JP2022511055A - 筋ジストロフィーに対するエクソンスキッピングオリゴマーコンジュゲート - Google Patents

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Abstract

エクソン５０スキッピングを誘導するためにヒトジストロフィン遺伝子において選択された標的部位に相補的なアンチセンスオリゴマーが記載される。様々な態様において、アンチセンスオリゴマーは、式（Ｉ）に従って記載されるか、TIFF2022511055000202.tif13687またはその薬学的に許容される塩であり、Ｔ、Ｎｕ、ｎ、およびＲ１００は、本明細書に定義される。

Description

関連出願
本出願は、２０１８年１２月１３日に出願された米国仮出願第６２／７７９，０２８号に対する優先権を主張する。上記の出願の教示全体は、参照によりそれらの全体が組み込まれる。
ＥＦＳ－ＷＥＢを介して電子的に提出された配列表への言及
本明細書と同時に出願された電子的に提出された配列表（名称：８１７１＿５０＿ＷＯ００＿ＳＬ．ｔｘｔ、サイズ：１０，０８０バイト、作成日：２０１９年１１月６日）の内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
本開示は、ヒトジストロフィン遺伝子におけるエクソン５０スキッピングに好適な新規のアンチセンスオリゴマーおよびその医薬組成物に関する。本開示はまた、新規のアンチセンスオリゴマーを使用してエクソン５０スキッピングを誘導するための方法、エクソン５０スキッピングに適しているジストロフィン遺伝子の変異を有する対象においてジストロフィンを産生するための方法、およびエクソン５０スキッピングに適しているジストロフィン遺伝子の変異を有する対象を治療するための方法も提供する。
デュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）は、タンパク質ジストロフィンの発現の欠陥によって引き起こされる。タンパク質をコードする遺伝子は、ＤＮＡの２００万を超えるヌクレオチドにわたって拡散された７９個のエクソンを含有する。エクソンのリーディングフレームを変化させるか、または停止コドンを導入するか、または全アウトオブフレームエクソン（複数可）の除去もしくは１つ以上のエクソンの重複を特徴とする、任意のエクソンの変異は、機能性ジストロフィンの産生を妨げ、ＤＭＤをもたらす可能性がある。
変異、典型的には１つ以上のエクソンの欠失が、全ジストロフィン転写物に沿った正しいリーディングフレームをもたらし、これにより、ｍＲＮＡのタンパク質への翻訳が早期に終結されない場合、より重症度の低い形態の筋ジストロフィーであるベッカー型筋ジストロフィー（ＢＭＤ）が生じることが分かっている。変異ジストロフィンプレｍＲＮＡのプロセシングにおける上流エクソンと下流のエクソンの結合が、遺伝子の正しいリーディングフレームを維持する場合、結果は、ある程度の活性を保持する短い内部欠失を有するタンパク質をコードするｍＲＮＡであり、ベッカー表現型がもたらされる。
ジストロフィンを産生し、ＤＭＤを治療するための治療方法に有用である、エクソン５０スキッピングに好適なアンチセンスオリゴマーおよび対応する医薬組成物のニーズが存在する。
アンチセンスオリゴマー、またはその薬学的に許容される塩は、選択された標的に結合してヒトジストロフィン遺伝子においてエクソンスキッピングを誘導することができ、アンチセンスオリゴマーは、アニーリング部位として指定されるジストロフィンプレｍＲＮＡのエクソン５０標的領域に相補的である塩基の配列を含み、塩基配列およびアニーリング部位は、以下から選択され、
Figure 2022511055000002
Ｔは、チミンまたはウラシルである。一態様において、各Ｔは、チミンである。
いくつかの実施形態において、１～ｎ個の各Ｎｕは、５’から３’に、以下：配列番号：１、配列番号：３、配列番号：４、配列番号：５、配列番号：６、配列番号：７、配列番号：８、または配列番号：９のうちの１つにおける核酸塩基に対応する。いくつかの実施形態において、１～ｎ個の各Ｎｕは、５’から３’に、配列番号：３における核酸塩基に対応する。
一態様において、アンチセンスオリゴマーは、アンチセンスオリゴマーの５’末端に結合されたＴ部分を含有し、Ｔ部分は、以下から選択される。
Figure 2022511055000003
ある特定の実施形態において、アンチセンスオリゴマーは、１個以上の細胞膜透過性ペプチド（本明細書では「ＣＰＰ」と呼称される）にコンジュゲートされる。ある特定の実施形態において、１個以上のＣＰＰは、アンチセンスオリゴマーの末端に結合される。ある特定の実施形態において、少なくとも１個のＣＰＰは、アンチセンスオリゴマーの５’末端に結合される。ある特定の実施形態において、少なくとも１個のＣＰＰは、アンチセンスオリゴマーの３’末端に結合される。ある特定の実施形態において、第１のＣＰＰは、アンチセンスオリゴマーの５’末端に結合され、第２のＣＰＰは、アンチセンスオリゴマーの３’末端に結合される。
いくつかの実施形態において、ＣＰＰは、アルギニンリッチペプチドである。「アルギニンリッチ」という用語は、少なくとも２個、好ましくは２、３、４、５、６、７、または８個のアルギニン残基を有するＣＰＰを指し、各々が任意に１個以上の非荷電疎水性残基によって分離され、任意に約６～１４個のアミノ酸残基を含有する。以下に説明されるように、ＣＰＰは、好ましくは、そのカルボキシ末端でリンカーを介してアンチセンスオリゴヌクレオチドの３’および／または５’末端に連結され、リンカーはまた、１個以上のアミノ酸であり得、かつ好ましくは、Ｈ、アシル、アセチル、ベンゾイル、またはステアロイルから選択されるＲａを含む置換基Ｒａによってそのアミノ末端でキャッピングされる。いくつかの実施形態において、Ｒａは、アセチルである。
以下の表に見られるように、本明細書で使用するためのＣＰＰの非限定的な例としては、－（ＲＸＲ）４－Ｒａ（配列番号：１５）、－Ｒ－（ＦＦＲ）３－Ｒａ（配列番号：１６）、－Ｂ－Ｘ－（ＲＸＲ）４－Ｒａ（配列番号：１７）、－Ｂ－Ｘ－Ｒ－（ＦＦＲ）３－Ｒａ（配列番号：１８）、－ＧＬＹ－Ｒ－（ＦＦＲ）３－Ｒａ（配列番号：１９）、－ＧＬＹ－Ｒ５－Ｒａ（配列番号：２０）、－Ｒ５－Ｒａ（配列番号：２１）、－ＧＬＹ－Ｒ６－Ｒａ（配列番号：１１）、および－Ｒ６－Ｒａ（配列番号：１０）が挙げられ、式中、Ｒａは、Ｈ、アシル、アセチル、ベンゾイル、およびステアロイルから選択され、Ｒは、アルギニンであり、Ｘは、６－アミノヘキサン酸であり、Ｂは、β－アラニンであり、Ｆは、フェニルアラニンであり、ＧＬＹ（またはＧ）は、グリシンである。ＣＰＰ「Ｒ５（配列番号：２１）」は、アミド結合を介して一緒に連結された５個のアルギニン残基のペプチドを示すことを意味する（単一の置換基、例えば、Ｒ５（配列番号：２１）ではない）。ＣＰＰ「Ｒ６（配列番号：１０）」は、アミド結合を介して一緒に連結された６個のアルギニン残基のペプチドを示すことを意味する（単一の置換基、例えば、Ｒ６（配列番号：１０）ではない）いくつかの実施形態において、Ｒａは、アセチルである。
例示的なＣＰＰを表１（配列番号：１０、１１、および１５～２１）に示す。
Figure 2022511055000004
ＣＰＰ、それらの合成、およびオリゴマーにコンジュゲートする方法は、米国出願公開第ＵＳ２０１２／０２８９４５７号、ならびに国際特許出願公開第ＷＯ２００４／０９７０１７号、同第ＷＯ２００９／００５７９３号、および同第ＷＯ２０１２／１５０９６０号にさらに記載されており、これらの開示は、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。
いくつかの実施形態において、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＣＰＰとリンカーの組み合わせとして定義される置換基「Ｚ」を含む。リンカーは、そのカルボキシ末端でＣＰＰをオリゴヌクレオチドの３’末端および／または５’末端に架橋する。様々な実施形態において、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、オリゴマーの３’末端に連結された１個のＣＰＰのみを含み得る。他の実施形態において、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、オリゴマーの５’末端に連結された１個のＣＰＰのみを含み得る。
Ｚ内のリンカーは、例えば、１、２、３、４、または５個のアミノ酸を含み得る。
特定の実施形態において、Ｚは、以下から選択され、
－Ｃ（Ｏ）（ＣＨ２）５ＮＨ－ＣＰＰ、
－Ｃ（Ｏ）（ＣＨ２）２ＮＨ－ＣＰＰ、
－Ｃ（Ｏ）（ＣＨ２）２ＮＨＣ（Ｏ）（ＣＨ２）５ＮＨ－ＣＰＰ、
－Ｃ（Ｏ）ＣＨ２ＮＨ－ＣＰＰ、および以下の式：
Figure 2022511055000005
 式中、ＣＰＰは、ＣＰＰカルボキシ末端でのアミド結合によってリンカー部分に結合される。
様々な実施形態において、ＣＰＰは、本明細書に記載され、かつ表１に示される、アルギニンリッチペプチドである。様々な実施形態において、アルギニンリッチＣＰＰは、－Ｒ５－Ｒａ（すなわち、５個のアルギニン残基、配列番号：２１）であり、式中、Ｒａは、Ｈ、アシル、アセチル、ベンゾイル、およびステアロイルから選択される。ある特定の実施形態において、Ｒａは、アセチルである。様々な実施形態において、ＣＰＰは、配列番号：２１であり、リンカーは、－Ｃ（Ｏ）（ＣＨ２）５ＮＨ－、－Ｃ（Ｏ）（ＣＨ２）２ＮＨ－、－Ｃ（Ｏ）（ＣＨ２）２ＮＨＣ（Ｏ）（ＣＨ２）５ＮＨ－、－Ｃ（Ｏ）ＣＨ２ＮＨ－、および
Figure 2022511055000006
 からなる群から選択される。
いくつかの実施形態において、リンカーは、１、２、３、４、または５個のアミノ酸を含む。
いくつかの実施形態において、ＣＰＰは、配列番号：２１であり、リンカーは、Ｇｌｙである。いくつかの実施形態において、ＣＰＰは、配列番号：２０である。
ある特定の実施形態において、アルギニンリッチＣＰＰは、－Ｒ６－Ｒａ（すなわち、６個のアルギニン残基、配列番号：１０）であり、式中、Ｒａは、Ｈ、アシル、アセチル、ベンゾイル、およびステアロイルから選択される。ある特定の実施形態において、Ｒａは、アセチルである。様々な実施形態において、ＣＰＰは、配列番号：１０、１５、または１６から選択され、リンカーは、－Ｃ（Ｏ）（ＣＨ２）５ＮＨ－、－Ｃ（Ｏ）（ＣＨ２）２ＮＨ－、－Ｃ（Ｏ）（ＣＨ２）２ＮＨＣ（Ｏ）（ＣＨ２）５ＮＨ－、
－Ｃ（Ｏ）ＣＨ２ＮＨ－、および
Figure 2022511055000007
 からなる群から選択される。
いくつかの実施形態において、リンカーは、１、２、３、４、または５個のアミノ酸を含む。
いくつかの実施形態において、ＣＰＰは、配列番号：１０であり、リンカーは、Ｇｌｙである。いくつかの実施形態において、ＣＰＰは、配列番号：１１である。
ある特定の実施形態において、Ｚは、オリゴマーの５’および／または３’末端で本開示のアンチセンスオリゴマーに共有結合している－Ｃ（Ｏ）ＣＨ２ＮＨ－Ｒ６－Ｒａ（「Ｒ６」は、配列番号：１０として開示される）であり、式中、Ｒａは、Ｈ、アシル、アセチル、ベンゾイル、またはステアロイルであり、Ｒ６のアミノ末端をキャップする（配列番号：１０）。ある特定の実施形態において、Ｒａは、アセチルである。これらの非限定的な例において、ＣＰＰは、－Ｒ６－Ｒａ（配列番号：１０）であり、リンカーは、－Ｃ（Ｏ）ＣＨ２ＮＨ－（すなわち、ＧＬＹ）である。Ｚ＝－Ｃ（Ｏ）ＣＨ２ＮＨ－Ｒ６－Ｒａ（「Ｒ６」は、配列番号：１０として開示される）のこの特定の例はまた、以下の構造によって例示され、
Figure 2022511055000008
 式中、Ｒａは、Ｈ、アシル、アセチル、ベンゾイル、およびステアロイルから選択される。いくつかの実施形態において、Ｒａは、アセチルである。
様々な実施形態において、ＣＰＰは、－Ｒ６－Ｒａ（配列番号：１０）であり、以下の式としても例示され、
Figure 2022511055000009
 式中、Ｒａは、Ｈ、アシル、アセチル、ベンゾイル、およびステアロイルから選択される。ある特定の実施形態において、ＣＰＰは、配列番号：１１である。いくつかの実施形態において、Ｒａは、アセチルである。
いくつかの実施形態において、ＣＰＰは、－（ＲＸＲ）４－Ｒａ（配列番号：１５）であり、以下の式としても例示される。
Figure 2022511055000010
様々な実施形態において、ＣＰＰは、－Ｒ－（ＦＦＲ）３－Ｒａ（配列番号：１６）であり、以下の式としても例示される。
Figure 2022511055000011
様々な実施形態において、Ｚは、以下から選択され、
－Ｃ（Ｏ）（ＣＨ２）５ＮＨ－ＣＰＰ、
－Ｃ（Ｏ）（ＣＨ２）２ＮＨ－ＣＰＰ、
－Ｃ（Ｏ）（ＣＨ２）２ＮＨＣ（Ｏ）（ＣＨ２）５ＮＨ－ＣＰＰ、
－Ｃ（Ｏ）ＣＨ２ＮＨ－ＣＰＰ、および以下の式：
Figure 2022511055000012
 式中、ＣＰＰは、ＣＰＰカルボキシ末端でのアミド結合によってリンカー部分に結合され、かつＣＰＰは、以下：
Figure 2022511055000013
 （－Ｒ－（ＦＦＲ）３－Ｒａ）（配列番号：１６）、
Figure 2022511055000014
 （－（ＲＸＲ）４－Ｒａ）（配列番号：１５）、
Figure 2022511055000015
 および（－Ｒ６－Ｒａ）（配列番号：１０）
から選択される。いくつかの実施形態において、Ｒａは、アセチルである。
いくつかの実施形態において、１～ｎ個の各Ｎｕは、５’から３’に、配列番号３に対応する。
いくつかの態様において、修飾アンチセンスオリゴマーの核酸塩基は、モルホリノ環構造に連結され、モルホリノ環構造は、１つの環構造のモルホリノ窒素を隣接する環構造の５’環外炭素に結合するリン含有サブユニット間連結によって結合される。
いくつかの態様において、アンチセンスオリゴマーの核酸塩基は、ペプチド核酸（ＰＮＡ）に連結され、リン酸－糖ポリヌクレオチド骨格は、核酸塩基が連結している可撓性擬似ペプチドポリマーで置換されている。
いくつかの態様において、アンチセンスオリゴマーの核酸塩基のうちの少なくとも１つは、ロックド核酸（ＬＮＡ）に連結され、ロックド核酸構造は、リボース部分が２’酸素と４’炭素を結合する余分な架橋を有する、化学的に修飾されたヌクレオチド類似体である。
いくつかの態様において、アンチセンスオリゴマーの核酸塩基のうちの少なくとも１つは、架橋核酸（ＢＮＡ）に連結され、糖立体構造は、フラノース骨格への追加の架橋構造の導入によって制限またはロックされる。
いくつかの態様において、アンチセンスオリゴマーの核酸塩基のうちの少なくとも１つは、２’－Ｏ，４’－Ｃ－エチレン架橋核酸（ＥＮＡ）に連結される。
いくつかの態様において、修飾アンチセンスオリゴマーは、アンロックド核酸（ＵＮＡ）サブユニットを含有し得る。ＵＮＡおよびＵＮＡオリゴマーは、サブユニットのＣ２’－Ｃ３’結合が切断されているＲＮＡの類似体である。
いくつかの態様において、修飾アンチセンスオリゴマーは、非架橋酸素のうちの１つが硫黄で置換されている、１つ以上のホスホロチオエート（またはＳ－オリゴ）を含有する。いくつかの態様において、修飾アンチセンスオリゴマーは、リボースの２’－ＯＨが、それぞれ、メチル、メトキシエチル、２－（Ｎ－メチルカルバモイル）エチル、またはフルオロ基で置換されている、１つ以上の２’Ｏ－メチル、２’Ｏ－ＭＯＥ、ＭＣＥ、および２’－Ｆを含有する。
いくつかの態様において、修飾アンチセンスオリゴマーは、トリシクロ－ＤＮＡ（ｔｃ－ＤＮＡ）であり、これは、骨格の立体構造的柔軟性を制限し、かつねじれ角γの骨格形状を最適化するために、各ヌクレオチドがシクロプロパン環の導入によって修飾されている、拘束されたＤＮＡ類似体である。
様々な態様において、本開示は、式（Ｉ）に従うアンチセンスオリゴマー、
Figure 2022511055000016
 またはその薬学的に許容される塩を提供し、式中、
各Ｎｕは、一緒になって標的化配列を形成する核酸塩基であり、
Ｔは、
Figure 2022511055000017
 から選択される部分であり、Ｔ部分の遠位－ＯＨまたは－ＮＨ２は、任意に細胞膜透過性ペプチドに連結され、
Ｒ１００は、水素または細胞膜透過性ペプチドであり、
１～ｎ個の各Ｎｕは、５’から３’に、以下のうちの１つにおける核酸塩基に対応し、
Figure 2022511055000018
 式中、Ａは、
Figure 2022511055000019
 であり、Ｃは、
Figure 2022511055000020
 であり、Ｇは、
Figure 2022511055000021
 であり、Ｔは、
Figure 2022511055000022
 である。
いくつかの実施形態において、１～ｎ個の各Ｎｕは、５’から３’に、以下：配列番号：１、配列番号：３、配列番号：４、配列番号：５、配列番号：６、配列番号：７、配列番号：８、または配列番号：９のうちの１つにおける核酸塩基に対応する。いくつかの実施形態において、１～ｎ個の各Ｎｕは、５’から３’に、配列番号３に対応する。
別の態様において、本開示は、式（ＩＩ）のアンチセンスオリゴマー、
Figure 2022511055000023
 またはその薬学的に許容される塩を提供し、式中、１～ｎ個の各Ｎｕは、５’から３’に、以下のうちの１つにおける核酸塩基に対応し、
Figure 2022511055000024
 式中、Ａは、
Figure 2022511055000025
 であり、Ｃは、
Figure 2022511055000026
 であり、Ｇは、
Figure 2022511055000027
 であり、Ｔは、
Figure 2022511055000028
 である。
いくつかの実施形態において、式（ＩＩ）の遠位－ＯＨは、細胞膜透過性ペプチドに連結される。
いくつかの実施形態において、１～ｎ個の各Ｎｕは、５’から３’に、以下：配列番号：１、配列番号：３、配列番号：４、配列番号：５、配列番号：６、配列番号：７、配列番号：８、または配列番号：９のうちの１つにおける核酸塩基に対応する。いくつかの実施形態において、１～ｎ個の各Ｎｕは、５’から３’に、配列番号３に対応する。
別の態様において、本開示は、式（ＩＩＩ）のアンチセンスオリゴマー、
Figure 2022511055000029
 またはその薬学的に許容される塩を提供し、式中、１～ｎ個の各Ｎｕは、５’から３’に、以下のうちの１つにおける核酸塩基に対応し、
Figure 2022511055000030
 式中、Ａは、
Figure 2022511055000031
 であり、Ｃは、
Figure 2022511055000032
 であり、Ｇは、
Figure 2022511055000033
 であり、Ｔは、
Figure 2022511055000034
 である。
いくつかの実施形態において、式（ＩＩＩ）の遠位－ＯＨは、細胞膜透過性ペプチドに連結される。
いくつかの実施形態において、１～ｎ個の各Ｎｕは、５’から３’に、配列番号３に対応する。
別の態様において、本開示は、式（ＩＶ）のアンチセンスオリゴマーを提供し、
Figure 2022511055000035
 式中、１～ｎ個の各Ｎｕは、５’から３’に、以下のうちの１つにおける核酸塩基に対応し、
Figure 2022511055000036
 式中、Ａは、
Figure 2022511055000037
 であり、Ｃは、
Figure 2022511055000038
 であり、Ｇは、
Figure 2022511055000039
 であり、Ｔは、
Figure 2022511055000040
 である。
いくつかの実施形態において、１～ｎ個の各Ｎｕは、５’から３’に、配列番号３に対応する。
式（ＩＶ）についてのいくつかの実施形態において、アンチセンスオリゴマーは、式（ＩＶａ）に従う。
Figure 2022511055000041
別の態様において、本開示は、式（Ｖ）のアンチセンスオリゴマーを提供し、
Figure 2022511055000042
 式中、１～ｎ個の各Ｎｕは、５’から３’に、以下のうちの１つにおける核酸塩基に対応し、
Figure 2022511055000043
 式中、Ａは、
Figure 2022511055000044
 であり、Ｃは、
Figure 2022511055000045
 であり、Ｇは、
Figure 2022511055000046
 であり、Ｔは
Figure 2022511055000047
 である。いくつかの実施形態において、１～ｎ個の各Ｎｕは、５’から３’に、配列番号３に対応する。
別の態様において、本開示は、デュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）の治療を必要とする対象においてそれを行うための方法を提供し、対象は、エクソン５０スキッピングに適しているジストロフィン遺伝子の変異を有し、方法は、本開示のアンチセンスオリゴマーを対象に投与することを含む。本開示はまた、デュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）の治療を必要とする対象においてそれを行うための薬剤の製造のための、本開示のアンチセンスオリゴマーの使用にも対処し、対象は、エクソン５０スキッピングに適しているジストロフィン遺伝子の変異を有する。
別の態様において、本開示は、エクソン５０スキッピングに適しているジストロフィン遺伝子の変異を有する対象においてジストロフィン産生を誘導するためにｍＲＮＡリーディングフレームを修復する方法を提供し、方法は、本開示のアンチセンスオリゴマーを対象に投与することを含む。別の態様において、本開示は、エクソン５０スキッピングに適しているジストロフィン遺伝子の変異を有する対象において、ｍＲＮＡプロセシング中にジストロフィンプレｍＲＮＡからエクソン５０を排除する方法を提供し、方法は、本開示のアンチセンスオリゴマーを対象に投与することを含む。別の態様において、本開示は、エクソン５０スキッピングに適しているジストロフィン遺伝子の変異を有する対象において、ジストロフィンプレｍＲＮＡのエクソン５０、イントロン４９、および／またはイントロン５０を結合する方法を提供し、方法は、本開示のアンチセンスオリゴマーを対象に投与することを含む。
別の態様において、本開示は、療法で使用するための、本開示のアンチセンスオリゴマーを本明細書に提供する。ある特定の実施形態において、本開示は、デュシェンヌ型筋ジストロフィーの治療で使用するための、本開示のアンチセンスオリゴマーを提供する。ある特定の実施形態において、本開示は、療法で使用するための薬剤の製造で使用するための、本開示のアンチセンスオリゴマーを提供する。ある特定の実施形態において、本開示は、デュシェンヌ型筋ジストロフィーの治療のための薬剤の製造で使用するための、本開示のアンチセンスオリゴマーを提供する。
別の態様において、本開示はまた、デュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）の治療を必要とする対象においてそれを行うためのキットも提供し、対象は、エクソン５０スキッピングに適しているジストロフィン遺伝子の変異を有し、キットは、少なくとも、好適な容器に包装された本開示のアンチセンスオリゴマーと、その使用のための説明書と、を含む。
本開示の実施形態は、概して、改善されたアンチセンスオリゴマーおよびその使用方法に関し、この方法は、ヒトジストロフィン遺伝子においてエクソンスキッピングを誘導するように特異的に設計される。ジストロフィンは筋機能において重要な役割を果たし、様々な筋肉関連疾患がこの遺伝子の変異型を特徴とする。したがって、ある特定の実施形態において、本明細書に記載される改善されたアンチセンスオリゴマーは、デュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）およびベッカー型筋ジストロフィー（ＢＭＤ）に見られる変異ジストロフィン遺伝子などのヒトジストロフィン遺伝子の変異型においてエクソンスキッピングを誘導する。
変異によって引き起こされる異常なｍＲＮＡスプライシング事象により、これらの変異ヒトジストロフィン遺伝子は、欠陥のあるジストロフィンタンパク質を発現するか、または測定可能なジストロフィンを全く発現しないかのいずれかであり、これは様々な形態の筋ジストロフィーを引き起こす状態である。この状態を治療するために、本開示のアンチセンスオリゴマーは、変異ヒトジストロフィン遺伝子の予めプロセシングされたｍＲＮＡの選択された領域にハイブリダイズし、そうでなければ異常にスプライシングされたジストロフィンｍＲＮＡにおいてエクソンスキッピングおよび差次的スプライシングを誘導し、それにより、筋細胞が機能性ジストロフィンタンパク質をコードするｍＲＮＡ転写物を産生することを可能にする。ある特定の実施形態において、結果として生じるジストロフィンタンパク質は、必ずしも「野生型」の形態のジストロフィンではなく、むしろ、先端を切断されたが機能的な形態のジストロフィンである。
筋細胞における機能性ジストロフィンタンパク質のレベルを高めることによって、これらおよび関連する実施形態は、筋ジストロフィー、特にそのような形態の筋ジストロフィー、例えばＤＭＤおよびＢＭＤなどの予防および治療に有用であり、これらは、異常なｍＲＮＡスプライシングによる欠陥のあるジストロフィンタンパク質の発現を特徴とする。本明細書に記載される特定のアンチセンスオリゴマーは、他のオリゴマーよりも改善されたジストロフィン－エクソン特異的標的化をさらに提供し、それにより、関連する形態の筋ジストロフィーを治療する代替的な方法よりも有意かつ実用的な利点を提供する。
したがって、本開示は、選択された標的に結合してヒトジストロフィン遺伝子においてエクソンスキッピングを誘導することができるアンチセンスオリゴマーまたはその薬学的に許容される塩に関し、アンチセンスオリゴマーは、アニーリング部位として指定されるジストロフィンプレｍＲＮＡのエクソン５０標的領域に相補的である塩基の配列を含み、塩基配列およびアニーリング部位は、以下から選択され、
Figure 2022511055000048
 Ｔは、チミンまたはウラシルである。
いくつかの実施形態において、１～ｎ個の各Ｎｕは、５’から３’に、以下：配列番号：１、配列番号：３、配列番号：４、配列番号：５、配列番号：６、配列番号：７、配列番号：８、または配列番号：９のうちの１つにおける核酸塩基に対応する。いくつかの実施形態において、１～ｎ個の各Ｎｕは、５’から３’に、配列番号：３における核酸塩基に対応する。
一態様において、アンチセンスオリゴマーは、アンチセンスオリゴマーの５’末端に結合されたＴ部分を含有し、Ｔ部分は、以下から選択される。
Figure 2022511055000049
ある特定の実施形態において、アンチセンスオリゴマーは、１個以上の細胞膜透過性ペプチド（本明細書では「ＣＰＰ」と呼称される）にコンジュゲートされる。ある特定の実施形態において、１個以上のＣＰＰは、アンチセンスオリゴマーの末端に結合される。ある特定の実施形態において、少なくとも１個のＣＰＰは、アンチセンスオリゴマーの５’末端に結合される。ある特定の実施形態において、少なくとも１個のＣＰＰは、アンチセンスオリゴマーの３’末端に結合される。ある特定の実施形態において、第１のＣＰＰは、アンチセンスオリゴマーの５’末端に結合され、第２のＣＰＰは、アンチセンスオリゴマーの３’末端に結合される。
いくつかの実施形態において、ＣＰＰは、アルギニンリッチペプチドである。「アルギニンリッチ」という用語は、少なくとも２個、好ましくは２、３、４、５、６、７、または８個のアルギニン残基を有するＣＰＰを指し、各々が任意に１個以上の非荷電疎水性残基によって分離され、任意に約６～１４個のアミノ酸残基を含有する。以下に説明されるように、ＣＰＰは、好ましくは、そのカルボキシ末端でリンカーを介してアンチセンスオリゴヌクレオチドの３’および／または５’末端に連結され、リンカーはまた、１個以上のアミノ酸であり得、かつ好ましくは、Ｈ、アシル、アセチル、ベンゾイル、またはステアロイルから選択されるＲａを含む置換基Ｒａによってそのアミノ末端でキャッピングされる。いくつかの実施形態において、Ｒａは、アセチルである。
以下の表に見られるように、本明細書で使用するためのＣＰＰの非限定的な例としては、－（ＲＸＲ）４－Ｒａ（配列番号：１５）、Ｒ－（ＦＦＲ）３－Ｒａ（配列番号：１６）、－Ｂ－Ｘ－（ＲＸＲ）４－Ｒａ（配列番号：１７）、－Ｂ－Ｘ－Ｒ－（ＦＦＲ）３－Ｒａ（配列番号：１８）、－ＧＬＹ－Ｒ－（ＦＦＲ）３－Ｒａ（配列番号：１９）、－ＧＬＹ－Ｒ５－Ｒａ（配列番号：２０）、－Ｒ５－Ｒａ（配列番号：２１）、－ＧＬＹ－Ｒ６－Ｒａ（配列番号：１１）、および－Ｒ６－Ｒａ（配列番号：１０）が挙げられ、式中、Ｒａは、Ｈ、アシル、ベンゾイル、およびステアロイルから選択され、Ｒは、アルギニンであり、Ｘは、６－アミノヘキサン酸であり、Ｂは、β－アラニンであり、Ｆは、フェニルアラニンであり、ＧＬＹ（またはＧ）は、グリシンである。ＣＰＰ「Ｒ５（配列番号：２１）」は、アミド結合を介して一緒に連結された５個のアルギニン残基のペプチドを示すことを意味する（単一の置換基、例えば、Ｒ５（配列番号：２１）ではない）。ＣＰＰ「Ｒ６（配列番号：１０）」は、アミド結合を介して一緒に連結された６個のアルギニン残基のペプチドを示すことを意味する（単一の置換基、例えば、Ｒ６（配列番号：１０）ではない）。いくつかの実施形態において、Ｒａは、アセチルである。
例示的なＣＰＰを表１（配列番号：１０、１１、および１５～２１）に示す。
Figure 2022511055000050
ＣＰＰ、それらの合成、およびオリゴマーにコンジュゲートする方法は、米国出願公開第ＵＳ２０１２／０２８９４５７号、ならびに国際特許出願公開第ＷＯ２００４／０９７０１７号、同第ＷＯ２００９／００５７９３号、および同第ＷＯ２０１２／１５０９６０号にさらに記載されており、これらの開示は、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。
いくつかの実施形態において、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＣＰＰとリンカーの組み合わせとして定義される置換基「Ｚ」を含む。リンカーは、そのカルボキシ末端でＣＰＰをオリゴヌクレオチドの３’末端および／または５’末端に架橋する。様々な実施形態において、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、オリゴマーの３’末端に連結された１個のＣＰＰのみを含み得る。他の実施形態において、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、オリゴマーの５’末端に連結された１個のＣＰＰのみを含み得る。
Ｚ内のリンカーは、例えば、１、２、３、４、または５個のアミノ酸を含み得る。
特定の実施形態において、Ｚは、以下から選択され、
－Ｃ（Ｏ）（ＣＨ２）５ＮＨ－ＣＰＰ、
－Ｃ（Ｏ）（ＣＨ２）２ＮＨ－ＣＰＰ、
－Ｃ（Ｏ）（ＣＨ２）２ＮＨＣ（Ｏ）（ＣＨ２）５ＮＨ－ＣＰＰ、
－Ｃ（Ｏ）ＣＨ２ＮＨ－ＣＰＰ、および以下の式：
Figure 2022511055000051
 式中、ＣＰＰは、ＣＰＰカルボキシ末端でのアミド結合によってリンカー部分に結合される。
様々な実施形態において、ＣＰＰは、本明細書に記載され、かつ表１に示される、アルギニンリッチペプチドである。ある特定の実施形態において、アルギニンリッチＣＰＰは、－Ｒ５－Ｒａ（すなわち、５個のアルギニン残基、配列番号：２１）であり、式中、Ｒａは、Ｈ、アシル、アセチル、ベンゾイル、およびステアロイルから選択される。ある特定の実施形態において、Ｒａは、アセチルである。様々な実施形態において、ＣＰＰは、配列番号：１５、１６、または２１から選択され、リンカーは、－Ｃ（Ｏ）（ＣＨ２）５ＮＨ－、－Ｃ（Ｏ）（ＣＨ２）２ＮＨ－、－Ｃ（Ｏ）（ＣＨ２）２ＮＨＣ（Ｏ）（ＣＨ２）５ＮＨ－、
－Ｃ（Ｏ）ＣＨ２ＮＨ－、および
Figure 2022511055000052
 からなる群から選択される。いくつかの実施形態において、リンカーは、１、２、３、４、または５個のアミノ酸を含む。
いくつかの実施形態において、ＣＰＰは、配列番号：２１であり、リンカーは、Ｇｌｙである。いくつかの実施形態において、ＣＰＰは、配列番号：２０である。
ある特定の実施形態において、アルギニンリッチＣＰＰは、－Ｒ６－Ｒａ（すなわち、６個のアルギニン残基、配列番号：１０）であり、式中、Ｒａは、Ｈ、アシル、アセチル、ベンゾイル、およびステアロイルから選択される。ある特定の実施形態において、Ｒａは、アセチルである。様々な実施形態において、ＣＰＰは、配列番号：１０、１５、または１６から選択され、リンカーは、－Ｃ（Ｏ）（ＣＨ２）５ＮＨ－、－Ｃ（Ｏ）（ＣＨ２）２ＮＨ－、－Ｃ（Ｏ）（ＣＨ２）２ＮＨＣ（Ｏ）（ＣＨ２）５ＮＨ－、
－Ｃ（Ｏ）ＣＨ２ＮＨ－、および
Figure 2022511055000053
 からなる群から選択される。いくつかの実施形態において、リンカーは、１、２、３、４、または５個のアミノ酸を含む。
いくつかの実施形態において、ＣＰＰは、配列番号：１０であり、リンカーは、Ｇｌｙである。いくつかの実施形態において、ＣＰＰは、配列番号：１１である。
ある特定の実施形態において、Ｚは、オリゴマーの５’および／または３’末端で本開示のアンチセンスオリゴマーに共有結合している－Ｃ（Ｏ）ＣＨ２ＮＨ－Ｒ６－Ｒａ（「Ｒ６」は、配列番号：１０として開示される）であり、式中、Ｒａは、Ｈ、アシル、アセチル、ベンゾイル、またはステアロイルであり、Ｒ６のアミノ末端をキャップする（配列番号：１０）。ある特定の実施形態において、Ｒａは、アセチルである。これらの非限定的な例において、ＣＰＰは、－Ｒ６－Ｒａ（配列番号：１０）であり、リンカーは、－Ｃ（Ｏ）ＣＨ２ＮＨ－（すなわち、ＧＬＹ）である。Ｚ＝－Ｃ（Ｏ）ＣＨ２ＮＨ－Ｒ６－Ｒａ（「Ｒ６」は、配列番号：１０として開示される）のこの特定の例はまた、以下の構造によって例示され、
Figure 2022511055000054
 式中、Ｒａは、Ｈ、アシル、アセチル、ベンゾイル、およびステアロイルから選択される。
様々な実施形態において、ＣＰＰは、－Ｒ６－Ｒａ（配列番号：１０）であり、以下の式としても例示され、
Figure 2022511055000055
 式中、Ｒａは、Ｈ、アシル、アセチル、ベンゾイル、およびステアロイルから選択される。ある特定の実施形態において、ＣＰＰは、配列番号：１１である。いくつかの実施形態において、Ｒａは、アセチルである。
いくつかの実施形態において、ＣＰＰは、－（ＲＸＲ）４－Ｒａ（配列番号：１５）であり、以下の式としても例示される。
Figure 2022511055000056
様々な実施形態において、ＣＰＰは、－Ｒ－（ＦＦＲ）３－Ｒａ（配列番号：１６）であり、以下の式としても例示される。
Figure 2022511055000057
様々な実施形態において、Ｚは、以下から選択され、
－Ｃ（Ｏ）（ＣＨ２）５ＮＨ－ＣＰＰ、
－Ｃ（Ｏ）（ＣＨ２）２ＮＨ－ＣＰＰ、
－Ｃ（Ｏ）（ＣＨ２）２ＮＨＣ（Ｏ）（ＣＨ２）５ＮＨ－ＣＰＰ、
－Ｃ（Ｏ）ＣＨ２ＮＨ－ＣＰＰ、および以下の式：
Figure 2022511055000058
 式中、ＣＰＰは、ＣＰＰカルボキシ末端でのアミド結合によってリンカー部分に結合され、かつＣＰＰは、以下：
Figure 2022511055000059
 （－Ｒ－（ＦＦＲ）３－Ｒａ）（配列番号：１６）、
Figure 2022511055000060
 （－（ＲＸＲ）４－Ｒａ）（配列番号：１５）、
Figure 2022511055000061
 または（－Ｒ６－Ｒａ）（配列番号：１０）
から選択される。いくつかの実施形態において、Ｒａは、アセチルである。
いくつかの実施形態において、１～ｎ個の各Ｎｕは、５’から３’に、配列番号３に対応する。
いくつかの態様において、修飾アンチセンスオリゴマーの核酸塩基は、モルホリノ環構造に連結され、モルホリノ環構造は、１つの環構造のモルホリノ窒素を隣接する環構造の５’環外炭素に結合するリン含有サブユニット間連結によって結合される。そのような態様において、配列番号：１～９の各々のＴは、好ましくは、チミンである。
いくつかの態様において、アンチセンスオリゴマーの核酸塩基は、ペプチド核酸（ＰＮＡ）に連結され、リン酸－糖ポリヌクレオチド骨格は、核酸塩基が連結している可撓性擬似ペプチドポリマーで置換されている。
いくつかの態様において、アンチセンスオリゴマーの核酸塩基のうちの少なくとも１つは、ロックド核酸（ＬＮＡ）に連結され、ロックド核酸構造は、リボース部分が２’酸素と４’炭素を結合する余分な架橋を有する、化学的に修飾されたヌクレオチド類似体である。そのような態様において、配列番号：１～９の各々のＬＮＡに連結される各核酸塩基は、５－メチル基を含む。
いくつかの態様において、アンチセンスオリゴマーの核酸塩基のうちの少なくとも１つは、架橋核酸（ＢＮＡ）に連結され、糖立体構造は、フラノース骨格への追加の架橋構造の導入によって制限またはロックされる。いくつかの態様において、アンチセンスオリゴマーの核酸塩基のうちの少なくとも１つは、２’－Ｏ，４’－Ｃ－エチレン架橋核酸（ＥＮＡ）に連結される。そのような態様において、配列番号：１～９の各々のＢＮＡまたはＥＮＡに連結される各核酸塩基は、５－メチル基を含む。
いくつかの態様において、骨格の化学物質が許容する場合、配列番号１～９：の各チミンは、ウラシルである。
別段の定義がない限り、本明細書で使用される全ての技術用語および科学用語は、本開示が属する当該分野の当業者によって一般的に理解されるものと同じ意味を有する。本明細書に記載されるものと類似または同等の任意の方法および材料が、本開示の実施または試験で使用され得るが、好ましい方法および材料が記載される。本開示の目的のために、以下の用語が以下に定義される。
Ｉ．定義
本明細書で使用される場合、「アルキル」という用語は、別段の定めがない限り、飽和直鎖または分岐炭化水素を指す。ある特定の実施形態において、アルキル基は、第一級、第二級、または第三級炭化水素である。ある特定の実施形態において、アルキル基は、１～１０個の炭素原子、すなわち、Ｃ１～Ｃ１０アルキルを含む。ある特定の実施形態において、アルキル基は、１～６個の炭素原子、すなわち、Ｃ１～Ｃ６アルキルを含む。この用語は、ハロゲン化アルキル基を含む、置換アルキル基および非置換アルキル基の両方を含む。ある特定の実施形態において、アルキル基は、フッ素化アルキル基である。アルキル基が置換され得る部分の非限定的な例は、当業者に既知であるように、例えば、参照により本明細書に組み込まれるＧｒｅｅｎｅ，ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ Ｇｒｏｕｐｓ ｉｎ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，１９９１で教示されるように、保護されていないか、または必要に応じて保護されているかのいずれかの、ハロゲン（フルオロ、クロロ、ブロモ、もしくはヨード）、ヒドロキシル，アミノ、アルキルアミノ、アリールアミノ、アルコキシ、アリールオキシ、ニトロ、シアノ、スルホン酸、硫酸塩、ホスホン酸、リン酸塩、またはホスホン酸塩からなる群から選択される。ある特定の実施形態において、アルキル基は、メチル、ＣＦ３、ＣＣｌ３、ＣＦＣｌ２、ＣＦ２Ｃｌ、エチル、ＣＨ２ＣＦ３、ＣＦ２ＣＦ３、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、ｓｅｃ－ブチル、ｔ－ブチル、ペンチル、イソペンチル、ネオペンチル、ヘキシル、イソヘキシル、３－メチルペンチル、２，２－ジメチルブチル、および２，３－ジメチルブチルからなる群から選択される。
「エクソン５０スキッピングに適している」とは、対象または患者に関して本明細書で使用される場合、ジストロフィンプレｍＲＮＡのエクソン５０のスキッピングがないことにより、リーディングフレームがアウトオブフレームとなり、それによりプレｍＲＮＡの翻訳が妨げられて、対象または患者が機能性または半機能性ジストロフィンを産生することができなくなる、ジストロフィン遺伝子の１つ以上の変異を有する対象および患者を含むことが意図される。患者がエクソンスキッピングに適しているジストロフィン遺伝子の変異を有するかどうかを決定することは、十分に当業者の理解の範囲内である（例えば、Ａａｒｔｓｍａ－Ｒｕｓ ｅｔ ａｌ．（２００９）Ｈｕｍ Ｍｕｔａｔ．３０：２９３－２９９、Ｇｕｒｖｉｃｈ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍ Ｍｕｔａｔ．２００９；３０（４）６３３－６４０、およびＦｌｅｔｃｈｅｒ ｅｔ ａｌ．（２０１０）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ １８（６）１２１８－１２２３を参照）。
本明細書で使用される場合、「オリゴマー」という用語は、サブユニット間連結によって結合されるサブユニットの配列を指す。ある特定の事例において、「オリゴマー」という用語は、「アンチセンスオリゴマー」に関連して使用される。「アンチセンスオリゴマー」について、各サブユニットは、（ｉ）リボース糖またはその誘導体と、（ｉｉ）それらに結合した核酸塩基とからなり、これにより、塩基対合部分の順序は、サブユニット、サブユニット間連結、またはそれらの両方のいずれかが自然発生的ではないという条件で、標的配列内で核酸：オリゴマーヘテロ二本鎖を形成するために、ワトソン－クリック塩基対合によって核酸（典型的にはＲＮＡ）中の標的配列に相補的である塩基配列を形成する。ある特定の実施形態において、アンチセンスオリゴマーは、ホスホロジアミデートモルホリノオリゴマー（ＰＭＯ）である。他の実施形態において、アンチセンスオリゴマーは、２’－Ｏ－メチルホスホロチオエートである。他の実施形態において、本開示のアンチセンスオリゴマーは、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、ロックド核酸（ＬＮＡ）、または２’－Ｏ，４’－Ｃ－エチレン架橋核酸（ＥＮＡ）などの架橋核酸（ＢＮＡ）である。追加の例示的な実施形態は、本明細書に記載される。
「相補的な」および「相補性」という用語は、ワトソン－クリック塩基対合則によって互いに関連する２つ以上のオリゴマー（すなわち、各々が核酸塩基配列を含む）を指す。例えば、核酸塩基配列「Ｔ－Ｇ－Ａ（５’３’）」は、核酸塩基配列「Ａ－Ｃ－Ｔ（３’５’）」に相補的である。相補性は、「部分的」であり得、所与の核酸塩基配列の全てには満たない核酸塩基が、塩基対合則に従って他の核酸塩基配列とマッチされる。例えば、いくつかの実施形態において、所与の核酸塩基配列と別の核酸塩基配列との間の相補性は、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、または約９５％であり得る。あるいは、例を続けると、所与の核酸塩基配列と別の核酸塩基配列との間に「完全な（ｃｏｍｐｌｅｔｅ）」または「完全な（ｐｅｒｆｅｃｔ）」（１００％）相補性が存在し得る。核酸塩基配列間の相補性の程度は、配列間のハイブリダイゼーションの効率および強度に有意な影響を与える。
「有効量」および「治療有効量」という用語は、本明細書において互換的に使用され、所望の治療効果をもたらすのに有効である、単回投与として、または連続投与の一部としてのいずれかで哺乳動物対象に投与される、アンチセンスオリゴマーなどの治療化合物の量を指す。アンチセンスオリゴマーについて、この効果は、典型的には、選択された標的配列の翻訳もしくは天然のスプライスプロセシングを阻害することによって、または臨床的に有意な量のジストロフィン（統計的有意性）を産生することによってもたらされる。
いくつかの実施形態において、有効量は、対象を治療するための一定期間にわたって、アンチセンスオリゴマーを含む組成物約１ｍｇ／ｋｇ～約２００ｍｇ／ｋｇである。いくつかの実施形態において、有効量は、対象におけるジストロフィン陽性線維の数を増加させるために、アンチセンスオリゴマーを含む組成物約１ｍｇ／ｋｇ～約２００ｍｇ／ｋｇである。ある特定の実施形態において、有効量は、例えば６分間歩行試験（６ＭＷＴ）において、健康な同等者と比較して患者の歩行距離を安定化、維持、または改善するために、アンチセンスオリゴマーを含む組成物約１ｍｇ／ｋｇ～約２００ｍｇ／ｋｇである。
「増強する」もしくは「増強すること」、または「増加させる」もしくは「増加させること」、または「刺激する」もしくは「刺激すること」は、概して、前述のうちのいずれかの１つ以上のアンチセンスオリゴマーまたは医薬組成物が、アンチセンスオリゴマーなし、または対照化合物のいずれかによって引き起こされる応答と比較して、細胞または対象においてより大きい生理学的応答（すなわち、下流効果）をもたらすまたは引き起こす能力を指す。より大きい生理学的応答は、当該技術分野における理解および本明細書の記載から明らかな応答の中でも特に、機能的な形態のジストロフィンタンパク質の発現の増加、または筋組織におけるジストロフィン関連生物活性の増加を含み得る。
本明細書で使用される場合、「機能」および「機能性」などの用語は、生物学的、酵素的、または治療的機能を指す。
「機能性」ジストロフィンタンパク質は、概して、典型的には、ＤＭＤまたはＢＭＤを有するある特定の対象に存在する、改変されたかまたは「欠陥のある」形態のジストロフィンタンパク質と比較して、そうでなければ筋ジストロフィーに特徴的である筋組織の進行性分解を低減するのに十分な生物学的活性を有するジストロフィンタンパク質を指す。一例として、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの筋培養におけるジストロフィン関連活性は、筋管のサイズ、筋原線維の組織化（または崩壊）、収縮活性、およびアセチルコリン受容体の自発的クラスター化に従って測定することができる（例えば、Ｂｒｏｗｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｅｌｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ．１１２：２０９－２１６，１９９９を参照）。また、動物モデルは、疾患の病因を研究するための貴重なリソースであり、ジストロフィン関連活性を試験するための手段を提供する。ＤＭＤ研究に最も広く使用されている動物モデルのうちの２つは、ｍｄｘマウスおよびゴールデンレトリバー筋ジストロフィー（ＧＲＭＤ）イヌであり、それらの両方がジストロフィン陰性である（例えば、Ｃｏｌｌｉｎｓ＆Ｍｏｒｇａｎ，Ｉｎｔ Ｊ Ｅｘｐ Ｐａｔｈｏｌ ８４：１６５－１７２，２００３を参照）。これらおよび他の動物モデルを使用して、様々なジストロフィンタンパク質の機能活性を測定することができる。先端を切断された形態のジストロフィン、例えば、本開示のある特定のエクソンスキッピングアンチセンスオリゴマーの投与後に産生されるそのような形態が含まれる。
「ミスマッチ」（複数可）という用語は、塩基対合則に従って標的プレｍＲＮＡにマッチしないオリゴマー核酸塩基配列中の１つ以上の核酸塩基（連続的であるか分離しているかにかかわらず）を指す。多くの場合、完全相補性が望ましいが、いくつかの実施形態は、標的プレｍＲＮＡに対して１つ以上、ただし好ましくは６、５、４、３、２、または１つのミスマッチを含み得る。オリゴマー内の任意の位置における変動が含まれる。ある特定の実施形態において、本開示のアンチセンスオリゴマーは、末端付近の核酸塩基配列の変動、内部の変動を含み、存在する場合、典型的には、５’および／または３’末端の約６、５、４、３、２、または１つのサブユニット内にある。ある特定の実施形態において、１、２、または３つの核酸塩基を除去し、なお標的上の結合を提供することができる。
「モルホリノ」、「モルホリノオリゴマー」、および「ＰＭＯ」という用語は、以下の一般構造：
Figure 2022511055000062
 の、かつＳｕｍｍｅｒｔｏｎ，Ｊ．，ｅｔ ａｌ．，Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ＆Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，７：１８７－１９５（１９９７）の図２に記載されるような、ホスホロジアミデートモルホリノオリゴマーを指す。本明細書に記載されるモルホリノは、上記の一般構造の全ての立体異性体および互変異性体を含む。モルホリノオリゴマーの合成、構造、および結合特性は、米国特許第５，６９８，６８５号、同第５，２１７，８６６号、同第５，１４２，０４７号、同第５，０３４，５０６号、同第５，１６６，３１５号、同第５，５２１，０６３号、同第５，５０６，３３７号、同第８，０７６，４７６号、および同第８，２９９，２０６号に詳述されており、これらの全ては、参照により本明細書に組み込まれる。
ある特定の実施形態において、モルホリノは、オリゴマーの５’または３’末端で「テール」部分とコンジュゲートされて、その安定性および／または溶解性を高める。例示的なテールは、
Figure 2022511055000063
 を含む。Ｔ部分の遠位－ＯＨまたは－ＮＨ２は、任意に細胞膜透過性ペプチドに連結される。
上記の例示的なテール部分のうち、「ＴＥＧ」または「ＥＧ３」は、以下のテール部分を指す。
Figure 2022511055000064
上記の例示的なテール部分のうち、「ＧＴ」は、以下のテール部分を指す。
Figure 2022511055000065
本明細書で使用される場合、「－Ｇ－Ｒ５（配列番号：２０）」および「－Ｇ－Ｒ５－Ａｃ（配列番号：２０）」という用語は、互換的に使用され、本開示のアンチセンスオリゴマーにコンジュゲートされたペプチド部分を指す。様々な実施形態において、「Ｇ」は、アミド結合によって「Ｒ５（配列番号：２１）」にコンジュゲートされたグリシン残基を表し、各「Ｒ」は、アミド結合によって一緒にコンジュゲートされたアルギニン残基を表し、これにより「Ｒ５（配列番号：２１）」は、アミド結合によって一緒にコンジュゲートされた５個のアルギニン残基を意味する。アルギニン残基は、任意の立体配置を有することができ、例えば、アルギニン残基は、Ｌ－アルギニン残基、Ｄ－アルギニン残基、またはＤ－アルギニン残基とＬ－アルギニン残基の混合物であり得る。ある特定の実施形態において、「－Ｇ－Ｒ５（配列番号：２０）」または「－Ｇ－Ｒ５－Ａｃ（配列番号：２０）」は、「テール」部分の遠位－ＯＨまたはＮＨ２に連結される。ある特定の実施形態において、「－Ｇ－Ｒ５（配列番号：２０）」または「－Ｇ－Ｒ５－Ａｃ（配列番号：２０）」は、本開示のＰＭＯアンチセンスオリゴマーの最も３’のモルホリノサブユニットのモルホリン環窒素にコンジュゲートされる。いくつかの実施形態において、「－Ｇ－Ｒ５（配列番号：２０）」または「－Ｇ－Ｒ５－Ａｃ（配列番号：２０）」は、本開示のアンチセンスオリゴマーの３’末端にコンジュゲートされ、以下の式のものである。
Figure 2022511055000066
 もしくはその薬学的に許容される塩、または
Figure 2022511055000067
本明細書で使用される場合、「－Ｇ－Ｒ６（配列番号：１１）」および「－Ｇ－Ｒ６－Ａｃ（配列番号：１１）」および「Ｒ６Ｇ（配列番号：１１）」という用語は、互換的に使用され、本開示のアンチセンスオリゴマーにコンジュゲートされたペプチド部分を指す。様々な実施形態において、「Ｇ」は、アミド結合によって「Ｒ６（配列番号：１０）」にコンジュゲートされたグリシン残基を表し、各「Ｒ」は、アミド結合によって一緒にコンジュゲートされたアルギニン残基を表し、これにより「Ｒ６（配列番号：１０）」は、アミド結合によって一緒にコンジュゲートされた６個のアルギニン残基を意味する。アルギニン残基は、任意の立体配置を有することができ、例えば、アルギニン残基は、Ｌ－アルギニン残基、Ｄ－アルギニン残基、またはＤ－アルギニン残基とＬ－アルギニン残基の混合物であり得る。ある特定の実施形態において、「－Ｇ－Ｒ６（配列番号：１１）」または「－Ｇ－Ｒ６－Ａｃ（配列番号：１１）」は、「テール」部分の遠位－ＯＨまたは
－ＮＨ２に連結される。ある特定の実施形態において、「－Ｇ－Ｒ６（配列番号：１１）」または「－Ｇ－Ｒ６－Ａｃ（配列番号：１１）」は、本開示のＰＭＯアンチセンスオリゴマーの最も３’のモルホリノサブユニットのモルホリン環窒素にコンジュゲートされる。いくつかの実施形態において、「－Ｇ－Ｒ６（配列番号：１１）」または「－Ｇ－Ｒ６－Ａｃ（配列番号：１１）」は、本開示のアンチセンスオリゴマーの３’末端にコンジュゲートされ、以下の式のものである。
Figure 2022511055000068
「核酸塩基」（Ｎｕ）、「塩基対合部分」、または「塩基」という用語は、互換的に使用され、自然発生または「天然」ＤＮＡもしくはＲＮＡ（例えば、ウラシル、チミン、アデニン、シトシン、およびグアニン）で見られるプリンまたはピリミジン塩基、ならびにこれらの自然発生的プリンおよびピリミジンの類似体を指す。これらの類似体は、結合親和性などの改善された特性をオリゴマーに付与し得る。例示的な類似体としては、ヒポキサンチン（イノシンの塩基構成成分）、２，６－ジアミノプリン、５－メチルシトシン、Ｃ５－プロピニル修飾ピリミジン、１０－（９－（アミノエトキシ）フェノキサジニル）（Ｇ－クランプ）などが挙げられる。
塩基対合部分のさらなる例としては、ウラシル、チミン、アデニン、シトシン、グアニン、およびヒポキサンチン（イノシン）（アシル保護基によって保護されたそれらのそれぞれアミノ基を有する）、２－フルオロウラシル、２－フルオロシトシン、５－ブロモウラシル、５－ヨードウラシル、２，６－ジアミノプリン、アザシトシン、偽イソシトシンおよび偽ウラシルなどのピリミジン類似体、ならびに８－置換プリン、キサンチン、またはヒポキサンチン（後者の２つは自然分解生成物である）などの他の修飾核酸塩基が挙げられるが、これらに限定されない。Ｃｈｉｕ ａｎｄ Ｒａｎａ，ＲＮＡ，２００３，９，１０３４－１０４８；Ｌｉｍｂａｃｈ ｅｔ ａｌ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１９９４，２２，２１８３－２１９６、およびＲｅｖａｎｋａｒ ａｎｄ Ｒａｏ，Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ Ｎａｔｕｒａｌ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，ｖｏｌ．７，３１３に開示される修飾核酸塩基もまた企図され、これらの内容は、参照により本明細書に組み込まれる。
塩基対合部分のさらなる例としては、１つ以上のベンゼン環が付加された拡大サイズの核酸塩基が挙げられるが、これらに限定されない。Ｇｌｅｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈカタログ（ｗｗｗ．ｇｌｅｎｒｅｓｅａｒｃｈ．ｃｏｍ）、Ｋｒｕｅｇｅｒ ＡＴ ｅｔ ａｌ．，Ａｃｃ．Ｃｈｅｍ．Ｒｅｓ．，２００７，４０，１４１－１５０、Ｋｏｏｌ，ＥＴ，Ａｃｃ．Ｃｈｅｍ．Ｒｅｓ．，２００２，３５，９３６－９４３、Ｂｅｎｎｅｒ Ｓ．Ａ．，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｅｔ．，２００５，６，５５３－５４３、Ｒｏｍｅｓｂｅｒｇ，Ｆ．Ｅ．，ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．，２００３，７，７２３－７３３、およびＨｉｒａｏ，Ｉ．，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．，２００６，１０，６２２－６２７（これらの内容は、参照により本明細書に組み込まれる）に記載される核酸塩基置換は、本明細書に記載されるアンチセンスオリゴマーにおいて有用であると企図される。拡大サイズの核酸塩基の例としては、以下に示されるもの、ならびにその互変異性体が挙げられる。
Figure 2022511055000069
本明細書で使用される場合、「非経口投与」および「非経口的に投与される」という語句は、通常は注射による、腸内および局所投与以外の投与様式を意味し、静脈内、筋肉内、動脈内、髄腔内、嚢内、眼窩内、心臓内、皮内、腹腔内、経気管、皮下、表皮下、関節内、嚢下、くも膜下、脊髄内、および胸骨内の注射および注入を含むが、これらに限定されない。
本明細書で使用される場合、構造式内で使用される一組の括弧は、括弧間の構造特徴が繰り返されることを示す。いくつかの実施形態において、使用される括弧は、「［」および「］」であり得、ある特定の実施形態において、繰り返す構造特徴を示すために使用される括弧は、「（」および「）」であり得る。いくつかの実施形態において、括弧間の構造特徴の繰り返し反復数は、括弧の外側に示される数、例えば、２、３、４、５、６、７などである。様々な実施形態において、括弧間の構造特徴の繰り返し反復数は、「Ｚ」などの括弧の外側に示される変数によって示される。
本明細書で使用される場合、構造式内のキラル炭素またはリン原子に引き寄せられた直鎖結合または曲がりくねった（ｓｑｕｉｇｇｌｙ）結合は、キラル炭素またはリンの立体化学が未定義であり、キラル中心の全ての形態および／またはそれらの混合物を含むことが意図されていることを示す。そのような図の例が以下に示される。
Figure 2022511055000070
「薬学的に許容される」という語句は、物質または組成物が、製剤を含む他の成分および／またはそれを用いて治療される対象と、化学的および／または毒性学的に適合性がなければならないことを意味する。
本明細書で使用される場合、「薬学的に許容される担体」という語句は、非毒性、不活性固体、半固体もしくは液体充填剤、希釈剤、封入材料、または任意の種類の製剤補助剤を意味する。薬学的に許容される担体として役立ち得る材料のいくつかの例としては、製剤者の判断に従って、糖類、例えば、ラクトース、グルコース、スクロース；デンプン、例えば、トウモロコシデンプンおよびジャガイモデンプン；セルロースおよびその誘導体、例えば、カルボキシメチルナトリウムセルロース、エチルセルロース、および酢酸セルロース；粉末トラガカント；麦芽；ゼラチン；タルク；賦形剤、例えば、カカオバターおよび坐剤ワックス；油、例えば、ピーナッツ油、綿実油、サフラワー油、ゴマ油、オリーブ油、コーン油、および大豆油；グリコール、例えば、プロピレングリコールエステル、例えば、オレイン酸エチルおよびラウリン酸エチル；寒天；緩衝剤、例えば、水酸化マグネシウムおよび水酸化アルミニウム；アルギニン酸；発熱性物質除去蒸留水；等張生理食塩水；リンゲル液；エチルアルコール；リン酸緩衝液；非毒性適合性潤滑剤、例えば、ラウリル硫酸ナトリウムおよびステアリン酸マグネシウム；着色剤；離型剤；コーティング剤；甘味剤；香味剤；芳香剤；防腐剤；および酸化防止剤がある。
ジストロフィン合成または産生に関する「修復」という用語は、概して、本明細書に記載されるアンチセンスオリゴマーを用いた治療後の筋ジストロフィー患者における、先端を切断された形態のジストロフィンを含むジストロフィンタンパク質の産生を指す。治療後の患者のジストロフィン陽性線維の割合は、既知の技術を使用して筋生検によって決定され得る。例えば、筋生検は、患者の上腕二頭筋などの好適な筋肉から採取され得る。
陽性ジストロフィン線維の割合の分析は、治療前および／もしくは治療後、または治療過程全体を通した時点において実施され得る。いくつかの実施形態において、治療後の生検は、治療前の生検と対側の筋肉から採取される。治療前および治療後のジストロフィン発現分析は、ジストロフィンのための任意の好適なアッセイを使用して実施され得る。いくつかの実施形態において、免疫組織化学的検出は、モノクローナル抗体またはポリクローナル抗体などのジストロフィンのためのマーカーである抗体を使用して、筋生検からの組織切片上で実施される。例えば、ジストロフィンのための高感度マーカーであるＭＡＮＤＹＳ１０６抗体が使用され得る。任意の好適な二次抗体が使用され得る。
いくつかの実施形態において、ジストロフィン陽性線維の割合は、陽性線維数を、カウントした総線維数で割ることによって計算される。正常な筋肉試料は、１００％のジストロフィン陽性線維を有する。したがって、ジストロフィン陽性線維の割合は、正常の割合として表され得る。治療前の筋肉ならびに復帰突然変異線維におけるジストロフィンの微量レベルの存在を制御するために、治療後の筋肉におけるジストロフィン陽性線維をカウントする場合、ベースラインは、患者からの治療前の筋肉切片を使用して設定され得る。これは、その患者の治療後の筋肉切片におけるジストロフィン陽性線維をカウントするための閾値として使用され得る。他の実施形態において、抗体で染色された組織切片は、Ｂｉｏｑｕａｎｔ画像分析ソフトウェア（Ｂｉｏｑｕａｎｔ Ｉｍａｇｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｎａｓｈｖｉｌｌｅ，ＴＮ）を使用したジストロフィン定量化にも使用され得る。総ジストロフィン蛍光シグナル強度は、正常の割合として報告され得る。さらに、モノクローナルまたはポリクローナル抗ジストロフィン抗体を用いたウェスタンブロット分析を使用して、ジストロフィン陽性線維の割合を決定することができる。例えば、Ｌｅｉｃａ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓからの抗ジストロフィン抗体ＮＣＬ－Ｄｙｓ１が使用され得る。また、ジストロフィン陽性線維の割合は、サルコグリカン複合体（β，γ）および／または神経ＮＯＳの構成成分の発現を決定することによっても分析され得る。
いくつかの実施形態において、本開示のアンチセンスオリゴマーを用いた治療は、治療なしで予想されるＤＭＤ患者における進行性呼吸筋機能障害および／または不全を遅らせるか、または低減する。いくつかの実施形態において、本開示のアンチセンスオリゴマーを用いた治療は、治療なしで予想される換気補助の必要性を低減または排除し得る。いくつかの実施形態において、疾患の経過を追跡するための呼吸機能の測定、ならびに可能性のある治療介入の評価には、最大吸気圧（ＭＩＰ）、最大呼気圧（ＭＥＰ）、および努力肺活量（ＦＶＣ）が含まれる。ＭＩＰおよびＭＥＰは、それぞれ、吸入中および呼気中に人が発生させることができる圧力レベルを測定し、かつ呼吸筋力の感度尺度である。ＭＩＰは、横隔膜の筋力低下の尺度である。
いくつかの実施形態において、ＭＥＰは、ＭＩＰおよびＦＶＣを含む他の肺機能検査における変化の前に低下し得る。ある特定の実施形態において、ＭＥＰは、呼吸機能障害の早期指標であり得る。ある特定の実施形態において、ＦＶＣは、最大吸気後の努力呼気中に排出される空気の総体積を測定するために使用され得る。ＤＭＤ患者において、ＦＶＣは、１０代前半まで身体的成長と同時に増加する。しかしながら、成長が病気の進行によって遅くなるまたは不良になり、筋力低下が進行すると、肺活量は下降期に入り、１０～１２歳の後、年間約８～８．５パーセントの平均速度で低下する。ある特定の実施形態において、予測ＭＩＰパーセント（ＭＩＰは体重で調整）、予測ＭＥＰパーセント（ＭＥＰは年齢で調整）、および予測ＦＶＣパーセント（ＦＶＣは年齢および身長で調整）は、支持的分析である。
本明細書で使用される場合、「対象」および「患者」という用語は、ＤＭＤもしくはＢＭＤ、またはこれらの状態に関連する症状のいずれか（例えば、筋線維の消失）を有する、またはそのリスクがある対象（または患者）など、本開示のアンチセンスオリゴマーを用いて治療され得る症状を示す、または症状を示すリスクがある任意の動物を含む。好適な対象（または患者）には、実験動物（マウス、ラット、ウサギ、またはモルモットなど）、家畜、および家庭用動物またはペット（ネコまたはイヌなど）が含まれる。非ヒト霊長類、および好ましくはヒト患者（または対象）が含まれる。また、エクソン５０スキッピングに適しているジストロフィン遺伝子の変異を有する対象（または患者）においてジストロフィンを産生する方法も含まれる。
本明細書で使用される場合、「全身投与」、「全身に投与される」、「末梢投与」、および「末梢に投与される」という語句は、中枢神経系への直接の投与以外の、化合物、薬物、または他の材料の投与を意味し、これにより患者の系内に入り、ひいては代謝および他の類似のプロセス、例えば、皮下投与などの対象となる。
「標的化配列」または「塩基配列」という語句は、標的プレｍＲＮＡ中のヌクレオチドの配列に相補的であるオリゴマーの核酸塩基の配列を指す。本開示のいくつかの実施形態において、標的プレｍＲＮＡ中のヌクレオチドの配列は、Ｈ５０Ｄ（＋０４－１８）、Ｈ５０Ｄ（＋０７－１８）、Ｈ５０Ｄ（＋０７－１６）、Ｈ５０Ｄ（＋０７－１７）、Ｈ５０Ａ（－１９＋０７）、Ｈ５０Ｄ（＋０７－１５）、Ｈ５０Ａ（－０２＋２３）、Ｈ５０Ｄ（＋０６－１８）、またはＨ５０Ｄ（＋０７－２０）として指定されるジストロフィンプレｍＲＮＡ中のエクソン５０、イントロン４９、および／またはイントロン５０アニーリング部位である。一実施形態において、本明細書に記載されるアンチセンスオリゴマーによって標的化されるアニーリング部位は、Ｈ５０Ｄ（＋０７－１６）である。
対象（例えば、ヒトなどの哺乳動物）または細胞の「治療」は、対象または細胞の自然経過を変化させる試みにおいて使用される任意の種類の介入である。治療は、限定するものではないが、オリゴマーまたはその医薬組成物の投与を含み、予防的に、または病理学的事象の開始後もしくは病原体との接触後のいずれかに実施され得る。治療は、ある特定の形態の筋ジストロフィーのような、ジストロフィンタンパク質に関連した疾患または状態の症状または病理に対する任意の望ましい効果を含み、例えば、治療されている疾患または状態の、１つ以上の測定可能なマーカーの最小限の変化または改善を含み得る。また、治療されている疾患もしくは状態の進行速度を低下させること、その疾患もしくは状態の発症を遅延させること、またはその発症の重症度を低減することを対象とし得る、「予防的」治療も含まれる。「治療」または「予防」は、必ずしも疾患もしくは状態またはその随伴症状の完全な根絶、治癒、または予防を示すものではない。
いくつかの実施形態において、本開示のアンチセンスオリゴマーを用いた治療は、治療なしで予想され得る、新規のジストロフィン産生を増加させ、疾患進行を遅延させ、歩行不能を遅らせるかもしくは低減し、筋肉の炎症を低減し、筋肉損傷を低減し、筋機能を改善し、肺機能の喪失を低減し、かつ／または筋肉再生を増強する。いくつかの実施形態において、治療は、疾患進行を維持するか、遅延させるか、または遅らせる。いくつかの実施形態において、治療は、歩行を維持するか、または歩行不能を低減する。いくつかの実施形態において、治療は、肺機能を維持するか、または肺機能の喪失を低減する。いくつかの実施形態において、治療は、例えば、６分間歩行試験（６ＭＷＴ）によって測定されるように、患者の安定した歩行距離を維持するか、または増加させる。いくつかの実施形態において、治療は、１０メートルを歩行／走行する時間を維持するか、または減少させる（すなわち、１０メートル歩行／走行試験）。いくつかの実施形態において、治療は、仰臥位から起立するまでの時間を維持するか、または低減する（すなわち、起立時間試験）。いくつかの実施形態において、治療は、４つの標準階段を上る時間を維持するか、または低減する（すなわち、４階段昇段試験）。いくつかの実施形態において、治療は、例えば、ＭＲＩ（例えば、脚筋のＭＲＩ）によって測定されるように、患者の筋肉の炎症を維持するか、または低減する。いくつかの実施形態において、ＭＲＩは、Ｔ２および／または脂肪画分を測定して、筋変性を特定する。ＭＲＩは、炎症、浮腫、筋肉損傷、および脂肪浸潤によって引き起こされる筋肉の構造および組成の変化を特定することができる。
いくつかの実施形態において、本開示のアンチセンスオリゴマーを用いた治療は、新規のジストロフィン産生を増加させ、治療なしで予測される歩行不能を遅らせるか、または低減する。例えば、治療は、対象の歩行能力（例えば、歩行の安定化）を安定化するか、維持するか、改善するか、または増加させ得る。いくつかの実施形態において、治療は、例えば、ＭｃＤｏｎａｌｄら （Ｍｕｓｃｌｅ Ｎｅｒｖｅ，２０１０；４２：９６６－７４、参照により本明細書に組み込まれる）によって記載される６分間歩行試験（６ＭＷＴ）によって測定されるように、患者の安定した歩行距離を維持するか、または増加させる。６分間歩行距離（６ＭＷＤ）の変化は、絶対値、変化率、または％予測値の変化として表され得る。健康な同等者の典型的なパフォーマンスと比較した６ＭＷＴにおけるＤＭＤ患者のパフォーマンスは、％予測値を計算することによって決定することができる。例えば、％予測６ＭＷＤは、男性の場合、以下の方程式を使用して計算され得る：１９６．７２＋（３９．８１×年齢）－（１．３６×年齢２）＋（１３２．２８×身長（メートル））。女性の場合、％予測６ＭＷＤは、以下の方程式を使用して計算され得る：１８８．６１＋（５１．５０×年齢）－（１．８６×年齢２）＋（８６．１０×身長（メートル））（Ｈｅｎｒｉｃｓｏｎ ｅｔ ａｌ．ＰＬｏＳ Ｃｕｒｒ．，２０１２，ｖｅｒｓｉｏｎ ２、参照により本明細書に組み込まれる）。
ＤＭＤ患者の筋機能の喪失は、正常な小児の成長および発達の背景に反して起こり得る。実際に、ＤＭＤを有する小児は、進行性筋肉障害にもかかわらず、約１年の課程にわたって６ＭＷＴ中の歩行距離の増加を示し得る。いくつかの実施形態において、ＤＭＤ患者からの６ＭＷＤは、定型発達の対照対象、ならびに年齢および性別が一致した対象からの既存の標準データと比較される。いくつかの実施形態において、正常な成長および発達は、標準データにフィッティングされた年齢および身長に基づく方程式を使用して説明され得る。そのような方程式を使用して、ＤＭＤを有する対象における６ＭＷＤをパーセント予測（％予測）値に変換することができる。ある特定の実施形態において、％予測６ＭＷＤデータの分析は、正常な成長および発達を説明する方法を表し、若年齢（例えば、７歳以下）における機能の増加が、ＤＭＤ患者における能力の改善というよりむしろ安定を表すことを示し得る（Ｈｅｎｒｉｃｓｏｎ ｅｔ ａｌ．ＰＬｏＳ Ｃｕｒｒ．，２０１２，ｖｅｒｓｉｏｎ ２、参照により本明細書に組み込まれる）。
異なるアンチセンス分子を区別するために、アンチセンス分子の命名法システムが提案および公開された（Ｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，（２００２）Ｊ Ｇｅｎ Ｍｅｄ ４，６４４－６５４を参照）。この命名法は、以下に示されるように、全てが同じ標的領域に向けられたいくつかのわずかに異なるアンチセンス分子を試験する場合に、特に適切なものとなった。
Ｈ＃Ａ／Ｄ（ｘ：ｙ）
最初の文字は、種を示す（例えば、Ｈ：ヒト、Ｍ：マウス、Ｃ：イヌ）。「＃」は、標的ジストロフィンエクソン番号を示す。「Ａ／Ｄ」は、それぞれエクソンの始点および終点におけるアクセプターまたはドナースプライス部位を示す。（ｘ ｙ）は、アニーリング座標を表し、「－」または「＋」は、それぞれイントロンまたはエクソン配列を示す。例えば、Ａ（－６＋１８）は、標的エクソンの前にあるイントロンの最後の６塩基、および標的エクソンの最初の１８塩基を示す。最も近いスプライス部位がアクセプターになるため、これらの座標の前に「Ａ」が付く。ドナースプライス部位におけるアニーリング座標の記載は、Ｄ（＋２－１８）であり得、最後の２エクソン塩基および最初の１８イントロン塩基が、アンチセンス分子のアニーリング部位に対応する。エクソンアニーリング座標全体は、Ａ（＋６５＋８５）、つまり、そのエクソンの始点から６５番目～８５番目のヌクレオチドの部位によって表される。
ＩＩ．アンチセンスオリゴマー
Ａ．エクソン５０スキッピングを誘導するように設計されたアンチセンスオリゴマー
ある特定の実施形態において、本開示のアンチセンスオリゴマーは、ジストロフィン遺伝子のエクソン５０、イントロン４９、および／またはイントロン５０標的領域に相補的であり、かつエクソン５０スキッピングを誘導する。特に、本開示は、アニーリング部位として指定されるジストロフィンプレｍＲＮＡのエクソン５０、イントロン４９、および／またはイントロン５０標的領域に相補的なアンチセンスオリゴマーに関する。いくつかの実施形態において、アニーリング部位は、Ｈ５０Ｄ（＋０４－１８）、Ｈ５０Ｄ（＋０７－１８）、Ｈ５０Ｄ（＋０７－１６）、Ｈ５０Ｄ（＋０７－１７）、Ｈ５０Ａ（－１９＋０７）、Ｈ５０Ｄ（＋０７－１５）、Ｈ５０Ａ（－０２＋２３）、Ｈ５０Ｄ（＋０６－１８）、またはＨ５０Ｄ（＋０７－２０）から選択される。いくつかの実施形態において、アニーリング部位は、Ｈ５０Ｄ（＋０７－１６）である。
本開示のアンチセンスオリゴマーは、ジストロフィンプレｍＲＮＡを標的化し、エクソン５０のスキッピングを誘導するため、成熟したスプライシングされたｍＲＮＡ転写物から除外またはスキッピングされる。エクソン５０をスキッピングすることによって、破壊されたリーディングフレームは、インフレーム変異に修復される。ＤＭＤは様々な遺伝的サブタイプからなるが、本開示のアンチセンスオリゴマーは、ジストロフィンプレｍＲＮＡのエクソン５０をスキッピングするように特異的に設計された。エクソン５０のスキッピングに適しているＤＭＤ変異は、ＤＭＤ患者のサブグループ（４％）を含む。
エクソン５０スキッピングを誘導するアンチセンスオリゴマーの核酸塩基配列は、ジストロフィンプレｍＲＮＡのエクソン５０、イントロン４９、および／またはイントロン５０内の特定の標的配列に相補的であるように設計される。いくつかの実施形態において、アンチセンスオリゴマーは、ＰＭＯであり、ＰＭＯの各モルホリノ環は、例えば、ＤＮＡ（アデニン、シトシン、グアニン、およびチミン）中に見られる核酸塩基を含む核酸塩基に連結される。
Ｂ．オリゴマー化学的物質の特徴
本開示のアンチセンスオリゴマーは、様々なアンチセンスオリゴマー化学物質を用いることができる。オリゴマー化学物質の例としては、モルホリノオリゴマー、ホスホロチオエート修飾オリゴマー、２’－Ｏ－メチル修飾オリゴマー、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、ロックド核酸（ＬＮＡ）、ホスホロチオエートオリゴマー、２’－Ｏ－ＭＯＥ修飾オリゴマー、２’－フルオロ修飾オリゴマー、２’－Ｏ，４’Ｃ－エチレン架橋核酸（ＥＮＡ）、トリシクロ－ＤＮＡ、トリシクロ－ＤＮＡホスホロチオエートサブユニット、２’－Ｏ－［２－（Ｎ－メチルカルバモイル）エチル］修飾オリゴマー（上記のいずれかの組み合わせを含む）が挙げられるが、これらに限定されない。ホスホロチオエートと２’－Ｏ－Ｍｅ修飾化学物質を組み合わせて、２’－Ｏ－Ｍｅ－ホスホロチオエート骨格を生成することができる。例えば、ＰＣＴ公開第ＷＯ／２０１３／１１２０５３号および同第ＷＯ／２００９／００８７２５号（これらは、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる）を参照されたい。利用される化学物質によって許容される場合、配列番号：１～９のうちのいずれかにおける各Ｔは、ウラシルであり得る。利用される化学物質によって許容される場合、配列番号：１～９のうちのいずれかにおける関連する核酸塩基は、５－メチル基を含み得る。本開示のオリゴマー化学物質の例示的な実施形態が以下にさらに記載される。
１． ペプチド核酸（ＰＮＡ）
ペプチド核酸（ＰＮＡ）は、骨格がデオキシリボース骨格と構造的に同形であり、ピリミジンまたはプリン塩基が結合するＮ－（２－アミノエチル）グリシン単位からなる、ＤＮＡの類似体である。天然ピリミジンおよびプリン塩基を含有するＰＮＡは、ワトソン－クリック塩基対合則に従い相補的なオリゴマーにハイブリダイズし、塩基対認識の点でＤＮＡを模倣する。ＰＮＡの骨格は、ホスホジエステル結合というよりむしろペプチド結合によって形成され、アンチセンス用途によく適したものになる（以下の構造を参照）。骨格は非荷電性であり、通常を超える熱安定性を示すＰＮＡ／ＤＮＡまたはＰＮＡ／ＲＮＡ二本鎖をもたらす。ＰＮＡは、ヌクレアーゼまたはプロテアーゼによって認識されない。ＰＮＡの非限定的な例が以下に示される。
Figure 2022511055000071
自然構造に対する根本的構造変化にもかかわらず、ＰＮＡは、ＤＮＡまたはＲＮＡへのヘリックス形態での配列特異的結合が可能である。ＰＮＡの特徴には、相補的なＤＮＡまたはＲＮＡに対する高い結合親和性、単一塩基ミスマッチによって引き起こされる不安定化作用、ヌクレアーゼおよびプロテアーゼに対する耐性、塩濃度に依存しないＤＮＡまたはＲＮＡとのハイブリダイゼーション、ならびにホモプリンＤＮＡとの三重鎖形成が含まれる。ＰＡＮＡＧＥＮＥ（商標）は、その独自のＢｔｓ ＰＮＡモノマー（Ｂｔｓ、ベンゾチアゾール－２－スルホニル基）および独自のオリゴマー化プロセスを開発してきた。Ｂｔｓ ＰＮＡモノマーを使用したＰＮＡオリゴマー化は、脱保護、カップリング、およびキャッピングの反復サイクルから構成される。ＰＮＡは、当該技術分野において既知の任意の技術を使用して合成的に産生され得る。例えば、米国特許 第６，９６９，７６６号、同第７，２１１，６６８号、同第７，０２２，８５１号、同第７，１２５，９９４号、同第７，１４５，００６号、および同第７，１７９，８９６号を参照されたい。また、ＰＮＡの調製について、米国特許 第５，５３９，０８２号、同第５，７１４，３３１号、および同第５，７１９，２６２も参照されたい。ＰＮＡ化合物のさらなる教示は、Ｎｉｅｌｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５４：１４９７－１５００，１９９１に見ることができる。上記の各々は、参照によりその全体が組み込まれる。
２． ロックド核酸（ＬＮＡ）
アンチセンスオリゴマーはまた、「ロックド核酸」サブユニット（ＬＮＡ）を含有し得る。「ＬＮＡ」は、架橋核酸（ＢＮＡ）と呼ばれる修飾のクラスのメンバーである。ＢＮＡは、リボース環の立体構造をＣ３０－エンド（ノーザン）糖パッカーにロックする共有結合を特徴とする。ＬＮＡの場合、架橋は、２’－Ｏ位置と４’－Ｃ位置との間のメチレンから構成される。ＬＮＡは、骨格の事前組織化および塩基スタッキングを増強して、ハイブリダイゼーションおよび熱安定性を高める。
ＬＮＡの構造は、例えば、Ｗｅｎｇｅｌ，ｅｔ ａｌ．，Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ（１９９８）４５５、Ｋｏｓｈｋｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ（１９９８）５４：３６０７、Ｊｅｓｐｅｒ Ｗｅｎｇｅｌ，Ａｃｃｏｕｎｔｓ ｏｆ Ｃｈｅｍ．Ｒｅｓｅａｒｃｈ（１９９９）３２：３０１、Ｏｂｉｋａ，ｅｔ ａｌ．，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔｅｒｓ（１９９７）３８：８７３５、Ｏｂｉｋａ，ｅｔ ａｌ．，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔｅｒｓ（１９９８）３９：５４０１、およびＯｂｉｋａ，ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（２００８）１６：９２３０に見ることができ、これらは、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。ＬＮＡの非限定的な例が以下に示される。
Figure 2022511055000072
本開示のアンチセンスオリゴマーは、１つ以上のＬＮＡを組み込み得る。場合によっては、アンチセンスオリゴマーは、ＬＮＡから完全に構成され得る。個々のＬＮＡヌクレオシドサブユニットの合成およびそれらのオリゴマーへの組み込みのための方法は、例えば、米国特許 第７，５７２，５８２号、同第７，５６９，５７５号、同第７，０８４，１２５号、同第７，０６０，８０９号、同第７，０５３，２０７号、同第７，０３４，１３３号、同第６，７９４，４９９号、および同第６，６７０，４６１号に記載され、これらの各々は、参照によりその全体が組み込まれる。典型的なサブユニット間リンカーとしては、ホスホジエステル部分およびホスホロチオエート部分が挙げられる。あるいは、非リン含有リンカーが用いられ得る。さらなる実施形態は、ＬＮＡ含有アンチセンスオリゴマーを含み、各ＬＮＡサブユニットは、ＤＮＡサブユニットによって分離される。ある特定のアンチセンスオリゴマーは、交互のＬＮＡおよびＤＮＡサブユニットから構成され、サブユニット間リンカーは、ホスホロチオエートである。
２’Ｏ，４’Ｃ－エチレン架橋核酸（ＥＮＡ）は、ＢＮＡのクラスの別のメンバーである。非限定的な例が以下に示される。
Figure 2022511055000073
ＥＮＡオリゴマーおよびその調製は、Ｏｂｉｋａ ｅｔ ａｌ．，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ（１９９７）３８（５０）：８７３５に記載されており、これは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。本開示のアンチセンスオリゴマーは、１つ以上のＥＮＡサブユニットを組み込み得る。
３．アンロックド核酸（ＵＮＡ）
アンチセンスオリゴマーはまた、アンロックド核酸（ＵＮＡ）サブユニットを含有し得る。ＵＮＡおよびＵＮＡオリゴマーは、サブユニットのＣ２’－Ｃ３’結合が切断されているＲＮＡの類似体である。ＬＮＡは、（ＤＮＡおよびＲＮＡに対して）立体構造的に制限されるが、ＵＮＡは、非常に柔軟である。ＵＮＡは、例えば、ＷＯ２０１６／０７０１６６に開示されている。ＵＮＡの非限定的な例が以下に示される。
Figure 2022511055000074
典型的なサブユニット間リンカーとしては、ホスホジエステル部分およびホスホロチオエート部分が挙げられる。あるいは、非リン含有リンカーが用いられ得る。
４．ホスホロチオエート
「ホスホロチオエート」（またはＳ－オリゴ）は、非架橋酸素のうちの１つが硫黄で置換されている正常なＤＮＡのバリアントである。ホスホロチオエートの非限定的な例が以下に示される。
Figure 2022511055000075
ヌクレオチド間結合の硫化は、５’から３’および３’から５’のＤＮＡ ＰＯＬ１エキソヌクレアーゼ、ヌクレアーゼＳ１およびＰ１、ＲＮａｓｅ、血清ヌクレアーゼ、ならびにヘビ毒ホスホジエステラーゼを含む、エンドヌクレアーゼおよびエキソヌクレアーゼの作用を低減する。ホスホロチオエートは、ホスホン酸水素に対する二硫化炭素中の元素硫黄の溶液の作用、または亜リン酸トリエステルをテトラエチルチウラムジスルフィド（ＴＥＴＤ）もしくは３Ｈ－１，２－ベンソジチオール－３－オン１，１－ジオキシド（ＢＤＴＤ）のいずれかで硫化する方法、の２つの主要な経路によって作製される（例えば、Ｉｙｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．５５，４６９３－４６９９，１９９０（これは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）を参照）。後者の方法は、ほとんどの有機溶媒中の元素硫黄の不溶性、および二硫化炭素の毒性の問題を回避する。ＴＥＴＤおよびＢＤＴＤ法はまた、より高い純度のホスホロチオエートをもたらす。
５． トリクリクロ－ＤＮＡおよびトリシクロ－ホスホロチオエートサブユニット
トリシクロ－ＤＮＡ（ｔｃ－ＤＮＡ）は、骨格の立体構造的柔軟性を制限し、かつねじれ角γの骨格形状を最適化するために、各ヌクレオチドがシクロプロパン環の導入によって修飾されている、拘束されたＤＮＡ類似体のクラスである。ホモ塩基アデニンおよびチミン含有ｔｃ－ＤＮＡは、相補的ＲＮＡと非常に安定したＡ－Ｔ塩基対を形成する。トリシクロ－ＤＮＡおよびその合成は、国際特許出願公開第ＷＯ２０１０／１１５９９３号に記載されており、これは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。本開示のアンチセンスオリゴマーは、１つ以上のトリシクロ－ＤＮＡサブユニットを組み込み得る。場合によっては、アンチセンスオリゴマーは、トリシクロ－ＤＮＡサブユニットから完全に構成され得る。
トリシクロ－ホスホロチオエートサブユニットは、ホスホロチオエートサブユニット間連結を有するトリシクロ－ＤＮＡサブユニットである。トリシクロ－ホスホロチオエートサブユニットおよびその合成は、国際特許出願公開第ＷＯ２０１３／０５３９２８号に記載されており、これは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。本開示のアンチセンスオリゴマーは、１つ以上のトリシクロ－ＤＮＡサブユニットを組み込み得る。場合によっては、アンチセンスオリゴマーは、トリシクロ－ＤＮＡサブユニットから完全に構成され得る。トリシクロ－ＤＮＡ／トリシクロ－ホスホロチオエートサブユニットの非限定的な例が以下に示される。
Figure 2022511055000076
６．２’－Ｏ－メチル、２’－Ｏ－ＭＯＥ、および２’－Ｆオリゴマー
「２’－Ｏ－Ｍｅオリゴマー」分子は、リボース分子の２’－ＯＨ残基にメチル基を有する。２’－Ｏ－Ｍｅ－ＲＮＡは、ＤＮＡと同じ（または類似の）挙動を示すが、ヌクレアーゼ分解から保護される。２’－Ｏ－Ｍｅ－ＲＮＡはまた、さらなる安定化のためにホスホロチオエートオリゴマー（ＰＴＯ）と組み合わせることができる。２’Ｏ－Ｍｅオリゴマー（ホスホジエステルまたはホスホロチオエート）は、当該技術分野の常用技術に従って合成することができる（例えば、Ｙｏｏ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．３２：２００８－１６，２００４（これは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）を参照）。２’Ｏ－Ｍｅオリゴマーの非限定的な例が以下に示される。
Figure 2022511055000077
２’－Ｏ－メトキシエチルオリゴマー（２’－Ｏ－ＭＯＥ）は、リボース分子の２’－ＯＨ残基にメトキシエチル基を有し、Ｍａｒｔｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｈｅｌｖ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ，７８，４８６－５０４，１９９５で考察されており、これは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。２’－Ｏ－ＭＯＥサブユニットの非限定的な例が以下に示される。
Figure 2022511055000078
２’－フルオロ（２’－Ｆ）オリゴマーは、２’－ＯＨの代わりに２’位に蛍光ラジカルを有する。２’－Ｆオリゴマーの非限定的な例が以下に示される。
Figure 2022511055000079
２’－フルオロオリゴマーは、ＷＯ２００４／０４３９７７にさらに記載されており、これは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
２’－Ｏ－メチル、２’－Ｏ－ＭＯＥ、および２’－Ｆオリゴマーはまた、以下に示されるように、１つ以上のホスホロチオエート（ＰＳ）連結を含み得る。
Figure 2022511055000080
さらに、２’－Ｏ－メチル、２’－Ｏ－ＭＯＥ、および２’－Ｆオリゴマーは、例えば、以下に示される２’－Ｏ－メチルＰＳオリゴマードリサペルセンのように、オリゴマー全体にわたってＰＳサブユニット間連結を含み得る。
Figure 2022511055000081
あるいは、２’－Ｏ－メチル、２’－Ｏ－ＭＯＥ、および／または２’－Ｆオリゴマーは、以下に示されるように、オリゴマーの末端にＰＳ連結を含み得る。
Figure 2022511055000082
式中、
Ｒは、ＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ３（メトキシエチルまたはＭＯＥ）であり、
Ｘ、Ｙ、およびＺは、それぞれ、指定された５’－ウィング、中央ギャップ、および３’－ウィングの各領域内に含有されるヌクレオチドの数を表す。
本開示のアンチセンスオリゴマーは、１つ以上の２’－Ｏ－メチル、２’－Ｏ－ＭＯＥ、および２’－Ｆサブユニットを組み込み得、本明細書に記載されるサブユニット間連結のいずれかを利用し得る。いくつかの事例において、本開示のアンチセンスオリゴマーは、２’－Ｏ－メチル、２’－Ｏ－ＭＯＥ、または２’－Ｆサブユニットから完全に構成され得る。本開示のアンチセンスオリゴマーの一実施形態は、２’－Ｏ－メチルサブユニットから完全になる。
７．２’－Ｏ－［２－（Ｎ－メチルカルバモイル）エチル］オリゴマー（ＭＣＥ）
ＭＣＥは、本開示のアンチセンスオリゴマーで有用な２’－Ｏ修飾リボヌクレオシドの別の例である。ここで、２’－ＯＨは、ヌクレアーゼ耐性を高めるために２－（Ｎ－メチルカルバモイル）エチル部分へと誘導体化される。ＭＣＥオリゴマーの非限定的な例が以下に示される。
Figure 2022511055000083
ＭＣＥおよびその合成は、Ｙａｍａｄａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．（２０１１）７６（９）：３０４２－５３に記載され、これは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。本開示のアンチセンスオリゴマーは、１つ以上のＭＣＥサブユニットを組み込み得る。
８．立体特異的オリゴマー
立体特異的オリゴマーは、各リン含有連結の立体化学が、実質的に立体的に純粋なオリゴマーが産生されるような合成方法によって固定されるものである。立体特異的オリゴマーの非限定的な例が以下に示される。
Figure 2022511055000084
上記の例において、オリゴマーの各リンは、同一の立体配置を有する。追加の例としては、本明細書に記載されるオリゴマーが挙げられる。例えば、ＬＮＡ、ＥＮＡ、トリシクロ－ＤＮＡ、ＭＣＥ、２’－Ｏ－メチル、２’－Ｏ－ＭＯＥ、２’－Ｆ、およびモルホリノ系オリゴマーは、立体特異的リン含有ヌクレオシド間連結、例えば、ホスホロチオエート、ホスホジエステル、ホスホロアミダート、ホスホロジアミデート、または他のリン含有ヌクレオシド間連結などを用いて調製することができる。そのようなオリゴマーの調製で使用するための立体特異的オリゴマー、調製方法、キラル制御合成、キラル設計、およびキラル補助剤は、例えば、ＷＯ２０１７／１９２６６４、ＷＯ２０１７／１９２６７９、ＷＯ２０１７／０６２８６２、ＷＯ２０１７／０１５５７５、ＷＯ２０１７／０１５５５５、ＷＯ２０１５／１０７４２５、ＷＯ２０１５／１０８０４８、ＷＯ２０１５／１０８０４６、ＷＯ２０１５／１０８０４７、ＷＯ２０１２／０３９４４８、ＷＯ２０１０／０６４１４６、ＷＯ２０１１／０３４０７２、ＷＯ２０１４／０１０２５０、ＷＯ２０１４／０１２０８１、ＷＯ２０１３／０１２７８５８、およびＷＯ２０１１／００５７６１に詳述されており、これらの各々は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
立体特異的オリゴマーは、ＲＰまたはＳＰ配置においてリン含有ヌクレオシド間連結を有し得る。連結の立体配置が制御されるキラルリン含有連結は、「立体純粋」と称され、連結の立体配置が制御されないキラルリン含有連結は、「立体不規則的」と称される。ある特定の実施形態において、本開示のオリゴマーは、複数の立体純粋および立体不規則的連結を含み、これにより得られるオリゴマーは、オリゴマーの予め指定された位置に立体純粋サブユニットを有する。立体純粋サブユニットの位置の例は、図７Ａおよび図７Ｂの国際特許出願公開第ＷＯ２０１７／０６２８６２（Ａ２）号に提供される。一実施形態において、オリゴマー中の全てのキラルリン含有連結は、立体不規則的である。一実施形態において、オリゴマー中の全てのキラルリン含有連結は、立体純粋である。
ｎ個（ｎは１以上の整数である）のキラルリン含有連結を有するオリゴマーの一実施形態において、オリゴマー中のｎ個全てのキラルリン含有連結は、立体不規則的である。ｎ個（ｎは１以上の整数である）のキラルリン含有連結を有するオリゴマーの一実施形態において、オリゴマー中のｎ個全てのキラルリン含有連結は、立体純粋である。ｎ個（ｎは１以上の整数である）のキラルリン含有連結を有するオリゴマーの一実施形態において、オリゴマー中のｎ個のリン含有連結のうちの少なくとも１０％（整数に四捨五入）は、立体純粋である。ｎ個（ｎは１以上の整数である）のキラルリン含有連結を有するオリゴマーの一実施形態において、オリゴマー中のｎ個のリン含有連結のうちの少なくとも２０％（整数に四捨五入）は、立体純粋である。ｎ個（ｎは１以上の整数である）のキラルリン含有連結を有するオリゴマーの一実施形態において、オリゴマー中のｎ個のリン含有連結のうちの少なくとも３０％（整数に四捨五入）は、立体純粋である。ｎ個（ｎは１以上の整数である）のキラルリン含有連結を有するオリゴマーの一実施形態において、オリゴマー中のｎ個のリン含有連結のうちの少なくとも４０％（整数に四捨五入）は、立体純粋である。ｎ個（ｎは１以上の整数である）のキラルリン含有連結を有するオリゴマーの一実施形態において、オリゴマー中のｎ個のリン含有連結のうちの少なくとも５０％（整数に四捨五入）は、立体純粋である。ｎ個（ｎは１以上の整数である）のキラルリン含有連結を有するオリゴマーの一実施形態において、オリゴマー中のｎ個のリン含有連結のうちの少なくとも６０％（整数に四捨五入）は、立体純粋である。ｎ個（ｎは１以上の整数である）のキラルリン含有連結を有するオリゴマーの一実施形態において、オリゴマー中のｎ個のリン含有連結のうちの少なくとも７０％（整数に四捨五入）は、立体純粋である。ｎ個（ｎは１以上の整数である）のキラルリン含有連結を有するオリゴマーの一実施形態において、オリゴマー中のｎ個のリン含有連結のうちの少なくとも８０％（整数に四捨五入）は、立体純粋である。ｎ個（ｎは１以上の整数である）のキラルリン含有連結を有するオリゴマーの一実施形態において、オリゴマー中のｎ個のリン含有連結のうちの少なくとも９０％（整数に四捨五入）は、立体純粋である。
ｎ個（ｎは１以上の整数である）のキラルリン含有連結を有するオリゴマーの一実施形態において、オリゴマーは、同じ立体配向（すなわち、ＳＰまたはＲＰのいずれか）の少なくとも２個の連続的な立体純粋リン含有連結を含有する。ｎ個（ｎは１以上の整数である）のキラルリン含有連結を有するオリゴマーの一実施形態において、オリゴマーは、同じ立体配向（すなわち、ＳＰまたはＲＰのいずれか）の少なくとも３個の連続的な立体純粋リン含有連結を含有する。ｎ個（ｎは１以上の整数である）のキラルリン含有連結を有するオリゴマーの一実施形態において、オリゴマーは、同じ立体配向（すなわち、ＳＰまたはＲＰのいずれか）の少なくとも４個の連続的な立体純粋リン含有連結を含有する。ｎ個（ｎは１以上の整数である）のキラルリン含有連結を有するオリゴマーの一実施形態において、オリゴマーは、同じ立体配向（すなわち、ＳＰまたはＲＰのいずれか）の少なくとも５個の連続的な立体純粋リン含有連結を含有する。ｎ個（ｎは１以上の整数である）のキラルリン含有連結を有するオリゴマーの一実施形態において、オリゴマーは、同じ立体配向（すなわち、ＳＰまたはＲＰのいずれか）の少なくとも６個の連続的な立体純粋リン含有連結を含有する。ｎ個（ｎは１以上の整数である）のキラルリン含有連結を有するオリゴマーの一実施形態において、オリゴマーは、同じ立体配向（すなわち、ＳＰまたはＲＰのいずれか）の少なくとも７個の連続的な立体純粋リン含有連結を含有する。ｎ個（ｎは１以上の整数である）のキラルリン含有連結を有するオリゴマーの一実施形態において、オリゴマーは、同じ立体配向（すなわち、ＳＰまたはＲＰのいずれか）の少なくとも８個の連続的な立体純粋リン含有連結を含有する。ｎ個（ｎは１以上の整数である）のキラルリン含有連結を有するオリゴマーの一実施形態において、オリゴマーは、同じ立体配向（すなわち、ＳＰまたはＲＰのいずれか）の少なくとも９個の連続的な立体純粋リン含有連結を含有する。ｎ個（ｎは１以上の整数である）のキラルリン含有連結を有するオリゴマーの一実施形態において、オリゴマーは、同じ立体配向（すなわち、ＳＰまたはＲＰのいずれか）の少なくとも１０個の連続的な立体純粋リン含有連結を含有する。ｎ個（ｎは１以上の整数である）のキラルリン含有連結を有するオリゴマーの一実施形態において、オリゴマーは、同じ立体配向（すなわち、ＳＰまたはＲＰのいずれか）の少なくとも１１個の連続的な立体純粋リン含有連結を含有する。ｎ個（ｎは１以上の整数である）のキラルリン含有連結を有するオリゴマーの一実施形態において、オリゴマーは、同じ立体配向（すなわち、ＳＰまたはＲＰのいずれか）の少なくとも１２個の連続的な立体純粋リン含有連結を含有する。ｎ個（ｎは１以上の整数である）のキラルリン含有連結を有するオリゴマーの一実施形態において、オリゴマーは、同じ立体配向（すなわち、ＳＰまたはＲＰのいずれか）の少なくとも１３個の連続的な立体純粋リン含有連結を含有する。ｎ個（ｎは１以上の整数である）のキラルリン含有連結を有するオリゴマーの一実施形態において、オリゴマーは、同じ立体配向（すなわち、ＳＰまたはＲＰのいずれか）の少なくとも１４個の連続的な立体純粋リン含有連結を含有する。ｎ個（ｎは１以上の整数である）のキラルリン含有連結を有するオリゴマーの一実施形態において、オリゴマーは、同じ立体配向（すなわち、ＳＰまたはＲＰのいずれか）の少なくとも１５個の連続的な立体純粋リン含有連結を含有する。ｎ個（ｎは１以上の整数である）のキラルリン含有連結を有するオリゴマーの一実施形態において、オリゴマーは、同じ立体配向（すなわち、ＳＰまたはＲＰのいずれか）の少なくとも１６個の連続的な立体純粋リン含有連結を含有する。ｎ個（ｎは１以上の整数である）のキラルリン含有連結を有するオリゴマーの一実施形態において、オリゴマーは、同じ立体配向（すなわち、ＳＰまたはＲＰのいずれか）の少なくとも１７個の連続的な立体純粋リン含有連結を含有する。ｎ個（ｎは１以上の整数である）のキラルリン含有連結を有するオリゴマーの一実施形態において、オリゴマーは、同じ立体配向（すなわち、ＳＰまたはＲＰのいずれか）の少なくとも１８個の連続的な立体純粋リン含有連結を含有する。ｎ個（ｎは１以上の整数である）のキラルリン含有連結を有するオリゴマーの一実施形態において、オリゴマーは、同じ立体配向（すなわち、ＳＰまたはＲＰのいずれか）の少なくとも１９個の連続的な立体純粋リン含有連結を含有する。ｎ個（ｎは１以上の整数である）のキラルリン含有連結を有するオリゴマーの一実施形態において、オリゴマーは、同じ立体配向（すなわち、ＳＰまたはＲＰのいずれか）の少なくとも２０個の連続的な立体純粋リン含有連結を含有する。
ｎ個（ｎは１以上の整数である）のキラルリン含有連結を有するオリゴマーの一実施形態において、オリゴマーは、同じ立体配向（すなわち、ＳＰまたはＲＰのいずれか）の少なくとも２個の連続的な立体純粋リン含有連結と、他の立体配向の少なくとも２個の連続的な立体純粋リン含有連結とを含有する。例えば、オリゴマーは、ＳＰ配向の少なくとも２個の連続的な立体純粋リン含有連結のと、ＲＰ配向の少なくとも２個の連続的な立体純粋リン含有連結とを含有し得る。
ｎ個（ｎは１以上の整数である）のキラルリン含有連結を有するオリゴマーの一実施形態において、オリゴマーは、交互のパターンで同じ立体配向の少なくとも２個の連続的な立体純粋リン含有連結を含有する。例えば、オリゴマーは、順番に、以下：２個以上のＲＰ、２個以上のＳＰ、および２個以上のＲＰ等を含有し得る。
９．モルホリノオリゴマー
本開示の例示的な実施形態は、以下の一般構造：
Figure 2022511055000085
 の、かつＳｕｍｍｅｒｔｏｎ，Ｊ．，ｅｔ ａｌ．，Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ＆Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，７：１８７－１９５（１９９７）の図２に記載されるような、ホスホロジアミデートモルホリノオリゴマーに関する。本明細書に記載されるモルホリノは、上記の一般構造の全ての立体異性体および互変異性体を含むことが意図されている。モルホリノオリゴマーの合成、構造、および結合特性は、米国特許第５，６９８，６８５号、同第５，２１７，８６６号、同第５，１４２，０４７号、同第５，０３４，５０６号、同第５，１６６，３１５号、同第５，５２１，０６３号、同第５，５０６，３３７号、同第８，０７６，４７６号、および同第８，２９９，２０６号に詳述されており、これらの全ては、参照により本明細書に組み込まれる。
ある特定の実施形態において、モルホリノは、オリゴマーの５’または３’末端で「テール」部分とコンジュゲートされて、その安定性および／または溶解性を高める。例示的なテールは、
Figure 2022511055000086
 を含み、
「テール」部分の遠位－ＯＨまたは－ＮＨ２は、任意に細胞膜透過性ペプチドに連結される。
様々な態様において、本開示は、式（Ｉ）に従うアンチセンスオリゴマー、
Figure 2022511055000087
 またはその薬学的に許容される塩を提供し、式中、
各Ｎｕは、一緒になって標的化配列を形成する核酸塩基であり、
Ｔは、
Figure 2022511055000088
 から選択される部分であり、Ｔ部分の遠位－ＯＨまたは－ＮＨ２は、細胞膜透過性ペプチドに任意で連結され、
Ｒ１００は、水素または細胞膜透過性ペプチドであり、
１～ｎ個の各Ｎｕは、５’から３’に、以下のうちの１つにおける核酸塩基に対応し、
Figure 2022511055000089
 式中、Ａは、
Figure 2022511055000090
 であり、Ｃは、
Figure 2022511055000091
 であり、Ｇは、
Figure 2022511055000092
 であり、Ｔは、
Figure 2022511055000093
 である。
いくつかの実施形態において、１～ｎ個の各Ｎｕは、５’から３’に、以下：配列番号１、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、または配列番号９のうちの１つに対応する。いくつかの実施形態において、１～ｎ個の各Ｎｕは、５’から３’に、配列番号３に対応する。
様々な実施形態において、Ｔは、
Figure 2022511055000094
 であり、Ｔ部分の遠位－ＯＨは、任意に細胞膜透過性ペプチドに連結される。
様々な実施形態において、Ｒ１００は、水素である。様々な他の実施形態において、Ｒ１００は、細胞膜透過性ペプチドである。様々な実施形態において、Ｒ１００は、－Ｒ５（配列番号：２１）である。様々な他の実施形態において、Ｒ１００は、－Ｇ－Ｒ５（配列番号：２０）である。様々な実施形態において、Ｒ１００は、－Ｒ６（配列番号：１０）である。様々な他の実施形態において、Ｒ１００は、－Ｇ－Ｒ６（配列番号：１１）である。
いくつかの実施形態において、式（Ｉ）のアンチセンスオリゴマーは、遊離塩基形態である。いくつかの実施形態において、式（Ｉ）のアンチセンスオリゴマーは、その薬学的に許容される塩である。いくつかの実施形態において、式（Ｉ）のアンチセンスオリゴマーは、そのＨＣｌ（塩酸）塩である。ある特定の実施形態において、ＨＣｌ塩は、１ＨＣｌ、２ＨＣｌ、３ＨＣｌ、４ＨＣｌ、５ＨＣｌ、または６ＨＣｌ塩である。ある特定の実施形態において、ＨＣｌ塩は、６ＨＣｌ塩である。
様々な実施形態において、Ｔは、
Figure 2022511055000095
 であり、Ｔ部分の遠位－ＯＨは、任意に細胞膜透過性ペプチドに連結され、Ｒ１００は、細胞膜透過ペプチドである。
様々な実施形態において、Ｔは、
Figure 2022511055000096
 であり、Ｒ１００は、細胞膜透過性ペプチドである。
様々な実施形態において、Ｔは、
Figure 2022511055000097
 であり、Ｒ１００は、－Ｇ－Ｒ５（配列番号：２０）である。
様々な実施形態において、Ｔは、
Figure 2022511055000098
 であり、Ｒ１００は、－Ｇ－Ｒ６（配列番号：１１）である。
いくつかの実施形態において、本開示のアンチセンスオリゴマーは、式（ＩＩ）に従うか、
Figure 2022511055000099
 またはその薬学的に許容される塩であり、式中、１～ｎ個の各Ｎｕは、５’から３’に、以下のうちの１つにおける核酸塩基に対応し、
Figure 2022511055000100
 式中、Ａは、
Figure 2022511055000101
 であり、Ｃは、
Figure 2022511055000102
 であり、Ｇは、
Figure 2022511055000103
 であり、Ｔは、
Figure 2022511055000104
 である。
いくつかの実施形態において、式（ＩＩ）の遠位－ＯＨは、細胞膜透過性ペプチドに連結される。
いくつかの実施形態において、１～ｎ個の各Ｎｕは、５’から３’に、以下：配列番号１、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、または配列番号９のうちの１つに対応する。いくつかの実施形態において、１～ｎ個の各Ｎｕは、５’から３’に、配列番号３に対応する。
いくつかの実施形態において、式（ＩＩ）のアンチセンスオリゴマーは、遊離塩基形態である。いくつかの実施形態において、式（ＩＩ）のアンチセンスオリゴマーは、その薬学的に許容される塩形態である。いくつかの実施形態において、式（ＩＩ）のアンチセンスオリゴマーは、そのＨＣｌ（塩酸）塩である。ある特定の実施形態において、ＨＣｌ塩は、１ＨＣｌ、２ＨＣｌ、３ＨＣｌ、４ＨＣｌ、５ＨＣｌ、または６ＨＣｌ塩である。ある特定の実施形態において、ＨＣｌ塩は、６ＨＣｌ塩である。
いくつかの実施形態において、本開示のアンチセンスオリゴマーは、式（ＩＩＩ）に従うか、
Figure 2022511055000105
 またはその薬学的に許容される塩であり、式中、１～ｎ個の各Ｎｕは、５’から３’に、以下のうちの１つにおける核酸塩基に対応し、
Figure 2022511055000106
 式中、Ａは、
Figure 2022511055000107
 であり、Ｃは、
Figure 2022511055000108
 であり、Ｇは、
Figure 2022511055000109
 であり、Ｔは、
Figure 2022511055000110
 である。
いくつかの実施形態において、式（ＩＩＩ）の遠位－ＯＨは、細胞膜透過性ペプチドに連結される。
いくつかの実施形態において、式（ＩＩＩ）の遠位－ＯＨは、任意に細胞膜透過性ペプチドに連結される。
いくつかの実施形態において、１～ｎ個の各Ｎｕは、５’から３’に、以下：配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、または配列番号９のうちの１つに対応する。いくつかの実施形態において、１～ｎ個の各Ｎｕは、５’から３’に、配列番号３に対応する。
いくつかの実施形態において、式（ＩＩＩ）のアンチセンスオリゴマーは、遊離塩基形態である。いくつかの実施形態において、式（ＩＩＩ）のアンチセンスオリゴマーは、その薬学的に許容される塩である。いくつかの実施形態において、式（ＩＩＩ）のアンチセンスオリゴマーは、そのＨＣｌ（塩酸）塩である。ある特定の実施形態において、ＨＣｌ塩は、６ＨＣｌ塩である。
いくつかの実施形態において、本開示のアンチセンスオリゴマーは、式（ＩＶ）に従い、
Figure 2022511055000111
 式中、１～ｎ個の各Ｎｕは、５’から３’に、以下のうちの１つにおける核酸塩基に対応し、
Figure 2022511055000112
 式中、Ａは、
Figure 2022511055000113
 であり、Ｃは、
Figure 2022511055000114
 であり、Ｇは、
Figure 2022511055000115
 であり、Ｔは、
Figure 2022511055000116
 である。
いくつかの実施形態において、式（ＩＶ）の遠位－ＯＨは、任意に細胞膜透過性ペプチドに連結される。
いくつかの実施形態において、１～ｎ個の各Ｎｕは、５’から３’に、以下：配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、または配列番号９のうちの１つに対応する。いくつかの実施形態において、１～ｎ個の各Ｎｕは、５’から３’に、配列番号３に対応する。
例えば、式（ＩＶ）のいくつかの実施形態を含む、いくつかの実施形態において、本開示のアンチセンスオリゴマーは、式（ＩＶａ）に従う。
Figure 2022511055000117
いくつかの実施形態において、本開示のアンチセンスオリゴマーは、式（Ｖ）に従うか、
Figure 2022511055000118
 またはその薬学的に許容される塩であり、式中、１～ｎ個の各Ｎｕは、５’から３’に、以下のうちの１つにおける核酸塩基に対応し、
Figure 2022511055000119
 式中、Ａは、
Figure 2022511055000120
 であり、Ｃは、
Figure 2022511055000121
 であり、Ｇは、
Figure 2022511055000122
 であり、Ｔは、
Figure 2022511055000123
 である。
いくつかの実施形態において、式（ＩＶ）の遠位－ＯＨは、細胞膜透過性ペプチドに連結される。
いくつかの実施形態において、式（Ｖ）の遠位－ＯＨは、任意に細胞膜透過性ペプチドに連結される。
いくつかの実施形態において、１～ｎ個の各Ｎｕは、５’から３’に、以下：配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、または配列番号９のうちの１つに対応する。いくつかの実施形態において、１～ｎ個の各Ｎｕは、５’から３’に、配列番号３に対応する。
いくつかの実施形態において、式（Ｖ）のアンチセンスオリゴマーは、遊離塩基形態である。いくつかの実施形態において、式（Ｖ）のアンチセンスオリゴマーは、その薬学的に許容される塩である。いくつかの実施形態において、式（Ｖ）のアンチセンスオリゴマーは、そのＨＣｌ（塩酸）塩である。ある特定の実施形態において、ＨＣｌ塩は、５ＨＣｌ塩である。
いくつかの実施形態において、本開示のアンチセンスオリゴマーは、式（ＶＩ）に従い、
Figure 2022511055000124
 式中、１～ｎ個の各Ｎｕは、５’から３’に、以下のうちの１つにおける核酸塩基に対応し、
Figure 2022511055000125
 式中、Ａは、
Figure 2022511055000126
 であり、Ｃは、
Figure 2022511055000127
 であり、Ｇは、
Figure 2022511055000128
 であり、Ｔは、
Figure 2022511055000129
 である。
いくつかの実施形態において、式（ＶＩ）の遠位－ＯＨは、任意に細胞膜透過性ペプチドに連結される。
いくつかの実施形態において、１～ｎ個の各Ｎｕは、５’から３’に、以下：配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、または配列番号９のうちの１つに対応する。いくつかの実施形態において、１～ｎ個の各Ｎｕは、５’から３’に、配列番号３に対応する。
１０．核酸塩基修飾および置換
ある特定の実施形態において、本開示のアンチセンスオリゴマーは、ＲＮＡ核酸塩基およびＤＮＡ核酸塩基（多くの場合、当該技術分野では単に「塩基」と称される）から構成される。ＲＮＡ塩基は、アデニン（Ａ）、ウラシル（Ｕ）、シトシン（Ｃ）、およびグアニン（Ｇ）として一般的に既知である。ＤＮＡ塩基は、アデニン（Ａ）、チミン（Ｔ）、シトシン（Ｃ）、およびグアニン（Ｇ）として一般的に既知である。様々な実施形態において、本開示のアンチセンスオリゴマーは、シトシン（Ｃ）、グアニン（Ｇ）、チミン（Ｔ）、アデニン（Ａ）、５－メチルシトシン（５ｍＣ）、ウラシル（Ｕ）、およびヒポキサンチン（Ｉ）から構成される。
ある特定の実施形態において、オリゴマー中の１つ以上のＲＮＡ塩基またはＤＮＡ塩基は、ＲＮＡ塩基またはＤＮＡ塩基以外の塩基で修飾または置換され得る。修飾または置換塩基を含有するオリゴマーは、核酸中で最も一般的に見られる１つ以上のプリンまたはピリミジン塩基が、それほど一般的ではないか、または非天然の塩基で置換されたオリゴマーを含む。
プリン塩基は、以下の一般式によって記載されるように、イミダゾール環に融合したピリミジン環を含む。
Figure 2022511055000130
アデニンおよびグアニンは、核酸中で最も一般的に見られる２つのプリン核酸塩基である。他の自然発生的プリンとしては、Ｎ６－メチルアデニン、Ｎ２－メチルグアニン、ヒポキサンチン、および７－メチルグアニンが挙げられるが、これらに限定されない。
ピリミジン塩基は、以下の一般式によって記載されるように、６員ピリミジン環を含む。
Figure 2022511055000131
シトシン、ウラシル、およびチミンは、核酸中で最も一般的に見られるピリミジン塩基である。他の自然発生的ピリミジンとしては、５－メチルシトシン、５－ヒドロキシメチルシトシン、偽ウラシル、および４－チオウラシルが挙げられるが、これらに限定されない。一実施形態において、本明細書に記載されるオリゴマーは、ウラシルの代わりにチミン塩基を含有する。
他の好適な塩基としては、２，６－ジアミノプリン、オロチン酸、アグマチジン、リシジン、２－チオピリミジン（例えば、２－チオウラシル、２－チオチミン）、Ｇ－クランプおよびその誘導体、５－置換ピリミジン（例えば、５－ハロウラシル、５－プロピニルウラシル、５－プロピニルシトシン、５－アミノメチルウラシル、５－ヒドロキシメチルウラシル、５－アミノメチルシトシン、５－ヒドロキシメチルシトシン、スーパーＴ）、７－デアザグアニン、７－デアザアデニン、７－アザ－２，６－ジアミノプリン、８－アザ－７－デアザグアニン、８－アザ－７－デアザアデニン、８－アザ－７－デアザ－２，６－ジアミノプリン、スーパーＧ、スーパーＡ、およびＮ４－エチルシトシン、またはそれらの誘導体；Ｎ２－シクロペンチルグアニン（ｃＰｅｎｔ－Ｇ）、Ｎ２－シクロペンチル－２－アミノプリン（ｃＰｅｎｔ－ＡＰ）、およびＮ２－プロピル－２－アミノプリン（Ｐｒ－ＡＰ）、偽ウラシル、またはそれらの誘導体；ならびに２，６－ジフルオロトルエンのような縮重塩基もしくはユニバーサル塩基、または脱塩基部位のような非存在塩基（例えば、１－デオキシリボース、１，２－ジデオキシリボース、１－デオキシ－２－Ｏ－メチルリボース；または環酸素が窒素で置換されているピロリジン誘導体（アザリボース））が挙げられるが、これらに限定されない。スーパーＡ、スーパーＧ、およびスーパーＴの誘導体の例は、米国特許第６，６８３，１７３号（Ｅｐｏｃｈ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）に見ることができ、これは、参照により完全に本明細書に組み込まれる。ｃＰｅｎｔ－Ｇ、ｃＰｅｎｔ－ＡＰ、およびＰｒ－ＡＰは、ｓｉＲＮＡに組み込まれた場合、免疫賦活作用を低減することが示された（Ｐｅａｃｏｃｋ Ｈ．ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．２０１１，１３３，９２００）。偽ウラシルは、ウラシルの自然発生的異性化バージョンであり、ウリジンにおける通常のＮ－グリコシドというよりむしろＣ－グリコシドによる。偽ウリジン含有合成ｍＲＮＡは、ウリジン含有ｍＰｖＮＡと比較して、改善された安全性プロファイルを有し得る（ＷＯ２００９／１２７２３０、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。
ある特定の核酸塩基は、本開示のアンチセンスオリゴマーの結合親和性を高めるために特に有用である。これらには、５－置換ピリミジン、６－アザピリミジン、ならびにＮ－２、Ｎ－６、およびＯ－６置換プリン（２－アミノプロピルアデニン、５－プロピニルウラシル、および５－プロピニルシトシンを含む）が含まれる。５－メチルシトシン置換は、核酸二本鎖の安定性を０．６～１．２℃増加させることが示されており、さらに具体的には、２’－Ｏ－メトキシエチル糖修飾と組み合わせた場合に、現在より好ましい塩基置換である。追加の例示的な修飾核酸塩基には、核酸塩基の少なくとも１つの水素原子がフッ素で置換されているものが含まれる。
１１．アンチセンスオリゴマーの薬学的に許容される塩
本明細書に記載されるアンチセンスオリゴマーのある特定の実施形態は、アミノまたはアルキルアミノなどの塩基性官能基を含有し得、ひいては薬学的に許容される酸と薬学的に許容される塩を形成することができる。この点における「薬学的に許容される塩」という用語は、本開示のアンチセンスオリゴマーの比較的非毒性の無機酸および有機酸付加塩を指す。これらの塩は、投与ビヒクルまたは剤形製造プロセスにおいて原位置で調製される得か、または本開示の精製されたアンチセンスオリゴマーを、その遊離塩基形態で、好適な有機酸もしくは無機酸と別々に反応させ、その後の精製中にそのようにして形成された塩を単離することによって調製され得る。代表的な塩としては、臭化水素酸塩、塩酸塩、硫酸塩、重硫酸塩、リン酸塩、硝酸塩、酢酸塩、吉草酸塩、オレイン酸塩、パルミチン酸塩、ステアリン酸塩、ラウリン酸塩、安息香酸塩、乳酸塩、トシル酸塩、クエン酸塩、マレイン酸塩、フマル酸塩、コハク酸塩、酒石酸塩、ナフチル酸塩、メシル酸塩、グルコヘプトン酸塩、ラクトビオン酸塩、およびラウリルスルホン酸塩などが挙げられる。（例えば、Ｂｅｒｇｅ ｅｔ ａｌ．（１９７７）「Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓａｌｔｓ」，Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．６６：１－１９を参照）。
主題のアンチセンスオリゴマーの薬学的に許容される塩は、例えば、非毒性の有機酸または無機酸からの、アンチセンスオリゴマーの従来的な非毒性塩または第四級アンモニウム塩を含む。例えば、そのような従来的な非毒性塩としては、無機酸に由来するもの、例えば、塩酸、臭化水素酸、硫酸、スルファミン酸、リン酸、硝酸など；ならびに有機酸から調製された塩、例えば、酢酸、プロピオン酸、コハク酸、グリコール、ステアリン酸、乳酸、リンゴ酸、酒石酸、クエン酸、アスコルビン酸、パルミチン酸、マレイン酸、ヒドロキシマレイン酸、フェニル酢酸、グルタミン酸、安息香酸、サリチル酸（ｓａｌｉｃｙｃｌｉｃ）、スルファニル酸、２－アセトキシ安息香酸、フマル酸、トルエンスルホン酸、メタンスルホン酸、エタンジスルホン酸、シュウ酸、イソチオン酸（ｉｓｏｔｈｉｏｎｉｃ）などが挙げられる。
ある特定の実施形態において、本開示のアンチセンスオリゴマーは、１つ以上の酸性官能基を含有し得、ひいては薬学的に許容される塩基と薬学的に許容される塩を形成することができる。これらの事例において、「薬学的に許容される塩」という用語は、本開示のアンチセンスオリゴマーの比較的非毒性の無機塩基および有機塩基付加塩を指す。これらの塩は同様に、投与ビヒクルまたは剤形製造プロセスにおいて原位置で調製され得るか、または精製されたアンチセンスオリゴマーを、その遊離酸形態で、好適な塩基、例えば、薬学的に許容される金属カチオンの水酸化物、炭酸塩、もしくは重炭酸塩と、アンモニアと、または薬学的に許容される有機第一級アミン、第二級アミン、もしくは第三級アミンと別々に反応させることによって調製され得る。代表的なアルカリまたはアルカリ土類塩としては、リチウム、ナトリウム、カリウム、カルシウム、マグネシウム、およびアルミニウム塩などが挙げられる。塩基付加塩の形成に有用な代表的な有機アミンとしては、エチルアミン、ジエチルアミン、エチレンジアミン、エタノールアミン、ジエタノールアミン、ピペラジンなどが挙げられる。（例えば、上記のＢｅｒｇｅ ｅｔ ａｌを参照）。
ＩＩＩ．製剤および投与様式
ある特定の実施形態において、本開示は、本明細書に記載されるアンチセンスオリゴマーの治療送達に好適な製剤または医薬組成物を提供する。したがって、ある特定の実施形態において、本開示は、１つ以上の薬学的に許容される担体（添加剤）および／または希釈剤と共に製剤化した、治療有効量の本明細書に記載されるアンチセンスオリゴマーのうちの１つ以上を含む、薬学的に許容される組成物を提供する。本開示のアンチセンスオリゴマーを単独で投与することは可能であるが、アンチセンスオリゴマーを医薬製剤（組成物）として投与することが好ましい。一実施形態において、製剤のアンチセンスオリゴマーは、式（ＩＩＩ）に従うか、またはその薬学的に許容される塩である。
本開示のアンチセンスオリゴマーに適用可能であり得る核酸分子の送達のための方法は、例えば、Ａｋｈｔａｒ ｅｔ ａｌ．，１９９２，Ｔｒｅｎｄｓ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏ．，２：１３９；Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ ｆｏｒ Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，ｅｄ．Ａｋｈｔａｒ，１９９５，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ、およびＳｕｌｌｉｖａｎ ｅｔ ａｌ．，ＰＣＴ ＷＯ９４／０２５９５に記載されている。これらおよび他のプロトコルは、本開示のアンチセンスオリゴマーを含む、実質的に任意の核酸分子の送達に利用され得る。
本開示の医薬組成物は、固体または液体形態での投与のために特別に製剤化され得、以下：（１）経口投与、例えば、浸漬液（水性または非水性の溶液または懸濁液）、錠剤（口腔、舌下、または全身吸収）、ボーラス、散剤、顆粒剤、舌に適用するためのペースト、（２）例えば、滅菌溶液もしくは懸濁液または徐放性製剤としての、例えば、皮下注射、筋肉内注射、静脈内注射、または硬膜外注射による非経口投与、（３）例えば、皮膚に適用するためのクリーム、軟膏、または制御放出性パッチもしくは噴霧剤としての局所適用、（４）例えば、ペッサリー、クリーム、もしくは発泡体としての膣内投与または直腸内投与、（５）舌下投与、（６）眼内投与、（７）経皮投与、あるいは（８）経鼻投与に適合されたものを含む。
薬学的に許容される担体として役立ち得る材料のいくつかの例としては、（１）糖類、例えば、ラクトース、グルコース、およびスクロース、（２）デンプン、例えば、トウモロコシデンプンおよびジャガイモデンプン、（３）セルロースおよびその誘導体、例えば、カルボキシメチルセルロースナトリウム、エチルセルロース、および酢酸セルロース、（４）粉末トラガカント、（５）麦芽、（６）ゼラチン、（７）タルク、（８）賦形剤、例えば、ココアバターおよび坐剤ワックス、（９）油、例えば、ピーナッツ油、綿実油、サフラワー油、ゴマ油、オリーブ油、コーン油、および大豆油、（１０）グリコール、例えば、プロピレングリコール、（１１）ポリオール、例えば、グリセリン、ソルビトール、マンニトール、およびポリエチレングリコール、（１２）エステル、例えば、オレイン酸エチルおよびラウリン酸エチル、（１３）寒天、（１４）緩衝剤、例えば、水酸化マグネシウムおよび水酸化アルミニウム、（１５）アルギニン酸、（１６）発熱性物質除去蒸留水、（１７）等張生理食塩水、（１８）リンゲル液、（１９）エチルアルコール、（２０）ｐＨ緩衝液、（２１）ポリエステル、ポリカーボネート、および／またはポリ無水物、ならびに（２２）医薬製剤に用いられる他の非毒性適合性物質が挙げられるが、これらに限定されない。
本開示のアンチセンスオリゴマーを用いた製剤に好適な薬剤の追加の非限定的な例としては、ＰＥＧコンジュゲート核酸；リン脂質コンジュゲート核酸；親油性部分を含有する核酸；ホスホロチオエート；様々な組織への薬物の侵入を増強することができるＰ糖タンパク質阻害剤（Ｐｌｕｒｏｎｉｃ Ｐ８５など）；生分解性ポリマー、例えば、埋め込み後の徐放性送達のためのポリ（Ｄ，Ｌ－ラクチド－コグリコリド）ミクロスフェア（Ｅｍｅｒｉｃｈ，Ｄ Ｆ ｅｔ ａｌ．，１９９９，Ｃｅｌｌ Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ，８，４７－５８）Ａｌｋｅｒｍｅｓ，Ｉｎｃ．Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，Ｍａｓｓ．；および負荷ナノ粒子、例えば、血液脳関門にわたって薬物を送達することができ、神経取込み機構を変化させることができる、ポリブチルシアノアクリレートからなるもの（Ｐｒｏｇ Ｎｅｕｒｏｐｓｙｃｈｏｐｈａｒｍａｃｏｌ Ｂｉｏｌ Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｙ，２３，９４１－９４９，１９９９）が挙げられる。
本開示はまた、ポリ（エチレングリコール）（「ＰＥＧ」）脂質（ＰＥＧ修飾、分岐、および非分岐、もしくはそれらの組み合わせ、または長期循環型リポソームもしくはステルスリポソーム）を含有する、表面修飾リポソームを含む組成物の使用を特徴とする。本開示のオリゴマーコンジュゲートはまた、様々な分子量の共有結合ＰＥＧ分子も含むことができる。これらの製剤は、標的組織における薬物の蓄積を増加させるための方法を提供する。このクラスの薬物担体は、単核細胞貪食系（ＭＰＳまたはＲＥＳ）によるオプソニン化および排除に抵抗し、それにより、封入薬物の血液循環時間の延長および組織曝露の増強を可能にする（Ｌａｓｉｃ ｅｔ ａｌ．Ｃｈｅｍ．Ｒｅｖ．１９９５，９５，２６０１－２６２７、Ｉｓｈｉｗａｔａ ｅｔ ａｌ．，Ｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｕｌｌ．１９９５，４３，１００５－１０１１）。そのようなリポソームは、おそらく溢血および血管新生標的組織における捕捉によって、腫瘍に選択的に蓄積することが示されている（Ｌａｓｉｃ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ １９９５，２６７，１２７５－１２７６、Ｏｋｕ ｅｔ ａｌ．，１９９５，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，１２３８，８６－９０）。長期循環型リポソームは、特にＭＰＳの組織に蓄積することが知られている従来的なカチオン性リポソームと比較して、ＤＮＡおよびＲＮＡの薬物動態および薬力学を増強する（Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９９５，４２，２４８６４－２４８７０、Ｃｈｏｉ ｅｔ ａｌ．，国際ＰＣＴ公開第ＷＯ９６／１０３９１号、Ａｎｓｅｌｌ ｅｔ ａｌ．，国際ＰＣＴ公開第ＷＯ９６／１０３９０号、Ｈｏｌｌａｎｄ ｅｔ ａｌ．，国際ＰＣＴ公開第ＷＯ９６／１０３９２号）。また、長期循環型リポソームは、肝臓や脾臓などの代謝的に攻撃的なＭＰＳ組織において蓄積を回避するそれらの能力に基づいて、カチオン性リポソームと比較して、より大きい程度まで薬物をヌクレアーゼ分解から保護する可能性が高い。
さらなる実施形態において、本開示は、米国特許 第６，６９２，９１１号、同第７，１６３，６９５号、および同第７，０７０，８０７号に記載されるような、送達のために調製されたアンチセンスオリゴマー医薬組成物を含む。この点に関して、一実施形態において、本開示は、単独で、あるいはＰＥＧ（例えば、分岐もしくは非分岐ＰＥＧ、または両方の混合物）と組み合わせて、ＰＥＧおよび標的化部分と組み合わせて、あるいは架橋剤と組み合わせた上記のいずれかの、リシンおよびヒスチジン（ＨＫ）のコポリマーを含む組成物中の本開示のアンチセンスオリゴマー（米国特許第７，１６３，６９５号、同第７，０７０，８０７号、および６，６９２，９１１号に記載）を提供する。ある特定の実施形態において、本開示は、グルコン酸修飾ポリヒスチジンまたはグルコニル化ポリヒスチジン／トランスフェリン－ポリリシンを含む医薬組成物中のアンチセンスオリゴマーを提供する。当業者であれば、ＨｉｓおよびＬｙｓに類似した特性を有するアミノ酸が組成物内で置換され得ることも認識するであろう。
湿潤剤、乳化剤、および潤滑剤（ラウリル硫酸ナトリウムおよびステアリン酸マグネシウムなど）、着色剤、離型剤、コーティング剤、甘味剤、香味剤、芳香剤、防腐剤、ならびに酸化防止剤も組成物中に存在し得る。
薬学的に許容される酸化防止剤の例としては、（１）水溶性酸化防止剤、例えば、アスコルビン酸、システイン塩酸塩、重硫酸ナトリウム、メタ重亜硫酸ナトリウム、亜硫酸ナトリウムなど、（２）油溶性酸化防止剤、例えば、パルミチン酸アスコルビル、ブチル化ヒドロキシアニソール（ＢＨＡ）、ブチル化ヒドロキシトルエン（ＢＨＴ）、レシチン、没食子酸プロピル、アルファ－トコフェロールなど、および（３）金属キレート剤、例えば、クエン酸、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、ソルビトール、酒石酸、リン酸などが挙げられる。
本開示の製剤としては、経口、経鼻、局所（口腔および舌下を含む）、直腸、膣、および／または非経口投与に好適な製剤が挙げられる。製剤は、便利に単位剤形で提示され得、薬学の技術分野で周知の任意の方法によって調製され得る。単一剤形を生成するために担体材料と組み合わされ得る有効成分の量は、治療される対象および特定の投与様式に応じて異なる。単一剤形を生成するために担体材料と組み合わされ得る有効成分の量は、概して、治療効果をもたらす活性成分の量である。概して、この量は、有効成分の約０．１パーセント～約９９パーセント、好ましくは約５パーセント～約７０パーセント、最も好ましくは約１０パーセント～約３０パーセントの範囲である。
ある特定の実施形態において、本開示の製剤は、シクロデキストリン、セルロース、リポソーム、ミセル形成剤、例えば、胆汁酸、およびポリマー担体、例えば、ポリエステルおよびポリ無水物から選択される賦形剤と、本開示のアンチセンスオリゴマーと、を含む。一実施形態において、製剤のアンチセンスオリゴマーは、式（ＩＶ）に従う。一実施形態において、製剤のアンチセンスオリゴマーは、式（ＩＶａ）に従う。ある特定の実施形態において、上記の製剤は、本開示のアンチセンスオリゴマーを経口的にバイオアベイラビリティにする。
これらの製剤または医薬組成物を調製する方法は、本開示のアンチセンスオリゴマーを、担体、および任意に１つ以上の副成分と会合させるステップを含む。概して、製剤は、本開示のアンチセンスオリゴマーを、液体担体、もしくは微粉化固体担体、またはその両方と均一かつ密接に会合させ、次いで、必要に応じて生成物を成形することによって調製される。
経口投与に好適な本開示の製剤は、カプセル、カシェ、丸剤、錠剤、トローチ（風味付けした基剤、通常はスクロースおよびアカシアもしくはトラガカントを使用）、散剤、顆粒剤、または水性もしく非水性液体の溶液もしくは懸濁液として、または水中油もしくは油中水の液体エマルションとして、またはエリキシル剤もしくはシロップとして、または香錠（不活性塩基、例えば、ゼラチンおよびグリセリン、もしくはスクロースおよびアカシアを使用）として、および／または口内洗浄液として、などの形態であり得、各々が、有効成分として、所定量の本開示のアンチセンスオリゴマーを含有する。本開示のアンチセンスオリゴマーはまた、ボーラス、舐剤、またはペーストとして投与され得る。
経口投与のための本開示の固形剤形（カプセル、錠剤、丸剤、糖剤、散剤、顆粒剤、トルーチなど）において、有効成分は、１つ以上の薬学的に許容される担体、例えば、クエン酸ナトリウムもしくはリン酸二カルシウム、および／または以下：（１）充填剤または増量剤、例えば、デンプン、ラクトース、スクロース、グルコース、マンニトール、および／またはケイ酸、（２）結合剤、例えば、カルボキシメチルセルロース、アルギン酸塩、ゼラチン、ポリビニルピロリドン、スクロース、および／またはアカシア、（３）保湿剤、例えば、グリセロール、（４）崩壊剤、例えば、寒天、炭酸カルシウム、ジャガイモまたはタピオカデンプン、アルギン酸、特定のケイ酸塩、および炭酸ナトリウム、（５）溶解遅延剤、例えば、パラフィン、（６）吸収促進剤、例えば、第四級アンモニウム化合物および界面活性剤、例えば、ポロキサマーおよびラウリル硫酸ナトリウム、（７）湿潤剤、例えば、セチルアルコール、モノステアリン酸グリセロール、および非イオン性界面活性剤、（８）吸収剤、例えば、カオリンおよびベントナイト粘土、（９）潤滑剤、例えば、タルク、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム、固体ポリエチレングリコール、ラウリル硫酸ナトリウム、ステアリン酸亜鉛、ステアリン酸ナトリウム、ステアリン酸、およびそれらの混合物、（１０）着色剤、ならびに（１１）放出制御剤、例えば、クロスポビドンまたはエチルセルロースのうちのいずれかと混合され得る。カプセル、錠剤、および丸剤の場合、医薬組成物はまた、緩衝剤を含み得る。類似の種類の固体医薬組成物はまた、ラクトースまたは乳糖、ならびに高分子量ポリエチレングリコールなどの賦形剤を使用した、軟質および硬質シェルのゼラチンカプセル中の充填剤としても用いられ得る。
錠剤は、任意に１つ以上の副成分との圧縮または成型によって作製され得る。圧縮錠剤は、結合剤（例えば、ゼラチンまたはヒドロキシプロピルメチルセルロース）、潤滑剤、不活性希釈剤、防腐剤、崩壊剤（例えば、デンプングリコール酸ナトリウムまたは架橋カルボキシメチルセルロースナトリウム）、表面活性剤または分散剤を使用して調製され得る。成型錠剤は、不活性液体希釈剤で湿らせた粉末化合物の混合物を好適な機械で成型することによって作製され得る。
本開示の医薬組成物の錠剤および他の固体剤形、例えば、糖剤、カプセル、丸剤、および顆粒は、任意に、コーティングおよびシェル、例えば、腸溶性コーティング、および医薬品製剤技術で周知の他のコーティングを用いて獲得または調製され得る。また、それらは、所望の放出プロファイル、他のポリマーマトリックス、リポソームおよび／またはミクロスフェアを提供するために、例えば、ヒドロキシプロピルメチルセルロースを様々な割合で使用して、その中の有効成分の徐放または制御放出を提供するように製剤化され得る。それらは、例えば、凍結乾燥など、迅速放出のために製剤化され得る。それらは、例えば、細菌保持フィルタを通した濾過によって、または使用直前に滅菌水中もしくはいくつかの他の滅菌注射用培地中に溶解され得る滅菌固体医薬組成物の形態の滅菌剤を組み込むことによって滅菌され得る。これらの医薬組成物はまた、任意に不透明化剤を含有し得、消化管のある特定の部分においてのみ、または消化管のある特定の部分において優先的に、任意に遅延した様式で、有効成分（複数可）を放出する組成物であり得る。使用され得る埋め込み組成物の例としては、ポリマー物質およびワックスが挙げられる。有効成分はまた、適切な場合、上記の賦形剤のうちの１つ以上を有するマイクロカプセルの形態でもあり得る。
本開示のアンチセンスオリゴマーの経口投与のための液体剤形としては、薬学的に許容されるエマルション、マイクロエマルション、溶液、懸濁液、シロップ、およびエリキシル剤が挙げられる。有効成分に加えて、液体剤形は、例えば、水または他の溶媒、可溶化剤および乳化剤、例えば、エチルアルコール、イソプロピルアルコール、炭酸エチル、酢酸エチル、ベンジルアルコール、安息香酸ベンジル、プロピレングリコール、１，３－ブチレングリコール、油（特に、綿実油、落花生油、コーン油、胚芽油、オリーブ油、ヒマシ油、およびゴマ油）、グリセロール、テトラヒドロフリルアルコール、ソルビタンのポリエチレングリコールおよび脂肪酸エステル、ならびにそれらの混合物など、当該技術分野で一般的に使用される不活性希釈剤を含有し得る。
不活性希釈剤に加えて、経口医薬組成物はまた、湿潤剤、乳化剤および懸濁剤、甘味剤、香味剤、着色剤、芳香剤、ならびに防腐剤などのアジュバントも含むことができる。
活性化合物に加えて、懸濁液は、例えば、エトキシ化イソステアリルアルコール、ポリオキシエチレンソルビトールおよびソルビタンエステル、微結晶セルロース、メタ水酸化アルミニウム、ベントナイト、寒天およびトラガカント、ならびにそれらの混合物などの懸濁剤を含有し得る。
直腸投与または膣投与のための製剤は、坐剤として提示され得、これは、本開示の１つ以上の化合物を、例えば、ココアバター、ポリエチレングリコール、坐剤ワックス、またはサリチル酸塩を含む１つ以上の好適な非刺激性賦形剤または担体と混合することによって調製され得、これは室温では固体であるが、体温では液体であり、したがって、直腸または膣腔で溶解し、活性化合物を放出する。
本明細書に提供されるオリゴマーの局所投与または経皮投与のための製剤または剤形としては、粉末、噴霧剤、軟膏、ペースト、クリーム、ローション、ゲル、溶液、パッチ、および吸入剤が挙げられる。活性オリゴマーコンジュゲートは、滅菌条件下で、薬学的に許容される担体と、および必要とされ得る任意の防腐剤、緩衝剤、または噴射剤と混合され得る。軟膏、ペースト、クリーム、およびゲルは、本開示の活性化合物に加えて、動物性および植物性脂肪、油、ワックス、パラフィン、デンプン、トラガカンス、セルロース誘導体、ポリエチレングリコール、シリコーン、ベントナイト、ケイ酸、タルク、および酸化亜鉛、またはそれらの混合物などの賦形剤を含有し得る。
散剤および噴霧剤は、本開示のアンチセンスオリゴマーに加えて、ラクトース、タルク、ケイ酸、水酸化アルミニウム、ケイ酸カルシウム、およびポリアミド粉末、またはこれらの物質の混合物などの賦形剤を含有することができる。噴霧剤はさらに、クロロフルオロ炭化水素などの通例の噴射剤、ならびにブタンおよびプロパンなどの揮発性非置換炭化水素を含有することができる。
経皮パッチは、本開示のアンチセンスオリゴマーの体内への制御送達を提供するというさらなる利点を有する。そのような剤形は、オリゴマーを適切な培地中に溶解するか、または培地中に分散させることによって作製され得る。吸収促進剤もまた、皮膚にわたる薬剤の流れを増加させるために使用され得る。そのような流れの速度は、当該技術分野で公知の方法の中でも特に、速度制御膜を提供すること、またはポリマーマトリックスもしくはゲル中に薬剤を分散させることのいずれかによって制御され得る。
非経口投与に好適な医薬組成物は、１つ以上の薬学的に許容される滅菌等張水溶液もしくは非水溶液、分散液、懸濁液もしくはエマルション、または使用直前に滅菌注射用溶液もしくは分散液に再構成され得る滅菌粉末と組み合わせて、本開示の１つ以上のオリゴマーコンジュゲートを含み得、これらは、糖、アルコール、酸化防止剤、緩衝液、静菌剤、製剤を意図されたレシピエントの血液と等張にする溶質、または懸濁剤もしくは増粘剤を含有し得る。本開示の医薬組成物で用いられ得る好適な水性および非水性担体の例としては、水、エタノール、ポリオール（グリセロール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコールなど）、およびそれらの好適な混合物、オリーブ油などの植物油、およびオレイン酸エチルなどの注射用有機エステルが挙げられる。適切な流動性は、例えば、レシチンなどのコーティング材料の使用によって、分散液の場合に必要な粒径の維持によって、および界面活性剤の使用によって維持され得る。一実施形態において、医薬組成物のアンチセンスオリゴマーは、式（ＩＶ）に従う。一実施形態において、医薬組成物のアンチセンスオリゴマーは、式（ＩＶａ）に従う。
これらの医薬組成物はまた、防腐剤、湿潤剤、乳化剤、および分散剤などのアジュバントも含有し得る。主題のオリゴマーコンジュゲートに対する微生物の作用の防止は、様々な抗菌剤および抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノールソルビン酸などを含むことによって確保され得る。また、糖、塩化ナトリウムなどの等張剤を組成物に含むことが望ましい場合もある。さらに、注射用剤形の持続的吸収は、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンなどの、吸収を遅延させる薬剤を含むことによってもたらされ得る。
場合によっては、薬物の効果を延長するために、皮下注射または筋肉内注射からの薬物の吸収を遅らせることが望ましい。これは、当該技術分野で既知の方法の中でも特に、水溶性が乏しい結晶性または非晶質材料の液体懸濁液の使用によって達成され得る。次いで、薬物の吸収速度は、その溶解速度に依存し、溶解速度は、順に、結晶サイズおよび結晶形態に依存し得る。あるいは、非経口的に投与された薬物形態の吸収の遅延は、薬物を油ビヒクルに溶解または懸濁することによって達成される。
注射用デポー形態は、ポリラクチド－ポリグリコリドなどの生分解性ポリマー中で主題のオリゴマーコンジュゲートのマイクロカプセルマトリックスを形成することによって作製され得る。ポリマーに対するオリゴマーの比率および用いられる特定のポリマーの性質に応じて、オリゴマー放出の速度が制御され得る。他の生分解性ポリマーの例としては、ポリ（オルトエステル）およびポリ（無水物）が挙げられる。デポー注射用製剤はまた、体内組織と適合性のあるリポソームまたはマイクロエマルションに薬物を封入することによっても調製され得る。
本開示のアンチセンスオリゴマーが、ヒトおよび動物に医薬品として投与される場合、それらは、それ自体で、または例えば、薬学的に許容される担体と組み合わせたアンチセンスオリゴマーの０．１～９９％（より好ましくは１０～３０％）を含有する医薬組成物として投与することができる。
本開示の製剤または調製物は、経口的、非経口的、局所的、または直腸に投与され得る。これらは、典型的には、各投与経路に好適な形態で投与される。例えば、それらは、錠剤もしくはカプセルの形態で、注射、吸入、目薬、軟膏、坐剤、もしくは点滴によって、ローションもしくは軟膏によって局所的に、または坐剤によって直腸に投与される。
選択される投与経路にかかわらず、好適な水和形態で使用され得る本開示のアンチセンスオリゴマー、および／または本開示の医薬組成物は、当業者に既知の従来的な方法によって薬学的に許容される剤形に製剤化され得る。本開示の医薬組成物中の有効成分の実際の投与量レベルは、患者に対して許容できないほど毒性であることなく、特定の患者、組成物、および投与様式に対して望ましい治療応答を達成するために有効である有効成分の量を得るために変動し得る。
選択される投与量レベルは、用いられる本開示の特定のアンチセンスオリゴマー、またはそのエステル、塩、もしくはアミドの活性、投与経路、投与時刻、用いられる特定のオリゴマーの排泄速度または代謝速度、吸収の速度および程度、治療期間、用いられる特定のオリゴマーと組み合わせて使用される他の薬物、化合物、および／または材料、治療中の患者の年齢、性別、体重、条件、全般的な健康状態、および既往歴、ならびに医学技術で周知の同様の要因を含む、様々な要因に依存する。
当該技術分野における通常の技術を有する医師または獣医であれば、必要な医薬組成物の有効量を容易に決定および処方することができる。例えば、医師または獣医は、所望の治療効果を達成するために必要とされるレベルよりも低いレベルで、医薬組成物に用いられる本開示のアンチセンスオリゴマーの用量を開始し、所望の効果が達成されるまで投与量を徐々に増加させることができる。概して、本開示のアンチセンスオリゴマーの好適な１日用量は、治療効果をもたらすのに有効な最低用量であるアンチセンスオリゴマーの量である。そのような有効用量は、概して、本明細書に記載される要因に依存する。概して、患者のための本開示のアンチセンスオリゴマーの経口、静脈内、脳室内、および皮下用量は、示された効果のために使用される場合、１日当たり体重１キログラム当たり約０．０００１～約１００ｍｇの範囲である。
いくつかの実施形態において、本開示のアンチセンスオリゴマーは、概して、約１～約２００ｍｇ／ｋｇの用量で投与される。いくつかの実施形態において、静脈内投与のための用量は、約０．５ｍｇ～２００ｍｇ／ｋｇである。
いくつかの実施形態において、式（Ｉ）のアンチセンスオリゴマーは、概して、約１～約２００ｍｇ／ｋｇの用量で投与される。いくつかの実施形態において、静脈内投与のための式（Ｉ）のアンチセンスオリゴマーの用量は、約０．５ｍｇ～約２００ｍｇ／ｋｇである。いくつかの実施形態において、式（ＩＩ）のアンチセンスオリゴマーは、概して、約１～約２００ｍｇ／ｋｇの用量で投与される。いくつかの実施形態において、静脈内投与のための式（ＩＩ）のアンチセンスオリゴマーの用量は、約０．５ｍｇ～約２００ｍｇ／ｋｇである。いくつかの実施形態において、式（ＩＩＩ）のアンチセンスオリゴマーは、概して、約１～約２００ｍｇ／ｋｇの用量で投与される。いくつかの実施形態において、静脈内投与のための式（ＩＩＩ）のアンチセンスオリゴマーの用量は、約０．５ｍｇ～約２００ｍｇ／ｋｇである。いくつかの実施形態において、式（ＩＶ）のアンチセンスオリゴマーは、概して、約１～約２００ｍｇ／ｋｇの用量で投与される。いくつかの実施形態において、静脈内投与のための式（ＩＶ）のアンチセンスオリゴマーの用量は、約０．５ｍｇ～約２００ｍｇ／ｋｇである。いくつかの実施形態において、式（ＩＶａ）のアンチセンスオリゴマーは、概して、約１～約２００ｍｇ／ｋｇの用量で投与される。いくつかの実施形態において、静脈内投与のための式（ＩＶａ）のアンチセンスオリゴマーの用量は、約０．５ｍｇ～約２００ｍｇ／ｋｇである。いくつかの実施形態において、式（Ｖ）のアンチセンスオリゴマーは、概して、約１～約２００ｍｇ／ｋｇの用量で投与される。いくつかの実施形態において、静脈内投与のための式（Ｖ）のアンチセンスオリゴマーの用量は、約０．５ｍｇ～約２００ｍｇ／ｋｇである。いくつかの実施形態において、式（ＶＩ）のアンチセンスオリゴマーは、概して、約１～約２００ｍｇ／ｋｇの用量で投与される。いくつかの実施形態において、静脈内投与のための式（ＶＩ）のアンチセンスオリゴマーの用量は、約０．５ｍｇ～約２００ｍｇ／ｋｇである。
当該技術分野で理解されるように、毎週、隔週、３週間毎、または毎月の投与は、本明細書で考察されるように、１回以上の投与または部分用量であり得る。
本明細書に記載される核酸分子およびアンチセンスオリゴマーは、当業者に既知の様々な方法によって細胞に投与され、このような方法としては、本明細書に記載され、かつ当該技術分野において既知であるような、リポソームへの封入、イオン導入、またはヒドロゲル、シクロデキストリン、生分解性ナノカプセル、および生体接着性ミクロスフェアなどの他のビヒクルへの組み込みが挙げられるが、これらに限定されない。ある特定の実施形態において、マイクロ乳化技術を利用して、親油性（非水溶性）医薬剤のバイオアベイラビリティを改善し得る。例としては、Ｔｒｉｍｅｔｒｉｎｅ（Ｄｏｒｄｕｎｏｏ，Ｓ．Ｋ．，ｅｔ ａｌ．，Ｄｒｕｇ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ａｎｄ Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ Ｐｈａｒｍａｃｙ，１７（１２），１６８５－１７１３，１９９１）、およびＲＥＶ ５９０１（Ｓｈｅｅｎ，Ｐ．Ｃ．，ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｐｈａｒｍ Ｓｃｉ ８０（７），７１２－７１４，１９９１）が挙げられる。利点の中でも特に、マイクロ乳化は、循環系の代わりにリンパ系への吸収を優先的に誘導し、それにより肝臓を迂回し、肝胆道循環における化合物の破壊を防止することによって、増強されたバイオアベイラビリティを提供する。
開示の一態様において、製剤は、本明細書に提供されるオリゴマーから形成されるミセルと、ミセルが約１００ｎｍ未満の平均直径を有する少なくとも１つの両親媒性担体とを含有する。より好ましい実施形態は、約５０ｎｍ未満の平均直径を有するミセルを提供し、さらに好ましい実施形態は、約３０ｎｍ未満またはさらに約２０ｎｍ未満の平均直径を有するミセルを提供する。
全ての好適な両親媒性担体が企図されるが、現在好ましい担体は、概して、一般的に安全と認められている（ＧＲＡＳ）状態を有し、かつ本開示のアンチセンスオリゴマーを可溶化することと、溶液が複雑な水相（ヒト胃腸管に見られるものなど）と接触する後期段階でマイクロ乳化することとの両方ができる担体である。これらの要件を満たす両親媒性成分は、通常、ＨＬＢ（親水性－親油性のバランス）値が２－２０であり、それらの構造は、Ｃ－６からＣ－２０の範囲の直鎖脂肪族ラジカルを含有する。例としては、ポリエチレングリコール化脂肪酸グリセリドおよびポリエチレングリコールがある。
両親媒性担体の例としては、飽和および一不飽和ポリエチレングリコール化脂肪酸グリセリド、例えば、完全または部分的に水素化された様々な植物油から得られるものが挙げられる。そのような油は、有利に、トリ－、ジ－、およびモノ－脂肪酸グリセリド、ならびに対応する脂肪酸のジ－およびモノ－ポリ（エチレングリコール）エステルからなり得、特に好ましい脂肪酸組成物としては、カプリン酸４～１０％、カプリン酸３～９％、ラウリン酸４０～５０％、ミリスチン酸１４～２４％、パルミチン酸４～１４％、およびステアリン酸５～１５％が挙げられる。別の有用なクラスの両親媒性担体としては、飽和もしくは一不飽和脂肪酸（ＳＰＡＮシリーズ）または対応するエトキシ化類似体（ＴＷＥＥＮ（登録商標）シリーズ）を有する、部分的にエステル化されたソルビタンおよび／またはソルビトールが挙げられる。
Ｇｅｌｕｃｉｒｅシリーズ、Ｌａｂｒａｆｉｌ、Ｌａｂｒａｓｏｌ、またはＬａｕｒｏｇｌｙｃｏｌ（全てＧａｔｔｅｆｏｓｓｅ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｓａｉｎｔ Ｐｒｉｅｓｔ，Ｆｒａｎｃｅによって製造および流通）、ＰＥＧ－モノ－オレイン酸、ＰＥＧ－ジ－オレイン酸、ＰＥＧ－モノ－ラウリン酸およびジ－ラウリン酸、レシチン、ポリソルベート８０など（米国および世界中の多くの企業によって製造および流通）を含む市販の両親媒性担体が、特に有用であり得る。
ある特定の実施形態において、送達は、本開示の医薬組成物を好適な宿主細胞に導入するために、リポソーム、ナノカプセル、微粒子、ミクロスフェア、脂質粒子、小胞などを使用することによって起こり得る。特に、本開示の医薬組成物は、脂質粒子、リポソーム、小胞、ナノスフェア、ナノ粒子、または同様のもののいずれかに封入されて、送達用に製剤化され得る。そのような送達ビヒクルの製剤化および使用は、既知かつ従来的な技術を使用して行われ得る。
本開示での使用に好適な親水性ポリマーは、容易に水溶性であり、小胞形成脂質に共有結合することができ、かつ毒性作用なしにｉｎ ｖｉｖｏで耐容性がある（すなわち、生体適合性である）ものである。好適なポリマーとしては、ポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）、ポリ乳酸（ポリラクチドとも呼ばれる）、ポリグリコール酸（ポリグリコリドとも呼ばれる）、ポリ乳酸－ポリグリコール酸コポリマー、およびポリビニルアルコールが挙げられる。ある特定の実施形態において、ポリマーは、約１００もしくは１２０ダルトン～最大で約５，０００もしくは１０，０００ダルトン、または約３００ダルトン～約５，０００ダルトンの重量平均分子量を有する。他の実施形態において、ポリマーは、約１００～約５，０００ダルトンの重量平均分子量を有する、または約３００～約５，０００ダルトンの重量平均分子量を有する、ポリ（エチレングリコール）である。ある特定の実施形態において、ポリマーは、約７５０ダルトンの重量平均分子量を有するポリ（エチレングリコール）、例えば、ＰＥＧ（７５０）である。ポリマーは、その中のモノマーの数によっても定義され得、本開示の好ましい実施形態は、少なくとも約３つのモノマーのポリマーを利用し、３つのモノマーからなるそのようなＰＥＧポリマーは、分子量が約１３２ダルトンである。
本開示での使用に適し得る他の親水性ポリマーとしては、ポリビニルピロリドン、ポリメトキサゾリン、ポリエチルオキサゾリン、ポリヒドロキシプロピルメタクリルアミド、ポリメタクリルアミド、ポリジメチルアクリルアミド、および誘導体化セルロース、例えば、ヒドロキシメチルセルロースまたはヒドロキシエチルセルロースが挙げられる。
ある特定の実施形態において、本開示の製剤は、ポリアミド、ポリカーボネート、ポリアルキレン、アクリルエステルおよびメタクリルエステルのポリマー、ポリビニルポリマー、ポリグリコリド、ポリシロキサン、ポリウレタンおよびそのコポリマー、セルロース、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリスチレン、乳酸およびグリコール酸のポリマー、ポリ無水物、ポリ（オルソ）エステル、ポリ（ブチック酸）（ｂｕｔｉｃ ａｃｉｄ）、ポリ（吉草酸）、ポリ（ラクチド－ｃｏ－カプロラクトン）、多糖類、タンパク質、ポリヒアルロン酸、ポリシアノアクリレート、ならびにそれらのブレンド、混合物、またはコポリマーからなる群から選択される生体適合性ポリマーを含む。
シクロデキストリンは、６、７、または８グルコース単位からなる環状オリゴ糖であり、それぞれギリシャ文字α、β、またはγによって示される。グルコース単位は、α－１，４－グルコシド結合によって連結される。糖単位の椅子型配座の結果として、全ての二次ヒドロキシル基（Ｃ－２、Ｃ－３における）が環の一方の側に位置する一方で、Ｃ－６における全ての一次ヒドロキシル基は、他方の側に位置する。結果として、外面は親水性であり、シクロデキストリンを水溶性にする。対照的に、シクロデキストリンの空洞は、それらが原子Ｃ－３およびＣ－５の水素によって、ならびにエーテル様酸素によって覆われているため、疎水性である。これらのマトリックスは、例えば、１７α－エストラジオールなどのステロイド化合物を含む、様々な比較的疎水性の化合物との複合体形成を可能にする（例えば、ｖａｎ Ｕｄｅｎ ｅｔ ａｌ．Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｔｉｓｓ．Ｏｒｇ．Ｃｕｌｔ．３８：１－３－１１３（１９９４）を参照）。複合体形成は、ファンデルワールス相互作用および水素結合形成によって起こる。シクロデキストリンの化学的性質に関する一般的なレビューについては、Ｗｅｎｚ，Ａｇｎｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．，３３：８０３－８２２（１９９４）を参照されたい。
シクロデキストリン誘導体の物理化学的性質は、置換の種類および程度に大きく依存する。例えば、それらの水溶性は、不溶性（例えば、トリアセチル－ベータ－シクロデキストリン）から１４７％可溶性（ｗ／ｖ）（Ｇ－２－ベータ－シクロデキストリン）の範囲である。さらに、それらは多くの有機溶媒に可溶性である。シクロデキストリンの特性は、それらの溶解性を増減させることによって、様々な製剤構成成分の溶解度の制御を可能にする。
多数のシクロデキストリンおよびそれらの調製のための方法が記載されている。例えば、Ｐａｒｍｅｔｅｒ（Ｉ）ら（米国特許第３，４５３，２５９号）およびＧｒａｍｅｒａら （米国特許第３，４５９，７３１号）は、電気的中性シクロデキストリンについて記載した。他の誘導体としては、カチオン特性を有するシクロデキストリン［Ｐａｒｍｅｔｅｒ（ＩＩ）、米国特許 第３，４５３，２５７号］、不溶性架橋シクロデキストリン（Ｓｏｌｍｓ、米国特許第３，４２０，７８８号）、およびアニオン特性を有するシクロデキストリン［Ｐａｒｍｅｔｅｒ（ＩＩＩ）、米国特許 第３，４２６，０１１号］が挙げられる。アニオン特性を有するシクロデキストリン誘導体の中でも、カルボン酸、亜リン酸、亜ホスフィン酸、ホスホン酸、リン酸、チオホスホン酸、チオスルフィン酸、およびスルホン酸が、親シクロデキストリンに付加されている［Ｐａｒｍｅｔｅｒ（ＩＩＩ）、米国特許 第３，４５３，２５７号を参照］。さらに、スルホアルキルエーテルシクロデキストリン誘導体は、Ｓｔｅｌｌａら（米国特許第５，１３４，１２７号）によって記載されている。
リポソームは、水性内部区画を取り囲む少なくとも１つの脂質二重層膜からなる。リポソームは、膜の種類およびサイズによって特徴付けられ得る。小型単一ラメラ小胞（ＳＵＶ）は、単一膜を有し、典型的には直径が０．０２～０．０５μｍの範囲であり、大型単一ラメラ小胞（ＬＵＶ）は、典型的には０．０５μｍよりも大きい。大型オリゴラメラ小胞および多重ラメラ小胞は、複数の、通常は同心性の膜層を有し、典型的には０．１μｍよりも大きい。
いくつかの非同心膜を有するリポソーム、すなわち、より大きい小胞内に含有されるいくつかのより小さい小胞は、多胞体小胞と呼ばれる。本開示の一態様は、本開示のアンチセンスオリゴマーを含有するリポソームを含む製剤に関し、リポソーム膜は、増加した担持能力を有するリポソームを提供するように製剤化される。あるいは、または加えて、本開示のアンチセンスオリゴマーは、リポソームのリポソーム二重層内に含有され得るか、またはその上に吸着され得る。本開示のアンチセンスオリゴマーは、脂質界面活性剤と凝集され、リポソームの内部空間内に担持され得る。これらの場合、リポソーム膜は、活性薬剤－界面活性剤凝集体の崩壊効果に抵抗するように製剤化される。
本開示の一実施形態によると、リポソームの脂質二重層は、ポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）で誘導体化された脂質を含有し、これによりＰＥＧ鎖は、脂質二重層の内面から、リポソームによって封入された内部空間へと延在し、かつ脂質二重層の外部から周囲環境へと延在する。
本開示のリポソーム内に含有される活性薬剤は、可溶化形態である。界面活性剤および活性薬剤の凝集体（対象の活性薬剤を含有するエマルションまたはミセルなど）は、本開示によるリポソームの内部空間内に閉じ込められ得る。界面活性剤は、活性薬剤を分散させ可溶化するように作用し、様々な鎖長（例えば、約Ｃ１４～約Ｃ２０）の生体適合性リゾホスファチジルコリン（ＬＰＧ）を含むがこれに限定されない、任意の好適な脂肪族、脂環式、または芳香族界面活性剤から選択され得る。ＰＥＧ－脂質などのポリマー誘導体化脂質は、ミセル／膜融合を阻害するように作用するため、また界面活性剤分子へのポリマーの添加が界面活性剤のＣＭＣを減少させ、ミセル形成を助けるため、ミセル形成にも利用され得る。マイクロモル範囲のＣＭＯを有する界面活性剤が好ましく、より高いＣＭＣ界面活性剤を利用して、本開示のリポソーム内に閉じ込められたミセルを調製し得る。
本開示によるリポソームは、当該技術分野で既知の様々な技術のいずれかによって調製され得る。例えば、米国特許 第４，２３５，８７１号、公開ＰＣＴ出願第ＷＯ９６／１４０５７号、Ｎｅｗ ＲＲＣ，Ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ：Ａ ｐｒａｃｔｉｃａｌ ａｐｐｒｏａｃｈ，ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ（１９９０），ｐａｇｅｓ ３３－１０４、およびＬａｓｉｃ ＤＤ，Ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ ｆｒｏｍ ｐｈｙｓｉｃｓ ｔｏ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ ＢＶ，Ａｍｓｔｅｒｄａｍ，１９９３を参照されたい。例えば、本開示のリポソームは、リポソーム中で所望の誘導体化脂質の最終モルパーセントに相当する脂質濃度で、親水性ポリマーで誘導体化された脂質を予め形成されたリポソームに拡散することによって、例えば、予め形成されたリポソームを脂質グラフトポリマーから構成されるミセルに曝露することによって、調製され得る。親水性ポリマーを含有するリポソームはまた、当該技術分野で既知のように、均質化、脂質場水和、または押出技術によって形成され得る。
別の例示的な製剤化手順において、活性薬剤はまず、疎水性分子を容易に可溶化するリゾホスファチジルコリンまたは他の低ＣＭＣ界面活性剤（ポリマーグラフト脂質を含む）中での音波処理によって分散される。次いで、活性薬剤の得られたミセル懸濁液を使用して、好適なモルパーセントのポリマーグラフト脂質またはコレステロールを含有する乾燥脂質試料を再水和する。次いで、脂質および活性薬剤懸濁液は、当該技術分野で既知の押出技術を使用してリポソームに形成され、得られたリポソームは、標準的なカラム分離によって封入されていない溶液から分離される。
本開示の一態様において、リポソームは、選択されたサイズ範囲において実質的に均一なサイズを有するように調製される。１つの効果的なサイズ決定方法は、選択された均一な孔径を有する一連のポリカーボネート膜を通してリポソームの水性懸濁液を押し出すことを伴い、膜の孔径は、その膜を通した押出によってもたらされるリポソームの最大サイズに概ね相当する。例えば、米国特許 第４，７３７，３２３号（１９８８年４月１２日）を参照されたい。ある特定の実施形態において、ＤｈａｒｍａＦＥＣＴ（登録商標）およびＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（登録商標）などの試薬を利用して、ポリヌクレオチドまたはタンパク質を細胞に導入し得る。
本開示の製剤の放出特性は、封入材料、封入薬物の濃度、および放出調節剤の存在に依存する。例えば、放出は、例えば、胃にあるような低ｐＨ、または腸にあるような高ｐＨでのみ放出するｐＨ感受性コーティングを使用して、ｐＨ依存性になるように操作され得る。腸溶性コーティングは、胃を通過した後まで放出が起こらないように使用され得る。異なる材料に封入されたシアナミドの複数のコーティングまたは混合物を使用して、胃内で初期放出を得て、続いて腸内で後の放出を得ることができる。放出はまた、塩または細孔形成剤を含むことによっても操作され得、これは、カプセルからの拡散による水取込みまたは薬物の放出を増加させることができる。薬物の溶解性を修正する賦形剤は、放出速度を制御するためにも使用され得る。マトリックスの分解またはマトリックスからの放出を増強する薬剤も組み込まれ得る。それらは、薬物に添加され得、別個の相として（すなわち、微粒子として）添加されるか、または化合物に応じてポリマー相に共溶解され得る。ほとんどの場合、量は、０．１～３０パーセント（ｗ／ｗポリマー）であるべきである。分解促進剤の種類としては、硫酸アンモニウムおよび塩化アンモニウムなどの無機塩、クエン酸、安息香酸、およびアスコルビン酸などの有機酸、炭酸ナトリウム、炭酸カリウム、炭酸カルシウム、炭酸亜鉛、および水酸化亜鉛などの無機塩基、ならびにプロタミン硫酸塩、スペルミン、コリン、エタノールアミン、ジエタノールアミン、およびトリエタノールアミンなどの有機塩基、ならびにＴｗｅｅｎ（登録商標）およびＰｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）などの界面活性剤が挙げられる。マトリックスに微細構造を付加する細孔形成剤（すなわち、無機塩および糖類などの水溶性化合物）が、微粒子として添加される。範囲は、典型的には、１～３０パーセント（ｗ／ｗポリマー）である。
また、取込みは、腸内の粒子の滞留時間を変化させることによっても操作され得る。これは、例えば、粒子を粘膜接着性ポリマーでコーティングするか、または封入材料として選択することによって達成され得る。例としては、遊離カルボキシル基を有するほとんどのポリマー、例えば、キトサン、セルロース、および特にポリアクリレート（本明細書で使用される場合、ポリアクリレートは、アクリレート基、ならびにシアノアクリレートおよびメタクリレートなどの修飾アクリレート基を含むポリマーを指す）が挙げられる。
アンチセンスオリゴマーは、外科用もしくは医療用のデバイスまたはインプラント内に含有されるように製剤化され得るか、またはそれによって放出されるように適合され得る。ある特定の態様において、インプラントは、アンチセンスオリゴマーでコーティングされ得るか、または別の方法で処理され得る。例えば、ヒドロゲル、または生体適合性および／もしくは生分解性ポリマーなどの他のポリマーを使用して、本開示の医薬組成物でインプラントをコーティングし得る（すなわち、組成物は、ヒドロゲルまたは他のポリマーを使用することによって医療デバイスと共に使用するように適合され得る）。医療デバイスを薬剤でコーティングするためのポリマーおよびコポリマーは、当該技術分野で周知である。インプラントの例としては、ステント、薬剤溶出性ステント、縫合糸、人工器官、血管カテーテル、透析カテーテル、血管グラフト、人工心臓弁、心臓ペースメーカー、植込み型除細動器、ＩＶ針、接骨および骨形成用デバイス、例えば、ピン、スクリュー、プレート、および他のデバイス、ならびに創傷治癒のための人工組織マトリックスが挙げられるが、これらに限定されない。
本明細書に提供される方法に加えて、本開示による使用のためのアンチセンスオリゴマーは、他の医薬品から類推して、ヒトまたは獣医学で使用するための任意の便利な方法で投与するために製剤化され得る。アンチセンスオリゴマーおよびそれらの対応する製剤は、単独で、または筋芽細胞移植、幹細胞療法、アミノグリコシド系抗生物質の投与、プロテアソーム阻害剤、および上方制御療法（例えば、ジストロフィンの常染色体パラログであるユートロフィンの上方制御）などの筋ジストロフィーの治療における他の治療戦略と組み合わせて投与され得る。
いくつかの実施形態において、追加の治療薬は、本開示のアンチセンスオリゴマーの投与の前に、それと同時に、またはその後に投与され得る。例えば、アンチセンスオリゴマーは、ステロイドおよび／または抗生物質と組み合わせて投与され得る。ある特定の実施形態において、アンチセンスオリゴマーは、バックグラウンドステロイド理論（例えば、間欠的または長期／連続的バックグラウンドステロイド療法）を受けている患者に投与される。例えば、いくつかの実施形態において、患者は、アンチセンスオリゴマーの投与前にコルチコステロイドを用いて治療されており、ステロイド療法を受け続けている。いくつかの実施形態において、ステロイドは、糖質コルチコイドまたはプレドニゾンである。
記載される投与経路は、当業者が任意の特定の動物および状態にとって最適な投与経路および任意の投与量を容易に決定することができるため、指針としてのみ意図される。ｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏの両方で、機能的な新しい遺伝子材料を細胞に導入するための複数のアプローチが試みられている（Ｆｒｉｅｄｍａｎｎ（１９８９）Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４４：１２７５－１２８０）。これらのアプローチとしては、発現する遺伝子の修飾レトロウイルスへの組み込み、（Ｆｒｉｅｄｍａｎｎ（１９８９）、上記、Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ（１９９１）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ５１（１８），ｓｕｐｐｌ．：５０７４Ｓ－５０７９Ｓ）、非レトロウイルスベクター（例えば、アデノ関連ウイルスベクター）への組み込み（Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄ，ｅｔ ａｌ．（１９９２）Ｃｅｌｌ，６８：１４３－１５５、Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄ，ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５２：４３１－４３４）、またはリポソームを介した異種プロモーター－エンハンサーエレメントに連結された導入遺伝子の送達（Ｆｒｉｅｄｍａｎｎ（１９８９）、上記、Ｂｒｉｇｈａｍ，ｅｔ ａｌ．（１９８９）Ａｍ．Ｊ．Ｍｅｄ．Ｓｃｉ．，２９８：２７８－２８１、Ｎａｂｅｌ，ｅｔ ａｌ．（１９９０）Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４９：１２８５－１２８８、Ｈａｚｉｎｓｋｉ，ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ａｍ．Ｊ．Ｒｅｓｐ．Ｃｅｌｌ Ｍｏｌｅｃ．Ｂｉｏｌ．，４：２０６－２０９、およびＷａｎｇ ａｎｄ Ｈｕａｎｇ（１９８７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ），８４：７８５１－７８５５）、リガンド特異的、カチオン系輸送システムとの結合（Ｗｕ ａｎｄ Ｗｕ（１９８８）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６３：１４６２１－１４６２４）、またはネイキッドＤＮＡ、発現ベクターの使用（Ｎａｂｅｌ ｅｔ ａｌ．（１９９０）、上記、Ｗｏｌｆｆ ｅｔ ａｌ．（１９９０）Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４７：１４６５－１４６８）が挙げられる。導入遺伝子の組織への直接注射は、局所発現のみをもたらす（Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄ（１９９２）、上記、Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄ ｅｔ ａｌ．（１９９１）、上記、Ｂｒｉｇｈａｍ ｅｔ ａｌ．（１９８９）、上記、Ｎａｂｅｌ（１９９０）、上記、およびＨａｚｉｎｓｋｉ ｅｔ ａｌ．（１９９１）、上記）。Ｂｒｉｇｈａｍらのグループ（Ａｍ．Ｊ．Ｍｅｄ．Ｓｃｉ．（１９８９）２９８：２７８－２８１およびＣｌｉｎｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ（１９９１）３９（要約））は、ＤＮＡリポソーム複合体の静脈内または気管内のいずれかの投与後のマウスの肺のｉｎ ｖｉｖｏトランスフェクションのみを報告している。ヒト遺伝子治療手順のレビュー文献の一例は、Ａｎｄｅｒｓｏｎ，Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９９２）２５６：８０８－８１３である。
さらなる実施形態において、本開示の医薬組成物は、Ｈａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｃｏｍｍｓ．７，１０９８１（２０１６）（この全体は、参照により本明細書に組み込まれる）に提供されるように、炭水化物を追加的に含み得る。いくつかの実施形態において、本開示の医薬組成物は、５％のヘキソース炭水化物を含み得る。例えば、本開示の医薬組成物は、５％のグルコース、５％のフルクトース、または５％のマンノースを含み得る。ある特定の実施形態において、本開示の医薬組成物は、２．５％のグルコースおよび２．５％のフルクトースを含み得る。いくつかの実施形態において、本開示の医薬組成物は、５体積％の量で存在するアラビノース、５体積％の量で存在するグルコース、５体積％の量で存在するソルビトール、５体積％の量で存在するガラクトース、５体積％の量で存在するフルクトース、５体積％の量で存在するキシリトール、５体積％の量で存在するマンノース、各々が２．５体積％の量で存在するグルコースとフルクトースの組み合わせ、ならびに５．７体積％の量で存在するグルコース、２．８６体積％の量で存在するフルクトース、および１．４体積％の量で存在するキシリトールの組み合わせから選択される炭水化物を含んでもよい。
ＩＶ．使用方法
エクソンスキッピングを使用したジストロフィンリーディングフレームの修復
ジストロフィン遺伝子のアウトオブフレーム変異によって引き起こされるＤＭＤの治療に対する潜在的な治療アプローチは、インフレーム変異によって引き起こされるＢＭＤとして既知である、より軽度な形態のジストロフィン異常症によって示唆される。アウトオブフレーム変異をインフレーム変異に変換する能力は、仮定では、ｍＲＮＡリーディングフレームを保持し、内部的に短縮されたがなお機能的なジストロフィンタンパク質を産生する。本開示のアンチセンスオリゴマーを、これを達成するように設計した。
式（Ｉ）、式（ＩＩ）、式（ＩＩＩ）、式（ＩＶ）、式（ＩＶａ）、式（Ｖ）、式（ＶＩ）のアンチセンスオリゴマーの標的化プレｍＲＮＡ配列とのハイブリダイゼーションは、プレｍＲＮＡスプライシング複合体の形成を阻害し、成熟ｍＲＮＡからエクソン５０を欠失させる。本開示のアンチセンスオリゴマーの構造および立体構造により、相補的配列に対する配列特異的塩基対合が可能となる。
全ての７９個のエクソンを含有する正常なジストロフィンｍＲＮＡは、正常なジストロフィンタンパク質を産生する。各エクソンの形状は、コドンがどのようにエクソン間で分割されるかを示す。注目すべきことに、１つのコドンは、３つのヌクレオチドからなる。長方形のエクソンは、完全なコドンで始まり、終わる。矢印形状のエクソンは、完全なコドンで始まるが、コドンのヌクレオチド＃１のみを含有する分割コドンで終わる。このコドンのヌクレオチド＃２および＃３は、シェブロン形状で始まる後続のエクソンに含有される。
ヒトジストロフィンプレｍＲＮＡのエクソン５０、イントロン４９、および／またはイントロン５０の標的領域に相補的であり、エクソン５０のスキッピングを誘導する、アンチセンスオリゴマーの効果を分析するための臨床転帰は、ジストロフィン陽性線維（ＰＤＰＦ）の割合、６分間歩行試験（６ＭＷＴ）、歩行不能（ＬＯＡ）、ノーススター歩行評価（ＮＳＡＡ）、肺機能検査（ＰＦＴ）、外部の支持なしで（仰臥位から）立ち上がる能力、ｄｅ ｎｏｖｏジストロフィン産生、および他の機能的尺度を含む。
いくつかの実施形態において、本開示は、エクソン５０のスキッピングに適しているジストロフィン遺伝子の変異を有する対象においてジストロフィンを産生するための方法を提供し、この方法は、本明細書に記載されるように、アンチセンスオリゴマーまたはその薬学的に許容される塩を対象に投与することを含む。ある特定の実施形態において、本開示は、エクソン５０スキッピングに適しているジストロフィン遺伝子の変異を有するデュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）を有する対象において、ジストロフィンタンパク質産生を誘導するためにｍＲＮＡリーディングフレームを修復するための方法を提供する。タンパク質産生は、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ－ＰＣＲ）、ウェスタンブロット分析、または免疫組織化学検査（ＩＨＣ）によって測定され得る。
いくつかの実施形態において、本開示は、ＤＭＤの治療を必要とする対象においてそれを行うための方法を提供し、対象は、エクソン５０スキッピングに適しているジストロフィン遺伝子の変異を有し、方法は、本明細書に記載されるようなアンチセンスオリゴマーまたはその薬学的に許容される塩を対象に投与することを含む。様々な実施形態において、対象の治療は、疾患進行の遅延によって測定される。いくつかの実施形態において、対象の治療は、対象における歩行の維持、または対象における歩行不能の低減によって測定される。いくつかの実施形態において、歩行は、６分間歩行試験（６ＭＷＴ）を使用して測定される。ある特定の実施形態において、歩行は、ノーススタート歩行評価（ＮＳＡＡ）を使用して測定される。
いくつかの実施形態において、本開示は、ＤＭＤを有する対象において肺機能を維持するか、または肺機能の喪失を低減するための方法を提供し、対象は、エクソン５０のスキッピングに適しているＤＭＤ遺伝子の変異を有し、方法は、本明細書に記載されるように、アンチセンスオリゴマーまたはその薬学的に許容される塩を対象に投与することを含む。いくつかの実施形態において、肺機能は、最大呼気圧（ＭＥＰ）として測定される。ある特定の実施形態において、肺機能は、最大吸気圧（ＭＩＰ）として測定される。いくつかの実施形態において、肺機能は、努力肺活量（ＦＶＣ）として測定される。
さらなる実施形態において、本開示の医薬組成物は、Ｈａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｃｏｍｍｓ．７，１０９８１（２０１６）（この全体は、参照により本明細書に組み込まれる）に提供されるように、同じ製剤または別個の製剤のいずれかで、本開示の方法において炭水化物と同時投与され得る。いくつかの実施形態において、本開示の医薬組成物は、５％のヘキソース炭水化物と同時投与され得る。例えば、本開示の医薬組成物は、５％のグルコース、５％のフルクトース、または５％のマンノースと同時投与され得る。ある特定の実施形態において、本開示の医薬組成物は、２．５％のグルコースおよび２．５％のフルクトースと同時投与され得る。いくつかの実施形態において、本開示の医薬組成物は、５体積％の量で存在するアラビノース、５体積％の量で存在するグルコース、５体積％の量で存在するソルビトール、５体積％の量で存在するガラクトース、５体積％の量で存在するフルクトース、５体積％の量で存在するキシリトール、５体積％の量で存在するマンノース、各々が２．５体積％の量で存在するグルコースとフルクトースの組み合わせ、ならびに５．７体積％の量で存在するグルコース、２．８６体積％の量で存在するフルクトース、および１．４体積％の量で存在するキシリトールの組み合わせから選択される炭水化物と同時投与され得る。
様々な実施形態において、本開示のアンチセンスオリゴマーは、治療有効量の非ステロイド性抗炎症化合物と同時投与される。いくつかの実施形態において、非ステロイド性抗炎症化合物は、ＮＦ－ｋＢ阻害剤である。例えば、いくつかの実施形態において、ＮＦ－ｋＢ阻害剤は、ＣＡＴ－１００４またはその薬学的に許容される塩であり得る。様々な実施形態において、ＮＦ－ｋＢ阻害剤は、サリチル酸塩とＤＨＡのコンジュゲートであり得る。いくつかの実施形態において、ＮＦ－ｋＢ阻害剤は、ＣＡＴ－１０４１またはその薬学的に許容される塩である。ある特定の実施形態において、ＮＦ－ｋＢ阻害剤は、サリチル酸塩とＥＰＡのコンジュゲートである。様々な実施形態において、ＮＦ－ｋＢ阻害剤は、
Figure 2022511055000132
 またはその薬学的に許容される塩である。
いくつかの実施形態において、非ステロイド性抗炎症化合物は、ＴＧＦ－ｂ阻害剤である。例えば、ある特定の実施形態において、ＴＧＦ－ｂ阻害剤は、ＨＴ－１００である。
ある特定の実施形態において、療法に使用するための、本明細書に記載されるアンチセンスオリゴマーが記載される。ある特定の実施形態において、デュシェンヌ型筋ジストロフィーの治療に使用するための、本明細書に記載されるアンチセンスオリゴマーが記載される。ある特定の実施形態において、療法に使用するための薬剤の製造に使用するための、本明細書に記載されるアンチセンスオリゴマーが記載される。ある特定の実施形態において、デュシェンヌ型筋ジストロフィーの治療のための薬剤の製造に使用するための、本明細書に記載されるアンチセンスオリゴマーが記載される。
Ｖ．キット
本開示はまた、遺伝的疾患を有する患者の治療のためのキットを提供し、このキットは、好適な容器に包装された、少なくともアンチセンス分子（例えば、配列番号１～９のいずれかに記載される塩基配列を含むアンチセンスオリゴマー）を、その使用のための説明書と共に含む。キットはまた、緩衝液、安定剤などの周辺試薬も含有し得る。当業者であれば、上記方法の用途が、多くの他の疾患の治療に使用するのに好適なアンチセンス分子を特定するために幅広い用途を有することを理解するべきである。一実施形態において、キットは、式（Ｉ）～（ＶＩ）のいずれかによるアンチセンスオリゴマーを含む。
上記の開示は、理解を明確にする目的で、例示および実施例によってある程度詳細に記載されてきたが、本開示の教示を踏まえて、添付の特許請求の範囲の趣旨または範囲から逸脱することなく、ある特定の変更および修正がそれに対して成され得ることは、当業者に容易に明らかになるであろう。以下の実施例は、例示としてのみ提供されるものであり、限定するものではない。当業者であれば、実質的に類似した結果をもたらすように変更または修正され得る様々な重要ではないパラメータを容易に認識するであろう。
材料および方法
モルホリノサブユニットの調製
Figure 2022511055000133
スキーム１を参照すると、Ｂは、塩基対合部分を表し、モルホリノサブユニットは、示されるように、対応するリボヌクレオシド（１）から調製され得る。モルホリノサブユニット（２）は、好適な保護基前駆体、例えば、塩化トリチルとの反応によって任意に保護され得る。３’保護基は、概して、以下により詳細に記載されるように、固体オリゴマー合成中に除去される。塩基対合部分は、固相オリゴマー合成に対して好適に保護され得る。好適な保護基としては、アデニンおよびシトシンに対するベンゾイル、グアニンに対するフェニルアセチル、およびヒポキサンチン（イノシン）に対するピバロイルオキシメチルが挙げられる。ピバロイルオキシメチル基は、ヒポキサンチン複素環塩基のＮ１位置に導入され得る。保護されていないヒポキサンチンサブユニットが用いられてもよいが、活性化反応における収率は、塩基が保護されている場合にはるかに優れている。他の好適な保護基としては、米国特許第８，０７６，４７６号に開示されているものが挙げられ、これは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
活性化されたリン化合物４との３の反応は、所望の連結部分５を有するモルホリノサブユニットをもたらす。
構造４の化合物は、当業者に既知の任意の数の方法を使用して調製され得る。次いで、モルホリノ部分とのカップリングは、上記に概説されるとおりに進む。
構造５の化合物は、サブユニット間連結を含むオリゴマーを調製するための固相オリゴマー合成に使用され得る。そのような方法は、当該技術分野で周知である。簡潔に言うと、構造５の化合物は、５’末端で修飾されて、固体支持体へのリンカーを含有し得る。一旦支持されると、３’末端の５の保護基（例えば、トリチル）を除去し、遊離アミンを、構造５の第２の化合物の活性化リン部分と反応させる。この配列は、所望の配列のオリゴが得られるまで繰り返される。末端の３’末端の保護基は、３’修飾が所望される場合、除去されるか、またはそのままにされるかのいずれかであり得る。オリゴは、任意の数の方法、または固体支持体への連結を切断するための塩基を用いた例示的な処理を使用して、固体支持体から除去することができる。
本開示の一般的および具体的なモルホリノオリゴマーにおけるモルホリノオリゴマーの調製は、実施例においてより詳細に説明される。
モルホリノオリゴマーの調製
本開示の化合物の調製は、スキーム２に従って、以下のプロトコルを使用して実施することができる。
Figure 2022511055000134
トリチルピペラジンフェニルカルバメート３５の調製：ジクロロメタン中の化合物１１の冷却懸濁液（６ｍＬ／ｇの１１）に、水中の炭酸カリウム（３．２当量）の溶液（４ｍＬ／ｇの炭酸カリウム）を添加する。この二相混合物に、ジクロロメタン中のクロロギ酸フェニル（１．０３当量）の溶液（２ｇ／ｇのクロロギ酸フェニル）をゆっくりと添加する。反応混合物を２０℃に加温する。反応完了時（１～２時間）に、層を分離する。有機層を水で洗浄し、無水炭酸カリウム上で乾燥させる。生成物３５をアセトニトリルからの結晶化によって単離する。
カルバメートアルコール３６の調製：水素化ナトリウム（１．２当量）を、１－メチル－２－ピロリジノン中に懸濁する（３２ｍＬ／ｇの水素化ナトリウム）。トリエチレングリコール（１０．０当量）および化合物３５（１．０当量）を、この懸濁液に添加し得る。得られたスラリーを９５℃に加熱する。反応完了時（１～２時間）に、混合物を２０℃に冷却する。この混合物に、３０％のジクロロメタン／メチルｔｅｒｔ－ブチルエーテル（ｖ：ｖ）および水を添加する。生成物含有有機層を、水性ＮａＯＨ、水性コハク酸、および飽和水性塩化ナトリウムで連続的に洗浄する。生成物３６を、ジクロロメタン／メチルｔｅｒｔ－ブチルエーテル／ヘプタンからの結晶化によって単離する。
テール酸３７の調製：テトラヒドロフラン中の化合物３６の溶液（７ｍＬ／ｇの３６）に、コハク酸無水物（２．０当量）およびＤＭＡＰ（０．５当量）を添加する。混合物を５０℃に加熱する。反応完了時（５時間）に、混合物を２０℃に冷却し、水性ＮａＨＣＯ３を用いてｐＨ８．５に調整する。メチルｔｅｒｔ－ブチルエーテルを添加し、生成物を水層中に抽出する。ジクロロメタンを添加し、水層混合物を水性クエン酸でｐＨ３に調整する。生成物含有有機層を、ｐＨ＝３のクエン酸緩衝液と飽和水性塩化ナトリウムの混合物で洗浄する。この３７のジクロロメタン溶液を、化合物３８の調製において単離することなく使用する。
３８の調製：Ｎ－ヒドロキシ－５－ノルボルネン－２，３－ジカルボン酸イミド（ＨＯＮＢ）（１．０２当量）、４－ジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ）（０．３４当量）、次いで１－（３－ジメチルアミノプロピル）－Ｎ’－エチルカルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）（１．１当量）を、化合物３７の溶液に添加する。混合物を５５℃に加熱する。反応完了時（４～５時間）に、混合物を２０℃に冷却し、１：１の０．２Ｍクエン酸／ブラインおよびブラインで連続的に洗浄する。ジクロロメタン溶液を、アセトンへ、次いでＮ，Ｎ－ジメチルホルムアミドへ溶媒交換させ、生成物を、アセトン／Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミドから飽和水性塩化ナトリウム中への沈殿によって単離する。粗生成物を水中で数回再スラリー化して、残留Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミドおよび塩を除去する。
ＰＭＯ合成方法Ａ：ジスルフィドアンカーの使用
アンカー装填樹脂への活性化「テール」の導入を、固相合成中のサブユニットの組み込みに使用される手順によって、ジメチルイミダゾリジノン（ＤＭＩ）中で実施する。
Figure 2022511055000135
この手順を、シラン処理したジャケット付きペプチド槽（ＣｈｅｍＧｌａｓｓ，ＮＪ，ＵＳＡ）内で、粗多孔性（４０～６０μｍ）ガラスフリット、オーバーヘッド撹拌器、およびテフロン（登録商標）三方活栓を用いて実施して、Ｎ２がフリットまたは真空抽出によって泡立つことを可能にし得る。
以下の手順の樹脂処理／洗浄ステップは、樹脂流動化または撹拌床反応器および溶媒／溶液抽出の２つの基本操作からなる。樹脂流動化については、Ｎ２がフリットによって上方に流動することを可能にするように活栓を配置し、指定の樹脂処理／洗浄液を反応器に添加し、樹脂に浸透させ、完全に湿らせる。次いで、混合を開始し、樹脂スラリーを所定時間混合する。溶媒／溶液抽出については、混合およびＮ２流動を停止し、真空ポンプを起動し、次いで、樹脂処理／洗浄液を排出して廃棄することを可能にするように活栓を配置する。特に記載のない限り、樹脂処理／洗浄液体積は全て、１５ｍＬ／ｇの樹脂である。
１－メチル－２－ピロリジノン（ＮＭＰ；２０ｍＬ／ｇ樹脂）を、シラン処理したジャケット付きペプチド槽内のアミノメチルポリスチレン樹脂（１００～２００メッシュ；窒素置換に基づいて約１．０ｍｍｏｌ／ｇ装填；７５ｇ、１当量、Ｐｏｌｙｍｅｒ Ｌａｂｓ，ＵＫ、部品番号１４６４－Ｘ７９９）に添加し、樹脂を、１～２時間混合しながら膨潤させる。膨潤溶媒の排出後、樹脂をジクロロメタン（２×１～２分）、２５％イソプロパノール／ジクロロメタン中の５％ジイソプロピルエチルアミン（２×３～４分）、およびジクロロメタン（２×１～２分）で洗浄する。最終洗浄液の排出後、樹脂を、１－メチル－２－ピロリジノン中のジスルフィドアンカー３４の溶液（０．１７Ｍ；１５ｍＬ／ｇ樹脂、約２．５当量）で処理し、樹脂／試薬混合物を４５℃で６０時間加熱する。反応完了時に、加熱を中断し、アンカー溶液を排出し、１－メチル－２－ピロリジノン（４×３～４分）およびジクロロメタン（６×１～２分）で樹脂を洗浄する。樹脂を、ジクロロメタン中の１０％（ｖ／ｖ）二炭酸ジエチル（ＤＥＤＣ）の溶液（１６ｍＬ／ｇ、２×５～６分）で処理し、次いで、ジクロロメタン（６×１～２分）で洗浄する。樹脂３９を、Ｎ２流下で１～３時間、次いで真空下で一定重量（±２％）になるまで乾燥させる。
アミノメチルポリスチレン－ジスルフィド樹脂の装填量の決定：樹脂の装填量（潜在的に利用可能な反応部位の数）を、樹脂１グラム当たりのトリフェニルメチル（トリチル）基の数の分光アッセイによって決定する。
既知の重量の乾燥樹脂（２５±３ｍｇ）をシラン処理した２５ｍＬのメスフラスコに移し、ジクロロメタン中の約５ｍＬの２％（ｖ／ｖ）トリフルオロ酢酸を添加する。内容物を穏やかに旋回させて混合し、３０分間放置する。体積は、さらなるジクロロメタン中の２％（ｖ／ｖ）トリフルオロ酢酸で最大２５ｍＬになり、内容物を完全に混合する。ポジティブディスプレイスメント式ピペットを使用して、トリチル含有溶液（５００μＬ）のアリコートを１０ｍＬのメスフラスコに移し、その体積をメタンスルホン酸で１０ｍＬにする。
最終溶液中のトリチルカチオン含有量を、４３１．７ｎｍのＵＶ吸光度によって測定し、樹脂装填量を、適切な体積、希釈、消散係数（ε：４１μｍｏｌ－１ｃｍ－１）、および樹脂重量を使用して、樹脂１グラム当たりのトリチル基（μｍｏｌ／ｇ）で測定する。アッセイを三つ組で実施し、平均装填量を計算する。
本実施例の樹脂装填手順は、約５００μｍｏｌ／ｇの装填量を樹脂に提供する。ジスルフィドアンカー組み込みステップを室温で２４時間実施する場合、３００～４００μｍｏｌ／ｇの装填量を得る。
テール装填量：アミノメチルポリスチレン－ジスルフィド樹脂の調製と同じ設定および体積を使用して、テールを固体支持体に導入することができる。アンカー装填樹脂を、最初に酸性条件下で脱保護し、得られた材料をカップリング前に中和する。カップリングステップでは、ジスルフィドアンカー溶液の１－メチル－２－ピロリジノンの代わりに、４－エチルモルホリン（ＮＥＭ、０．４Ｍ）を含有するＤＭＩ中の３８の溶液（０．２Ｍ）を使用する。４５℃で２時間後、樹脂３９を２５％イソプロパノール／ジクロロメタン中の５％ジイソプロピルエチルアミンで２回、およびＤＣＭで１回洗浄する。無水安息香酸（０．４Ｍ）およびＮＥＭ（０．４Ｍ）の溶液を、樹脂に添加する。２５分後、反応器ジャケットを室温に冷却し、樹脂を２５％イソプロパノール／ジクロロメタン中の５％ジイソプロピルエチルアミンで２回、およびＤＣＭで８回洗浄する。樹脂４０を濾過し、高真空下で乾燥させる。樹脂４０の装填量を、テール装填量で使用される元のアミノメチルポリスチレン－ジスルフィド樹脂３９の装填量と定義する。
固相合成：モルホリノオリゴマーを、４ｍＬのＢｉｏＣｏｍｍａポリプロピレン反応カラム（部品番号ＣＴ００３－ＢＣ）中の特別注文製ＢｉｏＡｕｔｏｍａｔｉｏｎ １２８ＡＶＢ（Ｐｌａｎｏ，ＴＸ）上で調製する。カラムを合成器上に置く場合、水流用のチャネルを備えたアルミニウムブロックをカラムの周囲に配置する。ＡＶＢ１２８は代替的に試薬／洗浄溶液を添加し、指定の時間保持し、真空を使用してカラムを空にする。
最大約２５サブユニットの長さの範囲のオリゴマーについては、５００μｍｏｌ／ｇに近い樹脂の装填量を伴うアミノメチルポリスチレンジ－スルフィド樹脂が好ましい。より大きいオリゴマーについては、３００～４００μｍｏｌ／ｇの樹脂の装填量を伴うアミノメチルポリスチレン－ジスルフィド樹脂が好ましい。５’－テールを有する分子が所望される場合、テールが装填されている樹脂は、同じ装填量ガイドラインで選択される。
以下の試薬溶液を調製する。
脱トリチル化溶液：４：１のジクロロメタン／トリフルオロエタノール溶液中の１％の４シアノピリジンおよびトリフルオロ酢酸（ｗ／ｗ）、
中和溶液：５：１のジクロロメタン／イソプロパノール溶液中の３％のジイソプロピルエチルアミン、ならびに
カップリング溶液：１，３－ジメチルイミダゾリジノン（ＤＭＩ）溶液中の所望の塩基および連結型の０．１８Ｍ（または２０サブユニットよりも長く成長しているオリゴマーについては０．２４Ｍ）の活性化モルホリノサブユニットならびに０．４ＭのＮ－エチルモルホリン。
ジクロロメタン（ＤＣＭ）を、異なる試薬溶液洗浄液を分離する移行洗浄液として使用する。
ブロックを４２℃に設定した合成器において、２ｍＬの１－メチル－２－ピロリジノンを、３０ｍｇのアミノメチルポリスチレン－ジスルフィド樹脂（またはテール樹脂）を含有する各カラムに添加して、室温で３０分間放置する。２ｍＬのジクロロメタンで２回洗浄した後、以下の合成サイクルを用い得る。
Figure 2022511055000136
個々のオリゴマーの配列を、各カラムが適切な配列中の適切なカップリング溶液（Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｔ、またはＩ）を受けるように合成器にプログラムする。カラム内のオリゴマーがその最終サブユニットの組み込みを完了している場合、カラムをブロックから除去し、４－メトキシトリフェニルメチルクロリド（ＤＭＩ中０．３２Ｍ）および０．８９Ｍの４－エチルモルホリンを含有するカップリング溶液を使用して、手動で最終サイクルを実施する。
樹脂からの切断ならびに塩基および骨格保護基の除去：メトキシトリチル化後、樹脂を２ｍＬの１－メチル－２－ピロリジノンで８回洗浄する。１－メチル－２－ピロリジノン中の０．１Ｍの１，４－ジチオスレイトール（ＤＴＴ）および０．７３Ｍのトリエチルアミンからなる１ｍＬの切断溶液を添加し、カラムに蓋をし、室温で３０分間放置する。その後、１２ｍＬのＷｈｅａｔｏｎバイアルに排出する。大きく収縮した樹脂を３００μＬの切断溶液で２回洗浄する。溶液に、４．０ｍＬの濃縮水性アンモニア（－２０℃で保存）を添加し、バイアルに（テフロン（登録商標）ライナー付きスクリューキャップで）きつく蓋をし、混合物を旋回させて溶液を混合する。バイアルを４５℃のオーブン内に１６～２４時間置き、塩基および骨格保護基の切断をもたらす。
粗生成物精製：バイアル入りのアンモノリシス溶液をオーブンから取り出し、室温に冷却させる。溶液を２０ｍＬの０．２８％水性アンモニアで希釈し、Ｍａｃｒｏｐｒｅｐ ＨＱ樹脂（ＢｉｏＲａｄ）を含有する２．５×１０ｃｍのカラムに通す。塩勾配（Ａ：０．２８％アンモニア、Ｂ：０．２８％アンモニア中の１Ｍ塩化ナトリウム、６０分間で０～１００％ Ｂ）を使用して、メトキシトリチル保護オリゴマーを溶出する。組み合わせた画分をプールし、所望の生成物に応じてさらに処理する。
モルホリノオリゴマーの脱メトキシトリチル化：Ｍａｃｒｏｐｒｅｐ精製からのプールされた画分を１ＭのＨ３ＰＯ４で処理して、ｐＨを２．５に低下させる。最初の混合後、試料を室温で４分間放置し、その時点で２．８％アンモニア／水でｐＨ１０～１１に中和する。生成物を固相抽出（ＳＰＥ）によって精製する。
ＳＰＥカラム充填および調整：Ａｍｂｅｒｃｈｒｏｍｅ ＣＧ－３００Ｍ（Ｄｏｗ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ（Ｒｏｈｍ ａｎｄ Ｈａａｓ）；Ｍｉｄｌａｎｄ，ＭＩ）（３ｍＬ）を、２０ｍＬフリットカラム（ＢｉｏＲａｄ Ｅｃｏｎｏ－Ｐａｃ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ Ｃｏｌｕｍｎｓ（７３２－１０１１））に充填し、樹脂を、３ｍＬの以下：０．２８％ ＮＨ４ＯＨ／８０％アセトニトリル、０．５Ｍ ＮａＯＨ／２０％エタノール、水、５０ｍＭ Ｈ３ＰＯ４／８０％アセトニトリル、水、０．５ ＮａＯＨ／２０％エタノール、水、０．２８％ ＮＨ４ＯＨですすぐ。
ＳＰＥ精製：脱メトキシトリチル化からの溶液をカラムに装填し、樹脂を８ｍＬの０．２８％水性アンモニアで３回すすぐ。Ｗｈｅａｔｏｎバイアル（１２ｍＬ）をカラムの下に配置することができ、生成物を、０．２８％水性アンモニア水中の２ｍＬの４５％アセトニトリルで２回洗浄することによって溶出することができる。
生成物単離：溶液をドライアイス中で凍結させ、バイアルを凍結乾燥機に少なくとも２日間入れ、ふわふわした白色粉末を得る。次いで、試料を水中に溶解し、シリンジを使用して０．２２ミクロンのフィルタ（Ｐａｌｌ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ａｃｒｏｄｉｓｃ ２５ｍｍシリンジフィルタ、０．２ミクロンのＨＴ Ｔｕｆｆｒｙｎ膜を備える）に通して濾過し、光学密度（ＯＤ）をＵＶ分光光度計上で測定して、存在するオリゴマーのＯＤ単位を決定し、かつ分析用の試料を分注する。次いで、溶液を、凍結乾燥のためにＷｈｅａｔｏｎバイアルに戻す。
ＭＡＬＤＩによるモルホリノオリゴマーの分析：ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ質量分析を使用して、精製物中の画分の組成を決定し、かつオリゴマーの同一性（分子量）の証拠を得ることができる。３，５－ジメトキシ－４－ヒドロキシケイ皮酸（シナピン酸）、３，４，５－トリヒドキシアセトフェノン（ＴＨＡＰ）、またはアルファ－シアノ－４－ヒドキシケイ皮酸（ＨＣＣＡ）の溶液をマトリックスとして用いて希釈した後、試料を実験することができる。
ＰＭＯ合成方法Ｂ：ニトロカルボキシフェニルプロピル（ＮＣＰ２）アンカーの使用
ＮＣＰ２アンカー合成：
１．４－フルオロ－３－ニトロ安息香酸メチルの調製（１）
Figure 2022511055000137
 １２．７ｋｇの４－フルオロ－３－ニトロ安息香酸、４０ｋｇのメタノール、および２．８２ｋｇの濃硫酸を、１００Ｌフラスコに添加することができる。混合物を、３６時間還流撹拌（６５℃）する。反応混合物を０℃に冷却する。結晶を約３８℃で形成することができる。混合物を０℃で４時間保持し、次いで窒素下で濾過する。１００Ｌフラスコを洗浄し、濾過ケーキを、０℃に冷却されている１０ｋｇのメタノールで洗浄する。固体濾過ケーキを漏斗上で１時間乾燥させ、トレイに移し、室温において真空オーブン内で一定重量になるまで乾燥させる。
２．３－ニトロ－４－（２－オキソプロピル）安息香酸の調製
Ａ．（Ｚ）－メチル４－（３－ヒドロキシ－１－メトキシ－１－オキソブタ－２－エン－２－イル）－３－ニトロ安息香酸塩（２）
Figure 2022511055000138
 ３．９８ｋｇの前のステップからの４－フルオロ－３－ニトロ安息香酸メチル（１）、９．８ｋｇのＤＭＦ、および２．８１ｋｇのアセト酢酸メチルを、１００Ｌフラスコに添加することができる。混合物を撹拌し、０℃に冷却する。温度を５℃以下に維持しながら、３．６６ｋｇのＤＢＵを約４時間にわたって添加する。混合物をさらに１時間撹拌する。反応温度を１５℃以下に維持しながら、３７．５ｋｇの精製水中の８．１５ｋｇのクエン酸の溶液を添加する。添加後、反応混合物をさらに３０分間撹拌し、次いで窒素下で濾過する。湿潤濾過ケーキを１４．８ｋｇの精製水と共に１００Ｌフラスコに戻す。スラリーを１０分間撹拌し、次いで濾過する。湿潤ケーキを１００Ｌフラスコに再び戻し、１４．８ｋｇの精製水で１０分間スラリー化し、粗（Ｚ）－メチル４－（３－ヒドロキシ－１－メトキシ－１－オキソブタ－２－エン－２－イル）－３－ニトロ安息香酸塩に濾過した。
Ｂ．３－ニトロ－４－（２－オキソプロピル）安息香酸
Figure 2022511055000139
 粗（Ｚ）－メチル４－（３－ヒドロキシ－１－メトキシ－１－オキソブタ－２－エン－２－イル）－３－ニトロ安息香酸塩を、窒素下で１００Ｌ反応フラスコに充填することができる。１４．２ｋｇの１，４－ジオキサンを添加し、次いで撹拌する。反応混合物の温度を１５℃未満に維持しながら、１６．６５５ｋｇの濃縮ＨＣｌおよび１３．３３ｋｇの精製水の溶液（６Ｍ ＨＣｌ）を２時間にわたって添加する。添加が完了すると、反応混合物を２４時間還流加熱（８０℃）し、室温に冷却し、窒素下で濾過する。固体濾過ケーキを１４．８ｋｇの精製水で粉砕し、濾過し、１４．８ｋｇの精製水で再び粉砕し、濾過する。固体を３９．９ｋｇのＤＣＭと共に１００Ｌフラスコに戻し、１時間撹拌しながら還流させる。１．５ｋｇの精製水を添加して、残りの固体を溶解する。底部有機層を、予め加温した７２Ｌフラスコに分配し、次いで、清潔な乾燥１００Ｌフラスコに戻す。溶液を０℃に冷却し、１時間保持し、次いで濾過する。固体濾過ケーキを、９．８ｋｇのＤＣＭおよび５ｋｇのヘプタンの溶液でそれぞれ２回洗浄し、次いで漏斗上で乾燥させる。固体をトレイに移し、１．８５５ｋｇの一定重量の３－ニトロ－４－（２－オキソプロピル）安息香酸になるまで乾燥させる。
３．Ｎ－トリチルピペラジンコハク酸塩（ＮＴＰ）の調製
Figure 2022511055000140
 １．８０５ｋｇのトリフェニルメチルクロリドおよび８．３ｋｇのトルエン（ＴＰＣ溶液）を、窒素下で７２Ｌジャケット付きフラスコに充填することができる。混合物を、固体が溶解するまで撹拌する。５．６１ｋｇのピペラジン、１９．９ｋｇのトルエン、および３．７２ｋｇのメタノールを、窒素下で１００Ｌジャケット付き反応フラスコに添加する。混合物を撹拌し、０℃に冷却する。反応温度を１０℃以下に維持しながら、ＴＰＣ溶液を、数回に分けて４時間にわたってゆっくりと添加する。混合物を１０℃で１．５時間撹拌し、次いで１４℃に加温させる。３２．６ｋｇの精製水を７２Ｌフラスコに充填し、次いで内部バッチ温度を２０＋／－５℃に維持しながら、１００Ｌフラスコに移すことができる。層を分割させ、底部水層を分離および保存する。有機層をそれぞれ３２ｋｇの精製水で３回抽出し、水層を分離し、保存された水溶液と組み合わせる。
残りの有機層を１８℃に冷却し、１０．８７ｋｇの精製水中の８４７ｇのコハク酸の溶液を、数回に分けてゆっくりと有機層に添加する。混合物を２０＋／－５℃で１．７５時間撹拌する。混合物を濾過し、固体を２ｋｇのＴＢＭＥおよび２ｋｇのアセトンで洗浄し、次いで漏斗上で乾燥させる。濾過ケーキを、それぞれ５．７ｋｇのアセトンで２回粉砕し、濾過し、粉砕間に１ｋｇのアセトンで洗浄する。固体を漏斗上で乾燥させ、次いでトレイに移し、室温において真空オーブン内で一定重量になるまで乾燥させる。
４．（４－（２－ヒドロキシプロピル）－３－ニトロフェニル）（４－トリチルピペラジン－１－イル）メタノンの調製
Ａ．１－（２－ニトロ－４（４－トリチルピペラジン－１－カルボニル）フェニル）プロパン－２－オンの調製
Figure 2022511055000141
 ２ｋｇの３－ニトロ－４－（２－オキソプロピル）安息香酸（３）、１８．３ｋｇのＤＣＭ、および１．８４５ｋｇのＮ－（３－ジメチルアミノプロピル）－Ｎ’－エチルカルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ．ＨＣｌ）を、窒素下で１００Ｌジャケット付きフラスコに充填することができる。溶液を、均質な混合物が形成されるまで撹拌する。３．０４８ｋｇのＮＴＰを室温で３０分間にわたって添加し、８時間撹拌する。５．４４ｋｇの精製水を反応混合物に添加し、３０分間撹拌する。層を分離させ、生成物を含有する底部有機層を排出および保存する。水層を５．６５ｋｇのＤＣＭで２回抽出する。組み合わせた有機層を、４．０８ｋｇの精製水中の１．０８ｋｇの塩化ナトリウムの溶液で洗浄する。有機層を１．０６８ｋｇの硫酸ナトリウム上で乾燥させ、濾過する。硫酸ナトリウムを、１．３ｋｇのＤＣＭで洗浄する。組み合わせた有機層を、２５２ｇのシリカゲルでスラリー化し、２５２ｇのシリカゲルの床を含有するフィルタ漏斗を通して濾過する。シリカゲル床を、２ｋｇのＤＣＭで洗浄する。組み合わせた有機層をロータリーエバポレーター上で蒸発させ、次いで４．８ｋｇのＴＨＦを残渣に添加し、ＴＨＦ中の２．５体積の粗１－（２－ニトロ－４（４－トリチルピペラジン－１－カルボニル）フェニル）プロパン－２－オンに達するまでロータリーエバポレーター上で蒸発させる。
Ｂ．（４－（２－ヒドロキシプロピル）－３－ニトロフェニル）（４－トリチルピペラジン－１－イル）メタノン（５）の調製
Figure 2022511055000142
 ３６００ｇの前のステップからの４および９８００ｇのＴＨＦを、１００Ｌジャケット付きフラスコに窒素下で充填することができる。撹拌溶液を５℃以下に冷却する。溶液を１１５２５ｇのエタノールで希釈し、１９４ｇの水素化ホウ素ナトリウムを５℃以下で約２時間にわたって添加する。反応混合物を５℃以下でさらに２時間撹拌する。反応を、３ｋｇの水中の１．１ｋｇの塩化アンモニウムの溶液をゆっくりと添加することによってクエンチして、温度を１０℃以下に維持する。反応混合物をさらに３０分間撹拌し、濾過して無機物を除去し、１００Ｌジャケット付きフラスコに再充填し、２３ｋｇのＤＣＭで抽出する。有機層を分離し、水層をそれぞれ４．７ｋｇのＤＣＭでさらに２回抽出する。組み合わせた有機層を、３ｋｇの水中の８００ｇの塩化ナトリウムの溶液で洗浄し、次いで２．７ｋｇの硫酸ナトリウム上で乾燥させる。懸濁液を濾過し、濾過ケーキを２ｋｇのＤＣＭで洗浄する。組み合わせた濾液を２．０体積に濃縮し、約３６０ｇの酢酸エチルで希釈し、蒸発させる。粗生成物を、窒素下で、ＤＣＭで充填した４ｋｇのシリカのシリカゲルカラムに装填し、７．２ｋｇのＤＣＭ中の２．３ｋｇの酢酸エチルで溶出する。組み合わせた画分を蒸発させ、残渣を１１．７ｋｇのトルエンに取り込む。トルエン溶液を濾過し、濾過ケーキをそれぞれ２ｋｇのトルエンで２回洗浄する。濾過ケーキを、一定重量になるまで乾燥させる。
５．２，５－ジオキソピロリジン－１－イル（１－（２－ニトロ－４－（４－トリフェニルメチルピペラジン－１カルボニル）フェニル）プロパン－２－イル）炭酸塩（ＮＣＰ２アンカー）の調製
Figure 2022511055000143
 ４．３ｋｇの化合物５（１Ｈ ＮＭＲによる残留トルエンに基づいて調整した重量；これ以降の全ての試薬は適宜スケール調整される）および１２．７ ｋｇのピリジンを、１００Ｌジャケット付きフラスコに窒素下で充填することができる。３．１６０ｋｇのＤＳＣ（１Ｈ ＮＭＲにより７８．９１重量％）を、内部温度を３５℃以下に維持しながらこれに添加する。反応混合物を周囲室温で約２２時間エージングし、次いで濾過する。濾過ケーキを、２００ｇのピリジンで洗浄する。それぞれ１／２の濾液体積を含む２つのバッチにおいて、濾液洗浄液を、５０ｋｇの水中の１１ｋｇのクエン酸の溶液を含有する１００Ｌジャケット付きフラスコにゆっくりと充填し、３０分間撹拌して、固体沈殿を可能にすることができる。固体をフィルタ漏斗で回収し、１回の洗浄当たり４．３ｋｇの水で２回洗浄し、フィルタ漏斗上で、真空下で乾燥させる。
組み合わせた固体を、１００Ｌジャケット付きフラスコに充填し、２８ｋｇのＤＣＭ中に溶解し、４．３ｋｇの水中の９００ｇの炭酸カリウムの溶液で洗浄する。１時間後、層を分離させ、水層を除去する。有機層を１０ｋｇの水で洗浄し、分離し、３．５ｋｇの硫酸ナトリウム上で乾燥させる。ＤＣＭを濾過し、蒸発させ、真空下で６．１６ｋｇのＮＣＰ２アンカーになるまで乾燥させる。
ＮＣＰ２アンカー装填樹脂合成
約５２ＬのＮＭＰおよび２３００ｇのアミノメチルポリスチレン樹脂を、テフロン（登録商標）活栓を備えた７５Ｌ固相合成反応器に充填し得る。樹脂を、ＮＭＰ中で約２時間撹拌して膨潤させ、次いで排出する。樹脂を、１回の洗浄当たり４ＬのＤＣＭで２回、次いで１回の洗浄当たり３９Ｌの中和溶液で２回、次いで１回の洗浄当たり３９ＬのＤＣＭで２回洗浄する。ＮＣＰ２アンカー溶液を撹拌樹脂溶液にゆっくりと添加し、室温で２４時間撹拌し、次いで排出する。樹脂を、１回の洗浄当たり３９ＬのＮＭＰで４回、および１回の洗浄当たり３９ＬのＤＣＭで６回洗浄する。樹脂を、１／２の二炭酸ジエチル（ＤＥＤＣ）キャッピング溶液で３０分間処理および撹拌し、排出し、残りの１／２のＤＥＤＣキャッピング溶液で３０分間処理および撹拌し、排出する。樹脂を、１回の洗浄当たり３９ＬのＤＣＭで６回洗浄し、次いでオーブン内で３５７３．７１ｇの一定重量のアンカー装填樹脂になるまで乾燥させる。
ＮＣＰ２アンカーを使用したモルホリノオリゴマーの調製
ＰＭＯ粗原薬の５０Ｌ固相合成
１．材料
Figure 2022511055000144
 出発材料の化学構造：
Ａ．活性化ＥＧ３テール
Figure 2022511055000145
 Ｂ．活性化Ｃサブユニット（調製については、米国特許第８，０６７，５７１号を参照）
Figure 2022511055000146
 Ｃ．活性化Ａサブユニット（調製については、米国特許第８，０６７，５７１号を参照）
Figure 2022511055000147
 Ｄ．活性化ＤＰＧサブユニット（調製については、ＷＯ２００９／０６４４７１を参照）
Figure 2022511055000148
 Ｅ．活性化Ｔサブユニット（調製については、ＷＯ２０１３／０８２５５１を参照）
Figure 2022511055000149
 Ｆ．アンカー装填樹脂
Figure 2022511055000150
 式中、Ｒ１は、支持培地である。
Figure 2022511055000151
２．ＰＭＯ粗原薬の合成
Ａ．樹脂膨潤
７５０ｇのアンカー装填樹脂および１０．５ＬのＮＭＰのアリコートを、５０Ｌのシラン処理した反応器に充填し、３時間撹拌し得る。ＮＭＰを排出し、アンカー装填樹脂を、それぞれ５．５ＬのＤＣＭで２回、およびそれぞれ５．５Ｌの３０％ ＴＦＥ／ＤＣＭで２回、洗浄する。
Ｂ．サイクル０：ＥＧ３テールカップリング
アンカー装填樹脂を、それぞれ５．５Ｌの３０％ ＴＦＥ／ＤＣＭで３回洗浄し、排出し、５．５ＬのＣＹＴＦＡ溶液で１５分間洗浄し、排出し、５．５ＬのＣＹＴＦＡ溶液で１５分間、排出することなく再び洗浄し、それに１２２ｍＬの１：１のＮＥＭ／ＤＣＭを充填し、懸濁液を２分間撹拌し、排出し得る。樹脂を、５．５Ｌの中和溶液で５分間、２回洗浄し、排出し、次いでそれぞれ５．５ＬのＤＣＭで２回洗浄し、排出する。３ＬのＤＭＩ中の７０６．２ｇの活性化ＥＧ３テールおよび２３４ｍＬのＮＥＭの溶液を樹脂に充填し、室温で３時間撹拌し、排出し得る。樹脂を、１回の洗浄当たりそれぞれ５．５Ｌの中和溶液で５分間、２回、次いで５．５ＬのＤＣＭで１回洗浄し、排出する。２６８０ｍＬのＮＭＰ中の３７４．８ｇの無水安息香酸および１９５ｍＬのＮＥＭの溶液を充填し、１５分間撹拌し、排出し得る。樹脂を、５．５Ｌの中和溶液で５分間撹拌し、次いで５．５ＬのＤＣＭで１回、およびそれぞれ５．５Ｌの３０％ ＴＦＥ／ＤＣＭで２回洗浄する。樹脂を、５．５Ｌの３０％ ＴＦＥ／ＤＣＭ中に懸濁し、１４時間保持する。
Ｃ．サブユニットカップリングサイクル１～ｎ
Figure 2022511055000152
 ｉ．カップリング前の処理
各カップリングサイクルの前に、樹脂を、１）３０％ ＴＦＥ／ＤＣＭで洗浄し、２）ａ）ＣＹＴＦＡ溶液で１５分間処理し、排出し、ｂ）ＣＹＴＦＡ溶液で１５分間処理し、それに１：１のＮＥＭ／ＤＣＭを添加し、撹拌し、排出し、３）中和溶液で３回撹拌し、４）ＤＣＭで２回洗浄する。
ｉｉ．カップリング後の処理
各サブユニット溶液を排出した後、樹脂を、１）ＤＣＭで洗浄し、２）３０％ ＴＦＥ／ＤＣＭで２回洗浄する。樹脂を次のカップリングサイクルの前に一定期間保持する場合、２回目のＴＦＥ／ＤＣＭ洗浄液は排出せず、樹脂を当該ＴＦＥ／ＤＣＭ洗浄溶液中に保持する。
ｉｉｉ．活性化サブユニットカップリングサイクル
各カップリングサイクルを、各塩基含有サブユニットについて表２に初期Ｃ（シトシン）モノマーカップリングについて概説するように実施する。
ｉｖ．最終ＩＰＡ洗浄
最終カップリングステップを実施した後、樹脂を、それぞれ１９．５ＬのＩＰＡで８回洗浄し、真空下で室温で約６３．５時間乾燥させて、乾燥重量を５，５７９．８ｇとする。
Ｃ．切断
上記の樹脂結合ＰＭＯ粗原薬を２ロットに分割し、各ロットを以下のように処理する。２，７８９．９ｇの樹脂のロットを、１）１０ＬのＮＭＰで２時間撹拌し、次いで、ＮＭＰを排出し、２）それぞれ１０Ｌの３０％ ＴＦＥ／ＤＣＭで３回洗浄し、３）１０ＬのＣＹＴＦＡ溶液で１５分間処理し、４）１０ＬのＣＹＴＦＡ溶液で１５分間処理し、次いでそれに１３０ｍＬの１：１のＮＥＭ／ＤＣＭを添加し、２分間撹拌し、排出する。樹脂を、それぞれ１０Ｌの中和溶液で３回処理し、１０ＬのＤＣＭで６回、およびそれぞれ１０ＬのＮＭＰで８回洗浄する。樹脂を、６．９６ＬのＮＭＰ中の１５３０．４ｇのＤＴＴおよび２９８０ＤＢＵの切断溶液で２時間処理し、ＰＭＯ粗原薬を樹脂から切り離す。切断溶液を排出し、別個の槽に保持する。反応器および樹脂を、切断溶液と組み合わせた４．９７ＬのＮＭＰで洗浄する。
Ｄ．脱保護
組み合わせた切断溶液とＮＭＰ洗浄液を圧力槽に移し、それに、冷凍庫内で－１０℃～－２５℃の温度に予め冷却した３９．８ＬのＮＨ４ＯＨ（ＮＨ３・Ｈ２Ｏ）を添加した。圧力槽を密封し、４５℃に１６時間加熱し、次いで２５℃に冷却させる。ＰＭＯ粗原薬を含有するこの脱保護溶液を、精製水で３：１に希釈し、ｐＨを２Ｍリン酸で３．０に、次いでＮＨ４ＯＨでｐＨ８．０３に調整する。
Ｅ．ＰＭＯ粗原薬の精製
ＰＭＯ粗原薬を含有する上記のパートＤからの脱保護溶液を、ＴｏｙｏＰｅａｒｌ Ｓｕｐｅｒ－Ｑ ６５０Ｓアニオン交換樹脂（Ｔｏｓｏｈ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）のカラム上に装填し、１７カラム体積に対して０～３５％Ｂの勾配で溶出し（緩衝液Ａ：１０ｍＭの水酸化ナトリウム、緩衝液Ｂ：１０ｍＭの水酸化ナトリウム中の１Ｍの塩化ナトリウム）、許容される純度の画分（Ｃ１８およびＳＣＸ ＨＰＬＣ）をプールして、精製された医薬品溶液とする。
精製された原薬溶液を脱塩し、凍結乾燥させて、精製されたＰＭＯ原薬とする。
Figure 2022511055000153
ＣＰＰコンジュゲート（「Ｒ６Ｇｌｙ」は、配列番号：１１として開示される）
Figure 2022511055000154
 分析手順：マトリックス支援レーザー脱離イオン化飛行時間型質量スペクトル（ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ－ＭＳ）を、シナピン酸（ＳＡ）マトリックスを使用して、Ｂｒｕｋｅｒ Ａｕｔｏｆｌｅｘ（商標）Ｓｐｅｅｄ上で記録することができる。３０００ダイオードアレイ検出器およびＰｒｏＰａｃＴＭ ＳＣＸ－２０カラム（２５０×４ｍｍ）を備えたＴｈｅｒｍｏ Ｄｉｏｎｅｘ ＵｌｔｉＭａｔｅ ３０００システム上で、１．０ｍＬ／分の流速（ｐＨ＝２、カラム温度３０℃）を使用して、ＳＣＸ－ＨＰＬＣを実施することができる。移動相は、Ａ（２４ｍＭのＨ３ＰＯ４を含有する水中の２５％アセトニトリル）およびＢ（１ＭのＫＣｌおよび２４ｍＭのＨ３ＰＯ４を含有する水中の２５％アセトニトリル）であり得る。勾配溶出を用い得る：０分、３５％ Ｂ；２分、３５％ Ｂ；２２分、８０％ Ｂ；２５分、８０％ Ｂ；２５．１分、３５％ Ｂ；３０分、３５％ Ｂ。
Ａｃ－Ｌ－Ａｒｇ－Ｌ－Ａｒｇ－Ｌ－Ａｒｇ－Ｌ－Ａｒｇ－Ｌ－Ａｒｇ－Ｌ－Ａｒｇ－Ｇｌｙ－ＯＨ（配列番号：１１）ヘキサトリフルオロアセテート（６１４．７ｍｇ、０．３５４ｍｍｏｌ）、および１－［ビス（ジメチルアミノ）メチレン］－１Ｈ－１，２，３－トリアゾロ［４，５－ｂ］ピリジニウム３－オキシドヘキサフルオロリン酸塩（ＨＡＴＵ、１３４．４ｍｇ、０．３５４ｍｍｏｌ）、およびジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ、２０ｍＬ）を、ＰＭＯ（２日間の凍結乾燥によって新たに乾燥させた）の混合物に添加する。混合物を室温で３分間撹拌し、次いで、Ｎ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＰＥＡ、６８．５ｍｇ、０．５３０ｍｍｏｌ）を添加する。５分後、濁った混合物は、透明な溶液になる。反応をＳＣＸ－ＨＰＬＣによって監視することができる。２時間後、２０ｍＬの１０％水酸化アンモニウム溶液（２．８％ ＮＨ３＊Ｈ２Ｏ）を添加する。混合物を室温でさらに２時間撹拌する。反応を４００ｍＬの水の添加によって終了する。トリフルオロエタノール（２．０ｍＬ）を溶液に添加する。
溶液を２つの分量に分割し、各分量をＷＣＸカラム（カラム当たり１０ｇの樹脂）によって精製することができる。各ＷＣＸカラムを、最初に水中の２０％アセトニトリル（ｖ／ｖ）で洗浄して、ＰＭＯ出発材料を除去する。ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ質量スペクトル分析がＰＭＯシグナルの不在を示す場合、洗浄（各カラムに対して２２５ｍＬ）を停止することができる。次いで、各カラムを水（カラム当たり１００ｍＬ）で洗浄する。所望の生成物を、２．０ＭのグアニジンＨＣｌ（各カラムに対して１４０ｍＬ）で溶出することができる。精製溶液を一緒にプールし、次いで２つの分量に分割し、各々をＳＰＥカラム（各カラムに対して１０ｇの樹脂）によって脱塩する。
ＳＰＥカラムを、最初に１．０ＭのＮａＣｌ水溶液（各カラムに対して１００ｍＬ）で洗浄して、六塩酸塩の塩形態を生成することができる。次いで、各ＳＰＥカラムを水（各カラムに対して２００ｍＬ）で洗浄する。最終脱塩生成物は、水中の５０％アセトニトリル（ｖ／ｖ、各カラムに対して１５０ｍＬ）を使用して溶出することができる。アセトニトリルは減圧下で排出することにより除去することができる。得られた水溶液を凍結乾燥して、六塩酸塩として所望の生成物を得ることができる。
実施例１：ＰＭＯ
上述のＰＭＯ合成方法を使用して、ＰＭＯ＃１、ＰＭＯ＃２、およびＰＭＯ＃３を以下のように合成した。
Figure 2022511055000155
 式中、１～２２および５’から３’の各Ｎｕは、Ｈ５０Ｄ（＋０４－１８）（配列番号：１）である。
Figure 2022511055000156
Figure 2022511055000157
 式中、１～２５および５’から３’の各Ｎｕは、Ｈ５０Ｄ（＋０７－１８）（配列番号：２）である。
Figure 2022511055000158
Figure 2022511055000159
 式中、１～２３および５’から３’の各Ｎｕは、Ｈ５０Ｄ（＋０７－１６）（配列番号：３）である。
Figure 2022511055000160
 式中、Ａは、
Figure 2022511055000161
 であり、Ｃは、
Figure 2022511055000162
 であり、Ｇは、
Figure 2022511055000163
 であり、Ｔは、
Figure 2022511055000164
 である。
ＰＭＯ＃１（配列番号：１）は、医薬品製剤を許容にするには限定されすぎた溶解性特性を有する生成物をもたらし、ＰＭＯ＃２（配列番号：２）は、十分な収率および純度を有して製造することができない生成物をもたらした。
ＰＭＯ＃１およびＰＭＯ＃２の合成とは対照的に、ＰＭＯ＃３（５’末端のＰＭＯ＃２とは２塩基のみが異なる）の合成は、溶解性または精製の問題がなく、ＰＭＯ＃３からのＰＰＭＯ＃３のその後の合成を可能にした（実施例２－以下）。
Figure 2022511055000165
類似のプロセスを使用して、ＰＭＯ＃４、ＰＭＯ＃５、ＰＭＯ＃６、ＰＭＯ＃７、ＰＭＯ＃８、およびＰＭＯ＃９を合成した。
実施例２：ＰＰＭＯ＃３
上述のプロトコルを使用して、ＰＰＭＯ＃３をＰＭＯ＃３（配列番号３）から合成した。
Figure 2022511055000166
 式中、１～２３および５’から３’の各Ｎｕは、配列番号：３である。
Figure 2022511055000167
 式中、Ａは、
Figure 2022511055000168
 であり、Ｃは、
Figure 2022511055000169
 であり、Ｇは、
Figure 2022511055000170
 であり、Ｔは
Figure 2022511055000171
 である。
実施例３：ｉｎ ｖｉｔｒｏでのエクソン５０スキッピング
以下の表に記載されるように、ヒトジストロフィン（ＤＭＤ）エクソン５０を標的とする２つの化合物、ＰＭＯ＃３およびＰＰＭＯ＃３（両方が同じ配列を含有する）を、健康なヒト筋管におけるＤＭＤエクソン５０スキッピングについて評価した。
Figure 2022511055000172
具体的には、健康なヒト筋芽細胞（Ｚｅｎ－Ｂｉｏ，Ｉｎｃ．から購入したパッセージ５～６、ＳＫＢ－Ｆ－ＳＬ）を、低血清培地（ＳＫＭ－Ｄ、Ｚｅｎ－Ｂｉｏ，Ｉｎｃ．）中でインキュベートすることにより分化を開始する前に、ＳＫＭ－Ｍ培地中で８０～９０％の培養密度を達成するように培養した。分化の５日後、成熟筋管を様々な濃度（すなわち、４０μｍ、２０μｍ、１０μｍ、５μｍ、２．５μｍ、および１．２５μｍ）で上記化合物とインキュベートした。９６時間のインキュベーション後、筋管をＰＢＳで洗浄し、１％のβ－メルカプトエタノールを補充したＲＮｅａｓｙ Ｍｉｃｒｏキット（カタログ番号７４００４、Ｑｉａｇｅｎ）中でＲＬＴ緩衝液により溶解した。ＲＮＡを溶出するために２０μＬのＲＮａｓｅ不含水を使用したことを除いて、製造業者の推奨に従って全ＲＮＡを単離した。
両方の化合物によるＤＭＤエクソン５０スキッピングを決定するために、ワンステップエンドポイントＲＴ－ＰＣＲを実施した。ｃＤＮＡ合成およびＰＣＲ増幅は、１００ｎｇの総ＲＮＡ、遺伝子特異的プライマー、およびＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ ＩＩＩワンステップＲＴ－ＰＣＲシステムをプラチナＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（カタログ番号１２５７４－０２６、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）と共に使用して実行した。遺伝子特異的プライマーを、ヒトＤＭＤエクソン４９および５２（フォワードプライマー：ＣＣＡ ＧＣＣ ＡＣＴ ＣＡＧ ＣＣＡ ＧＴＧ ＡＡＧ（配列番号：１２）、リバースプライマー：ＣＧＡ ＴＣＣ ＧＴＡ ＡＴＧ ＡＴＴ ＧＴＴ ＣＴＡ ＧＣＣ（配列番号：１３））で標的化するように設計した。ｃＤＮＡ合成およびＰＣＲ増幅は、表６に示されるプログラムを使用して、ＢｉｏＲａｄ ＣＦＸ９６リアルタイムサーマルサイクラーによって実施した。スキッピングされたおよびスキッピングされていないＰＣＲ産物の発現を、製造業者の説明書に従って、ＤＮＡ １Ｋ試薬（カタログ番号７６０５１７およびＣＬＳ７６０６７３、Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）により調製されたＬａｂＣｈｉｐ ＧＸシステムのＤＮＡ拡張範囲ＬａｂＣｈｉｐ上に２２μＬのＰＣＲ産物を装填することによって評価した。ＤＭＤエクソン５０スキッピングの割合を、スキッピングされたおよびスキッピングされていないバンドの合計モル濃度（ｎｍｏｌ／Ｌ）と比較した、エクソン５０スキッピングされたバンドのモル濃度の割合として計算する。
両側の、対応のないスチューデントのｔ検定（等分散的）を使用して、２群の平均値が各用量で互いに統計的に異なるかどうかを評価した。０．０５未満のＰ値は、統計的に有意であると考えられる。
Figure 2022511055000173
結果は、ＰＰＭＯ＃３がＰＭＯ＃３と比較してＤＭＤエクソン５０スキッピングを有意に増加させることを示し、（ＰＰＭＯ＃３のＰＭＯ＃に対するスキッピングの比率として）以下の表に示される。
Figure 2022511055000174
上記の表７のデータは、全ての濃度でのＰＭＯ＃３と比較して、細胞がＰＰＭＯ＃３で処理された場合に、より高いエクソン５０スキッピングが筋管において生じることを示す。この改善は、実施例４の非ヒト霊長類（ＮＨＰ）研究などのｉｎ ｖｉｖｏ比較試験でさらに実証され得、ＮＨＰは、ＰＰＭＯ＃３またはＰＭＯ＃３で処理され、エクソン５０スキッピングは、様々な関連する筋組織で測定される（詳細は実施例４を参照）。
実施例４：ＮＨＰにおけるエクソン５０スキッピング
ＰＰＭＯアンチセンスオリゴマーのエクソンスキッピングの有効性をさらに実証するために、非ヒト霊長類を利用する。具体的には、無傷の筋組織を有するカニクイザルに、ＰＰＭＯ＃３（実施例２）、ＰＭＯ＃３（実施例１）、または生理食塩水を静脈内注射する。
動物を、臨床観察（例えば、皮膚および毛皮の評価、呼吸への影響）ならびに体重測定を含め、研究全体を通して観察する。血液および尿検体を、少なくとも検査開始前、ならびに初回投与および最終投与の２４時間後（該当する場合）に採取する。
予定された各剖検時に、または臨終に安楽死させた時に、横隔膜、十二指腸の平滑筋、食道、および大動脈、大腿四頭筋、三角筋、二頭筋、および心臓の切片を採取し、急速凍結させる。エクソン５０スキッピング率を、上記のようにＲＴ－ＰＣＲを使用して決定する。
実施例５：ｉｎ ｖｉｔｒｏでのＰＭＯによるエクソン５０スキッピング
一連のＰＭＯ（配列番号１～７、ＰＭＯ＃１～＃７）を調製し、エクソン５０スキッピングの効率について試験した。簡潔に言うと、ヒトの初代筋芽細胞を、標準的な技術を使用して培養した。凍結乾燥したＰＭＯをヌクレアーゼ不含水に再懸濁し、モル濃度を検証するために、ＰＭＯ溶液をＮａｎｏＤｒｏｐ ２０００分光光度計（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して測定した。用量範囲のＰＭＯを、製造業者の説明書およびＰ３キット（Ｌｏｎｚａ）に従い、ヌクレオポレーションを使用して筋芽細胞（例えば、０．６２５、１．２５、２．５、５、１０、および２０μＭ） に送達し、ＲＮＡ抽出前に、３７℃、５％のＣＯ２のインキュベーター中で一晩インキュベートした。ＲＮＡを、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ製のＲＮＡｓｐｉｎ ９６ウェルＲＮＡ単離キットを使用してＰＭＯ処理細胞から抽出し、ヒトＤＭＤエクソン４９～５２を増幅させたプライマーと共に標準的な技術を使用してＲＴ－ＰＣＲに供した。Ｃａｌｉｐｅｒ ＬａｂＣｈｉｐバイオアナライザーを使用してスキッピングを測定し、エクソンスキッピング％（すなわち、全長ＰＣＲ産物と比較したエクソンスキッピングされた産物のバンド強度）を、式［エクソン５０スキッピングされた産物／（エクソン５０スキッピングされた産物とエクソン５０スキッピングされていない産物との合計）×１００］によって計算し、ＥＣ５０値を、各濃度で誘導されたスキッピング率に基づいて計算した。表８に示されるように、エクソン５０のスプライスアクセプターまたはスプライスドナー領域を標的とするように設計された本開示のＰＭＯオリゴマーは、エクソン５０のスキッピングをＰＭＯ＃１、ＰＭＯ＃２、およびＰＭＯ＃３で提供し、最高レベルのエクソン５０スキッピング活性（ＥＣ５０＜１．０μＭ）を提供した。
Figure 2022511055000175
（１） ＊＊＊＊＝ＥＣ５０１．０μＭ未満、＊＊＝ＥＣ５０１．０～３．０μＭ、＊＝ＥＣ５０３．０μＭ以上。
前述の発明を実施するための形態および不随する実施例は、単に例示であり、添付の特許請求の範囲およびそれらの同等物によってのみ定義される本発明の範囲に対する限定として取られるべきではないことを理解されたい。
本開示の実施形態に対する様々な変更および修正は、当業者に明らかであろう。本発明の化学構造、置換基、誘導体、中間体、合成、組成物、製剤、または使用方法に関連するものを含むがこれに限定されない、このような変更および修正は、それらの趣旨または範囲から逸脱することなく行われ得る。
Figure 2022511055000176

Claims (29)

  1. 選択された標的に結合してヒトジストロフィン遺伝子においてエクソンスキッピングを誘導することができるアンチセンスオリゴマー、またはその薬学的に許容される塩であって、前記アンチセンスオリゴマーが、アニーリング部位として指定されるジストロフィンプレｍＲＮＡのエクソン５０標的領域に相補的である塩基の配列を含み、前記塩基配列およびアニーリング部位が、以下から選択され、
    Figure 2022511055000177
     式中、配列番号：１～９の各々のＴが、チミンまたはウラシルである、アンチセンスオリゴマー、またはその薬学的に許容される塩。
  2. 前記アンチセンスオリゴマーが、前記アンチセンスオリゴマーの５’末端に結合されたＴ部分を含有し、前記Ｔ部分が、以下から選択され、
    Figure 2022511055000178
     前記アンチセンスオリゴマーが、任意に細胞膜透過性ペプチドに連結され、
    前記アンチセンスオリゴマーが、ヒトジストロフィン遺伝子においてエクソンスキッピングを誘導する、請求項１に記載のアンチセンスオリゴマー、またはその薬学的に許容される塩。
  3. 細胞膜透過性ペプチドが、前記アンチセンスオリゴマーの３’末端に結合される、請求項１～２のいずれか一項に記載のアンチセンスオリゴマー。
  4. 前記細胞膜透過性ペプチドが、アルギニンリッチペプチドである、請求項３に記載のアンチセンスオリゴマー。
  5. 前記アルギニンリッチペプチドが、－（ＲＸＲ）４－Ｒａ（配列番号：１５）、Ｒ－（ＦＦＲ）３－Ｒａ（配列番号：１６）、－Ｂ－Ｘ－（ＲＸＲ）４－Ｒａ（配列番号：１７）、－Ｂ－Ｘ－Ｒ－（ＦＦＲ）３－Ｒａ（配列番号：１８）、－ＧＬＹ－Ｒ－（ＦＦＲ）３－Ｒａ（配列番号：１９）、－ＧＬＹ－Ｒ５－Ｒａ（配列番号：２０）、－Ｒ５－Ｒａ（配列番号：２１）、－ＧＬＹ－Ｒ６－Ｒａ（配列番号：１１）、および－Ｒ６－Ｒａ（配列番号：１０）からなる群から選択され、式中、Ｒａが、Ｈ、アシル、ベンゾイル、およびステアロイルから選択され、Ｒが、アルギニンであり、Ｘが、６－アミノヘキサン酸であり、Ｂが、β－アラニンであり、Ｆが、フェニルアラニンであり、ＧＬＹ（またはＧ）が、グリシンである、請求項４に記載のアンチセンスオリゴマー。
  6. 前記アンチセンスオリゴマーの核酸塩基が、モルホリノ環構造に連結される、請求項１～５のいずれか一項に記載のアンチセンスオリゴマー。
  7. 式（Ｉ）に従うアンチセンスオリゴマー、
    Figure 2022511055000179
     またはその薬学的に許容される塩であって、式中、
    各Ｎｕが、一緒になって標的化配列を形成する核酸塩基であり、
    Ｔが、
    Figure 2022511055000180
     から選択される部分であり、前記Ｔ部分の遠位－ＯＨまたは－ＮＨ２が、任意に細胞膜透過性ペプチドに連結され、
    Ｒ１００が、水素または細胞膜透過性ペプチドであり、
    １～ｎ個の各Ｎｕが、５’から３’に、以下のうちの１つにおける前記核酸塩基に対応し、
    Figure 2022511055000181
     式中、Ａが、
    Figure 2022511055000182
     であり、Ｃが、
    Figure 2022511055000183
     であり、Ｇが、
    Figure 2022511055000184
     であり、Ｔが、
    Figure 2022511055000185
     である、アンチセンスオリゴマー、またはその薬学的に許容される塩。
  8. １～ｎ個の各Ｎｕが、５’から３’に、配列番号：３に対応する、請求項７に記載のアンチセンスオリゴマー。
  9. 前記アンチセンスオリゴマーが、１個の細胞膜透過性ペプチドを含有する、請求項７または８に記載のアンチセンスオリゴマー。
  10. Ｔが、以下から選択される部分である、請求項７～９のいずれか一項に記載のアンチセンスオリゴマー。
    Figure 2022511055000186
  11. Ｔが、以下から選択される部分であり、
    Figure 2022511055000187
     Ｒ１００が、細胞膜透過性ペプチドである、請求項７～１０のいずれか一項に記載のアンチセンスオリゴマー。
  12. Ｔが、
    Figure 2022511055000188
     であり、
    Ｒ１００が、細胞膜透過性ペプチドである、請求項１１に記載のアンチセンスオリゴマー。
  13. 前記細胞膜透過性ペプチドが、アルギニンリッチペプチドである、請求項７～１２のいずれか一項に記載のアンチセンスオリゴマー。
  14. 前記アルギニンリッチペプチドが、－（ＲＸＲ）４－Ｒａ（配列番号：１５）、Ｒ－（ＦＦＲ）３－Ｒａ（配列番号：１６）、－Ｂ－Ｘ－（ＲＸＲ）４－Ｒａ（配列番号：１７）、－Ｂ－Ｘ－Ｒ－（ＦＦＲ）３－Ｒａ（配列番号：１８）、－ＧＬＹ－Ｒ－（ＦＦＲ）３－Ｒａ（配列番号：１９）、－ＧＬＹ－Ｒ５－Ｒａ（配列番号：２０）、－Ｒ５－Ｒａ（配列番号：２１）、－ＧＬＹ－Ｒ６－Ｒａ（配列番号：１１）、および－Ｒ６－Ｒａ（配列番号：１０）からなる群から選択され、式中、Ｒａが、Ｈ、アシル、ベンゾイル、およびステアロイルから選択され、Ｒが、アルギニンであり、Ｘが、６－アミノヘキサン酸であり、Ｂが、β－アラニンであり、Ｆが、フェニルアラニンであり、ＧＬＹ（またはＧ）が、グリシンである、請求項１３に記載のアンチセンスオリゴマー。
  15. 前記アンチセンスオリゴマーが、遊離塩基形態である、請求項７～１４のいずれか一項に記載のアンチセンスオリゴマー。
  16. 前記アンチセンスオリゴマーが、その薬学的に許容される塩である、請求項７～１４のいずれか一項に記載のアンチセンスオリゴマー。
  17. 式（ＩＩＩ）に従うアンチセンスオリゴマー、
    Figure 2022511055000189
     またはその薬学的に許容される塩であって、式中、１～ｎ個の各Ｎｕが、５’から３’に、以下のうちの１つにおける核酸塩基に対応し、
    Figure 2022511055000190
     式中、Ａが、
    Figure 2022511055000191
     であり、Ｃが、
    Figure 2022511055000192
     であり、Ｇが、
    Figure 2022511055000193
     であり、Ｔが、
    Figure 2022511055000194
     であり、式（ＩＩＩ）の遠位－ＯＨが、任意に細胞膜透過性ペプチドに連結される、アンチセンスオリゴマー、またはその薬学的に許容される塩。
  18. 式（ＩＩＩ）の１～ｎ個の各Ｎｕが、５’から３’に、配列番号：３に対応する、請求項１７に記載のアンチセンスオリゴマー。
  19. 前記アンチセンスオリゴマーが、遊離塩基形態である、請求項１７～１８のいずれか一項に記載のアンチセンスオリゴマー。
  20. 前記アンチセンスオリゴマーが、その薬学的に許容される塩である、請求項１７～１８のいずれか一項に記載のアンチセンスオリゴマー。
  21. １～ｎ個の各Ｎｕが、５’から３’に、配列番号：３に対応する、請求項２０に記載のアンチセンスオリゴマー。
  22. 式（ＩＶ）に従うアンチセンスオリゴマーであって、
    Figure 2022511055000195
     式中、１～ｎ個の各Ｎｕが、５’から３’に、以下のうちの１つにおける核酸塩基に対応し、
    Figure 2022511055000196
     式中、Ａが、
    Figure 2022511055000197
     であり、Ｃが、
    Figure 2022511055000198
     であり、Ｇが、
    Figure 2022511055000199
     であり、Ｔが、
    Figure 2022511055000200
     であり、式（ＩＶ）の遠位－ＯＨが、任意に細胞膜透過性ペプチドに連結される、アンチセンスオリゴマー。
  23. 式（ＩＶ）の１～ｎ個の各Ｎｕが、５’から３’に、配列番号：３に対応する、請求項２２に記載のアンチセンスオリゴマー。
  24. 前記アンチセンスオリゴマーが、式（ＩＶａ）の構造に従う、請求項２２に記載のアンチセンスオリゴマー。
    Figure 2022511055000201
  25. 請求項１～２４のいずれか一項に記載のアンチセンスオリゴマーまたはその薬学的に許容される塩、および薬学的に許容される担体を含む、医薬組成物。
  26. デュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）の治療を必要とする対象においてそれを行うための方法であって、前記方法が、治療有効量の請求項１～２４のいずれか一項に記載のアンチセンスオリゴマーまたは請求項２５に記載の医薬組成物を前記対象に投与することを含む、方法。
  27. 前記対象が、エクソン５０スキッピングに適している前記ジストロフィン遺伝子の変異を有する、請求項２６に記載の方法。
  28. 対象においてジストロフィン産生を誘導するためにｍＲＮＡリーディングフレームを修復する方法であって、前記方法が、治療有効量の請求項１～２４のいずれか一項に記載のアンチセンスオリゴマーまたは請求項２５に記載の医薬組成物を前記対象に投与することを含む、方法。
  29. 前記対象が、エクソン５０スキッピングに適している前記ジストロフィン遺伝子の変異を有する、請求項２８に記載の方法。
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