BR112012011195B1 - Oligonucleotídeo antissentido, composição farmacêutica e uso de uma composição farmacêutica - Google Patents

Abstract

moléculas antissentido e métodos para tratamento de patologias. trata-se a presente invenção de uma molécula antissentido capaz de se ligar a um local alvo selecionado para induzir o salto de éxon no gene da distrofína, conforme estebelecido na seq. id no: 1 a 59.

Description

Campo da Invenção:

[001] A presente invenção refere-se a novos compostos antissentido e composições apropriadas para facilitar o salto de éxon. A presente invenção também apresenta métodos para induzir o salto de éxon, por meio do uso dos novos compostos antissentido, bem como de composições terapêuticas adaptadas para utilização nos métodos da presente invenção.

Fundamentos da Invenção:

[002] A discussão abaixo relativa aos fundamentos da invenção pretende apenas facilitar a compreensão da presente invenção. A discussão não é uma confirmação ou admissão de que qualquer um dos materiais referidos é ou fez parte do conhecimento geral comum à data de prioridade do pedido.

[003] Esforços significativos estão sendo feitos em pesquisa de métodos para suprimir ou compensar mutações em genes que causam doenças. Tecnologias antissentido estão sendo desenvolvidas, por meio do uso de uma variedade de substâncias químicas, para afetar a expressão do gene em uma variedade de níveis diferentes (transcrição, splicing (processo que remove os íntrons e junta os éxons), estabilidade, tradução). A maior parte dessas pesquisas enfoca a utilização de compostos antissentido para corrigir ou compensar genes anormais ou associados à doença em um grande número de diferentes condições.

[004] As moléculas antissentido são capazes de inibir a expressão gênica com excelente especificidade e, por isso, muitos esforços voltados às pesquisas sobre oligonucleotídeos como moduladores da expressão gênica têm sido centrados na expressão da inibição de genes-alvo, como, por exemplo, oncogenes ou genes virais. Os oligonucleotídeos antissentido são direcionados ou contra o RNA (fita de sentido) ou contra o DNA onde eles formam estruturas triplex que inibem a transcrição pela RNA polimerase II.

[005] Para alcançar um efeito desejado na regulação decrescente do gene específico, os oligonucleotídeos devem ou promover a desintegração do mRNA-alvo ou bloquear a tradução deste mRNA, prevenindo, assim, eficazmente, a síntese da proteína alvo indesejável.

[006] Essas técnicas não são úteis quando o objetivo é a regulação crescente da produção da proteína nativa ou compensação das mutações que induzem o término prematuro da tradução, como, por exemplo, mutações de quadro de leitura ou antissentido.

[007] Além disso, nos casos em que uma proteína normalmente funcional é terminada prematuramente devido às mutações da mesma, um meio para restaurar uma parte da produção da proteína funcional através da tecnologia antissentido demonstrou ser possível por meio da intervenção durante os processos de splicing (Sierakowska H, e outros, (1996) Proc. Natl. Acad. Sei. EUA 93,12840-12844; Wilton SD, e outros, Neuromusc Disorders (1999) 9.330-338; van Deutekom JC e outros, (2001) Human. Mol. Genet. 10, 1547-1554). Nestes casos, a transcrição do gene defeituoso não deve ser submetida à degradação-alvo, portanto, a química do oligonucleotídeo antissentido não deve promover a desintegração do mRNA alvo.

[008] Em uma variedade de doenças genéticas, os efeitos das mutações sobre a expressão eventual de um gene podem ser modulados através de um processo do salto do éxon alvo durante o splicing. O splicing é direcionado por uma maquinaria multipartícula complexa que coloca as junções éxon-íntron adjacentes em pré-mRNA em estreita proximidade e executa a clivagem das ligações fosfodiéster nas extremidades dos íntrons, com a sua reformação subsequente entre os éxons que serão submetidos ao splicing em conjunto. Este processo complexo e altamente preciso é mediado por motivos de sequência no pré-mRNA, que são segmentos de RNA semiconservados relativamente curtos, aos quais se ligam os vários fatores de splicing nucleares que então são envolvidos nas reações de splicing. Ao alterar o modo no qual a maquinaria de splicing lê ou reconhece os motivos envolvidos no processamento do pré-mRNA, é possível criar moléculas de mRNA submetidas diferencialmente ao splicing. Agora foi reconhecido que a maioria dos genes humanos é submetida ao splicing de forma alternativa durante a expressão gênica normal, embora os mecanismos invocados não tenham sido identificados. Por meio do uso de oligonucleotídeos antissentido, foi demonstrado que os erros e as deficiências em um mRNA codificado poderiam ser desviados ou removidos dos transcritos gênicos maduros.

[009] Na natureza, a extensão da deleção genética ou do salto de éxon no splicing não é totalmente compreendida, embora tenha sido documentado que ocorre em muitos casos, geralmente em níveis muito baixos (Sherrat TG e outros, (1993) Am. J. Hum. Genet. 53, 1007-1015). No entanto, é reconhecido que se os éxons associados às mutações causadoras de doenças podem ser especificamente excluídos a partir de alguns genes, um produto proteico encurtado pode às vezes ser produzido, contendo propriedades biológicas similares às da proteína nativa ou com atividade biológica suficiente para melhorar a doença causada por mutações associadas ao éxon alvo (Lu QL e outros, (2003) Nature Medicine 9,1009-1014; Aartsma-Rus A. e outros, (2004) Am. J. Hum. Genet. 74:83-92).

[010] Este processo de salto do éxon alvo provavelmente seja particularmente útil nos genes longos quando existem muitos éxons e íntrons, quando há redundância na constituição genética dos éxons ou quando uma proteína é capaz de funcionar sem um ou mais éxons particulares (por exemplo, com o gene da distrofina, que consiste de 79 éxons; ou, possivelmente, alguns genes de colágeno, que codificam blocos repetidos de sequência ou os enormes genes de nebulina ou titina, que são compostos de -80 e mais de 370 éxons, respectivamente).

[011] Os esforços para redirecionar o processamento gênico para o tratamento de doenças genéticas associadas a truncamentos causados por mutações em genes diferentes têm sido centralizados na utilização de oligonucleotídeos antissentido que, ou: (1) coincidem total ou parcialmente com os elementos envolvidos no splicing, ou; (2) se ligam ao pré-mRNA em uma posição suficientemente próxima do elemento para desestabilizar a ligação e a função dos fatores de splicing que normalmente medeiam uma reação de splicing específica que ocorre nesse elemento (por exemplo, ligam-se ao pré- mRNA em uma posição dentro de 3, 6 ou 9 nucleotídeos do elemento a ser bloqueado).

[012] Por exemplo, tem sido relatada a modulação do splicing do pré-mRNA da distrofina mutante com oligorribonucleotídeos antissentido tanto in vitro como in vivo. Em um tipo de mutação de distrofina relatada no Japão, uma mutação de deleção de 52 pares de base faz com que o éxon 19 seja removido com os íntrons flanqueantes durante o splicing (Matsuo e outros, (1991) J. Clin. Invest. 87:2127-2131). Um sistema de splicing de minigene in vitro tem sido utilizado para mostrar que um 2'-O- metiloligoribonucleotídeo de 31 unidades complementar à metade 5' da sequência eliminada no éxon 19 Kobe de distrofina inibiu o splicing do pré-mRNA do tipo selvagem (Takeshima e outros (1995), J. Clin. Invest. 95:515-520). O mesmo oligonucleotídeo foi utilizado para induzir o salto de éxon da transcrição do gene nativo de distrofina em células linfoblastóides cultivadas humanas.

[013] Dunckley e outros (1997), em Nucleosides & Nucleotides, 16,1665-1668, descreveram construções in vitro para a análise do splicing ao redor do éxon 23 de distrofina mutada no camundongo mutante mdx, um modelo para distrofia muscular. Foram discutidos planos para analisar essas construções in vitro por meio do uso de oligonucleotídeos 2'-modificados direcionados para locais do splicing dentro e adjacente ao éxon 23 de distrofina mutada no camundongo, embora nenhuma sequência ou local alvo foi dado.

[014] Subsequentemente, observou-se que 2'-O-metiloligorribonucleotídeos corrigiam a deficiência de distrofina em mioblastos do camundongo mdx deste grupo. Observou-se que um oligonucleotídeo antissentido direcionado para o local do splicing 3' do íntron 22 de distrofina de murino causou saltos do éxon mutante, bem como vários éxons flanqueantes e criou uma nova transcrição de distrofina no quadro de leitura com uma nova deleção interna. Esta distrofina mutada expressou em 1-2% dos miotubos mdx tratados com antissentido. A utilização de modificações de oligonucleotídeos, como, por exemplo, 2'-O-metoxietilfosfodiésteres é descrita (Dunckley e outros (1998) Human Mol. Genetics, 5:1083-90).

[015] Portanto, as moléculas antissentido podem representar uma ferramenta no tratamento de doenças genéticas, como, por exemplo, distrofia muscular de Duchenne (DMD). No entanto, as tentativas de induzir o salto de éxon por meio do uso de moléculas antissentido tiveram sucesso variado.

[016] Estudos sobre o éxon 19 de distrofina, onde se obteve com sucesso o salto de éxon do pré-mRNA da distrofina por meio do uso de uma variedade de moléculas antissentido direcionadas para os locais ou motivos de splicing flanqueantes no éxon, implicam uma definição de éxon, conforme descrição por Errington e outros (2003), J. Gen. Med. 5:518-527.

[017] Em contraposição com a aparente facilidade do salto do éxon 19, o primeiro relato do salto do éxon 23 no camundongo mdx, por Dunckley e outros (1998), considera-se agora que é relatada apenas uma transcrição reversa ou artefato de origem natural, em vez de qualquer atividade antissentido real. Além de não gerar consistentemente transcrições faltando o éxon 23, Dunckley e outros (1998) não mostraram qualquer evolução temporal do salto do éxon induzido e nem mesmo a titulação de oligonucleotídeos antissentido, para demonstrar efeitos dependentes da dose, onde os níveis do salto do éxon correspondiam com quantidades crescentes ou decrescentes de oligonucleotídeo antissentido. Além disso, este trabalho não poderia ser replicado por outros pesquisadores.

[018] O primeiro exemplo de salto do éxon específico e reproduzível no modelo do camundongo mdx foi relatado por Wilton e outros (1999), em Neuromuscular Disorders, 9, 330-338. Ao direcionar uma molécula antissentido para o local de splicing doador, o salto do éxon 23 consistente e eficaz foi induzido no mRNA da distrofina dentro de 6 horas de tratamento das células cultivadas. Wilton e outros (1999) também descreveram como alvo a região receptor do pré-mRNA da distrofina do camundongo com oligonucleotídeos antissentido mais longos e sendo incapaz de repetir os resultados publicados por Dunckley e outros (1998). Nenhum salto de éxon, seja do éxon 23 sozinho ou da eliminação múltipla de vários éxons flanqueantes, poderia ser reprodutivelmente detectado por meio do uso de uma seleção de oligonucleotídeos antissentido direcionados para o local de splicing receptor do íntron 22.

[019] Embora o primeiro oligonucleotídeo antissentido direcionado para o local de splicing doador do íntron 23 tenha induzido um salto de éxon consistente em mioblastos cultivados primários, este composto foi considerado muito menos eficaz em culturas de células imortalizadas que expressam níveis mais elevados de distrofina. No entanto, com refinado direcionamento e projeto do oligonucleotídeo antissentido, a eficácia da eliminação do éxon específico foi aumentada em quase uma ordem de magnitude (vide Mann CJ e outros (2002), em J Gen. Med. 4.644-654).

[020] Assim sendo, ainda há a necessidade de fornecer oligonucleotídeos antissentido que sejam capazes de se ligar e modificar o splicing de uma sequência de nucleotídeos alvo. Direcionar simplesmente os oligonucleotídeos antissentido para motivos supostamente cruciais para o splicing não é garantia de eficácia deste composto em um ambiente terapêutico.

[021] A discussão anterior dos fundamentos da invenção pretende apenas facilitar a compreensão da presente invenção. Deve-se observar que a discussão não é uma confirmação ou admissão de que qualquer um dos materiais referidos fazia parte do conhecimento geral comum na data de prioridade do pedido.

Sumário da Invenção:

[022] A presente invenção apresenta compostos moleculares antissentido e composições apropriadas para a ligação aos motivos de RNA envolvidos no splicing do pré-mRNA, que são capazes de induzir o salto do éxon de forma específica e eficaz, bem como um método para a sua utilização.

[023] A escolha da seleção alvo desempenha um papel crucial na eficácia do salto do éxon e, consequentemente, sua aplicação subsequente de uma potencial terapia. Designar simplesmente moléculas antissentido para direcionar a regiões alvo do pré-mRNA supostamente envolvidas no splicing não é garantia de induzir o salto do éxon de forma específica e eficaz. Os alvos mais óbvios ou facilmente definidos para a intervenção do splicing são os locais de splicing doadores e receptores, embora existam motivos menos definidos ou conservados, que incluem elementos potencializadores de splicing exônico, elementos silenciadores e pontos de ramificação.

[024] Os locais de splicing doadores e receptores têm sequências de consenso de aproximadamente 16 e 8 bases, respectivamente (vide Figura 1 para a representação esquemática de motivos e domínios envolvidos no reconhecimento do éxon, na eliminação do íntron e no splicing).

[025] De acordo com um primeiro aspecto, a presente invenção apresenta moléculas antissentido capazes de se ligar a um alvo selecionado para induzir o salto de éxon.

[026] Por exemplo, para induzir o salto de éxon nos éxons 5, 12, 17, 21, 22, 24, 43-47, 49, 50, 54-64, 66, 67, 70 e 72 na transcrição do gene da distrofina, as moléculas antissentido são, de preferência, selecionadas do grupo listado na Tabela 1A.

[027] Em um exemplo adicional, é possível combinar dois ou mais oligonucleotídeos antissentido da presente invenção em conjunto para induzir o salto do éxon de forma mais eficaz nos éxons 3, 4, 8, 10, 26, 36, 48,60, 66 e 68. Uma combinação ou um "coquetel" de oligonucleotídeos antissentido são direcionados a éxons para induzir o salto do éxon de forma eficaz.

[028] De acordo com um segundo aspecto, a presente invenção apresenta moléculas antissentido selecionadas e/ou adaptadas para ajudar no tratamento profilático ou terapêutico de uma doença genética que compreende pelo menos uma molécula antissentido em uma forma apropriada para a administração a um paciente.

[029] De acordo com um terceiro aspecto, a presente invenção apresenta um método para tratar um paciente que sofre de uma doença genética na qual há uma mutação em um gene que codifica uma proteína particular e o efeito da mutação pode ser anulada pelo salto de éxon, sendo que o dito método compreende as seguintes etapas: (a) selecionar uma molécula antissentido, de acordo com os métodos aqui descritos, e; (b) administrar a molécula a um paciente em necessidade de tal tratamento.

[030] A presente invenção também contempla a utilização de oligonucleotídeos antissentido purificados e isolados da presente invenção, para a produção de um medicamento para o tratamento de uma doença genética.

[031] A presente invenção também apresenta um método de tratamento de uma condição caracterizada por distrofia muscular de Duchenne, sendo que o dito método compreende a administração, a um paciente com necessidade de tratamento, de uma quantidade eficaz de um oligonucleotídeo antissentido apropriadamente projetado da presente invenção, relevante para a lesão genética particular do dito paciente. Além disso, a presente invenção apresenta um método para tratar profilaticamente um paciente, para prevenir ou pelo menos minimizar a distrofia muscular Duchene, que compreende as seguintes etapas: administração ao paciente de uma quantidade eficaz de um oligonucleotídeo antissentido ou de uma composição farmacêutica compreendendo uma ou mais destas moléculas biológicas.

[032] A presente invenção também presente apresenta kits para o tratamento de uma doença genética, sendo que os ditos kits compreendem pelo menos um oligonucleotídeo antissentido da presente invenção embalado em um recipiente apropriado e instruções para a sua utilização.

[033] Outros aspectos e vantagens da presente invenção ficarão evidentes aos especialistas na técnica a partir da revisão da descrição abaixo, que prossegue com referência às figuras em anexo.

Breve Descrição dos Desenhos

[034] A Figura 1 é uma representação esquemática de motivos e domínios envolvidos no reconhecimento do éxon, na eliminação do íntron e no splicing.

[035] A Figura 2 é uma representação diagramática do conceito de salto de éxon induzido pelo oligonucleotídeo antissentido para desviar mutações causadoras de doenças (desenho sem escala). A caixa hachurada representa um éxon portador de uma mutação que impede a tradução do resto do mRNA em uma proteína. A barra preta sólida representa um oligonucleotídeo antissentido que impede a inclusão deste éxon no mRNA maduro.

[036] A Figura 3 ilustra o sistema de eletroforese em gel que mostra um "coquetel" de moléculas antissentido direcionadas para o éxon 3, que induz o salto de éxon forte e consistente a uma concentração de transfecção de 10 nanomolar em células musculares humanas cultivadas.

[037] A Figura 4 ilustra o sistema de eletroforese em gel que mostra um "coquetel" de moléculas antissentido direcionadas para o éxon 4, que induz o salto de éxon forte e consistente a uma concentração de transfecção de 25 nanomolar em células musculares humanas cultivadas.

[038] A Figura 5 ilustra o sistema de eletroforese em gel que mostra o salto de éxon humano 5 forte e eficaz por meio do uso de moléculas antissentido [H5a(+35+65)] direcionadas em um domínio interno do éxon 5, presumivelmente um potencializador de splicing de éxon. Este composto preferido induz o salto de éxon consistente a uma concentração de transfecção de 25 nanomolar em células musculares humanas cultivadas.

[039] A Figura 6 ilustra o sistema de eletroforese em gel que mostra um "coquetel" de moléculas antissentido direcionadas para o éxon 8, que induz o salto forte e consistente do éxon 8 e dos éxons 8/9 a uma concentração de transfecção de 10 nanomolar em células musculares humanas cultivadas.

[040] A Figura 7 ilustra o sistema de eletroforese em gel que mostra vários "coquetéis" e moléculas antissentido simples que induzem o salto do éxon 10 e dos éxons circundantes. Uma combinação de [H10A(-05 +16)] e [H10A(+98+119)] ou [H10A(-05+16)] e [H10A(+130+149)] induz o salto do éxon 10 e dos éxons 9-12, enquanto [H10A(-05+16)] sozinha induz o salto dos éxons 9-14.

[041] A Figura 8 ilustra o sistema de eletroforese em gel que mostra o salto do éxon 14 por meio do uso da molécula antissentido H14A(+31 +61) direcionada para o éxon 14.

[042] Figura 9 ilustra o sistema de eletroforese em gel que mostra o salto do éxon 17 por meio do uso da molécula antissentido H17A(+10 +35) direcionada para o éxon 17.

[043] A Figura 10 ilustra o sistema de eletroforese em gel que mostra dois coquetéis de moléculas antissentido direcionadas para o éxon 26. O coquetel duplo [H26A(-07+19)] e [H26A(+24+50)] induz um bom salto do éxon 26, e a adição de uma molécula antissentido adicional ao coquetel não afeta a eficácia do salto.

[044] A Figura 11 ilustra o sistema de eletroforese em gel que mostra um "coquetel" de moléculas antissentido direcionadas para o éxon 36, que induz o salto de éxon forte e consistente a uma concentração de transfecção de 25 nanomolar em células musculares humanas cultivadas.

[045] A Figura 12 ilustra o sistema de eletroforese em gel que mostra o salto forte e consistente do éxon 43 a 25 nanomolar em células musculares humanas cultivadas, por meio do uso da molécula antissentido H43A(+92+117).

[046] A Figura 13 ilustra o sistema de eletroforese em gel que mostra o salto do éxon 55 dose dependente, por meio do uso da molécula antissentido H44A(+65+90).

[047] A Figura 14 ilustra o sistema de eletroforese em gel que mostra o salto forte e consistente do éxon 45, por meio do uso da molécula antissentido H45A(-09+25).

[048] A Figura 15 ilustra o sistema de eletroforese em gel que mostra o salto forte e consistente do éxon 46, por meio do uso da molécula antissentido H46A(+81+109).

[049] A Figura 16 ilustra o sistema de eletroforese em gel que mostra o salto forte e consistente do éxon 47, por meio do uso da molécula antissentido H47A (+01+29).

[050] A Figura 17 ilustra o sistema de eletroforese em gel que mostra um "coquetel" de moléculas antissentido direcionadas para o éxon 47, que induzem o salto de éxon forte e consistente.

[051] A Figura 18 ilustra o sistema de eletroforese em gel que mostra o salto forte e consistente do éxon 49, por meio do uso da molécula antissentido H49A(+45+70).

[052] A Figura 19 ilustra o sistema de eletroforese em gel que mostra o salto forte e consistente do éxon 50, por meio do uso da molécula antissentido H50A(+48+74).

[053] A Figura 20 ilustra o sistema de eletroforese em gel que mostra o salto forte e consistente do éxon 51, por meio do uso da molécula antissentido H51A(+66+95).

[054] A Figura 21 ilustra o sistema de eletroforese em gel que mostra o salto forte e consistente do éxon 54, por meio do uso da molécula antissentido H54A(+67+97).

[055] A Figura 22 ilustra o sistema de eletroforese em gel que mostra a molécula antissentido H55A(-10+20) que induziu o salto do éxon 55 dose dependente.

[056] A Figura 23 ilustra o sistema de eletroforese em gel que mostra o salto forte e consistente do éxon 56, por meio do uso da molécula antissentido H56A(+92+121).

[057] A Figura 24 ilustra o sistema de eletroforese em gel que mostra a molécula antissentido H57A(-10+20) que induziu o salto do éxon 57 dose dependente.

[058] A Figura 25 ilustra o sistema de eletroforese em gel que mostra o salto do éxon 59 e dos éxons 58/59, por meio do uso da molécula antissentido H59A(+96+120) direcionada para o éxon 59.

[059] A Figura 26 ilustra o sistema de eletroforese em gel que mostra dois coquetéis diferentes que induzem o salto do éxon 60.

[060] A Figura 27 ilustra o sistema de eletroforese em gel que mostra o salto do éxon 63, por meio do uso da molécula antissentido H63A(+20+49).

[061] A Figura 28 ilustra o sistema de eletroforese em gel que mostra o salto do éxon 64, por meio do uso da molécula antissentido H64A(+34+62).

[062] A Figura 29 ilustra o sistema de eletroforese em gel que mostra um "coquetel" de moléculas antissentido direcionadas para o éxon 66, que induz o salto de éxon dose dependente.

[063] A Figura 30 ilustra o sistema de eletroforese em gel que mostra o salto do éxon 67, por meio do uso da molécula antissentido H67A(+17+47).

[064] A Figura 31 ilustra o sistema de eletroforese em gel que mostra um "coquetel" de moléculas antissentido direcionadas para o éxon 68, que induz o salto de éxon dose dependente.

[065] A Figura 32 ilustra o sistema de eletroforese em gel que mostra um "coquetel" de moléculas, que induz o salto de éxon forte e consistente dos éxons 69/70 a uma concentração de transfecção de 25 nanomolar.

[066] A Figura 33 ilustra o sistema de eletroforese em gel que mostra vários "coquetéis" de moléculas antissentido, que induzem vários níveis de salto no éxon 50.

[067] A Figura 34 ilustra o sistema de eletroforese em gel que mostra um coquetel de três moléculas antissentido, que induz o salto eficaz dos éxons 50/51.

[068] A Figura 35 é um gráfico dos resultados da densitometria que mostra diversos níveis de eficácia no salto de éxon. As moléculas antissentido testadas foram Éxon 3 [H3A(+30+60) & H3A(+61+85)]; Éxon 4 [H4D(+14-11) e H4A(+11+40)]; Éxon 14 [H14A(+32+61)]; Éxon 17 [H17A(+10+35)]; Éxon 26 [H26A(-07+19), H26A(+24+50) & H26A(+68+92)]; Éxon 36 [H36A(-16+09) & H36A(+22+51)].

[069] A Figura 36 é um gráfico dos resultados da densitometria que mostra diversos níveis de eficácia no salto de éxon. As moléculas antissentido testadas foram Éxon 46 [H46A(+81+109)]; Éxon 47 [H47A(+01+29)]; Éxon 48 [H48A(+01+28) & H48A(+40+67)]; Éxon 49 [H49A(+45+70)].

[070] A Figura 37 ilustra o sistema de eletroforese em gel que mostra o salto do éxon 11, por meio do uso da molécula antissentido H11A(+50+79).

[071] A Figura 38 ilustra o sistema de eletroforese em gel que mostra o salto do éxon 12, por meio do uso da molécula antissentido H12A(+30+57).

[072] A Figura 39 ilustra o sistema de eletroforese em gel que mostra o salto do éxon 44, por meio do uso da molécula antissentido H44A(+59+85).

[073] A Figura 40 ilustra o sistema de eletroforese em gel que mostra o salto do éxon 45, por meio do uso da molécula antissentido H45A(- 03+25).

[074] A Figura 41 ilustra o sistema de eletroforese em gel que mostra o salto do éxon 51, por meio do uso da molécula antissentido H51A(+71+100).

[075] A Figura 42 ilustra o sistema de eletroforese em gel que mostra o salto do éxon 52, por meio do uso da molécula antissentido H52A(+09+38).

[076] A Figura 43 ilustra o sistema de eletroforese em gel que mostra o salto do éxon 53, por meio do uso da molécula antissentido H53A(+33+65).

[077] A Figura 44 ilustra o sistema de eletroforese em gel que mostra o salto do éxon 46, por meio do uso da molécula antissentido H46A(+93+122).

[078] A Figura 45 ilustra o sistema de eletroforese em gel que mostra o salto do éxon 73, por meio do uso da molécula antissentido H73A(+02+26).

[079] A Figura 46 ilustra sequências de moléculas antissentido.

Descrição Detalhada:

[080] Breve Descrição das Listagens de Sequências Tabela 1A: Moléculas antissentido simples Tabela 1B: Coquetéis de moléculas antissentido

Generalidades:

[081] Os especialistas na técnica apreciarão que a invenção aqui descrita podem apresentar variações e modificações diferentes daquelas descritas especificamente. Deve-se compreender que a presente invenção inclui todas as ditas variações e modificações. A presente invenção também inclui todas as etapas, características, composições e todos os compostos referidos ou indicados no presente relatório, sejam individual ou coletivamente, e qualquer e todas as combinações ou qualquer duas ou mais das etapas ou características.

[082] A presente invenção não deve ser limitada em seu âmbito pelas modalidades específicas aqui descritas, cujo propósito é apenas de exemplificação. Os produtos funcionalmente equivalentes, composições e métodos estão claramente incluídos no âmbito da presente invenção, conforme aqui descrito.

[083] Os números de identidade de sequência (ID. SEQ. No.:) contendo informação da sequência de nucleotídeos e aminoácidos incluídos no presente relatório são coletados no final da descrição e foram preparados por meio do uso do programa PatentIn Version 3.0. Cada sequência de nucleotídeos ou aminoácidos é identificada na listagem de sequências pelo indicador numérico <210> seguido pelo identificador de sequência (por exemplo: <210>1, <210>2, etc.) O comprimento, o tipo de sequência e o organismo de origem para cada sequência de nucleotídeos ou aminoácidos são indicados por informações fornecidas nos campos de indicadores numéricos <211>, <212> e <213>, respectivamente. Sequências de nucleotídeos e aminoácidos referidos no presente relatório são definidas pela informação fornecida no campo indicador numérico <400> seguida pelo identificador de sequência (por exemplo, <400>1, <400>2, etc.).

[084] Um sistema de nomenclatura de molécula antissentido foi proposto e publicado para distinguir as diferentes moléculas antissentido (vide Mann e outros, 2002, em J. Gen. Med. 4, 644-654). Esta nomenclatura tornou-se especialmente relevante quando foram testadas várias moléculas antissentido levemente diferentes, sendo todas direcionadas para a mesma região alvo, conforme mostrado abaixo:H # A/D (x : y).

[085] A primeira letra designa a espécie (por exemplo, H: humano, M: murino, C: canino);"#" designa o número do éxon de distrofina alvo;"A/D" indica local de splicing receptor ou doador no início e no final do éxon, respectivamente.

[086] (x y) representa as coordenadas de associação onde "-" ou "+" indicam sequências intrônicas ou exônicas, respectivamente. Como um exemplo, A(-6+18) poderia indicar as últimas 6 bases do íntron que precedem o éxon alvo e as primeiras 18 bases do éxon alvo. O local de splicing mais próximo do receptor para essas coordenadas seria precedido de um "A". A descrição das coordenadas de associação no local de splicing doador pode ser D(+2-18), sendo que as últimas duas bases exônicas e as 18 primeiras bases intrônicas correspondem ao local de associação da molécula antissentido. As coordenadas de associação inteiramente exônicas são seriam representados por A(+65+85), que é o local entre os 65° e 85° nucleotídeos a partir do início deste éxon.

[087] As descrições completas de todas as publicações (incluindo patentes, pedidos de patentes, artigos de revistas, manuais de laboratório, livros ou outros documentos) aqui citadas são incorporadas a título de referência. Não é feita nenhuma admissão de que qualquer uma das referências da técnica anterior constitui ou faz parte do conhecimento geral comum das pessoas que trabalham no campo ao qual a presente invenção se refere.

[088] Como aqui utilizados, os termos "derivado" e "derivado de" indicam que um número inteiro específico pode ser obtido a partir de uma fonte particular, embora não necessariamente diretamente a partir dessa fonte.

[089] Em todo o relatório, a menos que o contexto exija o contrário, a palavra "compreender" ou suas variações, como "compreende" ou "compreendendo" implica a inclusão de um número inteiro declarado ou grupo de números inteiros, mas não a exclusão de qualquer outro número inteiro ou grupo de números inteiros.

[090] Outras definições para os termos selecionados aqui utilizados podem ser encontradas na descrição detalhada da invenção e aplicadas em todo o relatório. A menos que definidos de outra forma, todos os outros termos técnicos e científicos aqui utilizados têm o mesmo significado como habitualmente conhece um especialista na técnica à qual a presente invenção pertence.

Descrição da Modalidade Preferida

[091] Quando molécula(s) antissentido é/são direcionada(s) para sequências de nucleotídeos envolvidas no splicing em éxons dentro de sequências de pré-mRNA, o splicing normal do éxon pode ser inibido, fazendo com que a maquinaria de splicing desvie todo o éxon mutado do mRNA maduro. O conceito de salto de éxon induzido por oligonucleotídeo antissentido é mostrado na Figura 2.

[092] Em muitos genes, a eliminação de um éxon inteiro levaria à produção de uma proteína não funcional através da perda de domínios funcionais importantes ou o rompimento do quadro de leitura. No entanto, em algumas proteínas, é possível diminuir a proteína através da eliminação de um ou mais éxons de dentro da proteína, sem interromper o quadro de leitura e sem alterar gravemente a atividade biológica da proteína. Tipicamente, tais proteínas têm um papel estrutural e/ou possuem domínios funcionais em suas extremidades. A presente invenção descreve moléculas antissentido capazes de se ligarem a um específico pré-mRNA de distrofina alvo e redirecionar o processamento desse gene.

[093] Um objetivo preferido de uma terapia baseada em moléculas antissentido é obter o salto de éxon máximo, ao fornecer a concentração mais baixa possível da molécula antissentido. Geralmente, uma molécula antissentido pode causar um salto de éxon forte e robusto, um salto de éxon fraco e esporádico ou nenhum salto de éxon. É preferível desenvolver moléculas antissentido (sozinhas ou em combinação) que possam apresentar um salto de éxon forte, robusto e consistente a uma dose terapêutica baixa.

Moléculas Antissentido

[094] De acordo com um primeiro aspecto da presente invenção, são apresentadas moléculas antissentido capazes de se ligarem a um alvo selecionado para induzir o salto de éxon. Para induzir o salto de éxon em éxons da transcrição do gene da distrofina, as moléculas antissentido são, de preferência, selecionadas entre o grupo de compostos apresentados na Tabela 1A.

[095] Também é apresentada uma combinação ou "coquetel" de dois ou mais oligonucleotídeos antissentido capazes de se ligarem a um alvo selecionado para induzir o salto de éxon. Para induzir o salto de éxon em éxons da transcrição do gene da distrofina, as moléculas antissentido em um "coquetel" são, de preferência, selecionadas do grupo de compostos mostrados na Tabela 1B.

[096] Projetar moléculas antissentido para mascarar completamente os locais de splicing pode não gerar necessariamente qualquer salto do éxon alvo. Além disso, os inventores da presente invenção descobriram que o tamanho ou o comprimento do próprio oligonucleotídeo antissentido não é sempre um fator primário quando se projeta moléculas antissentido. Com alguns alvos, como, por exemplo, o éxon 19, os oligonucleotídeos antissentido tão curtos quanto 12 bases foram capazes de induzir o salto de éxon, embora não de forma tão eficaz quanto os oligonucleotídeos mais longos (20-31 bases). Em alguns outros alvos, como, por exemplo, o éxon 23 de distrofina de murino, os oligonucleotídeos antissentido de apenas 17 resíduos foram capazes de induzir o salto de forma mais eficaz que o outro composto sobreposto de 25 nucleotídeos. No entanto, os inventores da presente invenção também descobriram que as moléculas antissentido mais longas são frequentemente mais eficazes na indução do salto do éxon do que as moléculas mais curtas. Assim, de preferência, as moléculas antissentido da presente invenção têm entre 24 e 30 ácidos nucleicos de comprimento, de preferência, aproximadamente 28 nucleotídeos de comprimento. Por exemplo, foi previamente descoberto que um oligonucleotídeo antissentido de 20 bases (H16A(-07+13)) foi ineficaz na indução do salto de éxon do éxon 16, mas um oligonucleotídeo de 31 bases (H16A(-06+25)), que englobava completamente o oligonucleotídeo mais curto, foi eficaz na indução do salto (Harding e outros, 2007, em Mol. Ther. 15:157-166).

[097] Os inventores também descobriram que não parece haver qualquer motivo padrão que possa ser bloqueado ou mascarado pelas moléculas antissentido para redirecionar o splicing. Em alguns éxons, como, por exemplo, o éxon 23 de distrofina de camundongo, o local de splicing doador foi o mais receptivo ao alvo para redirecionar o salto deste éxon. Deve-se observar que o projeto e o teste de uma série de moléculas antissentido específicas do éxon 23 para associar-se com regiões sobrepostas do local de splicing doador mostraram uma variação considerável na eficácia do salto de éxon induzido. Conforme relatado por Mann e outros (2002), houve uma variação significativa na eficácia de desviar a mutação sem sentido dependendo da associação do oligonucleotídeo antissentido (“Improved antisense oligonucleotide induced exon skipping in the mdx mouse model of muscular dystrophy”, em J. Gen. Med. 4: 644-654). Direcionar para o local receptor do éxon 23 ou vários domínios internos, não induziu nenhum salto consistente do éxon 23.

[098] Em outros éxons focalizados para eliminação, mascarar o local de splicing doador não induziu qualquer salto de éxon. No entanto, ao orientar as moléculas antissentido para o local de splicing receptor (éxon 8 humano, conforme discutido abaixo), induziu-se o salto de éxon forte e sustentado. Deve-se observar que a eliminação do éxon 8 humano foi fortemente ligada com a eliminação conjunta do éxon 9. Não há nenhuma homologia de sequência forte entre os oligonucleotídeos antissentido do éxon 8 e as regiões correspondentes do éxon 9, de modo que não parece ser uma questão de reação cruzada. Pelo contrário, o splicing destes dois éxons está geralmente ligado. Este não é um exemplo isolado, uma vez que se observa o mesmo efeito em células caninas, pois ao focalizar o éxon 8 para eliminação, também resultou no salto do éxon 9. Focalizar o éxon 23 para a eliminação no pré-mRNA de distrofina de camundongo também resulta na eliminação frequente do éxon 22. Este efeito ocorre de maneira dose-dependente e também indica um processamento estreitamente coordenado de dois éxons adjacentes.

[099] Em outros éxons alvo, as moléculas antissentido direcionadas para os locais de splicing doadores ou receptores não induziram o salto de éxon ou induziram saltos pobres, enquanto a associação de moléculas antissentido em regiões exônicas (ou seja, potencializadores de splicing de éxon dentro do éxon 4 de distrofina humana) foi mais eficaz na indução do salto de éxon. Alguns éxons, tanto o éxon 19 humano, como o camundongo, por exemplo, são prontamente saltados ao focalizar as moléculas antissentido para uma variedade de motivos. Isto é, o salto do éxon alvo é induzido após o uso de oligonucleotídeos antissentido para mascarar locais de splicing doadores ou receptores ou potencializadores de splicing de éxon.

[0100] Também não é possível predizer quais coquetéis de moléculas antissentido induzirão o salto de éxon. Por exemplo, a combinação de duas moléculas antissentido que, por si só, são muito boas na indução do salto de um determinado éxon, pode não causar o salto de um éxon quando combinadas em um coquetel. Por exemplo, cada uma de H50A(+02+30) e H50A(+66+95), por si só, induz um bom salto dos éxons 50 e 51. Entretanto, em combinação, como um coquetel, elas apenas induziram um salto pobre dos dois éxons. Da mesma forma, a combinação de H50A(+02+30) e H51A(+66+90) ou H50A(+02+30) e H51A(+61+90) não causa um salto eficaz dos éxons 50 e 51, embora individualmente as moléculas antissentido sejam eficazes. Contudo, a introdução de uma terceira molécula antissentido [H51 D(+16-07)], que, por si só, não causa saltos, criou um coquetel de três elementos ([H50A(+02+30)], H51A(+61+90) e [H51D(+16-07)], que foi capaz de provocar salto dos éxons 50 e 51 a menos de 1 nM.

[0101] Alternativamente, a combinação de duas ou três moléculas antissentido que por si só são ineficazes ou apenas moderadamente eficazes pode causar um excelente salto quando combinadas. Por exemplo, H26A(-07+19) [ID. SEQ. No.: 39], H26A(+24+50) [ID. SEQ. No.: 40] e H26A(+68+92) [ID. SEQ. No.: 41] [41] causam, individualmente, salto ineficaz do éxon 26, assim como também induzem o salto de éxon múltiplo (26-29 ou 2730). No entanto, quando os três éxons são combinados como um coquetel, ocorre o salto do éxon 26 altamente eficaz.

[0102] A partir dos exemplos e discussão acima, é evidente que não há uma maneira de prever com precisão se uma combinação irá funcionar ou não.

[0103] As moléculas antissentido podem causar o salto de éxons de uma maneira "dependente da dose" ou "não dependente da dose". Por moléculas antissentido "dependentes da dose", entende-se que uma maior quantidade de moléculas antissentido induz melhor o salto de éxon, enquanto por moléculas antissentido "não dependentes da dose", entende-se que as moléculas antissentido são capazes de induzir o salto mesmo mediante doses muito baixas. Por exemplo, na Figura 15, pode-se observar que H46A(+81+109) [ID. SEQ. No.: 12] dá igualmente bom salto do éxon 46, independentemente da quantidade de moléculas antissentido presentes (de 600nM a 25nM). Em contraste, H57A(-10+20) [ID. SEQ. No.: 20] (Figura 24) induz um forte salto do éxon 57 a 100 nM, mas um salto reduzido a 50 nM e uma redução ainda maior no salto a 25nM.

[0104] É preferível selecionar as moléculas antissentido que induzem o salto de uma maneira independente da dose, uma vez que estas moléculas podem ser administradas em concentrações muito baixas e ainda assim oferecer um efeito terapêutico. No entanto, também é aceitável selecionar como moléculas preferidas aquelas moléculas antissentido que induzem o salto de uma forma dependente da dose, particularmente se as moléculas induzem um bom ou excelente salto a baixas concentrações. De preferência, as moléculas antissentido da presente invenção são capazes de induzir um bom ou excelente salto de éxon a concentrações inferiores a 500 nM, preferivelmente, inferiores a 200nM e, mais preferivelmente, tão baixo quanto 100 nM, 50 nM ou a 25 nM. Preferivelmente, as moléculas de oligonucleotídeos da presente invenção são capazes de induzir o salto em níveis superiores a 30% a uma concentração de 100 nM.

[0105] Para identificar e selecionar os oligonucleotídeos antissentido apropriados para utilização na modulação do salto de éxon, primeiramente, deve-se identificar uma sequência de ácido nucleico, cuja função é a de ser modulada. Este pode ser, por exemplo, um gene (ou mRNA transcrito do gene) cuja expressão é associada a um determinado distúrbio ou estado de doença, ou uma molécula de ácido nucleico de um agente infeccioso. Dentro do contexto da presente invenção, o(s) local(s) alvo preferido(s) é/são aquele(s) envolvido(s) no splicing do mRNA (isto é, locais de splicing doadores, locais de splicing receptores ou elementos potencializadores de splicing exônico). Os pontos de ramificação de splicing e as sequências de reconhecimento de éxons ou potencializadores de splicing também são potenciais locais alvo para modulação do splicing do mRNA.

[0106] De preferência, a presente invenção tem o objetivo de apresentar moléculas antissentido capazes de se ligarem a um alvo selecionado no pré-mRNA de distrofina para induzir o salto de éxon de forma eficaz e consistente. A distrofia muscular de Duchenne surge a partir de mutações que impedem a síntese de um produto gênico funcional da distrofina. Estes defeitos gênicos de distrofia muscular de Duchenne são tipicamente mutações sem sentido ou rearranjos genômicos, como deleções, duplicações ou microdeleções ou inserções que desestabilizam o quadro de leitura. Uma vez que o gene da distrofina humana é um gene grande e complexo (com 79 éxons sendo submetidos ao splicing em conjunto para gerar um mRNA maduro com um quadro de leitura aberta de aproximadamente 11.000 bases), há muitas posições onde estas mutações podem ocorrer. Consequentemente, uma terapia baseada em oligonucleotídeos antissentido completa para abranger muitas das diferentes mutações causadoras de doenças no gene da distrofina irá exigir que muitos dos éxons possam ser direcionados para a eliminação durante o splicing.

[0107] Dentro do contexto da presente invenção, o(s) local(s) alvo preferido(s) é/são aquele(s) envolvido(s) no splicing do mRNA (isto é, locais de splicing doadores, locais de splicing receptores ou elementos potencializadores de splicing exônico). Os pontos de ramificação de splicing e as sequências de reconhecimento de éxons ou potencializadores de splicing também são potenciais locais alvo para modulação do splicing do mRNA.

[0108] O oligonucleotídeo e o DNA ou RNA são complementares um do outro quando um número suficiente de posições correspondentes em cada molécula está ocupado por nucleotídeos que podem se unir um com o outro por ponte de hidrogênio. Assim, "especificamente hibridizável" e "complementar" são termos que utilizados para indicar um grau suficiente de complementaridade ou emparelhamento preciso, de tal maneira que ocorra uma ligação estável e específica entre o oligonucleotídeo e o DNA ou RNA alvo. Entende-se na técnica que a sequência de uma molécula antissentido não precisa ser 100% complementar à sua sequência alvo para ser especificamente hibridizável. Uma molécula antissentido é especificamente hibridizável quando a ligação do composto com a molécula de DNA ou RNA alvo interfere na função normal do DNA ou RNA alvo para causar uma perda de utilidade, e há um grau suficiente de complementaridade para evitar a ligação não específica do composto antissentido com sequências não alvo em condições em que se deseja a ligação específica, isto é, em condições fisiológicas, no caso de ensaios in vivo ou tratamento terapêutico e, no caso de ensaios in vitro, em condições em que os ensaios são executados.

[0109] Embora o método acima possa ser utilizado para selecionar moléculas antissentido capazes de eliminar qualquer éxon de dentro de uma proteína que possa ser encurtada, sem afetar a sua função biológica, a deleção do éxon não deve levar a um deslocamento do quadro de leitura no mRNA transcrito encurtado. Assim, se em uma sequência linear de três éxons, o final do primeiro éxon codifica dois dos três nucleotídeos de um códon e o próximo éxon é eliminado, então, o terceiro éxon na sequência linear deverá começar com um único nucleotídeo que seja capaz de completar o tripleto de nucleotídeos para um códon. Se o terceiro éxon não inicia com um único nucleotídeo, haverá um deslocamento do quadro de leitura que levaria à geração de uma proteína não funcional ou truncada.

[0110] Deve-se observar que as disposições dos códons no final de éxons em proteínas estruturais podem nem sempre quebrar no final de um códon. Por conseguinte, pode haver a necessidade de eliminar mais do que um éxon do pré-mRNA para assegurar a leitura no quadro do mRNA. Em tais circunstâncias, uma pluralidade de oligonucleotídeos antissentido pode precisar ser selecionada pelo método da presente invenção, sendo que cada um deles é direcionado a uma região diferente responsável pela indução do splicing nos éxons que serão excluídos.

[0111] O comprimento de uma molécula antissentido pode variar, contanto seja capaz de se ligar seletivamente ao local pretendido dentro da molécula do pré-mRNA. O comprimento de tais sequências pode ser determinado de acordo com os procedimentos de seleção aqui descritos. Geralmente, a molécula antissentido será de aproximadamente 10 nucleotídeos de comprimento até aproximadamente 50 nucleotídeos de comprimento. No entanto, deve-se observar que qualquer comprimento de nucleotídeos dentro desta variação pode ser utilizado no método. De preferência, o comprimento da molécula antissentido varia entre 17 a 30 nucleotídeos de comprimento. Surpreendentemente, verificou-se que as moléculas antissentido mais longas são frequentemente mais eficazes na indução do salto de éxon. Assim, de preferência, a molécula antissentido varia entre 24 e 30 nucleotídeos de comprimento.

[0112] Para determinar quais éxons podem ser conectados a um gene de distrofina, deve ser feita referência a um mapa de limites de éxons. A conexão de um éxon com outro é baseada nos éxons que possuem o mesmo número no limite 3' que está presente no limite 5' do éxon ao qual está conectado. Portanto, se o éxon 7 for excluído, o éxon 6 deve ser conectado ao éxon 12 ou 18 para manter o quadro de leitura. Portanto, precisam ser selecionados oligonucleotídeos antissentido, que redirecionem o splicing para os éxons 7 a 11 em primeira instância ou para os éxons 7 a 17, em segunda instância. Outra abordagem um pouco mais simples para restaurar o quadro de leitura em torno da deleção do éxon 7, seria remover os dois éxons flanqueantes. A indução do salto dos éxons 6 e 8 deve resultar em uma transcrição no quadro com o splicing dos éxons 5 a 9. Na prática, contudo, direcionar o éxon 8 para a eliminação do pré-mRNA resulta na eliminação conjunta do éxon 9, de tal modo que a transcrição resultante teria o éxon 5 unido ao éxon 10. A inclusão ou a exclusão do éxon 9 não altera o quadro de leitura.

[0113] Uma vez que foram identificadas as moléculas antissentido que serão testadas, elas são preparadas de acordo com as técnicas padrão conhecidas na técnica. O método mais comum para a produção de moléculas antissentido é a metilação da posição 2'-hidroxirribose e a incorporação de um esqueleto de fosforotioato. Isto produz moléculas que se assemelham superficialmente ao RNA, mas que são muito mais resistentes à degradação por nuclease.

[0114] Para evitar a degradação do pré-mRNA durante a formação de um dúplex com as moléculas antissentido, as moléculas antissentido utilizadas no método podem ser adaptadas para minimizar ou impedir a clivagem por RNase H endógena. Esta propriedade é altamente preferida, pois a presença de oligonucleotídeos de RNA não metilados em um ambiente intracelular ou em contato com extratos brutos contendo a RNase H levará à degradação dos dúplex de pré-mRNA:oligonucleotídeos antissentido. Qualquer forma de moléculas antissentido modificadas que seja capaz de desviar ou não induzir tal degradação pode ser utilizada no presente método. A resistência à nuclease pode ser obtida através da modificação das moléculas antissentido da presente invenção, de modo que compreenda uma cadeia de hidrocarboneto alifático parcialmente insaturado e um ou mais grupos carregados ou polares, incluindo grupos ácido carboxílico, grupos éster e grupos álcool.

[0115] Os derivados de 2'-O-metila são um exemplo de moléculas antissentido que, quando formam dúplex com RNA, não são clivadas por RNase H celular. Os 2'-O-metil-oligorribonucleotídeos são muito estáveis em um ambiente celular e nos tecidos animais, e os seus dúplexes com RNA têm maiores valores de Tm do que suas contrapartes ribo- ou desoxirribo-. Alternativamente, as moléculas antissentido resistentes à nuclease da presente invenção podem ter pelo menos um dos últimos nucleotídeos fluorados no 3'- terminal. Ainda alternativamente, as moléculas antissentido resistentes à nuclease da presente invenção têm ligações de fosforotioato que ligam entre pelo menos duas das últimas bases dos nucleotídeos no terminal 3’, de preferência, tendo ligações de fosforotioato de ligação entre as últimas quatro bases dos nucleotídeos no terminal 3’.

[0116] As moléculas antissentido que não ativam a RNase H podem ser feitas de acordo com técnicas conhecidas (vide, por exemplo, a Patente dos Estados Unidos No. 5.149.797). Tais moléculas antissentido, que podem ser sequências de desoxirribonucleotídeos ou ribonucleotídeos, simplesmente contêm qualquer modificação estrutural que estericamente impede ou previne a ligação da RNase H a uma molécula dúplex contendo o oligonucleotídeo como um membro do mesmo, cuja modificação estrutural não impede ou interrompe substancialmente a formação do duplex. Uma vez que as porções do oligonucleotídeo envolvido na formação do duplex são substancialmente diferentes das referidas porções envolvidas na ligação de RNase H do mesmo, estão disponíveis numerosas moléculas antissentido que não ativam a RNase H. Por exemplo, as ditas moléculas antissentido podem ser oligonucleotídeos, sendo que pelo menos um, ou todos, dos resíduos de fosfato de ponte internucleotídica são fosfatos modificados, como, por exemplo, metilfosfonatos, metilfosforotioatos, fosforomorfolidatos e fosforopiperazidatos e fosforamidatos. Por exemplo, todos os outros resíduos de fosfato de ponte internucleotídica podem ser modificados conforme descrição. Em outro exemplo não limitativo, as ditas moléculas antissentido são moléculas em que pelo menos um, ou todos, dos nucleotídeos contêm uma porção 2'-alquila inferior (por exemplo, alquila C1-C4 linear ou ramificada, saturada ou insaturada, tal como metila, etila, etenila, propila, 1-propenila, 2-propenila e isopropila). Por exemplo, todos os outros nucleotídeos podem ser modificados conforme descrição.

[0117] Embora os oligonucleotídeos antissentido sejam uma forma preferida das moléculas antissentido, a presente invenção compreende outras moléculas antissentido oligoméricas, incluindo, mas sem se limitar a miméticos oligonucleotídicos, conforme descrição abaixo.

[0118] Os exemplos específicos de compostos antissentido preferidos úteis na presente invenção incluem oligonucleotídeos contendo cadeias principais modificadas ou ligações internucleosídicas não naturais. Conforme definição no presente relatório descritivo, os oligonucleotídeos com cadeias principais modificadas incluem aqueles que retêm um átomo de fósforo no esqueleto e aqueles que não retêm um átomo de fósforo no esqueleto. Para as finalidades do presente relatório descritivo e conforme referidos na técnica, os oligonucleotídeos modificados que não possuem um átomo de fósforo em seu esqueleto internucleosídico também podem ser considerados oligonucleosídeos.

[0119] Em outros miméticos oligonucleotídicos preferidos, tanto o açúcar como a ligação internucleosídica, isto é, o esqueleto das unidades de nucleotídeos, são substituídos por grupos novos. As unidades de base são mantidas para hibridação com um composto alvo de ácido nucleico apropriado. Tal composto oligomérico, um mimético oligonucleotídico que tem demonstrado excelentes propriedades de hibridação, é referido como um ácido nucleico peptídico (ANP). Nos compostos de ANP, o esqueleto sacarídeo de um oligonucleotídeo é substituído por um esqueleto contendo amida, em particular, um esqueleto de aminoetilglicina. As nucleobases são retidas e ligadas direta ou indiretamente a átomos de nitrogênio aza da porção amida do esqueleto.

[0120] Os oligonucleotídeos modificados também podem conter uma ou mais porções de açúcar substituídas. Os oligonucleotídeos podem também incluir modificações ou substituições na nucleobase (muitas vezes referidas na técnica simplesmente como 'base'). Determinadas nucleobases são particularmente úteis para aumentar a afinidade de ligação dos compostos oligoméricos da presente invenção. Estas incluem pirimidinas 5- substituídas, 6-azapirimidinas e purinas N-2, N-6 e O-6 substituídas, incluindo 2- aminopropiladenina, 5-propiniluracil e 5-propinilcitosina. Substituições de 5- metilcitosina têm demonstrado aumento da estabilidade do ácido nucleico duplex a 0,6-1,2°C e são substituições de base atualmente preferidas, ainda mais particularmente quando combinadas com modificações de 2'-O-metoxietil açúcar.

[0121] Outra modificação dos oligonucleotídeos da presente invenção consiste em ligar, quimicamente, ao oligonucleotídeo, uma ou mais porções ou conjugados, que melhorem a atividade, a distribuição celular ou a captação celular do oligonucleotídeo. Tais porções incluem, mas não ficam limitadas a porções lipídicas, como, por exemplo, uma porção de colesterol, ácido cólico, um tioéter, como, por exemplo, hexil-S-tritiltiol, um tiocolesterol, uma cadeia alifática, como, por exemplo, resíduos de dodecanodiol ou undecil, um fosfolipídio, como, por exemplo, di-hexadecil-rac-glicerol ou 1,2-di-O- hexadecil-rac-glicero-3 H -fosfonato de trietilamônio, uma cadeia de poliam ina ou polietilenoglicol, ou ácido adamantanoacético, uma porção de palmitila ou uma porção de octadecilamina ou hexilaminocarboniloxicolesterol.

[0122] Não é necessário que todas as posições de um dado composto sejam modificadas uniformemente, e, de fato, mais de uma das modificações acima mencionadas podem ser incorporadas em um único composto ou até mesmo em um único nucleosídeo dentro de um oligonucleotídeo. A presente invenção também inclui compostos antissentido que são compostos quiméricos. Compostos antissentido "quiméricos" ou "quimeras", no contexto da presente invenção, são moléculas antissentido, particularmente oligonucleotídeos, que contêm duas ou mais regiões quimicamente distintas, sendo cada uma composta de pelo menos uma unidade monomérica, isto é, um nucleotídeo, no caso de um composto de oligonucleotídeos. Estes oligonucleotídeos contêm tipicamente pelo menos uma região na qual o oligonucleotídeo é modificado, de modo a conferir maior resistência à degradação por nuclease e maior captação celular, e uma região adicional para a maior afinidade de ligação ao ácido nucleico alvo.

Métodos de produção de moléculas antissentido

[0123] As moléculas antissentido utilizadas, de acordo com a presente invenção, podem ser conveniente e rotineiramente produzidas através da técnica bem conhecida de síntese em fase sólida. O equipamento para a dita síntese é vendido por vários fornecedores, incluindo, por exemplo, Applied Biosystems (Foster City, Califórnia). Um método para sintetizar oligonucleotídeos em um suporte sólido modificado é descrito na Patente dos Estados Unidos No. 4.458.066.

[0124] Adicionalmente, ou como alternativa, podem ser empregados quaisquer outros meios conhecidos na técnica para a dita síntese.É bem conhecida a utilização de técnicas semelhantes para preparar oligonucleotídeos, como, por exemplo, fosforotioatos e derivados alquilados. Em uma modalidade automatizada, são utilizadas dietilfosforamiditas como materiais de partida e podem ser sintetizadas conforme descrição por Beaucage, e outros, em Tetrahedron Letters (1981), 22:1859-1862.

[0125] As moléculas antissentido da presente invenção são sintetizadas in vitro e não incluem composições antissentido de origem biológica e nem construções de vetores genéticos concebidos para direcionar a síntese in vivo de moléculas antissentido. As moléculas da presente invenção também podem ser misturadas, encapsuladas, conjugadas ou de outra forma associadas com outras moléculas, estruturas moleculares ou misturas de compostos, como, por exemplo, lipossomas, moléculas direcionadas para o receptor, outras formulações tópicas, orais ou retais, para auxiliar na captação, distribuição e/ou absorção.

Agentes terapêuticos

[0126] A presente invenção também pode ser utilizada como um agente profilático ou terapêutico, que pode ser utilizado com a finalidade de tratamento de uma doença genética.

[0127] Por conseguinte, em uma modalidade, a presente invenção apresenta moléculas antissentido que se ligam a um alvo selecionado no pré-mRNA de distrofina para induzir o salto de éxon eficaz e consistente descrito no presente relatório descritivo, em uma quantidade terapeuticamente eficaz misturada com um veículo, diluente ou excipiente farmaceuticamente aceitável.

[0128] A expressão "farmaceuticamente aceitável" refere- se a entidades moleculares e composições que são fisiologicamente toleráveis e normalmente não produzem uma reação alérgica ou de forma semelhante inconveniente, como, por exemplo, perturbações gástricas e algo do gênero, quando administradas a um paciente. O termo "veículo" se refere a um diluente, adjuvante, excipiente ou veículo com o qual o composto é administrado. Tais veículos farmacêuticos podem ser líquidos estéreis, como, por exemplo, água e óleos, incluindo os de petróleo, origem sintética, animal, ou vegetal, como, por exemplo, óleo de amendoim, óleo de soja, óleo mineral, óleo de gergelim e semelhantes. De preferência, água ou soluções salinas e soluções de glicerol e dextrose aquosa são utilizadas como veículos, particularmente para soluções injetáveis. Veículos farmacêuticos apropriados são descritos por Martin, em Remington's Pharmaceutical Sciences, 18- Ed., Mack Publishing Co., Easton, PA, (1990).

[0129] Em uma forma mais específica da presente invenção, são fornecidas composições farmacêuticas compreendendo quantidades terapeuticamente eficazes de uma molécula antissentido em conjunto com diluentes, conservantes, solubilizantes, emulsionantes, adjuvantes e/ou veículos farmaceuticamente aceitáveis. Tais composições incluem diluentes de vários teores de tampão (por exemplo, Tris-HCl, acetato, fosfato), pH e força iônica e aditivos, como, por exemplo, detergentes e agentes solubilizantes (por exemplo, Tween 80, Polissorbato 80), antioxidantes (por exemplo, ácido ascórbico, metabissulfito de sódio), conservantes (por exemplo, Timerosal, álcool benzílico) e substâncias de volume (por exemplo, lactose, manitol). O material pode ser incorporado em preparações particuladas de compostos poliméricos como, por exemplo, ácido poliláctico, ácido poliglicólico, etc., ou em lipossomas. O ácido hialurônico também pode ser utilizado. As ditas composições podem influenciar o estado físico, a estabilidade, a taxa de liberação in vivo e a taxa de depuração in vivo das proteínas presentes e derivados. Vide, por exemplo, Martin, Remington's Pharmaceutical Sciences, 18a Ed. (1990, Mack Publishing Co., Easton, PA 18042), páginas 1435-1712, que estão aqui incorporadas a título de referência. As composições podem ser preparadas na forma líquida, ou pode estar em pó seco, como, por exemplo, na forma liofilizada.

[0130] Deve-se observar que as composições farmacêuticas fornecidas de acordo com a presente invenção podem ser administradas por qualquer meio conhecido na técnica. De preferência, as composições farmacêuticas para administração são administradas por injeção, oralmente, ou por via pulmonar ou nasal. As moléculas antissentido são, preferencialmente, administradas por via intravenosa, intra-arterial, intraperitoneal, intramuscular ou subcutânea.

Terapia baseada em molécula antissentido

[0131] Também abordada pela presente invenção é a utilização das moléculas antissentido da presente invenção na produção de um medicamento para a modulação de uma doença genética.

[0132] A administração de uma quantidade terapeuticamente útil de moléculas antissentido pode ser obtida por métodos previamente publicados. Por exemplo, a administração intracelular da molécula antissentido pode ser através de uma composição compreendendo uma mistura da molécula antissentido e uma quantidade eficaz de um copolímero em bloco. Um exemplo deste método é descrito no Pedido de Patente dos Estados Unidos No. 20040248833.

[0133] Outros métodos de administração de moléculas antissentido ao núcleo são descritos por Mann CJ e outros (2001), em [“Antisense-induced exon skipping and the synthesis of dystrophin in the mdx mouse ”. Proc., Natl. Acad. Science, 98(1) 42-47] e por Gebski e outros (2003), em Human Molecular Genetics, 12(15): 1801 -1811.

[0134] Um método para a introdução de uma molécula de ácido nucleico em uma célula por meio de um vetor de expressão, seja como DNA nu ou complexado com veículos lipídicos, é descrito na Patente dos Estados Unidos No. 6.806.084.

[0135] Pode ser desejável fornecer a molécula antissentido em um sistema de dispersão coloidal. Sistemas de dispersão coloidal incluem complexos macromoleculares, nanocápsulas, microesferas, grânulos e sistemas baseados em lipídios, incluindo emulsões óleo em água, micelas, micelas mistas e lipossomas ou formulações lipossômicas.

[0136] Os lipossomas são vesículas de membranas artificiais que são úteis como veículos de administração in vitro e in vivo. Estas formulações podem ter características de carga líquida catiônica, aniônica ou neutra e são características úteis com métodos de administração in vitro, in vivo e ex vivo. Tem sido demonstrado que as grandes vesículas unilamelares (LUV), que variam de 0,2-4,0 PHI.m em tamanho, podem encapsular uma percentagem substancial de um tampão aquoso contendo grandes macromoléculas. RNA e DNA podem ser encapsulados dentro do interior aquoso e serem administrados às células em uma forma biologicamente ativa (Fraley e outros, em Trends Biochem. Sei., 6:77, 1981).

[0137] Para que um lipossoma seja um veículo de transferência de genes eficaz, as seguintes características devem estar presentes: (1) encapsulação da molécula antissentido de interesse a uma alta eficácia, entretanto, sem comprometer a sua atividade biológica; (2) ligação preferencial e substancial a uma célula alvo, em comparação com as células não alvo; (3) administração do conteúdo aquoso da vesícula ao citoplasma da célula alvo com alta eficácia, e; (4) expressão precisa e eficaz da informação gênica (Mannino e outros, em Biotechniques, 6:682, 1988).

[0138] A composição do lipossoma é geralmente uma combinação de fosfolipídios, em particular, fosfolipídios de alta temperatura de transição de fase, geralmente em combinação com esteroides, especialmente o colesterol. Outros fosfolipídios ou outros lipídios também podem ser utilizados. As características físicas dos lipossomas dependem do pH, da força iônica e da presença de cátions divalentes.

[0139] Alternativamente, a construção antissentido pode ser combinada com outros veículos ou diluentes farmaceuticamente aceitáveis para a produção de uma composição farmacêutica. Os veículos e diluentes apropriados incluem soluções salinas isotônicas, como, por exemplo, solução salina tamponada com fosfato. A composição pode ser formulada para administração via parenteral, intramuscular, intravenosa, subcutânea, intraocular, oral ou transdérmica.

[0140] As vias de administração descritas destinam-se apenas como guia, uma vez que um especialista na técnica será capaz de determinar prontamente a melhor via de administração e qualquer dosagem para qualquer animal em particular e condição específica.

[0141] As moléculas antissentido da presente invenção englobam quaisquer sais, ésteres ou sais de tais ésteres farmaceuticamente aceitáveis, ou qualquer outro composto que, após administração a um animal, incluindo um ser humano, seja capaz de fornecer (direta ou indiretamente) o metabólito biologicamente ativo ou resíduo do mesmo. Portanto, por exemplo, a divulgação também é projetada para prodrogas e sais farmaceuticamente aceitáveis dos compostos da presente invenção, os sais farmaceuticamente aceitáveis de tais pró-drogas, e outros bioequivalentes.

[0142] A expressão "sais farmaceuticamente aceitáveis" refere-se aos sais farmaceuticamente e fisiologicamente aceitáveis dos compostos da presente invenção, isto é, sais que retêm a atividade biológica desejada do composto original e não conferem efeitos toxicológicos indesejáveis do mesmo.

[0143] Para os oligonucleotídeos, exemplos preferidos de sais farmaceuticamente aceitáveis incluem, mas não ficam limitados a: (a) sais formados com cátions como, por exemplo, sódio, potássio, amônio, magnésio, cálcio, poliaminas, como, por exemplo, espermina e espermidina, etc.; (b) sais de adição de ácido formados por ácidos inorgânicos, como, por exemplo, ácido clorídrico, ácido bromídrico, ácido sulfúrico, ácido fosfórico, ácido nítrico e semelhantes; (c) sais formados por ácidos orgânicos, como, por exemplo, ácido acético, ácido oxálico, ácido tartárico, ácido succínico, ácido maleico, ácido fumárico, ácido glucônico, ácido cítrico, ácido málico, ácido ascórbico, ácido benzóico, ácido tânico, ácido palmítico, ácido algínico, ácido poliglutâmico, ácido naftalenossulfônico, ácido metanossulfônico, ácido p-toluenossulfônico, ácido naftalenodisulfônico, ácido poligalacturônico e semelhantes, e; (d) sais formados a partir de ânions elementares, como, por exemplo, cloro, bromo e iodo.

[0144] As composições farmacêuticas da presente invenção podem ser administradas de diversas maneiras, dependendo se o tratamento local ou sistêmico é desejado e da área a ser tratada. A administração pode ser tópica (incluindo oftálmica e em membranas mucosas, incluindo administração retal), pulmonar, por exemplo, por inalação ou insuflação de pós ou aerossóis (incluindo por nebulizador, intratraqueal, intranasal, epidérmica e transdérmica), oral ou parenteral. A administração parenteral inclui administração intravenosa, administração intra-arterial, administração subcutânea, injeção intraperitoneal ou intramuscular ou infusão, ou intracraniana, por exemplo, administração intratecal ou administração intraventricular. Acredita-se que os oligonucleotídeos com pelo menos uma modificação 2'-O-metoxietila sejam particularmente úteis para a administração oral.

[0145] As formulações farmacêuticas da presente invenção, que podem ser convenientemente apresentadas na forma de dosagem unitária, podem ser preparadas de acordo com técnicas convencionais bem conhecidas na indústria farmacêutica. Tais técnicas incluem a etapa de colocar os ingredientes ativos em associação com o(s) excipiente(s) ou veículo(s) farmacêutico(s). Em geral, as formulações são preparadas ao colocar os ingredientes ativos em associação uniforme e íntima com veículos líquidos ou veículos sólidos precisamente divididos ou ambos e, depois, se necessário, moldando o produto.

Kits da Invenção

[0146] A presente invenção também fornece kits para o tratamento de um paciente com uma doença genética, sendo que o dito compreende pelo menos uma molécula antissentido embalada em um recipiente apropriado, juntamente com instruções para a sua utilização.

[0147] Em uma modalidade preferida da presente invenção, os kits irão conter pelo menos uma molécula antissentido, conforme mostrado na Tabela 1A, ou um coquetel de moléculas antissentido, conforme mostrado na Tabela 1B. Os kits também podem conter reagentes periféricos, como, por exemplo, tampões, estabilizadores, etc.

[0148] Os conteúdos do kit podem ser liofilizados e o kit pode conter, adicionalmente, um solvente apropriado para a reconstituição dos componentes liofilizados. Os componentes individuais do kit são embalados em recipientes separados e associado a tais recipientes pode ser incluído um aviso na forma prescrita por uma agência governamental que regula a produção, a utilização ou a venda de produtos farmacêuticos ou biológicos, sendo que o dito aviso descreve a aprovação do órgão de produção, utilização ou venda para administração humana.

[0149] Quando os componentes do kit são fornecidos em uma ou mais soluções líquidas, a solução líquida pode ser uma solução aquosa, como, por exemplo, uma solução aquosa estéril. Para uso in vivo, a construção de expressão pode ser formulada em uma composição injetável farmaceuticamente aceitável. Neste caso, o próprio recipiente pode ser um inalante, uma seringa, uma pipeta, conta-gotas ou outros, como, por exemplo, aparelhos, a partir do qual a formulação pode ser aplicada a uma área afetada do animal, como, por exemplo, nos pulmões, injetada em um animal, ou mesmo aplicada e misturada com os outros componentes do kit.

[0150] Os componentes do kit também podem ser fornecidos nas formas secas ou liofilizadas. Quando os reagentes ou os componentes são fornecidos na forma seca, a reconstituição é geralmente feita pela adição de um solvente apropriado. Prevê-se que o solvente também possa ser fornecido em qualquer outro tipo de recipiente. Independentemente do número ou do tipo de recipientes, os kits da presente invenção também podem compreender ou ser embalados com um instrumento para ajudar na injeção/administração ou na colocação da composição complexa final dentro do corpo de um animal. Este instrumento pode ser um inalante, uma seringa, uma pipeta, uma pinça, uma colher de medida, conta-gotas ou qualquer veículo de administração medicamente aprovado.

[0151 ] Os especialistas na técnica deverão apreciar que as aplicações do método acima têm uma ampla aplicação para identificar as moléculas antissentido apropriadas para utilização no tratamento de muitas outras doenças.

Exemplos

[0152] Os Exemplos seguintes servem para descrever de forma mais completa a forma de uso da presente invenção acima descrita, bem como para estabelecer os melhores modos contemplados para a realização de vários aspectos da presente invenção. Entende-se que de nenhum modo estes Exemplos pretendem limitar o verdadeiro escopo da presente invenção, mas são apresentados a título de ilustração. As referências aqui citadas são expressamente incorporadas a título de referência.

[0153] Os métodos de clonagem molecular, imunologia e química de proteína, que não são explicitamente descritos nos exemplos a seguir são relatados na literatura e são conhecidos por aqueles especialistas na técnica. Os textos gerais que descrevem técnicas convencionais de biologia molecular, microbiologia e DNA recombinante no âmbito da técnica incluem, por exemplo: Sambrook e outros, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Segunda Edição, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York (1989); Glover ed., DNA Cloning: A Practical Approach, Volumes I e II, MRL Press, Ltd., Oxford, U.K. (1985); e Ausubel, F., Brent, R., Kingston, R.E., Moore, D.D., Seidman, J.G., Smith, J.A., Struhl, K. Current Protocols in Molecular Biology. Greene Publishing Associates/Wiley Intersciences, New York (2002).

Determinação do salto de éxon induzido em células musculares humanas

[0154] Tentativas feitas pelos inventores de desenvolver uma abordagem racional no projeto de moléculas antissentido não foram completamente bem sucedidas, pois não pareceu ser uma tendência consistente que pudesse ser aplicada a todos os éxons. Como tal, a identificação dos compostos de moléculas antissentido mais eficazes e, por conseguinte, mais terapêuticos, tem sido resultante de estudos empíricos.

[0155] Estes estudos empíricos envolveu o uso de programas de computador para identificar motivos potencialmente envolvidos no splicing. Outros programas de computador também foram utilizados para identificar regiões do pré-mRNA que podem não ter tido uma estrutura secundária extensa e, por conseguinte, eram locais potenciais para a associação de moléculas antissentido. Nenhuma dessas abordagens se mostrou totalmente confiável no projeto de oligonucleotídeos antissentido para indução eficaz e confiável do salto de éxon.

[0156] Foram selecionados para análise locais de associação no pré-mRNA de distrofina humana, inicialmente com base em motivos conhecidos ou previstos ou regiões envolvidas no splicing. Os oligonucleotídeos antissentido 2OMe foram projetados para complementarem as sequências alvo sob pesquisa e foram sintetizados em um sintetizador de ácidos nucleicos Expedite 8909. Após a conclusão da síntese, os oligonucleotídeos da coluna de suporte foram clivados e desprotegidos com hidróxido de amônio antes de serem dessalinizados. A qualidade da síntese dos oligonucleotídeos foi monitorizada pela intensidade dos sinais de tritilo em cada etapa de desproteção durante a síntese, conforme foi detectado no registro da síntese. A concentração do oligonucleotídeo antissentido foi estimada por medição da absorvência de uma alíquota diluída a 260 nM.

[0157] Quantidades especificadas das moléculas antissentido foram então testadas quanto à sua capacidade para induzir o salto de éxon em um ensaio in vitro, conforme descrição abaixo.

[0158] Resumidamente, as culturas de mioblastos primários normais foram preparadas a partir de biópsias musculares humanas obtidas após consentimento informado. As células foram propagadas e colocadas para se diferenciarem em miotubos, por meio do uso de técnicas de cultura padrão. As células foram então transfectadas com os oligonucleotídeos antissentido por meio da administração dos oligonucleotídeos nas células como lipoplexos catiônicos, misturas de moléculas antissentido ou preparações de lipossomas catiônicos.

[0159] As células foram então colocadas para crescerem durante mais 24 horas, após o que o RNA total foi extraído e a análise molecular foi iniciada. Foi realizada uma amplificação por transcriptase reversa (RT-PCR) para estudar as regiões-alvo do pré-mRNA de distrofina ou as re-disposições induzidas exônicas.

[0160] Por exemplo, no teste de uma molécula antissentido para induzir o salto do éxon 19, o teste de amplificação por transcriptase reversa (RT-PCR) examinou diversos éxons para detectar o envolvimento de quaisquer éxons adjacentes. Por exemplo, quando o salto do éxon 19 foi induzido, a amplificação por transcriptase reversa (RT-PCR) foi realizada com iniciadores que amplificaram os éxons 17 e 21. Amplificações de produtos ainda maiores nesta área (isto é, éxons 13-26) também foram realizadas para garantir que havia uma distorção mínima de amplificação para a transcrição do salto induzido menor. Os produtos menores ou do éxon saltado tendem a ser amplificados com maior eficácia e podem distorcer a estimativa da transcrição normal e induzida.

[0161] Os tamanhos dos produtos da reação de amplificação foram estimados em um gel de agarose e comparados com os padrões de tamanho apropriados. A confirmação final da identidade destes produtos foi realizada por sequenciamento direto do DNA para estabelecer que as junções de éxon corretas ou esperadas fossem mantidas.

[0162] Uma vez que o salto do éxon eficaz foi induzido com uma molécula antissentido, subsequentes moléculas antissentido sobrepostas podem ser sintetizadas e depois avaliadas no ensaio, conforme descrição acima. A nossa definição de uma molécula antissentido eficaz é aquela que induz o salto do éxon forte e sustentado a concentrações de transfecção na ordem de 300 nM ou menos. De preferência, as moléculas de oligonucleotídeos da presente invenção são capazes de induzir o salto a níveis superiores a 30% a uma concentração de 100 nM.

Métodos de Densitometria

[0163] A análise de densitometria dos resultados dos procedimentos de salto de éxon foi realizada para determinar quais as moléculas antissentido atingiram a eficácia desejada. Os produtos de amplificação foram fracionados em gel de agarose a 2%, corados com brometo de etídio e as imagens captadas por um sistema de documentação de gel Chemi-Smart 3000 (Vilber Lourmat, Marne La Vallee). As bandas foram então analisadas por meio do uso do sistema de documentação de gel (Bio-Profil, Bio-1 D versão 11.9, Vilber Lourmat, Marne La Vallee), de acordo com as instruções do fabricante.

[0164] A densitometria foi realizada nas seguintes moléculas antissentido: Figura 35 Éxon 3 H3A(+30+60) & H3A(+61+85) Éxon 4 H4D(+14-11) & H4A(+11+40) Éxon 14 H14A(+32+61) Éxon 17 H17A(+10+35) Éxon 26 H26A(-07+19), H26A(+24+50) & H26A(+68+92) Éxon 36 H36A(-16+09) & H36A(+22+51) Figura 36 Éxon 46 H46A(+81+109) Éxon 47 H47A(+01+29) Éxon 48 H48A(+01+28) & H48A(+40+67) Éxon 49 H49A(+45+70)

Oligonucleotídeos antissentido direcionados para o éxon 17

[0165] Os oligonucleotídeos antissentido direcionados para o éxon 17 foram preparados e testados quanto à sua capacidade para induzir o salto de éxon em células musculares humanas, por meio do uso de métodos semelhantes, conforme descrição acima.

[0166] Na Tabela 2 abaixo, pode-se observar que o efeito de moléculas antissentido direcionadas ao mesmo local (o local de splicing receptor do éxon 17) pode ser muito diferente, mesmo que o local de ligação das duas moléculas antissentido seja sobreposto. H17A(-07+23) [ID. SEQ. No.: 3], que se associa às últimas 7 bases do íntron 16 e às primeiras 23 bases do éxon 17, induz o salto do éxon 17 quando administrada na célula a uma concentração de 25nM. Em contraste, a molécula antissentido H17A(-12+18), que se associa às últimas 12 bases do íntron 16 e às primeiras 18 bases do éxon 17, e, portanto, se sobrepõe ao local da ligação de H17A(-07+23), não foi absolutamente capaz de induzir o salto de éxon. Além disso, H17A(-07+16), que se associa às últimas 7 bases do íntron 16 e às primeiras 16 bases do éxon 17 causou o salto dos éxons 17 e 18 a 200nM. A molécula antissentido H17A(+61+86) [ID. SEQ. No.: 4], que se liga em um motivo potencializador de splicing intra-exônico do éxon 17, também é capaz de induzir um bom salto. Pode-se verificar que a capacidade das moléculas antissentido de induzir o salto de éxon não pode ser prevista simplesmente a partir de sua localização de ligação e deve ser determinada através de testes rigorosos.Tabela 2: sequências de moléculas antissentido testadas para determinar se elas induzem o salto do éxon 17

[0167] Estes dados mostram que algumas moléculas antissentido específicas induzem o salto de éxon eficaz enquanto outra molécula antissentido, que tem como alvo uma região sobreposta ou próxima, pode ser muito menos eficaz. Estudos de titulação mostram que uma molécula é capaz de induzir o salto do éxon alvo a 20-25 nM enquanto que uma molécula antissentido menos eficaz pode apenas induzir o salto de éxon a concentrações de 300 nM e acima. Portanto, foi demonstrado que a segmentação das moléculas antissentido para os motivos envolvidos no splicing desempenha um papel crucial na eficácia global deste composto.

[0168] A eficácia refere-se à capacidade de induzir o salto consistente de um éxon alvo. No entanto, às vezes, o salto dos éxons alvo está consistentemente associado com um éxon flanqueante. Isto é, verificou-se que o splicing de alguns éxons está firmemente ligado. Por exemplo, no éxon alvo 23 no modelo de camundongo de distrofia muscular com moléculas antissentido direcionadas para o local doador deste éxon, são frequentemente detectadas transcrições de distrofina ausentes nos éxons 22 e 23. Como outro exemplo, quando se utiliza uma molécula antissentido direcionado para o éxon 8 do gene de distrofina humana, muitas transcrições induzidas estão ausentes nos éxons 8 e 9.

Oligonucleotídeos antissentido direcionados para o éxon 2

[0169] Os oligonucleotídeos antissentido direcionados para o éxon 2 foram preparados e testados quanto à sua capacidade de induzir o salto de éxon em células musculares humanas, por meio do uso de métodos semelhantes, conforme descrição acima.Tabela 3: sequências de moléculas antissentido testadas para determinar se elas induzem o salto do éxon 2

Oligonucleotídeos antissentido direcionados para o éxon 3

[0170] Os oligonucleotídeos antissentido direcionados para o éxon 3 foram preparados e testados quanto à sua capacidade de induzir o salto de éxon em células musculares humanas, por meio do uso de métodos semelhantes, conforme descrição acima.

[0171] Utilizadas sozinhas, cada uma das moléculas antissentido H3A(+30+60) [ID. SEQ. No.: 31] e H3A(+61+85) [ID. SEQ. No.: 32] induziu o salto do éxon 3. No entanto, em combinação, as duas moléculas são ainda mais eficazes na indução do salto (Figura 3), e também são capazes de induzir o salto dos éxons 4 e 5 a 300nM e 600nM, um resultado não visto ou previsto pelos resultados da utilização de cada molécula antissentido sozinha. Produtos adicionais acima da transcrição induzida faltando o éxon 3 surgem a partir da amplificação dos iniciadores excedentes externos da amplificação por transcriptase reversa (RT-PCR), bem como a formação de heteroduplex.Tabela 4: sequências de moléculas antissentido testadas para determinar se elas induzem o salto do éxon 3

Oligonucleotídeos antissentido direcionados para o éxon 4

[0172] Os oligonucleotídeos antissentido direcionados para o éxon 4 foram preparados e testados quanto à sua capacidade de induzir o salto de éxon em células musculares humanas, por meio do uso de métodos semelhantes, conforme descrição acima.

[0173] A Figura 4 mostra o salto do éxon 4, por meio do uso de um coquetel de H4A(+11+40) [ID. SEQ. No.: 33] e H4D(+14-11) [ID. SEQ. No.: 34].Tabela 5: sequências de moléculas antissentido testadas para determinar se elas induzem o salto do éxon 4

Oligonucleotídeos antissentido direcionados para o éxon 5

[0174] Os oligonucleotídeos antissentido direcionados para o éxon 5 foram preparados e testados quanto à sua capacidade de induzir o salto de éxon em células musculares humanas, por meio do uso de métodos semelhantes, conforme descrição acima.

[0175] H5D(+26-05) seria considerada como uma molécula antissentido não preferencial, pois não induz nem mesmo o salto do éxon 5 de nível baixo. No entanto, H5a(+35+65) [ID. SEQ. No.: 1], que presumivelmente tem como alvo um elemento potencializador de splicing exônico, foi avaliada e demonstrou ser altamente eficaz na indução do salto daquele éxon alvo, conforme mostrado na Figura 5 e é considerado o composto preferido para indução do salto do éxon 5.Tabela 6: sequências de moléculas antissentido testadas para determinar se elas induzem o salto do éxon 5

Oligonucleotídeos antissentido direcionados para o éxon 6

[0176] Os oligonucleotídeos antissentido direcionados para o éxon 6 foram preparados e testados quanto à sua capacidade de induzir o salto de éxon em células musculares humanas, por meio do uso de métodos semelhantes, conforme descrição acima.Tabela 7: sequências de moléculas antissentido testadas para determinar se elas induzem o salto do éxon 6

Oligonucleotídeos antissentido direcionados para o éxon 7

[0177] Os oligonucleotídeos antissentido direcionados para o éxon 7 foram preparados e testados quanto à sua capacidade de induzir o salto de éxon em células musculares humanas, por meio do uso de métodos semelhantes, conforme descrição acima.Tabela 8: sequências de moléculas antissentido testadas para determinar se elas induzem o salto do éxon 7

Oligonucleotídeos antissentido direcionados para o éxon 8

[0178] Os oligonucleotídeos antissentido direcionados para o éxon 8 foram preparados e testados quanto à sua capacidade de induzir o salto de éxon em células musculares humanas, por meio do uso de métodos semelhantes, conforme descrição acima. Vide Figura 6.Tabela 9: sequências de moléculas antissentido testadas para determinar se elas induzem o salto do éxon 8

Oligonucleotídeos antissentido direcionados para o éxon 9

[0179] Os oligonucleotídeos antissentido direcionados para o éxon 9 foram preparados e testados quanto à sua capacidade de induzir o salto de éxon em células musculares humanas, por meio do uso de métodos semelhantes, conforme descrição acima.Tabela 10: sequências de moléculas antissentido testadas para determinar se elas induzem o salto do éxon 9

Oligonucleotídeos antissentido direcionados para o éxon 10

[0180] Os oligonucleotídeos antissentido direcionados para o éxon 10 foram preparados e testados quanto à sua capacidade de induzir o salto de éxon em células musculares humanas, por meio do uso de métodos semelhantes, conforme descrição acima. Vide Figura 7 para exemplos de uma molécula única de oligonucleotídeo antissentido e coquetéis que induzem o salto do éxon 10 e dos éxons adjacentes. A molécula única de oligonucleotídeo antissentido H10A(-05+16) [ID. SEQ. No.: 37] foi capaz de induzir o salto dos éxons 9-14, enquanto que a combinação com H10A(+98+119) [ID. SEQ. No.: 38] foi capaz de induzir o salto do éxon 10 sozinho e dos éxons 9-12 (e alguns saltos dos éxons 10-12). A combinação de H10A(-05+16) e H10A(+130+149) foi capaz de induzir o salto do éxon 10 e dos éxons 9-12.Tabela 11: sequências de moléculas antissentido testadas para determinar se elas induzem o salto do éxon 10

Oligonucleotídeos antissentido direcionados para o éxon 11

[0181 ] Os oligonucleotídeos antissentido direcionados para o éxon 11 foram preparados e testados quanto à sua capacidade de induzir o salto de éxon em células musculares humanas, por meio do uso de métodos semelhantes, conforme descrição acima. Vide Figura 37.Tabela 12: sequências de moléculas antissentido testadas para determinar se elas induzem o salto do éxon 11

Oligonucleotídeos antissentido direcionados para o éxon 12

[0182] Os oligonucleotídeos antissentido direcionados para o éxon 12 foram preparados e testados quanto à sua capacidade de induzir o salto de éxon em células musculares humanas, por meio do uso de métodos semelhantes, conforme descrição acima. Vide Figura 38. Tabela 13: sequências de moléculas antissentido testadas para determinar se elas induzem o salto do éxon 12

Oligonucleotídeos antissentido direcionados para o éxon 13

[0183] Os oligonucleotídeos antissentido direcionados para o éxon 13 foram preparados e testados quanto à sua capacidade de induzir o salto de éxon em células musculares humanas, por meio do uso de métodos semelhantes, conforme descrição acima. Tabela 14: sequências de moléculas antissentido testadas para determinar se elas induzem o salto do éxon 13

Oligonucleotídeos antissentido direcionados para o éxon 14

[0184] Os oligonucleotídeos antissentido direcionados para o éxon 14 foram preparados e testados quanto à sua capacidade de induzir o salto de éxon em células musculares humanas, por meio do uso de métodos semelhantes, conforme descrição acima. Vide Figura 8.Tabela 15: sequências de moléculas antissentido testadas para determinar se elas induzem o salto do éxon 14

Oligonucleotídeos antissentido direcionados para o éxon 16

[0185] Os oligonucleotídeos antissentido direcionados para o éxon 16 foram preparados e testados quanto à sua capacidade de induzir o salto de éxon em células musculares humanas, por meio do uso de métodos semelhantes, conforme descrição acima.Tabela 16: sequências de moléculas antissentido testadas para determinar se elas induzem o salto do éxon 16

Oligonucleotídeos antissentido direcionados para o éxon 17

[0186] Os oligonucleotídeos antissentido direcionados para o éxon 17 foram preparados e testados quanto à sua capacidade de induzir o salto de éxon em células musculares humanas, por meio do uso de métodos semelhantes, conforme descrição acima.Tabela 64: sequências de moléculas antissentido testadas para determinar se elas induzem o salto do éxon 17

Oligonucleotídeos antissentido direcionados para o éxon 18

[0187] Os oligonucleotídeos antissentido direcionados para o éxon 18 foram preparados e testados quanto à sua capacidade de induzir o salto de éxon em células musculares humanas, por meio do uso de métodos semelhantes, conforme descrição acima. Vide Figura 9. Tabela 17: sequências de moléculas antissentido testadas para determinar se elas induzem o salto do éxon 18

Oligonucleotídeos antissentido direcionados para o éxon 19

[0188] Os oligonucleotídeos antissentido direcionados para o éxon 19 foram preparados e testados quanto à sua capacidade de induzir o salto de éxon em células musculares humanas, por meio do uso de métodos semelhantes, conforme descrição acima.Tabela 18: sequências de moléculas antissentido testadas para determinar se elas induzem o salto do éxon 19

Oligonucleotídeos antissentido direcionados para o éxon 20

[0189] Os oligonucleotídeos antissentido direcionados para o éxon 20 foram preparados e testados quanto à sua capacidade de induzir o salto de éxon em células musculares humanas, por meio do uso de métodos semelhantes, conforme descrição acima. Tabela 19: sequências de moléculas antissentido testadas para determinar se elas induzem o salto do éxon 20

Oligonucleotídeos antissentido direcionados para o éxon 23

[0190] Os oligonucleotídeos antissentido direcionados para o éxon 23 foram preparados e testados quanto à sua capacidade de induzir o salto de éxon em células musculares humanas, por meio do uso de métodos semelhantes, conforme descrição acima. H23(+69+98)-SNP contém um polimorfismo de nucleotídeo único (SNP) que foi previamente documentado. Tabela 65: sequências de moléculas antissentido testadas para determinar se elas induzem o salto do éxon 23

Oligonucleotídeos antissentido direcionados para o éxon 24

[0191 ] Os oligonucleotídeos antissentido direcionados para o éxon 24 foram preparados e testados quanto à sua capacidade de induzir o salto de éxon em células musculares humanas, por meio do uso de métodos semelhantes, conforme descrição acima. Tabela 20: sequências de moléculas antissentido testadas para determinar se elas induzem o salto do éxon 24

Oligonucleotídeos antissentido direcionados para o éxon 25

[0192] Os oligonucleotídeos antissentido direcionados para o éxon 25 foram preparados e testados quanto à sua capacidade de induzir o salto de éxon em células musculares humanas, por meio do uso de métodos semelhantes, conforme descrição acima. O oligonucleotídeo H25A(+95+119)- DupA é uma molécula antissentido paciente específica. Tabela 21: sequências de moléculas antissentido testadas para determinar se elas induzem o salto do éxon 25

Oligonucleotídeos antissentido direcionados para o éxon 26

[0193] Os oligonucleotídeos antissentido direcionados para o éxon 26 foram preparados e testados quanto à sua capacidade de induzir o salto de éxon em células musculares humanas, por meio do uso de métodos semelhantes, conforme descrição acima. Vide Figura 10. Tabela 22: sequências de moléculas antissentido testadas para determinar se elas induzem o salto do éxon 26

Oligonucleotídeos antissentido direcionados para o éxon 31

[0194] Os oligonucleotídeos antissentido direcionados para o éxon 31 foram preparados e testados quanto à sua capacidade de induzir o salto de éxon em células musculares humanas, por meio do uso de métodos semelhantes, conforme descrição acima. Tabela 23: sequências de moléculas antissentido testadas para determinar se elas induzem o salto do éxon 31

Oligonucleotídeos antissentido direcionados para o éxon 32

[0195] Os oligonucleotídeos antissentido direcionados para o éxon 32 foram preparados e testados quanto à sua capacidade de induzir o salto de éxon em células musculares humanas, por meio do uso de métodos semelhantes, conforme descrição acima. Tabela 24: sequências de moléculas antissentido testadas para determinar se elas induzem o salto do éxon 32

Oligonucleotídeos antissentido direcionados para o éxon 34

[0196] Os oligonucleotídeos antissentido direcionados para o éxon 34 foram preparados e testados quanto à sua capacidade de induzir o salto de éxon em células musculares humanas, por meio do uso de métodos semelhantes, conforme descrição acima. Tabela 25: sequências de moléculas antissentido testadas para determinar se elas induzem o salto do éxon 34

Oligonucleotídeos antissentido direcionados para o éxon 35

[0197] Os oligonucleotídeos antissentido direcionados para o éxon 35 foram preparados e testados quanto à sua capacidade de induzir o salto de éxon em células musculares humanas, por meio do uso de métodos semelhantes, conforme descrição acima. Tabela 26: sequências de moléculas antissentido testadas para determinar se elas induzem o salto do éxon 35

Oligonucleotídeos antissentido direcionados para o éxon 36

[0198] Os oligonucleotídeos antissentido direcionados para o éxon 36 foram preparados e testados quanto à sua capacidade de induzir o salto de éxon em células musculares humanas, por meio do uso de métodos semelhantes, conforme descrição acima. Vide Figura 11. Tabela 27: sequências de moléculas antissentido testadas para determinar se elas induzem o salto do éxon 36

Oligonucleotídeos antissentido direcionados para o éxon 38

[0199] Os oligonucleotídeos antissentido direcionados para o éxon 38 foram preparados e testados quanto à sua capacidade de induzir o salto de éxon em células musculares humanas, por meio do uso de métodos semelhantes, conforme descrição acima.Tabela 28: sequências de moléculas antissentido testadas para determinar se elas induzem o salto do éxon 38

Oligonucleotídeos antissentido direcionados para o éxon 39

[0200] Os oligonucleotídeos antissentido direcionados para o éxon 39 foram preparados e testados quanto à sua capacidade de induzir o salto de éxon em células musculares humanas, por meio do uso de métodos semelhantes, conforme descrição acima. Tabela 29: sequências de moléculas antissentido testadas para determinar se elas induzem o salto do éxon 39

Oligonucleotídeos antissentido direcionados para o éxon 41

[0201 ] Os oligonucleotídeos antissentido direcionados para o éxon 41 foram preparados e testados quanto à sua capacidade de induzir o salto de éxon em células musculares humanas, por meio do uso de métodos semelhantes, conforme descrição acima. Tabela 30: sequências de moléculas antissentido testadas para determinar se elas induzem o salto do éxon 41

Oligonucleotídeos antissentido direcionados para o éxon 42

[0202] Os oligonucleotídeos antissentido direcionados para o éxon 42 foram preparados e testados quanto à sua capacidade de induzir o salto de éxon em células musculares humanas, por meio do uso de métodos semelhantes, conforme descrição acima. Tabela 31: sequências de moléculas antissentido testadas para determinar se elas induzem o salto do éxon 20

Oligonucleotídeos antissentido direcionados para o éxon 43

[0203] Os oligonucleotídeos antissentido direcionados para o éxon 43 foram preparados e testados quanto à sua capacidade de induzir o salto de éxon em células musculares humanas, por meio do uso de métodos semelhantes, conforme descrição acima. Vide Figura 12. Tabela 32: sequências de moléculas antissentido testadas para determinar se elas induzem o salto do éxon 20

Oligonucleotídeos antissentido direcionados para o éxon 44

[0204] Os oligonucleotídeos antissentido direcionados para o éxon 44 foram preparados e testados quanto à sua capacidade de induzir o salto de éxon em células musculares humanas, por meio do uso de métodos semelhantes, conforme descrição acima. Vide Figura 13 e Figura 39. Tabela 33: sequências de moléculas antissentido testadas para determinar se elas induzem o salto do éxon 44

Oligonucleotídeos antissentido direcionados para o éxon 45

[0205] Os oligonucleotídeos antissentido direcionados para o éxon 45 foram preparados e testados quanto à sua capacidade de induzir o salto de éxon em células musculares humanas, por meio do uso de métodos semelhantes, conforme descrição acima. Vide Figura 14 e Figura 40. Tabela 34: sequências de moléculas antissentido testadas para determinar se elas induzem o salto do éxon 45

Oligonucleotídeos antissentido direcionados para o éxon 46

[0206] Os oligonucleotídeos antissentido direcionados para o éxon 46 foram preparados e testados quanto à sua capacidade de induzir o salto de éxon em células musculares humanas, por meio do uso de métodos semelhantes, conforme descrição acima. Vide Figura 15 e Figura 44.Tabela 35: sequências de moléculas antissentido testadas para determinar se elas induzem o salto do éxon 46

Oligonucleotídeos antissentido direcionados para os éxons 44, 45 e 46

[0207] Os oligonucleotídeos antissentido direcionados para os éxons 44, 45 e 46 foram preparados e testados quanto à sua capacidade de induzir o salto de éxon em células musculares humanas, por meio do uso de métodos semelhantes, conforme descrição acima.Tabela 36: sequências de moléculas antissentido testadas para determinar se elas induzem o salto dos éxons 44 e 45

Oligonucleotídeos antissentido direcionados para o éxon 47

[0208] Os oligonucleotídeos antissentido direcionados para o éxon 47 foram preparados e testados quanto à sua capacidade de induzir o salto de éxon em células musculares humanas, por meio do uso de métodos semelhantes, conforme descrição acima. Vide Figura 16. Tabela 37: sequências de moléculas antissentido testadas para determinar se elas induzem o salto do éxon 47

Oligonucleotídeos antissentido direcionados para o éxon 48

[0209] Os oligonucleotídeos antissentido direcionados para o éxon 48 foram preparados e testados quanto à sua capacidade de induzir o salto de éxon em células musculares humanas, por meio do uso de métodos semelhantes, conforme descrição acima. Vide Figura 17. Tabela 38: sequências de moléculas antissentido testadas para determinar se elas induzem o salto do éxon 48

Oligonucleotídeos antissentido direcionados para o éxon 49

[0210] Os oligonucleotídeos antissentido direcionados para o éxon 49 foram preparados e testados quanto à sua capacidade de induzir o salto de éxon em células musculares humanas, por meio do uso de métodos semelhantes, conforme descrição acima. Vide Figura 18. Tabela 39: sequências de moléculas antissentido testadas para determinar se elas induzem o salto do éxon 49

Oligonucleotídeos antissentido direcionados para o éxon 50

[0211 ] Os oligonucleotídeos antissentido direcionados para o éxon 50 foram preparados e testados quanto à sua capacidade de induzir o salto de éxon em células musculares humanas, por meio do uso de métodos semelhantes, conforme descrição acima. Vide Figuras 19 e 33. Tabela 40: sequências de moléculas antissentido testadas para determinar se elas induzem o salto do éxon 50

Oligonucleotídeos antissentido direcionados para o éxon 51

[0212] Os oligonucleotídeos antissentido direcionados para o éxon 51 foram preparados e testados quanto à sua capacidade de induzir o salto de éxon em células musculares humanas, por meio do uso de métodos semelhantes, conforme descrição acima. Vide Figura 20 e Figura 41.Tabela 41: sequências de moléculas antissentido testadas para determinar se elas induzem o salto do éxon 51

Oligonucleotídeos antissentido direcionados para o éxon 52

[0213] Os oligonucleotídeos antissentido direcionados para o éxon 52 foram preparados e testados quanto à sua capacidade de induzir o salto de éxon em células musculares humanas, por meio do uso de métodos semelhantes, conforme descrição acima. Vide Figura 42. Tabela 42: sequências de moléculas antissentido testadas para determinar se elas induzem o salto do éxon 52

Oligonucleotídeos antissentido direcionados para o éxon 53

[0214] Os oligonucleotídeos antissentido direcionados para o éxon 53 foram preparados e testados quanto à sua capacidade de induzir o salto de éxon em células musculares humanas, por meio do uso de métodos semelhantes, conforme descrição acima. Vide Figura 43. Tabela 43: sequências de moléculas antissentido testadas para determinar se elas induzem o salto do éxon 53

Oligonucleotídeos antissentido direcionados para o éxon 54

[0215] Os oligonucleotídeos antissentido direcionados para o éxon 54 foram preparados e testados quanto à sua capacidade de induzir o salto de éxon em células musculares humanas, por meio do uso de métodos semelhantes, conforme descrição acima. Vide Figura 21. Tabela 44: sequências de moléculas antissentido testadas para determinar se elas induzem o salto do éxon 54

Oligonucleotídeos antissentido direcionados para o éxon 55

[0216] Os oligonucleotídeos antissentido direcionados para o éxon 55 foram preparados e testados quanto à sua capacidade de induzir o salto de éxon em células musculares humanas, por meio do uso de métodos semelhantes, conforme descrição acima. Vide Figura 22. Tabela 45: sequências de moléculas antissentido testadas para determinar se elas induzem o salto do éxon 55

Oligonucleotídeos antissentido direcionados para o éxon 56

[0217] Os oligonucleotídeos antissentido direcionados para o éxon 56 foram preparados e testados quanto à sua capacidade de induzir o salto de éxon em células musculares humanas, por meio do uso de métodos semelhantes, conforme descrição acima. Vide Figura 23. Tabela 46: sequências de moléculas antissentido testadas para determinar se elas induzem o salto do éxon 56

Oligonucleotídeos antissentido direcionados para o éxon 57

[0218] Os oligonucleotídeos antissentido direcionados para o éxon 57 foram preparados e testados quanto à sua capacidade de induzir o salto de éxon em células musculares humanas, por meio do uso de métodos semelhantes, conforme descrição acima. Vide Figura 24. Tabela 47: sequências de moléculas antissentido testadas para determinar se elas induzem o salto do éxon 57

Oligonucleotídeos antissentido direcionados para o éxon 59

[0219] Os oligonucleotídeos antissentido direcionados para o éxon 59 foram preparados e testados quanto à sua capacidade de induzir o salto de éxon em células musculares humanas, por meio do uso de métodos semelhantes, conforme descrição acima. Vide Figura 25. Tabela 48: sequências de moléculas antissentido testadas para determinar se elas induzem o salto do éxon 59

Oligonucleotídeos antissentido direcionados para o éxon 60

[0220] Os oligonucleotídeos antissentido direcionados para o éxon 60 foram preparados e testados quanto à sua capacidade de induzir o salto de éxon em células musculares humanas, por meio do uso de métodos semelhantes, conforme descrição acima. Vide Figura 26. Tabela 49: sequências de moléculas antissentido testadas para determinar se elas induzem o salto do éxon 60

Oligonucleotídeos antissentido direcionados para o éxon 61

[0221] Os oligonucleotídeos antissentido direcionados para o éxon 61 foram preparados e testados quanto à sua capacidade de induzir o salto de éxon em células musculares humanas, por meio do uso de métodos semelhantes, conforme descrição acima.Tabela 50: sequências de moléculas antissentido testadas para determinar se elas induzem o salto do éxon 61

Oligonucleotídeos antissentido direcionados para o éxon 62

[0222] Os oligonucleotídeos antissentido direcionados para o éxon 62 foram preparados e testados quanto à sua capacidade de induzir o salto de éxon em células musculares humanas, por meio do uso de métodos semelhantes, conforme descrição acima. Tabela 51: sequências de moléculas antissentido testadas para determinar se elas induzem o salto do éxon 62

Oligonucleotídeos antissentido direcionados para o éxon 63

[0223] Os oligonucleotídeos antissentido direcionados para o éxon 63 foram preparados e testados quanto à sua capacidade de induzir o salto de éxon em células musculares humanas, por meio do uso de métodos semelhantes, conforme descrição acima. Vide Figura 27. Tabela 52: sequências de moléculas antissentido testadas para determinar se elas induzem o salto do éxon 63

Oligonucleotídeos antissentido direcionados para o éxon 64

[0224] Os oligonucleotídeos antissentido direcionados para o éxon 64 foram preparados e testados quanto à sua capacidade de induzir o salto de éxon em células musculares humanas, por meio do uso de métodos semelhantes, conforme descrição acima. Vide Figura 28. Tabela 53: sequências de moléculas antissentido testadas para determinar se elas induzem o salto do éxon 64

Oligonucleotídeos antissentido direcionados para o éxon 65

[0225] Os oligonucleotídeos antissentido direcionados para o éxon 65 foram preparados e testados quanto à sua capacidade de induzir o salto de éxon em células musculares humanas, por meio do uso de métodos semelhantes, conforme descrição acima. Tabela 54: sequências de moléculas antissentido testadas para determinar se elas induzem o salto do éxon 65

Oligonucleotídeos antissentido direcionados para o éxon 66

[0226] Os oligonucleotídeos antissentido direcionados para o éxon 66 foram preparados e testados quanto à sua capacidade de induzir o salto de éxon em células musculares humanas, por meio do uso de métodos semelhantes, conforme descrição acima. Vide Figura 29. Tabela 55: sequências de moléculas antissentido testadas para determinar se elas induzem o salto do éxon 66

Oligonucleotídeos antissentido direcionados para o éxon 67

[0227] Os oligonucleotídeos antissentido direcionados para o éxon 67 foram preparados e testados quanto à sua capacidade de induzir o salto de éxon em células musculares humanas, por meio do uso de métodos semelhantes, conforme descrição acima. Vide Figura 30. Tabela 56: sequências de moléculas antissentido testadas para determinar se elas induzem o salto do éxon 67

Oligonucleotídeos antissentido direcionados para o éxon 68

[0228] Os oligonucleotídeos antissentido direcionados para o éxon 68 foram preparados e testados quanto à sua capacidade de induzir o salto de éxon em células musculares humanas, por meio do uso de métodos semelhantes, conforme descrição acima. Vide Figura 31. Tabela 57: sequências de moléculas antissentido testadas para determinar se elas induzem o salto do éxon 68

Oligonucleotídeos antissentido direcionados para o éxon 69

[0229] Os oligonucleotídeos antissentido direcionados para o éxon 69 foram preparados e testados quanto à sua capacidade de induzir o salto de éxon em células musculares humanas, por meio do uso de métodos semelhantes, conforme descrição acima. Vide Figura 32, que mostra um coquetel de H69A(+32+60) e H70A(-06+18) para remover os dois éxons, 69 e 70. Tabela 58: sequências de moléculas antissentido testadas para determinar se elas induzem o salto do éxon 69

Oligonucleotídeos antissentido direcionados para o éxon 70

[0230] Os oligonucleotídeos antissentido direcionados para o éxon 70 foram preparados e testados quanto à sua capacidade de induzir o salto de éxon em células musculares humanas, por meio do uso de métodos semelhantes, conforme descrição acima. Tabela 59: sequências de moléculas antissentido testadas para determinar se elas induzem o salto do éxon 70

Oligonucleotídeos antissentido direcionados para o éxon 71

[0231 ] Os oligonucleotídeos antissentido direcionados para o éxon 71 foram preparados e testados quanto à sua capacidade de induzir o salto de éxon em células musculares humanas, por meio do uso de métodos semelhantes, conforme descrição acima.Tabela 60: sequências de moléculas antissentido testadas para determinar se elas induzem o salto do éxon 71

Oligonucleotídeos antissentido direcionados para o éxon 72

[0232] Os oligonucleotídeos antissentido direcionados para o éxon 72 foram preparados e testados quanto à sua capacidade de induzir o salto de éxon em células musculares humanas, por meio do uso de métodos semelhantes, conforme descrição acima. Tabela 61: sequências de moléculas antissentido testadas para determinar se elas induzem o salto do éxon 72

Oligonucleotídeos antissentido direcionados para o éxon 73

[0233] Os oligonucleotídeos antissentido direcionados para o éxon 73 foram preparados e testados quanto à sua capacidade de induzir o salto de éxon em células musculares humanas, por meio do uso de métodos semelhantes, conforme descrição acima.Tabela 62: sequências de moléculas antissentido testadas para determinar se elas induzem o salto do éxon 73

Oligonucleotídeos antissentido direcionados para o éxon 74

[0234] Os oligonucleotídeos antissentido direcionados para o éxon 74 foram preparados e testados quanto à sua capacidade de induzir o salto de éxon em células musculares humanas, por meio do uso de métodos semelhantes, conforme descrição acima. Tabela 66: sequências de moléculas antissentido testadas para determinar se elas induzem o salto do éxon 74

Oligonucleotídeos antissentido direcionados para o éxon 76

[0235] Os oligonucleotídeos antissentido direcionados para o éxon 76 foram preparados e testados quanto à sua capacidade de induzir o salto de éxon em células musculares humanas, por meio do uso de métodos semelhantes, conforme descrição acima. Tabela 63: sequências de moléculas antissentido testadas para determinar se elas induzem o salto do éxon 76

[0236] Modificações dos modos de execução descritos acima de diversas modalidades da presente invenção ficarão evidentes aos especialistas na técnica, com base nos ensinamentos acima relacionados com a invenção divulgada. As modalidades da presente invenção acima são meramente exemplares e de forma alguma devem ser interpretadas de qualquer forma limitadora.

Claims (15)

1. OLIGONUCLEOTÍDEO ANTISSENTIDO, caracterizado pelo fato de que é selecionado do grupo que consiste em: (i) GCU GCC CAA UGC CAU CCU GGA GUU CCU GUA AGA U (SEQ ID NO: 11); (ii) GCU GCC CAA UGC CAU CCU GGA GUU CCU G (SEQ ID NO: 55); (iii) GCU GCC CAA UGC CAU CCU GGA GUU CCU GUA A (SEQ ID NO: 61); (iv) CAA UGC CAU CCU GGA GUU CCU GUA AGA UAC C (SEQ ID NO: 62); (v) CAA UGC CAU CCU GGA GUU CCU G (SEQ ID NO: 63); (vi) CAA UGC CAU CCU GGA GUU CCU GUA AGA U (SEQ ID NO: 64); (vii) UGC CAU CCU GGA GUU CCU GUA AGA UAC C (SEQ ID NO: 66); (viii) CAA UGC CAU CCU GGA GUU CCU GUA AGA (SEQ ID NO: 230); (ix) GCC CAA UGC CAU CCU GGA GUU CCU GUA AGA UAC C (SEQ ID NO: 237); (x) GCC CAA UGC CAU CCU GGA GUU CCU GUA AGA U (SEQ ID NO: 239); (xi) UUG CCG CUG CCC AAU GCC AUC CUG GAG UUC CUG UAA GAU (SEQ ID NO: 240); (xii) GCU GCC CAA UGC CAU CCU GGA GUU CCU GUA AG (SEQ IS NO: 231); (xiii) GCC CAA UGC CAU CCU GGA GUU CCU GUA A (SEQ ID NO: 242); (xiv) GCC GCU GCC CAA UGC CAU CCU GGA GUU CCU GUA A (SEQ ID NO: 243); (xv) GCC CAA UGC CAU CCU GGA GUU CCU G (SEQ ID NO: 244); e (xvi) GCC GCU GCC CAA UGC CAU CCU GGA GUU CCU G (SEQ ID NO: 245), ou um sal farmaceuticamente aceitável; em que dito oligonucleótido antissentido compreende uma modificação ou substituição da nucleobase selecionada a partir do grupo que consiste em pirimidinas 5- substituídas, 6-azapyrimidinas, purinas substituídas N-2, purinas substituídas N-6 e purinas substituídas O-6.

2. OLIGONUCLEOTÍDEO ANTISSENTIDO ou o sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que é selecionado a partir do grupo consiste em: (i) GCU GCC CAA UGC CAU CCU GGA GUU CCU G (SEQ ID NO: 55); (ii) CAA UGC CAU CCU GGA GUU CCU G (SEQ ID NO: 63); (iii) GCC CAA UGC CAU CCU GGA GUU CCU G (SEQ ID NO: 244); e (iv) GCC GCU GCC CAA UGC CAU CCU GGA GUU CCU G (SEQ ID NO: 245).

3. OLIGONUCLEOTÍDEO ANTISSENTIDO ou o sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a sequência de base oligonucleotídica antissentido compreende uma base de piridina 5 substituída.

4. OLIGONUCLEOTÍDEO ANTISSENTIDO ou o sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o oligonucleótido antissentido induz o salto de exon em concentração igual ou inferior a 300 nM.

5. OLIGONUCLEOTÍDEO ANTISSENTIDO ou o sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, de acordo com a sua reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o oligonucleótido antissentido induz o salto de exon em concentração igual ou inferior a 25 nM.

6. OLIGONUCLEOTÍDEO ANTISSENTIDO ou o sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o oligonucleótido não ativa a RNase H.

7. OLIGONUCLEOTÍDEO ANTISSENTIDO ou o sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado pelo fato de que as ligações internucleotídicas da cadeia principal são substituídas por ligações internucleotídicas não naturais.

8. OLIGONUCLEOTÍDEO ANTISSENTIDO ou o sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que as ligações internucleotídicas não naturais são fosfatos modificados.

9. OLIGONUCLEOTÍDEO ANTISSENTIDO ou o sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que o fosfato modificado é selecionado dentre os metilfosfonatos, metilfosforotioatos, fosforomorfolidatos, fosforopiperazidatos e fosforoamidatos.

10. OLIGONUCLEOTÍDEO ANTISSENTIDO, ou o sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, caracterizado pelo fato de que a molécula de oligonucleotídeo antissentido é um ácido nucleico peptídico.

11. OLIGONUCLEOTÍDEO ANTISSENTIDO ou o sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10, caracterizado pelo fato de que a molécula de oligonucleótido antissentido está quimicamente ligada a uma ou mais frações ou conjugados que aumentam a atividade, distribuição celular, ou absorção celular do oligonucleótido antissentido.

12. OLIGONUCLEOTÍDEO ANTISSENTIDO ou o sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10, caracterizada pelo fato de que a molécula de oligonucleótido antissentido está quimicamente ligada a uma cadeia de polietilenoglicol.

13. OLIGONUCLEOTÍDEO ANTISSENTIDO ou sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que cada ligação internucleosídica do oligonucleotídeo antissentido é uma ligação fosfato modificada e em que o oligonucleotídeo antissentido está quimicamente ligado a uma cadeia de polietilenoglicol.

14. COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA, caracterizada pelo fato de que compreende o oligonucleotídeo antissentido ou o sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 13, e um veículo farmaceuticamente aceitável.

15. USO DE UMA COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA, a composição como definida na reivindicação 14, caracterizada pelo fato de ser para produção de um medicamento para o tratamento de distrofia muscular de Duchenne.