度。“治疗”或“预防”不一定表示完全根除、治愈或防止疾病或病症或其相关症状。

在一些实施方式中，用本公开的反义寡聚体治疗增加新型抗肌肉萎缩蛋白产生，延缓疾病进展，减缓或减少行走损失，减少肌肉炎症，减少肌肉损伤，改善肌肉功能，减少肺功能损失，和/或增强肌肉再生，这是在没有治疗或预期未经治疗的情况下预期的。在一些实施方式中，治疗维持、延迟或减缓疾病进展。在一些实施方式中，治疗保持行走或减少行走损失。在一些实施方式中，治疗维持肺功能或减少肺功能损失。在一些实施方式中，治疗维持或增加患者的稳定步行距离，通过例如6分钟步行测试(6MWT)测量。在一些实施方式中，治疗维持或减少步行/跑步10米的时间(即10米步行/跑步测试)。在一些实施方式中，治疗维持或减少从仰卧站立的时间(即站立时间测试)。在一些实施方式中，治疗维持或减少爬升四个标准楼梯的时间(即四阶爬升测试)。在一些实施方式中，治疗维持或减少患者的肌肉炎症，通过例如MRI(例如腿部肌肉的MRI)测量。在一些实施方式中，MRI测量T2和/或脂肪分数以鉴定肌肉退化。MRI可以识别由炎症，水肿，肌肉损伤和脂肪浸润引起的肌肉结构和组成的变化。

在一些实施方式中，用本公开的反义寡聚体进行治疗增加新型抗肌肉萎缩蛋白产生，并减缓或减少了未经治疗所预期的行走损失。例如，治疗可以稳定，维持，改善或增加受试者的步行能力(例如行走的稳定)。在一些实施方式中，治疗维持或增加患者的稳定步行距离，例如通过McDonald等人(Muscle Nerve，2010；42：966-74，通过引用并入本文)描述的6分钟步行测试(6MWT)测量。6分钟步行距离(6MWD)的变化可以表示为绝对值，百分比变化或％预测值的变化。在一些实施方式中，治疗维持或改善受试者在6MWT中相对于健康同伴的20％缺少的稳定步行距离。可以通过计算％预测值来确定6MWT中DMD患者相对于健康同伴的典型表现的表现。例如，对于男性，％预测的6MWD可以使用以下等式计算：196.72+(39.81×年龄)-(1.36×年龄²)+(132.28×身高(米))。对于女性，％预测的6MWD可以使用以下等式计算：188.61+(51.50×年龄)-(1.86×年龄²)+(86.10×身高(米))(Henricson等人，PLoS Curr.，2012，版本2，通过引用并入本文)。在一些实施方式中，用反义寡聚体治疗增加患者从基线到大于3，5，6，7，8，9，10，15，20，25，30或50米(包括其间的所有整数)的稳定步行距离。

DMD患者的肌肉功能损失可能发生在正常儿童生长发育的背景下。事实上，尽管进行性肌肉损伤，年龄较大的DMD患儿在6MWT期间可能会在约1年的时间内行走距离增加。在一些实施方式中，将来自患有DMD的患者的6MWD与通常发育的对照受试者和来自年龄和性别匹配的受试者的现有标准化数据进行比较。在一些实施方式中，可以使用适合于标准化数据的基于年龄和身高的方程来解释正常生长和发育。这样的方程可用于将6MWD转换为患有DMD的受试者中的百分比预测(％预测)值。在某些实施方式中，％预测的6MWD数据的分析代表了解释正常生长和发育的方法，并且可以显示在早期(例如小于或等于7岁)的功能增益代表稳定而不是改善患有DMD的患者的能力(Henricson等人，PLoS Curr.，2012，第2版，通过引用并入本文)。

提出并公开了反义分子命名系统以区分不同的反义分子(参见Mann等人，(2002)JGen Med 4,644-654)。当测试几种略微不同的反义分子时，这种命名法变得特别相关，所有反义分子都指向同一目标区域，如下所示：

H#A/D(x:y)。

第一个字母表示物种(例如H：人，M：鼠，C：犬)。“#”表示靶抗肌肉萎缩蛋白外显子数目。“A/D”分别表示外显子开始和结束时的受体或供体剪接位点。(x y)表示退火坐标，其中“-”或“+”分别表示内含子或外显子序列。例如，A(-6+18)表示靶外显子之前的内含子的最后6个碱基和靶外显子的前18个碱基。最接近的剪接位点将是受体，因此这些坐标前面会有“A”。描述供体剪接位点处的退火坐标可以是D(+2-18)，其中最后2个外显子碱基和前18个内含子碱基对应于反义分子的退火位点。完全外显子退火坐标将由A(+65+85)表示，即从该外显子开始的第65和第85个核苷酸之间的位点。

II.反义寡聚体

A.反义寡聚体旨在诱导外显子45跳跃

在某些实施方式中，本公开的反义寡聚体与抗肌萎缩蛋白基因的外显子45靶区域互补并诱导外显子45跳跃。特别地，本公开涉及长度为22至30个亚基的反义寡聚体，包括至少10，12，15，17，20，25或更多个与指定为退火部位的抗肌肉萎缩蛋白基因的外显子45靶区域互补的连续核苷酸，其选自：H45A(-06+20)，H45A(-03+19)，H45A(-09+16)，H45A(-09+19)和H45A(-12+16)。反义寡聚体与退火位点互补，诱导外显子45跳跃。

本公开的反义寡聚体靶向抗肌肉萎缩蛋白前mRNA并诱导外显子45的跳跃，因此将其从成熟的剪接mRNA转录物中排除或跳跃。通过跳跃外显子45，中断的阅读框架恢复为框内突变。虽然DMD由各种遗传亚型组成，但本公开的反义寡聚体被特别设计为跳跃抗肌肉萎缩蛋白前mRNA的外显子45。适合于跳跃外显子45的DMD突变包括与外显子45邻接的外显子的缺失(即包括外显子44或外显子46的缺失)，并且包含DMD患者的亚组(8％)。

诱导外显子45跳跃的PMO的序列被设计为与抗肌肉萎缩蛋白前mRNA的外显子45内的特定靶序列互补。PMO中的每个吗啉代环与核碱基连接，包括例如DNA中发现的核碱基(腺嘌呤，胞嘧啶，鸟嘌呤和胸腺嘧啶)。

B.寡聚体化学特征

本公开的反义寡聚体可以使用多种反义化学。寡聚体化学的实例包括但不限于吗啉代寡聚体，硫代磷酸酯修饰的寡聚体，2'O-甲基修饰的寡聚体，肽核酸(PNA)，锁核酸(LNA)，硫代磷酸酯寡聚体，2'O-MOE修饰的寡聚体，2'-氟修饰的寡聚体，2'O,4'C-乙烯桥连核酸(ENA)，三环-DNA，三环-DNA硫代磷酸酯核苷酸，2'-O-[2-(N-甲基氨基甲酰基)乙基]修饰的寡聚体，包括任何前述物质的组合。可以组合硫代磷酸酯和2'-O-Me-修饰的化学物质以产生2'O-Me-硫代磷酸酯骨架。参见例如PCT公开号WO/2013/112053和WO/2009/008725，其通过引用整体并入本文。以下进一步描述本公开的寡聚体化学的示例性实施方式。

1.肽核酸(PNA)

肽核酸(PNA)是DNA的类似物，其中骨架与脱氧核糖骨架在结构上是同形的，由与嘧啶或嘌呤碱基连接的N-(2-氨基乙基)甘氨酸单元组成。含有天然嘧啶和嘌呤碱基的PNA与遵循Watson-Crick碱基配对规则的互补寡聚体杂交，并且在碱基对识别方面模拟DNA(Egholm，Buchardt等人，1993)。PNA的主链由肽键而不是磷酸二酯键形成，使得它们非常适合反义应用(参见下面的结构)。骨架不带电荷，导致PNA/DNA或PNA/RNA双链体表现出大于正常的热稳定性。PNA不被核酸酶或蛋白酶识别。PNA的非限制性示例如下所示：

尽管天然结构发生了根本性的结构变化，但PNA能够以螺旋形式与DNA或RNA进行序列特异性结合。PNA的特征包括对互补DNA或RNA的高结合亲和力，由单碱基错配引起的去稳定作用，对核酸酶和蛋白酶的抗性，与DNA或RNA的杂交，不依赖于盐浓度和具有同型嘌呤DNA的三链体形成。PANAGENE^TM开发了其专有的Bts PNA单体(Bts；苯并噻唑-2-磺酰基)和专有的寡聚化方法。使用Bts PNA单体的PNA寡聚化由脱保护、偶联和加帽的重复循环组成。PNA可以使用本领域已知的任何技术合成产生。参见例如美国专利号6,969,766，7,211,668，7,022,851，7,125,994，7,145,006和7,179,896。还参见美国专利号5,539,082；5,714,331；和5,719,262用于制备PNA。PNA化合物的进一步教导可以在Nielsen等人，Science，254：1497-1500，1991中找到。前述各自均通过引用整体并入。

2.锁核酸(LNA)

反义寡聚体化合物还可含有“锁核酸”亚基(LNA)。“LNA”是称为桥接核酸(BNA)的一类修饰的成员。BNA的特征在于共价连接，其将核糖环的构象锁定在C30-内(北)糖皱褶中。对于LNA，桥由2'-O和4'-C位置之间的亚甲基组成。LNA增强骨架预组织和碱基堆积以增加杂交和热稳定性。

LNA的结构可以在例如Wengel等人，Chemical Communications(1998)455；Tetrahedron(1998)54：3607，和Chem of Chem.Research(1999)32：301)；Obika等人，Tetrahedron Letters(1997)38：8735；(1998)39：5401，和Bioorganic MedicinalChemistry(2008)16：9230，其通过引用整体并入本文。LNA的非限制性示例如下所示：

本公开的化合物可以包含一种或多种LNA；在某些情况下，化合物可以完全由LNA组成。用于合成单个LNA核苷亚基及其掺入寡聚体的方法描述于，例如美国专利号4,522,517，美国专利号7,572,582，7,569,575，7,084,125，7,060,809，7,053,207，7,034,133，6,794,499和6,670,461，它们各自通过引用整体并入。典型的亚基间连接子包括磷酸二酯和硫代磷酸酯部分；或者，可以使用不含磷的接头。进一步的实施方式包括含LNA的化合物，其中每个LNA亚基被DNA亚基分开。某些化合物由交替的LNA和DNA亚基组成，其中亚基间连接基是硫代磷酸酯。

2'O,4'C-乙烯-桥接核酸(ENA)是BNA类的另一成员。下面描述了一个非限制性示例：

ENA寡聚体及其制备描述于Obika等人，Tetrahedron Ltt 38(50)：8735中，其通过引用整体并入本文。本公开的化合物可以包含一个或多个ENA亚基。

3.硫代磷酸酯

“硫代磷酸酯”(或S-寡聚体)是正常DNA的变体，其中一个非桥连氧被硫取代。硫代磷酸酯的非限制性实例描述如下：

核苷酸间键的硫化降低了内切核酸酶和核酸外切酶的作用，包括5'至3'和3'至5'DNA POL 1核酸外切酶，核酸酶S1和P1，RNA酶，血清核酸酶和蛇毒磷酸二酯酶。硫代磷酸酯通过两种主要途径制备：通过二硫化碳中元素硫溶液在膦酸氢盐上的作用，或通过用四乙基秋兰姆二硫化物(TETD)或3H-1,2-苯并二硫-3-酮1,1-二氧化物(BDTD)硫化亚磷酸三酯的方法制备(参见例如Iyer等人，J.Org.Chem.55,4693-4699,1990，其通过引用整体并入本文)。后一种方法避免了元素硫在大多数有机溶剂中的不溶性和二硫化碳的毒性问题。TETD和BDTD方法也产生更高纯度的硫代磷酸酯。

4.三环-DNA和三环-硫代磷酸酯核苷酸

三环-DNA(tc-DNA)是一类受约束的DNA类似物，其中通过引入环丙烷环来修饰每个核苷酸以限制骨架的构象灵活性并优化扭转角γ的骨架几何形状。含有腺嘌呤和胸腺嘧啶的tc-DNA与互补RNA形成非常稳定的A-T碱基对。三环-DNA及其合成描述于国际专利申请公开号WO2010/115993中，其通过引用整体并入本文。本公开的化合物可以掺入一种或多种三环-DNA核苷酸；在某些情况下，化合物可以完全由三环-DNA核苷酸组成。

三环硫代磷酸酯核苷酸是具有硫代磷酸酯亚基间连接的三环-DNA核苷酸。三环硫代磷酸酯核苷酸及其合成描述于国际专利申请公开号WO2013/053928中，其通过引用整体并入本文。本公开的化合物可以掺入一种或多种三环-DNA核苷酸；在某些情况下，化合物可以完全由三环-DNA核苷酸组成。三环-DNA/三环-硫代磷酸酯核苷酸的非限制性实例描述如下：

5.2'O-甲基，2'O-MOE和2'-F寡聚体

“2'-O-Me寡聚体”分子在核糖分子的2'-OH残基处带有甲基。2'-O-Me-RNA显示出与DNA相同(或相似)的行为，但保护免于核酸酶降解。2'-O-Me-RNA也可以与硫代磷酸酯寡聚体(PTO)组合以进一步稳定化。可以根据本领域的常规技术合成2'O-Me寡聚体(磷酸二酯或硫代磷酸酯)(参见例如Yoo等人，Nucleic Acids Res.32：2008-16,2004，其通过引用整体并入本文)。2'O-Me寡聚体的非限制性实例描述如下：

2'O-甲氧基乙基寡聚体(2'-O MOE)，如2'O-Me寡聚体，在核糖分子的2'-OH残基处带有甲氧基乙基，并在Martin等人，Helv.Chim.Acta,78,486-504,1995中讨论，其通过引用整体并入本文。2'O-MOE核苷酸的非限制性实例描述如下：

与前述烷基化的2'OH核糖衍生物相反，2'-氟寡聚体在2'位置具有氟基，代替2'OH。2'-F寡聚体的非限制性实例描述如下：

2'-氟寡聚体进一步描述于WO 2004/043977中，其通过引用整体并入本文。

2'O-甲基、2'O-MOE和2'F寡聚体也可包含一种或多种硫代磷酸酯(PS)键，如下所示：

另外，2'O-甲基、2'O-MOE和2'F寡聚体可以在整个寡聚体中包含PS亚基间键，例如在下面描述的2'O-甲基PS寡聚体drisapersen中：

或者，包含2'O-甲基、2'O-MOE和/或2'F寡聚体的寡聚体可在寡聚体的末端包含PS键，如下所示：

R＝CH₂CH₂OCH₃，甲氧基乙基(MOE)

其中，x、y、z分别表示每个指定的5'翼，中心间隙和3'翼区域中包含的核苷酸数。

本公开的反义寡聚体可以掺入一个或多个2'O-甲基，2'O-MOE和2'F亚基，并且可以利用本文所述的任何亚基间连接。在一些情况下，本公开的化合物可以由完全2'O-甲基，2'O-MOE或2'F亚基组成。本公开化合物的一个实施方式完全由2'O-甲基亚基组成。

6.2'-O-[2-(N-甲基氨基甲酰基)乙基]寡聚体(MCE)

MCE是可用于本公开化合物的2'O修饰的核糖核苷的另一个实例。此处，将2'OH衍生为2-(N-甲基氨基甲酰基)乙基部分以增加核酸酶抗性。MCE寡聚体的非限制性实例描述如下：

MCE及其合成描述于Yamada等人，J.Org.Chem.,76(9)：3042-53中，其通过引用整体并入本文。本公开的化合物可以包含一个或多个MCE亚基。

7.立体特异性寡聚体

立体特异性寡聚体是通过合成方法固定每个含磷键的立体化学，从而产生基本上纯的单一寡聚体。立体特异性寡聚体的非限制性实例描述如下：

在上面的示例中，寡聚体的每个磷具有相同的立体化学性质。另外的实例包括上述寡聚体。例如，LNA，ENA，三环-DNA，MCE，2'O-甲基，2'O-MOE，2'-F和基于吗啉代的寡聚体可以用立体特异性含磷的核苷间键合制备，例如硫代磷酸酯，磷酸二酯，氨基磷酸酯，二氨基磷酸酯或其它含有孔的核苷间键。用于制备这种寡聚体的立体特异性寡聚体，制备方法，手性控制合成，手性设计和手性助剂详细描述于例如WO2015107425，WO2015108048，WO2015108046，WO2015108047，WO2012039448，WO2010064146，WO2011034072，WO2014010250，WO2014012081，WO20130127858和WO2011005761中，其各自通过引用整体并入本文。

8.吗啉代寡聚体

本公开的示例性实施方式涉及以下一般结构的二氨基磷酸酯吗啉代寡聚体：

在各种实施方式中，本公开的反义寡聚体可以具有式(I)：

或其药学上可接受的盐，其中：

每个Nu是一个核碱基，它们一起形成靶向序列；

Z是20至26的整数；

T是选自以下的部分：

其中R³是C₁-C₆烷基；并且

R²选自H，乙酰基，三苯甲基和4-甲氧基三苯甲基，

在一些实施方式中，靶向序列选自：

a)SEQ ID NO：1(5'-CCAATGCCATCCTGGAGTTCCTGTAA-3')，其中Z是24；

b)SEQ ID NO：2(5'-CAATGCCATCCTGGAGTTCCTG-3')，其中Z是20；

c)SEQ ID NO：3(5'-TGCCATCCTGGAGTTCCTGTAAGAT-3')，其中Z是23；

d)SEQ ID NO：4(5'-CAATGCCATCCTGGAGTTCCTGTAAGAT-3')，其中Z是26；以及

e)SEQ ID NO：5(5'-TGCCATCCTGGAGTTCCTGTAAGATACC-3')，其中Z是26。

在各种实施方式中，T是

在一些实施方式中，R²是H。在某些实施方式中，Z是24，在一些实施方式中，Z是20。在一些实施方式中，Z是23。在一些实施方式中，Z是26。

在一些实施方式中，T是R²是H，并且Z是24。在一些实施方式中，T是R²是H，并且Z是20。在一些实施方式中，T是R²是H，并且Z是23。在一些实施方式中，T是R²是H，并且Z是26。

在一些实施方式中，T是靶向序列是SEQ ID NO：1(5'-CCAATGCCATCCTGGAGTTCCT GTAA-3')并且Z是24。在一些实施方式中，T是靶向序列是SEQ ID NO：2(5'-CAATGCCATCCTGGAGTTCCTG-3')并且Z是20。在一些实施方式中，T是靶向序列是SEQ ID NO：3(5'-TGCCATCCTGGAGTTCCTGTAAGAT-3')并且Z是23。在一些实施方式中，T是靶向序列是SEQ ID NO：4(5'-CAATGCCATCCTGGAGTTCCTGTAAGAT-3')并且Z是26。在一些实施方式中，T是靶向序列是SEQ ID NO：5(5'-TGCCATCCTGGAGTTCCTGTAAGATACC-3')并且Z是26。

在一些实施方式中，本公开的反义寡聚体是式(II)：

或其药学上可接受的盐，其中：

每个Nu是一个核碱基，它们一起形成靶向序列；并且

X是21至29的整数；

其中靶向序列选自：

a)SEQ ID NO：1(5'-CCAATGCCATCCTGGAGTTCCTGTAA-3')，其中X是25；

b)SEQ ID NO：2(5'-CAATGCCATCCTGGAGTTCCTG-3')，其中X是21；

c)SEQ ID NO：3(5'-TGCCATCCTGGAGTTCCTGTAAGAT-3')，其中X是24；

d)SEQ ID NO：4(5'-CAATGCCATCCTGGAGTTCCTGTAAGAT-3')，其中X是27；以及

e)SEQ ID NO：5(5'-TGCCATCCTGGAGTTCCTGTAAGATACC-3')，其中X是27。

在一些实施方式中，包括例如式(II)的反义寡聚体的实施方式，靶向序列是SEQID NO：1(5'-CCAATGCCATCCTGGAGTTCCTGTAA-3)并且X是25。在一些实施方式中，包括例如式(II)的反义寡聚体的实施方式，靶向序列是SEQ ID NO：2(5'-CAATGCCATCCTGGAGTTCCTG-3)并且X是21。在一些实施方式中，包括例如式(II)的反义寡聚体的实施方式，靶向序列是SEQID NO：3(5'-TGCCATCCTGGAGTTCCTGTAAGAT-3)并且X是24。在一些实施方式中，包括例如式(II)的反义寡聚体的实施方式，靶向序列是SEQ ID NO：4(5'-CAATGCCATCCTGGAGTTCCTGTAAGAT-3)并且X是27。在一些实施方式中，包括例如式(II)的反义寡聚体的实施方式，靶向序列是SEQ ID NO：5(5'-TGCCATCCTGGAGTTCCTGTAAGATACC-3)并且X是27。

在本公开的一个实施方式中，反义寡聚体是casimersen。

9.核碱基修饰和取代

在某些实施方式中，本公开的反义寡聚体由RNA核碱基和DNA核碱基组成(本领域通常简称为“碱基”)。RNA碱基通常称为腺嘌呤(A)，尿嘧啶(U)，胞嘧啶(C)和鸟嘌呤(G)。DNA碱基通常称为腺嘌呤(A)，胸腺嘧啶(T)，胞嘧啶(C)和鸟嘌呤(G)。

在某些实施方式中，寡聚体中的一个或多个RNA碱基或DNA碱基可以被修饰或用除RNA碱基或DNA碱基之外的碱基取代。含有修饰或取代的碱基的寡聚体包括寡聚体，其中核酸中最常见的一个或多个嘌呤或嘧啶碱基被较不常见或非天然的碱基取代。

嘌呤碱基包含与咪唑环稠合的嘧啶环，如以下通式所述：

腺嘌呤和鸟嘌呤是核酸中最常见的两个嘌呤核碱基。这些可以被其它天然存在的嘌呤取代，包括但不限于N⁶-甲基腺嘌呤，N²-甲基鸟嘌呤，次黄嘌呤和7-甲基鸟嘌呤。

嘧啶碱包含六元嘧啶环，如下以下通式所述：

胞嘧啶，尿嘧啶和胸腺嘧啶是最常见于核酸中的嘧啶碱基。这些可以被其它天然存在的嘧啶取代，包括但不限于5-甲基胞嘧啶，5-羟甲基胞嘧啶，假尿嘧啶和4-硫尿嘧啶。在一个实施方式中，本文所述的寡聚体含有胸腺嘧啶碱基代替尿嘧啶。

其它修饰或取代的碱包括但不限于2,6-二氨基嘌呤，乳清酸，阿马替啶，赖氨酸，2-硫代嘧啶(例如2-硫尿嘧啶，2-硫代胸腺嘧啶)，G-钳及其衍生物，5-取代的嘧啶(例如5-卤代尿嘧啶，5-丙炔基尿嘧啶，5-丙炔基胞嘧啶，5-氨基甲基尿嘧啶，5-羟甲基尿嘧啶，5-氨基甲基胞嘧啶，5-羟甲基胞嘧啶，Super T)，7-脱氮鸟嘌呤，7-脱氮腺嘌呤，7-氮杂-2,6-二氨基嘌呤，8-氮杂-7-脱氮鸟嘌呤，8-氮杂-7-脱氮腺嘌呤，8-氮杂-7-脱氮-2,6-二氨基嘌呤，Super G，SuperA和N4-乙基胞嘧啶，或其衍生物；N²-环戊基鸟嘌呤(cPent-G)，N²-环戊基-2-氨基嘌呤(cPent-AP)和N²-丙基-2-氨基嘌呤(Pr-AP)，假尿嘧啶或其衍生物；和简并或通用碱基，如2,6-二氟甲苯或缺乏碱基如无碱基位点(如1-脱氧核糖，1,2-二脱氧核糖，1-脱氧-2-O-甲基核糖；或吡咯烷衍生物，其中环氧已被氮代替(氮杂核糖))。SuperA，SuperG和Super T的衍生物的实例可以在美国专利6,683,173(Epoch Biosciences)中找到，其通过引用整体并入本文。当掺入siRNA中时，显示cPent-G，cPent-AP和Pr-AP降低免疫刺激作用(PeacockH.等人，J.Am.Chem.Soc.2011,133,9200)。假尿嘧啶是天然存在的尿嘧啶异构化形式，具有C-糖苷而不是尿苷中的常规N-糖苷。与含尿苷的mPvNA相比，含假尿苷的合成mRNA可具有改善的安全性特征(WO 2009127230，其通过引用整体并入本文)。

某些修饰或取代的核碱特别可用于增加本公开的反义寡聚体的结合亲和力。这些包括5-取代的嘧啶，6-氮杂嘧啶以及N-2，N-6和O-6取代的嘌呤，包括2-氨基丙基腺嘌呤，5-丙炔基尿嘧啶和5-丙炔基胞嘧啶。已显示5-甲基胞嘧啶取代使核酸双链体稳定性增加0.6-1.2℃，并且目前是优选的碱基取代，甚至更特别是当与2'-O-甲氧基乙基糖修饰组合时。

10.氢的同位素

在本公开的化合物中，原子的任何天然存在的同位素可以按其天然丰度存在，或者可以在一个或多个位置处富含同位素。例如，在本公开中，被鉴定为在某个位置处具有氢原子的化合物在该位置处可具有1H-(质子)，2H-(氘或D)和3H-(氚或T)，或者在该位置处的碳原子可以是12C-，13C-或14C-碳。

增加一种或多种同位素的一个或多个位置可以有助于组合物的活性，这是由于化合物的质量随同位素的变化和/或组合物对不稳定同位素的放射性而允许组合物的存在或代谢物更容易被检测到。

最丰富的氢同位素是1H，天然丰度大于99.98％。氘天然包含为约1/6000氢或0.015％的丰度。在本公开的一些化合物中，位置处的氘的量可以从氘的天然丰度中富集至多6000倍，这意味着该位置处约100％的氢原子是氘。在本公开的一些实施方式中，氘的富集可以是组合物中1000倍，2000倍，3000倍(约50％氘)或更高。或者，氘的富集可导致组合物在一个或多个位置处具有大于约10％，20％，30％，40％，50％，60％，70％，80％，90％。

11.寡聚体的药学上可接受的盐

本文所述寡聚体的某些实施方式可含有碱性官能团，例如氨基或烷基氨基，因此能够与药学上可接受的酸形成药学上可接受的盐。在这方面，术语“药学上可接受的盐”是指本公开化合物的相对无毒的无机和有机酸加成盐。这些盐可以在施用载体或剂型制造过程中原位制备，或者通过使本公开的纯化化合物以其游离碱形式与合适的有机或无机酸分别反应，并在随后的纯化过程中分离由此形成的盐。代表性的盐包括氢溴酸盐，盐酸盐，硫酸盐，硫酸氢盐，磷酸盐，硝酸盐，乙酸盐，戊酸盐，油酸盐，棕榈酸盐，硬脂酸盐，月桂酸盐，苯甲酸盐，乳酸盐，磷酸盐，甲苯磺酸盐，柠檬酸盐，马来酸盐，富马酸盐，琥珀酸盐，酒石酸盐，萘二甲酸盐，甲磺酸盐，葡庚糖酸盐，乳糖酸盐和月桂基磺酸盐等。(参见例如Berge等人(1977)“Pharmaceutical Salts”，J.Pharm.Sci.66：1-19)。

本公开寡聚体的药学上可接受的盐包括化合物的常规无毒盐或季铵盐，例如，来自无毒的有机或无机酸。例如，这种常规的无毒盐包括衍生自无机酸的那些，例如盐酸盐，氢溴酸盐，硫酸盐，氨基磺酸盐，磷酸盐，硝酸盐等；由有机酸制备的盐，例如乙酸，丙酸，琥珀酸，乙醇酸，硬脂酸，乳酸，苹果酸，酒石酸，柠檬酸，抗坏血酸，棕榈酸，马来酸，羟基马来酸，苯乙酸，谷氨酸，苯甲酸，水杨酸，磺胺，2-乙酰氧基苯甲酸，富马酸，甲苯磺酸，甲磺酸，乙烷二磺酸，草酸和等硫离子等。

在某些实施方式中，本公开的寡聚体可含有一个或多个酸性官能团，因此能够与药学上可接受的碱形成药学上可接受的盐。在这些情况下，术语“药学上可接受的盐”是指本公开化合物的相对无毒的无机和有机碱加成盐。这些盐同样可以在施用载体或剂型制造过程中原位制备，或者通过使纯化的化合物以其游离酸形式与合适的碱(例如药学上可接受的金属阳离子，氨，或药学上可接受的有机伯，仲或叔胺的氢氧化物，碳酸盐或碳酸氢盐)分别反应来制备。代表性的碱金属或碱土金属盐包括锂盐，钠盐，钾盐，钙盐，镁盐和铝盐等。可用于形成碱加成盐的代表性有机胺包括乙胺，二乙胺，乙二胺，乙醇胺，二乙醇胺和哌嗪等。(参见例如Berge等人，同上)。

III.制剂和施用模式

在某些实施方式中，本公开提供了适合于治疗性递送本文所述的反义寡聚体的制剂或药物组合物。因此，在某些实施方式中，本公开提供了药学上可接受的组合物，其包含治疗有效量的一种或多种本文所述的寡聚体，与一种或多种药学上可接受的载体(添加剂)和/或稀释剂一起配制。虽然本公开的寡聚体可以单独施用，但优选将该化合物作为药物制剂(组合物)施用。

用于递送核酸分子的方法描述于例如Akhtar等人，1992,Trends Cell Bio.,2:139；和Delivery Strategies for Antisense Oligonucleotide Therapeutics,ed.Akhtar；Sullivan等人，PCT WO 94/02595。这些和其它方式可用于递送实际上任何核酸分子，包括本公开的寡聚体。

如下所述，本公开的药物组合物可以特别配制用于以固体或液体形式施用，包括适于以下的那些：(1)口服施用，例如浸液(水性或非水性溶液或悬浮液)，片剂，例如用于口腔，舌下和全身吸收的那些，丸剂，粉末，颗粒，用于舌头的糊剂；(2)肠胃外施用，例如通过皮下，肌肉内，静脉内或硬膜外注射，例如无菌溶液或悬浮液，或缓释制剂；(3)局部施用，例如作为霜剂，软膏剂或控释贴剂或喷雾施用于皮肤；(4)阴道内或直肠内，例如子宫托，乳膏或泡沫；(5)舌下；(6)眼睛；(7)透皮；或(8)鼻腔。

可用作药学上可接受的载体的材料的一些实例包括但不限于：(1)糖，例如乳糖，葡萄糖和蔗糖；(2)淀粉，例如玉米淀粉和马铃薯淀粉；(3)纤维素及其衍生物，例如羧甲基纤维素钠，乙基纤维素和醋酸纤维素；(4)粉末黄蓍胶；(5)麦芽；(6)明胶；(7)滑石粉；(8)辅料，例如可可脂和栓剂蜡；(9)油类，例如花生油，棉籽油，红花油，芝麻油，橄榄油，玉米油和豆油；(10)二醇类，例如丙二醇；(11)多元醇，例如甘油，山梨糖醇，甘露醇和聚乙二醇；(12)酯类，例如油酸乙酯和月桂酸乙酯；(13)琼脂；(14)缓冲剂，例如氢氧化镁和氢氧化铝；(15)海藻酸；(16)无热原水；(17)等渗盐水；(18)林格溶液；(19)乙醇；(20)pH缓冲溶液；(21)聚酯，聚碳酸酯和/或聚酸酐；(22)药物制剂中使用的其它无毒相容物质。

适用于与本公开的反义寡聚体一起配制的试剂的其它非限制性实例包括：PEG缀合的核酸，磷脂缀合的核酸，含有亲脂部分的核酸，硫代磷酸酯，P-糖蛋白抑制剂(例如Pluronic P85)，其可以加强药物进入各种组织；可生物降解的聚合物，例如聚(DL-丙交酯-共-乙交酯)微球，用于植入后的持续释放递送(Emerich，D F等人，1999，Cell Transplant，8,47-58)Alkermes，Inc.，Cambridge，Mass；和负载的纳米颗粒，例如由聚氰基丙烯酸丁酯制成的纳米颗粒，其可以通过血脑屏障递送药物并且可以改变神经元摄取机制(ProgNeuropsychopharmacol Biol Psychiatry，23,941-949,1999)。

本公开还涉及包含表面修饰的脂质体的组合物的用途，所述脂质体含有聚(乙二醇)脂质(PEG-修饰的，支化的和非支化的或其组合，或长循环脂质体或隐形脂质体)。本公开的寡聚体还可包含各种分子量的共价连接的PEG分子。这些制剂提供了增加靶组织中药物积累的方法。这类药物载体通过单核吞噬细胞系统(MPS或RES)抵抗调理和消除，从而使包封药物的血液循环时间更长并且组织暴露增加(Lasic等人，Chem.Rev.1995,95,2601-2627；Ishiwata等人，Chem.Pharm.Bull.1995,43,1005-1011)。已经显示这种脂质体在肿瘤中选择性地积累，可能是通过外渗和在新血管化的靶组织中捕获(Lasic等人，Science1995,267,1275-1276；Oku等人，1995，Biochim.Biophys.Acta,1238,86-90)。长循环脂质体增强DNA和RNA的药代动力学和药效学，特别是与已知在MPS组织中积累的常规阳离子脂质体相比(Liu等人，J.Biol.Chem.1995,42,24864-24870；Choi等人，国际PCT公开号WO 96/10391；Ansell等人，国际PCT公开号WO96/10390；Holland等人，国际PCT公开号WO 96/10392)。与阳离子脂质体相比，长循环脂质体还可以更大程度地保护药物免受核酸酶降解，这是基于它们避免在代谢侵袭性MPS组织例如肝脏和脾脏中积累的能力。

在进一步的实施方式中，本公开包括制备用于递送的寡聚体药物组合物，如美国专利号6,692,911，7,163,695和7,070,807中所述。在这方面，在一个实施方式中，本公开提供了本公开的寡聚体，其包含单独的赖氨酸和组氨酸(HK)的共聚物(如美国专利号7,163,695,7,070,807和6,692,911中所述)，或与PEG(例如支链或非支链PEG或两者的混合物)组合，与PEG和靶向部分或任何与交联剂组合的前述物质组合。在某些实施方式中，本公开提供了包含葡糖酸修饰的多组氨酸或葡糖酸化的多组氨酸/转铁蛋白-多聚赖氨酸的药物组合物中的反义寡聚体。本领域技术人员还将认识到，具有与His和Lys相似性质的氨基酸可在组合物中被取代。

润湿剂，乳化剂和润滑剂，例如十二烷基硫酸钠和硬脂酸镁，以及着色剂，脱模剂，包衣剂，甜味剂，调味剂和芳香剂，防腐剂和抗氧化剂也可以存在于组合物中。

药学上可接受的抗氧化剂的实例包括：(1)水溶性抗氧化剂，例如抗坏血酸，半胱氨酸盐酸盐，硫酸氢钠，偏亚硫酸氢钠和亚硫酸钠等；(2)油溶性抗氧化剂，例如抗坏血酸棕榈酸酯，丁基化羟基苯甲醚(BHA)，丁基化羟基甲苯(BHT)，卵磷脂，没食子酸丙酯和α-生育酚等；(3)金属螯合剂，例如柠檬酸，乙二胺四乙酸(EDTA)，山梨糖醇，酒石酸和磷酸等。

本公开的制剂包括适合口服，鼻腔，局部(包括口腔和舌下)，直肠，阴道和/或肠胃外施用的制剂。制剂可以方便地以单位剂型存在，并且可以通过药学领域熟知的任何方法制备。可以与载体材料组合以产生单一剂型的活性成分的量将根据所治疗的宿主、特定施用方式而变化。可以与载体材料组合以产生单一剂型的活性成分的量通常是产生治疗效果的化合物的量。通常，在百分之百中，该量为活性成分的约0.1％至约99％，优选约5％至约70％，最优选约10％至约30％。

在某些实施方式中，本公开的制剂包含选自环糊精，纤维素，脂质体，胶束形成剂(例如胆汁酸)和聚合物载体(例如聚酯和聚酸酐)的赋形剂；和本公开的寡聚体。在某些实施方式中，前述制剂使得本公开的寡聚体是口服生物可利用的。

制备这些制剂或药物组合物的方法包括使本公开的寡聚体与载体和任选的一种或多种辅助成分结合的步骤。通常，通过将本公开的化合物与液体载体或细碎的固体载体或两者均匀且紧密地结合，然后如果需要，使产物成形，以制备制剂。

适于口服施用的本公开的制剂可以是胶囊，扁囊剂，丸剂，片剂，锭剂(使用调味基础，通常是蔗糖和阿拉伯胶或黄蓍胶)，粉末，颗粒或作为水性或非水性液体的溶液或悬浮液的形式，或作为水包油或油包水液体乳液，或作为酏剂或糖浆，或作为锭剂(使用惰性碱，例如明胶和甘油，或蔗糖和阿拉伯胶)和/或作为口腔清洗剂等，各自含有预定量的本公开化合物作为活性成分。本公开的寡聚体也可以以大丸剂，药糖剂或糊剂形式施用。

在本公开的用于口服施用的固体剂型(胶囊，片剂，丸剂，糖衣丸，粉末，颗粒，小片等)中，活性成分可以与一种或多种药学上可接受的载体混合，例如柠檬酸钠或磷酸二钠，和/或以下任一种：(1)填充剂或增量剂，例如淀粉，乳糖，蔗糖，葡萄糖，甘露糖醇和/或硅酸；(2)粘合剂，例如羧甲基纤维素，藻酸盐，明胶，聚乙烯吡咯烷酮，蔗糖和/或阿拉伯胶；(3)保湿剂，例如甘油；(4)崩解剂，例如琼脂，碳酸钙，马铃薯或木薯淀粉，海藻酸，某些硅酸盐和碳酸钠；(5)溶液缓凝剂，例如石蜡；(6)吸收促进剂，例如季铵化合物和表面活性剂，例如泊洛沙姆和十二烷基硫酸钠；(7)润湿剂，例如鲸蜡醇，单硬脂酸甘油酯和非离子表面活性剂；(8)吸收剂，例如高岭土和膨润土；(9)润滑剂，例如滑石，硬脂酸钙，硬脂酸镁，固体聚乙二醇，十二烷基硫酸钠，硬脂酸锌，硬脂酸钠，硬脂酸及其混合物；(10)着色剂；(11)控释剂例如交聚维酮或乙基纤维素。在胶囊，片剂和丸剂的情况下，药物组合物还可包含缓冲剂。类似类型的固体药物组合物也可用作软和硬壳明胶胶囊中的填充剂，使用诸如乳糖或乳糖等赋形剂，以及高分子量聚乙二醇等。

片剂可以通过压缩或模塑制备，任选地含有一种或多种辅助成分。可以使用粘合剂(例如明胶或羟丙基甲基纤维素)，润滑剂，惰性稀释剂，防腐剂，崩解剂(例如羟基乙酸淀粉钠或交联羧甲基纤维素钠)，表面活性剂或分散剂制备压缩片剂。模制片剂可以通过在合适的机器中模制用惰性液体稀释剂润湿的粉末化合物的混合物来制备。

本公开的药物组合物的片剂和其它固体剂型，例如糖衣丸，胶囊，丸剂和颗粒，可任选地用涂层和外壳刻痕或制备，例如药学制剂领域中熟知的肠溶包衣和其它包衣。它们也可以配制成使其中的活性成分缓慢或受控释放，例如，使用不同比例的羟丙基甲基纤维素以提供所需的释放曲线，其它聚合物基质，脂质体和/或微球。它们可以配制成快速释放，例如冷冻干燥。它们可以通过例如通过细菌截留过滤器过滤，或通过掺入无菌固体药物组合物形式的灭菌剂来灭菌，所述灭菌剂可以在使用前立即溶解在无菌水或一些其它无菌可注射介质中。这些药物组合物还可以任选地含有遮光剂，并且可以是仅在肠胃道的某一部分中或优选以延迟的方式释放活性成分的组合物。可以使用的包埋组合物的实例包括聚合物质和蜡。如果合适，活性成分也可以是一种或多种上述赋形剂的微胶囊形式。

用于口服施用本公开化合物的液体剂型包括药学上可接受的乳液，微乳液，溶液，悬浮液，糖浆和酏剂。除活性成分外，液体剂型可含有本领域常用的惰性稀释剂，例如水或其它溶剂，增溶剂和乳化剂，例如乙醇，异丙醇，碳酸乙酯，乙酸乙酯，苯甲醇，苯甲酸苄酯，丙二醇，1,3-丁二醇，油(特别是棉籽，花生，玉米，胚芽，橄榄，蓖麻和芝麻油)，甘油，四氢呋喃醇，聚乙二醇和脱水山梨糖醇的脂肪酸酯，及其混合物。

除惰性稀释剂外，口服药物组合物还可包括佐剂，如润湿剂，乳化剂和悬浮剂，甜味剂，调味剂，着色剂，芳香剂和防腐剂。

除活性化合物外，悬浮液可含有悬浮剂，例如乙氧基化异硬脂醇，聚氧乙烯山梨糖醇和脱水山梨糖醇酯，微晶纤维素，偏氢氧化铝，膨润土，琼脂和黄蓍胶，及其混合物。

用于直肠或阴道施用的制剂可以作为栓剂提供，其可以通过将一种或多种本公开的化合物与一种或多种合适的非刺激性赋形剂或载体混合来制备，所述赋形剂或载体包括例如可可脂，聚乙二醇，栓剂蜡或水杨酸盐，在室温下为固体，但在体温下为液体，因此会在直肠或阴道腔内融化并释放出活性化合物。

用于局部或透皮施用本文提供的寡聚体的制剂或剂型包括粉末，喷雾剂，软膏，糊剂，乳膏，洗剂，凝胶，溶液，贴剂和吸入剂。活性寡聚体可以在无菌条件下与药学上可接受的载体混合，并与可能需要的任何防腐剂，缓冲剂或推进剂混合。除了本公开的活性化合物之外，软膏，糊剂，乳膏和凝胶可以含有赋形剂，例如动物和植物脂肪，油，蜡，石蜡，淀粉，黄蓍胶，纤维素衍生物，聚乙二醇，硅氧烷，膨润土，硅酸，滑石和氧化锌，或其混合物。

除本公开的寡聚体外，粉剂和喷雾剂还可含有赋形剂，例如乳糖，滑石，硅酸，氢氧化铝，硅酸钙和聚酰胺粉末，或这些物质的混合物。喷雾剂可另外含有常规推进剂，例如氯氟烃和挥发性的未取代烃，例如丁烷和丙烷。

透皮贴剂具有额外的优点，即向身体提供本公开的寡聚体的受控递送。这种剂型可以通过将寡聚体溶解或分散在适当的介质中来制备。吸收促进剂也可用于增加药剂在皮肤上的通量。除了本领域已知的其它方法之外，可以通过提供速率控制膜或将试剂分散在聚合物基质或凝胶中来控制这种通量的速率。

适用于肠胃外施用的药物组合物可包含一种或多种本公开的寡聚体与一种或多种药学上可接受的无菌等渗水溶液或非水溶液，分散液，悬浮液或乳液，或可重构成无菌可注射溶液或分散液的无菌粉末的组合，在使用之前，其可含有糖，醇，抗氧化剂，缓冲剂，抑菌剂，溶质，其使制剂与预期接受者的血液或悬浮剂或增稠剂等渗。可用于本公开的药物组合物中的合适的水性和非水性载体的实例包括水，乙醇，多元醇(例如甘油，丙二醇和聚乙二醇等)，及其合适的混合物，植物油，例如橄榄油和可注射的有机酯，如油酸乙酯。例如，通过使用包衣材料如卵磷脂，通过在分散体的情况下保持所需的粒度，以及通过使用表面活性剂，可以保持适当的流动性。

这些药物组合物还可含有佐剂，如防腐剂，润湿剂，乳化剂和分散剂。通过包含各种抗细菌剂和抗真菌剂，例如对羟基苯甲酸酯，氯丁醇和苯酚山梨酸等，可以确保防止微生物对主题寡聚体的作用。还可能需要在组合物中包含等渗剂，例如糖和氯化钠等。此外，可以通过包含延迟吸收的试剂如单硬脂酸铝和明胶来延长可注射药物形式的吸收。

在某些情况下，为了延长药物的作用，希望减慢皮下或肌内注射药物的吸收。这可以通过使用本领域已知的其它方法，使用水溶性差的结晶或无定形材料的液体悬浮液来实现。然后，药物的吸收速率取决于其溶解速率，而溶解速率又取决于晶体大小和晶形。或者，通过将药物溶解或悬浮在油性载体中来实现肠胃外施用的药物形式的延迟吸收。

可注射的储库形式可以通过在可生物降解的聚合物如聚丙交酯-聚乙交酯中形成本公开寡聚体的微囊基质来制备。取决于寡聚体与聚合物的比例，以及所用特定聚合物的性质，可以控制寡聚体的释放速率。其它可生物降解的聚合物的实例包括聚(原酸酯)和聚(酸酐)。还可以通过将药物包埋在与身体组织相容的脂质体或微乳液中来制备储库可注射制剂。

当本公开的寡聚体作为药物施用于人和动物时，它们可以按本身给予或作为含有例如0.1-99％(更优选10-30％)活性成分与药学上可接受的载体组合的药物组合物给予。

如上所述，本公开的制剂或制品可以口服，肠胃外，局部或直肠施用。它们通常以适合于每种施用途径的形式给出。例如，它们以片剂或胶囊形式通过注射，吸入，眼用洗剂，软膏，栓剂等施用，通过注射，输注或吸入施用；通过乳液或软膏局部施用；和通过栓剂直肠施用。

本文所用的短语“肠胃外施用”和“以肠胃外施用”是指除肠内和局部施用以外的施用方式，通常通过注射施用，包括但不限于静脉内，肌肉内，动脉内，鞘内，囊内，眶内，心内，皮内，腹膜内，经气管，皮下，表皮下，关节内，包膜下，蛛网膜下，脊柱内和胸骨内注射和输注。

本文所用的短语“全身施用”，“以全身施用”，“外周施用”和“以外周施用”是指将化合物、药物或其它物质直接施用于中枢神经系统，使其进入患者体内。因此，它可以进行新陈代谢和其它类似过程，例如皮下施用。

无论选择何种施用途径，可以通过本领域技术人员已知的常规方法将本公开的寡聚体(可以以合适的水合形式使用)和/或本公开的药物组合物配制成药学上可接受的剂型。可以改变本公开的药物组合物中活性成分的实际剂量水平，以便获得有效实现特定患者、组合物和施用方式的所需治疗反应的活性成分的量，而不是对患者不可接受地有毒。

所选择的剂量水平将取决于多种因素，包括所用本公开的特定寡聚体，或其酯、盐或酰胺的活性，施用途径，施用时间，所用特定寡聚体的排泄或代谢的速率，吸收的速度和程度，治疗的持续时间，与所用特定寡聚体组合使用的其它药物、化合物和/或材料，年龄，性别，体重，病症，一般健康状况和待治疗患者的既往病史，以及医学领域众所周知的因素。

具有本领域普通技能的医生或兽医可以容易地确定和开出所需药物组合物的有效量。例如，医生或兽医可以以低于实现所需治疗效果所需的水平开始药物组合物中使用的本公开化合物的剂量，并逐渐增加剂量直至达到所需效果。通常，本发明化合物的合适日剂量是化合物的量，其是有效产生治疗效果的最低剂量。这种有效剂量通常取决于上述因素。通常，当用于所示效果时，本公开化合物的口服，静脉内，脑室内和皮下剂量对于患者而言在每天每千克体重约0.0001至约100mg的范围内。

在一些实施方式中，本公开的寡聚体以通常约20-100mg/kg的剂量施用。在某些情况下，可能需要大于100mg/kg的剂量。在一些实施方式中，静脉注射的剂量为约0.5mg至100mg/kg。在一些实施方式中，寡聚体以约20mg/kg，21mg/kg，25mg/kg，26mg/kg，27mg/kg，28mg/kg，29mg/kg，30mg/kg，31mg/kg，32mg/kg，33mg/kg，34mg/kg，35mg/kg，36mg/kg，37mg/kg，38mg/kg，39mg/kg，40mg/kg，41mg/kg，42mg/kg，43mg/kg，44mg/kg，45mg/kg，46mg/kg，47mg/kg，48mg/kg，49mg/kg，50mg/kg，51mg/kg，52mg/kg，53mg/kg，54mg/kg，55mg/kg，56mg/kg，57mg/kg，58mg/kg，59mg/kg，60mg/kg，65mg/kg，70mg/kg，75mg/kg，80mg/kg，85mg/kg，90mg/kg，95mg/kg，100mg/kg的剂量施用，包括其间的所有整数。在一些实施方式中，寡聚体以30mg/kg施用。在一些实施方式中，寡聚体以50mg/kg施用。

如果需要，活性化合物的有效日剂量可以作为两个，三个，四个，五个，六个或更多个亚剂量施用，所述亚剂量在一天中以适当的间隔分开施用，任选地以单位剂型施用。在某些情况下，施用是每天一次施用。在某些实施方式中，施用是根据需要每2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14天，或每1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12周，或每1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12个月一次或多次施用，以保持所需功能性抗肌肉萎缩蛋白的表达。

核酸分子可通过本领域熟悉的各种方法施用于细胞，包括但不限于脂质体包封，离子电渗疗法，或掺入其它载体，如水凝胶，环糊精，可生物降解的纳米胶囊和生物粘附性微球，如本文所述和本领域已知的。在某些实施方式中，微乳化技术可用于改善亲脂性(水不溶性)药剂的生物利用度。实例包括Trimetrine(Dordunoo，SK等人，Drug Developmentand Industrial Pharmacy，17(12)，1685-1713，1991和REV 5901(Sheen，PC等人，J PharmSci 80(7)，712-714，1991)。除了其它益处之外，微乳化通过优先将吸收引导至淋巴系统而不是循环系统来提供增强的生物利用度，循环系统因此绕过肝脏，并防止肝胆循环中化合物的破坏。

在公开的一个方面，制剂含有由本文提供的寡聚体和至少一种两亲性载体形成的胶束，其中胶束的平均直径小于约100nm。更优选的实施方式提供平均直径小于约50nm的胶束，甚至更优选的实施方式提供平均直径小于约30nm，或甚至小于约20nm的胶束。

虽然考虑了所有合适的两亲性载体，但目前优选的载体通常是具有通常认可的安全(GRAS)状态，并且可以溶解本公开的化合物并在溶液与复杂的水相(例如在人类胃肠道中发现的水相)发生接触的后期微乳化它们的那些。通常，满足这些要求的两亲性成分具有2-20的HLB(亲水性至亲脂性平衡)值，并且它们的结构含有C-6至C-20范围内的直链脂族基团。实例是聚乙二醇化脂肪酸甘油酯和聚乙二醇。

两亲性载体的实例包括饱和和单不饱和的聚乙二醇化脂肪酸甘油酯，例如由完全或部分氢化的各种植物油获得的那些。这些油可有利地由三-、二-和单-脂肪酸甘油酯和相应脂肪酸的二-和单-聚乙二醇酯组成，特别优选的脂肪酸组合物包括癸酸4-10，癸酸3-9，月桂酸40-50，肉豆蔻酸14-24，棕榈酸4-14和硬脂酸5-15％。另一类有用的两亲载体包括部分酯化的脱水山梨糖醇和/或山梨糖醇，饱和或单不饱和脂肪酸(SPAN-系列)或相应的乙氧基化类似物(TWEEN-系列)。

市售的两亲性载体可能是特别有用的，包括Gelucire系列，Labrafil，Labrasol或Lauroglycol(均由Gattefosse Corporation，Saint Priest，France制造和分销)，PEG-单油酸酯，PEG-二油酸酯，PEG-单-月桂酸酯和二-月桂酸酯，卵磷脂，聚山梨醇酯80等(由美国和全球的许多公司生产和销售)。

在某些实施方式中，递送可以通过使用脂质体，纳米胶囊，微粒，微球，脂质颗粒和囊泡等进行，以将本公开的药物组合物引入合适的宿主细胞中。特别地，本公开的药物组合物可以配制成包封在脂质颗粒，脂质体，囊泡，纳米球或纳米颗粒等中以用于递送。可以使用已知和常规技术进行这种递送载体的配制和使用。

适用于本公开的亲水性聚合物是易溶于水的，可共价连接到形成囊泡的脂质，并且在体内耐受而没有毒性作用(即是生物相容的)的那些。合适的聚合物包括聚乙二醇(PEG)，聚乳酸(也称为聚丙交酯)，聚乙醇酸(也称为聚乙交酯)，聚乳酸-聚乙醇酸共聚物和聚乙烯醇。在某些实施方式中，聚合物的分子量为约100或120道尔顿至约5000或10000道尔顿，或约300道尔顿至约5000道尔顿。在其它实施方式中，聚合物是分子量为约100至约5000道尔顿的聚乙二醇，或分子量为约300至约5000道尔顿的聚乙二醇。在某些实施方式中，聚合物是750道尔顿的聚乙二醇(PEG(750))。聚合物也可以由其中的单体数量来定义；本公开的优选实施方式使用至少约三种单体的聚合物，例如由三种单体(约150道尔顿)组成的PEG聚合物。

可适用于本公开的其它亲水性聚合物包括聚乙烯吡咯烷酮，聚甲恶唑啉，聚乙基恶唑啉，聚羟丙基甲基丙烯酰胺，聚甲基丙烯酰胺，聚二甲基丙烯酰胺和衍生的纤维素，如羟甲基纤维素或羟乙基纤维素。

在某些实施方式中，本公开的制剂包含选自由聚酰胺，聚碳酸酯，聚亚烷基，丙烯酸和甲基丙烯酸酯的聚合物，聚乙烯基聚合物，聚乙交酯，聚硅氧烷，聚氨酯及其共聚物，纤维素，聚丙烯，聚乙烯，聚苯乙烯，乳酸和乙醇酸聚合物，聚酸酐，聚(邻)酯，聚(丁酸)，聚(戊酸)，聚(丙交酯-己内酯)，多糖，蛋白质，聚透明质酸，聚氰基丙烯酸酯，及其共混物，混合物或共聚物组成的组中的生物相容性聚合物。

环糊精是环状低聚糖，由6，7或8个葡萄糖单元组成，分别用希腊字母α，β或γ表示。葡萄糖单元通过α-1,4-糖苷键连接。由于糖单元的椅子构象，所有仲羟基(在C-2，C-3处)位于环的一侧，而C-6处的所有伯羟基位于另一侧。因此，外表面是亲水的，使环糊精具有水溶性。相反，环糊精的空腔是疏水的，因为它们通过原子C-3和C-5的氢以及类似醚的氧排列。这些基质允许与各种相对疏水的化合物络合，包括例如类固醇化合物如17α-雌二醇(参见，例如，van Uden等人，Plant Cell Tiss.Org.Cult.38:1-3-113(1994))。络合通过范德华相互作用和氢键形成发生。关于环糊精化学的综述，参见Wenz,Agnew.Chem.Int.Ed.Engl.,33:803-822(1994)。

环糊精衍生物的物理化学性质很大程度上取决于取代的种类和程度。例如，它们在水中的溶解度范围从不溶性(例如，三乙酰基-β-环糊精)到147％可溶性(w/v)(G-2-β-环糊精)。此外，它们可溶于许多有机溶剂中。环糊精的性质使得能够通过增加或降低其溶解度来控制各种制剂组分的溶解度。

已经描述了许多环糊精及其制备方法。例如，Parmeter(I)等人(美国专利号3,453,259)和Gramera等人(美国专利号3,459,731)描述了电中性环糊精。其它衍生物包括具有阳离子性质的环糊精[Parmeter(II)，美国专利号3,453,257]，不溶性交联环糊精(Solms，美国专利号3,420,788)和具有阴离子性质的环糊精[Parmeter(III)，美国专利号3,426,011]。在具有阴离子性质的环糊精衍生物中，羧酸，亚磷酸，次膦酸，膦酸，磷酸，硫代膦酸，硫代亚磺酸和磺酸已被附加到母体环糊精上[参见Parmeter(III)，同上]。此外，Stella等人(美国专利号5,134,127)已经描述了磺烷基醚环糊精衍生物。

脂质体由至少一个包封含水内部隔室的脂质双层膜组成。脂质体可以通过膜类型和大小来表征。小单层囊泡(SUV)具有单个膜，通常直径在0.02和0.05μm之间；大单层囊泡(LUVS)通常大于0.05μm。寡层大囊泡和多层囊泡具有多个(通常是同心的)膜层，并且通常大于0.1μm。具有几个非同心膜的脂质体，即几个较小囊泡包含在较大囊泡内，被称为多泡囊泡。

本公开的一个方面涉及包含含有本公开的寡聚体的脂质体的制剂，其中配制脂质体膜以提供具有增加的携带能力的脂质体。或者或另外，本公开的化合物可包含在脂质体的脂质体双层内或吸附在脂质体的脂质体双层上。本公开的寡聚体可以与脂质表面活性剂聚集并且携带在脂质体的内部空间内；在这些情况下，配制脂质体膜以抵抗活性剂-表面活性剂聚集体的破坏作用。

根据本公开的一个实施方式，脂质体的脂质双层包含用聚乙二醇(PEG)衍生的脂质，使得PEG链从脂质双层的内表面延伸到由脂质体包封的内部空间中，并且延伸从脂质双层的外部进入周围环境。

包含在本公开的脂质体内的活性剂是溶解形式。根据本发明，表面活性剂和活性剂(例如含有目标活性剂的乳液或胶束)的聚集体可以包埋在脂质体的内部空间内。表面活性剂用于分散和溶解活性剂，并且可以选自任何合适的脂族，脂环族或芳族表面活性剂，包括但不限于具有不同链长(例如约C14至约C20)的生物相容性溶血磷脂酰胆碱(LPG)。聚合物衍生的脂质如PEG-脂质也可用于胶束形成，因为它们将起到抑制胶束/膜融合的作用，并且因为向表面活性剂分子中加入聚合物会降低表面活性剂的CMC并有助于胶束形成。优选的是具有微摩尔范围的CMO的表面活性剂；较高CMC表面活性剂可用于制备包埋在本公开的脂质体内的胶束。

根据本公开的脂质体可以通过本领域已知的多种技术中的任一种来制备。参见例如美国专利号第4,235,871；公布的PCT申请WO 96/14057；New RRC，Liposomes：Apracticalapproach，IRLPress，Oxford(1990)，第33-104页；Lasic DD，Liposomes from physics toapplications，Elsevier Science Publishers BV，Amsterdam，1993。例如，本公开的脂质体可以通过将用亲水聚合物衍生的脂质扩散到预先形成的脂质体中来制备，例如通过将预先形成的脂质体暴露于由脂质接枝的聚合物组成的胶束，其脂质浓度对应于脂质体中所需的衍生化脂质的最终摩尔百分比。含有亲水性聚合物的脂质体也可以通过本领域已知的均质化，脂质场水合或挤出技术形成。

在另一个示例性制剂程序中，首先通过超声处理将活性剂分散在溶血磷脂酰胆碱或其它低CMC表面活性剂(包括聚合物接枝的脂质)中，其容易溶解疏水分子。然后将所得的活性剂胶束悬浮液用于再水合含有合适摩尔百分比的聚合物接枝的脂质或胆固醇的干燥脂质样品。然后使用本领域已知的挤出技术将脂质和活性剂悬浮液形成脂质体，并通过标准柱分离将所得脂质体与未包封的溶液分离。

在本公开的一个方面，制备脂质体以在选定的尺寸范围内具有基本上均匀的尺寸。一种有效的定尺寸方法包括将脂质体的水性悬浮液挤出通过一系列具有选定的均匀孔径的聚碳酸酯膜；膜的孔径大致对应于通过该膜挤出产生的最大尺寸的脂质体。参见例如美国专利号4,737,323(1988年4月12日)。在某些实施方式中，可以使用诸如和的试剂将多核苷酸或蛋白质引入细胞中。

本公开制剂的释放特征取决于包封材料，包封药物的浓度和释放调节剂的存在。例如，可以将释放操作为pH依赖性，例如，使用仅在低pH下释放的pH敏感性涂层，如在胃中，或在较高的pH下，如在肠中。肠溶包衣可用于防止在通过胃之前发生释放。包封在不同材料中的多种包衣或氨腈的混合物可用于在胃中获得初始释放，随后在肠中释放。还可以通过包含盐或成孔剂来控制释放，所述盐或成孔剂可以通过从胶囊扩散来增加水的摄取或释放。改变药物溶解度的赋形剂也可用于控制释放速率。还可以掺入增强基质降解或从基质中释放的试剂。它们可以加入到药物中，作为单独的相加入(即作为颗粒)，或者可以根据化合物共溶在聚合物相中。在大多数情况下，该量应在0.1％至30％(w/w聚合物)之间。降解增强剂的种类包括无机盐如硫酸铵和氯化铵，有机酸如柠檬酸，苯甲酸和抗坏血酸，无机碱如碳酸钠，碳酸钾，碳酸钙，碳酸锌和氢氧化锌，和有机碱如硫酸鱼精蛋白，精胺，胆碱，乙醇胺，二乙醇胺和三乙醇胺，以及表面活性剂如和将微观结构添加到基质中的孔形成剂(即水溶性化合物，例如无机盐和糖)作为颗粒加入。该范围通常在1％至30％(w/w聚合物)之间。

还可以通过改变颗粒在肠中的停留时间来控制摄取。例如，这可以通过用粘膜粘合剂聚合物涂覆或选择包封材料来实现。实例包括具有游离羧基的大多数聚合物，例如脱乙酰壳多糖，纤维素，尤其是聚丙烯酸酯(如本文所用，聚丙烯酸酯是指包括丙烯酸酯基团和改性丙烯酸酯基团的聚合物，例如氰基丙烯酸酯和甲基丙烯酸酯)。

寡聚体可以配制成包含在外科手术或医疗装置或植入物内，或者适于通过外科手术或医疗装置或植入物释放。在某些方面，植入物可以用寡聚体涂覆或以其它方式处理。例如，水凝胶或其它聚合物，例如生物相容的和/或可生物降解的聚合物，可用于用本公开的药物组合物涂覆植入物(即通过使用水凝胶或其它聚合物，该组合物可适于与医疗装置一起使用)。用于用药剂涂覆医疗装置的聚合物和共聚物在本领域中是众所周知的。植入物的实例包括但不限于支架，药物洗脱支架，缝合线，假体，血管导管，透析导管，血管移植物，假体心脏瓣膜，心脏起搏器，植入式心律转复除颤器，IV针，骨固定装置和结构，例如销，螺钉，板和其它装置，以及用于伤口愈合的人造组织基质。

除了本文提供的方法之外，根据本公开使用的寡聚体可以通过与其它药物类似的方式配制用于以任何方便的方式用于人或兽医学中。反义寡聚体及其相应的制剂可以单独施用或与其它治疗策略组合施用，用于治疗肌肉萎缩症，例如成肌细胞移植，干细胞疗法，氨基糖苷类抗生素的施用，蛋白酶体抑制剂和上调疗法(例如上调抗肌肉萎缩蛋白相关蛋白，一种抗肌肉萎缩蛋白的常染色体旁系同源物)。

在一些实施方式中，另外的治疗剂可以在施用本公开的寡聚体之前，同时或之后施用。例如，寡聚体可以与类固醇和/或抗生素组合施用。在某些实施方式中，将寡聚体施用于患有背景类固醇理论的患者(例如间歇性或慢性/连续背景类固醇治疗。例如，在一些实施方式中，患者在施用反义寡聚体之前已经用皮质类固醇治疗，并且继续接受类固醇治疗。在一些实施方式中，类固醇是糖皮质激素或泼尼松。

所描述的施用途径仅作为指导，因为熟练的从业者将能够容易地确定任何特定动物和病症的最佳施用途径和任何剂量。已经尝试了多种用于在体外和体内将功能性新遗传物质引入细胞的方法(Friedmann(1989)Science，244：1275-1280)。这些方法包括将待表达的基因整合到修饰的逆转录病毒中(Friedmann(1989)同上；Rosenberg(1991)CancerResearch 51(18)，suppl.：5074S-5079S)；整合到非逆转录病毒载体(例如腺相关病毒载体)中(Rosenfeld，等人(1992)Cell，68：143-155；Rosenfeld等人(1991)Science，252：431-434)；或通过脂质体递送与异源启动子-增强子元件连接的转基因(Friedmann(1989)，同上；Brigham等人(1989)Am.J.Med.Sci.，298：278-281；Nabel等人(1990)Science，249：1285-1288；Hazinski等人(1991)Am.J.Resp.Cell Molec.Biol.，4：206-209；以及Wang和Huang(1987)Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)，84：7851-7855)；与配体特异性的、基于阳离子的转运系统相结合(Wu和Wu(1988)J.Biol.Chem.，263：14621-14624)或裸DNA、表达载体的使用(Nabel等人(1990)，同上)；Wolff等人(1990)Science，247：1465-1468)。将转基因直接注射到组织中仅产生局部表达(Rosenfeld(1992)同上)；Rosenfeld等人(1991)同上；Brigham等人(1989)同上；Nabel(1990)同上；和Hazinski等人(1991)同上)。Brigham等人小组(Am.J.Med.Sci.(1989)298：278-281和Clinical Research(1991)39(摘要))已报道了在静脉内或气管内施用DNA脂质体复合物后仅对小鼠肺进行体内转染。人类基因治疗程序的综述文章的一个示例是：Anderson，Science(1992)256：808-813。

IV.使用方法

使用外显子跳跃恢复抗肌萎缩蛋白阅读框架

由抗肌肉萎缩蛋白基因的框外突变引起的DMD治疗的潜在治疗方法由称为BMD的较轻微形式的抗肌肉萎缩蛋白病暗示，其由框内突变引起。将框外突变转换为框内突变的能力将假设保留mRNA阅读框架并产生内部缩短但功能性的抗肌肉萎缩蛋白。设计本公开的反义寡聚体以实现此目的。

PMO与靶向前mRNA序列的杂交干扰前mRNA剪接复合物的形成并从成熟mRNA中删除外显子45。本公开的反义寡聚体的结构和构象允许与互补序列的序列特异性碱基配对。通过类似的机制，例如eteplirsen设计为跳跃抗肌肉萎缩蛋白前mRNA的外显子51的PMO，允许序列特异性碱基配对抗肌肉萎缩蛋白前mRNA的外显子51中包含的互补序列。

含有全部79个外显子的正常抗肌肉萎缩蛋白mRNA将产生正常的抗肌肉萎缩蛋白。图1中的图片描绘了抗肌肉萎缩蛋白前mRNA和成熟mRNA的一小部分，从外显子47到外显子53。每个外显子的形状描绘了密码子如何在外显子之间分裂；值得注意的是，一个密码子由三个核苷酸组成。矩形外显子以完整密码子开始和结束。箭形外显子以完整的密码子开始，但以分开的密码子结束，仅包含密码子的核苷酸#1。该密码子的核苷酸#2和#3包含在随后的外显子中，其将以人字形开始。

抗肌肉萎缩蛋白mRNA缺失来自抗肌肉萎缩蛋白基因的整个外显子通常导致DMD。图2中的图片说明了一种已知导致DMD的遗传突变(外显子50的缺失)。由于外显子49以完整密码子结束并且外显子51以密码子的第二个核苷酸开始，因此外显子49之后的阅读框架移位，导致框外mRNA读取框架和在突变下游掺入不正确的氨基酸。随后缺乏功能性的C-末端抗肌肉萎缩聚糖结合结构域导致产生不稳定的抗肌肉萎缩蛋白。

Eteplirsen跳跃外显子51以恢复mRNA阅读框架。由于外显子49以完整密码子结束并且外显子52以密码子的第一个核苷酸开始，外显子51的缺失恢复了阅读框架，导致产生内部缩短的抗肌肉萎缩蛋白，其具有完整的抗肌肉萎缩聚糖结合位点，类似于“框内“BMD突变(图3)。

非临床研究支持使用外显子跳跃改善抗肌肉萎缩蛋白mRNA开放阅读框架来改善DMD表型的可行性。在DMD的肌肉萎缩动物模型中的大量研究表明，通过外显子跳跃恢复抗肌肉萎缩蛋白导致肌肉力量和功能的可靠改善(Sharp2011；Yokota 2009；Wu 2008；Wu2011；Barton-Davis 1999；Goyenvalle 2004；Gregorevic 2006；Yue 2006；Welch 2007；Kawano 2008；Reay 2008；van Putten2012)。一个引人注目的示例来自一项研究，其中将外显子跳跃(使用PMO)治疗后的抗肌肉萎缩蛋白水平与相同组织中的肌肉功能进行比较。在肌肉萎缩的mdx小鼠中，用小鼠特异性PMO治疗的胫骨前肌(TA)肌肉在应激诱导收缩后保持其最大力容量的约75％，而未治疗的对侧TA肌肉仅保持其最大力容量的约25％(p<0.05)(Sharp 2011)。在另一项研究中，3只肌肉萎缩的CXMD狗在2-5个月大时接受外显子跳跃治疗，使用PMO特异性基因突变，每周一次持续5到7周，或每隔一周一次持续22周。在外显子跳跃治疗后，所有3只狗在骨骼肌中表现出广泛的全身抗肌肉萎缩蛋白表达，以及相对于基线保持或改善的行走(15米跑步测试)。相比之下，未经治疗的年龄匹配的CXMD狗在研究过程中显示出行走的显著减少(Yokota，2009)。

在mdx小鼠和在人源化DMD(hDMD)小鼠模型两者中，PMO在等摩尔浓度下具有比硫代磷酸酯更多的外显子跳跃活性，其表达整个人DMD转录物(Heemskirk 2009)。体外实验使用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)和蛋白质印迹(WB)在正常人骨骼肌细胞或DMD患者的肌肉细胞中具有不同的突变，适合于外显子51跳跃鉴定的eteplirsen(PMO)作为强效诱导剂外显子51跳跃。在hDMD小鼠模型(Arechavala-Gomeza 2007)中已经在体内证实了Eteplirsen诱导的外显子51跳跃。

分析与人抗肌肉萎缩蛋白前mRNA的外显子45的靶区域互补并诱导外显子45跳跃的反义寡聚体的影响的临床结果包括抗肌肉萎缩蛋白阳性纤维百分比(PDPF)，六分钟步行试验(6MWT)，行走损失(LOA)，北极星动态评估(NSAA)，肺功能测试(PFT)，在没有外部支持的情况下起升能力(从仰卧位)，从头抗肌肉萎缩蛋白生产和其它功能测量。

在一些实施方式中，本公开提供了在具有适合于外显子45跳跃的抗肌肉萎缩蛋白基因突变的受试者中产生抗肌肉萎缩蛋白的方法，该方法包括向受试者施用如本文所述的反义寡聚体或其药学上可接受的盐。在某些实施方式中，本公开提供了用于恢复mRNA阅读框架以在患有杜氏肌肉萎缩症(DMD)的受试者中诱导抗肌肉萎缩蛋白产生的方法，所述受试者具有适合于外显子45跳跃的抗肌肉萎缩蛋白基因突变。蛋白质产生可以通过逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)，蛋白质印迹分析或免疫组织化学(IHC)来测量。

在一些实施方式中，本公开提供了在有需要的受试者中治疗DMD的方法，其中所述受试者具有适合于外显子45跳跃的抗肌肉萎缩蛋白基因的突变，该方法包括向受试者施用如本文所述的反义寡聚体或其药学上可接受的盐。在各种实施方式中，通过延迟疾病进展来测量受试者的治疗。在一些实施方式中，通过维持受试者的行走或减少受试者的行走损失来测量受试者的治疗。在一些实施方式中，使用6分钟步行测试(6MWT)测量行走。在某些实施方式中，使用北极星动态评估(NSAA)测量行走。

在各种实施方式中，本公开提供了用于维持患有DMD的受试者的肺功能或减少肺功能损失的方法，其中所述受试者具有适合于外显子45跳跃的DMD基因突变，该方法包括向受试者施用如本文所述的反义寡聚体或其药学上可接受的盐。在一些实施方式中，肺功能测量为最大呼气压力(MEP)。在某些实施方式中，肺功能测量为最大吸气压力(MIP)。在一些实施方式中，肺功能测量为强迫生命能力(FVC)。

研究4045-301(ESSENCE)：

研究4045-301是对DMD患者中的SRP-4045(casimersen)和SRP-4053(golodirsen)的研究。本研究是一项双盲、安慰剂对照、多中心、为期48周的研究，旨在评估SRP-4045和SRP-4053的疗效和安全性。具有通过跳跃外显子45或53可纠正的框外缺失的合格患者将被随机分配接受每周一次静脉内(IV)输注30mg/kg SRP-4045或30mg/kg SRP-4053(合并-活性组，66名患者)或安慰剂(33名患者)，持续48周。临床疗效将在定期安排的研究访问中进行评估，包括功能测试，例如六分钟步行测试。所有患者将在基线进行肌肉活检，并在研究过程中进行第二次肌肉活检。在整个研究过程中，将通过收集不良事件(AE)，实验室测试，心电图(ECG)，超声心动图(ECHO)，生命体征和体格检查来评估安全性。在整个研究期间将定期采集血样以评估两种药物的药代动力学。主要结果指标包括从基线开始的6分钟步行试验(6MWT)的变化[时间范围：基线至第48周]，次要结果指标包括抗肌肉萎缩蛋白阳性纤维的百分比[时间范围：基线至第24周和第48周的]和从基线的最大吸气压力(MIP)％预测的，最大呼气压力(MEP)％预测的变化[时间范围：基线至第48周]。有关该研究的更多详细信息，请访问www.clinicaltrials.org(NCT02500381)。

V.试剂盒

本公开还提供了用于治疗患有遗传疾病的患者的试剂盒，该试剂盒包含至少一种反义分子(例如SEQ ID NO：1-5中所示的反义寡聚体)，包装在合适的容器中，及其使用说明书。试剂盒还可以含有外周试剂，例如缓冲剂，稳定剂等。本领域普通技术人员应该理解，上述方法的应用广泛应用于鉴定适用于治疗许多其它疾病的反义分子。

实施例

尽管为了清楚理解的目的已经通过说明和实施例详细地描述了前述公开，但是根据本公开的教导，本领域普通技术人员将容易明白，可以是在不脱离所附权利要求的精神或范围的情况下对其进行某些改变和修改。以下实施例仅以说明的方式提供，而不是作为限制。本领域技术人员将容易地认识到可以改变或修改以产生基本相似结果的各种非关键参数。

材料和方法

细胞和组织培养处理条件

将人横纹肌肉瘤细胞(ATCC，CCL-136；RD细胞)以1.5×10⁶个细胞/瓶接种于组织培养物处理的T75烧瓶(Nunc)中，含24mL温热的含有L-谷氨酰胺(HyClone)的DMEM，10％胎牛血清和1％青霉素-链霉素抗生素溶液(CelGro)；24小时后，吸出培养基，在温热的PBS中洗涤细胞一次，并加入新鲜培养基。使细胞在37℃培养箱中在5.0％CO₂下生长至80％汇合，并使用胰蛋白酶收获。冻干的磷酰二胺吗啉代寡聚体(PMO)在无核酸酶的水中以约0.5至2.0mM重悬；为了验证摩尔浓度，使用NanoDrop 2000分光光度计(Thermo Scientific)测量PMO溶液。根据制造商的说明书和SG试剂盒(Lonza)，使用核转染将PMO递送至RD细胞。如所示以各种浓度测试PMO(例如2.5，5，10，12.5，20和25微摩尔)。将细胞在核转染后以12或24孔板(n＝2或3)的每孔约2-3×10⁵个细胞温育24小时，然后如下所述进行RNA提取。

RNA提取和PCR扩增

使用来自GE Healthcare的RNAspin 96孔RNA分离试剂盒从PMO处理的细胞(RD细胞或原代人成肌细胞)中提取RNA，并使用标准技术和以下引物对进行巢式RT-PCR。外引物：正向5'-CAATGCTCCTGACCTCTGTGC-3'(SEQ ID NO：6)，反向5'-GCTCTTTTCCAGGTTCAAGTGG-3'(SEQ ID NO：7)；内引物：正向5'-GTCTACAACAAAGCTCAGGTCG-3'(SEQ ID NO：8)，反向5'-GCAATGTTATCTGCTTCCTCCAACC-3'(SEQ ID NO：9)。通过Cy5标记的丙烯酰胺凝胶电泳的密度测定法测量外显子跳跃。外显子跳跃的百分比(即外显子跳跃的产物相对于全长PCR产物的条带强度)通过在校正长度的原始信号强度和每个条带中预期的GC含量之后量化跳跃和未跳跃的条带的强度来计算。预期的PCR产物如下表所示：

	bp	％GC
			未跳跃的	571	40.8
跳跃的	395	38.5

外显子跳跃活性计算为跳跃和未跳跃的预期产品的总强度的百分比。

用改进的亚基间连接制备吗啉代亚基，PMO和PMO

方案1：PMO亚基的一般合成途径

参考方案1，其中B代表碱基配对部分，吗啉代亚基可以由相应的核糖核苷(1)制备，如图所示。吗啉代亚基(2)可任选地通过与合适的保护基前体(例如三苯甲基氯)反应来保护。通常在固态寡聚体合成期间除去3'保护基团，如下面更详细描述的。碱基配对部分可以适当地保护固相寡聚体合成。合适的保护基包括腺嘌呤和胞嘧啶的苯甲酰，鸟嘌呤的苯乙酰基和次黄嘌呤的新戊酰氧基甲基(I)。新戊酰氧基甲基可以引入次黄嘌呤杂环碱基的N1位置。尽管可以使用未受保护的次黄嘌呤亚基，但是当碱基被保护时，活化反应的产率要高得多。其它合适的保护基团包括美国专利号8,076,476中公开的那些，其通过引用整体并入本文。

3与活化磷化合物4的反应产生具有所需连接部分的吗啉代亚基5。

结构4的化合物可使用本领域技术人员已知的许多方法制备。然后如上所述进行与吗啉代部分的偶联。

结构5的化合物可用于固相寡聚体合成，以制备包含亚基间连接的寡聚体。这些方法在本领域中是公知的。简而言之，结构5的化合物可以在5'末端修饰以含有与固体支持物的接头。一旦被支持，去除5的保护基团(例如3'末端的三苯甲基)，并使游离胺与结构5的第二化合物的活化磷部分反应。重复该序列直至获得所需长度的寡核苷酸。如果需要3'修饰，则末端3'端的保护基团可以被除去或保留。可以使用任何数量的方法从固体支持物中除去寡聚体，或用碱处理以裂解与固体支持物的连接。

本公开的一般吗啉代寡聚体和特定吗啉代寡聚体的制备在实施例中更详细地描述。

实施例1

吗啉代寡聚体的制备

根据方案2，使用以下方案进行本公开化合物的制备：

方案2：活化尾酸的制备

三苯甲基哌嗪苯基氨基甲酸酯35的制备：向冷却的化合物11的二氯甲烷(6mL/g11)悬浮液中加入碳酸钾(3.2当量)的水(4mL/g碳酸钾)溶液。向该两相混合物中缓慢加入氯甲酸苯酯(1.03当量)的二氯甲烷溶液(2g/g氯甲酸苯酯)。将反应混合物温热至20℃。反应完成后(1-2小时)，分离各层。用水洗涤有机层，并用无水碳酸钾干燥。通过从乙腈中结晶分离产物35。

氨基甲酸酯醇36的制备：将氢化钠(1.2当量)悬浮在1-甲基-2-吡咯烷酮(32mL/g氢化钠)中。向该悬浮液中加入三甘醇(10.0当量)和化合物35(1.0当量)。将所得浆液加热至95℃。反应完成后(1-2小时)，将混合物冷却至20℃。向该混合物中加入30％二氯甲烷/甲基叔丁基醚(v：v)和水。依次用NaOH水溶液，琥珀酸水溶液和饱和氯化钠水溶液洗涤含产物的有机层。通过从二氯甲烷/甲基叔丁基醚/庚烷中结晶分离产物36。

尾酸37的制备：向化合物36的四氢呋喃(7mL/g 36)溶液中加入琥珀酸酐(2.0当量)和DMAP(0.5当量)。将混合物加热至50℃。反应完成后(5小时)，将混合物冷却至20℃并用NaHCO₃水溶液调节至pH 8.5。加入甲基叔丁基醚，将产物萃取到水层中。加入二氯甲烷，用柠檬酸水溶液将混合物调节至pH 3。含有产物的有机层用pH＝3的柠檬酸盐缓冲液和饱和氯化钠水溶液的混合物洗涤。在制备化合物38时，不经分离使用该37的二氯甲烷溶液。

38的制备：向化合物37的溶液中加入N-羟基-5-降冰片烯-2,3-二羧酸酰亚胺(HONB)(1.02当量)，4-二甲基氨基吡啶(DMAP)(0.34当量)，然后1-(3-二甲基氨基丙基)-N'-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)(1.1当量)。将混合物加热至55℃。反应完成后(4-5小时)，将混合物冷却至20℃并依次用1:10.2M柠檬酸/盐水和盐水洗涤。将二氯甲烷溶液与丙酮进行溶剂交换，然后与N,N-二甲基甲酰胺进行溶剂交换，通过从丙酮/N,N-二甲基甲酰胺中沉淀到饱和氯化钠水溶液中分离产物。将粗产物在水中重新浆化数次，以除去残留的N,N-二甲基甲酰胺和盐。

通过用于在固相合成期间结合亚基的程序，在二甲基咪唑烷酮(DMI)中进行将活化“尾部”引入到载荷树脂上。

方案3：用于合成吗啉代寡聚体的固体载体的制备

该程序在硅烷化的夹套肽容器(ChemGlass，NJ，USA)中进行，该容器具有粗孔隙率(40-60μm)玻璃料，顶置式搅拌器和三通Teflon旋塞阀，以允许N2通过玻璃料鼓泡或真空抽气。

以下步骤中的树脂处理/洗涤步骤包括两种基本操作：树脂流化或搅拌床反应器和溶剂/溶液萃取。对于树脂流化，将活塞定位成允许N2向上流过玻璃料，并将指定的树脂处理/洗涤加入反应器中并使其渗透并完全润湿树脂。然后开始混合并将树脂浆料混合指定的时间。对于溶剂/溶液萃取，停止混合和N2流动并启动真空泵，然后定位旋塞以允许将树脂处理/洗涤排出到废物中。除非另有说明，否则所有树脂处理/洗涤体积均为15mL/g树脂。

在硅烷化的夹套肽容器中向氨甲基聚苯乙烯树脂(100-200目；基于氮置换的～1.0mmol/g负载；75g，1当量，Polymer Labs，UK，part#1464-X799)中加入1-甲基-2-吡咯烷酮(NMP；20ml/g树脂)，并使树脂在搅拌下溶胀1-2小时。在抽空溶胀溶剂后，用二氯甲烷(2×1-2分钟)，5％二异丙基乙胺的25％异丙醇/二氯甲烷溶液(2×3-4分钟)和二氯甲烷(2×1-2分钟)洗涤树脂。抽真空后，用二硫化物锚34的1-甲基-2-吡咯烷酮(0.17M；15mL/g树脂，～2.5当量)溶液处理树脂，并将树脂/试剂混合物加热至45℃达60小时。反应完成后，停止加热，抽空锚固溶液，用1-甲基-2-吡咯烷酮(4×3-4分钟)和二氯甲烷(6×1-2分钟)洗涤树脂。将树脂用10％(v/v)二碳酸二乙酯的二氯甲烷溶液(16mL/g；2×5-6min)处理，然后用二氯甲烷(6×1-2min)洗涤。将树脂39在N2流下干燥1-3小时，然后真空干燥至恒重(±2％)。产率：原树脂重量的110-150％。

氨甲基聚苯乙烯-二硫化物树脂的负载的测定：树脂的负载(潜在可用的反应性位点的数量)通过对每克树脂的三苯基甲基(三苯甲基)基团数量的光谱测定法来确定。

将已知重量的干燥树脂(25±3mg)转移到硅烷化的25ml容量瓶中，加入～5mL 2％(v/v)三氟乙酸的二氯甲烷溶液。通过轻轻旋转混合内容物，然后静置30分钟。用另外的2％(v/v)三氟乙酸的二氯甲烷溶液将体积升至25mL并充分混合内容物。使用正位移移液管，将等分试样的含三苯甲基的溶液(500μL)转移至10mL容量瓶中，用甲磺酸将体积升至10mL。

最终溶液中的三苯甲基阳离子含量通过在431.7nm处的UV吸光度和使用适当体积，稀释度，消光系数(ε：41μmol-1cm-1)和树脂重量以每克树脂的三苯甲基基团计算的树脂负载(μmol/g)来测量。一式三份进行测定并计算平均负载。

该实施例中的树脂负载程序将对树脂提供约500μmol/g的负载。如果二硫化物锚固结合步骤在室温下进行24小时，则获得300-400μmol/g的负载。

尾部负载：使用与制备氨甲基聚苯乙烯-二硫化物树脂相同的设置和体积，可将尾部引入固体载体中。首先将锚固树脂在酸性条件下脱保护，并在偶联之前将所得材料中和。对于偶联步骤，使用38(0.2M)的含有4-乙基吗啉(NEM，0.4M)的DMI溶液代替二硫化物锚定溶液。在45℃下2小时后，将树脂39用5％二异丙基乙胺的25％异丙醇/二氯甲烷溶液洗涤两次并用DCM洗涤一次。向树脂中加入苯甲酸酐(0.4M)和NEM(0.4M)的溶液。25分钟后，将反应器夹套冷却至室温，用5％二异丙基乙胺的25％异丙醇/二氯甲烷溶液洗涤树脂两次，用DCM洗涤8次。过滤树脂40并在高真空下干燥。树脂40的负载定义为在尾部负载中使用的原始氨甲基聚苯乙烯-二硫化物树脂39的负载。

固相合成：在2mL Gilson聚丙烯反应柱(部件号3980270)中，在Gilson AMS-422自动化肽合成仪上制备吗啉代寡聚体。当柱子置于合成器上时，在柱子周围放置一个带有水流通道的铝块。AMS-422可选择添加试剂/洗涤溶液，保持指定时间，并使用真空抽空色谱柱。

对于长度最多约25个亚基的寡聚体，优选负载接近500μmol/g树脂的氨甲基聚苯乙烯-二硫化物树脂。对于较大的寡聚体，优选负载300-400μmol/g树脂的氨甲基聚苯乙烯-二硫化物树脂。如果需要具有5'-尾部的分子，则选择具有相同负载指南的已负载尾部的树脂。

制备以下试剂溶液：

·脱三苯甲基化溶液：10％氰基乙酸(w/v)的4：1二氯甲烷/乙腈溶液；

·中和溶液：5％二异丙基乙胺的3：1二氯甲烷/异丙醇溶液；

·偶联溶液：0.18M(或对于长度超过20个亚基的寡聚体为0.24M)所需碱基和连接类型的活化吗啉代亚基和0.4M N-乙基吗啉的1,3-二甲基咪唑烷酮溶液。

使用二氯甲烷(DCM)作为分离不同试剂溶液洗涤的过渡洗涤液。

在合成器上，将嵌段设定为42℃，向每个含有30mg氨甲基聚苯乙烯-二硫化物树脂(或尾部树脂)的柱中加入2mL 1-甲基-2-吡咯烷酮，并使其在室温下静置30分钟。用2mL二氯甲烷洗涤2次后，采用以下合成循环：

将各个寡聚体的序列编程到合成仪中，使得每个柱以适当的顺序接收适当的偶联溶液(A，C，G，T，I)。当柱中的寡聚体完成其最终亚基的掺入时，将柱从挡板中取出，并用含有0.89M 4-乙基吗啉的4-甲氧基三苯基甲基氯(0.32M，在DMI中)所组成的偶联溶液手动进行最终循环。

从树脂裂解并除去碱基和骨架保护基：甲氧基三苯甲基化后，用2mL 1-甲基-2-吡咯烷酮洗涤树脂8次。加入1mL由0.1M 1,4-二硫苏糖醇(DTT)和0.73M三乙胺的1-甲基-2-吡咯烷酮组成的裂解溶液，盖上柱子，并使其在室温下静置30分钟。此后，将溶液倒入12mLWheaton小瓶中。用300μL裂解溶液洗涤大大收缩的树脂两次。向溶液中加入4.0mL浓氨水(储存在-20℃)，小瓶盖紧(用Teflon衬里的螺旋盖)，旋转混合物以混合溶液。将小瓶置于45℃烘箱中16-24小时，以实现碱基和骨架保护基的切割。

粗产物纯化：将瓶装的氨解溶液从烘箱中取出并冷却至室温。将溶液用20mL0.28％氨水稀释，并通过含有Macroprep HQ树脂(BioRad)的2.5×10cm柱。使用盐梯度(A：0.28％氨与B：1M氯化钠在0.28％氨中；0-100％B在60分钟内)洗脱含甲氧基三苯甲基的峰。将结合的级分合并，并根据所需产物进一步处理。

吗啉代寡聚体的脱甲氧基三苯甲基化：将来自Macroprep纯化的合并级分用1MH₃PO₄处理以将pH降低至2.5。初始混合后，样品在室温下静置4分钟，此时用2.8％氨/水将它们中和至pH 10-11。通过固相萃取(SPE)纯化产物。

SPE柱填料和调节：将Amberchrome CG-300M(Rohm和Haas；Philadelphia，PA)(3mL)装入20mL烧结柱(BioRad Econo-Pac Chromatography Columns(732-1011))中，并用3mL以下物质冲洗树脂：0.28％NH₄OH/80％乙腈；0.5M NaOH/20％乙醇；水；50mM H₃PO₄/80％乙腈；水；0.5NaOH/20％乙醇；水；0.28％NH₄OH。

SPE纯化：将来自脱甲氧基三苯甲基化的溶液上样到柱上，并用3-6mL0.28％氨水冲洗树脂三次。将Wheaton小瓶(12mL)置于柱下，通过用2mL45％乙腈的0.28％氨水溶液洗涤两次以洗脱产物。

产物分离：将溶液在干冰中冷冻，将小瓶置于冷冻干燥器中以产生蓬松的白色粉末。将样品溶解在水中，使用注射器通过0.22微米过滤器(Pall Life Sciences，Acrodisc25mm注射过滤器，具有0.2微米HT Tuffryn膜)过滤，并在UV分光光度计上测量光密度(OD)以确定存在的寡聚体的OD单位，以及分配样品用于分析。然后将溶液放回Wheaton小瓶中进行冻干。

通过MALDI分析吗啉代寡聚体：使用MALDI-TOF质谱法测定纯化中级分的组成，并提供寡聚体的同一性(分子量)的证据。在用3,5-二甲氧基-4-羟基肉桂酸(芥子酸)，3,4,5-三羟基苯乙酮(THAP)或α-氰基-4-羟基肉桂酸(HCCA)的溶液稀释后，将样品作为基质进行操作。

实施例2

使用实施例1中描述的方案，合成以下PMO并用于实施例中。

其中从1至26的每个Nu和5'至3'是：

其中A是C是G是并且T是

HPLC：78.60％；条件：Dionex DNAPac(DNX#97)梯度：0分钟时75％A+20％B+5％C；20分钟时50％A；21分钟时25％A+75％C；流动相A：10mM NaOH/20mM NaCl；C：10mM NaOH/0.5M NaCL。柱温：45℃；流速1.0mL/min。

MALDI质谱证实质量：8908.2

实施例3

使用实施例1中描述的方案，合成以下PMO并用于实施例中。

其中从1至22的每个Nu和5'至3'是：

其中A是C是G是并且T是

HPLC：71.85％；条件：Dionex DNAPac(DNX#97)梯度：0分钟时75％A+20％B+5％C；20分钟时50％A；21分钟时25％A+75％C；流动相A：10mM NaOH/20mM NaCl；C：10mM NaOH/0.5M NaCL。柱温：45℃；流速1.0mL/min。

MALDI质谱证实质量：7588.39

实施例4

使用实施例1中描述的方案，合成以下PMO并用于实施例中。

其中从1至25的每个Nu和5'至3'是：

其中A是C是G是并且T是

HPLC：78.00％；条件：Dionex DNAPac(DNX#97)梯度：0分钟时75％A+20％B+5％C；20分钟时50％A；21分钟时25％A+75％C；流动相A：10mM NaOH/20mM NaCl；C：10mM NaOH/0.5M NaCL。柱温：45℃；流速1.0mL/min。

MALDI质谱证实质量：8623.84

实施例5

使用实施例1中描述的方案，合成以下PMO并用于实施例中。

其中从1至28的每个Nu和5'至3'是：

其中A是C是G是并且T是

HPLC：71.84％；条件：Dionex DNAPac(DNX#97)梯度：0分钟时75％A+20％B+5％C；20分钟时50％A；21分钟时25％A+75％C；流动相A：10mM NaOH/20mM NaCl；C：10mM NaOH/0.5M NaCL。柱温：45℃；流速1.0mL/min。

MALDI质谱证实质量：9616.50

实施例6

使用实施例1中描述的方案，合成以下PMO并用于实施例中。

其中从1至28的每个Nu和5'至3'是：

其中A是C是G是并且T是

HPLC：75.15％；条件：Dionex DNAPac(DNX#97)梯度：0分钟时75％A+20％B+5％C；20分钟时50％A；21分钟时25％A+75％C；流动相A：10mM NaOH/20mM NaCl；C：10mM NaOH/0.5M NaCL。柱温：45℃；流速1.0mL/min。

MALDI质谱证实质量：9593.64

实施例7

使用实施例1中描述的方案，合成以下PMO并用于实施例中。

其中从1至30的每个Nu和5'至3'是：

其中A是C是G是并且T是

MALDI质谱证实质量：10271.39

实施例8

外显子45跳跃

制备实施例2-6中描述的一系列反义寡聚体，其如下表所述靶向人抗肌肉萎缩蛋白外显子45，并评估诱导外显子45跳跃的能力。

具体地，人横纹肌肉瘤细胞用于确定化合物1-5在不同浓度(即12.5μm，2.5μm，0.5μm和0.25μm)下诱导外显子45跳跃的能力。在核转染后二十四小时，收集RNA并进行巢式RT-PCR。使用Cy5标记的丙烯酰胺凝胶电泳分析样品并计算外显子跳跃百分比。结果如下表所示：

结果表明了在所有测试的PMO中外显子45跳跃水平的剂量反应。令人惊讶的是，相对于其它测试的PMO，化合物2在12.5μm和2.5μm浓度下诱导了最高百分比的外显子45跳跃。特别地，化合物2在12.5μm浓度下诱导了比化合物6多82％的外显子45跳跃。

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本说明书中引用的所有出版物和专利申请均通过引用并入本文，如同每个单独的出版物或专利申请被具体和单独地指出通过引用并入。

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序列表

<u>说明</u>	<u>序列</u>	<u>SEQ ID NO</u>
			H45A(-06+20)	CCAATGCCATCCTGGAGTTCCTGTAA	1
H45A(-03+19)	CAATGCCATCCTGGAGTTCCTG	2
			H45A(-09+16)	TGCCATCCTGGAGTTCCTGTAAGAT	3
H45A(-09+19)	CAATGCCATCCTGGAGTTCCTGTAAGAT	4
			H45A(-12+16)	TGCCATCCTGGAGTTCCTGTAAGATACC	5
外正向引物	CAATGCTCCTGACCTCTGTGC	6
			外反向引物	GCTCTTTTCCAGGTTCAAGTGG	7
内正向引物	GTCTACAACAAAGCTCAGGTCG	8
			内反向引物	GCAATGTTATCTGCTTCCTCCAACC	9
hE45CMC(-12+18)	AATGCCATCCTGGAGTTCCTGTAAGATACC	10

。

Claims

1.一种式(I)的反义寡聚体：

或其药学上可接受的盐，其中：

每个Nu是核碱基，它们一起形成靶向序列；

Z是20至26的整数；

T是选自以下的部分：

其中R³是C₁-C₆烷基；并且

R²选自H、乙酰基、三苯甲基和4-甲氧基三苯甲基，

其中所述靶向序列与选自由H45A(-06+20)、H45A(-03+19)、H45A(-09+16)、H45A(-09+19)和H45A(-12+16)组成的群组中的外显子45靶区域互补。

2.根据权利要求1所述的反义寡聚体，其中，所述靶向序列选自：

a)SEQ ID NO:1(5'-CCAATGCCATCCTGGAGTTCCTGTAA-3')，其中Z是24；

b)SEQ ID NO:2(5'-CAATGCCATCCTGGAGTTCCTG-3')，其中Z是20；

c)SEQ ID NO:3(5'-TGCCATCCTGGAGTTCCTGTAAGAT-3')，其中Z是23；

d)SEQ ID NO:4(5'-CAATGCCATCCTGGAGTTCCTGTAAGAT-3')，其中Z是26；以及

e)SEQ ID NO:5(5'-TGCCATCCTGGAGTTCCTGTAAGATACC-3')，其中Z是26。

3.根据权利要求1或2所述的反义寡聚体，其中，T是：

4.根据权利要求1至3中任一项所述的反义寡聚体，其中，R²是H。

5.根据权利要求1至4中任一项所述的反义寡聚体，其中，Z是24。

6.根据权利要求1至4中任一项所述的反义寡聚体，其中，Z是20。

7.根据权利要求1至4中任一项所述的反义寡聚体，其中，Z是23。

8.根据权利要求1至4中任一项所述的反义寡聚体，其中，Z是26。

9.根据权利要求1至4中任一项所述的反义寡聚体，其中，所述靶向序列是SEQ ID NO:1(5'-CCAATGCCATCCTGGAGTTCCTGTAA-3')并且Z是24。

10.根据权利要求1至4中任一项所述的反义寡聚体，其中，所述靶向序列是SEQ ID NO:2(5'-CAATGCCATCCTGGAGTTCCTG-3')并且Z是20。

11.根据权利要求1至4中任一项所述的反义寡聚体，其中，所述靶向序列是SEQ ID NO:3(5'-TGCCATCCTGGAGTTCCTGTAAGAT-3')并且Z是23。

12.根据权利要求1至4中任一项所述的反义寡聚体，其中，所述靶向序列是SEQ ID NO:4(5'-CAATGCCATCCTGGAGTTCCTGTAAGAT-3')并且Z是26。

13.根据权利要求1至4中任一项所述的反义寡聚体，其中，所述靶向序列是SEQ ID NO:5(5'-TGCCATCCTGGAGTTCCTGTAAGATACC-3')并且Z是26。

14.根据权利要求1所述的反义寡聚体，其选自由以下组成的群组：

其中从1至26的每个Nu和5'至3'是：

和

其中从1至22的每个Nu和5'至3'是：

和

其中从1至25的每个Nu和5'至3'是：

和

其中从1至28的每个Nu和5'至3'是：

和

其中从1至28的每个Nu和5'至3'是：

其中，对于化合物1至5的每一个，A是C是G是并且T是

15.根据权利要求1所述的反义寡聚体，其选自：

其中从1至22的每个Nu和5'至3'是：

16.一种药物组合物，其包含根据权利要求1至15中任一项所述的反义寡聚体和药学上可接受的载体。

17.根据权利要求1至15中任一项所述的反义寡聚体在制备用于治疗有需要的受试者的杜氏肌肉萎缩症(DMD)或产生抗肌肉萎缩蛋白的药物中的用途，其中，所述受试者具有适合于外显子45跳跃的抗肌肉萎缩蛋白基因的突变。