ES2693459T3

ES2693459T3 - Moléculas antisentido y métodos para el tratamiento de patologías

Info

Publication number: ES2693459T3
Application number: ES10829367.1T
Authority: ES
Inventors: Stephen Wilton; Sue Fletcher; Abbie Adams; Penny Meloni
Original assignee: University of Western Australia
Current assignee: University of Western Australia
Priority date: 2009-11-12
Filing date: 2010-11-12
Publication date: 2018-12-11
Anticipated expiration: 2030-11-12
Also published as: CN105838714A; KR102239374B1; US11447776B2; BR112012011195A2; US9758783B2; EP2499249A4; KR20130084595A; KR101958491B1; NZ626359A; IL297299A; KR102581868B1; CY1121198T1; HRP20181824T1; US10287586B2; EP2499249B1; IL219753A; AU2010317599B2; KR102366851B1; US20210040482A1; JP2018082714A

Abstract

Oligonucleótido antisentido que induce la omisión del exón 45 en un pre-ARNm de distrofina humana, en el que el oligonucleótido antisentido se selecciona del grupo que consiste en: i) un oligonucleótido antisentido de 22 bases que comprenden CAA UGC CAU CCU GGA GUU CCU G o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, ii) un oligonucleótido antisentido de 22 bases que comprende CAA UGC CAU CCU GGA GUU CCU G y que comprende una base pirimidina 5-sustituida o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, iii) un oligonucleótido antisentido de 25 bases que comprende GCC CAA UGC CAU CCU GGA GUU CCU G o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, iv) un oligonucleótido antisentido de bases que comprende GCC CAA UGC CAU CCU GGA GUU CCU G y que comprende una base pirimidina 5-sustituida o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, v) un oligonucleótido antisentido de 28 bases que comprende GCU GCC CAA UGC CAU CCU GGA GUU CCU G o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, vi) un oligonucleótido antisentido de 28 bases que comprende GCU GCC CAA UGC CAU CCU GGA GUU CCU G y que comprende una base pirimidina 5-sustituida o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, vii) un oligonucleótido antisentido de 31 bases que comprende GCC GCU GCC CAA UGC CAU CCU GGA GUU CCU G o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, y viii) un oligonucleótido antisentido de 31 bases que comprende GCC GCU GCC CAA UGC CAU CCU GGA GUU CCU G y que comprende una base pirimidina 5-sustituida o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.

Description

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

DESCRIPCION

Moleculas antisentido y metodos para el tratamiento de patolog^as Campo de la invencion

La presente invencion se refiere a nuevos compuestos y composiciones antisentido adecuados para facilitar la omision exonica. Proporciona ademas composiciones terapeuticas adaptadas a la utilizacion en los metodos de la invencion

Antecedentes de la tecnica

El analisis a continuacion de los antecedentes de la tecnica pretende facilitar exclusivamente la comprension de la presente invencion. El analisis no es un reconocimiento o admision de que alguna parte del material al que se hace referencia es o ha sido parte del conocimiento general comun en la fecha de prioridad de la solicitud. Actualmente se esta realizando un esfuerzo significativo en la investigacion de metodos para suprimir o compensar mutaciones en genes causantes de enfermedades. Se estan desarrollando tecnologfas antisentido usando una serie de procesos qmmicos para afectar a la expresion genica en una variedad de niveles diferentes (transcripcion, corte y empalme, estabilidad, traduccion). Gran parte de esa investigacion se ha centrado en el uso de compuestos antisentido para corregir o compensar genes anomalos o asociados con la enfermedad en infinidad de afecciones diferentes.

Las moleculas antisentido son capaces de inhibir la expresion genica con una especificidad exquisita y, por esta causa, numerosos esfuerzos concentrados en los oligonucleotidos como moduladores de la expresion genica se han centrado en inhibir la expresion de genes diana tales como oncogenes o genes vmcos. Los oligonucleotidos antisentido se dirigen, bien contra ARN (cadena de sentido) o bien contra ADN, en el que forman estructuras triplex que inhiben la transcripcion por la ARN polimerasa II.

Para lograr un efecto deseado en la regulacion genica negativa espedfica, los oligonucleotidos tienen, bien que estimular la degradacion del ARNm diana, o bien bloquear la traduccion de ese ARNm, evitando de esta manera de forma eficaz la smtesis de novo de la protema diana no deseable.

Dichas tecnicas no resultan utiles en los casos en que el objetivo es regular positivamente la produccion de la protema nativa o compensar mutaciones que inducen la terminacion prematura de la traduccion, tales como mutaciones sin sentido o de desplazamiento del marco de lectura.

Ademas, en los casos en que una protema normalmente funcional se termina prematuramente por mutaciones en la misma, se ha demostrado que es posible un medio para la restauracion de cierta produccion de protema funcional mediante tecnologfa antisentido, a traves de la intervencion durante los procesos de corte y empalme (Sierakowska H, et al., (1996) Proc Natl Acad Sci USA 93,12840, 12840-12844; Wilton SD, et al., (1999) Neuromusc Disorders 9.330, 330-338; van Deutekom JC et al., (2001) Human Mol Genet 10, 1547-1554). En estos casos, el transcrito defectuoso del gen no deberia someterse a degradacion dirigida para que el proceso qmmico del oligonucleotido antisentido no estimule la degradacion del ARNm diana.

En una variedad de enfermedades geneticas, los efectos de las mutaciones sobre la expresion final de un gen pueden modularse a traves de un procedimiento dirigido de omision exonica durante el proceso de corte y empalme. El proceso de corte y empalme esta dirigido por una compleja maquinaria multipartmula que reune en estrecha proximidad las uniones exon-intron contiguas en el pre-ARNm y realiza el corte de los enlaces fosfodiester en los extremos de los intrones con su posterior reforma entre los exones que van a cortarse y empalmarse entre sf. Este proceso complejo y de elevada precision esta mediado por motivos de secuencia en el pre-ARNm que son segmentos de ARN relativamente cortos y semiconservados a los que se unen los diversos factores nucleares de corte y empalme que participan despues en las reacciones de corte y empalme. Mediante la modificacion de la forma en que la maquinaria de corte y empalme lee o reconoce los motivos que participan en el procesamiento del pre-ARNm, resulta posible crear moleculas de ARNm cortadas y empalmadas de forma diferencial. Actualmente se ha reconocido que la mayoria de los genes humanos se cortan y empalman de forma alternativa durante la expresion genica normal, aunque los mecanismos invocados no se han identificado. Mediante el uso de oligonucleotidos antisentido, se ha demostrado que los errores y las deficiencias en un ARNm codificado podrian evitarse o eliminarse de los transcritos genicos maduros.

Bajo condiciones naturales no se entiende bien cual es el grado de participacion de la delecion genetica u omision exonica en el proceso de corte y empalme, aunque se ha documentado que sucede en muchos casos, generalmente a niveles muy bajos (Sherrat T.G. et al., Am. J. Hum. Genet. 53:1007-1015, 1993). Sin embargo, se reconoce que si los exones asociados con mutaciones causantes de enfermedad pueden delecionarse de algunos genes de forma espedfica, puede producirse en ocasiones un producto protema acortado que tiene propiedades biologicas similares a las de la protema nativa o que tiene una actividad biologica suficiente para aliviar la enfermedad causada por las mutaciones asociadas al exon diana (Lu Q.L. et al., Nature Medicine 9:1009-1014, 2003; Aartsma-Rus A et al., Am. J. Hum. Genet. 74: 83-92, 2004).

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

Es probable que este proceso de omision exonica dirigida resulte particularmente util en genes largos en los que hay numerosos exones e intrones, en donde hay redundancia en la constitucion genetica de los exones o en los que una protema es capaz de funcionar sin uno o mas exones particulares (p. ej., con el gen de la distrofina, que consta de 79 exones, o posiblemente, algunos genes de colageno que codifican bloques de secuencia repetidos o los enormes genes de nebulina o titina, que estan constituidos de ~80 y mas de 370 exones, respectivamente).

Los esfuerzos por redirigir el procesamiento genico al tratamiento de enfermedades geneticas asociadas a truncados causados por mutaciones en diversos genes se han centrado en la utilizacion de oligonucleotidos antisentido que: (1) se solapan total o parcialmente con los elementos que participan en el proceso de corte y empalme, o (2) se unen al pre-ARNm en una posicion suficientemente proxima al elemento para interferir en la union y funcion de los factores de corte y empalme que normalmente medianan en una reaccion particular de corte y empalme que se produce en ese elemento (p.ej., se une al pre-ARNm en una posicion a 3, 6 o 9 nucleotidos del elemento que debe bloquearse).

Por ejemplo, la modulacion del corte y empalme del pre-ARNm de la distrofina mutante con oligorribonucleotidos antisentido se ha informado tanto in vitro como in vivo. En un tipo de mutacion de distrofina publicado en Japon, una mutacion por delecion de 52 pares de bases provoca que durante el proceso de corte y empalme se elimine el exon 19 con los intrones flanqueantes (Matsuo et al., (1991) J Clin Invest. 87:2127-2131). Se ha usado un sistema in vitro de corte y empalme minigenico para demostrar que un 31-mero 2'-O-metil oligorribonucleotido complementario a la mitad 5' de la secuencia delecionada del exon 19 de distrofina de Kobe inhida el corte y empalme del pre-ARNm de tipo salvaje (Takeshima et al., J. Clin. Invest. 95:515-520, 1995). El mismo oligonucleotido se uso para inducir la omision exonica a partir del transcrito nativo del gen de distrofina en celulas linfoblastoides humanas en cultivo.

Dunckley et al., Nucleosides & Nucleotides, 16:1665-1668, 1997, han descrito constructos in vitro para el analisis de corte y empalme alrededor del exon 23 de distrofina mutada en el raton mutante mdx, un modelo de distrofia muscular. Se proporciona un comentario de los planes para analizar estos constructos in vitro usando oligonucleotidos modificados en 2' dirigidos a los sitios de corte y empalme dentro y contiguos al exon 23 de distrofina de raton, aunque no se proporciona ningun sitio ni secuencia diana.

Posteriormente, se informo de 2'-O-metil oligorribonucleotidos que corregfan la deficiencia de distrofina en mioblastos del raton mdx de este grupo. Se ha informado de que un oligonucleotido antisentido dirigido al sitio de corte y empalme 3' del intron 22 de la distrofina murina causa la omision del exon mutante asf como de varios exones flanqueantes y crea un nuevo transcrito de distrofina dentro del marco de lectura con una nueva delecion interna. Esta distrofina mutada se expreso en 1-2 % de los miotubos de mdx tratados con moleculas antisentido. Se describe el uso de otras modificaciones de oligonucleotidos tales como 2'-O-metoxietil-fosfodiesteres (Dunckley et al. (1998) Human Mol. Genetics, 5, 1083-90).

De esta manera, las moleculas antisentido pueden proporcionar una herramienta para el tratamiento de trastornos geneticos tales como la distrofia muscular de Duchenne (DMD). Sin embargo, los intentos para inducir omision exonica usando moleculas antisentido han tenido un exito desigual.

Los estudios sobre el exon 19 de la distrofina han sido la omision con exito de este exon del pre-ARNm de la distrofina utilizando una diversidad de moleculas antisentido dirigidas a los sitios o motivos de corte y empalme flanqueantes dentro del exon que participan en la definicion de exon tal como indican Errington et al., J. Gen. Med. 5: 518-527, 2003).

En contraposicion con la aparente facilidad de omision del exon 19, actualmente se considera que la primera publicacion de la omision del exon 23 en el raton mdx, por Dunckley et al., (1998) informa unicamente de un transcrito revertiente que aparece de forma natural, o de un artefacto mas que de cualquier actividad antisentido verdadera. Ademas de no generar de forma sistematica transcritos sin el exon 23, Durickley et al., (1998) no demostraron en ningun momento ningun curso temporal de omision exonica inducida o incluso de titulacion de oligonucleotidos antisentido, para demostrar efectos dependientes de dosis en los que los niveles de omision exonica se correspondieran con cantidades crecientes o decrecientes de oligonucleotido antisentido. Ademas, este trabajo no pudo ser reproducido por otros investigadores.

El primer ejemplo de omision exonica espedfica y reproducible en el modelo de raton mdx fue publicado por Witton et al. (1999) Neuromuscular Disorders 9.330, 338-338. Dirigiendo una molecula antisentido al sitio de corte y empalme donante, se indujo una omision eficaz y sistematica del exon 23 en el ARNm de la distrofina a las 6 horas de tratamiento de las celulas cultivadas. Wilton et al., (1999), tambien describen el reconocimiento de la region aceptora del pre- ARNm de la distrofina de raton por oligonucleotidos antisentido mas largos y su incapacidad de repetir los resultados publicados por Duncley et al. (1998). No pudo detectarse de manera reproducible ninguna omision exonica, ni del 23 solo, ni de la delecion multiple de varios exones flanqueantes utilizando una seleccion de oligonucleotidos antisentido dirigidos hacia el sitio de corte y empalme aceptor del intron 22.

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

Aunque el primer oligonucleotido antisentido dirigido al sitio de corte y empalme donante del intron 23 induda la omision sistematica de exones en mioblastos en cultivo primario, se encontro que este compuesto era mucho menos eficiente en cultivos de celulas inmortalizadas que expresaban niveles mas elevados de distrofina. Sin embargo, con un reconocimiento mas afinado y el diseno de oligonucleotidos antisentido, la eficiencia de la delecion de exones espedficos se incremento practicamente en un orden de magnitud (vease Mann C.J. et al., J. Gen. Med. 4:644-654, 2002).

El documento n° WO2010/048583 proporciona moleculas antisentido capaces de unirse a un sitio diana seleccionado en un gen de distrofina humana para inhibir la omision exonica.

Sigue existiendo una necesidad de proporcionar oligonucleotidos antisentido capaces de unirse y de modificar el corte y empalme de una secuencia diana de nucleotidos. La simple direccion de los oligonucleotidos antisentido a motivos que se supone que son cruciales para el corte y empalme no es una garantfa de la eficacia de dicho compuesto en un contexto terapeutico.

El analisis anterior de los antecedentes de la invencion pretende unicamente facilitar la compresion de la misma. Debena apreciarse que el analisis no es un reconocimiento o admision de que cualquier parte del material al que se hace referencia es o ha sido parte del conocimiento general comun en la fecha de prioridad de la solicitud.

Descripcion resumida de la invencion

La presente invencion proporciona compuestos y composiciones de molecula antisentido adecuados para unirse a motivos de ARN que participan en el corte y empalme del pre-ARNm que son capaces de inducir una omision exonica espedfica y eficiente y un metodo para la utilizacion de los mismos.

La eleccion de la seleccion diana desempena un papel crucial en la eficacia de la omision exonica y, por lo tanto, en su posterior aplicacion en una terapia potencial. El simple diseno de moleculas antisentido con diana en regiones diana de pre-ARNm que se supone que participan en el corte y empalme no es una garantfa de induccion de omision exonica eficiente y espedfica. Las dianas mas obvias o mas facilmente definidas para la intervencion en el corte y empalme son los sitios donantes y aceptores de corte y empalme, aunque hay motivos menos definidos o conservados que incluyen intensificadores exonicos de corte y empalme, elementos silenciadores y puntos de ramificacion. Los sitios donantes y aceptores de corte y empalme tienen secuencias de consenso de aproximadamente 16 y 8 bases respectivamente (vease la figura 1 para la representacion esquematica de los motivos y dominios que participan en el reconocimiento exonico, la delecion de intrones y el proceso de corte y empalme).

Segun un primer aspecto, la invencion proporciona un oligonucleotido antisentido que induce la omision del exon 45 en un pre-ARNm de distrofina humana, en el que el oligonucleotido antisentido se selecciona del grupo que consiste en:

i) un oligonucleotido antisentido de 22 bases que comprenden CAA UGC CAU CCU GGA GUU CCU G o una sal farmaceuticamente aceptable del mismo,

ii) un oligonucleotido antisentido de 22 bases que comprende CAA UGC CAU CCU GGA GUU CCU G y que comprende una base pirimidina 5-sustituida o una sal farmaceuticamente aceptable del mismo,

iii) un oligonucleotido antisentido de 25 bases que comprende GCC CAA uGc CAU CCU GGA GUU CCU G o una sal farmaceuticamente aceptable del mismo,

iv) un oligonucleotido antisentido de 25 bases que comprende GCC CAA UGC CAU CCU GGA GUU CCU G y que comprende una base pirimidina 5-sustituida o una sal farmaceuticamente aceptable del mismo,

v) un oligonucleotido antisentido de 28 bases que comprende GCU GCC CAA uGc CAU CCU GGA GUU CCU G o una sal farmaceuticamente aceptable del mismo,

vi) un oligonucleotido antisentido de 28 bases que comprende GCU GCC CAA UGC CAU CCU GGA GUU CCU G y que comprende una base pirimidina 5-sustituida o una sal farmaceuticamente aceptable del mismo,

vii) un oligonucleotido antisentido de 31 bases que comprende GCC GCU GCC CAA UgC CAU CCU GGA GUU CCU G o una sal farmaceuticamente aceptable del mismo, y

viii) un oligonucleotido antisentido de 31 bases que comprende GCC GCU GCC CAA UGC CAU CCU GGA GUU CCU G y que comprende una base pirimidina 5-sustituida o una sal farmaceuticamente aceptable del mismo.

Para inducir la omision exonica en los exones 5, 12, 17, 21,22, 24, 43-47, 49, 50, 54-64, 66, 67, 70 y 72 en el transcrito del gen de distrofina, pueden seleccionarse moleculas antisentido del grupo indicado en la Tabla 1A.

Resulta posible combinar dos o mas oligonucleotidos antisentido para inducir una omision exonica mas eficiente en los exones 3, 4, 8, 10, 26, 36, 48, 60, 66 y 68. Se dirige una combinacion o "coctel" de oligonucleotidos antisentido a los exones para inducir una omision exonica eficiente.

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

Segun un segundo aspecto, la presente invencion proporciona una composicion, que comprende un oligonucleotido antisentido segun la presente invencion o una sal farmaceuticamente aceptable del mismo, y un portador farmaceuticamente aceptable.

Segun un tercer aspecto, la invencion proporciona un oligonucleotido antisentido o sal farmaceuticamente aceptable del mismo segun la presente invencion o composicion segun la presente invencion, para la utilizacion en un metodo de tratamiento de la distrofia muscular.

La invencion se refiere ademas a la utilizacion de un oligonucleotido antisentido o sal farmaceuticamente aceptable del mismo de la invencion, o una composicion de la presente invencion, para la preparacion de un medicamento destinado a la modulacion de la distrofia muscular.

La distrofia muscular puede ser la distrofia muscular de Duchenne.

La invencion proporciona ademas un metodo de tratamiento de una condicion caracterizada por distrofia muscular de Duchenne, donde el metodo comprende administrar en el paciente que necesita tratamiento una cantidad eficaz de un oligonucleotido antisentido de la invencion, relevante para la lesion genetica particular en dicho paciente. Ademas, la invencion proporciona un metodo para tratar de forma profilactica a un paciente para prevenir o, por lo menos, minimizar la distrofia muscular de Duchenne, que comprende la etapa de: administracion en el paciente de una cantidad eficaz de un oligonucleotido antisentido o de una composicion farmaceutica que comprende una o mas de estas moleculas biologicas.

Otros aspectos y ventajas de la invencion resultaran evidentes para el experto en la materia a partir de una revision de la descripcion, posteriormente, en la que se hace referencia a las figuras a continuacion.

Breve descripcion de los dibujos

Figura 1. Representacion esquematica de motivos y dominios que participan en el reconocimiento de exones, la delecion de intrones y el proceso de corte y empalme.

Figura 2. Representacion diagramatica del concepto de omision exonica inducida por oligonucleotido antisentido para evitar las mutaciones causantes de enfermedad (no representado a escala). La caja sombreada representa un exon portador de una mutacion que evita la traduccion a protema del resto del ARNm. La barra negra representa un oligonucleotido antisentido que evita la inclusion de ese exon en el ARNm maduro.

Figura 3. Electroforesis en gel que muestra un 'coctel' de moleculas antisentido dirigidas al exon 3, que inducen una omision exonica fuerte y consistente a una concentracion de transfeccion de 10 nanomolar en celulas musculares humanas normales en cultivo.

Figura 4. Electroforesis en gel que muestra un 'coctel' de moleculas antisentido dirigidas al exon 4, que inducen una omision exonica fuerte y consistente a una concentracion de transfeccion de 25 nanomolar en celulas musculares humanas normales en cultivo.

Figura 5. Electroforesis en gel que muestra una omision del exon 5 humano fuerte y eficiente utilizando moleculas antisentido [H5A(+35+65)] dirigidas a un dominio interno del exon 5, presumiblemente un intensificador del corte y empalme del exon. Este compuesto preferente induce una omision exonica consistente a una concentracion de transfeccion de 25 nanomolar en celulas musculares humanas en cultivo. Figura 6. Electroforesis en gel que muestra un 'coctel' de moleculas antisentido dirigidas al exon 8, que induce una omision exonica fuerte y consistente tanto del exon 8 como del exon 8/9 a una concentracion de transfeccion de 10 nanomolar en celulas musculares humanas normales en cultivo.

Figura 7. Electroforesis en gel que muestra diversos cocteles y moleculas antisentido individuales que inducen la omision del exon 10 y exones circundantes. Una combinacion de [H10A(-05+16)] y [H10A(+98+119)] o [H10A(-05+16)] y [H10A(+130+149)] induce la omision del exon y de los exones 9-12, mientras que [H10A(-05+16)] por sf solo induce la omision de los exones 9-14.

Figura 8. Electroforesis en gel que muestra la omision del exon 14 utilizando la molecula antisentido H14A(+31+61) dirigida al exon 14.

Figura 9. Electroforesis en gel que muestra la omision del exon 17 utilizando la molecula antisentido H17A(+10+35) dirigida al exon 17.

Figura 10. Electroforesis en gel que muestra dos cocteles de moleculas antisentido dirigidas al exon 26. El coctel doble de [H26A(-07+19)] y [H26A(+24+50)] induce una buena omision del exon 26 y la adicion de una molecula antisentido adicional al coctel no afecta a la eficiencia de la omision.

Figura 11. Electroforesis en gel que muestra un 'coctel' de moleculas antisentido dirigidas al exon 36, que inducen una omision exonica fuerte y consistente a una concentracion de transfeccion de 25 nanomolar en celulas musculares humanas normales en cultivo.

Figura 12. Electroforesis en gel que muestra una omision del exon 43 fuerte y consistente a 25 nanomolar en celulas musculares humanas normales en cultivo utilizando la molecula antisentido H43A(+92+117).

Figura 13. Electroforesis en gel que muestra la dependencia de la dosis de la omision del exon 55 utilizando la molecula antisentido H44A(+65+90).

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

Figura 14. Electroforesis en gel que muestra una omision del exon 45 fuerte y consistente utilizando la molecula antisentido H45A(-09+25).

Figura 15. Electroforesis en gel que muestra una omision del exon 46 fuerte y consistente utilizando la molecula antisentido H46A(+81 + l09).

Figura 16. Electroforesis en gel que muestra una omision del exon 47 fuerte y consistente utilizando la molecula antisentido H47A(+01+29).

Figura 17. Electroforesis en gel que muestra un 'coctel' de moleculas antisentido dirigidas al exon 47 que inducen una omision exonica fuerte y consistente.

Figura 18. Electroforesis en gel que muestra una omision del exon 49 fuerte y consistente utilizando la molecula antisentido H49A(+45+70).

Figura 19. Electroforesis en gel que muestra una omision del exon 50 fuerte y consistente utilizando la molecula antisentido H50A(+48+74).

Figura 20. Electroforesis en gel que muestra una omision del exon 51 fuerte y consistente utilizando la molecula antisentido H51A(+66+95).

Figura 21. Electroforesis en gel que muestra una omision del exon 54 fuerte y consistente utilizando la molecula antisentido H54A(+67+97).

Figura 22. Electroforesis en gel que muestra una molecula antisentido H55A(-10+20) indujo una omision del exon 55 dependiente de la dosis.

Figura 23. Electroforesis en gel que muestra una omision del exon 56 fuerte y consistente utilizando la molecula antisentido H56A(+92+121).

Figura 24. Electroforesis en gel que muestra una molecula antisentido H57A(-10+20) indujo una omision del exon 57 dependiente de la dosis.

Figura 25. Electroforesis en gel que muestra la omision del exon 59 y del exon 58/59 utilizando la molecula antisentido H59A(+96+120) dirigida al exon 59.

Figura 26. Electroforesis en gel que muestra dos cocteles diferentes que inducen la omision exonica del exon 60.

Figura 27. Electroforesis en gel que muestra la omision del exon 63 utilizando la molecula antisentido H63A(+20+49).

Figura 28. Electroforesis en gel que muestra la omision del exon 64 utilizando la molecula antisentido H64A(+34+62).

Figura 29. Electroforesis en gel que muestra un 'coctel' de moleculas antisentido dirigidas al exon 66 que inducen una omision exonica dependiente de la dosis.

Figura 30. Electroforesis en gel que muestra la omision del exon 67 utilizando la molecula antisentido H67A(+17+47).

Figura 31. Electroforesis en gel que muestra un 'coctel' de moleculas antisentido dirigidas al exon 68 que inducen una omision exonica dependiente de la dosis.

Figura 32. Electroforesis en gel que muestra un 'coctel' de moleculas antisentido que inducen una omision exonica fuerte y consistente de los exones 69/70 a una concentracion de transfeccion de 25 nanomolar. Figura 33. Electroforesis en gel que muestra diversos 'cocteles' de moleculas antisentido que inducen diversos niveles de omision en el exon 50.

Figura 34. Electroforesis en gel que muestra un coctel de tres moleculas antisentido que inducen una omision eficiente de los exones 50/51.

Figura 35. Grafico de los resultados de densitometna que muestran diversas eficiencias de omision exonica. Las moleculas antisentido sometidas a ensayo fueron: exon 3 [H3A(+30+60) y H3A(+61+85)], exon 4 [H4D(+14-11) y H4A(+11+40)], exon 14 [H14A(+32+61)], exon 17 [H17A(+10+35)], exon 26 [H26A(-07+19), H26A(+24+50) y H26A(+68+92)] y, exon 36 [H36A(-16+09) y H36A(+22+51)].

Figura 36. Grafico de los resultados de densitometna que muestran diversas eficiencias de omision exonica. Las moleculas antisentido sometidas a ensayo eran exon 46 [H46A(+81 + 109)], exon 47 [H47A(+01+29)], exon 48 [H48A(+01+28) y H48A(+40+67)], exon 49 [H49A(+45+70)].

Figura 37. Electroforesis en gel que muestra la omision del exon 11 utilizando la molecula antisentido H11A(+50+79).

Figura 38. Electroforesis en gel que muestra la omision del exon 12 utilizando la molecula antisentido H12A(+30+57).

Figura 39. Electroforesis en gel que muestra la omision del exon 44 utilizando la molecula antisentido H44A(+59+85).

Figura 40. Electroforesis en gel que muestra la omision del exon 45 utilizando la molecula antisentido H45A(- 03+25).

Figura 41. Electroforesis en gel que muestra la omision del exon 51 utilizando la molecula antisentido H51A(+71 + 100).

Figura 42. Electroforesis en gel que muestra la omision del exon 52 utilizando la molecula antisentido H52A(+09+38).

Figura 43. Electroforesis en gel que muestra la omision del exon 53 utilizando la molecula antisentido H53A(+33+65).

Figura 44. Electroforesis en gel que muestra la omision del exon 46 utilizando la molecula antisentido H46A(+93+122).

Figura 45. Electroforesis en gel que muestra la omision del exon 73 utilizando la molecula antisentido H73A(+02+26).

Figura 46. Secuencias de las moleculas antisentido.

5 Descripcion detallada

Breve descripcion de los listados de secuencias

Table 1A: moleculas antisentido individuales

SEC ID: Exon Secuencia

: Exon 5

1: H5A(+35+65) AAA CCA AGA GUC AGU UUA UGA UUU CCA UCU A

: Exon 11

52: H11A(+50+79) CUG UUC CAA UCA GCU UAC UUC CCA AUU GUA

: Exon 12

2: H12A(+52+75) UCU UCU GUU UUU GUU AGC CAG UCA

53: H12A(+30+57) CAG UCA UUC AAC UCU UUC AGU UUC UGA U

: Exon 17

3: H17A(-07+23) GUG GUG GUG ACA GCC UGU GAA AUC UGU GAG

4: H17A(+61+86) UGU UCC CUU GUG GUC ACC GUA GUU AC

: Exon 21

5: H21A(+86+114) CAC AAA GUC AUC CAG GAA CAU GGG UC

6: H21A(+90+119) AAG GCC AAG UCU GCA UCC AGG AAC AUG

: Exon 22

7: H22A(+125+146) CUG CAA UUC CCC GAG UCU CUG C

: Exon 24

8: H24A(+51+73) CAA GGG CAG GCC AUU CCU CCU UC

: Exon 43

9: H43A(+92+117) GAG AGC UUC CUG UAG CUU CAC CCU UC

: Exon 44

10: H44A(+65+90) UGU UCA GCU UCU GUU AGC CAC UGA

54: H44A(+59+85) CUG UUC AGC UUC UGU UAG CCA CUG AUU

: Exon 45

11: H45A(+09+25) GCU GCC CAA UGC CAU CCU GGA GUU CCU GUA AGA U

55: H45A(+03+25) GCU GCC CAA UGC CAU CCU GGA GUU CCU G

61: H45A(+06+25) GCU GCC CAA UGC CAU CCU GGA GUU CCU GUA A

62: H45A(+12+25) CAA UGC CAU CCU GGA GUU CCU GUA AGA UAC C

: Exon 46

12: H46A(+81+109) UCC AGG UUC AAG UGG GAU ACU AGC AAU GU

56: H46A(+93+122) GUU GCU GCU CUU UUC CAG GUU CAA GUG GGA

: Exon 47

13: H47A(+01+29) UGG CGC AGG GGC AAC UCU UCC ACC AGU AA

: Exon 49

14: H49A(+45+70) ACA AAU GCU GCC CUU UAG ACA AAA UC

: Exon 50

15: H50A(+48+74) GGC UGC UUU GCC CUC AGC UCU UGA AGU

: Exon 51

57: H51A(+71+100) AGC AGG UAC CUC CAA CAU CAA GGA AGA UG

: Exon 52

58: H52A(+09+38) UCC AAC UGG GGA CGC CUC UGU UCC AAA UCC UGC

: Exon 53

59: H53A(+33+65) UUC AAC UGU UGC CUC CGG UUC UGA AGG UGU UCU

: Exon 54

16: H54A(+67+97) UGG UCU CAU CUG CAG AAU AAU CCC GGA GAA G

: Exon 55

17: H55A(-10 +20) CAG CCU CUC GCU CAC UCA CCC UGC AAA GGA

: Exon 56

18: H56A(+92+121) CCA AAC GUC UUU GUA ACA GGA CUG CAU

19: H56A(+112+141) CCA CUU GAA GUU CAU GUU AUC CAA ACG UCU

: Exon 57

20: H57A(-10+20) AAC UGG CUU CCA AAU GGG ACC UGA AAA AGA

: Exon 58

21: H58A(+34+64) UUC GUA CAG UCU CAA GAG UAC UCA UGA UUA C

22: H58D(+17-07) CAA UUA CCU CUG GGC UCC UGG UAG

: Exon 59

23: H59A(+96 +120) CUA UUU UUC UCU GCC AGU CAG CGG A

: Exon 60

24: H60A(+33+62) CGA GCA AGG UCA UUG ACG UGG CUC ACG UUC

: Exon 61

25: H61A(+10+40) GGG CUU CAU GCA GCU GCC UGA CUC GGU CCU C

: Exon 62

26: H62A(23+52) UAG GGC ACU UUG UUU GGC GAG AUG GCU CUC

: Exon 63

27: H63A(+20+49) GAG CUC UGU CAU UUU GGG AUG GUC CCA GCA

: Exon 64

28: H64A(+34+62) CUG CAG UCU UCG GAG UUU CAU GGC AGU CC

: Exon 66

29: H66A(-8+19) GAU CCU CCC UGU UCG UCC CCU AUU AUG

: Exon 67

30: H67A(+17+47) GCG CUG GUC ACA AAA UCC UGU UGA ACU UGC

: Exon 73

60: H73A(+02+26) CAU UGC UGU UUU CCA UUU CUG GUA G

Tabla 1B: cocteles de moleculas antisentido

SEC ID: Exon Secuencia

: Cocteles de exon 3

31: H3A(+30+60) UAG GAG GCG CCU CCC AUC CUG UAG GUC ACU G

32: H3A(+61+85) G CCC UGU CAG GCC UUC GAG GAG GUC

: Cocteles de exon 4

33: H4A(+11+40) UGU UCA GGG CAU GAA CUC UUG UGG AUC CUU

34: H4D(+14-11) GUA CUA CUU ACA UUA UUG UUC UGC A

: Cocteles de exon 8

35: H8A(-06+24) UAU CUG GAU AGG UGG UAU CAA CAU CUG UAA

36: H8A(+134+158) AUG UAA CUG AAA AUG UUC UUC UUU A

: Cocteles de exon 10

37: H10A(-05+16) CAG GAG CUU CCA AAU GCU GCA

38: H10A(+98+119) UCC UCA GCA GAA AGA AGC CAC G

: Cocteles de exon 26

39: H26A(-07+19) CCU CCU UUC UGG CAU AGA CCU UCC AC

40: H26A(+24+50) CUU ACA GUU UUC UCC AAA CCU CCC UUC

41: H26A(+68+92) UGU GUC AUC CAU UCG UGC AUC UCU G

: Cocteles de exon 36

42: H36A(-16+09) CUG GUA UUC CUU AAU UGU ACA GAG A

43: H36A(+22+51) UGU GAU GUG GUC CAC AUU CUG GUC AAA AGU

: Cocteles de exon 48

44: H48A(+01+28) CUU GUU UCU CAG GUA AAG CUC UGG AAA C

45: H48A(+40+67) CAA GCU GCC CAA GGU CUU UUA UUUU GAG C

: Cocteles de exon 60

46: H60A(+87+116) UCC AGA GUG CUG AGG UUA UAC GGU GAG AGC

47: H60A(+37+66) CUG GCG AGC AAG GUC CUU GAC GUG GCU CAC

: Cocteles de exon 66

48: H66A(-02+28) CAG GAC ACG GAU CCU CCC UGU UCG UCC CCU

49: H66D(+13-17) UAA UAU ACA CGA CUU ACA UCU GUA CUU GUC

: Cocteles de exon 68

50: H68A(+48+72) CAC CAU GGA CUG GGG UUC CAG UCU C

51: H68D(+23-03) UAC CUG AAU CCA AUG AUU GGA CAC UC

Parte general

15 Los numeros de identificacion de secuencias (SEC ID n°) que contienen informacion de la secuencia de nucleotidos y aminoacidos incluidos en la presente memoria se recopilan al final de la descripcion y se han preparado usando el programa PatentIn, version 3.0. Cada secuencia de nucleotidos o aminoacidos esta identificada en el listado de

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

secuencias mediante el indicador numerico <210> seguido de un identificador de secuencia (p. ej. <210>1, <210>2, etc.). La longitud, el tipo de secuencia y el organismo de origen para cada secuencia de nucleotidos o aminoacidos se indican mediante la informacion proporcionada en los campos de indicador numerico <211>, <212> y <213>, respectivamente. Las secuencias de nucleotidos o aminoacidos a las que se hace referencia en la especificacion se definen mediante la informacion proporcionada en el campo de indicador numerico <400> seguido del identificador de secuencia (p. ej. <400>1, <400>2, etc.).

Se ha propuesto y publicado un sistema de nomenclatura de moleculas antisentido para distinguir entre las diferentes moleculas antisentido (vease Mann et al., (2002) J Gen Med 4, 644-654). Esta nomenclatura se hizo especialmente importante al someter a ensayo varias moleculas antisentido ligeramente diferentes, con diana todas en la misma region diana, como se muestra a continuacion:

imagen1

La primera letra designa la especie (p.ej., H: humana, M: murina, C: canina) "n°" designa el numero de exon de distrofina diana.

"A/D" indica el sitio de corte y empalme donante o aceptor al principio y al final del exon, respectivamente.

(X y) representa las coordinadas de apareamiento, en las que "-" o "+" indican secuencias intronicas o exonicas, respectivamente. Como ejemplo, A(-6+18) indicana las ultimas 6 bases del intron que precede al exon diana y las primeras 18 bases del exon diana. El sitio de corte y empalme mas cercano sena el aceptor, de modo que estas coordenadas inan precedidas por una "A". La descripcion de coordenadas de apareamiento en el sitio de corte y empalme donante podna ser D(+2-18) en el que las ultimas 2 bases exonicas y las primeras 18 bases intronicas corresponden al sitio de apareamiento de la molecula antisentido. Las coordenadas de apareamiento totalmente exonico podnan representarse mediante A(+65+85), que es el sitio entre el 65° y el 85° nucleotido a partir del comienzo de ese exon.

Tal como se utiliza en la presente memoria, el termino "derivado" y "derivado de" se considerara que indican que puede obtenerse un entero espedfico a partir de una fuente concreta, aunque no resulta necesario que ello sea directamente a partir de esa fuente.

A lo largo de esta especificacion, a menos que el contexto requiera otra cosa, la palabra "comprender", o variaciones tales como "comprende" o "que comprende", se entendera que implican la inclusion de un entero o grupo de enteros establecidos poro no la exclusion de cualquier otro entero o grupo de enteros.

Otras definiciones para los terminos seleccionados usados en el presente documento pueden encontrarse dentro de la descripcion detallada de la invencion y aplicarse a lo largo de ella. A menos que se defina otra cosa, todos los demas terminos cientfficos y tecnicos usados en el presente documento tienen el mismo significado que el que entiende comunmente un experto habitual en la tecnica a la que pertenece la invencion.

Descripcion de la realizacion preferente

En el caso de que una o mas moleculas antisentido sean dirigidas a secuencias de nucleotidos que participan en el corte y empalme en exones dentro de las secuencias de pre-ARNm, el corte y empalme normal del exon puede inhibirse y causar que la maquinaria de corte y empalme evite los exones mutados enteros del ARNm maduro. El concepto de omision exonica inducida por oligonucleotido antisentido se muestra en la figura 2.

En muchos genes, la delecion de un exon entero conducina a la produccion de una protema no funcional por la perdida de dominios funcionales importantes o la disrupcion del marco de lectura. Sin embargo, en algunas protemas, resulta posible acortar la protema mediante delecion de uno o mas exones del interior de la protema sin interferir con el marco de lectura y sin alterar gravemente la actividad biologica de la protema. Tfpicamente, dichas protemas tienen un papel estructural o poseen dominios funcionales en sus extremos. La presente invencion describe moleculas antisentido capaces de unirse a dianas espedficas de pre-ARNm de distrofina y redirigir el procesamiento de ese gen.

Un objetivo preferente de una terapia basada en moleculas antisentido es conseguir la maxima omision exonica proporcionando la concentracion mas baja posible de la molecula antisentido. En general, una molecula antisentido puede provocar una omision exonica robusta fuerte, una omision exonica esporadica o ninguna omision exonica en absoluto. Resulta preferible desarrollar moleculas antisentido (solas o en combinacion) que puedan proporcionar una omision exonica consistentemente robusta fuerte a una dosis terapeutica baja.

Moleculas antisentido

Segun un primer aspecto de la invencion, se proporciona un oligonucleotido antisentido que induce la omision del exon

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

45 en un pre-ARNm de distrofina humana, en el que el oligonucleotido antisentido se selecciona del grupo que consiste en:

Para inducir omision exonica en los exones del transcrito del gen de la distrofina, las moleculas antisentido pueden seleccionarse del grupo de compuestos que se muestra en la Tabla 1A.

Se proporciona ademas una combinacion o "coctel" de dos o mas oligonucleotidos antisentido capaces de unirse a una diana seleccionada para inducir omision exonica. Para inducir omision exonica en los exones del transcrito del gen de la distrofina, las moleculas antisentido en un "coctel" se seleccionan preferentemente del grupo de compuestos que se muestra en la Tabla 1B.

El diseno de moleculas antisentido para enmascarar completamente los sitios de corte y empalme de consenso puede no generar necesariamente alguna omision del exon diana. Ademas, los inventores han descubierto que el tamano o la longitud del propio oligonucleotido antisentido no siempre es un factor importante durante el diseno de las moleculas antisentido. Con algunas dianas, tales como el exon 19, oligonucleotidos antisentido de tan solo 12 bases fueron capaces de inducir omision exonica, aunque no de forma tan eficaz como oligonucleotidos mas largos (de 20-31 bases). En algunas otras dianas, tales como el exon 23 de distrofina murina, oligonucleotidos antisentido de solo 17 restos de longitud fueron capaces de inducir una omision mas eficaz que otro compuesto solapante de 25 nucleotidos. Sin embargo, en la presente invencion se ha encontrado generalmente que las moleculas antisentido mas largas con frecuencia resultan mas eficaces en la induccion de la omision exonica que moleculas mas cortas. De esta manera, preferentemente, las moleculas antisentido de la presente invencion presentan una longitud de 24 a 30 acidos nucleicos, preferentemente de aproximadamente 28 nucleotidos. Por ejemplo, se ha encontrado anteriormente que un oligonucleotido antisentido de 20 bases (H16A(-07+13)) resultaba ineficaz en la induccion de omision del exon 16 pero que un oligonucleotido de 31 bases (H16A(-06+25)), que comprendfa por completo el oligonucleotido mas corto, resultaba eficaz en la induccion de omision (Harding et al., Mol. Ther. 15:157-166, 2007).

Los inventores tambien han encontrado que aparentemente no existe ningun motivo estandar que pueda bloquearse o enmascararse mediante moleculas antisentido para redirigir el corte y empalme. En algunos exones, tales como el exon 23 de la distrofina de raton, el sitio de corte y empalmen donante era el mas facilmente utilizable como diana para redirigir la omision de ese exon. Hay que destacar que el diseno y el ensayo de una serie de moleculas antisentido espedficas del exon 23 para aparearse con regiones solapantes del sitio de corte y empalme donante mostro una variacion considerable en cuanto a la eficacia de la omision exonica inducida. Como informan Mann et al., (2002) existe una variacion significativa en la eficacia de la evitacion de la mutacion sin sentido dependiente del apareamiento de oligonucleotidos antisentido ("Improved antisense oligonucleotide induced exon skipping in the mdx mouse model of muscular dystrophy", J. Gen. Med. 4:644-654). No se encontro que la direccion hacia el sitio aceptor del exon 23 o a ciertos dominios internos indujera una omision sistematica del exon 23.

En otros exones definidos como diana para la eliminacion, el enmascaramiento del sitio de corte y empalme donante no indujo ninguna omision exonica. Sin embargo, dirigiendo moleculas antisentido al sitio de corte y empalme aceptor (exon 8 humano, tal como se comenta posteriormente), se indujo una omision exonica fuerte y mantenida. Hay que destacar que la delecion del exon 8 humano estuvo fuertemente asociada con la eliminacion conjunta del exon 9. No hay una fuerte homologfa de secuencia entre los oligonucleotidos antisentido del exon 8 y las regiones correspondientes del exon 9, de modo que no parece que sea una cuestion de reaccion cruzada. Mas bien, el corte y empalme de estos dos exones generalmente esta relacionado. Este no es un caso aislado, ya que se observa el mismo efecto en celulas caninas en las que la definicion como diana del exon 8 para su eliminacion tambien dio como resultado la omision del exon 9. La definicion como diana del exon 23 para su eliminacion en el pre-ARNm de la distrofina del raton tambien da como resultado, ademas, la eliminacion frecuente del exon 22. Este efecto se produce de una manera dependiente de la dosis y tambien indica un procesamiento estrechamente coordinado de dos exones contiguoss.

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

En otros exones diana, las moleculas antisentido dirigidas hacia los sitios de corte y empalme donantes o aceptores no indujeron o indujeron un nivel bajo de omision exonica, mientras que el apareamiento de moleculas antisentido con regiones intraexonicas (es decir, intensificadores del corte y empalme exonico dentro del exon 4 de la distrofina humana) fue mas eficaz en la induccion de omision exonica. Algunos exones, por ejemplo, el exon 19, tanto de raton como humano, son facilmente omitidos mediante la direccion de moleculas antisentido hacia una variedad de motivos. Esto es, la omision exonica dirigida se induce despues del uso de oligonucleotidos antisentido para enmascarar los sitios de corte y empalme donante y aceptor o intensificadores del corte y empalme exonico.

Tampoco resulta posible predecir que cocteles de moleculas antisentido induciran la omision exonica. Por ejemplo, la combinacion de dos moleculas antisentido que, por sf mismas, inducen muy bien la omision de un exon dado podna no causar omision de un exon al combinarlas en un coctel. Por ejemplo, cada una de H50A(+02+30) y H50A(+66+95) por sf misma indujo una buena omision de los exones 50 y 51. Sin embargo, en combinacion como coctel, solo indujeron un nivel bajo de omision de los dos exones. De manera similar, la combinacion de H50A(+02+30) y H51A(+66+90) o H50A (+02+30) y H51A(+61+90) no causo una omision eficiente de los exones 50 y 51, aunque las moleculas antisentido individuales eran eficaces. Sin embargo, la introduccion de una tercera molecula antisentido [H51D(+16-07)] que por sf misma no causaba omision), creo un coctel de tres elementos ([H50A(+02+30)], H51A(+66+90) y [H51D(+16-07)]) que fue capaz de causar la omision de los exones 50 y 51 a una concentracion de tan solo 1 nM.

Alternativamente, la combinacion de dos o tres moleculas antisentido que resultan ineficaces o solo moderadamente eficaces por sf mismas puede causar un excelente nivel de omision en combinacion. Por ejemplo, individualmente H26A(-07+19) [SEC ID n° 39], H26A(+24+50) [SEC ID n° 40] y H26A(+68+92) [SEC ID n° 41] causan una omision ineficiente del exon 26 y tambien inducen la omision exonica multiple (26-29 o 27-30). Sin embargo, al combinar los tres exones como coctel, se produce una omision altamente eficiente del exon 26.

A partir de los ejemplos y analisis anteriormente proporcionados, resulta evidente que no existe ningun modo de predecir con precision si una combinacion funcionara o no.

Las moleculas antisentido pueden provocar la omision de exones de una manera 'dependiente de dosis' o 'no dependiente de dosis'. La expresion 'dependiente de dosis' se refiere a que una cantidad mas grande de la molecula antisentido induce una mejor omision del exon, mientras que las moleculas antisentido no dependientes de dosis son capaces de inducir omision incluso a dosis muy bajas. Por ejemplo, a partir de la figura 15 puede observarse que H46A(+81 + 109) [SEC ID n° 12] proporciona una omision igualmente buena del exon 46 con independencia de la cantidad de molecula antisentido presente (de 600 nM a 25 nM). En contraste, H57A(-10+20) [SEC ID n° 20] (figura 24) induce una fuerte omision del exon 57 a 100 nM, pero una omision reducida a 50 nM y una reduccion incluso mayor de la omision a 25 nM.

Resulta preferible seleccionar moleculas antisentido que induzcan omision de una manera dependiente de dosis, ya que estas moleculas pueden administrarse a concentraciones muy bajas y todavfa presentar un efecto terapeutico. Sin embargo, tambien resulta aceptable seleccionar como moleculas preferentes aquellas moleculas antisentido que induzcan omision de una manera dependiente de dosis, particularmente si esas moleculas inducen omision buena o excelente a concentraciones bajas. Preferentemente, las moleculas antisentido de la presente invencion son capaces de inducir una omision exonica buena o excelente a concentraciones inferiores a 500 nM, preferentemente inferiores a 200 nM y mas preferentemente de tan solo 100 nM, 50 nM o incluso de 25 nM. Lo mas preferentemente, las moleculas de oligonucleotido de la presente invencion son capaces de inducir omision a niveles superiores a 30% a una concentracion de 100 nM.

Para identificar y seleccionar oligonucleotidos antisentido adecuados para su uso en la modulacion de la omision de exones, hay que identificar primero una secuencia de acido nucleico cuya funcion sea ser modulada. Esta puede ser, por ejemplo, un gen (o ARNm transcrito a partir del gen) cuya expresion este asociada con un trastorno o estado patologico concreto, o una molecula de acido nucleico de un agente infeccioso. Dentro del contexto de la presente invencion, el sitio o sitios diana preferentes son aquellos que participan en el corte y empalme del ARNm (es decir, sitios de corte y empalme donantes, sitios de corte y empalme aceptores, o elementos intensificadores del corte y empalme exonico). Los puntos de ramificacion de corte y empalme y las secuencias de reconocimiento o los intensificadores del corte y empalme exonicos tambien son potenciales sitios diana para la modulacion del corte y empalme del ARNm.

Preferentemente, la presente invencion presenta como objetivo proporcionar moleculas antisentido capaces de unirse a una diana seleccionada en el pre-ARNm de la distrofina para inducir una omision exonica eficaz y consistente. La distrofia muscular de Duchenne aparece a partir de mutaciones que imposibilitan la smtesis de un producto funcional del gen de la distrofina. Estos defectos geneticos de la distrofia muscular de Duchenne son tfpicamente mutaciones sin sentido o reordenamientos genomicos tales como eliminaciones, duplicaciones o microdeleciones o inserciones que alteran el marco de lectura. Como el gen de la distrofina humana es un gen largo y complejo (con 79 exones que se cortan y empalman a la vez para generar un ARNm maduro con un marco de lectura abierto de aproximadamente

11

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

11.000 bases), hay muchas posiciones en las que pueden producirse estas mutaciones. En consecuencia, una terapia integral basada en oligonucleotidos antisentido para abordar muchas de las diferentes mutaciones causantes de enfermedad en el gen de la distrofina requerira que puedan definirse como diana numerosos exones para su eliminacion durante el proceso de corte y empalme.

Dentro del contexto de la presente invencion, el sitio o sitios diana preferentes son aquellos que participan en el corte y empalme del ARNm (es decir, sitios de corte y empalme donantes, sitios de corte y empalme aceptores o elementos intensificadores del corte y empalme exonico). Los puntos de ramificacion de corte y empalme y las secuencias de reconocimiento o los intensificadores del corte y empalme exonicos tambien son potenciales sitios diana para la modulacion del corte y empalme del ARNm.

El oligonucleotido y el ADN o ARN son complementarios entre sf en el caso de que un numero suficiente de posiciones correspondientes en cada molecula se encuentra ocupado por nucleotidos que pueden formar enlaces de hidrogeno entre sf. Por tanto, "hibridable de forma espedfica" y "complementario" son expresiones que se usan para indicar un grado de complementariedad de apareamiento preciso tal que se produzca una union estable y espedfica entre el oligonucleotido y el ADN o ARN diana. Se entiende en la tecnica que la secuencia de una molecula antisentido no necesita ser complementaria al 100 % a la de su secuencia diana para ser hibridable de forma espedfica. Una molecula antisentido es hibridable de forma espedfica en el caso de que la union del compuesto a la molecula diana de ADN o ARN interfiere con la funcion normal del ADN o ARN diana para causar una perdida de utilidad, y hay un grado de complementariedad suficiente para evitar la union no espedfica del compuesto antisentido a secuencias no diana en condiciones en las cuales se desea la union espedfica, es decir, en condiciones fisiologicas en el caso de ensayos in vivo o el tratamiento terapeutico, y en el caso de ensayos in vitro, en las condiciones en las cuales se realizan los ensayos

Aunque el metodo anterior puede usarse para seleccionar moleculas antisentido capaces de eliminar cualquier exon del interior de una protema que es capaz de acortarse sin afectar a su funcion biologica, la eliminacion del exon no debena conducir a un desplazamiento del marco de lectura en el ARNm transcrito acortado. Por tanto, si en una secuencia lineal de tres exones, el final del primer exon codifica dos o tres nucleotidos en un codon y el siguiente exon se elimina, entonces, el tercer exon de la secuencia lineal ha de empezar con un solo nucleotido que sea capaz de completar el triplete de nucleotidos para un codon. Si el tercer exon no comienza con un solo nucleotido, habra un desplazamiento del marco de lectura que conducina a la generacion de una protema truncada o no funcional.

Se apreciara que los codones organizados en los extremos de los exones en las protemas estructurales no se rompen en todos los casos al final de un codon. En consecuencia, existe una necesidad de delecionar mas de un exon del pre-ARNm para garantizar la lectura dentro del marco del ARNm. En tales circunstancias, puede ser necesario seleccionar una pluralidad de oligonucleotidos antisentido mediante el metodo de la invencion, en el que cada uno se dirija a una region diferente responsable de la induccion de corte y empalme en los exones que se van a delecionar.

La longitud de una molecula antisentido puede variar con la condicion de que sea capaz de unirse de forma selectiva a la localizacion pretendida dentro de la molecula de pre-ARNm. La longitud de dichas secuencias puede determinarse de acuerdo con los procesos de seleccion descritos en el presente documento. Generalmente, la molecula antisentido presentara entre aproximadamente 10 nucleotidos de longitud y aproximadamente 50 nucleotidos de longitud. Sin embargo, se apreciara que puede usarse en el metodo cualquier longitud de nucleotidos dentro de este intervalo. Preferentemente, la longitud de la molecula antisentido presenta una longitud de 17 a 30 nucleotidos. Inesperadamente, se ha encontrado que las moleculas antisentido mas largas con frecuencia resultan mas eficaces en la induccion de omision exonica. De esta manera, mas preferentemente la molecula antisentido presenta una longitud de 24 a 30 nucleotidos.

A fin de determinar que exones pueden estar conectados en un gen de distrofina, debena hacerse referencia a un mapa de lfmites exonicos. La conexion de un exon con otro esta basada en los exones que poseen el mismo numero en el lfmite 3' que el que esta presente en el lfmite 5' del exon al que se esta conectando. Por tanto, si se eliminase el exon 7, el exon 6 ha de conectar con los exones 12 o 18 para mantener el marco de lectura. Por tanto, resulta necesario seleccionar los oligonucleotidos antisentido que redirigieron el corte y el empalme para los exones 7 a 11 en el primer caso, o los exones 7 a 17 en el segundo caso. Otro planteamiento, en cierto modo mas simple, para restaurar el marco de lectura alrededor de una eliminacion del exon 7 sena eliminar los dos exones flanqueantes. La induccion de la omision de los exones 6 y 8 dana como resultado un transcrito dentro del marco con el corte y empalme de los exones 5 a 9. En la practica, sin embargo, la definicion del exon 8 como diana para la eliminacion del pre-ARNm da como resultado la eliminacion conjunta del exon 9, de modo que el transcrito resultante tendna el exon 5 unido al exon 10. La inclusion o exclusion de exon 9 no altera el marco de lectura.

Una vez identificadas las moleculas antisentido que se van a someter a ensayo, se preparan de acuerdo con metodos estandares conocidos en la tecnica. El metodo mas comun para producir moleculas antisentido es la metilacion de la posicion 2'-hidroxirribosa y la incorporacion de un esqueleto fosforotioato. Ello produce moleculas que son superficialmente similares al ARN pero que son mucho mas resistentes a la degradacion por nucleasas.

Para evitar la degradacion del pre-ARNm durante la formacion de duplex con las moleculas antisentido, las moleculas

12

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

antisentido utilizadas en el metodo pueden adaptarse para reducir al mmimo o evitar el corte por ARNasa H endogena. Esta propiedad resulta altamente preferente, ya que la presencia de oligonucleotidos de ARN no metilados en un medio intracelular o en contacto con extractos en bruto que contienen ARNasa H conducira a la degradacion de los duplex de pre-ARNm:oligonucleotido antisentido. Cualquier forma de molecula antisentido modificada que sea capaz de evitar o no inducir dicha degradacion puede usarse en el presente metodo. La resistencia a nucleasas puede conseguirse mediante la modificacion de las moleculas antisentido de la invencion de manera que comprenda una cadena hidrocarburo alifatica insaturada y uno o mas grupos polares o con carga, incluyendo grupos acido carboxflico, grupos ester y grupos alcohol.

Un ejemplo de moleculas antisentido que, al formar duplex con ARN, no resultan cortados por la ARNasa H son los derivados 2'-O-metilo. Los 2'-O-metil-oligorribonucleotidos son muy estables en el medio celular y en tejidos animales, y sus duplex con ARN presentan valores de Tm mas elevados que sus equivalentes ribo- o desoxirribo-. Alternativamente, las moleculas antisentido resistentes a nucleasas de la invencion pueden presentar por lo menos uno de los ultimos nucleotidos 3'-terminales fluorado. Todavfa alternativamente, las moleculas antisentido resistentes a nucleasas de la invencion presentan enlaces fosforotioato que unen por lo menos dos de las ultimas bases nucleotidas 3'-terminales, preferentemente con enlaces fosforotioato uniendo las ultimas cuatro bases nucleotidas 3'- terminales.

Pueden generarse moleculas antisentido que no activan la ARNasa H de acuerdo con tecnicas conocidas (vease, p. ej., la patente US n° 5.149.797). Tales moleculas antisentido, que pueden ser secuencias de desoxirribonucleotidos o ribonucleotidos, contienen, simplemente, cualquier modificacion estructural que obstaculice o evite de forma esterica la union de la ARNasa H a una molecula duplex que contenga el oligonucleotido como un miembro de la misma, cuya modificacion estructural no obstaculice de forma sustancial o altere la formacion de duplex. Como las porciones del oligonucleotido que participa en la formacion de duplex son sustancialmente diferentes de las porciones que participan en la union de ARNasa H al mismo, se dispone de numerosas moleculas antisentido que no activan la ARNasa H. Por ejemplo, dichas moleculas antisentido pueden ser oligonucleotidos en los que al menos uno, o todos los residuos fosfato formadores de puente entre nucleotidos son fosfatos modificados, tales como metilfosfonatos, metilfosforotioatos, fosforomorfolidatos, fosforopiperazidatos y fosforamidatos. Por ejemplo, uno de cada dos de los residuos fosfato formadores de puente entre nucleotidos puede modificarse tal como se ha indicado.

En otro ejemplo no limitante, tales moleculas antisentido son moleculas en las que por lo menos uno, o todos los nucleotidos contienen una fraccion de alquilo inferior 2' (p. ej., alquilo C1-C4, lineal o ramificado saturado o insaturado, tal como metilo, etilo, etenilo, propilo 1-propenilo 2-propenilo e isopropilo). Por ejemplo, uno de cada dos de los nucleotidos puede modificarse tal como se ha indicado.

Aunque los oligonucleotidos antisentido son una forma preferente de moleculas antisentido, la presente invencion comprende otras moleculas antisentido oligomericas, incluyendo, aunque sin limitarse a ellas, mimeticos de oligonucleotido tales como los indicados posteriormente.

Entre los ejemplos espedficos de compuestos antisentido preferentes que resultan utiles en la presente invencion se incluyen oligonucleotidos que contienen esqueletos modificados o enlaces no naturales entre nucleosidos. Tal como se define en esta especificacion, los oligonucleotidos que presentan esqueletos modificados incluyen los que conservan un atomo de fosforo en el esqueleto y los que no presentan un atomo de fosforo en el esqueleto. Para los fines de la presente memoria y tal como se menciona a veces en la tecnica, los oligonucleotidos modificados que no tienen un atomo de fosforo en su esqueleto internucleosido tambien se considera que son oligonucleosidos.

En otros mimeticos de oligonucleotido preferentes, tanto el azucar como el enlace entre nucleosidos, es decir, el esqueleto de unidades nucleotidas, se sustituyen por grupos nuevos. Las unidades de base se mantienen para la hibridacion con un compuesto diana adecuado de acidos nucleicos. Uno de dichos compuestos oligomericos, un mimetico de oligonucleotido que se ha demostrado que tiene excelentes propiedades de hibridacion, se denomina acido peptidonucleico (APN). En los compuestos de APN, el esqueleto de azucar de un oligonucleotido se sustituye por un esqueleto que contiene amida, en concreto, un esqueleto de aminoetilglicina. Las nucleobases se conservan y se unen directa o indirectamente a los atomos de nitrogeno aza de la parte amida del esqueleto.

Los oligonucleotidos modificados pueden contener ademas uno o mas restos de azucar sustituidos. Los oligonucleotidos tambien pueden incluir modificaciones o sustituciones de las nucleobases (a las que se suele hacer referencia en la tecnica simplemente como "bases"). Determinadas nucleobases resultan particularmente utiles para incrementar la afinidad de union de los compuestos oligomericos de la invencion. Entre ellas se incluyen pirimidinas 5-sustituidas, 6-azapirimidinas y purinas N-2-sustituidas, N-6-sustituidas y O-6-sustituidas, incluyendo 2- aminopropiladenina, 5-propiniluracilo y 5-propinilcitosina. Se ha demostrado que las sustituciones de 5-metilcitosina incrementan la estabilidad del duplex de acido nucleico hacia 0,6-1,2 °C y actualmente son las sustituciones de base preferidas, aun mas concretamente cuando se combinan con modificaciones 2'-O-metoxietilo de azucar.

Otra modificacion de los oligonucleotidos de la invencion implica unir qmmicamente al oligonucleotido uno o mas fracciones o conjugados que potencian la actividad, la distribucion celular o la captacion celular del oligonucleotido. Entre tales fracciones se incluyen, aunque sin limitarse a ellas, fracciones de lfpidos, tales como una fraccion de

13

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

colesterol, acido colico, un tioeter, p. ej., hexil-S-tritiltiol, un tiocolesterol, una cadena alifatica, p. ej., residuos de dodecanodiol o undecilo, un fosfoKpido, p. ej., di-hexadecil-rac-glicerol o 1,2-di-O-hexadecil-rac-glicero-3-H-fosfonato de trietilamonio , una poliamina o una cadena de polietilenglicol, o acido adamantano-acetico, una fraccion palmitilo, o una fraccion octadecilamina o hexilamino-carbonil-oxicolesterol.

No resulta necesario que todas las posiciones en un compuesto dado se modifiquen uniformemente y de hecho puede incorporarse mas de una de las modificaciones anteriormente indicadas en un unico compuesto o incluso en un unico nucleosido dentro de un oligonucleotido. La presente invencion tambien incluye compuestos antisentido que son compuestos quimericos. Los compuestos antisentido "quimericos" o "quimeras" en el contexto de esta invencion, son moleculas antisentido, concretamente oligonucleotidos, que contienen dos o mas regiones qmmicamente distintas, formadas cada una de al menos una unidad monomerica, es decir, un nucleotido en el caso de un compuesto de oligonucleotido. Estos oligonucleotidos contienen tipicamente por lo menos una region en la que el oligonucleotido se modifica con el fin de conferir de esa forma la resistencia incrementada a la degradacion por nucleasas, una captacion celular aumentada, y una region adicional para la afinidad de union incrementada para el acido nucleico diana.

Metodos de preparacion de moleculas antisentido

Las moleculas antisentido usadas de acuerdo con esta invencion pueden prepararse de forma conveniente y rutinaria a traves de la tecnica bien conocida de smtesis en fase solida. Los equipos para dicha smtesis son comercializados por varios proveedores, incluyendo, por ejemplo, Applied Biosystems (Foster City, Calif.). Un metodo para sintetizar oligonucleotidos sobre un soporte solido modificado se describe en la patente US n° 4.458.066.

Puede emplearse de forma adicional o alternativa cualquier otro medio para dicha smtesis conocido en la tecnica. Es bien conocida la utilizacion de tecnicas similares para preparar oligonucleotidos, tales como los fosforotioatos y derivados alquilados. En una de dichas realizaciones automatizadas, se usan dietilfosforamiditas como materiales de partida y pueden sintetizarse tal como describen Beaucage et al., Tetrahedron Letters 22:1859-1862, 1981.

Las moleculas antisentido de la invencion se sintetizan in vitro y no incluyen composiciones antisentido de origen biologico, o constructos de vectores geneticos disenados para dirigir la smtesis in vivo de moleculas antisentido. Las moleculas de la invencion tambien pueden mezclarse, encapsularse, conjugarse o asociarse de otra forma con otras moleculas, estructuras moleculares o mezclas de compuestos, como, por ejemplo, formulaciones de liposomas, de moleculas dirigidas hacia receptores, orales, rectales, topicas u otras, para colaborar en la captacion, distribucion y/o absorcion.

Agentes terapeuticos

La presente invencion puede utilizarse ademas como profilactica o terapeutica, con fines de tratamiento de la distrofia muscular.

Por consiguiente, en una realizacion, la presente invencion proporciona moleculas antisentido que se unen a una diana seleccionada en el pre-ARNm de la distrofina para inducir la omision exonica eficaz y consistente descrita en la presente memoria en una cantidad terapeuticamente eficaz, mezclada con un portador, diluyente o excipiente farmaceuticamente aceptable.

La expresion "farmaceuticamente aceptable" se refiere a entidades y composiciones moleculares que son fisiologicamente tolerables y no producen tfpicamente una reaccion alergica o u otro tipo de reaccion adversa similar, tal como molestia gastrica y similar, al administrarlas en un paciente. El termino "vehmulo" se refiere a un diluyente, adyuvante, excipiente o vehmulo con el que se administra el compuesto. Dichos vehmulos farmaceuticos pueden ser lfquidos esteriles, tales como agua y aceites, incluyendo los originados en petroleo, y de origen animal, vegetal o sintetico, tal como aceite de cacahuete, aceite de soja, aceite mineral, aceite de sesamo y similares. Las soluciones de agua o salinas y las soluciones acuosas de dextrosa y glicerol se emplean preferentemente como portadores, particularmente para soluciones inyectables. En Martin, Remington's Pharmaceutical Sciences, 18a ed., Mack Publishing Co., Easton, PA, 1990, se describen portadores farmaceuticos adecuados.

En una forma mas espedfica de la invencion se proporcionan composiciones farmaceuticas que comprenden cantidades terapeuticamente eficaces de una molecula antisentido junto con diluyentes, conservantes, solubilizadores, emulsionantes, adyuvantes y/o portadores farmaceuticamente aceptables. Tales composiciones incluyen diluyentes con diverso contenido de tampones (p. ej., Tris-HCl, acetato, fosfato), pH y fuerza ionica, y aditivos tales como detergentes y agentes solubilizadores (p. ej., Tween-80, polisorbato-80), antioxidantes (p. ej., acido ascorbico, metabisulfito sodico, conservantes (p. ej., timerosal, alcohol bendlico) y sustancias de carga (p. ej., lactosa, manitol). El material puede incorporarse en preparaciones particuladas de compuestos polimericos, tales como acido polilactico, acido poliglicolico, etc. o en liposomas. Tambien puede usarse acido hialuronico. Tales composiciones pueden influir sobre el estado ffsico, la estabilidad, la tasa de liberacion in vivo, y la tasa de lavado vivo de las protemas y derivados presentes. Vease, p. ej., Martin, Remington's Pharmaceutical Sciences, 18a ed. (1990, Mack Publishing Co., Easton, PA 18042) paginas 1435 a 1712, las cuales se incorporan como referencia en la presente memoria. Las composiciones lfquidas pueden prepararse en forma lfquida, o pueden estar en polvo deshidratado, tal como en forma liofilizada.

14

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

Se apreciara que las composiciones farmaceuticas proporcionadas segun la presente invencion pueden administrarse mediante cualquiera de los medios conocidos en la tecnica. Preferentemente, las composiciones farmaceuticas para su administracion se administran mediante inyeccion, por via oral, o mediante via pulmonar o nasal. Las moleculas antisentido se administran mas preferentemente por vfas de administracion intravenosa, intraarterial, intraperitoneal, intramuscular, o subcutanea.

Terapia basada en moleculas antisentido

La presente invencion tambien se refiere a la utilizacion de las moleculas antisentido de la presente invencion, para la preparacion de un medicamento para la modulacion de una distrofia muscular.

La administracion de una cantidad terapeuticamente util de moleculas antisentido puede lograrse mediante metodos publicados previamente. Por ejemplo, la administracion intracelular de la molecula antisentido puede ser a traves de una composicion que comprende una mezcla de la molecula antisentido y una cantidad eficaz de un copolfmero en bloque. Un ejemplo de este metodo se describe en la solicitud de patente US n° 2004/0248833.

Otros metodos de administracion de moleculas antisentido en el nucleo se describen en Mann C.J. et al., ["Antisense- induced exon skipping and the synthesis of dystrophin in the mdx mouse", Proc., Natl. Acad. Science 98(1):42-47, 2001] y en Gebski et al., Human Molecular Genetics, 12(15): 1801-1811, 2003).

En la patente US n° 6.806.084 se describe un metodo para introducir una molecula de acido nucleico en una celula por medio de un vector de expresion, bien como ADN desnudo, o bien en complejo con portadores lipfdicos.

Puede ser deseable administrar la molecula antisentido en un sistema de dispersion coloidal. Los sistemas de dispersion coloidal incluyen complejos de macromoleculas, nanocapsulas, microesferas, perlas, y sistemas a base de lfpidos incluyendo emulsiones de aceite en agua, micelas, micelas mixtas, y liposomas o formulaciones de liposomas.

Los liposomas son vesfculas de membrana artificial que son utiles como vetuculos de administracion in vitro e in vivo. Estas formulaciones pueden tener caractensticas de carga neta cationica, anionica o neutra y son caractensticas utiles con los metodos de administracion in vitro, in vivo y ex vivo. Se ha demostrado que las vesfculas unilaminares grandes (VUG), cuyo tamano oscila desde 0,2-4,0 PHI.m pueden encapsular un porcentaje sustancial de un tampon acuoso que contiene macromoleculas grandes. El ARN y el ADN pueden encapsularse dentro del interior acuoso y administrarse en las celulas en una forma biologicamente activa (Fraley et al., Trends Biochem. Sci. 6:77, 1981).

Para que un liposoma sea un vetuculo de transferencia genica eficaz, debenan estar presentes las caractensticas siguientes: (1) encapsulado de la molecula antisentido de interes con una alta eficacia, al tiempo que no se compromete su actividad biologica, (2) union a una celula diana preferente y sustancial en comparacion con celulas no diana, (3) administracion del contenido acuoso de la vesfcula en el citoplasma de la celula diana con una alta eficiencia, y (4) expresion precisa y eficaz de la informacion genetica (Mannino et al., Biotechniques 6:682, 1988).

La composicion del liposoma habitualmente es una combinacion de fosfolfpidos, particularmente fosfolfpidos de alta temperatura de transicion de fase, normalmente en combinacion con esteroides, especialmente colesterol. Tambien pueden usarse otros fosfolfpidos u otros lfpidos. Las caractensticas ffsicas de los liposomas dependen del pH, la fuerza ionica, y la presencia de cationes divalentes.

Alternativamente, el constructo antisentido puede combinarse con otros portadores o diluyentes farmaceuticamente aceptables para producir una composicion farmaceutica. Los vetuculos y diluyentes adecuados incluyen soluciones salinas isotonicas, por ejemplo tampon fosfato salino. La composicion puede formularse para la administracion parenteral, intramuscular, intravenosa, subcutanea, intraocular, oral o transdermica.

Las vfas de administracion descritas pretender ser unicamente una grna, puesto que el experto en la materia sera capaz de determinar facilmente la via de administracion optima y cualquier dosis para cualquier animal y condicion particular.

Las moleculas antisentido de la invencion comprenden cualesquiera sales, esteres, o sales de dichos esteres, farmaceuticamente aceptables, o cualquier otro compuesto que, tras la administracion en un animal incluyendo un ser humano, sea capaz de proporcionar (directa o indirectamente) el metabolito o residuo biologicamente activo del mismo. Por consiguiente, por ejemplo, la exposicion se refiere ademas a profarmacos y sales farmaceuticamente aceptables de los compuestos de la invencion, a sales farmaceuticamente aceptables de dichos profarmacos y a otros bioequivalentes.

La expresion "sales farmaceuticamente aceptables" se refiere a sales fisiologica y farmaceuticamente aceptables de los compuestos de la invencion: es decir, sales que conservan la actividad biologica deseada del compuesto parental y no confieren efectos toxicologicos indeseables a este.

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

Para los oligonucleotidos, entre los ejemplos preferentes de sales farmaceuticamente aceptables se incluyen, aunque sin limitarse a ellos, (a) sales formadas con cationes, tales como sodio, potasio, amonio, magnesio, calcio, poliaminas tales como espermina y espermidina, etc., (b) sales de adicion de acido formadas con acidos inorganicos, por ejemplo, acido clortndrico, acido bromtndrico, acido sulfurico, acido fosforico, acido mtrico y similares, (c) sales formadas con acidos organicos tales como, por ejemplo, acido acetico, acido oxalico, acido tartarico, acido succmico, acido maleico, acido fumarico, acido gluconico, acido cftrico, acido maleico, acido ascorbico, acido benzoico, acido tanico, acido palmftico, acido algmico, acido poliglutamico, acido naftalenosulfonico, acido metanosulfonico, acido p- toluenosulfonico, acido naftalenosulfonico, acido poligalacturonico, y similares, y (d) sales formadas a partir de aniones elementales tales como cloro, bromo y yodo. Las composiciones farmaceuticas de la presente invencion pueden administrarse de una serie de formas dependiendo de si se desea tratamiento local o sistemico y de la zona que se va a tratar. La administracion puede ser topica (incluyendo oftalmica y en membranas mucosas, incluyendo la administracion rectal), pulmonar, p. ej., mediante inhalacion o insuflacion de polvos o aerosoles, (incluyendo mediante nebulizador, intratraqueal, intranasal, epidermica y transdermica), oral o parenteral. La administracion parenteral incluye la inyeccion o infusion intravenosa, intraarterial, subcutanea, intraperitoneal o intramuscular; o la administracion intracraneal, p. ej., intratecal o intraventricular. Se cree que los oligonucleotidos con al menos una modificacion 2'-O- metoxietilo resultan particularmente utiles para la administracion oral.

Las formulaciones farmaceuticas de la presente invencion, que pueden presentarse convenientemente en forma de dosificacion unitaria, pueden prepararse segun tecnicas convencionales bien conocidas en la industria farmaceutica. Entre dichas tecnicas se incluyen la etapa de asociar los ingredientes activos con el portador o portadores o excipiente o excipientes farmaceuticos. En general, las formulaciones se preparan poniendo en asociacion uniforme e mtima los ingredientes activos con vetnculos lfquidos o vetnculos solidos finamente divididos o ambos, y despues, en caso necesario, dando forma al producto.

Kits de la invencion

En la presente memoria se ensenan ademas kits para el tratamiento de un paciente con una enfermedad genetica, donde los kits comprenden por lo menos una molecula antisentido, envasada en un recipiente adecuado, junto con instrucciones de utilizacion.

Los kits pueden contener por lo menos una molecula antisentido tales como las mostradas en la Tabla 1A, o un coctel de moleculas antisentido tales como los mostrados en la Tabla 1B. Los kits pueden contener ademas reactivos perifericos tales como tampones, estabilizantes, etc.

El contenido del kit puede liofilizarse y el kit puede contener adicionalmente un solvente adecuado para la reconstitucion de los componentes liofilizados. Los componentes individuales del kit pueden envasarse en recipientes separados y, asociados a tales envases, puede encontrarse un impreso en la forma prescrita por una agencia reguladora de la fabricacion, utilizacion o comercializacion de los farmaceuticos o productos biologicos, donde el impreso refleje la autorizacion de la agencia respecto de la fabricacion, utilizacion o comercializacion para la administracion en el ser humano.

En el caso de que los componentes del kit se proporcionen en una o mas soluciones lfquidas, la solucion lfquida puede ser una solucion acuosa, por ejemplo una solucion acuosa esteril. Para la utilizacion in vivo, el constructo de expresion puede formularse en una composicion inyectable con jeringa farmaceuticamente aceptable. En este caso, los medios recipientes pueden ser ellos mismos un inhalador, jeringa, pipeta, cuentagotas u otro aparato similar, a partir del cual puede aplicarse la formulacion en una zona afectada del animal, tal como los pulmones, inyectarse en un animal o incluso aplicarse y mezclarse con los demas componentes del kit.

Los componentes del kit pueden proporcionarse tambien en formas secas o liofilizadas. En el caso de que los reactivos o componentes se proporcionen en forma seca, la reconstitucion generalmente se lleva a cabo mediante la adicion de un solvente adecuado. Se encuentra contemplado que el solvente se proporcione ademas en otros medios recipientes. Con independencia del numero o tipo de envases, los kits de la invencion pueden comprender ademas, o pueden envasarse con, un instrumento de ayuda a la inyeccion/administracion o aplicacion de la composicion compleja final dentro del cuerpo de un animal. Tal instrumento puede ser un inhalador, jeringa, pipeta, pinza, cuchara medidora, cuentagotas o cualquier otro vehnculo similar de administracion autorizado para el uso clmico.

Ejemplos

Los siguientes ejemplos sirven para describir de forma mas completa la manera de usar la invencion descrita anteriormente, asf como para exponer los mejores modos contemplados para llevar a cabo diversos aspectos de la invencion. Se entiende que estos ejemplos no sirven en modo alguno para limitar el verdadero alcance de esta invencion, sino que se presentan mas bien con fines ilustrativos.

Los metodos de clonacion molecular, inmunologfa y qmmica de protemas que no se describen de forma explfcita en los siguientes ejemplos, estan publicados en la bibliograffa y son conocidos por el experto en la materia. Los textos

16

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

generales que describieron tecnicas convencionales de biolog^a molecular, microbiologfa y de ADN recombinante dentro de la experiencia de la tecnica incluyeron, por ejemplo: Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, segunda edicion, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1989; Glover ed., DNA Cloning: A Practical Approach, volumenes I y II, MRL Press, Ltd., Oxford, R.U., 1985; y Ausubel F., Brent R., Kingston R.E., Moore D.D., Seidman J.G., Smith J.A., Struhl K., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates/Wiley Intersciences, New York, 2002.

Determinacion de la omision exonica inducida en celulas musculares humanas

Los intentos de los inventores de desarrollar un abordaje racional en el diseno de moleculas antisentido no tuvieron un exito completo, ya que aparentemente no se observaba una tendencia sistematica que pudiera aplicarse a todos los exones. Como tal, la identificacion de los compuestos de moleculas antisentido mas eficaces, y por lo tanto mas terapeuticos, ha sido el resultado de estudios empmcos.

Estos estudios empmcos implicaron el uso de programas informaticos para identificar motivos potencialmente implicados en el proceso de corte y empalme. Se usaron tambien otros programas informaticos para identificar regiones del pre-ARNm que podnan no haber tenido una estructura secundaria extensa y, por tanto, que eran sitios potenciales de apareamiento de moleculas antisentido. No se probo que ninguno de estos planteamientos fuese completamente fiable en el diseno de oligonucleotidos antisentido para la induccion fiable y eficaz de omision exonica.

Se seleccionaron para su examen sitios de apareamiento del pre-ARNm de la distrofina humana, sobre la base inicial de los motivos o regiones conocidos o predichos implicados en el corte y empalme. Se disenaron oligonucleotidos antisentido 2-O-Me para ser complementarios a las secuencias diana en investigacion, y se sintetizaron en un sintetizador de acidos nucleicos Expedite 8909. Tras la finalizacion de la smtesis, los oligonucleotidos se escindieron de la columna de soporte y se desprotegieron en hidroxido de amonio antes de desalarse. La calidad de la smtesis de oligonucleotidos se controlo mediante la intensidad de las senales de tritilo despues de cada etapa de desproteccion durante la smtesis, detectada en el registro de smtesis. La concentracion de oligonucleotido antisentido se estimo midiendo la absorbancia a 260 nm de una almuota diluida.

Se ensayo entonces la capacidad de cantidades especificadas de moleculas antisentido para su capacidad de inducir omision exonica en un ensayo in vitro, tal como se describe a continuacion.

Brevemente, se prepararon cultivos primarios de mioblastos normales a partir de biopsias de musculo humano obtenidas tras consentimiento informado. Las celulas se propagaron y se les permitio diferenciarse en miotubos usando tecnicas de cultivo convencionales. A continuacion, las celulas se transfectaron con los oligonucleotidos antisentido mediante la administracion de los oligonucleotidos en las celulas en forma de lipoplejos cationicos, mezclas de moleculas antisentido o preparaciones liposomicas cationicas.

Seguidamente las celulas se dejaron crecer durante otras 24 horas y despues se extrajo el ARN total y se comenzo el analisis molecular. Se llevo a cabo una amplificacion con transcriptasa inversa (RT-PCR) para estudiar las regiones diana del pre-ARNm de la distrofina o los reordenamientos exonicos inducidos.

Por ejemplo, en el ensayo de la induccion de omision del exon 19 por una molecula antisentido, la RT-PCR escaneo varios exones para detectar la participacion de cualquiera de los exones contiguos. Por ejemplo, al inducir la omision del exon 19, la RT-PCR se llevo a cabo con cebadores que amplificaban a lo largo de los exones 17 y 21. Tambien se llevaron a cabo amplificaciones de productos aun mas largos en esta zona (es decir, los exones 13-26) para asegurar que hubiera un sesgo de amplificacion mmimo para el transcrito omitido inducido mas corto. Los productos mas cortos o de exon omitido tienden a amplificarse de forma mas eficaz y pueden sesgar la estimacion del transcrito normal e inducido.

Los tamanos de los productos de la reaccion de amplificacion se estimaron en un gel de agarosa y se compararon frente a patrones de tamano apropiados. La confirmacion final de la identidad de estos productos se llevo a cabo mediante secuenciacion directa del ADN para establecer que se habfan mantenido las conexiones de exon correctas o esperadas.

Una vez se habfa inducido una omision exonica eficaz con una molecula antisentido, las moleculas antisentido solapantes posteriores pudieron sintetizarse y seguidamente evaluarse en el ensayo tal como se ha indicado anteriormente. La definicion de los presentes inventores de una molecula antisentido eficaz es una que induce una omision exonica fuerte y mantenida a concentraciones de transfeccion del orden de 300 nM o inferiores. Lo mas preferentemente, las moleculas de oligonucleotido de la presente invencion son capaces de inducir omision a niveles superiores a 30% a una concentracion de 100 nM.

Metodos densitometricos

Se llevo a cabo el analisis de densitometna de los resultados de los procedimientos de omision exonica con el fin de determinar que moleculas antisentido alcanzaban la eficiencia deseada. Los productos de amplificacion se

17

fraccionaron en geles de agarosa al 2%, se tineron con bromuro de etidio y las imagenes se capturaron mediante un sistema de documentacion en gel Chemi-Smart 3000 (Vilber Lourmat, Marne La Vallee). A continuacion, se analizaron las bandas utilizando el sistema de documentacion en gel (Bio-Profil, Bio-1D version 11.9, Vilber Lourmat, Marne La Vallee), siguiendo las instrucciones del fabricante.

5

Se llevo a cabo la densitometna en las moleculas antisentido siguientes:

Figura 35

Exon 3: H3A(+30+60) y H3A(+61+85)

Exon 4: H4D(+14-11) y H4A(+11+40)

Exon 14: H14A(+32+61)

Exon 17: H17A(+10+35)

Exon 26: H26A(-07+19), H26A(+24+50) y H26A(+68+92)

Exon 36: H36A(-16+09) y H36A(+22+51)

10 Figura 36

Exon 46: H46A(+81+109)

Exon 47: H47A(+01+29)

Exon 48: H48A(+01+28) y H48A(+40+67)

Exon 49: H49A(+45+70)

Oligonucleotidos antisentido dirigidos al exon 17

Se prepararon oligonucleotidos antisentido dirigidos al exon 17 y se sometio a ensayo su capacidad 15 exonica en celulas musculares humanas usando metodos similares a los descritos anteriormente.

A partir de la Tabla 2, posteriormente, puede observarse que el efecto de las moleculas antisentido sitio (el sitio de corte y empalme del exon 17) puede ser muy diferente, aunque los sitios de union de las dos moleculas antisentido sean solapantes. H17A(-07+23) [SEC ID n° 3], que se hibrida con las ultimas 7 bases del intron 16 y las 20 primeras 23 bases del exon 17, induce la omision del exon 17 al administrarlo en la celula a una concentracion de 25 nM. En contraste, la molecula antisentido H17A(-12+18), que se hibrida con las ultimas 12 bases del intron 16 y las primeras 18 bases del exon 17, y de esta manera se solapa con el sitio de union de H17A(-07+23), no fue capaz de inducir la omision exonica en absoluto. Ademas, H17A(-07+16), que se hibrida con las ultimas 7 bases del intron 16 y las primeras 16 bases del exon 17, causo la omision de tanto el exon 17 como el 18 a 200 nM. La molecula antisentido 25 H17a(+61+86) [SEC ID n° 4], que se une en un motivo intensificador de corte y empalme intraexonico del exon 17

tambien es capaz de inducir un buen nivel de omision. Puede observarse que la capacidad de las moleculas antisentido de inducir la omision exonica no puede predecirse simplemente a partir de su sitio de union y debe determinarse mediante ensayos rigurosos.

30 Tabla 2: secuencias de moleculas antisentido sometidas a ensayo para determinar si inducen la omision del exon 17

Nombre del oligonucleotido antisentido: Secuencia Capacidad de inducir omision

H17A(-12 +18): GGU GAC AGC CUG UGA AAU CUG UGA GAA GUA Sin omision

H17A(-07+23): GUG GUG GUG ACA GCC UGU GAA AUC UGU GAG Omision a 25 nM

H17A(-07+16): UGA CAG CCU GUG AAA UCU GUG AG Omision ex 17+18 a 200 nM

H17A(+10 +35): AGU GAU GGC UGA GUG GUG GUG ACA GC Omision a 50 nM

H17A(+31+50): ACA GUU GUC UGU GUU AGU GA Omision inconsistente

H17A(+61+86): UGU UCC CUU GUG GUC ACC GUA GUU AC Omision a 50 nM

H17A(+144+163): CAG AAU CCA CAG UAA UCU GC Omision a 300 nM

Estos datos demuestran que algunas moleculas antisentido particulares inducen una omision exonica eficiente, mientras que otras moleculas antisentido, con diana en regiones proximas o solapantes, pueden ser mucho menos eficientes. Los estudios de titulacion muestran que una molecula es capaz de inducir una omision exonica dirigida a 35 una concentracion de 20-25 nM, mientras que una molecula antisentido menos eficiente podna inducir omision exonica unicamente a concentraciones de 300 nM y superiores. Por lo tanto, los presentes inventores han demostrado que dirigir las moleculas antisentido a motivos que participan en el proceso de corte y empalme desempena un papel crucial en la eficacia global de ese compuesto.

de inducir omision dirigidas al mismo

5

10

15

20

25

Eficacia se refiere a la capacidad de inducir una omision consistente de un exon diana. Sin embargo, en ocasiones la omision de los exones diana esta consistentemente asociada a un exon flanqueante. Es decir, los presentes inventores han encontrado que el corte y empalme de algunos exones se encuentra estrechamente ligado. Por ejemplo, al utilizar como diana el exon 23 en el modelo de raton de distrofia muscular con moleculas antisentido dirigidas al sitio donante de ese exon, con frecuencia se detectan los exones 22 y 23 faltantes de transcritos de distrofina. A tftulo de otro ejemplo, al utilizar una molecula antisentido dirigida al exon 8 del gen de la distrofina humana, muchos transcritos inducidos no presentan tanto el exon 8 como el exon 9.

Oligonucleotidos antisentido dirigidos al exon 2

Se prepararon oligonucleotidos antisentido dirigidos al exon 2 y se sometieron a ensayo para su capacidad de inducir omision exonica en celulas musculares humanas usando metodos similares a los descritos anteriormente.

Tabla 3: secuencias de moleculas antisentido sometidas a ensayo para determinar si inducen la omision del exon 2

H2A(-14+10): UCU CUU UCA UCU AAA AUG CAA AAU Sin omision

H2A(-1+23): CUU UUG AAC AUC UUC UCU UUC AUC Sin omision

H2A(+7+38): UUU UGU GAA UGU UUU CUU UUG AAC AUC UUC UC Sin omision

H2A(+16+39): AUU UUG UGA AUG UUU UCU UUU GAA Sin omision

H2A(+30+60): UAG AAA AUU GUG CAU UUA CCC AUU UUG UGA A Sin omision

H2D(+19-11): ACC AUU CUU ACC UUA GAA AAU UGU GCA UUU Sin omision

H2D(+03-21): AAA GUA ACA AAC CAU UCU UAC CUU Sin omision

Oligonucleotidos antisentido dirigidos al exon 3

Se prepararon oligonucleotidos antisentido dirigidos al exon 3 y se sometieron a ensayo para su capacidad de inducir omision exonica en celulas musculares humanas usando metodos similares a los descritos anteriormente.

Utilizada cada una individualmente, las moleculas antisentido H3A(+30+60) [SEC ID n° 31] y H3A(+61+85) [SEC ID n° 32] indujeron la omision del exon 3. Sin embargo, en combinacion, las dos moleculas son todavfa mas eficaces en la induccion de omision (figura 3) y tambien son capaces de inducir omision de los exones 4 y 5 a 300 nM y 600 nM, un resultado no observado o predicho por los resultados de la utilizacion de cada molecula antisentido por sf sola. Aparecen productos adicionales sobre el exon 3 omitido del transcrito inducido a partir de la amplificacion de cebadores externos de contaminacion cruzada de la RT-PCR, asf como la formacion de heteroduplex.

Tabla 4: secuencias de moleculas antisentido sometidas a ensayo para determinar si inducen la omision del exon 3

H3A(+14+38): AGG UCA CUG AAG AGG UUC UCA AUA U Omision moderada a 10 nM

H3A(+20+40): GUA GGU CAC UGA AGA GGU UCU Omision fuerte a 50 nM

H3A(+25+60): AGG AGG CGU CUC CCA UCC UGU AGG UCA CUG AAG AG Omision debil

H3A(+45+65): AGG UCU AGG AGG CGC CUC CCA Sin omision

H3A(+48+73): CUU CGA GGA GGU CUA GGA GGC GCC UC Sin omision

H3A(+61+85): GCC CUG UCA GGC CUU CGA GGA GGU C Omision a 300 nM

H3D(+17-08): uca cau acA GUU UUU GCC CUG UCA G Sin omision

H3D(+19-02): UAC AGU UUU UGC CCU GUC AGG Sin omision

H3D(+14-10): AAG UCA CAU ACA GUU UUU GCC CUG Sin omision

H3D(+12-07): UCA CAU ACA GUU UUU GCC C Sin omision

Cocteles para el exon 3

H3A(+30+60): UAG GAG GCG CCU CCC AUC CUG UAG GUC ACU G Omision excelente hasta 100 nM, omision a 10 nM. Tambien extraen 4 y 5 a 300 nM

H3A(+61+85): G CCC UGU CAG GCC UUC GAG GUC

H3A(+61+85): G CCC UGU CAG GCC UUC GAG GAG GUC Omision muy fuerte a 50 nM

H3A(+30+54): GCG CCU CCC AUC CUG UAG GUC ACU G

H3A(+61+85): G CCC UGU CAG GCC UUC GAG GAG GUC Omision muy fuerte a 50 nM

H3A(+25+60): AGG AGG CGU CUC CCA UCC UGU AGG UCA CUG AAG AG

Oligonucleotidos antisentido dirigidos al exon 4

5 Se prepararon oligonucleotidos antisentido dirigidos al exon 4 y se sometieron a ensayo para su capacidad de inducir omision exonica en celulas musculares humanas usando metodos similares a los descritos anteriormente. La figura 4 muestra la omision del exon 4 utilizando un coctel de H4A(+11+40) [SEC ID n° 33] y H4D(+14-11) [SEC ID n° 34].

Tabla 5: secuencias de moleculas antisentido sometidas a ensayo para determinar si inducen la omision del exon 4

H4A(-08+17): GAU CCU UUU UCU UUU GGC UGA GAA C Omision debil baiando hasta 10 nM

H4A(+36+60): CCG CAG UGC CUU GUU GAC AUU GUU C Buena omision a 10 nM

H4D(+14-11): GUA CUA CUU ACA UUA UUG UUC UGC A Omision muy baja a 10 nM

Cocteles de exon 4

H4A(+11+40): UGU UCA GGG CAU GAA CUC UUG UGG AUC CUU Omision excelente (100% a 100 nM) y buena omision bajando hasta 5 nM

H4D(+14-11): GUA CUA CUU ACA UUA UUG UUC UGC A

10

Oligonucleotidos antisentido dirigidos al exon 5

Se prepararon oligonucleotidos antisentido dirigidos al exon 5 y se sometieron a ensayo para su capacidad de inducir omision exonica en celulas musculares humanas usando metodos similares a los descritos anteriormente. H5D(+26- 15 05) se considerana una molecula antisentido no preferente ya que no consiguio inducir ni siquiera un nivel bajo de

omision del exon 5. Sin embargo, se evaluo H5A(+35+65) [SEC ID n° 1], que presumiblemente presenta como diana un intensificador de corte y empalme exonico, se encontro que era altamente eficiente en la induccion de omision de dicho exon diana, tal como se muestra en la figura 5 y se considera el compuesto preferente para la omision inducida del exon 5.

20

Tabla 6: secuencias ^ de moleculas antisentido sometidas a ensayo para determinar si inducen la omision del exon 5

H5A(+35+65): AAA CCA AGA GUC AGU UUA UGA UUU CCA UCU A Omision elevada hasta 10 nM

H5D(+26-05): CUU ACC UGC CAG UGG AGG AUU AUA UUC CAA A Sin omision

Oligonucleotidos antisentido dirigidos al exon 6

Se prepararon oligonucleotidos antisentido dirigidos al exon 6 y se sometieron a ensayo para su capacidad de inducir omision exonica en celulas musculares humanas usando metodos similares a los descritos anteriormente.

5 Tabla 7: secuencias de moleculas antisentido sometidas a ensayo para determinar si inducen la omision del exon 6

H6A(-09+17): UUC AUU ACA UUU UUG ACC UAC AUG UG Debil hasta 600 nM

H6A(+32+57): CUU UUC ACU GUU GGU UUG UUG CAA UC Omision a 25 nM

KH9 6A(+66+94): AAU UAC GAG UUG AUU GUC GGA CCC AGC UC Omision a 25 nM

H6A(+69+96): AUA AUU ACG AGU UGA UUG UCG GAC CCA G Omision hasta 100 nM

H6A(+9B+123): GGU GAA GUU GAU UAC AUU AAC CUG UG Sin omision

H6D(+18-06): UCU UAC CUA UGA CUA UGG AUG AGA Sin omision

H6D(+07-15): CAG UAA UCU UCU UAC CUA UGA C Sin omision

H6D(+07-16): UCA GUA AUC UUC UUA CCU AUG AC Sin omision

H6D(+04-20): UGU CUC AGU AAU CUU CUU ACC UAU Sin omision

Oligonucleotidos antisentido dirigidos al exon 7

Se prepararon oligonucleotidos antisentido dirigidos al exon 7 y se sometieron a ensayo para su capacidad de inducir 10 omision exonica en celulas musculares humanas usando metodos similares a los descritos anteriormente.

Tabla 8: secuencias de moleculas antisentido sometidas a ensayo para determinar si inducen la omision del exon 7

H7A(-07+15): UCA AAU AGG UCU GGC CUA AAA C Sin omision

H7A(-03+18): CCA GUC AAA UAG GUC UGG CCU A Sin omision

H7A(+41+63): UGU UCC AGU CGU UGU GUG GCU GA Omision 50 nM

H7A(+41+67): UGC AUG UUC CAG UCG UUG UGU GGC UGA omision 25 nM

H7A(+47+74): UGU UGA AUG CAU GUU CCA GUC GUU GUG U Omision 25 nM, aunque debil

H7A(+49+71): UGA AUG CAU GUU CCA GUC GUU GU Buena omision hasta 25 nM

Oligonucleotidos antisentido dirigidos al exon 8 15

Se prepararon oligonucleotidos antisentido dirigidos al exon 8 y se sometieron a ensayo para su capacidad de inducir omision exonica en celulas musculares humanas usando metodos similares a los descritos anteriormente. Vease la figura 6.

20 Tabla 9: secuencias de moleculas antisentido sometidas a ensayo para determinar si inducen la omision del exon 8

H8A(-10+20): UGG AUA GGU GGU AUC AAC AUC UGU AAG CAC Omision muy debil de 8+9 hasta 10 nM

H8A(-07+15): GAU AGG UGG UAU CAA CAU CUG U Omision extremadamente debil de 8+9 hasta 10 nM

H8A(-06+24): UAU CUG GAU AGG UGG UAU CAA CAU CUG UAA Omision debil de 8+9 hasta 10 nM

H8A(-04+18): GAU AGG UGG UAU CAA CAU CUG U Efecto fuerte hasta 40 nM

H8A(+42+66): AAA CUU GGA AGA GUG AUG UGA UGU A Buen nivel de omision de 8+9 hasta 10 nM

H8A(+57+83): GCU CAC UUG UUG AGG CAA AAC UUG GAA Buena omision de 8+9 a conc. elevada, bajando hasta 10 nM

HBA(+96+120): GCC UUG GCA ACA UUU CCA CUU CCU G Omision debil de 8+9 hasta 300 nM

H8A(+134+158): AUG UAA CUG AAA AUG UUC UUC UUU A Omision debil de 8+9 hasta 100 nM

HBD(+13-12): UAC ACA CUU UAC CUG UUG AGA AUA G Omision debil de 8+9 hasta 50 nM

Cocteles de exon 8

H8A(-06+24): UAU CUG GAU AGG UGG UAU CAA CAU CUG UAA Buena omision hasta 10 nM (8+9) aunque tambien 8 solo

H8A(+134+158): AUG UAA CUG AAA AUG UUC UUC UUU A

H8A(-06+24): UAU CUG GU AGG UGG UAU CAA CAU CUG UAA Buena omision hasta 10 nM (8+9) aunque tambien 8 solo

H8D(+13-12): UAC ACA CUU UAC CUG UUG AGA AUA G

H8A(+57+83): GCU CAC UUG UUG AGG CAA AAC UUG GAA

H8A(+96+120): GCC UUG GCA ACA UUU CCA CUU CCU G

Oligonucleotidos antisentido dirigidos al exon 9

Se prepararon oligonucleotidos antisentido dirigidos al exon 9 y se sometieron a ensayo para su capacidad de inducir 5 omision exonica en celulas musculares humanas usando metodos similares a los descritos anteriormente.

Tabla 10: secuencias de moleculas antisentido sometidas a ensayo para determinar si inducen la omision del exon 9

H9A(+154+184): AGC AGC CUG UGU GUA GGC AUA GCU CUU GAA U Efecto fuerte hasta 100 nM

H9D(+26-04): AGA CCU GUG AAG GAA AUG GGC UCC GUG UAG Efecto fuerte hasta 200 nM

Oligonucleotidos antisentido dirigidos al exon 10

10

Se prepararon oligonucleotidos antisentido dirigidos al exon 10 y se sometieron a ensayo para su capacidad de inducir omision exonica en celulas musculares humanas usando metodos similares a los descritos anteriormente. Ver la figura 7 para ejemplos de una molecula oligonucleotido antisentido individual y cocteles que inducen la omision de exon 10 y exones circundantes. Molecula oligonucleotido antisentido individual H10A(-05+16) [SEC ID n° 37]: fue capaz de 15 inducir la omision de los exones 9 a 14, mientras que la combinacion con H10A(+98+119) [SEC ID n° 38] fue capaz de inducir la omision del exon 10 solo y los exones 9 a 12 (y cierta omision de los exones 10 a 12). La combinacion de H10A(-05+16) y H10A(+130+149) fue capaz de inducir la omision del exon 10 y de los exones 9 a 12.

Tabla 11: secuencias de moleculas antisentido sometidas a ensayo para determinar si inducen la omision del exon 10

20

H10A(-09+16): CAG GAG CUU CCA AAU GCU GCA CAA U Sin omision

H10A(+08+27): UGA CUU GUC UUC AGG AGC UU Sin omision

H10A(+21+42): CAA UGA ACU GCC AAA UGA CUU G Omision a 100 nM

H10A(+27+51): ACU CUC CAU CAA UGA ACU GCC AAA U Sin omision

H10A(+55+79): CUG UUU GAU AAC GGU CCA GGU UUA C Sin omision

H10A(+80+103): GCC ACG AUA AUA CUU CUU CUA AAG Sin omision

H10D(+16-09): UUA GUU UAC CUC AUG AGU AUG AAA C Sin omision

Cocteles de exon 10

H10A(-05+16): CAG GAG CUU CCA AAU GCU GCA

H10A(+98+119): UCC UCA GCA GAA AGA AGC CAC G Omision fuerte a 200 nM

H10A(-05+16): CAG GAG CUU CCA AAU GCU GCA

H10A(+130+149): UUA GAA AUC UCU CCU UGU GC Omision a 200 nM

Oligonucleotidos antisentido dirigidos al exon 11

Se prepararon oligonucleotidos antisentido dirigidos al exon 11 y se sometieron a ensayo para su capacidad de inducir 25 omision exonica en celulas musculares humanas usando metodos similares a los descritos anteriormente. Vease la figura 37.

Tabla 12: secuencias de moleculas antisentido sometidas a ensayo para determinar si inducen la omision del exon

11

H11A(-07+13): CCA UCA UGU ACC CCU GAC AA Omision a 300 nM

H11A(+134+157): CCC UGA GGC AUU CCC AUC UUG AAU Omision a 100 nM

H11A(+20+45): AUU ACC AAC CCG GCC CUG AUG GGC UG Omision hasta 25 nM

5

10

15

20

25

30

H11A(+46+75): UCC AAU CAG CUU ACU UCC CAA UUG UAG AAU Omision fuerte a 25 nM, ligera senal a 2,5 nM

H11A(+50+75): UCC AAU CAG CUU ACU UCC CAA UUG UA Omision fuerte a 10 nM, debil a 2,5 nM

H11A(+50+79): CUG UUC CAA UCA GCU UAC UUC CCA AUU GUA Omision fuerte a 5 nM, debil a 2,5 nM

H11A(+80+105): AGU UUC UUC AUC UUC UGA UAA UUU UC Omision debil hasta 25 nM

H11A(+106+135): AUU UAG GAG AUU CAU CUG CUC UUG UAC UUC Omision fuerte hasta 25 nM (20%)

H11A(+110+135): AUU UAG GAG AUU CAU CUG CUC UUG UA Omision fuerte hasta 25 nM (20%)

H11A(+110+139): UUG AAU UUA GGA GAU UCA UCU GCU CUU GUA Omision fuerte hasta 25 nM (20%)

Oligonucleotidos antisentido dirigidos al exon 12

Se prepararon oligonucleotidos antisentido dirigidos al exon 12 y se sometieron a ensayo para su capacidad de inducir omision exonica en celulas musculares humanas usando metodos similares a los descritos anteriormente. Vease la figura 38.

Tabla 13: secuencias de moleculas antisentido sometidas a ensayo para determinar si inducen la omision del exon 12

H12D(+06-16): CAU AAG AUA CAC CUA CCU UAU G Sin omision

H12A(+52+75): UCU UCU GUU UUU GUU AGC CAG UCA Omision fuerte

H12A(+30+57): CAG UCA UUC AAC UCU UUC AGU UUC UGA U Omision fuerte a 10 nM, debil a 2,5 nM

H12A(+60+87): UUC CUU GUU CUU UCU UCU GUU UUU GUU A Omision fuerte a 25 nM, debil a 5 nM

H12A(+90+117): AGA UCA GGU CCA AGA GGC UCU UCC UCC A Omision fuerte hasta 25 nM (30%)

H12A(+120+147): UGU UGU UGU ACU UGG CGU UUU AGG UCU U Omision fuerte hasta 25 nM (30%)

Oligonucleotidos antisentido dirigidos al exon 13

Se prepararon oligonucleotidos antisentido dirigidos al exon 13 y se sometieron a ensayo para su capacidad de inducir omision exonica en celulas musculares humanas usando metodos similares a los descritos anteriormente.

Tabla 14: secuencias de moleculas antisentido sometidas a ensayo para determinar si inducen la omision del exon 13

H13A(-12+12): UUC UUG AAG CAC CUG AAA GAU AAA Sin omision

Oligonucleotidos antisentido dirigidos al exon 14

Se prepararon oligonucleotidos antisentido dirigidos al exon 14 y se sometieron a ensayo para su capacidad de inducir omision exonica en celulas musculares humanas usando metodos similares a los descritos anteriormente. Vease la figura 8.

Tabla 15: secuencias de moleculas antisentido sometidas a ensayo para determinar si inducen la omision del exon 14

H14A(+45 +73): GAA GGA UGU CUU GUA AAA GAA CCC AGC GG Omision a 25 nM

Oligonucleotidos antisentido dirigidos al exon 16

Se prepararon oligonucleotidos antisentido dirigidos al exon 16 y se sometieron a ensayo para su capacidad de inducir omision exonica en celulas musculares humanas usando metodos similares a los descritos anteriormente.

Tabla 16: secuencias de moleculas antisentido sometidas a ensayo para determinar si inducen la omision del exon 16

H16A(-07+19): CUA GAU CCG CUU UUA AAA CCU GUU AA Sin omision

H16A(+09+31): GCU UUU UCU UUU CUA GAU CCG CU Sin omision

H16D(+18-07): CAC UAA CCU GUG CUG UAC UCU UUU C Sin omision

Oligonucleotidos antisentido dirigidos al exon 17

Se prepararon oligonucleotidos antisentido dirigidos al exon 17 y se sometieron a ensayo para su capacidad de inducir 5 omision exonica en celulas musculares humanas usando metodos similares a los descritos anteriormente.

T abla 64: secuencias de moleculas antisentido sometidas a ensayo para determinar si ^ inducen la omision del exon 17

H17A(+48+78): UGU GGU CAC CGU AGU UAC UGU UUC CAU UCA A Sin omision

H17A(+55+85): GUU CCC UUG UGG UCA CCG UAG UUA CUG UUU C Omision hasta 100 nM

Oligonucleotidos antisentido dirigidos al exon 18

10

Se prepararon oligonucleotidos antisentido dirigidos al exon 18 y se sometieron a ensayo para su capacidad de inducir omision exonica en celulas musculares humanas usando metodos similares a los descritos anteriormente. Vease la figura 9.

15 Tabla 17: secuencias de moleculas antisentido sometidas a ensayo para determinar si inducen la omision del exon 18

H18A(-09+11): CAA CAU CCU UCC UAA GAC UG Sin omision

H18A(+24+43): GCG AGU AAU CCA GCU GUG AA Omision inconsistente de ambos exones, 17+18

H18A(+41 +70): UUC AGG ACU CUG CAA CAG AGC UUC UGA GCG Omision exones 17+18 300nM

H18A(+83+108): UUG UCU GUG AAG UUG CCU UCC UUC CG Omision exones 17+18 300nM

H18D(+04-16): UUA AUG CAU AAC CUA CAU UG Sin omision

Oligonucleotidos antisentido dirigidos al exon 19

Se prepararon oligonucleotidos antisentido dirigidos al exon 19 y se sometieron a ensayo para su capacidad de inducir 20 omision exonica en celulas musculares humanas usando metodos similares a los descritos anteriormente.

Tabla 18: secuencias de moleculas antisentido sometidas a ensayo para determinar si inducen la omision del exon 19

H19A(+19+48): GGC AUC UUG CAG UUU UCU GAA CUU CUC AGC Omision hasta 25 nM

H19A(+27+54): UCU GCU GGC AUC UUG CAG UUU UCU GAA C Omision hasta 25 nM

H19D(+3-17): UCA ACU CGU GUA AUU ACC GU omision

Oligonucleotidos antisentido dirigidos al exon 20 25

Se prepararon oligonucleotidos antisentido dirigidos al exon 20 y se sometieron a ensayo para su capacidad de inducir omision exonica en celulas musculares humanas usando metodos similares a los descritos anteriormente.

Tabla 19: secuencias de moleculas antisentido sometidas a ensayo para determinar si inducen la omision del exon 20

H20A(+23+47): GUU CAG UUG UUC UGA GGC UUG UUU G Sombra debil a 600 nM

H20A(+140+164): AGU AGU UGU CAU CUG CUC CAA UUG U Sin omision

30 Oligonucleotidos antisentido dirigidos al exon 23

Se prepararon oligonucleotidos antisentido dirigidos al exon 23 y se sometieron a ensayo para su capacidad de inducir omision exonica en celulas musculares humanas usando metodos similares a los descritos anteriormente. Se

5

10

15

20

25

Tabla 65: secuencias de moleculas antisentido sometidas a ensayo para determinar si inducen la omision del exon 23

H23(+69+98)-PNU: CGG CUA AUU UCA GAG GGC GCU UUC UUU GAC Omision hasta 25 nM

Oligonucleotidos antisentido dirigidos al exon 24

Se prepararon oligonucleotidos antisentido dirigidos al exon 24 y se sometieron a ensayo para su capacidad de inducir omision exonica en celulas musculares humanas usando metodos similares a los descritos anteriormente.

T abla 20: secuencias de moleculas antisentido sometidas a ensayo para determinar si inducen la omision del exon 24

H24A(+51 +73): CAA GGG CAG GCC AUU CCU CCU UC Omision fuerte a 25 nM

Oligonucleotidos antisentido dirigidos al exon 25

Se prepararon oligonucleotidos antisentido dirigidos al exon 25 y se sometieron a ensayo para su capacidad de inducir omision exonica en celulas musculares humanas usando metodos similares a los descritos anteriormente. El oligonucleotido H25A(+95+119)-DupA es una molecula antisentido espedfica de paciente.

Tabla 21: secuencias de moleculas antisentido sometidas a ensayo para determinar si inducen la omision del exon 25

H25A(+10+34): UGG GCU GAA UUG UCU GAA UAU CAC Fuerte a 25 nM pero no redujo el producto de longitud completa.

H25D(+06-14): GAG AUU GUC UAU ACC UGU UG muy fuerte a 25 nM

H25A(+10+38): AGA CUG GGC UGA AUU GUC UGA AUA UCA CU Omision fuerte a 5 nM, debil a 2,5 nM

H25A(+95+119)- DupA*: UUG AGU UCU GUU CUC AAG UCU CGA AG Omision fuerte a 25 nM, debil a 5 nM (espedfico de paciente)

H25D(+13-14): GAG AUU GUC UAU ACC UGU UGG CAC AUG Omision fuerte a 10 nM

Oligonucleotidos antisentido dirigidos al exon 26

Se prepararon oligonucleotidos antisentido dirigidos al exon 26 y se sometieron a ensayo para su capacidad de inducir omision exonica en celulas musculares humanas usando metodos similares a los descritos anteriormente. Vease la figura 10.

Tabla 22: secuencias de moleculas antisentido sometidas a ensayo para determinar si inducen la omision del exon 26

H26A(-16+09): GGC AUA GAC CUU CCA CAA AAC AAA C Omision debil a 600 nM y 300 nM

H26A(-7+23): AAG GCC UCC UUU CUG GCA UAG ACC UUC CAC Debil a 600, 300 nM; exones multiples 26 a 29 o 27 a 30

H26A(-03+27): CUU CAA GGC CUC CUU UCU GGC AUA GAC CUU Debil a 600, 300 nM; exones multiples 26 a 29 o 27 a 30

H26A(+5+35): AAC CUC CCU UCA AGG CCU CCU UUC UGG CAU Sin omision

H26A(+24+50): CUU ACA GUU UUC UCC AAA CCU CCC UUC Debil a 600, 300 nM; exones multiples 26 a 29 o 27 a 30

H26D(+06-19): UUU CUU UUU UUU UUU UUA CCU UCA U Debil a 600 nM; exones multiples 26 a 29 o 27 a 30

H26D(+21-04): UUA CCU UCA UCU CUU CAA CUG CUU U Exones multiples 26 a 29 o 27 a 30

H26D(+10-10): UUU UUU UUA CCU UCA UCU CU Sin omision 26 otras bandas

Cocteles de exon 26

H26A(-07+19): CCU CCU UUC UGG CAU AGA CCU UCC AC Omision fuerte bajando hasta 25 nM

H26A(+24+50): CUU ACA GUU UUC UCC AAA CCU CCC UUC

H26A(+68+92): UGU GUC AUC CAU UCG UGC AUC UCU G

Oligonucleotidos antisentido dirigidos al exon 31

Se prepararon oligonucleotidos antisentido dirigidos al exon 31 y se sometieron a ensayo para su capacidad de inducir 5 omision exonica en celulas musculares humanas usando metodos similares a los descritos anteriormente.

T abla 23: secuencias de moleculas antisentido sometidas a ensayo para determinar si inducen la omision del exon 31

H31D(+12-18): UUC UGA AAU UUC AUA UAC CUG UGC AAC AUC Omision hasta 100 nM

H31D(+08-22): UAG UUU CUG AAA UAA CAU AUA CCU GUG CAA Omision hasta 100 nM

H31D(+06-24): CUU AGU UUC UGA AAU AAC AUA UAC CUG UGC Omision hasta 100 nM

H31 D(+02-22): UAG UUU CUG AAA UAA CAU AUA CCU Omision hasta 100 nM

H31D(+01-25): CCU UAG UUU CUG AAA UAA CAU AUA CC Omision fuerte a 300 nM

Oligonucleotidos antisentido dirigidos al exon 32

10

Se prepararon oligonucleotidos antisentido dirigidos al exon 32 y se sometieron a ensayo para su capacidad de inducir omision exonica en celulas musculares humanas usando metodos similares a los descritos anteriormente.

Tabla 24: secuencias de moleculas antisentido sometidas a ensayo para determinar si inducen la omision del exon 32

H32A(+49+78): ACU UUC UUG UAG ACG CUG CUC AAA AUU GGC Omision hasta 100 nM

15

Oligonucleotidos antisentido dirigidos al exon 34

Se prepararon oligonucleotidos antisentido dirigidos al exon 34 y se sometieron a ensayo para su capacidad de inducir omision exonica en celulas musculares humanas usando metodos similares a los descritos anteriormente.

20

Tabla 25: secuencias de moleculas antisentido sometidas a ensayo para determinar si inducen la omision del exon 34

H34A(+36+59): UUU CGC AUC UUA CGG GAC AAU UUC Omision hasta 200 nM

H34A(+41+70): CAU UCA UUU CCU UUC GCA UCU UAC GGG ACA Omision hasta 200 nM

H34A(+43+72): GAC AUU CAU UUC CUU UCG CAU CUU ACG GGA Omision hasta 100 nM

H34A(+51+83): UCU GUC AAG ACA UUC AUU UCC UUU CGC AUC Omision hasta 200 nM

H34A(+91+120): UGA UCU CUU UGU CAA UUC CAU AUC UGU AGC Omision hasta 100 nM

H34A(+92+121): CUG AUC UCU UUG UCA AUU CCA UAU CUG UGG Omision hasta 100 nM

H34A(+95+120): UGA UCU CUU UGU CAA UUC CAU AUC UG Debil hasta 25 nM

H34A(+95+124): CUG CUG AUC UCU UUG UCA AUU CCA UAU CUG Omision hasta 100 nM

Oligonucleotidos antisentido dirigidos al exon 35

Se prepararon oligonucleotidos antisentido dirigidos al exon 35 y se sometieron a ensayo para su capacidad de inducir 25 omision exonica en celulas musculares humanas usando metodos similares a los descritos anteriormente.

T abla 26: secuencias de moleculas antisentido sometidas a ensayo para determinar si inducen la omision del exon ^ 35

Nombre del oligonucleotido: Secuencia Capacidad de inducir

antisentido: omision

H35A(+14+43): UCU UCA GGU GCA CCU UCU GUU UCU CAA UCU Omision hasta 100 nM

H35A(+24+53): UCU GUG AUA CUC UUC AGG UGC ACC UUC UGU Omision hasta 100 nM

Oligonucleotidos antisentido dirigidos al exon 36

Se prepararon oligonucleotidos antisentido dirigidos al exon 36 y se sometieron a ensayo para su capacidad de inducir 5 omision exonica en celulas musculares humanas usando metodos similares a los descritos anteriormente. Vease la figura 11.

Tabla 27: secuencias de moleculas antisentido sometidas a ensayo para determinar si inducen la omision del exon 36

H36A(-16+09): CUG GUA UUC CUU AAU UGU ACA GAG A Sin omision

H36A(-01 + 19): CCA UGU GUU UCU GGU AUU CC Omision muy debil a 300 nM

H36A(+10+39): CAC AUU CUG GUC AAA AGU UUC CAU GUG UUU Omision hasta 25 nM

H36A(+22+51): UGU GAU GUG GUC CAC AUU CUG GUC AAA AGU Omision a 100 nM

H36A(+27+51): UGU GAU GUG GUC CAC AUU CUG GUC A Omision a 100 nM

H36A(+27+56): CAC UUU GUG AUG UGG UCC ACA UUC UGG UCA Omision a 300 nM

H36A(+32+61): UGA UCC ACU UUG UGA UGU GGU CCA CAU UCU Omision hasta 25 nM

H36A(+59+78): AAG UGU GUC AGC CUG AAU GA Omision muy debil

H36A(+65+94): UCU CUG AUU CAU CCA AAA GUG UGU CAG CCU 100% omision a 600 nM, omision hasta 25 nM

H36A(+80+109): GCU GGG GUU UCU UUU UCU CUG AUU CAU CCA 100% omision a 600 nM, omision hasta 25 nM

H36D(+15-10): UAU UUG CUA CCU UAA GCA CGU CUU C Omision muy debil

Cocteles de exon 36

H36A(-16+09): CUG GUA UUC CUU AAU UGU ACA GAG A

H36A(+22+51): UGU GAU GUG GUC CAC AUU CUG GUC AAA AGU Buen nivel de omision bajando hasta 25 nM

10 Oligonucleotidos antisentido dirigidos al exon 38

Se prepararon oligonucleotidos antisentido dirigidos al exon 38 y se sometieron a ensayo para su capacidad de inducir omision exonica en celulas musculares humanas usando metodos similares a los descritos anteriormente.

15 Tabla 28: secuencias de moleculas antisentido sometidas a ensayo para determinar si ^ inducen la omision del exon 38

H38A(-21-01): CUA AAA AAA AAG AUA GUG CUA Omision hasta 25 nM

H38A(-12+14): AAA GGA AUG GAG GCC UAA AAA AAA AG Omision hasta 25 nM

H38D(+14-11): AAC CAA UUU ACC AUA UCU UUA UUG A Omision hasta 25 nM

Oligonucleotidos antisentido dirigidos al exon 39

Se prepararon oligonucleotidos antisentido dirigidos al exon 39 y se sometieron a ensayo para su capacidad de inducir 20 omision exonica en celulas musculares humanas usando metodos similares a los descritos anteriormente.

Tabla 29: secuencias de moleculas ^ antisentido sometidas a ensayo para determinar si inducen la omision del exon 39

H39A(-07+23): ACA GUA CCA UCA UUG UCU UCA UUC UGA UC Omision hasta 600 nM

H39A(-07+23): ACA GUA CCC UCA UUG UCU UCA UUC UGA UC Omision hasta 600 nM

H39A(+58+87): CUC UCG CUU UCU CUC AUC UGU GAU UCU UUG Omision hasta 100 nM

H39A(+60+89): UCC UCU CGC UUU CUC UCA UCU GUG AUU CUU Omision hasta 100 nM

H39A(+102+126): UAU GUU UUG UCU GUA ACA GCU GCU G Omision hasta 600 nM

Oligonucleotidos antisentido dirigidos al exon 41

Se prepararon oligonucleotidos antisentido dirigidos al exon 41 y se sometieron a ensayo para su capacidad de inducir 5 omision exonica en celulas musculares humanas usando metodos similares a los descritos anteriormente.

Tabla 30: secuencias de moleculas antisentido sometidas a ensayo para determinar si inducen la omision del exon 41

H41A(-15+5): AUU UCC UAU UGA GCA AAA CC Omision bajando hasta 200 nM

H41A(+66+90): CAU UGC GGC CCC AUC CUC AGA CAA G Omision baiando hasta 100 nM

H41A(+92+120): GCU GAG CUG GAU CUG AGU UGG CUC CAC UG Omision bajando hasta 10 nM

H41A(+143+171): GUU GAG UCU UCG AAA CUG AGC AAA UUU GC Sin omision visible

H41 D(+5-15): CCA GUA ACA ACU CAC AAU UU Omision bajando hasta 200 nM

Oligonucleotidos antisentido dirigidos al exon 42

10

Se prepararon oligonucleotidos antisentido dirigidos al exon 42 y se sometieron a ensayo para su capacidad de inducir omision exonica en celulas musculares humanas usando metodos similares a los descritos anteriormente.

Tabla 31: secuencias de moleculas antisentido sometidas a ensayo para determinar si inducen la omision del exon 20

Exon 42

H42D(+18-02): ACC UUC AGA GAC UCC UCU UGC Omision fuerte

15

Oligonucleotidos antisentido dirigidos al exon 43

Se prepararon oligonucleotidos antisentido dirigidos al exon 43 y se sometieron a ensayo para su capacidad de inducir omision exonica en celulas musculares humanas usando metodos similares a los descritos anteriormente. Vease la 20 figura 12.

Tabla 32: secuencias de moleculas antisentido sometidas a ensayo para determinar si inducen la omision del exon ^ 20

Exon 43

H43A(+83+110): UCC UGU AGC UUC ACC CUU UCC ACA GGC G Sin omision

H43A(+92 +117): GAG AGC UUC CUG UAG CUU CAC CCU UU Omision a 10 nM

H43A(+101 +130): AAU CA GCU GGG AGA GAG CUU CCU GUA GCU Sin omision

H43D(+08-12): UGU GUU ACC UAC CCU UGU CG Omision bajando hasta 200 nM

H43A(-09+18): UAG ACU AUC UUU UAU AUU CUG UAA UAU Omision debil hasta 25 nM

H43A(+89+117): GAG AGC UUC CUG UAG CUU CAC CCU UUC CA Omision fuerte a 25 nM, debil a 2,5 nM

H43A(+81+111): UUC CUG UAG CUU CAC CCU UUC CAC AGG CGU U Omision fuerte a 50 nM, debil a 2,5 nM

H43A(+92+114): AGC UUC CUG UAG CUU CAC CCU UU Omision debil hasta 2,5 nM

H43A(+92+120): GGA GAG AGC UUC CUG UAG CUU CAC CCU UU Omision fuerte a 10 nM, debil a 5 nM

H43A(+95+117): GAG AGC UUC CUG UAG CUU CAC CC Omision fuerte a 25 nM, debil a 10 nM

Oligonucleotidos antisentido dirigidos al exon 44 25

5 Tabla 33: secuencias de moleculas antisentido sometidas a ensayo para determinar si inducen la omision del exon 44

Exon 44

H44A(-13+13): UCU GUC AAA UCG CCU GCA GGU AAA AG

H44A(-06+24): UUC UCA ACA GAU CUG UCA AAU CGC CUG CAG Sin omision

H44A(+44+68): GCC ACU GAU UAA AUA UCU UUA UAU C Omision a 100 nM

H44A(+46+75): UCU GUU AGC CAC UGA UUA AAU AUC UUU AUA Omision a 50 nM

H44A(+61 +84): UGU UCA GCU UCU GUU AGC CAC UGA Omision a 100 nM

H44A(+61+91): GAG AAA CUG UUC AGC UUC UGU UAG CCA CUG A Omision a 25 nM

H44A(+65+90): UGU UCA GCU UCU GUU AGC CAC UGA Omision a 10 nM

H44A(+68+98): UCU UUC UGA GAAACU GUU CAG CUU CUG UUA G Debil a 50 nM

H44A(-09+17): CAG AUC UGU CAA AUC GCC UGC AGG UA Omision debil hasta 10 nM

H44A(-06+20): CAA CAG AUC UGU CAA AUC GCC UGC AG Omision debil hasta 2,5 nM

H44A(+56+88): AAA CUG UUC AGC UUC UGU UAG CCA CUG AUU AAA ____ _ Omision fuerte a 5 nM, debil a 2,5 nM

H44A(+59+85): CUG UUC AGC UUC UGU UAG CCA CUG AUU Omision fuerte a 5 nM

H44A(+59+89): GAA ACU GUU CAG CUU CUG UUA GCC ACU GAU U Omision debil hasta 10 nM

H44A(+61+88): AAA CUG UUC AGC UUC UGU UAG CCA CUG A Omision debil hasta 25 nM

H44A(+65+92): UGA GAAACU GUU CAG CUU CUG UUA GCC A Omision debil hasta 25 nM

H44A(+64+95): UUC UGA GAA ACU GUU CAG CUU CUG UUA GCCA C __ . . _ _ Omision debil hasta 25 nM

H44A(+70+95): UUC UGA GAA ACU GUU CAG CUU CUG UU Omision debil hasta 50 nM

Oligonucleotidos antisentido dirigidos al exon 45

Se prepararon oligonucleotidos antisentido dirigidos al exon 45 y se sometieron a ensayo para su capacidad de inducir 10 omision exonica en celulas musculares humanas usando metodos similares a los descritos anteriormente. Ver las figuras 14 y 40.

Tabla 34: secuencias de moleculas antisentido sometidas a ensayo para determinar si inducen la omision del exon 45

Exon 45

H45A(-14+25): GCU GCC CM UGC CAU CCU GGA GUU CCU GUA AG Genera multiples bandas

H45A(-10 +20): CCA AUG CCA UCC UGG AGU UCC UGU AAG AUA Omision a 10 nM

H45A(-09+30): UUG CCG CUG CCC AAU GCC AUC CUG GAG UUC CUG UAAGAU Sin omision

H45A (-09+2b): GCU GCC CAA UGC CAU CCU GGA GUU CCU GUA AGA U Omision a 10 nM (omision de 100% a 25 nM)

H45A(-08 +19): CAA UGC CAU CCU GGA GUU CCU GUA AGA Omision a 50 nM

HM45A(-07+25): GCU GCC CM UGC CAU CCU GGA GUU CCU GUA AG Omision a 25 nM

H45A(+09 +34): CAG UUU GCC GCU GCC CAA UGC CAU CC Sin omision

H45A(+41 +64): CUU CCC CAG UUG CAU UCA AUG UUC Sin omision

H45A(+76 +98): CUG GCA UCU GUU UUU GAG GAU UG Sin omision

H45D(+02-18): UUA GAU CUG UCG CCC UAC CU Sin omision

H45A(-14+25): GCU GCC CM UGC CAU CCU GGA GUU CCU GUA AGA UAC CM

H45A(-12+22): GCC CM UGC CAU CCU GGA GUU CCU GUA AGA UAC C Omision fuerte a 5 nM, debil a 2,5 nM

H45A(-12+13): CAU CCU GGA GUU CCU GUA AGA UAC C Sin omision

H45A(-12+16): UGC CAU CCU GGA GUU CCU GUA AGA UAC C Omision fuerte a 25 nM, debil a 5 nM

H45A(-09+16): UGC CAU CCU GGA GUU CCU GUA AGA U Omision hasta 10 nM

H45A(-09+19): CAA UGC CAU CCU GGA GUU CCU GUA AGA Omision fuerte a 25 nM, debil a 2,5 nM

H45A(-09+22): GCC CAA UGC CAU CCU GGA GUU CCU GUA AGA U Omision fuerte a 10 nM, debil a 5 nM

H45A(-09+30): UUG CCG CUG CCC MU GCC AUC CUG GAG UUC CUG UM GAU Omision fuerte a 5 nM, debil a 2,5 nM

HM45A(-07+25): GCU GCC CM UGC CAU CCU GGA GUU CCU GUA AG Omision fuerte a 2,5 nM

H45A(-06+22): GCC CAA UGC CAU CCU GGA GUU CCU GUA A Omision fuerte a 5 nM, debil a 2,5 nM

H45A(-06+28): GCC GCU GCC CM UGA CAU CCU GGA GUU CCU GUA A Omision fuerte a 2,5 nM

H45A(-03+19): CAA UGC CAU CCU GGA GUU CCU G Omision fuerte a 5 nM, debil a 2,5 nM

H45A(-03+22): GCC CAA UGC CAU CCU GGA GUU CCU G Omision fuerte a 10 nM, debil a 2,5 nM

H45A(-03+25): GCU GCC CAA UGC CAU CCU GGA GUU CCU G Omision fuerte a 2,5 nM

H45A(-03+28): GCC GCU GCC CAA UGC CAU CCU GGA GUU CCU G Omision fuerte a 10 nM, debil a 2,5 nM

H45D(+10-19): AUU AGA UCU GUC GCC CUA CCU CUU UUU UC Sin omision

H45D(+16-11): UGU CGC CCU ACC UCU UUU UUC UGU CUG Sin omision

H45A(-06+25): GCU GCC CAA UGC CAU CCU GGA GUU CCU GUA A Omision fuerte a 2,5 nM

H45A(-12+19): CAA UGC CAU CCU GGA GUU CCU GUA AGA UAC C Omision fuerte a 25 nM

Tabla 35: secuencias de moleculas antisentido sometidas a ensayo para determinar si inducen la omision del exon 46

Exon 46

H46A(-05+19): AUU CUU UUG UUC UUC UAG CCU GGA Sin omision

H46A(+16+42): UCU CUU UGA AAU UCU GAC AAG AUA UUC Omision hasta 25 nM, otras bandas

H46A(+27+44): UUA AAU CUC UUU GAA AUU CU Sin omision

H46A(+35+60): AAA ACA AAU UCA UUU AAA UCU CUU UG Omision muy debil hasta 50 nM

H46A(+56+77): CUG CUU CCU CCA ACC AUA AAA C Sin omision

H46A(+63+87): GCA AUG UUA UCU GCU UCC UCC AAC C Sin omision

H46A(+81+109): UCC AGG UUC AAG UGG GAU ACU AGC AAU GU Omision fuerte a 25 nM

H46A(+83+103): UUC AAG UGG GAU ACU AGC AAU Omision a 25 nM

H46A(+90+109): UCC AGG UUC AAG UGG GAU AC Sin omision

H46A(+91+118): CUG CUC UUU UCC AGG UUC AAG UGG GAU A Omision fuerte a 25 nM

H46A(+95+122): GUU GCU GCU CUU UUC CAG GUU CAA GUG G Omision fuerte a 25 nM

H46A(+101+128): CUU UUA GUU GCU GCU CUU UUC CAG GUU C Omision fuerte a 25 nM

H46A(+113+136): AAG CUU UUC UUU UAG UUG CUG CUC Omision a 100 nM

H46A(+115+134): GCU UUU CUU UUA GUU GCU GC Omision a 100 nM

H46A(+116+145): GAC UUG CUC AAG CUU UUC UUU UAG UUG CUG Omision fuerte a 25 nM

H46D(+02-18): UUC AGA AAA UAA AAU UAC CU Sin omision

H46A(+93+122): GUU GCU GCU CUU UUC CAG GUU CAA GUG GGA 100% de omision a 25 nM, fuerte a 5 nM

H46A(+95+124): UAG UUG CUG CUC UUU UCC AGG UUC AAG UGG 100% de omision a 25 nM

Cocteles de oligonucleotidos antisentido dirigidos a los exones 44 a 46

10

Se prepararon cocteles de oligonucleotidos antisentido dirigidos a los exones 44 a 46 y se sometieron a ensayo para su capacidad de inducir omision exonica en celulas musculares humanas usando metodos similares a los descritos anteriormente.

15 _____Tabla 36: cocteles de ^ secuencias de molecula antisentido que inducen la omision de los exones 44 a 45

Cocteles para la omision de 44 + 45

H44A(+65 +90): AGA AAC UGU UCA GCU UCU GUU AGC CA

H45A(-10 +20): CCA AUG CCA UCC UGG AGU UCC UGU AAG AUA Omision a 25 nM

Cocteles para la omision de los exones 45 y 46

H45A(-10 +20): CCA AUG CCA UCC UGG AGU UCC UGU AAG AUA

H46A(+91 +118): CUG CUC UUU UCC AGG UUC AGG UGG GAU A Omision a 25 nM

H45A(-10 +20): CCA AUG CCA UCC UGG AGU UCC UGU AAG AUA

H46A(+107 +137): CAA GCU UUU CUU UUA GUU GCU GCU CUU UUC C Omision a 25 nM

Coctel para la omision de los exones 44/45/46

H45A(-10 +20): CCA AUG CCA UCC UGG AGU UCC UGU AAG AUA

H44A(+65 +90): AGA AAC UGU UCA GCU UCU GUU AGC CA

H46A(+91 +118): CUG CUC UUU UCC AGG UUC AGG UGG GAU A Omision a 25 nM

Oligonucleotidos antisentido dirigidos al exon 47

Se prepararon oligonucleotidos antisentido dirigidos al exon 47 y se sometieron a ensayo para su capacidad de inducir omision exonica en celulas musculares humanas usando metodos similares a los descritos anteriormente. Vease la 5 figura 16.

Tabla 37: secuencias de moleculas antisentido sometidas a ensayo para determinar si inducen la omision del exon 47

Exon 47

H47A(-07+19): GCA ACU CUU CCA CCA GUA ACU GAA AC Omision a 100 nM

H47A(+01+29): UGG CGC AGG GGC AAC UCU UCC ACC AGU AA Omision fuerte a 25 nM

H47A(+44+70): GCA CGG GUC CUC CAG UUU CAU UUA AUU Omision a 600 nM

H47A(+68+92): GGG CUU AUG GGA GCA CUU ACA AGC A Sin omision

H47A(+73+103): CUU GCU CUU CUG GGC UUA UGG GAG CAC UUA C Sin omision

H47A(+76+103): CUU GCU CUU CUG GGC UUA UGG GAG CAC U Omision debil a 200 nM, no se reduce la cantidad de producto de longitud completa

H47D(+17-10): AAU GUC UAA CCU UUA UCC ACU GGA GAU Sin omision

Oligonucleotidos antisentido dirigidos al exon 48

10

Se prepararon oligonucleotidos antisentido dirigidos al exon 48 y se sometieron a ensayo para su capacidad de inducir omision exonica en celulas musculares humanas usando metodos similares a los descritos anteriormente. Vease la figura 17.

15 Tabla 38: secuencias de moleculas antisentido sometidas a ensayo para determinar si inducen la omision del exon 48

Exon 48

H48A(-09+21): CUC AGG UAA AGC UCU GGA AAC CUG AAA GGA Sin omision

H48A(-08+19): CAG GUA AAG CUC UGG AAA CCU GAA AGG Sin omision

H48A(-07+23): UUC UCA GGU AAA GCU CUG GAA ACC UGA AAG Omision a 600, 300 nM

H48A(-05+25): GUU UCU CAG GUA AAG CUC UGG AAA CCU GAA Sin omision

H48A(+01+28): CUU GUU UCU CAG GUA AAG CUC UGG AAA C Debil hasta 50 nM

H48A(+07+33): UUC UCC UUG UUU CUC AGG UAA AGC UCU Debil hasta 50 nM

H48A(+40+67): CAA GCU GCC CAA GGU CUU UUA UUU GAG C Sin emision (esporadica)

H48A(+75+100): UUA ACU GCU CUU CAA GGU CUU CAA GC Debil hasta 1.000 nM

H48A(+96+122): GAU AAC CAC AGC AGC AGA UGA UUU AAC Sin omision

H48D(+17-10): AGU UCC CUA CCU GAA CGU CAA AUG GUC Sin omision

H48D(+16-09): GUU CCC UAC CUG AAC GUC AAA UGG U Sin omision

Coctel 48

H48A(+01+28): CUU GUU UCU CAG GUA AAG CUC UGG AAA C Omision fuerte a 25 nM

H48A(+40+67): CAA GCU GCC CAA GGU CUU UUA UUU GAG C

Oligonucleotidos antisentido dirigidos al exon 49

Se prepararon oligonucleotidos antisentido dirigidos al exon 49 y se sometieron a ensayo para su capacidad de inducir 20 omision exonica en celulas musculares humanas usando metodos similares a los descritos anteriormente. Vease la figura 18.

Tabla 39: secuencias de moleculas antisentido sometidas a ensayo para determinar si inducen la omision del exon 49

Exon 49

H49A(-07+19): GAA CUG CUA UUU CAG UUU CCU GGG GA Omision hasta 100 nM

H49A(+22+47): AUC UCU UCC ACA UCC GGU UGU UUA GC Omision hasta 25 nM

H49A(+45+70): ACA AAU GCU GCC CUU UAG ACA AAA UC Omision hasta 25 nM

H49D(+18-08): UUC AUU ACC UUC ACU GGC UGA GUG GC Omision hasta 100 nM

Oligonucleotidos antisentido dirigidos al exon 50

5 Se prepararon oligonucleotidos antisentido dirigidos al exon 50 y se sometieron a ensayo para su capacidad de inducir omision exonica en celulas musculares humanas usando metodos similares a los descritos anteriormente. Ver las figuras 19 y 33

Tabla 40: secuencias de moleculas antisentido sometidas a ensayo para determinar si inducen la omision del exon ^ 50

Exon 50

H50A(-07+20): CUC AGA UCU UCU AAC UUC CUC UUU AAC Omision debil a 25 nM

H50A(-02+27): CUC AGA GCU CAG AUC UUC UAA CUU CCU CU Omision debil a 100 nM

H50A(+10+36): CGC CUU CCA CUC AGA GCU CAG AUC UUC Omision debil hasta 25

H50A(+35+61): UCA GCU CUU GAA GUA AAC GGU UUA CCG Omision fuerte hasta 25 nM

H50A(+42+68): UUU GCC CUC AGC UCU UGA AGU AAA CGG Omision razonable hasta 25 nM

H50A(+48+74): GGC UGC UUU GCC CUC AGC UCU UGA AGU Omision fuerte a 25 nM

H50A(+63+88): CAG GAG CUA GGU CAG GCU GCU UUG CC Omision fuerte hasta 25 nM

H50A(+81+105): UCC AAU AGU GGU CAG UCC AGG AGC U

H50D(-01-27): AAA GAG AAU GGG AUC CAG UAU ACU UAC Omision debil a 100 nM

H50D(-15-41): AAA UAG CUA GAG CCA AAG AGA AUG GGA Sin omision

H50A(+42+74): GGC UGC UUU GCC CUC AGC UCU UGA AGU AAA CGG • Omision fuerte a 10 nM, debil a 5 nM

H50A(+46+75): AGG CUG CUU UGC CCU CAG CUC UUG AAG UAA Omision fuerte a 25 nM, debil a 10 nM

H50A(+48+78): GUC AGG CUG CUU UGC CCU CAG CUC UUG AAG U Omision fuerte a 10 nM, debil a 2,5 nM

H50A(+51 +80): AGG UCA GGC UGC UUU GCC CUC AGC UCU UGA Omision fuerte a 25 nM, debil a 2,5 nM

Hint49(-72-46): AAG AUA AUU CAU GAA CAU CUU AAU CCA Sin omision

10

Oligonucleotidos antisentido dirigidos al exon 51

Se prepararon oligonucleotidos antisentido dirigidos al exon 51 y se sometieron a ensayo para su capacidad de inducir omision exonica en celulas musculares humanas usando metodos similares a los descritos anteriormente. Ver las 15 figuras 20 y 41.

Tabla 41: secuencias de moleculas antisentido sometidas a ensayo para determinar si inducen la omision del exon 51

Exon 51

H51A(-29-10): UUU GGG UUU UUG CAA AAA GG Sin omision

H51A(-22-01): CUA AAA UAU UUU GGG UUU UUG C Sin omision

H51A(-14+10): UGA GUA GGA GCU AAA AUA UUU UGG Sin omision

H51(+26+52): GUU UCC UUA GUA ACC ACA GGU UGU GUC Omision muy debil hasta 25 nM

H51A(+40+67): AGU UUG GAG AUG GCA GUU UCC UUA GUA A Omision hasta 25 nM, tambien omite 50 o 52

H51A(+66+77): UGG CAU UUC UAG Sin omision

H51A(+66+80): AGA UGG CAU UUC UAG Sin omision

H51A(+66+83): GGA AGA UGG CAU UUC UAG Sin omision

H51A(+78+95): CUC CAA CAU CAA GGA AGA Sin omision

H51A(+81+95): CUC CAA CAU CAA GGA Sin omision

H51A(+84+95): CUC CAA CAU CAA Sin omision

H51A(+90+116): GAA AUC UGC CAG AGC AGG UAC CUC CAA Sin omision

H51A(+53+79): GAU GGC AUU UCU AGU UUG GAG AUG GCA Omision fuerte a 25 nM

H51A(+57+85): AAG GAA GAU GGC AUU UCU AGU UUG GAG AU Omision fuerte a 25 nM, debil a 2,5 nM

H51A(+71 + 100): GGU ACC UCC AAC AUC AAG GAA GAU GGC AUU Omision fuerte a 5 nM

H51A(+76+104): AGC AGG UAC CUC CAA CAU CAA GGA AGA UG Omision fuerte a 25 nM

Oligonucleotidos antisentido dirigidos al exon 52

Se prepararon oligonucleotidos antisentido dirigidos al exon 52 y se sometieron a ensayo para su capacidad de inducir 5 omision exonica en celulas musculares humanas usando metodos similares a los descritos anteriormente. Vease la figura 42.

Tabla 42: secuencias de moleculas antisentido sometidas a ensayo para determinar si inducen la omision del exon 52

Exon 52

H52A(-12+13): CCU GCA UUG UUG CCU GUA AGA ACA A Sin omision

H52A(-10+10): GCA UUG UUG CCU GUA AGA AC Sin omision

H52A(+07+33): GGG ACG CCU CUG UUC CAA AUC CUG CAU Omision a 50 nM

H52A(+17+46): GUU CUU CCA ACU GGG GAC GCC UCU GUU CCA Omision a 25 nM

H52A(+17+37): ACU GGG GAC GCC UCU GUU CCA Omision a 25 nM

H52A(+67+94): CCU CUU GAU UGC UGG UCU UGU UUU UCA A Omision extremadamente debil a 25 nM

Hint51(-40-14): UAC CCC UUA GUA UCA GGG UUC UUC AGC Sin omision (PNU C o T)

H52A(+09+38): AAC UGG GGA CGC CUC UGU UCC AAA UCC UGC Omision fuerte a 2,5 nM

H52A(+09+41): Omision fuerte hasta 5 nM, debil a 5 nM

UCC AAC UGG GGA CGC CUC UGU UCC AAA UCC UGC .. _____ _

H52A(+15+44): UCU UCC AAC UGG GGA CGC CUC UGU UCC AAA Omision fuerte hasta 10 nM, debil a 5 nM

10 Oligonucleotidos antisentido dirigidos al exon 53

Se prepararon oligonucleotidos antisentido dirigidos al exon 53 y se sometieron a ensayo para su capacidad de inducir omision exonica en celulas musculares humanas usando metodos similares a los descritos anteriormente. Vease la figura 43.

15

T abla 43: secuencias de moleculas antisentido sometidas a ensayo para determinar si inducen la omision del exon 53

Exon 53

H53A(-49-26): AUA GUA GUA AAU GCU AGU CUG GAG Sin omision

H53A(-38-13): GAA AAA UAA AUA UAU AGU AGU AAA UG Sin omision

H53A(-32-06): AUA AAA GGA AAA AUA AAU AUA UAG UAG Sin omision

H53A(-15+15): UCU GAA UUC UUU CAA CUA GAA UAA AAG GAA Sin omision

H53A(+39+65): CAA CUG UUG CCU CCG GUU CUG AAG GUG Omision a 50 nM

H53A(+39+67): UUC AAC UGU UGC CUC CGG UUC UGA AGG UG Omision a 100 nM

H39A(+39+69)-PNU: CGU UCA ACU GUU GCC UCC GGU UCU GAA GGU G Omision hasta 25 nM

H53A(+40+70): UCA UUC AAC UGU UGC CUC CGG UUC UGA AGG U Omision a 50 nM

H53A(+41+69): CAU UCA ACU GUU GCC UCC GGU UCU GAA GG Omision a 50 nM

H53A(+43+69): CAU UCA ACU GUU GCC UCC GGU UCU GAA Omision a 50 nM

H53A(+69+98): CAG CCA UUG UGU UGA AUC CUU UAA CAU UUC Omision a 50 nM

Hint52(-47-23): UAU AUA GUA GUA AAU GCU AGU CUG G Sin omision

H53A(+27+56): CCU CCG GUU CUG AAG GUG UUC UUG UAC UUC Omision fuerte a 25 nM, debil a 5 nM

H53A(+27+59): UUG CCU CCG GUU CUG AAG GUG UUC UUG UAC UUC Omision fuerte a 10 nM, debil a 5 nM

H53A(+30+59): UUG CCU CCG GUU CUG AAG GUG UUC UUG UAC

H53A(+30+64): AAC UGU UGC CUC CGG UUC UGA AGG UGU UCU UGU AC Omision fuerte a 25 nM, debil a 10 nM

H53A(+30+69): CAU UCA ACU GUU GCC UCC GGU UCU GAA GGU GUU CUU GUA C Omision fuerte a 25 nM, debil a 5 nM

H53A(+33+63): ACU GUU GCC UCC GGU UCU GAA GGU GUU CUU G Omision fuerte a 25 nM, debil a 5 nM

H53A(+33+67): UUC AAC UGU UGCCUC CGG UUC UGA AGG UGU UCU UG Omision fuerte a 50 nM, debil a 5 nM

H53A(+33+65): CAA CUG UUG CCU CCG GUU CUG AAG GUG UUC UUG Omision fuerte a 25 nM, debil a 2,5 nM

H53A(+35+67): UUC AAC UGU UGC CUC CGG UUC UGA AGG UGU UCU Omision fuerte hasta 25 nM

H53A(+37+67): UUC AAC UGU UGC CUC CGG UUC UGA AGG UGU U Omision fuerte hasta 25 nM

H53A(+36+70): Omision razonable hasta 5 nM

UCA UUC AAC UGU UGC CUC CGG UUC UGA AGG UGU UC •

H53A(+39+71): UUC AUU CAA CUG UUG CCU CCG GUU CUG AAG GUG Omision fuerte hasta 25 nM

H53A(+42+71): UUC AUU CAA CUG UUG CCU CCG GUU CUG AAG Omision fuerte a 100 nM, debil a 5 nM

Oligonucleotidos antisentido dirigidos al exon 54

Se prepararon oligonucleotidos antisentido dirigidos al exon 54 y se sometieron a ensayo para su capacidad de inducir 5 omision exonica en celulas musculares humanas usando metodos similares a los descritos anteriormente. Vease la figura 21.

Tabla 44: secuencias de moleculas ^ antisentido sometidas a ensayo para determinar si inducen la omision del exon 54

Exon 54

H54A(+13+34): UUG UCU GCC ACU GGC GGA GGU C Omision a 300 nM, produce 55+54

H54A(+60+90): AUC UGC AGA AUA AUC CCG GAG AAG UUU CAG Omision a 25 nM

H54A(+67+89): UCU GCA GAA UAA UCC CGG AGA AG Omision debil hasta 40 nM - ambos, 54+55

H54A(+67+97): UGG UCU CAU CUG CAG AAU AAU CCC GGA GAA G Omision a 10 nM

H54A(+77+106): GGA CUU UUC UGG UAU CAU CUG CAG AAU AAU Omision a 50 nM

Coctel para los exones 54+55

H54A(+67+97): UGG UCU CAU CUG CAG AAU AAU CCC GGA GAA G Espedfico para la omision de 54 y 55 a 10 nM

H55A(-10+14): CUC GCU CAC UCA CCC UGC AAA GGA Sin bandas adicionales

Tabla 45: secuencias de moleculas antisentido sometidas a ensayo para determinar si inducen la omision del exon 55

Exon 55

H55A(-10+14): CUC GCU CAC UCA CCC UGC AAA GGA Sin omision

H55A(-10 +20): CAG CCU CUC GCU CAC UCA CCC UGC AAA GGA Omision a 10 nM

H55A(+39 +61): CAG GGG GAA CUG UUG CAG UAA UC Sin omision

H55A(+41+71): UCU UUU ACU CCC UUG GAG UCU UCU AGG AGC C Sin omision

H55A(+73+93): UCU GUA AGC CAG GCA AGA AAC Sin omision

H55A(+107+137): CCU UAC GGG UAG CAU CCU GAU GGA CAU UGG C Sin omision

H55A(+112+136): CUU ACG GGU AGC AUC CUG UAG GAC A Omision muy debil a 100 nM

H55A(+132+161): CCU UGG AGU CUU CUA GGA GCC UUU CCU UAC Omision a 200 nM

H55A(+141+160): CUU GGA GUC UUC UAG GAG CC Omision a 100 nM

H55A(+143 +171): CUC UUU UAC UCC CUU GGA GUC UUC UAG GAG Sin omision

H55D(+11-09): CCU GAC UUA CUU GCC AUU GU Sin omision

Oligonucleotidos antisentido dirigidos al exon 56

10

Se prepararon oligonucleotidos antisentido dirigidos al exon 56 y se sometieron a ensayo para su capacidad de inducir omision exonica en celulas musculares humanas usando metodos similares a los descritos anteriormente. Vease la figura 23.

15 Tabla 46: secuencias de moleculas antisentido sometidas a ensayo para determinar si ^ inducen la omision del exon 56

Exon 56

H56A(-06+23): GCU UCA AUU UCA CCU UGG AGG UCC UAC AG Omision a 25 nM

H56A(-06+15): UUC ACC UUG GAG GUC CUA CAG Sin omision

H56A(+23+44): GUU GUG AUA AAC AUC UGU GUG A Sin omision

H56A(+56 +81): CCA GGG AUC UCA GGA UUU UUU GGC UG Sin omision

H56A(+67+91): CGG AAC CUU CCA GGG AUC UCA GGA U Omision a 200 nM

H56A(+92+121): CCA AAC GUC UUU GUA ACA GGA CUG CAU Omision a 25 nM

H56A(+102+126): GUU AUC CAA ACG UCU UUG UAA CAG G Omision a 100 nM

H56A(+102+131): UUC AUG UUA UCC AAA CGU CUU UGU AAC AGG Omision a 25 nM

H56A(+112+141): CCA CUU GAA GUU CAU GUU AUC CAA ACG UCU Omision a 25 nM

H56A(+117+146): UCA CUC CAC UUG AAG UUC AUG UUA UCC AAA Omision debil a 25 nM

H56A(+121+143): CUC CAC UUG AAG UUC AUG UUA UC Sin omision

H56D(+11-10): CUU UUC CUA CCA AAU GUU GAG Omision a 600 nM

Oligonucleotidos antisentido dirigidos al exon 57

Se prepararon oligonucleotidos antisentido dirigidos al exon 57 y se sometieron a ensayo para su capacidad de inducir 20 omision exonica en celulas musculares humanas usando metodos similares a los descritos anteriormente. Vease la figura 24.

Tabla 47: secuencias de moleculas antisentido sometidas a ensayo para determinar si inducen la omision del exon 57

Exon 57

H57A(-15+18): CUG GCU UCC AAA UGG GAC CUG AM AAG MC AGC . Sin omision

H57A(-12+18): CUG GCU UCC AAA UGG GAC CUG AAA AAG AAC Omision a 50 nM

H57A(-10+20): AAC UGG CUU CCA AAU GGG ACC UGA AAA AGA Omision a 300 nM

H57A(-06 +24): UCA GAA CUG GCU UCC AAA UGG GAC CUG AAA Omision a 300 nM

H57A(+21+44): GGU GCA GAC GCU UCC ACU GGU CAG Sin omision

H57A(+47 +77): GCU GUA GCC ACA CCA GAA GUU CCU GCA GAG A Sin omision

H57A(+79+103): CUG CCG GCU UAA UUC AUC AUC UUU C Sin omision

H57A(+105+131): CUG CUG GAA AGU CGC CUC CAA UAG GUG Sin omision

Oligonucleotidos antisentido dirigidos al exon 59

Se prepararon oligonucleotidos antisentido dirigidos al exon 59 y se sometieron a ensayo para su capacidad de inducir 5 omision exonica en celulas musculares humanas usando metodos similares a los descritos anteriormente. Vease la figura 25.

T abla 48: secuencias de moleculas antisentido sometidas a ensayo para determinar si inducen la omision del exon ^ 59

Exon 59

H59A(-06+16): UCC UCA GGA GGC AGC UCU AAA U Sin omision

H59A(+31 +61): UCC UC GCC UGC UUU CGU AGA AGC CGA GUG A Sin omision

H59A(+66+91): AGG UUC AAU UUU UCC CAC UCA GUA UU Sin omision

H59A(+96 +120): CUA UUU UUC.UCU GCC AGU CAG CGG A Omision a 100 nM

H59A(+96+125): CUC AUC UAU UUU UCU CUG CCA GUC AGC GGA Sin omision

H59A(+101 + 132): CA GGG UCU CAU CUA UUU UUC UCU GCC AGU CA Sin omision

H59A(+141 + 165): CAU CCG UGG CCU CUU GAA GUU CCU G Omision exones 58 y 59 a 200nM

H59A(+151+175): AGG UCC AGC UCA UCC GUG GCC UCU U Omision a 300 nM

H59A(+161 + 185): GCG CAG CUU GAG GUC CAG CUC AUC C Omision debil a 200 nM

H59A(+161+190): GCU UGG CGC AGC UUG AGG UCC AGC UCA UCC Omision a 100 nM

H59A(+171+197): CAC CUC AGC UUG GCG CAG CUU GAG GUC Sin omision

H59A(+181+205): CCC UUG AUC ACC UCA GCU UGG CGC A Sin omision

H59A(+200+220): ACG GGC UGC CAG GAU CCC UUG Sin omision

H59A(+221+245): GAG AGA GUC AAU GAG GAG AUC GCC C Sin omision

H59A(+92+125): CUC AUC UAU UUU UCU CUG CCA GUC AGC GGA GUG C

10 Oligonucleotidos antisentido dirigidos al exon 60

Se prepararon oligonucleotidos antisentido dirigidos al exon 60 y se sometieron a ensayo para su capacidad de inducir omision exonica en celulas musculares humanas usando metodos similares a los descritos anteriormente. Vease la figura 26.

15

T abla 49: secuencias de moleculas antisentido sometidas a ensayo para determinar si inducen la omision del exon 60^

Exon 60

H60A(-10+20): GCA AUU UCU CCU CGA AGU GCC UGU GUG CAA Sin omision

H60A-8+19: CAA UUU CUC CUC GAA GUG CCU GUG UGC Sin omision

H60A(+29+58): CAA GGU CAU UGA CGU GGC UCA CGU UCU CUU Omision hasta 50 nM

H60A(+33+62): CGA GCA AGG UCA UUG ACG UGG CUC ACG UUC Omision fuerte hasta 50 nM

H60A(+37+66): CUG GCG AGC AAG GUC CUU GAC GUG GCU CAC buen nivel de omision a 100 nM

H60A(+37+66): CUG GCG AGC AAG GUC AUU GAC GUG GCU CAC PSN

H60A(+39+66): CUG GCG AGC AAG GUC CUU GAC GUG GCU C buen nivel de omision a 100 nM

H60A(+43+73): UGG UAA GCU GGC GAG CAA GGU CCU UGA CGU G Omision debil a 100 nM

H60A(+51+75): AGU GGU AAG CUG GCG UGC AAG GUC A Omision debil a 100 nM

H60A(+72+102): UUA UAC GGU GAG AGC UGA AUG CCC AAA GUG Sin omision

H60A(+75+105): GAG GUU AUA CGG UGA GAG CUG AAU GCC CAA A Sin omision

H60A(+80+109): UGC UGA GGU UAU ACG GUG AGA GCU GAA buen nivel de omision a 100 nM

H60A(+87+116): UCC AGA GUG CUG AGG UUA UAC GGU GAG AGC Omision debil a 100 nM

H60D(+25-5): CUU UCC UGC AGA AGC UUC CAU CUG GUG UUC Omision debil a 600 nM

Cocteles de exon 60

H60A(-8+19): CAA UUU CUC CUC GAA GUG CCU GUG UGC

H60A(+37+66): CUG GCG AGC AAG GUC CUU GAC GUG GCU CAC Omision debil a 10 nM

H60A(+87+116): UCC AGA GUG CUG AGG UUA UAC GGU GAG AGC

H60A(+37+66): CUG GCG AGC AAG GUC CUU GAC GUG GCU CAC Omision a 10 nM

H60A(-10+20): GCA AUU UCU CCU CGA AGU GCC UGU GUG CAA

H60A(+43+73): UGG UAA GCU GGC GAG CAA GGU CCU UGA CGU G Omision a 10 nM

H60A(+39+66): CUG GCG AGC AAG GUC CUU GAC GUG GCU C

H60A(-10+20): GCA AUU UCU CCU CGA AGU GCC UGU GUG CAA Omision a 10 nM

Oligonucleotidos antisentido dirigidos al exon 61

Se prepararon oligonucleotidos antisentido dirigidos al exon 61 y se sometieron a ensayo para su capacidad de inducir 5 omision exonica en celulas musculares humanas usando metodos similares a los descritos anteriormente.

Tabla 50: secuencias de moleculas antisentido sometidas a ensayo para determinar si inducen la omision del exon 61

Exon 61

H61A(-7+19): CUC GGU CCU CGA CGG CCA CCU GGG AG Sin omision

H61A(+05+34): CAU GCA GCU GCC UGA CUC GGU CCU CGC CGG Omision hasta 50 nM

H61A(+10+40): GGG CUU CAU GCA GCU GCC UGA CUC GGU CCU C Omision a 100 nM

H61A(+16+40): GGG CUU CAU GCA GCU GCC UGA CUC G Sin omision

H61A(+16+45): CCU GUG GGC UUC AUG CAG CUG CCU GAC UCG Omision hasta 50 nM

H61A(+42+67): GCU GAG AUG CUG GAC CAA AGU CCC UG Sin omision

H61D(+10-16): GCU GAA AAU GAC UUA CUG GAA AGA AA Sin omision

Oligonucleotidos antisentido dirigidos al exon 62

10

Se prepararon oligonucleotidos antisentido dirigidos al exon 62 y se sometieron a ensayo para su capacidad de inducir omision exonica en celulas musculares humanas usando metodos similares a los descritos anteriormente.

Tabla 51: secuencias de moleculas antisentido sometidas a ensayo para determinar si inducen la omision del exon 62

Exon 62

H62A(-15+15): GAC CCU GGA CAG ACG CUG AAA AGA AGG GAG Sin omision

H62A(-10+20): CCA GGG ACC CUG GAC AGA CGC UGA AAA GAA Sin omision

H62A(-05+15): GAC CCU GGA CAG ACG CUG AA Debil hasta 25 nM

H62A(-3+25): CUC UCC CAG GGA CCC UGG ACA GAC GCU G Sin omision

H62A(+01+30): UGG CUC UCU CCC AGG GAC CCU GGA CAG ACG Omision de practicamente 100% hasta 300 nM

H62A(+8+34): GAG AUG GCU CUC UCC CAG GGA CCC UGG Omision a 300 nM

H62A(+13+43): UUG UUU GGU GAG AUG GCU CUC UCC CAG GGA C Debil hasta 25 nM

H62A(23+52): UAG GGC ACU UUG UUU GGC GAG AUG GCU CUC Omision a 100 nM

H62D(+17-03): UAC UUG AUA UAG UAG GGC AC Debil hasta 100 nM

H62D(+25-5): CUU ACU UGA UAU AGU AGG GCA CUU UGU UUG Sin omision

Tabla 52: secuencias de moleculas antisentido sometidas a ensayo para determinar si inducen la omision del exon ^ 63

Exon 63

H63A(-14+11): GAG UCU CGU GGC UAA AAC ACA AAA C Sin omision visible

H63A(+11+35): UGG GAU GGU CCC AGC AAG UUG UUU G Posible omision a 600 nM

H63A(+20+49): GAG CUC UGU CAU UUU GGG AUG GUC CCA GCA Omision hasta 100 nM

H63A(+33+57): GAC UGG UAG AGC UCU GUC AUU UUG G Sin omision visible

H63A(+40+62): CUA AAG ACU GGU AGA GCU CUG UC Sin omision

H63D(+8-17): CAU GGC CAU GUC CUU ACC UAA AGA C Sin omision visible

Oligonucleotidos antisentido dirigidos al exon 64

10

Se prepararon oligonucleotidos antisentido dirigidos al exon 64 y se sometieron a ensayo para su capacidad de inducir omision exonica en celulas musculares humanas usando metodos similares a los descritos anteriormente. Vease la figura 28.

15 Tabla 53: secuencias de moleculas antisentido sometidas a ensayo para determinar si inducen la omision del exon 64

Exon 64

H64A(-3+27): CUG AGA AUC UGA CAU UAU UCA GGU CAG CUG Sin omision

H64A(+34+62): CUG CAG UCU UCG GAG UUU CAU GGC AGU CC Omision a 50 nM

H64A(+43+72): AAA GGG CCU UCU GCA GUC UUC GGA GUU UCA Omision a 50 nM

H64A(+47+74): GCA AAG GGC CUU CUG CAG UCU UCG GAG Omision a 200 nM

H64D(+15-10): CAA UAC UUA CAG CAA AGG GCC UUC U Sin omision

Oligonucleotidos antisentido dirigidos al exon 65

Se prepararon oligonucleotidos antisentido dirigidos al exon 65 y se sometieron a ensayo para su capacidad de inducir 20 omision exonica en celulas musculares humanas usando metodos similares a los descritos anteriormente.

Tabla 54: secuencias de moleculas antisentido sometidas a ensayo para determinar si inducen la omision del exon 65

Exon 65

H65A(+123+148): UUG ACC AAA UUG UUG UGC UCU UGC UC Sin omision

Oligonucleotidos antisentido dirigidos al exon 66 25

Se prepararon oligonucleotidos antisentido dirigidos al exon 66 y se sometieron a ensayo para su capacidad de inducir omision exonica en celulas musculares humanas usando metodos similares a los descritos anteriormente. Vease la figura 29.

30 Tabla 55: secuencias de moleculas antisentido sometidas a ensayo para determinar si inducen la omision del exon 66

Exon 66

H66A(-8+19): GAU CCU CCC UGU UCG UCC CCU AUU AUG Omision a 100 nM

H66A(-02+28): CAG GAC ACG GAU CCU CCC UGU UCG UCC CCU Sin omision

H66D(+13-17): UAA UAU ACA CGA CUU ACA UCU GUA CUU GUC Sin omision

Cocteles de exon 66

H66A(-02+28): CAG GAC ACG GAU CCU CCC UGU UCG UCC CCU Omision a 25 nM

H66D(+13-17): UAA UAU ACA CGA CUU ACA UCU GUA CUU GUC

Oligonucleotidos antisentido dirigidos al exon 67

Tabla 56: secuencias de moleculas antisentido sometidas a ensayo para determinar si inducen la omision del exon 67

Exon 67

H67A(+17+47): GCG CUG GUC ACA AAA UCC UGU UGA ACU UGC Omision fuerte a 25 nM

H67A(+120+147): AGC UCC GGA CAC UUG GCU CAA UGU UAC U Sin omision

H67A(+125+149): GCA GCU CCG GAC ACU UGG GUC AAU G Omision a 600 nM

H67D(+22-08): UAA CUU ACA AAU UGG AAG CAG CUC CGG ACA Sin omision

Oligonucleotidos antisentido dirigidos al exon 68

10 Se prepararon oligonucleotidos antisentido dirigidos al exon 68 y se sometieron a ensayo para su capacidad de inducir omision exonica en celulas musculares humanas usando metodos similares a los descritos anteriormente. Vease la figura 31.

Tabla 57: secuencias de moleculas antisentido sometidas a ensayo para determinar si inducen la omision del exon ^ 68

Exon 68

H68A(-4+21): GAU CUC UGG CUU AUU AUU AGC CUG C Omision a 100 nM

H68A(+22+48): CAU CCA GUC UAG GAA GAG GGC CGC UUC Omision a 200 nM

H68A(+48+72): CAC CAU GGA CUG GGG UUC CAG UCU C Omision a 200 nM

H68A(+74+103): CAG CAG CCA CUC UGU GCA GGA CGG GCA GCC Sin omision

H68D(+23-03): UAC CUG AAU CCA AUG AUU GGA CAC UC Sin omision

Cocteles de exon 68

H68A(+48+72): CAC CAU GGA CUG GGG UUC CAG UCU C Omision a 10 nM

H68D(+23-03): UAC CUG AAU CCA AUG AUU GGA CAC UC

15

Oligonucleotidos antisentido dirigidos al exon 69

Se prepararon oligonucleotidos antisentido dirigidos al exon 69 y se sometieron a ensayo para su capacidad de inducir omision exonica en celulas musculares humanas usando metodos similares a los descritos anteriormente. Ver la figura 20 32 que muestra un coctel de H69A(+32+60) y H70A(-06+18) para eliminar ambos exones, 69 y 70.

Tabla 58: secuencias de moleculas antisentido sometidas a ensayo para determinar si inducen la omision del exon 69

Exon 69

H69A(-12+19): GUG CUU UAG ACU CCU GUA CCU GAU AAA GAG C Sin omision

H69A(+09 +39): UGG CAG AUG UCA UAA UUA AAG UGC UUU AGAC Omision de 68 a 71 a 200 nM

H69A(+29 +57): CCA GAA AAA AAG CAG CUU UGG CAG AUG UC Omision de 68 a 71 a 200 nM, tambien 68+69 y 69+70

H69A(+51+74): GGC CUU UUG CAA CUC GAC CAG AAA Omision de 68 a 71

H69A(+51 +80): UUU UAU GGC CUU UUG CAA CUC GAC CAG AAA omision de ~90% de 68 a 71 a 200nM

H69D(+08-16): CUG GCG UCA AAC UUA CCG GAG UGC Sin omision

5

10

15

20

25

Se prepararon oligonucleotidos antisentido dirigidos al exon 70 y se sometieron a ensayo para su capacidad de inducir omision exonica en celulas musculares humanas usando metodos similares a los descritos anteriormente.

Tabla 59: secuencias de moleculas antisentido sometidas a ensayo para determinar si inducen la omision del exon 70

Exon 70

H70A(-09+15): UUC UCC UGA UGU AGU CUA AAA GGG Sin omision

H70A(-07 +23): CGA ACA UCU UCU CCU GAU GUA GUC UAA AAG Sin omision

H70A(+16 +40): GUA CCU UGG CAA AGU CUC GAA CAU C Sin omision

H70A(+25 +48): GUU UUU UAG UAC CUU GGC AAA GUC Sin omision

H70A(+32+60): GGU UCG AAA UUU GUU UUU UAG UAC CUU GG Sin omision

H70A(+64 +93): GCC CAU UCG GGG AUG CUU CGC AAA AUA CCU Sin omision

Oligonucleotidos antisentido dirigidos al exon 71

Se prepararon oligonucleotidos antisentido dirigidos al exon 71 y se sometieron a ensayo para su capacidad de inducir omision exonica en celulas musculares humanas usando metodos similares a los descritos anteriormente.

Tabla 60: secuencias de moleculas antisentido sometidas a ensayo para determinar si inducen la omision del exon ^ 71

Exon 71

H71A(-08+16): GAU CAG AGU AAC GGG ACU GCA AAA

H71A(+07+30): ACU GGC CAG AAG UUG AUC AGA GUA Omision debil a 100 nM

H71A(+16+39): GCA GAA UCU ACU GGC CAG AAG UUG Omision a 100 nM

H71D(+19-05): CUC ACG CAG AAU CUA CUG GCC AGA

Oligonucleotidos antisentido dirigidos al exon 72

Se prepararon oligonucleotidos antisentido dirigidos al exon 72 y se sometieron a ensayo para su capacidad de inducir omision exonica en celulas musculares humanas usando metodos similares a los descritos anteriormente.

Tabla 61: secuencias de moleculas antisentido sometidas a ensayo para determinar si inducen la omision del exon 72

Exon 72

H72A(-8+22): AAG CUG AGG GGA CGA GGC AGG CCU AUA AGG Omision debil a 600 nM

H72A(+02+28): GUG UGA AAG CUG AGG GGA CGA GGC AGG Sin omision

H72D(+14-10): AGU CUC AUA CCU GCU AGC AUA AUG Sin omision

Oligonucleotidos antisentido dirigidos al exon 73

Se prepararon oligonucleotidos antisentido dirigidos al exon 73 y se sometieron a ensayo para su capacidad de inducir omision exonica en celulas musculares humanas usando metodos similares a los descritos anteriormente.

T abla 62: secuencias de moleculas antisentido sometidas a ensayo para determinar si inducen la omision del exon ^ 73

Exon 73

H73A(+24+49): AUG CUA UCA UUU AGA UAA GAU CCA U Omision debil

H73A(-16+10): UUC UGC UAG CCU GAU AAA AAA CGU AA Debil hasta 25 nM

H73A(+02+26): CAU UGC UGU UUU CCA UUU CUG GUA G Fuerte hasta 25 nM

H73D(+23-02): ACA UGC UCU CAU UAG GAG AGA UGC U Omision hasta 25 nM

HM73A(+19+44): UAU CAU UUA GAU AAG AUC CAU UGC UG Omision debil hasta 25 nM

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

Se prepararon oligonucleotidos antisentido dirigidos al exon 74 y se sometieron a ensayo para su capacidad de inducir omision exonica en celulas musculares humanas usando metodos similares a los descritos anteriormente.

T abla 66: secuencias de moleculas antisentido sometidas a ensayo para determinar si inducen la omision del exon 74

HM74A(+20+46): GUU CAA ACU UUG GCA GUA AUG CUG GAU Omision a 25 nM

HM74A(+50+77): GAC UAC GAG GCU GGC UCA GGG GGG AGU C 100 % de omision a 25 nM

HM74A(+96+122): GCU CCC CUC UUU CCU CAC UCU CUA AGG Omision a 25 nM

Oligonucleotidos antisentido dirigidos al exon 76

Se prepararon oligonucleotidos antisentido dirigidos al exon 76 y se sometieron a ensayo para su capacidad de inducir omision exonica en celulas musculares humanas usando metodos similares a los descritos anteriormente.

Tabla 63: secuencias de moleculas antisentido sometidas a ensayo para determinar si ^ inducen la omision del exon ^ 76

Exon 76

H76A(-02+25): CAU UCA CUU UGG CCU CUG CCU GGG GCU Sin omision detectable

H76A(+80+106): GAC UGC CAA CCA CUC GGA GCA GCA UAG Sin omision detectable

Las modificaciones de los modos anteriormente descritos para llevar a cabo las diversas realizaciones de la presente invencion resultaran evidentes para el experto en la materia basandose en las ensenanzas anteriores relacionadas con la invencion dada a conocer. Las realizaciones anteriores de la invencion son meramente ejemplares y no deben interpretarse en modo alguno como limitativas.

LISTADO DE SECUENCIAS

<110> UWA

<120> Moleculas antisentido y metodos de tratamiento de patologfas <130> 203594 <160> 59

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1 <211> 31 <212> ARN <213> Homo sapiens

<400> 1

aaaccaagag ucaguuuaug auuuccaucu a 31

<210> 2 <211> 24 <212> ARN <213> Homo sapiens

<400> 2

ucuucuguuu uuguuagcca guca 24

<210> 3 <211> 30 <212> ARN <213> Homo sapiens

<400> 3

guggugguga cagccuguga aaucugugag 30

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

<210>4 <211> 26 <212> ARN <213> Homo sapiens

<400> 4

uguucccuug uggucaccgu aguuac 26

<210>5 <211> 29 <212> ARN <213> Homo sapiens

<400> 5

cacaaagucu gcauccagga acauggguc 29

<210> 6 <211> 30 <212> ARN <213> Homo sapiens

<400> 6

aaggccacaa agucugcauc caggaacaug 30

<210>7 <211> 22 <212> ARN <213> Homo sapiens

<400> 7

cugcaauucc ccgagucucu gc 22

<210>8 <211> 23 <212> ARN <213> Homo sapiens

<400> 8

caagggcagg ccauuccucc uuc 23

<210> 9 <211> 26 <212> ARN <213> Homo sapiens

<400> 9

gagagcuucc uguagcuuca cccuuu 26

<210> 10 <211> 24 <212> ARN <213> Homo sapiens

<400> 10

uguucagcuu cuguuagcca cuga 24

<210> 11 <211> 34 <212> ARN <213> Homo sapiens

<400> 11

gcugcccaau gccauccugg aguuccugua agau 34 <210> 12 <211> 29

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

<212> ARN <213> Homo sapiens

<400> 12

uccagguuca agugggauac uagcaaugu 29

<210> 13 <211> 29 <212> ARN <213> Homo sapiens

<400> 13

uggcgcaggg gcaacucuuc caccaguaa 29

<210> 14 <211> 26 <212> ARN <213> Homo sapiens

<400> 14

acaaaugcug cccuuuagac aaaauc 26

<210> 15 <211> 27 <212> ARN <213> Homo sapiens

<400> 15

ggcugcuuug cccucagcuc uugaagu 27

<210> 16 <211> 31 <212> ARN <213> Homo sapiens

<400> 16

uggucucauc ugcagaauaa ucccggagaa g 31.

<210> 17 <211> 30 <212> ARN <213> Homo sapiens

<400> 17

cagccucucg cucacucacc cugcaaagga 30

<210> 18 <211> 27 <212> ARN <213> Homo sapiens

<400> 18

ccaaacgucu uuguaacagg acugcau 27

<210> 19 <211> 30 <212> ARN <213> Homo sapiens

<400> 19

ccacuugaag uucauguuau ccaaacgucu 30

<210> 20 <211> 30 <212> ARN <213> Homo sapiens

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

<400> 20

aacuggcuuc caaaugggac cugaaaaaga 30

<210> 21 <211> 31 <212> ARN <213> Homo sapiens

<400> 21

uucguacagu cucaagagua cucaugauua c 31

<210> 22 <211> 24 <212> ARN <213> Homo sapiens

<400> 22

caauuaccuc ugggcuccug guag 24

<210> 23 <211> 25 <212> ARN <213> Homo sapiens

<400> 23

cuauuuuucu cugccaguca gcgga 25

<210> 24 <211> 30 <212> ARN <213> Homo sapiens

<400> 24

cgagcaaggu cauugacgug gcucacguuc 30

<210> 25 <211> 31 <212> ARN <213> Homo sapiens

<400> 25

gggcuucaug cagcugccug acucgguccu c 31

<210> 26 <211> 30 <212> ARN <213> Homo sapiens

<400> 26

uagggcacuu uguuuggcga gauggcucuc 30

<210> 27 <211> 30 <212> ARN <213> Homo sapiens

<400> 27

gagcucuguc auuuugggau ggucccagca 30

<210> 28 <211> 29 <212> ARN <213> Homo sapiens <400> 28

cugcagucuu cggaguuuca uggcagucc

29

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

<210> 29 <211> 27 <212> ARN <213> Homo sapiens

<400> 29

gauccucccu guucgucccc uauuaug 27

<210> 30 <211> 30 <212> ARN <213> Homo sapiens

<400> 30

gcgcugguca caaaauccug uugaacuugc

<210> 31 <211> 31 <212> ARN <213> Homo sapiens

<400> 31

uaggaggcgc cucccauccu guaggucacu g

<210> 32 <211> 25 <212> ARN <213> Homo sapiens

<400> 32

gcccugucag gccuucgagg agguc 25

<210> 33 <211> 30 <212> ARN <213> Homo sapiens

<400> 33

uguucagggc augaacucuu guggauccuu

<210> 34 <211> 25 <212> ARN <213> Homo sapiens

<400> 34

guacuacuua cauuauuguu cugca 25

<210> 35 <211> 30 <212> ARN <213> Homo sapiens

<400> 35

uaucuggaua ggugguauca acaucuguaa

<210> 36 <211> 25 <212> ARN <213> Homo sapiens

30

31

30

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

<400> 36

auguaacuga aaauguucuu cuuua 25

<210> 37 <211> 21 <212> ARN <213> Homo sapiens

<400> 37

caggagcuuc caaaugcugc a 21

<210> 38 <211> 22 <212> ARN <213> Homo sapiens

<400> 38

uccucagcag aaagaagcca cg 22

<210> 39 <211> 26 <212> ARN <213> Homo sapiens

<400> 39

ccuccuuucu ggcauagacc uuccac 26

<210> 40 <211> 27 <212> ARN <213> Homo sapiens

<400> 40

cuuacaguuu ucuccaaacc ucccuuc 27

<210> 41 <211> 25 <212> ARN <213> Homo sapiens

<400> 41

ugugucaucc auucgugcau cucug 25

<210> 42 <211> 25 <212> ARN <213> Homo sapiens

<400> 42

cugguauucc uuaauuguac agaga 25

<210> 43 <211> 30 <212> ARN <213> Homo sapiens

<400> 43

ugugaugugg uccacauucu ggucaaaagu 30

<210> 44 <211> 28 <212> ARN <213> Homo sapiens

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

<400> 44

cuuguuucuc agguaaagcu cuggaaac 28

<210> 45 <211> 28 <212> ARN <213> Homo sapiens

<400> 45

caagcugccc aaggucuuuu auuugagc 28

<210> 46 <211> 30 <212> ARN <213> Homo sapiens

<400> 46

uccagagugc ugagguuaua cggugagagc 30

<210> 47 <211> 30 <212> ARN <213> Homo sapiens

<400> 47

cuggcgagca agguccuuga cguggcucac 30

<210> 48 <211> 30 <212> ARN <213> Homo sapiens

<400> 48

caggacacgg auccucccug uucguccccu 30

<210> 49 <211> 30 <212> ARN <213> Homo sapiens

<400> 49

uaauauacac gacuuacauc uguacuuguc 30

<210> 50 <211> 25 <212> ARN <213> Homo sapiens

<400> 50

caccauggac ugggguucca gucuc 25

<210> 51 <211> 26 <212> ARN <213> Homo sapiens

<400> 51

uaccugaauc caaugauugg acacuc 26

<210> 52 <211> 30 <212> ARN <213> Homo sapiens

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

<400> 52

cuguuccaau cagcuuacuu cccaauugua 30

<210> 53 <211> 28 <212> ARN <213> Homo sapiens

<400> 53

cagucauuca acucuuucag uuucugau 28

<210> 54 <211> 27 <212> ARN <213> Homo sapiens

<400> 54

cuguucagcu ucuguuagcc acugauu 27

<210> 55 <211> 28 <212> ARN <213> Homo sapiens

<400> 55

gcugcccaau gccauccugg aguuccug 28

<210> 56 <211> 30 <212> ARN <213> Homo sapiens

<400> 56

guugcugcuc uuuuccaggu ucaaguggga 30

<210> 57 <211> 29 <212> ARN <213> Homo sapiens

<400> 57

agcagguacc uccaacauca aggaagaug 29

<210> 58 <211> 33 <212> ARN <213> Homo sapiens

<400> 58

uccaacuggg gacgccucug uuccaaaucc ugc

<210> 59 <211> 33 <212> ARN <213> Homo sapiens

<400> 59

uucaacuguu gccuccgguu cugaaggugu ucu

<210> 60 <211> 25 <212> ARN <213> Homo sapiens

33

<400> 60

cauugcuguu uuccauuucu gguag 25

<210> 61 5 <211> 31

<212> ARN <213> Homo sapiens

<400> 61

10 gcugcccaau gccauccugg aguuccugua a 31

<210> 62 <211> 31 <212> ARN

15 <213> Homo sapiens

<400> 62

caaugccauc cuggaguucc uguaagauac c 31

20

Claims

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

REIVINDICACIONES

1. Oligonucleotido antisentido que induce la omision del exon 45 en un pre-ARNm de distrofina humana, en el que el oligonucleotido antisentido se selecciona del grupo que consiste en:

i) un oligonucleotido antisentido de 22 bases que comprenden CAA UGC CAU CCU GGA GUU CCU G o una sal farmaceuticamente aceptable del mismo,

ii) un oligonucleotido antisentido de 22 bases que comprende CAA UGC CAU CCU GGA GUU CCU G y que comprende una base pirimidina 5-sustituida o una sal farmaceuticamente aceptable del mismo,

iii) un oligonucleotido antisentido de 25 bases que comprende GCC CAA UGC CAU CCU GGA GUU CCU G o una sal farmaceuticamente aceptable del mismo,

iv) un oligonucleotido antisentido de 25 bases que comprende GCC CAA UGC CAU CCU GGA GUU CCU G y que comprende una base pirimidina 5-sustituida o una sal farmaceuticamente aceptable del mismo,

v) un oligonucleotido antisentido de 28 bases que comprende GCU GCC CaA UGC CAU CCU GGA GUU CCU G o una sal farmaceuticamente aceptable del mismo,

vi) un oligonucleotido antisentido de 28 bases que comprende GCU GCC CAA UGC CAU CCU GGA GUU CCU G y que comprende una base pirimidina 5-sustituida o una sal farmaceuticamente aceptable del mismo,

vii) un oligonucleotido antisentido de 31 bases que comprende GCC GCU GCC cAa UGC CAU CCU GGA GUU CCU G o una sal farmaceuticamente aceptable del mismo, y

viii) un oligonucleotido antisentido de 31 bases que comprende GCC GCU GCC CAA UGC CAU CCU GGA GUU CCU G y que comprende una base pirimidina 5-sustituida o una sal farmaceuticamente aceptable del mismo.
2. Oligonucleotido antisentido segun la reivindicacion 1, en el que el oligonucleotido antisentido son 22 bases que comprenden CAA UGC CAU CCU GGA GUU CCU G o una sal farmaceuticamente aceptable del mismo.
3. Oligonucleotido antisentido segun la reivindicacion 1, en el que el oligonucleotido antisentido son 22 bases que comprenden CAA UGC CAU CCU GGA GUU CCU G y que comprende una base pirimidina 5-sustituida o una sal farmaceuticamente aceptable del mismo.
4. Oligonucleotido antisentido segun la reivindicacion 1, en el que el oligonucleotido antisentido son 25 bases que comprenden CAA UGC CAU CCU GGA GUU CCU G o una sal farmaceuticamente aceptable del mismo.
5. Oligonucleotido antisentido segun la reivindicacion 1, en el que el oligonucleotido antisentido son 25 bases que comprenden GCC CAA UGC CAU CCU GGA GUU CCU G y que comprende una base pirimidina 5-sustituida o una sal farmaceuticamente aceptable del mismo.
6. Oligonucleotido antisentido segun la reivindicacion 1, en el que el oligonucleotido antisentido son 28 bases que comprenden GCU GCC CAA UGC CAU CCU GGA GUU CCU G o una sal farmaceuticamente aceptable del mismo.
7. Oligonucleotido antisentido segun la reivindicacion 1, en el que el oligonucleotido antisentido son 28 bases que comprenden GCU GCC CAA UGC CAU CCU GGA GUU CCU G y que comprende una base pirimidina 5-sustituida o una sal farmaceuticamente aceptable del mismo.
8. Oligonucleotido antisentido segun la reivindicacion 1, en el que el oligonucleotido antisentido son 31 bases que comprenden GCU GCC CAA UGC CAU CCU GGA GUU CCU G o una sal farmaceuticamente aceptable del mismo.
9. Oligonucleotido antisentido segun la reivindicacion 1, en el que el oligonucleotido antisentido son 31 bases que comprenden GCC GCU GCC CAA UGC CAU CCU GGA GUU CCU G y que comprende una base pirimidina 5- sustituida o una sal farmaceuticamente aceptable del mismo.
10. Oligonucleotido antisentido o sal farmaceuticamente aceptable del mismo, segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, que comprende una base 5-metilcitosina.
11. Oligonucleotido antisentido o sal farmaceuticamente aceptable del mismo, segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, en el que el oligonucleotido no activa la ARNasa H.
12. Oligonucleotido antisentido o sal farmaceuticamente aceptable del mismo segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en el que los enlaces internucleosido del esqueleto son sustituidos por enlaces internucleosido no naturales.
13. Oligonucleotidos antisentido o sal farmaceuticamente aceptable del mismo, segun las reivindicaciones 1 a 9, en el que los enlaces internucleosido son fosfatos modificados.

5

10

15

20

25

30
14. Oligonucleotido antisentido o sal farmaceuticamente aceptable del mismo, segun la reivindicacion 13, en el que el fosfato modificado se selecciona de fosfonatos de metilo, fosforotioatos de metilo, fosforomorfolidatos, fosforopiperazidatos y fosforoamidatos.
15. Oligonucleotidos antisentido o sal farmaceuticamente aceptable del mismo, segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en el que el oligonucleotido es un acido peptido-nucleico.
16. Oligonucleotido antisentido o sal farmaceuticamente aceptable del mismo, segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en el que el oligonucleotido se une qmmicamente a una o mas fracciones o conjugados que intensifican la actividad, la distribucion celular, o la captacion celular del oligonucleotido antisentido.
17. Composicion, que comprende un oligonucleotido antisentido o sal farmaceuticamente aceptable del mismo, segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 16 y un portador farmaceuticamente aceptable.
18. Oligonucleotido antisentido o sal farmaceuticamente aceptable del mismo, segun cualquiera de las reivindicaciones 1-16, o una composicion segun la reivindicacion 17, para su uso en un metodo de tratamiento de la distrofia muscular.
19. Utilizacion de un oligonucleotido antisentido o sal farmaceuticamente aceptable del mismo, segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 16, o una composicion segun la reivindicacion 17 para la preparacion de un medicamento para la modulacion de la distrofia muscular.
20. Oligonucleotido antisentido o sal farmaceuticamente aceptable del mismo, o composicion para la utilizacion segun la reivindicacion 18, o la utilizacion segun la reivindicacion 19, en el que la distrofia muscular es distrofia muscular de Duchenne.