ES2882500T3 - Oligómeros antisentido para el tratamiento del síndrome de Dravet - Google Patents

Oligómeros antisentido para el tratamiento del síndrome de Dravet Download PDF

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Huw M Nash
Adrian Krainer
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Cold Spring Harbor Laboratory
Stoke Therapeutics Inc
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Abstract

Una composición farmacéutica que comprende un oligómero antisentido (ASO), donde el ASO es complementario a una porción dirigida de un pre-mRNA que contiene intrón retenido (RIC pre-mRNA) que codifica la proteína SCN1A, donde el RIC pre-mRNA comprende un intrón retenido, un exón que flanquea el sitio de splicing 5' del intrón retenido y un exón que flanquea el sitio de splicing 3' del intrón retenido, y donde la unión del ASO al RIC pre-mRNA hará que un intrón retenido experimente splicing constitutivo del RIC pre-mRNA en células que expresan el RIC pre-mRNA, aumentando así el nivel de ARN funcional que codifica la proteína SCN1A en las células.

Description

DESCRIPCIÓN
Oligómeros antisentido para el tratamiento del síndrome de Dravet
Antecedentes de la invención
El retraso mental es la discapacidad más prevalente de los niños que afecta a del 1 al 3 % de la población. El retraso mental autosómico dominante-5 (MRD5) es una forma no sindrómica prevalente del trastorno que se caracteriza por la falta de características morfológicas, radiológicas y metabólicas asociadas. Un estudio de caso identificó lesiones genéticas de novo en el gen SYNGAP1 que resultan en la producción de proteínas truncadas en aproximadamente el 3 % de pacientes con retraso mental no sindrómico inexplicable. SYNGAP1 es una enzima activadora de GTPasa que se expresa selectivamente en el cerebro y es necesaria para el desarrollo normal (Hamden, y col., 2009, NEJM 360: 599-605).
El síndrome de Dravet (SD), también conocido como epilepsia mioclónica grave de la infancia o SMEI, fue descrito por primera vez por Dravet en 1978. Es una epilepsia infantil caracterizada por la aparición de convulsiones durante el primer año de vida que no remiten. Las mutaciones en el gen SCN1A, que es parte del grupo de genes SCN1A-SCN2A-SCN3A que codifica las subunidades formadoras de poros alfa del canal de sodio neuronal dependiente de voltaje, están asociadas con el desarrollo de la enfermedad (Miller, y col., 1993-2015, GeneReviews, Eds. Pagon RA, y col. Seattle (WA): Universidad de Washington, Seattle, Bookshelf ID: NBK1318 y Mulley, y col., 2005, Hum. Mutat. 25: 535- 542).
Resumen de la invención
En esta invención se describen procedimientos para tratar un retraso mental autosómico dominante 5 (MRD5) o síndrome de Dravet (SD) en un sujeto que lo necesite, aumentando la expresión de una proteína diana o ARN funcional por las células del sujeto, donde las células tienen un pre-mRNA que contiene intrón retenido (RIC premRNA), comprendiendo el RIC pre-mRNA un intrón retenido, un exón que flanquea el sitio de splicing 5', un exón que flanquea el sitio de splicing 3', y donde el RIC pre-mRNA codifica la proteína diana o ARN funcional, comprendiendo el procedimiento poner en contacto las células del sujeto con un oligómero antisentido (ASO) complementario a una porción dirigida del RIC pre-mRNA que codifica la proteína diana o ARN funcional, mediante el cual el intrón retenido experimenta splicing constitutivo del RIC pre-mRNA que codifica la proteína diana o ARN funcional, aumentando así el nivel de mRNA que codifica la proteína diana o ARN funcional y aumentando la expresión de la proteína diana o ARN funcional en las células del sujeto.
En esta invención se describen procedimientos para aumentar la expresión de una proteína diana, donde la proteína diana es SCN1A, mediante células que tienen un pre-mRNA que contiene intrón retenido (RIC pre-mRNA), comprendiendo el RIC pre-mRNA un intrón retenido, un exón que flanquea el sitio de splicing 5' del intrón retenido, un exón que flanquea el sitio de splicing 3' del intrón retenido, y donde el RIC pre-mRNA codifica la proteína SCN1A, comprendiendo el procedimiento poner en contacto las células con un oligómero antisentido (ASO) complementario a una porción dirigida del RIC pre-mRNA que codifica la proteína SCN1A, mediante el cual el intrón retenido experimenta splicing constitutivo del RIC pre-mRNA que codifica
la proteína SCN1A, aumentando así el nivel de mRNA que codifica la proteína SCN1A y aumentando la expresión de la proteína SCN1A en las células.
En los procedimientos antes mencionados, el procedimiento puede ser un procedimiento para tratar el SD y la proteína diana puede ser SCN1A. La proteína diana o el ARN funcional puede ser una proteína compensadora o un ARN funcional compensador que aumenta o reemplaza funcionalmente una proteína diana o ARN funcional que es deficiente en cantidad o actividad en el sujeto. Las células pueden estar en o ser de un sujeto que tiene una afección causada por una cantidad o actividad deficiente de la proteína SCN1A. La cantidad deficiente de la proteína diana puede ser causada por la haploinsuficiencia de la proteína diana, donde el sujeto tiene un primer alelo que codifica una proteína diana funcional y un segundo alelo a partir del cual no se produce la proteína diana, o un segundo alelo que codifica una proteína diana no funcional, y donde el oligómero antisentido se une a una porción dirigida de un RIC pre-mRNA transcrito desde el primer alelo. El sujeto puede tener una afección causada por un trastorno resultante de una deficiencia en la cantidad o función de la proteína diana, donde el sujeto tiene (a) un primer alelo mutante a partir del cual (i) la proteína diana se produce a un nivel reducido en comparación con la producción a partir de un alelo de tipo silvestre, (ii) la proteína diana se produce en una forma que tiene una función reducida en comparación con una proteína equivalente de tipo silvestre, o (iii) la proteína diana no se produce, y (b) un segundo alelo mutante a partir del cual (i) la proteína diana se produce a un nivel reducido en comparación con la producción a partir de un alelo de tipo silvestre, (ii) la proteína diana se produce en una forma que tiene una función reducida en comparación con una proteína equivalente de tipo silvestre, o (iii) la proteína diana no se produce, y donde cuando el sujeto tiene un primer alelo mutante (a) (iii), el segundo alelo mutante es (b)(i) o (b)(ii), y donde cuando el sujeto tiene un segundo alelo mutante (b)(iii), el primer alelo mutante es (a)(i) o (a)(ii), y donde el RIC pre-mRNA se transcribe a partir del primer alelo mutante que es (a)(i) o (a)(ii), y/o el segundo alelo que es (b)(i) o (b)(ii). La proteína diana puede producirse en una forma que tenga una función reducida en comparación con la proteína equivalente de tipo silvestre. La proteína diana se puede producir en una forma que sea completamente funcional en comparación con la proteína equivalente de tipo silvestre.
En los procedimientos antes mencionados, la porción dirigida del RIC pre-mRNA puede estar en el intrón retenido dentro de la región 6 en relación con el sitio de splicing 5' del intrón retenido a -16 en relación con el sitio de splicing 3' del intrón retenido. La porción dirigida del RIC pre-mRNA puede estar en el intrón retenido dentro de: (a) la región 6 a 499 en relación con el sitio de splicing 5' del intrón retenido; o (b) la región -16 a -496 en relación con el sitio de splicing 3' del intrón retenido. La porción dirigida del RIC pre-mRNA puede estar dentro de: (a) la región 2e a -4e en el exón que flanquea el sitio de splicing 5' del intrón retenido; o (b) la región 2e a -4e en el exón que flanquea el sitio de splicing 3' del intrón retenido. La porción dirigida del RIC pre-mRNA puede estar dentro de: (a) la región -4e a -1054e en relación con el sitio de splicing 5' del intrón retenido; (b) la región 6 a 499 en relación con el sitio de splicing 5' del intrón retenido; (c) la región -16 a -496 en relación con el sitio de splicing 3' del intrón retenido; o (d) la región 2e a 1912e en relación con el sitio de splicing 3' del intrón retenido.
En cualquiera de los procedimientos antes mencionados, la proteína diana es SCN1A. El RIC pre-mRNA puede comprender una secuencia con al menos aproximadamente el 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 97 % o 100 % de identidad de secuencia con cualquiera de las SEQ ID NO: 4-7. El RIC pre-mRNA puede estar codificado por una secuencia genética con al menos aproximadamente el 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 97 % o 100 % de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 1. La porción dirigida del RIC pre-mRNA puede comprender una secuencia con al menos el 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 97 % o 100 % de identidad de secuencia con una región que comprende al menos 8 ácidos nucleicos contiguos de SEQ ID NO: 2593. El ASO puede comprender una secuencia que es al menos aproximadamente el 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 97 % o 100 % complementaria a cualquiera de las SEQ ID NO: 10­ 1037. La porción dirigida del RIC pre-mRNA puede estar dentro de la región -264e a 496 en relación con el sitio de splicing 5' del intrón retenido 21 o dentro de la región -496 a 37e en relación con el sitio de splicing 3' del intrón retenido 21. El ASO puede comprender una secuencia que es al menos aproximadamente el 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 97 % o 100 % complementaria a cualquiera de las SEQ ID NO: 10-266 o 524-1037. La porción dirigida del RIC pre-mRNA puede estar dentro de la región -264e a -4e en relación con el sitio de splicing 5' del intrón retenido 21. El ASO puede comprender una secuencia que es al menos aproximadamente el 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 97 % o 100 % complementaria a cualquiera de las SEQ ID NO: 10-62, 524-576 o 781-833. La porción dirigida del RIC premRNA puede estar en el intrón retenido 21 dentro de la región 6 a 496 en relación con el sitio de splicing 5' del intrón retenido 21. El ASO puede comprender una secuencia que es al menos aproximadamente el 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 97 % o 100 % complementaria a cualquiera de las SeQ ID NO: 63-162, 577-675 o 834-932. La porción dirigida del RIC pre-mRNA puede estar en el intrón retenido 21 dentro de la región -16 a -496 en relación con el sitio de splicing 3' del intrón retenido 21. El ASO puede comprender una secuencia que es al menos aproximadamente el 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 97 % o 100 % complementaria a cualquiera de las SEQ ID NO: 163-258, 676-772 o 933­ 1029. La porción dirigida del RIC pre-mRNA puede estar dentro de la región 2e a 37e en relación con el sitio de splicing 3' del intrón retenido 21. El ASO puede comprender una secuencia que es al menos aproximadamente el 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 97 % o 100 % complementaria a cualquiera de las SEQ ID NO: 259-266, 773-780 o 1030­ 1037.
En los procedimientos antes mencionados, la proteína diana es SCN1A. La porción dirigida del RIC pre-mRNA puede estar dentro de la región -264e a 496 en relación con el sitio de splicing 5' del intrón retenido 23 o dentro de la región -496 a 37e en relación con el sitio de splicing 3' del intrón retenido 23. El ASO puede comprender una secuencia que es al menos aproximadamente el 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 97 % o 100 % complementaria a cualquiera de las SEQ ID NO: 267-523. La porción dirigida del RIC pre-mRNA puede estar dentro de la región -264e a -4e en relación con el sitio de splicing 5' del intrón retenido 23. El ASO puede comprender una secuencia que es al menos aproximadamente el 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 97 % o 100 % complementaria a cualquiera de las SEQ ID NO: 267-319. La porción dirigida del RIC pre-mRNA puede estar en el intrón retenido 23 dentro de la región 6 a 496 en relación con el sitio de splicing 5' del intrón retenido 23. El ASO puede comprender una secuencia que es al menos aproximadamente el 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 97 % o 100 % complementaria a cualquiera de las SEQ ID NO: 320-418. La porción dirigida del RIC pre-mRNA puede estar en el intrón retenido 23 dentro de la región -16 a -496 en relación con el sitio de splicing 3' del intrón retenido 23. El ASO puede comprender una secuencia que es al menos aproximadamente el 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 97 % o 100 % complementaria a cualquiera de las SEQ ID NO: 419-515. La porción dirigida del RIC pre-mRNA puede estar dentro de la región 2e a 37e en relación con el sitio de splicing 3' del intrón retenido 23. El ASO puede comprender una secuencia que es al menos aproximadamente el 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 97 % o 100 % complementaria a cualquiera de las SEQ ID NO: 516­ 523.
En cualquiera de los procedimientos antes mencionados, el oligómero antisentido puede no aumentar la cantidad de la proteína diana o el ARN funcional modulando el splicing alternativo del pre-mRNA transcrito de un gen que codifica el ARN funcional o la proteína diana. El oligómero antisentido puede no aumentar la cantidad de proteína diana o ARN funcional modulando el splicing aberrante resultante de la mutación del gen que codifica la proteína diana o el ARN funcional. El RIC pre-mRNA puede haber sido producido por splicing parcial de un pre-mRNA de longitud completa o splicing parcial de un pre-mRNA de tipo silvestre. El mRNA que codifica la proteína diana o el ARN funcional puede ser un mRNA maduro de longitud completa o un mRNA maduro de tipo silvestre. La proteína diana producida puede ser una proteína de longitud completa o una proteína de tipo silvestre. La cantidad total de mRNA que codifica la proteína diana o ARN funcional producido en la célula en contacto con el oligómero antisentido puede aumentarse de aproximadamente 1,1 a aproximadamente 10 veces, de aproximadamente 1,5 a aproximadamente 10 veces, de aproximadamente 2 a aproximadamente 10 veces, de aproximadamente 3 a aproximadamente 10 veces, de aproximadamente 4 a aproximadamente 10 veces, de aproximadamente 1,1 a aproximadamente 5 veces, de aproximadamente 1,1 a aproximadamente 6 veces, de aproximadamente 1,1 a aproximadamente 7 veces, de aproximadamente 1,1 a aproximadamente 8 veces, de aproximadamente 1,1 a aproximadamente aproximadamente 9 veces, de aproximadamente 2 a aproximadamente 5 veces, de aproximadamente 2 a aproximadamente 6 veces, de aproximadamente 2 a aproximadamente 7 veces, de aproximadamente 2 a aproximadamente 8 veces, de aproximadamente 2 a aproximadamente 9 veces, de aproximadamente 3 a aproximadamente 6 veces, de aproximadamente 3 a aproximadamente 7 veces, de aproximadamente 3 a aproximadamente 8 veces, de aproximadamente 3 a aproximadamente 9 veces, de aproximadamente 4 a aproximadamente 7 veces, de aproximadamente 4 a aproximadamente 8 veces, de aproximadamente 4 a aproximadamente 9 veces, al menos aproximadamente 1,1 veces, al menos aproximadamente 1,5 veces, al menos aproximadamente 2 veces, al menos aproximadamente 2,5 veces, al menos aproximadamente 3 veces, al menos aproximadamente 3,5 veces, al menos aproximadamente 4 veces, al menos aproximadamente 5 veces o al menos aproximadamente 10 veces, en comparación con la cantidad total de mRNA que codifica la proteína diana o ARN funcional producido en una célula de control. La cantidad total de proteína diana producida por la célula en contacto con el oligómero antisentido puede aumentarse de aproximadamente 1,1 a aproximadamente 10 veces, de aproximadamente 1,5 a aproximadamente 10 veces, de aproximadamente 2 a aproximadamente 10 veces, de aproximadamente 3 a aproximadamente 10 veces, de aproximadamente 4 a aproximadamente 10 veces, de aproximadamente 1,1 a aproximadamente 5 veces, de aproximadamente 1,1 a aproximadamente 6 veces, de aproximadamente 1,1 a aproximadamente 7 veces, de aproximadamente 1,1 a aproximadamente 8 veces, de aproximadamente 1,1 a aproximadamente 9 veces, de aproximadamente 2 a aproximadamente 5 veces, de aproximadamente 2 a aproximadamente 6 veces, de aproximadamente 2 a aproximadamente 7 veces, de aproximadamente 2 a aproximadamente 8 veces, de aproximadamente 2 a aproximadamente 9 veces, de aproximadamente 3 a aproximadamente 6 veces, de aproximadamente 3 a aproximadamente 7 veces, de aproximadamente 3 a aproximadamente 8 veces, de aproximadamente 3 a aproximadamente 9 veces, de aproximadamente 4 a aproximadamente 7 veces, de aproximadamente 4 a aproximadamente 8 veces, de aproximadamente 4 a aproximadamente 9 veces, al menos aproximadamente 1,1 veces, al menos aproximadamente 1,5 veces, al menos aproximadamente 2 veces, al menos aproximadamente 2,5 veces, al menos aproximadamente 3 veces, al menos aproximadamente 3,5 veces, al menos aproximadamente 4 veces, al menos aproximadamente 5 veces o al menos aproximadamente 10 veces, en comparación con la cantidad total de proteína diana producida por una célula de control.
En cualquiera de los procedimientos antes mencionados, el oligómero antisentido puede comprender una modificación de la cadena principal que comprende un enlace fosforotioato o un enlace fosforodiamidato. El oligómero antisentido puede comprender un fosforodiamidato morfolino, un ácido nucleico bloqueado, un ácido nucleico peptídico, un resto 2'-O-metilo, 2'-Fluoro o 2'-O-metoxietilo. El oligómero antisentido puede comprender al menos un resto de azúcar modificado. Cada resto de azúcar puede ser un resto de azúcar modificado. El oligómero antisentido puede consistir en de 8 a 50 nucleobases, de 8 a 40 nucleobases, de 8 a 35 nucleobases, de 8 a 30 nucleobases, de 8 a 25 nucleobases, de 8 a 20 nucleobases, de 8 a 15 nucleobases, de 9 a 50 nucleobases, de 9 a 40 nucleobases, de 9 a 35 nucleobases, de 9 a 30 nucleobases, de 9 a 25 nucleobases, de 9 a 20 nucleobases, de 9 a 15 nucleobases, de 10 a 50 nucleobases, de 10 a 40 nucleobases, de 10 a 35 nucleobases, de 10 a 30 nucleobases, de 10 a 25 nucleobases, de 10 a 20 nucleobases, de 10 a 15 nucleobases, de 11 a 50 nucleobases, de 11 a 40 nucleobases, de 11 a 35 nucleobases, de 11 a 30 nucleobases, de 11 a 25 nucleobases, de 11 a 20 nucleobases, de 11 a 15 nucleobases, de 12 a 50 nucleobases, de 12 a 40 nucleobases, de 12 a 35 nucleobases, de 12 a 30 nucleobases, de 12 a 25 nucleobases, de 12 a 20 nucleobases o de 12 a 15 nucleobases. El oligómero antisentido puede ser al menos el 80 %, al menos el 85 %, al menos el 90 %, al menos el 95 %, al menos el 98 %, al menos el 99 % o el 100 %, complementario a la porción dirigida del RIC pre-mRNA que codifica la proteína.
En cualquiera de los procedimientos antes mencionados, la célula puede comprender una población de RIC premRNA transcritos del gen que codifica la proteína diana o el RNA funcional, donde la población de RIC pre-mRNA comprende dos o más intrones retenidos, y donde el oligómero antisentido se une al intrón retenido más abundante en la población de RIC pre-mRNA. La unión del oligómero antisentido al intrón retenido más abundante puede inducir el splicing de los dos o más intrones retenidos de la población de RIC pre-mRNA para producir mRNA que codifica la proteína diana o ARN funcional. La célula puede comprender una población de RIC pre-mRNA transcritos del gen que codifica la proteína diana o el RNA funcional, donde la población de RIC pre-mRNA comprende dos o más intrones retenidos, y donde el oligómero antisentido se une al segundo intrón retenido más abundante en la población de RIC pre-mRNA. La unión del oligómero antisentido al segundo intrón retenido más abundante puede inducir el splicing de los dos o más intrones retenidos de la población de RIC pre-mRNA para producir mRNA que codifica la proteína diana o ARN funcional. El procedimiento puede comprender además evaluar la expresión de la proteína SYNGAP1 o SCN1A.
En cualquiera de los procedimientos antes mencionados, el SD puede tratarse y el oligómero antisentido puede unirse a una porción dirigida de un RIC pre-mRNA de SCN1A, donde la porción dirigida está dentro de una secuencia seleccionada de entre las SEQ ID NO: 10-1037. El sujeto puede ser un ser humano. El sujeto puede ser un animal no humano. El sujeto puede ser un feto, un embrión o un niño. Las células pueden estar ex vivo. El oligómero antisentido puede administrarse mediante inyección intratecal, inyección intracerebroventricular, inyección intraperitoneal, inyección intramuscular, inyección subcutánea o inyección intravenosa del sujeto. Los 9 nucleótidos en -3e a -1e del exón que flanquea el sitio de splicing 5' y 1 a 6 del intrón retenido, pueden ser idénticos a la secuencia de tipo silvestre correspondiente. Los 16 nucleótidos en -15 a -1 del intrón retenido y 1e del exón que flanquea el sitio de splicing 3' pueden ser idénticos a la secuencia de tipo silvestre correspondiente. En esta invención se describen oligómeros antisentido como se describe en cualquiera de los procedimientos antes mencionados.
Los oligómeros antisentido pueden comprender una secuencia con al menos aproximadamente el 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 97 % o 100 % de identidad de secuencia con cualquiera de las SEQ ID No : 10-2591.
En esta invención se proporcionan composiciones farmacéuticas que comprenden un oligómero antisentido (ASO), donde el ASO es complementario a una porción dirigida de un pre-mRNA que contiene intrón retenido (RIC premRNA) que codifica la proteína SCN1A, donde el RIC pre-mRNA comprende un intrón retenido, un exón que flanquea el sitio de splicing 5' del intrón retenido y un exón que flanquea el sitio de splicing 3' del intrón retenido, y donde la unión del a So al RIC pre-mRNA hará que un intrón retenido experimente splicing constitutivo del RIC premRNA en células que expresan el RIC pre-mRNA, aumentando así el nivel de ARN funcional que codifica la proteína SCN1A en las células.
También se proporcionan las composiciones farmacéuticas de la invención para su uso como medicamento. También se proporcionan las composiciones farmacéuticas de la invención para su uso en el tratamiento del síndrome de Dravet (SD) en un sujeto.
También se describen en esta invención composiciones farmacéuticas que comprenden un oligómero antisentido como se usa en un procedimiento antes mencionado o un oligómero antisentido que comprende una secuencia con al menos aproximadamente el 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 97 % o 100 % de identidad de secuencia con cualquiera de las SEQ ID NO: 10-2591, y un excipiente, diluyente o vehículo farmacéuticamente aceptable. En esta invención, en algunas realizaciones, se describen procedimientos para tratar a un sujeto que lo necesite, administrando la composición farmacéutica mediante inyección intratecal, inyección intracerebroventricular, inyección intraperitoneal, inyección intramuscular, inyección subcutánea o inyección intravenosa.
En esta invención se describen composiciones que comprenden un oligómero antisentido para su uso en un procedimiento de aumento de la expresión de una proteína diana o un ARN funcional por parte de las células para tratar MRD5 o SD en un sujeto que lo necesita, asociado con una proteína deficiente o un ARN funcional deficiente, donde la proteína deficiente o ARN funcional deficiente es deficiente en cantidad o actividad en el sujeto, donde el oligómero antisentido mejora el splicing constitutivo de un pre-mRNA que contiene intrón retenido (RIC pre-mRNA) que codifica la proteína diana o el ARN funcional, donde la proteína diana es: (a) la proteína deficiente; o (b) una proteína compensadora que aumenta o reemplaza funcionalmente a la proteína deficiente o en el sujeto; y donde el ARN funcional es: (c) el ARN deficiente; o (d) un ARN funcional compensador que aumenta o reemplaza funcionalmente el ARN funcional deficiente en el sujeto; donde el RIC pre-mRNA comprende un intrón retenido, un exón que flanquea el sitio de splicing 5' y un exón que flanquea el sitio de splicing 3', y donde el intrón retenido experimenta splicing del RIC pre-mRNA que codifica la proteína diana o el ARN funcional, aumentando así la producción o actividad de la proteína diana o el ARN funcional en el sujeto.
En esta invención se describen composiciones que comprenden un oligómero antisentido para su uso en un procedimiento de tratamiento de una afección asociada con la proteína SCN1A en un sujeto que lo necesita, comprendiendo el procedimiento la etapa de aumentar la expresión de la proteína SCN1A por las células del sujeto, donde las células tienen una pre-mRNA que contiene intrón retenido (RIC pre-mRNA) que comprende un intrón retenido, un exón que flanquea el sitio de splicing 5' del intrón retenido, un exón que flanquea el sitio de splicing 3' del intrón retenido, y donde el RIC pre-mRNA codifica la proteína SCN1A, comprendiendo el procedimiento poner en contacto las células con el oligómero antisentido, mediante el cual el intrón retenido experimenta splicing constitutivo de los transcritos de RIC pre-mRNA que codifican la proteína SCN1A, aumentando así el nivel de mRNA que codifica la proteína SCN1A y aumentando la expresión de la proteína SCN1A, en las células del sujeto. La afección puede ser una enfermedad o un trastorno. La enfermedad o trastorno puede ser retraso mental AD 5 o síndrome de Dravet. La proteína diana y el RIC pre-mRNA pueden estar codificados por el gen SCN1A. El oligómero antisentido puede dirigirse a una porción del RIC pre-mRNA que está en el intrón retenido dentro de la región 6 en relación con el sitio de splicing 5' del intrón retenido a -16 en relación con el sitio de splicing 3' del intrón retenido. El oligómero antisentido se dirige a una porción del RIC pre-mRNA que está en el intrón retenido dentro de: (a) la región 6 a 499 en relación con el sitio de splicing 5' del intrón retenido; o (b) la región -16 a -496 en relación con el sitio de splicing 3' del intrón retenido. El oligómero antisentido puede dirigirse a una porción del RIC pre-mRNA que está dentro de la región de aproximadamente 100 nucleótidos aguas abajo del sitio de splicing 5' del al menos un intrón retenido, a aproximadamente 100 nucleótidos aguas arriba del sitio de splicing 3' del al menos un intrón retenido. La porción dirigida del RIC pre-mRNA puede estar dentro de: (a) la región 2e a -4e en el exón que flanquea el sitio de splicing 5' del intrón retenido; o (b) la región 2e a -4e en el exón que flanquea el sitio de splicing 3' del intrón retenido. La porción dirigida del RIC pre-mRNA puede estar dentro de: (a) la región -4e a -1054e en relación con el sitio de splicing 5' del intrón retenido; (b) la región 6 a 499 en relación con el sitio de splicing 5' del intrón retenido; (c) la región -16 a -496 en relación con el sitio de splicing 3' del intrón retenido; o (d) la región 2e a 1912e en relación con el sitio de splicing 3' del intrón retenido.
En realizaciones de la invención, la proteína diana es SCN1A. En algunas realizaciones, el RIC pre-mRNA comprende una secuencia con al menos aproximadamente el 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 97 % o 100 % de identidad de secuencia con cualquiera de las SEQ ID NO: 4-7. En algunas realizaciones, el RIC pre-mRNA está codificado por una secuencia genética con al menos aproximadamente el 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 97 % o 100 % de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 1. En algunas realizaciones, la porción dirigida del RIC pre-mRNA comprende una secuencia con al menos el 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 97 % o 100 % de identidad de secuencia con una región que comprende al menos 8 ácidos nucleicos contiguos de SEQ ID NO: 2593. En algunas realizaciones, el ASO comprende una secuencia que es al menos aproximadamente el 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 97 % o 100 % complementaria a cualquiera de las SEQ ID NO: 10-1037. En algunas realizaciones, la porción dirigida del RIC premRNA está dentro de la región -264e a 496 en relación con el sitio de splicing 5' del intrón retenido 21 o dentro de la región -496 a 37e en relación con el sitio de splicing 3' del intrón retenido 21. En algunas realizaciones, el ASO comprende una secuencia que es al menos aproximadamente el 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 97 % o 100 % complementaria a cualquiera de las SEQ ID NO: 10-266 o 524-1037. En algunas realizaciones, la porción dirigida del RIC pre-mRNA está dentro de la región -264e a -4e en relación con el sitio de splicing 5' del intrón retenido 21. En algunas realizaciones, el ASO comprende una secuencia que es al menos aproximadamente el 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 97 % o 100 % complementaria a cualquiera de las SEQ ID NO: 10-62, 524-576 o 781-833. En algunas realizaciones, la porción dirigida del RIC pre-mRNA está en el intrón retenido 21 dentro de la región 6 a 496 en relación con el sitio de splicing 5' del intrón retenido 21. En algunas realizaciones, el ASO comprende una secuencia que es al menos aproximadamente el 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 97 % o 100 % complementaria a cualquiera de las SeQ ID NO: 63-162, 577-675 o 834-932. En algunas realizaciones, la porción dirigida del RIC pre-mRNA está en el intrón retenido 21 dentro de la región -16 a -496 en relación con el sitio de splicing 3' del intrón retenido 21. En algunas realizaciones, el ASO comprende una secuencia que es al menos aproximadamente el 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 97 % o 100 % complementaria a cualquiera de las SEQ ID NO: 163-258, 676-772 o 933-1029. En algunas realizaciones, la porción dirigida del RIC pre-mRNA está dentro de la región 2e a 37e en relación con el sitio de splicing 3' del intrón retenido 21. En algunas realizaciones, el ASO comprende una secuencia que es al menos aproximadamente el 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 97 % o 100 % complementaria a cualquiera de las SEQ ID NO: 259­ 266, 773-780 o 1030-1037.
En realizaciones de la invención, la proteína diana es SCN1A. En algunas realizaciones, la porción dirigida del RIC pre-mRNA está dentro de la región -264c a 496 en relación con el sitio de splicing 5' del intrón retenido 23 o dentro de la región -496 a 37e en relación con el sitio de splicing 3' del intrón retenido 23. En algunas realizaciones, el ASO comprende una secuencia que es al menos aproximadamente el 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 97 % o 100 % complementaria a cualquiera de las SEQ ID NO: 267-523. En algunas realizaciones, la porción dirigida del RIC premRNA está dentro de la región -264e a -4e en relación con el sitio de splicing 5' del intrón retenido 23. En algunas realizaciones, el ASO comprende una secuencia que es al menos aproximadamente el 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 97 % o 100 % complementaria a cualquiera de las SEQ ID NO: 267-319. En algunas realizaciones, la porción dirigida del RIC pre-mRNA está en el intrón retenido 23 dentro de la región 6 a 496 en relación con el sitio de splicing 5' del intrón retenido 23. En algunas realizaciones, el ASO comprende una secuencia que es al menos aproximadamente el 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 97 % o 100 % complementaria a cualquiera de las SeQ ID NO: 320­ 418. En algunas realizaciones, la porción dirigida del RIC pre-mRNA está en el intrón retenido 23 dentro de la región -16 a -496 en relación con el sitio de splicing 3' del intrón retenido 23. En algunas realizaciones, el ASO comprende una secuencia que es al menos aproximadamente el 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 97 % o 100 % complementaria a cualquiera de las SEQ ID NO: 419-515. En algunas realizaciones, la porción dirigida del RIC pre-mRNA está dentro de la región 2e a 37e en relación con el sitio de splicing 3' del intrón retenido 23. En algunas realizaciones, el ASO comprende una secuencia que es al menos aproximadamente el 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 97 % o 100 % complementaria a cualquiera de las SEQ ID NO: 516-523.
En algunas realizaciones de cualquiera de las composiciones antes mencionadas, el oligómero antisentido no aumenta la cantidad de proteína diana o ARN funcional modulando el splicing alternativo del pre-mRNA transcrito de un gen que codifica la proteína diana o ARN funcional. En algunas realizaciones, el oligómero antisentido no aumenta la cantidad de ARN funcional o proteína funcional modulando el splicing aberrante resultante de la mutación del gen que codifica la proteína diana o ARN funcional. En algunas realizaciones, el RIC pre-mRNA se produjo mediante splicing parcial de un pre-mRNA de longitud completa o un pre-mRNA de tipo silvestre. En algunas realizaciones, el mRNA que codifica la proteína diana o el ARN funcional puede ser un mRNA maduro de longitud completa o un mRNA maduro de tipo silvestre. En algunas realizaciones, la proteína diana producida es una proteína de longitud completa o una proteína de tipo silvestre. En algunas realizaciones, el intrón retenido es un intrón limitante de la velocidad. En algunas realizaciones, el intrón retenido es el intrón retenido más abundante en dicho RIC pre-mRNA. En algunas realizaciones, el intrón retenido es el segundo intrón retenido más abundante en dicho RIC pre-mRNA.
En algunas realizaciones de cualquiera de las composiciones antes mencionadas, el oligómero antisentido comprende una modificación de la cadena principal que comprende un enlace fosforotioato o un enlace fosforodiamidato. En algunas realizaciones, el oligómero antisentido es un oligonucleótido antisentido. En algunas realizaciones, el oligómero antisentido comprende un fosforodiamidato morfolino, un ácido nucleico bloqueado, un ácido nucleico peptídico, un resto 2'-O-metilo, 2'-Fluoro o 2'-O-metoxietilo. En algunas realizaciones, el oligómero antisentido comprende al menos un resto de azúcar modificado. En algunas realizaciones, cada resto de azúcar es un resto de azúcar modificado. En algunas realizaciones, el oligómero antisentido consiste en de 8 a 50 nucleobases, de 8 a 40 nucleobases, de 8 a 35 nucleobases, de 8 a 30 nucleobases, de 8 a 25 nucleobases, de 8 a 20 nucleobases, de 8 a 15 nucleobases, de 9 a 50 nucleobases, de 9 a 40 nucleobases, de 9 a 35 nucleobases, de 9 a 30 nucleobases, de 9 a 25 nucleobases, de 9 a 20 nucleobases, de 9 a 15 nucleobases, de 10 a 50 nucleobases, de 10 a 40 nucleobases, de 10 a 35 nucleobases, de 10 a 30 nucleobases, de 10 a 25 nucleobases, de 10 a 20 nucleobases, de 10 a 15 nucleobases, de 11 a 50 nucleobases, de 11 a 40 nucleobases, de 11 a 35 nucleobases, de 11 a 30 nucleobases, de 11 a 25 nucleobases, de 11 a 20 nucleobases, de 11 a 15 nucleobases, de 12 a 50 nucleobases, de 12 a 40 nucleobases, de 12 a 35 nucleobases, de 12 a 30 nucleobases, de 12 a 25 nucleobases, de 12 a 20 nucleobases o de 12 a 15 nucleobases.
En esta invención se describen composiciones farmacéuticas que comprenden: un oligómero antisentido que se hibrida con una secuencia diana de un transcrito de mRNA de SCN1A, donde el transcrito de mRNA de SCN1A comprende un intrón retenido, donde el oligómero antisentido induce el splicing del intrón retenido del transcrito de mRNA de SCN1A; y un excipiente, diluyente o vehículo farmacéuticamente aceptable. El transcrito de mRNA de SCN1A es un transcrito de RIC pre-mRNA de SCN1A. En algunas realizaciones, la porción dirigida del transcrito de RIC pre-mRNA de SCN1A está en el intrón retenido dentro de la región 500 en relación con el sitio de splicing 5' del intrón retenido a -500 en relación con el sitio de splicing 3' del intrón retenido. En algunas realizaciones, el transcrito de RIC pre-mRNA de SCN1A está codificado por una secuencia genética con al menos aproximadamente el 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 1. En algunas realizaciones, el transcrito de RIC pre-mRNA de SCN1A comprende una secuencia con al menos aproximadamente el 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % de identidad de secuencia con cualquiera de las SEQ ID NO: 4-7. En algunas realizaciones, el oligómero antisentido comprende una modificación de la cadena principal que comprende un enlace fosforotioato o un enlace fosforodiamidato. En algunas realizaciones, el oligómero antisentido es un oligonucleótido antisentido. En algunas realizaciones, el oligómero antisentido comprende un fosforodiamidato morfolino, un ácido nucleico bloqueado, un ácido nucleico peptídico, un resto 2'-O-metilo, 2'-Fluoro o 2'-O-metoxietilo. En algunas realizaciones, el oligómero antisentido comprende al menos un resto de azúcar modificado. En algunas realizaciones, el oligómero antisentido comprende de 8 a 50 nucleobases, de 8 a 40 nucleobases, de 8 a 35 nucleobases, de 8 a 30 nucleobases, de 8 a 25 nucleobases, de 8 a 20 nucleobases, de 8 a 15 nucleobases, de 9 a 50 nucleobases, de 9 a 40 nucleobases, de 9 a 35 nucleobases, de 9 a 30 nucleobases, de 9 a 25 nucleobases, de 9 a 20 nucleobases, de 9 a 15 nucleobases, de 10 a 50 nucleobases, de 10 a 40 nucleobases, de 10 a 35 nucleobases, de 10 a 30 nucleobases, de 10 a 25 nucleobases, de 10 a 20 nucleobases, de 10 a 15 nucleobases, de 11 a 50 nucleobases, de 11 a 40 nucleobases, de 11 a 35 nucleobases, de 11 a 30 nucleobases, de 11 a 25 nucleobases, de 11 a 20 nucleobases, de 11 a 15 nucleobases, de 12 a 50 nucleobases, de 12 a 40 nucleobases, de 12 a 35 nucleobases, de 12 a 30 nucleobases, de 12 a 25 nucleobases, de 12 a 20 nucleobases o de 12 a 15 nucleobases. En algunas realizaciones, el oligómero antisentido es al menos el 80 %, al menos el 85 %, al menos el 90 %, al menos el 95 %, al menos el 98 %, al menos el 99 %, o es el 100 % complementario a una porción dirigida del transcrito de RIC pre-mRNA de SCN1A. En algunas realizaciones, la porción dirigida del transcrito de RIC pre-mRNA de SCN1A está dentro de una secuencia seleccionada de entre las SEQ ID NO: 2593. En algunas realizaciones, el oligómero antisentido comprende una secuencia de nucleótidos que tiene al menos aproximadamente el 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % de identidad de secuencia con cualquiera de las SEQ ID NO: 1038-2591. En algunas realizaciones, el oligómero antisentido comprende una secuencia de nucleótidos seleccionada de entre las SEQ ID NO: 1038-2591. En algunas realizaciones, la composición farmacéutica se formula para inyección intratecal, inyección intracerebroventricular, inyección intraperitoneal, inyección intramuscular, inyección subcutánea o inyección intravenosa.
En esta invención se describen procedimientos para inducir el procesamiento de un transcrito de mRNA de SCN1A deficiente para facilitar la eliminación de un intrón retenido para producir un transcrito de mRNA de SCN1A completamente procesado que codifica una forma funcional de una proteína SCN1A, comprendiendo el procedimiento: (a) poner en contacto un oligómero antisentido con una célula diana de un sujeto; (b) hibridar el oligómero antisentido con el transcrito de mRNA de SCN1A deficiente, donde el transcrito de mRNA de SCN1A deficiente es capaz de codificar la forma funcional de una proteína SCN1A y comprende al menos un intrón retenido; (c) eliminar el al menos un intrón retenido del transcrito de mRNA de SCN1Adeficiente para producir el transcrito de mRNA de SCN1A completamente procesado que codifica la forma funcional de la proteína SCN1A; y (d) traducir la forma funcional de la proteína SCN1A del transcrito de mRNA de SCN1A completamente procesado. El intrón retenido puede ser un intrón retenido completo. El transcrito de mRNA de SCN1A deficiente puede ser un transcrito de mRNA de SCN1A.
En esta invención se describen procedimientos para tratar a un sujeto que tiene una afección causada por una cantidad o actividad deficiente de la proteína SCN1A que comprenden administrar al sujeto un oligómero antisentido que comprende una secuencia de nucleótidos con al menos aproximadamente el 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % de identidad de secuencia con cualquiera de las SEQ ID NO: 10-2591.
Breve descripción de los dibujos
Las características novedosas de la invención se exponen con particularidad en las reivindicaciones adjuntas. Se obtendrá una mejor comprensión de las características y ventajas de la presente invención haciendo referencia a la siguiente descripción detallada que expone realizaciones ilustrativas, en las que se utilizan los principios de la invención, y los dibujos adjuntos.
La FIG. 1 representa una representación esquemática de un transcrito de pre-mRNA que contiene intrón retenido (RIC) ejemplar. En la FIG. 1, la secuencia de consenso del sitio de splicing 5' se indica con letras subrayadas (las letras son nucleótidos; mayúscula: parte exónica; y minúscula: parte intrónica) de -3e a -1e y 1 a 6 (los números etiquetados con "e" son exónicos y los números no etiquetados son intrónicos). La secuencia de consenso del sitio de splicing 3' se indica con letras subrayadas (las letras son nucleótidos; mayúscula: parte exónica y minúscula: parte intrónica) de -15 a -1 y 1e (los números etiquetados con "e" son exónicos y los números no etiquetados son intrónicos). Las regiones diana intrónicas para el cribado de ASO comprenden los nucleótidos 6 en relación con el sitio de splicing 5' del intrón retenido (flecha a la izquierda) a -16 en relación con el sitio de splicing 3' del intrón retenido (flecha a la derecha). En las realizaciones, las regiones diana intrónicas para el cribado de ASO comprenden los nucleótidos 6 a 496 en relación con el sitio de splicing 5' del intrón retenido y de -16 a -499 en relación con el sitio de splicing 3' del intrón retenido. Las regiones diana exónicas comprenden los nucleótidos 2e a -4e en el exón que flanquea el sitio de splicing 5' del intrón retenido y 2e a -4e en el exón que flanquea el sitio de splicing 3' del intrón retenido. "n" o "N" indican cualquier nucleótido, "y" indica pirimidina. Las secuencias mostradas representan secuencias de consenso para sitios de splicing de mamíferos y no es necesario que los intrones y exones individuales coincidan con las secuencias de consenso en cada posición.
Las FIGS. 2A-B representan una representación esquemática de la estrategia de aumento dirigido de la producción de genes nucleares (TANGO). La FIG. 2A muestra una célula dividida en compartimentos nuclear y citoplasmático. En el núcleo, un transcrito de pre-mRNA de un gen diana que consiste en exones (rectángulos) e intrones (líneas de conexión) experimenta splicing para generar un mRNA, y este mRNA se exporta al citoplasma y se traduce en la proteína diana. Para este gen diana, el splicing del intrón 1 es ineficaz y un pre-mRNA que contiene intrón retenido (RIC) se acumula principalmente en el núcleo y, si se exporta al citoplasma, se degrada, lo que no conduce a la producción de proteína diana. La FIG. 2B muestra un ejemplo de la misma célula dividida en compartimentos nuclear y citoplasmático. El tratamiento con un oligómero antisentido (ASO) promueve el splicing del intrón 1 y da como resultado un aumento del mRNA, que a su vez se traduce en niveles más altos de proteína diana.
La FIG. 3 representa la retención de intrones en el gen SYNGAP1 con el intrón 15 mostrado en detalle. Se muestra la identificación de eventos de retención de intrones en el gen SYNGAP1 usando secuenciación de ARN (RNAseq), visualizada en el navegador del genoma UCSC. El panel superior muestra la densidad de lectura correspondiente al transcrito de SYNGAP1 expresada en HCN (neuronas corticales humanas) y localizada en la fracción citoplásmica (arriba) o nuclear (abajo). En la parte inferior de este panel, se muestra una representación gráfica del gen SYNGAP1 a escala. La densidad de lectura se muestra como picos. La densidad de lectura más alta corresponde a los exones (cajas negras), mientras que no se observan lecturas para la mayoría de los intrones (líneas con puntas de flecha) en ninguna de las fracciones celulares. Se detecta una mayor densidad de lectura para los intrones 15 y 18/19 (señalados por las flechas) en la fracción nuclear en comparación con la fracción citoplásmica, lo que indica que la eficiencia de splicing de los intrones 15 y 18/19 es baja, lo que da como resultado la retención de intrones. Los transcritos de pre-mRNA que contienen intrón retenido se retienen en el núcleo y no se exportan al citoplasma. La densidad de lectura para el intrón 15 en HCN se muestra en detalle en el panel inferior que indica una retención del intrón del 25 % calculada mediante análisis bioinformático.
La FIG. 4 representa una caminata ASO del intrón 15 (IVS15) del gen SYNGAP1 ejemplar. Se muestra una representación gráfica de la caminata ASO realizada para las secuencias de direccionamiento SYNGAP1 IVS 15 inmediatamente aguas abajo del sitio de splicing 5' o aguas arriba del sitio de splicing 3' usando ASO 2'-O-Me, cadena principal de PS. Los ASO fueron diseñados para cubrir estas regiones desplazando 5 nucleótidos a la vez. La estructura exón-intrón de SYNGAP1 está dibujada a escala.
La FIG. 5 representa la retención de intrones en el gen SYNGAP1 con los intrones 18 y 19 mostrados en detalle. La retención de intrones en el gen SYNGAP1 se identificó mediante secuenciación de ARN (RNAseq), visualizada en el navegador del genoma UCSC, como se describe en esta invención en los Ejemplos. La densidad de lectura para los intrones 18 y 19 en HCN se muestra en detalle en el panel inferior. Los intrones 18 y 19 flanquean al exón 19, un exón de splicing alternativo. Aunque el exón 19 no está anotado, los datos de RNAseq muestran evidencia de su existencia, de modo que se observa un pico claro en la fracción citoplásmica; sin embargo, la densidad de lectura correspondiente al exón 19 en la fracción citoplásmica es menor que la de los exones de splicing constitutivo en SYNGAP1. La densidad de lectura para el intrón 18/19 en HCN se muestra en detalle en el panel inferior que indica una retención del intrón del 42 % calculada mediante análisis bioinformático.
La FIG. 6 representa una caminata ASO del intrón 18 (IVS18) y del intrón 19 (IVS19) del gen SYNGAP1 ejemplares. Se muestra una representación gráfica de la caminata ASO realizada para las secuencias de direccionamiento SYNGAP1 IVS 18 y 19 inmediatamente aguas abajo del sitio de splicing 5' del intrón 18 o aguas arriba del sitio de splicing 3' del intrón 19 usando ASO 2'-O-Me, cadena principal de PS. Las regiones intrónicas del sitio de splicing que flanquean el exón alternativo 19 no están dirigidas a evitar afectar el nivel de inclusión del exón 19. Los ASO fueron diseñados para cubrir estas regiones desplazando 5 nucleótidos a la vez. La estructura exón-intrón de SYNGAP1 está dibujada a escala.
La FIG. 7A muestra un esquema de RefSeq Genes para SYNGAP1 correspondiente a NM_006772.
La FIG. 7B muestra un gráfico ejemplar que muestra el nivel de cambio promedio (n=3) veces mayor en los niveles de expresión de mRNA de SYNGAP1 sin intrón 15 en células ARPE-19 tratadas durante 24 h con 80 nM de los ASO indicados sobre las células tratadas de forma simulada. Los datos se normalizan a la expresión RPL32.
La FIG. 7C representa un esquema de RefSeq Genes para SYNGAP1correspondiente a NM_006772.
La FIG. 7D representa un gráfico ejemplar que muestra el nivel de cambio promedio (n=3) veces mayor en los niveles de expresión de mRNA de SYNGAP1 sin intrón 18 en células ARPE-19 tratadas durante 24 h con 80 nM de los ASO indicados sobre las células tratadas de forma simulada. Los datos se normalizan a la expresión RPL32.
La FIG. 7E representa un gráfico ejemplar que muestra el nivel de cambio promedio (n=3) veces mayor en los niveles de expresión de mRNA de SYNGAP1 sin intrón 18 en células ARPE-19 tratadas durante 24 h con 80 nM de los ASO indicados sobre las células tratadas de forma simulada. Los datos se normalizan a la expresión RPL32.
La FIG. 8A representa un esquema de una parte del RefSeqGene para SCN1A correspondiente a NM_006920. Los cebadores usados para el ensayo de RT-PCR se muestran en la FIG. 8B y la FIG. 8C.
La FIG. 8B representa un gel de agarosa que muestra los niveles de expresión de mRNA de SCN1A medidos por RT-PCR en las células indicadas (VM y CX: células neuroprogenitoras ReNcell; SK-N-AS: células de neuroblastoma; C: fracción citoplasmática; N: fracción nuclear).
La FIG. 8C representa un gel de agarosa que muestra los niveles de retención del intrón 21 en células SK-N-AS (izquierda) y células VM (derecha) medidos por RT-PCR (VM y CX: células neuroprogenitoras ReNcell; SK-N-AS: células de neuroblastoma; C: fracción citoplasmática; N: fracción nuclear).
La FIG. 8D representa un gráfico ejemplar que muestra el nivel de cambio promedio (n=2) veces mayor en los niveles de expresión de mRNA de SCN1A sin intrón 21 en células SK-N-AS tratadas durante 24 h con 80 nM de los ASO indicados sobre las células tratadas de forma simulada. Los datos se normalizan a la expresión RPL32. La FIG. 8E representa un gráfico ejemplar que muestra el nivel de cambio promedio (n=2) veces mayor en los niveles de expresión de mRNA de SCN1A sin intrón 21 en células SK-N-AS tratadas durante 24 h con 80 nM de los ASO indicados sobre las células tratadas de forma simulada. Los datos se normalizan a la expresión RPL32. La FIG. 8F representa un gráfico ejemplar que muestra el nivel de cambio promedio (n=2) veces mayor en los niveles de expresión de mRNA de SCN1A sin intrón 21 en células SK-N-AS tratadas durante 24 h con 40, 80 nM o 120 nM de los ASO indicados (que abarcan la unión de splicing exón 21-exón 22) sobre las células tratadas de forma simulada. Los datos se normalizan a la expresión RPL32.
La FIG. 8G representa un gráfico ejemplar que muestra el nivel de cambio promedio (n=2) veces mayor en los niveles de expresión de mRNA de SCN1A sin intrón 21 en células SK-N-AS tratadas durante 24 h con 80 nM de los ASO indicados sobre las células tratadas de forma simulada. Los datos se normalizan a la expresión RPL32.
La FIG. 8H representa las secuencias de los ASO utilizados en los experimentos mostrados en la FIG. 8D y la FIG. 8E.
La FIG. 8I representa las secuencias de los ASO utilizados en los experimentos mostrados en la FIG. 8G.
Descripción detallada de la invención
Los intrones individuales en los transcritos primarios de genes que codifican proteínas que tienen más de un intrón experimentan splicing del transcrito primario con diferentes eficiencias. En la mayoría de los casos, solo el mRNA de splicing completo se exporta a través de los poros nucleares para su posterior traducción en el citoplasma. Los transcritos sin splicing y de splicing parcial son detectables en el núcleo. En general, se piensa que la acumulación nuclear de transcritos sin splicing completo es un mecanismo para prevenir la acumulación de mRNA potencialmente perjudiciales en el citoplasma que pueden traducirse en proteínas. Para algunos genes, el splicing del intrón menos eficiente es una etapa postranscripcional limitante de la velocidad en la expresión génica, antes de la traducción en el citoplasma.
Se han descubierto en el núcleo de las células humanas niveles sustanciales de transcritos de splicing parcial que codifican la proteína SCN1A, deficiente en el retraso mental AD 5, y transcritos de splicing parcial que codifican la proteína SYNGAP1, deficiente en el síndrome de Dravet. Estas especies de pre-mRNA de SCN1A y SYNGAP1 comprenden al menos un intrón retenido. En esta invención se describen composiciones y procedimientos para regular al alza el splicing de uno o más intrones de SYNGAP1(no reivindicado) o SCN1A retenidos que limitan la velocidad de las etapas nucleares de expresión génica para aumentar la producción en estado estable de mRNA maduro de splicing completo y, por lo tanto, niveles traducidos de proteína SYNGAP1 o SCN1A. Estas composiciones y procedimientos utilizan oligómeros antisentido (ASO) que promueven el splicing constitutivo en los sitios de splicing de intrones de un pre-mRNA de SYNGAP1 o SCN1A que contiene intrón retenido (RIC pre-mRNA) que se acumula en el núcleo. Por tanto, la proteína SYNGAP1 o SCN1A puede aumentarse usando los procedimientos descritos en esta invención para tratar una afección causada por la deficiencia de SYNGAP1 o SCN1A, respectivamente.
Los procedimientos descritos en esta invención pueden usarse para aumentar la producción de SYNGAP1 o SCN1A para tratar una afección en un sujeto que lo necesite. El sujeto puede tener una afección en la que SYNGAP1 o SCN1A no es necesariamente deficiente en relación con el tipo silvestre, pero en la que un aumento de SYNGAP1 o SCN1A mitiga la afección, no obstante. La afección puede ser causada por una haploinsuficiencia de SYNGAP1 o SCN1A.
Retraso mental autosómico dominante 5
El retraso mental es la discapacidad grave que se produce con más frecuencia en los niños. La forma no sindrómica del trastorno es la más común y se caracteriza por la ausencia de características dismórficas. Las lesiones monoalélicas son suficientes para causar el trastorno que se caracteriza por un retraso global del desarrollo, hipotonía y retraso mental de moderado a severo. Los factores genéticos implicados en el retraso mental no sindrómico siguen siendo poco conocidos. Los análisis de ligamiento y citogenéticos han llevado a la identificación de 29 genes ligados al cromosoma X y 5 genes autosómicos recesivos asociados con el retraso mental no sindrómico, que en conjunto representan menos del 10 % de los casos (Hamden, y col., 2009). Además, aún no se han identificado genes autosómicos dominantes, lo que a su vez disminuye la probabilidad de identificar familias que sean susceptibles de análisis de ligamiento. Sin embargo, el hecho de que los reordenamientos cromosómicos de novo, que usualmente implican un cambio en el número de copias de las regiones genómicas, representen la causa más comúnmente reconocida de retraso mental indica que las lesiones monoalélicas son suficientes para causar este trastorno. Esto plantea la posibilidad de que las lesiones genéticas de novo más pequeñas, como las mutaciones puntuales, también contribuyan a la patogenia del trastorno. Un estudio de caso identificó lesiones genéticas de novo en el gen SYNGAP1 que resultan en la producción de proteínas truncadas en aproximadamente el 3 % de pacientes con retraso mental no sindrómico inexplicable. Los pacientes identificados en el estudio eran heterocigotos para las mutaciones de truncamiento de proteínas que comprendían dos mutaciones sin sentido y una deleción (Hamdan, y col.,2009). La enfermedad se describe, por ejemplo, en OMIM n.° 612621 (Online Mendelian Inheritance in Man (Herencia mendeliana en línea en el hombre), Universidad Johns Hopkins, 1966-2015).
SYNGAP1 es una enzima activadora de GTPasa que se expresa selectivamente en el cerebro. SYNGAP1, un componente del complejo del receptor de N-metil-D-aspartato (NMDA) que media la señalización del glutamato, actúa aguas abajo del receptor, bloqueando la inserción del receptor del ácido -amino-3-hidroxi-5-metil-4-isoxazol propiónico (AMPA) en la membrana postsináptica al inhibir la vía de señalización RAS-ERK. SYNGAP1 es necesario para el desarrollo normal; los ratones homocigotos para los alelos nulos del gen mueren poco después del nacimiento. Por el contrario, los ratones heterocigotos para el alelo nulo tienen una plasticidad sináptica y un aprendizaje deteriorados, en consonancia con el papel de SYNGAP 1 como componente del complejo del receptor NMDA (Hamdan, y col.,2009).
El splicing alternativo del gen SYNGAP1 da como resultado la expresión de tres isoformas de SYNGAP1 (Hamdan, y col., 2009). SYNGAP1 posee un dominio RASGAP que activa Ras GTPasas. Un motivo de unión a PDZ, QTRV, está presente en la isoforma 2 que media la interacción con otros componentes del complejo del receptor de NMDA. Los dominios RASGAP y QRTV regulan la plasticidad sináptica y la formación de espinas dendríticas que son necesarias para el aprendizaje y el desarrollo. Las mutaciones de truncamiento de proteínas asociadas con el retraso mental carecían del dominio RASGAP completo o de los motivos QTRV, en consonancia con su papel en la patogenia del retraso mental.
Síndrome de Dravet
El síndrome de Dravet (SD), también conocido como epilepsia mioclónica grave de la infancia (SMEI), es una encefalopatía epiléptica que se presenta en el primer año de vida. El síndrome de Dravet es una encefalopatía epiléptica cada vez más reconocida en la que el diagnóstico clínico se apoya en el hallazgo de mutaciones del gen del canal de sodio en aproximadamente el 70-80 % de los pacientes. Las mutaciones de los genes de los canales iónicos juegan un papel importante en la patogenia de una variedad de síndromes epilépticos, lo que hace que algunas epilepsias se consideren canalopatías. Los canales de sodio dependientes de voltaje (VGSC) juegan un papel esencial en la excitabilidad neuronal; por lo tanto, no es sorprendente que se hayan identificado muchas mutaciones asociadas con el SD en el gen que codifica una subunidad de VGSC. La enfermedad es descrita por, por ejemplo, Mulley, y col., 2005, y la descripción de la enfermedad en OMIM n.° 607208 (Online Mendelian Inheritance in Man (Herencia mendeliana en línea en el hombre), Universidad Johns Hopkins, 1966-2015).
Entre el 70 % y el 80 % de los pacientes son portadores de anomalías en el gen de la subunidadl del canal de sodio (SCN1A), y las mutaciones de truncamiento representan aproximadamente el 40 %, y tienen una correlación significativa con una edad más temprana de aparición de las convulsiones. Las mutaciones de secuenciación se encuentran en aproximadamente el 70 % de los casos y comprenden mutaciones de truncamiento (40 %) y de contrasentido (40 %) siendo el resto cambios en el sitio de splicing. La mayoría de las mutaciones son de novo, pero las mutaciones familiares se producen en el 5-10 % de los casos y generalmente son de tipo contrasentido. Las mutaciones restantes de SCN1A comprenden mutaciones en el sitio de splicing y de contrasentido, la mayoría de las cuales caen en la región de formación de poros del canal de sodio. En la actualidad, se han asociado más de 500 mutaciones con el SD y se distribuyen aleatoriamente a lo largo del gen (Mulley, y col., Neurol. 2006, 67, 1094­ 1095).
El gen SCN1A se encuentra en el grupo de genes del canal de sodio en el cromosoma humano 2q24 y codifica las subunidades formadoras de poros a conocidas como Nav1.1 del canal de sodio neuronal dependiente de voltaje. El gen SCN1A abarca aproximadamente 100 kb de ADN genómico y comprende 26 exones. La proteína SCN1A consiste en cuatro dominios, cada uno con seis segmentos transmembrana. Se han identificado dos variantes de splicing que dan como resultado una isoforma larga y corta que difieren en la presencia o ausencia de 11 aminoácidos en el bucle citoplasmático entre los dominios 1 y 2, en el exón 11 (Miller, y col., 1993-2015, y Mulley, y col., 2005, 25, 535-542).
La identificación de genes asociados con el retraso mental no sindrómico y el síndrome de Dravet que codifican proteínas en vías sinápticas bien caracterizadas ofrece la posibilidad de desarrollar tratamientos farmacológicos para dirigirse a los trastornos y reducir sus síntomas asociados.
Pre-mRNA que contiene intrén retenido (RIC pre-mRNA)
Los procedimientos descritos en esta invención aprovechan la presencia de pre-mRNA que contiene intrón retenido (RIC pre-mRNA) transcrito del SYNGAP1 o ScN1A y que codifica la proteína SYNGAP1 o SCN1A, en el núcleo celular. El splicing de las especies de RIC pre-mRNA de SYNGAP1 o SCN1A identificadas para producir mRNA de SYNGAP1 o SCN1A maduro de splicing completo, se induce utilizando ASO que estimulan el splicing de los intrones retenidos. El mRNA maduro de SYNGAP1 o SCN1A resultante puede exportarse en el citoplasma y traducirse, aumentando así la cantidad de proteína SYNGAP1 o SCN1A en las células del paciente y aliviando los síntomas del retraso mental AD 5 o síndrome de Dravet. Este procedimiento, que se describe más adelante, se conoce como aumento dirigido de la producción de genes nucleares (TANGO).
Transcritos nucleares de SYNGAP1
Como se describe en esta invención en los Ejemplos, el gen SYNGAP1 se analizó para detectar eventos de retención de intrones y se observó la retención del intrón 15 y 18/19. La secuenciación de ARN (RNAseq), visualizada en el navegador del genoma UCSC, mostró transcritos de SYNGAP1 expresados en neuronas corticales humanas (HCN) y localizadas en la fracción citoplásmica o nuclear. En ambas fracciones, no se observaron lecturas para la mayoría de los intrones. Sin embargo, se detectó una mayor densidad de lectura para los intrones 15 y 18/19 en la fracción nuclear en comparación con la fracción citoplásmica, lo que indica que la eficiencia de splicing de los intrones 15 y 18/19 es baja, lo que da como resultado la retención de intrones. Los transcritos de pre-mRNA que contienen intrón retenido se retienen en el núcleo y no se exportan al citoplasma. La densidad de lectura para los intrones 18/19 indicó una retención de intrones del 42 %. El valor porcentual de retención de intrones (PIR) para los intrones 18/19 se obtuvo promediando cuatro valores (54, 50, 35, 29), cada uno determinado en células HCN utilizando uno de cuatro algoritmos diferentes. La densidad de lectura para el intrón 15 indicó una retención del intrón del 25 %. El valor porcentual de retención de intrones (PIR) para el intrón 15 se obtuvo promediando cuatro valores (49, 0, 26, 23), cada uno determinado en células HCN utilizando uno de cuatro algoritmos diferentes.
En realizaciones de la invención, los ASO descritos en esta invención se dirigen a un RIC pre-mRNA transcrito a partir de una secuencia genómica de SCN1A. En algunas realizaciones, el ASO se dirige a un transcrito de RIC premRNA de una secuencia genómica de SCN1A que comprende el intrón retenido 21. En algunas realizaciones, el ASO se dirige a un transcrito de RIC pre-mRNA de una secuencia genómica de SCN1A que comprende el intrón retenido 23. En algunas realizaciones, el ASO se dirige a un transcrito de RIC pre-mRNA de SEQ ID NO: 1. En algunas realizaciones, el ASO se dirige a un transcrito de RIC pre-mRNA de SEQ ID NO: 1 que comprende un intrón retenido 21. En algunas realizaciones, el ASO se dirige a un transcrito de RIC pre-mRNA de SEQ ID NO: 1 que comprende un intrón retenido 23. En algunas realizaciones, los ASO descritos en esta invención se dirigen a una secuencia de RIC pre-mRNA de SCN1A. En algunas realizaciones, el ASO se dirige a una secuencia de RIC premRNA de SCN1A que comprende un intrón retenido 21. En algunas realizaciones, el ASO se dirige a una secuencia de RIC pre-mRNA de SCN1A que comprende un intrón retenido 23. En algunas realizaciones, el ASO se dirige a una secuencia de RIC pre-mRNA de SCNIA según cualquiera de las SEQ ID NO: 4-7. En algunas realizaciones, el ASO se dirige a una secuencia de RIC pre-ARNm de SCN1A según cualquiera de las SEQ ID NO: 4, 6 o 7 que comprende un intrón retenido 21. En algunas realizaciones, el ASO se dirige a una secuencia de RIC pre-mRNA de SCN1A según la SEQ ID NO: 5 que comprende un intrón retenido 23. En algunas realizaciones, los ASO descritos en esta invención se dirigen a la SEQ ID NO: 2593. En algunas realizaciones, el ASO tiene una secuencia según cualquiera de las SEQ ID NO: 10-1037.
En algunas realizaciones, el ASO se dirige al exón 21 de un RIC pre-mRNA de SCN1A que comprende un intrón retenido 21. En algunas realizaciones, el ASO se dirige a una secuencia del exón 21 aguas arriba (o 5') del sitio de splicing 5' de un RIC pre-ARNm de SCN1A que comprende un intrón retenido 21. En algunas realizaciones, el ASO se dirige a una secuencia de exón de aproximadamente 4 a aproximadamente 264 nucleótidos aguas arriba (o 5') del sitio de splicing 5' de un RIC pre-mRNA de SCN1A que comprende un intrón retenido 21. En algunas realizaciones, el ASO tiene una secuencia según cualquiera de las SEQ ID NO: 10-62, 524-576 o 781-833.
En algunas realizaciones, el ASO se dirige al intrón 21 en un RIC pre-mRNA de SCN1A que comprende un intrón retenido 21. En algunas realizaciones, el ASO se dirige a una secuencia del intrón 21 aguas abajo (o 3') del sitio de splicing 5' de un RIC pre-mRNA de SCN1A que comprende un intrón retenido 21. En algunas realizaciones, el ASO se dirige a una secuencia del intrón 21 de aproximadamente 6 a aproximadamente 496 nucleótidos aguas abajo (o 3') del sitio de splicing 5' de un RIC pre-mRNA de SCN1A que comprende un intrón retenido 21. En algunas realizaciones, el ASO tiene una secuencia según cualquiera de las SEQ ID NO: 63-161, 577-675 o 834-932.
En algunas realizaciones, el ASO se dirige a una secuencia del intrón 21 aguas arriba (o 5') del sitio de splicing 3' de un RIC pre-mRNA de SCN1A que comprende un intrón retenido 21. En algunas realizaciones, el ASO se dirige a una secuencia del intrón 21 de aproximadamente 16 a aproximadamente 496 nucleótidos aguas arriba (o 5') del sitio de splicing 3' de un RIC pre-mRNA de SCN1A que comprende un intrón retenido 21. En algunas realizaciones, el ASO tiene una secuencia según cualquiera de las SEQ ID NO: 162-258, 676-772 o 933-1029.
En algunas realizaciones, el ASO se dirige al exón 22 en un RIC pre-mRNA de SCN1A que comprende un intrón retenido 21. En algunas realizaciones, el ASO se dirige a una secuencia del exón 22 aguas abajo (o 3') del sitio de splicing 3' de un RIC pre-mRNA de SCN1A que comprende un intrón retenido 21. En algunas realizaciones, el ASO se dirige a una secuencia del exón 22 de aproximadamente 2 a aproximadamente 37 nucleótidos aguas abajo (o 3') del sitio de splicing 3' de un RIC pre-mRNA de SCN1A que comprende un intrón retenido 21. En algunas realizaciones, el ASO tiene una secuencia según cualquiera de las SEQ ID NO: 259-266, 773-780 o 1030-1037. En algunas realizaciones, el ASO se dirige al exón 23 de un RIC pre-mRNA de SCN1A que comprende un intrón retenido 23. En algunas realizaciones, el ASO se dirige a una secuencia del exón 23 aguas arriba (o 5') del sitio de splicing 5' de un RIC pre-mRNA de SCN1A que comprende un intrón retenido 23. En algunas realizaciones, el ASO se dirige a una secuencia de exón de aproximadamente 4 a aproximadamente 264 nucleótidos aguas arriba (o 5') del sitio de splicing 5' de un RIC pre-mRNA de SCN1A que comprende un intrón retenido 23. En algunas realizaciones, el ASO tiene una secuencia según cualquiera de las SEQ ID NO: 267-319.
En algunas realizaciones, el ASO se dirige al intrón 23 en un RIC pre-mRNA de SCN1A que comprende un intrón retenido 23. En algunas realizaciones, el ASO se dirige a una secuencia del intrón 23 aguas abajo (o 3') del sitio de splicing 5' de un RIC pre-mRNA de SCN1A que comprende un intrón retenido 23. En algunas realizaciones, el ASO se dirige a una secuencia del intrón 23 de aproximadamente 6 a aproximadamente 496 nucleótidos aguas abajo (o 3') del sitio de splicing 5' de un RIC pre-mRNA de SCN1A que comprende un intrón retenido 23. En algunas realizaciones, el ASO tiene una secuencia según cualquiera de las SEQ ID NO: 320-419.
En algunas realizaciones, el ASO se dirige a una secuencia del intrón 23 aguas arriba (o 5') del sitio de splicing 3' de un RIC pre-mRNA de SCN1A que comprende un intrón retenido 23. En algunas realizaciones, el ASO se dirige a una secuencia del intrón 23 de aproximadamente 16 a aproximadamente 496 nucleótidos aguas arriba (o 5') del sitio de splicing 3' de un RIC pre-mRNA de SCN1A que comprende un intrón retenido 23. En algunas realizaciones, el ASO tiene una secuencia según cualquiera de las SEQ ID NO: 420-515.
En algunas realizaciones, el ASO se dirige al exón 24 en un RIC pre-mRNA de SCN1A que comprende un intrón retenido 23. En algunas realizaciones, el ASO se dirige a una secuencia del exón 24 aguas abajo (o 3') del sitio de splicing 3' de un RIC pre-mRNA de SCN1A que comprende un intrón retenido 23. En algunas realizaciones, el ASO se dirige a una secuencia del exón 24 de aproximadamente 2 a aproximadamente 37 nucleótidos aguas abajo (o 3') del sitio de splicing 3' de un RIC pre-mRNA de SCN1A que comprende un intrón retenido 23. En algunas realizaciones, el ASO tiene una secuencia según cualquiera de las SEQ ID NO: 516-523.
En las realizaciones, la porción dirigida del RIC pre-mRNA de SCN1A está en el intrón 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 o 25 (numeración de intrones correspondiente a la secuencia de mRNA en NM_001202435.1). En las realizaciones, la hibridación de un ASO con la porción dirigida del RIC premRNA da como resultado un splicing mejorado en el sitio de splicing (sitio de splicing 5' o sitio de splicing 3') de al menos uno de los intrones retenidos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 o 25, y posteriormente aumenta la producción de proteína SCN1A. En las realizaciones, la porción dirigida del RIC pre-mRNA de SCN1A está en el intrón 21 o 23. Un experto en la materia puede determinar el número de intrón correspondiente en cualquier isoforma basándose en una secuencia de intrón proporcionada en esta invención o utilizando el número proporcionado en referencia a la secuencia de mRNA en NM_006920, NM_001202435, NM_001165964 o NM_001165963. Un experto en la materia también puede determinar las secuencias de exones flanqueantes en cualquier isoforma de SCN1A para el direccionamiento usando los procedimientos de la invención, basándose en una secuencia de intrón proporcionada en esta invención o usando el número de intrón proporcionado en referencia a la secuencia de mRNA en Nm_006920, NM_001202435, NM_001165964, o NM_001165963.
El grado de retención de intrones se puede expresar como porcentaje de retención de intrones (PIR), el porcentaje de transcritos en los que se retiene un intrón dado. En resumen, PIR se puede calcular como el porcentaje del número promedio de lecturas que mapean las uniones exón-intrón, sobre la suma del promedio de las lecturas de la unión exón-intrón más las lecturas de la unión exón-exón.
Los valores de PIR para SCN1A han sido informados, por ejemplo, por Braunschweig, y col., 2014, (véase, por ejemplo, la Tabla complementaria S9). Las composiciones de la invención se utilizan para aumentar la expresión de SCN1A induciendo el splicing constitutivo de un intrón retenido de un RIC pre-mRNA de SCN1A. En las realizaciones, el intrón retenido es cualquiera de los intrones 1-25. En las realizaciones, el intrón retenido es cualquiera de los intrones 2, 4, 6, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 20, 21, 22, 23, 24 y 25. En las realizaciones, el intrón retenido es cualquiera de los intrones 15, 18 y 19. En las realizaciones, el intrón retenido puede ser cualquier intrón SCN1A. En las realizaciones, el intrón retenido es el intrón 21. En las realizaciones, el intrón retenido es el intrón 23. La numeración del intrón SCN1Autilizada en esta invención corresponde a la secuencia de mRNA en NM_001202435.1. Se entiende que la numeración de intrones puede cambiar en referencia a una secuencia de isoformas de SCN1A diferente.
Expresión de proteínas SYNGAP1 o SCN1A
Como se describió anteriormente, las mutaciones SYNGAP1 en el retraso mental no sindrómico AD se extienden por toda la proteína y hay una alta tasa de mutación de novo. El análisis de ligamiento y citogenético han identificado 29 genes ligados al cromosoma X y 5 genes autosómicos recesivos asociados con el retraso mental no sindrómico AD, que representan menos del 10 % de los casos. Esto sugiere que las lesiones genéticas de novo más pequeñas, como las mutaciones puntuales, pueden contribuir a la patogenia de la enfermedad.
También descritas anteriormente, las mutaciones de SCN1A en el síndrome de Dravet se extienden por toda la proteína. Se han identificado más de 100 mutaciones novedosas en todo el gen surgiendo las más debilitantes de novo. Estas comprenden truncamientos (47 %), de contrasentido (43 %), deleciones (3 %), y mutaciones en el sitio de splicing (7 %). El porcentaje de sujetos portadores de mutaciones SCN1A varía entre el 33 y el 100 %. La mayoría de las mutaciones son cambios novedosos (88 %).
Los procedimientos descritos en esta invención pueden usarse para aumentar la producción de una proteína SYNGAP (no reivindicada) o SCN1A funcional. Como se usa en esta invención, el término "funcional" se refiere a la cantidad de actividad o función de una proteína SYNGAP1 o SCN1A que es necesaria para eliminar uno o más síntomas de una afección tratada, por ejemplo, retraso mental AD 5 o síndrome de Dravet. Los procedimientos pueden usarse para aumentar la producción de una proteína SYNGAP1 o SCN1A parcialmente funcional. Como se usa en esta invención, la expresión "parcialmente funcional" se refiere a cualquier cantidad de actividad o función de la proteína SYNGAP1 o SCN1A que sea menor que la cantidad de actividad o función que es necesaria para eliminar o prevenir uno o más síntomas de una enfermedad o afección. En algunas realizaciones, una proteína o ARN parcialmente funcional tendrá al menos el 10 %, al menos el 20 %, al menos el 30 %, al menos el 40 %, al menos el 50 %, al menos el 60 %, al menos el 70 %, al menos el 75 %, al menos el 80 %, al menos el 85 %, al menos el 90 % o al menos el 95 % menos de actividad en relación con la proteína o ARN completamente funcional.
El procedimiento puede ser un procedimiento para aumentar la expresión de la proteína SYNGAP1 o SCN1A por las células de un sujeto que tiene un RIC pre-mRNA que codifica la proteína SYNGAP1 o SCN1A, donde el sujeto tiene retraso mental AD 5 o síndrome de Dravet causado por una cantidad de actividad deficiente de la proteína SYNGAP1 o SCN1A, y donde la cantidad deficiente de la proteína SYNGAP1 o SCN1A está causada por la haploinsuficiencia de la proteína SYNGAP1 o SCN1A. El sujeto puede tener un primer alelo que codifica una proteína SYNGAP1 o SCN1A funcional y un segundo alelo a partir del cual no se produce la proteína SYNGAP1 o SCN1A. El sujeto puede tener un primer alelo que codifica una proteína SYNGAP1 o SCN1A funcional, y un segundo alelo que codifica una proteína SYNGAP1 o SCN1A no funcional. El sujeto puede tener un primer alelo que codifica una proteína SYNGAP1 o SCN1A funcional, y un segundo alelo que codifica una proteína SYNGAP1 o SCN1A parcialmente funcional. En cualquiera de estos procedimientos, el oligómero antisentido se une a una porción dirigida del RIC pre-mRNA transcrito del primer alelo (que codifica la proteína funcional SYNGAP 1 o SCN1A), induciendo así el splicing constitutivo del intrón retenido del RIC pre-mRNA, y provocando un aumento en el nivel de mRNA maduro que codifica la proteína funcional SYNGAP 1 o SCN1A, y un aumento en la expresión de la proteína SYNGAP1 o SCN1A en las células del sujeto.
El sujeto puede tener un primer alelo que codifica una proteína SYNGAP1 o SCN1A funcional, y un segundo alelo que codifica una proteína SYNGAP1 o SCN1A parcialmente funcional, y el oligómero antisentido puede unirse a una porción dirigida del RIC pre-mRNA transcrito del primer alelo (que codifica la proteína funcional SYNGAP1 o SCN1A) o una porción dirigida del RIC pre-mRNA transcrito a partir del segundo alelo (que codifica la proteína SYNGAP1 o SCN1A parcialmente funcional), induciendo así el splicing constitutivo del intrón retenido del RIC pre-mRNA, y provocando una aumento en el nivel de mRNA maduro que codifica la proteína SYNGAP1 o SCN1A, y un aumento en la expresión de la proteína SYNGAP1 o SCN1A funcional o parcialmente funcional en las células del sujeto. En procedimientos relacionados, el procedimiento es un procedimiento de uso de un ASO para aumentar la expresión de una proteína o ARN funcional. Se puede usar un ASO para aumentar la expresión de la proteína SYNGAP1 o SCN1A en las células de un sujeto que tiene un RIC pre-mRNA que codifica la proteína SYNGAP1 o SCN1A, donde el sujeto tiene una deficiencia, por ejemplo, retraso mental Ad 5 o síndrome de Dravet, en la cantidad o función de una proteína SYNGAP1 o SCN1A.
Los ASO descritos en esta invención pueden dirigirse al transcrito de RIC pre-mRNA que codifica la proteína que es causante de la enfermedad o afección. Los ASO pueden dirigirse a un transcrito de RIC pre-mRNA que codifica una proteína que no es causante de la enfermedad. Por ejemplo, una enfermedad que es el resultado de una mutación o deficiencia de una primera proteína en una ruta particular puede mejorarse dirigiendo un RIC pre-mRNA que codifica una segunda proteína, aumentando así la producción de la segunda proteína. La función de la segunda proteína puede compensar la mutación o deficiencia de la primera proteína (que es la causa de la enfermedad o afección). El sujeto puede tener:
(a) un primer alelo mutante a partir del cual
(i) la proteína SYNGAP1 o SCN1A se produce a un nivel reducido en comparación con la producción a partir de un alelo de tipo silvestre,
(ii) la proteína SYNGAP1 o SCN1A se produce en una forma que tiene una función reducida en comparación con una proteína equivalente de tipo silvestre o
(iii) no se produce la proteína SYNGAP1 o SCN1A o el ARN funcional; y
(b) un segundo alelo mutante a partir del cual
(i) la proteína SYNGAP1 o SCN1A se produce a un nivel reducido en comparación con la producción a partir de un alelo de tipo silvestre,
(ii) la proteína SYNGAP1 o SCN1A se produce en una forma que tiene una función reducida en comparación con una proteína equivalente de tipo silvestre o
(iii) no se produce la proteína SYNGAP1 o SCN1A, y
donde el RIC pre-mRNA se transcribe a partir del primer alelo y/o el segundo alelo. En estos procedimientos, el ASO se une a una porción dirigida del RIC pre-mRNA transcrito del primer alelo o del segundo alelo, induciendo así el splicing constitutivo del intrón retenido del RIC pre-mRNA y provocando un aumento en el nivel de mRNA que codifica la proteína SYNGAP1 o SCN1A y un aumento en la expresión de la proteína diana o ARN funcional en las células del sujeto. En estos procedimientos, la proteína diana o el ARN funcional que tiene un aumento en el nivel de expresión resultante del splicing constitutivo del intrón retenido del RIC pre-mRNA está en una forma que tiene una función reducida en comparación con la proteína equivalente de tipo silvestre (parcialmente funcional), o que tiene una función completa en comparación con la proteína equivalente de tipo silvestre (completamente funcional).
El nivel de mRNA que codifica la proteína SYNGAP1 o SCN1A puede aumentarse de 1,1 a 10 veces, en comparación con la cantidad de mRNA que codifica la proteína SYNGAP1 o SCN1A que se produce en una célula de control, por ejemplo, una que no se trata con el oligómero antisentido o una que se trata con un oligómero antisentido que no se une a la porción dirigida del RIC pre - mRNA de SYNGAP1 o SCN1A.
En los procedimientos, la afección causada por una cantidad o actividad deficiente de la proteína SYNGAP1 o SCN1A no es una afección causada por un splicing alternativo o aberrante del intrón retenido al que se dirige el ASO. En los procedimientos, la afección causada por una cantidad o actividad deficiente de la proteína SYNGAP 1 o SCN1A no es una afección causada por un splicing alternativo o aberrante de cualquier intrón retenido en un RIC pre-mRNA que codifica la proteína SYNGAP1 o SCN1A. En los procedimientos, puede producirse un splicing alternativo o aberrante en un pre-mRNA transcrito del gen SYNGAP1 o SCN1A, sin embargo, las composiciones y los procedimientos de la invención no previenen ni corrigen este splicing alternativo o aberrante.
Un sujeto tratado usando los procedimientos descritos en esta invención puede expresar una proteína SYNGAP1 o SCN1A parcialmente funcional de un alelo, donde la proteína SYNGAP1 o SCN1A parcialmente funcional está causada por una mutación de cambio de marco, una mutación sin sentido, una mutación de contrasentido o una deleción parcial del gen. Un sujeto tratado usando los procedimientos de la invención puede expresar una proteína SYNGAP1 o SCN1A no funcional de un alelo, donde la proteína SYNGAP1 o SCN1A no funcional está causada por una mutación de cambio de marco, una mutación sin sentido, una mutación de contrasentido, una deleción parcial del gen, en un alelo. Un sujeto tratado usando los procedimientos de la invención puede tener una deleción del gen completo SYNGAP1 o SCN1A, en un alelo.
Un sujeto puede tener una mutación de contrasentido SYNGAP1 o SCN1A. Un sujeto puede tener una mutación SYNGAP1 y SCN1A. En algunos casos, una mutación SYNGAP 1 puede ser una mutación de truncamiento. Una mutación de truncamiento SYNGAP 1 puede ser una mutación K138X, R579X o L813RfsX22. Una mutación K138X puede resultar en una proteína SYNGAP1 truncada que puede carecer de un dominio RASGAP. Dicha mutación K138X puede codificar una mutación c.412A^ T. En algunos casos, una mutación R579X puede truncar SYNGAP1 en una región que sigue a un dominio RASGAP. Una c.2438delT también puede truncar SYNGAP1 en una región que sigue a un dominio RASGAP. Una mutación L813RfsX22 puede codificar una secuencia de mutación c.2438delT. Dichas mutaciones pueden producirse aguas arriba del extremo 3' de un gen SYNGAP1 que puede experimentar splicing alternativo. Las mutaciones en dicho extremo 3' pueden alterar la codificación de una porción C-terminal de la proteína SYNGAP1.
Un sujeto puede tener una mutación que no está determinada. Una mutación que no está determinada puede ser una mutación SYNGAP1 o una mutación SCN1A. Una mutación que no está determinada puede ser una mutación SYNGAP1. En algunos casos, una mutación SYNGAP1 puede ser I1115T. Dicho, la mutación I1115T puede codificar una mutación c.3344T^C. Las mutaciones en SYNGAP1 pueden estar asociadas con enfermedades que no son retraso mental no sindrómico. Las mutaciones en SYNGAP 1 pueden asociarse con trastornos del espectro autista y esquizofrenia. En algunos casos, las mutaciones asociadas con SYNGAP 1 pueden ser un polimorfismo.
Un sujeto puede tener una mutación en SCNIA.Las mutaciones en SCN1A pueden extenderse por dicho gen. La proteína SCN1A puede consistir en cuatro dominios. Dichos dominios SCN1A pueden tener segmentos transmembrana. Pueden surgir mutaciones en dicha proteína SCN1A a lo largo de dicha proteína. Dicha proteína SCN1A puede consistir en al menos dos isoformas. Las mutaciones en SCN1A pueden comprender R931C, R946C, M934I, R1648C o R1648H. En algunos casos, se pueden observar mutaciones en un extremo C de una proteína SCN1A. También se pueden encontrar mutaciones en una proteína SCN1A en los bucles entre los segmentos 5 y 6 de los tres primeros dominios de dicha proteína SCN1A. En algunos casos, se pueden observar mutaciones en un extremo N de una proteína SCN1A. Las mutaciones dentro de SCN1A pueden ser R222X, R712X, I227S, R1892X, W952X, R1245X, R1407X, W1434R, c.4338+1G>A, S1516X, L1670fsX1678 o K1846fsX1856. Las mutaciones que pueden dirigirse también pueden codificar un poro de un canal iónico.
En las realizaciones, la presente invención puede usarse para tratar el síndrome de Dravet. En otras realizaciones, la presente invención puede usarse para tratar la epilepsia mioclónica grave de la infancia (SMEI). En otras realizaciones, la presente invención puede tratar el síndrome limítrofe de Dravet. La presente invención también puede tratar SMEI limítrofe. Además, la presente invención puede tratar la epilepsia generalizada con convulsiones febriles plus (GEFS+). GEFS+ puede estar asociado con mutaciones en subunidades del canal iónico asociadas a la epilepsia, como SCN1B o GABRG2. La presente invención también puede tratar las canalopatías por sodio. Las canalopatías de sodio pueden estar asociadas con mutaciones en SCN1A. Las canalopatías de sodio también pueden estar asociadas con subunidades de dicho SCN1A, como la subunidad beta, SCN1B. En algunos casos, también se pueden tratar con la presente invención enfermedades adicionales asociadas con mutaciones de SCN1A. Las enfermedades relacionadas con SCN1A asociadas con mutaciones de SCN1A pueden ser miotonía congénita atípica, parálisis periódica hiperpotasémica o paramiotonía congénita.
Un sujeto que tenga cualquier mutación SYNGAP1 o SCN1A conocida en la técnica y descrita en la bibliografía mencionada anteriormente (por ejemplo, por Hamdan, y col., 2009, Mulley, y col., 2005) puede tratarse usando los procedimientos y composiciones de la presente invención. La mutación puede estar dentro de cualquier intrón SYNGAP1 o SCN1A.
Us o de TANGO para aumentar la expresión de proteínas SYNGAP1 o SCN1A
Como se describió anteriormente, el aumento dirigido de la producción de genes nucleares (TANGO) puede usarse para aumentar la expresión de una proteína SYNGAP 1 (no reivindicada) o SCN1A. En estos procedimientos, un pre-mRNA que contiene intrón retenido (RIC pre-mRNA) que codifica la proteína SYNGAP 1 o SCN1A está presente en el núcleo de una célula. Las células que tienen un RIC pre-ARNm de SYNGAP1 o SCN1A que comprende un intrón retenido, un exón que flanquea el sitio de splicing 5' y un exón que flanquea el sitio de splicing 3', que codifica la proteína SYNGAP1 o SCN1A, se ponen en contacto con oligómeros antisentido (ASO) que son complementarios a una porción dirigida del RIC pre-mRNA. La hibridación de los ASO con la porción dirigida del RIC pre-mRNA da como resultado un splicing mejorado en el sitio de splicing (sitio de splicing 5' o sitio de splicing 3') del intrón retenido y posteriormente aumenta la producción de proteína diana.
Los términos "pre-mRNA" y "transcrito de pre-mRNA" pueden usarse indistintamente y se refieren a cualquier especie de pre-mRNA que contenga al menos un intrón. En las realizaciones, los transcritos de pre-mRNA o premRNA comprenden un casquete de 5'-7-metilguanosina y/o una cola de poli-A. En las realizaciones, los transcritos de pre-mRNA o pre-mRNA comprenden un casquete de 5'-7-metilguanosina y una cola de poli-A. En algunas realizaciones, el transcrito de pre-mRNA no comprende un casquete de 5'-7-metilguanosina y/o una cola de poli-A. Un transcrito de pre-mRNA es una molécula de ARN mensajero (mRNA) no productiva si no se traduce en una proteína (o se transporta al citoplasma desde el núcleo).
Como se usa en esta invención, un "pre-mRNA que contiene intrón retenido" ("RIC pre-mRNA") es un transcrito de pre-mRNA que contiene al menos un intrón retenido. El RIC pre-mRNA contiene un intrón retenido, un exón que flanquea el sitio de splicing 5' del intrón retenido, un exón que flanquea el sitio de splicing 3' del intrón retenido y codifica la proteína diana. Se entiende que un "RIC pre-mRNA que codifica una proteína diana" codifica la proteína diana cuando presenta splicing completo. Un "intrón retenido" es cualquier intrón que está presente en un transcrito de pre-mRNA cuando uno o más intrones, como un intrón adyacente, codificado por el mismo gen, han experimentado splicing del mismo transcrito de pre-mRNA. En algunas realizaciones, el intrón retenido es el intrón más abundante en el RIC pre-mRNA que codifica la proteína diana. En las realizaciones, el intrón retenido es el intrón más abundante en una población de RIC pre-mRNA transcritos del gen que codifica la proteína diana en una célula, donde la población de RIC pre-mRNA comprende dos o más intrones retenidos. En las realizaciones, un oligómero antisentido dirigido al intrón más abundante en la población de RIC pre-mRNA que codifican la proteína diana induce el splicing de dos o más intrones retenidos en la población, incluido el intrón retenido al que se dirige o se une el oligómero antisentido. En las realizaciones, se produce de ese modo un mRNA maduro que codifica la proteína diana. Los términos "mRNA maduro" y "mRNA de splicing completo" se usan indistintamente en esta invención para describir un mRNA completamente procesado que codifica una proteína diana (por ejemplo, mRNA que se exporta desde el núcleo al citoplasma y se traduce en proteína diana) o un ARN funcional completamente procesado. El término "mRNA productivo" también puede usarse para describir un mRNA completamente procesado que codifica una proteína diana. En las realizaciones, la región dirigida está en un intrón retenido que es el intrón más abundante en un RIC pre-mRNA que codifica la proteína SCN1A. En las realizaciones, el intrón más retenido en un RIC pre-mRNA que codifica la proteína SYNGAP1 es el intrón 15.
En las realizaciones, un intrón retenido es un intrón que se identifica como un intrón retenido basándose en una determinación de al menos aproximadamente el 5 %, al menos aproximadamente el 10 %, al menos aproximadamente el 15 %, al menos aproximadamente el 20 %, al menos aproximadamente el 25 %, al menos aproximadamente el 30 %, al menos aproximadamente el 35 %, al menos aproximadamente el 40 %, al menos aproximadamente el 45 % o al menos aproximadamente el 50 % de retención. En las realizaciones, un intrón retenido es un intrón que se identifica como un intrón retenido basándose en una determinación de aproximadamente el 5 % a aproximadamente el 100 %, de aproximadamente el 5 % a aproximadamente el 95 %, de aproximadamente el 5 % a aproximadamente el 90 %, de aproximadamente el 5 % a aproximadamente el 85 %, de aproximadamente el 5 % a aproximadamente el 80 %, aproximadamente el 5 % a aproximadamente el 75 %, de aproximadamente el 5 % a aproximadamente el 70 %, de aproximadamente el 5 % a aproximadamente el 65 %, de aproximadamente el 5 % a aproximadamente el 60 %, aproximadamente el 5 % a aproximadamente el 55 %, de aproximadamente el 5 % a aproximadamente el 50 %, aproximadamente el 5 % a aproximadamente el 45 %, aproximadamente el 5 % a aproximadamente el 40 %, aproximadamente el 5 % a aproximadamente el 35 %, de aproximadamente el 5 % a aproximadamente el 30 %, aproximadamente el 5 % a aproximadamente el 25 %, aproximadamente el 5 % a aproximadamente el 20 %, aproximadamente el 5 % a aproximadamente el 15 %, de aproximadamente el 10 % a aproximadamente el 100 %, aproximadamente el 10 % a aproximadamente el 95 %, aproximadamente el 10 % a aproximadamente el 90 %, de aproximadamente el 10 % a aproximadamente el 85 %, de aproximadamente el 10 % a aproximadamente el 80 %, de aproximadamente el 10 % a aproximadamente el 75 %, de aproximadamente el 10 % a aproximadamente el 70 %, de aproximadamente el 10 % a aproximadamente el 65 %, de aproximadamente el 10 % a aproximadamente el 60 %, de aproximadamente el 10 % a aproximadamente el 55 %, de aproximadamente el 10 % a aproximadamente el 50 %, de aproximadamente el 10 % a aproximadamente el 45 %, de aproximadamente el 10 % a aproximadamente el 40 %, aproximadamente el 10 % a aproximadamente el 35 %, de aproximadamente el 10 % a aproximadamente el 30 %, de aproximadamente el 10 % a aproximadamente el 25 %, de aproximadamente el 10 % a aproximadamente el 20 %, de aproximadamente el 15 % a aproximadamente el 100 %, de aproximadamente el 15 % a aproximadamente el 95 %, de aproximadamente el 15 % a aproximadamente el 90 %, de aproximadamente el 15 % a aproximadamente el 85 %, de aproximadamente el 15 % a aproximadamente el 80 %, de aproximadamente el15 % a aproximadamente el 75 %, de aproximadamente el 15 % a aproximadamente el 70 %, de aproximadamente el 15 % a aproximadamente el 65 %, de aproximadamente el 15 % a aproximadamente el 60 %, de aproximadamente el 15 % a aproximadamente el 55 %, de aproximadamente el 15 % a aproximadamente el 50 %, de aproximadamente el 15 % a aproximadamente el 45 %, de aproximadamente el 15 % a aproximadamente el 40 %, de aproximadamente el 15 % a aproximadamente el 35 %, de aproximadamente el 15 % a aproximadamente el 30 %, de aproximadamente el 15 % a aproximadamente el 25 %, de aproximadamente el 20 % a aproximadamente el 100 %, de aproximadamente el 20 % a aproximadamente el 95 %, de aproximadamente el 20 % a aproximadamente el 90 %, de aproximadamente el 20 % a aproximadamente el 85 %, de aproximadamente el 20 % a aproximadamente el 80 %, de aproximadamente el 20 % a aproximadamente el 75 %, de aproximadamente el 20 % a aproximadamente el 70 %, de aproximadamente el 20 % a aproximadamente el 65 %, de aproximadamente el 20 % a aproximadamente el 60 %, de aproximadamente el 20 % a aproximadamente el 55 %, de aproximadamente el 20 % a aproximadamente el 50 %, de aproximadamente el 20 % a aproximadamente el 45 %, de aproximadamente el 20 % a aproximadamente el 40 %, de aproximadamente el 20 % a aproximadamente el 35 %, de aproximadamente el 20 % a aproximadamente el 30 %, de aproximadamente el 25 % a aproximadamente el 100 %, de aproximadamente el 25 % a aproximadamente el 95 %, de aproximadamente el 25 % a aproximadamente el 90 %, de aproximadamente el 25 % a aproximadamente el 85 %, de aproximadamente el 25 % a aproximadamente el 80 %, de aproximadamente el 25 % a aproximadamente el 75 %, de aproximadamente el 25 % a aproximadamente el 70 %, de aproximadamente el 25 % a aproximadamente el 65 %, de aproximadamente el 25 % a aproximadamente el 60 %, de aproximadamente el 25 % a aproximadamente el 55 %, de aproximadamente el 25 % a aproximadamente el 50 %, de aproximadamente el 25 % a aproximadamente el 45 %, de aproximadamente el 25 % a aproximadamente el 40 % o de aproximadamente el 25 % a aproximadamente el 35 % de retención. Los datos de ENCODE (descritos por, por ejemplo,Tilgner, y col., 2012, "Deep sequencing of subcellular RNA fractions shows splicing to be predominantly co-transcriptional in the human genome but inefficient for IncRNAs" ("La secuenciación profunda de fracciones de ARN subcelular muestra que el splicing es predominantemente cotranscripcional en el genoma humano pero ineficaz para los lcRNA"), Genome Research 22(9):1616-25) se pueden utilizar para ayudar a identificar los intrones retenidos.
Como se usa en esta invención, el término "comprenden" o variaciones del mismo tales como "comprende" o la expresión "que comprende" deben leerse para indicar la inclusión de cualquier característica mencionada (por ejemplo, en el caso de un oligómero antisentido, una secuencia de nucleobase definida) pero sin la exclusión de otras características. Por tanto, como se usa en esta invención, la expresión "que comprende" es inclusiva y no excluye características adicionales no mencionadas (por ejemplo, en el caso de un oligómero antisentido, la presencia de nucleobases adicionales no mencionadas).
En realizaciones de cualquiera de las composiciones y procedimientos proporcionados en esta invención, "que comprende" puede reemplazarse por "que consiste esencialmente en" o "que consiste en". La frase "que consiste esencialmente en" se usa en esta invención para requerir la característica o características especificadas (por ejemplo, secuencia de nucleobase) así como aquellas que no afectan materialmente el carácter o función de la invención reivindicada. Como se usa en esta invención, la expresión "que consiste" se usa para indicar la presencia de la característica mencionada (por ejemplo, secuencia de nucleobase) sola (de modo que en el caso de un oligómero antisentido que consiste en una secuencia de nucleobase especificada, se excluye la presencia de nucleobases adicionales no mencionadas).
En las realizaciones, la región dirigida está en un intrón retenido que es el segundo intrón más abundante en un RIC pre-mRNA que codifica la proteína SCN1A. Por ejemplo, el segundo intrón retenido más abundante puede ser el intrón dirigido en lugar del intrón retenido más abundante debido a la singularidad de la secuencia de nucleótidos del segundo intrón retenido más abundante, la facilidad del diseño de ASO para dirigirse a una secuencia de nucleótidos particular y/o la cantidad de aumento en la producción de proteínas resultante del direccionamiento al intrón con un ASO. En las realizaciones, el intrón retenido es el segundo intrón más abundante en una población de RIC premRNA transcritos del gen que codifica la proteína diana en una célula, donde la población de RIC pre-mRNA comprende dos o más intrones retenidos. En las realizaciones, un oligómero antisentido dirigido al segundo intrón más abundante en la población de RIC pre-mRNA que codifican la proteína diana induce el splicing de dos o más intrones retenidos en la población, incluido el intrón retenido al que se dirige o se une el oligómero antisentido. En las realizaciones, se produce de ese modo ARN de splicing completo (maduro) que codifica la proteína diana.
En las realizaciones, un ASO es complementario a una región dirigida que está dentro de un intrón no retenido en un RIC pre-mRNA. En las realizaciones, la porción dirigida del RIC pre-ARNm está dentro de: la región 6 a 100 en relación con el sitio de splicing 5' del intrón no retenido; o la región -16 a -100 en relación con el sitio de splicing 3' del intrón no retenido. En algunas realizaciones, la porción dirigida del RIC pre-mRNA está dentro de la región 100 en relación con el sitio de splicing 5' del intrón no retenido a -100 en relación con el sitio de splicing 3' del intrón no retenido. Como se usa para identificar la ubicación de una región o secuencia, se entiende que "dentro" incluye los residuos en las posiciones enumeradas. Por ejemplo, una región 6 a 100 incluye los residuos en las posiciones 6 y 100. En las realizaciones, se produce de ese modo ARN de splicing completo (maduro) que codifica la proteína diana.
En las realizaciones, el intrón retenido del RIC pre-mRNA es un intrón de splicing ineficiente. Como se usa en esta invención, "de splicing ineficiente" puede referirse a una frecuencia relativamente baja de splicing en un sitio de splicing adyacente al intrón retenido (sitio de splicing 5' o sitio de splicing 3') en comparación con la frecuencia de splicing en otro sitio de splicing en el RIC pre-mRNA. La expresión "de splicing ineficiente" también puede referirse a la velocidad relativa o cinética de splicing en un sitio de splicing, en el que un intrón "de splicing ineficiente" puede experimentar splicing o eliminarse a una velocidad más lenta en comparación con otro intrón en un RIC pre-mRNA.
En las realizaciones, la secuencia de 9 nucleótidos en -3e a -1e del exón que flanquea el sitio de splicing 5' y 1 a 6 del intrón retenido es idéntica a la secuencia de tipo silvestre correspondiente. En las realizaciones, la secuencia de 16 nucleótidos en -15 a -1 del intrón retenido y 1e del exón que flanquea el sitio de splicing 3' es idéntica a la secuencia de tipo silvestre correspondiente. Como se usa en esta invención, la "secuencia de tipo silvestre" se refiere a la secuencia de nucleótidos para SYNGAP1 o SCN1A en el genoma de referencia publicado depositado en el depósito NCBI de información biológica y científica (operado por el National Center for Biotechnology Information ( Centro Nacional de Información Biotecnológica)), Biblioteca Nacional de Medicina, 8600 Rockville Pike, Bethesda, MD, EE.UU. 20894). Una posición de nucleótido indicada con una "e", también utilizada en esta invención, indica que el nucleótido está presente en la secuencia de un exón (por ejemplo, el exón que flanquea el sitio de splicing 5' o el exón que flanquea el sitio de splicing 3'). Como se usa en esta invención, la "secuencia de tipo silvestre" se refiere a la secuencia canónica disponible en NCBI Gene ID 8831 para SYNGAP y NCBI GENE ID 6323 para SCN1A.
Los procedimientos implican poner en contacto las células con un ASO que es complementario a una porción de un pre-mRNA que codifica la proteína SYNGAP1 o SCN1A, lo que da como resultado una mayor expresión de SYNGAP1 o SCN1A. Como se usa en esta invención, "poner en contacto" o administrar a células se refiere a cualquier procedimiento para proporcionar un ASO en proximidad inmediata con las células de manera que el ASO y las células interactúen. Una célula que se pone en contacto con un ASO tomará o transportará el ASO a la célula. El procedimiento implica poner en contacto una célula asociada a la afección o enfermedad o relevante para la afección o enfermedad con cualquiera de los ASO descritos en esta invención. En algunas realizaciones, el ASO puede modificarse adicionalmente o unirse (por ejemplo, unirse covalentemente) a otra molécula para dirigir el ASO a un tipo celular, mejorar el contacto entre el ASO y la célula asociada a la afección o enfermedad o relevante para la afección o enfermedad, o mejorar la captación del ASO.
Como se usa en esta invención, la expresión "aumentar la producción de proteínas" o "aumentar la expresión de una proteína diana" significa aumentar la cantidad de proteína que se traduce de un mRNA en una célula. Una "proteína diana" puede ser cualquier proteína para la cual se desea una expresión/producción aumentada.
Poner en contacto una célula que expresa un RIC pre-mRNA de SYNGAP1 o SCN1A con un ASO que es complementario a una porción dirigida del transcrito de RIC pre-mRNA de SYNGAP1 o SCN1A puede resultar en un aumento medible en la cantidad de la proteína SYNGAP1 o SCN1A (por ejemplo, una proteína diana) codificada por el pre-mRNA. Los procedimientos para medir o detectar la producción de una proteína serán evidentes para un experto en la materia e incluyen cualquier procedimiento conocido, por ejemplo, Western blotting, citometría de flujo, microscopía de inmunofluorescencia y ELISA.
Poner en contacto las células con un ASO que es complementario a una porción dirigida de un transcrito de RIC premRNA de SYNGAP1 o SCN1A puede resultar en un aumento en la cantidad de proteína SYNGAP1 o Sc N1A producida en al menos el 10, 20, 30, 40, 50, 60 , 80, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500 o el 1000 %, en comparación con la cantidad de proteína producida por una célula en ausencia del ASO/ausencia de tratamiento. La cantidad total de proteína SYNGAP1 o SCN1A producida por la célula con la que se puso en contacto el oligómero antisentido puede aumentarse de aproximadamente 1,1 a aproximadamente 10 veces, de aproximadamente 1,5 a aproximadamente 10 veces, de aproximadamente 2 a aproximadamente 10 veces, de aproximadamente 3 a aproximadamente 10 veces, de aproximadamente 4 a aproximadamente 10 veces, de aproximadamente 1,1 a aproximadamente 5 veces, de aproximadamente 1,1 a aproximadamente 6 veces, de aproximadamente 1,1 a aproximadamente 7 veces, de aproximadamente 1,1 a aproximadamente 8 veces, de aproximadamente 1,1 a aproximadamente 9 veces, de aproximadamente 2 a aproximadamente 5 veces, de aproximadamente 2 a aproximadamente 6 veces, de aproximadamente 2 a aproximadamente 7 veces, de aproximadamente 2 a aproximadamente 8 veces, de aproximadamente 2 a aproximadamente 9 veces, de aproximadamente 3 a aproximadamente 6 veces, de aproximadamente 3 a aproximadamente 7 veces, de aproximadamente 3 a aproximadamente 8 veces, de aproximadamente 3 a aproximadamente 9 veces, de aproximadamente 4 a aproximadamente 7 veces, de aproximadamente 4 a aproximadamente 8 veces, de aproximadamente 4 a aproximadamente 9 veces, al menos aproximadamente 1,1 veces, al menos aproximadamente 1,5 veces, al menos aproximadamente 2 veces, al menos aproximadamente 2,5 veces, al menos aproximadamente 3 veces, al menos aproximadamente 3,5 veces, al menos aproximadamente 4 veces, al menos aproximadamente 5 veces o al menos aproximadamente 10 veces, en comparación con la cantidad de proteína diana producida por un compuesto de control. Un compuesto de control puede ser, por ejemplo, un oligonucleótido que no es complementario a la porción dirigida del RIC pre-mRNA.
Poner en contacto las células con un ASO que es complementario a una porción dirigida de un transcrito de RIC pre-mRNA de SYNGAP1 o SCN1A puede resultar en un aumento en la cantidad de mRNA que codifica SYNGAP 1 o SCN1A, incluido el mRNA maduro que codifica la proteína diana. La cantidad de mRNA que codifica la proteína SYNGAP1 o SCN1A, o el mRNA maduro que codifica la proteína SYNGAP1 o SCN1A, puede aumentarse en al menos el 10, 20, 30, 40, 50, 60, 80, 100, 150, 200, 250, 300. , 350, 400, 450, 500 o 1000 %, en comparación con la cantidad de proteína producida por una célula en ausencia del ASO/ausencia de tratamiento. La cantidad total de mRNA que codifica la proteína SYNGAP1 o SCN1A, o el mRNA maduro que codifica la proteína SYNGAP1 o SCN1A producida en la célula con la que se puso en contacto el oligómero antisentido puede aumentarse de a aproximadamente 10 veces, de aproximadamente 1,5 a aproximadamente 10 veces, de aproximadamente 10 veces, de aproximadamente 3 a aproximadamente 10 veces, de aproximadamente 10 veces, de aproximadamente 1,1 a aproximadamente 5 veces, de a aproximadamente 6 veces, de aproximadamente 1,1 a aproximadamente 7 veces, de
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a aproximadamente 8 veces, de aproximadamente 1,1 a aproximadamente 9 veces, de
aproximadamente 2 a aproximadamente 5 veces, de aproximadamente 2 a aproximadamente 6 veces, de aproximadamente 2 a aproximadamente 7 veces, de aproximadamente 2 a aproximadamente 8 veces, de 2 a aproximadamente 9 veces, de aproximadamente 3 a aproximadamente 6 veces, de 3 a aproximadamente 7 veces, de aproximadamente 3 a aproximadamente 8 veces, de aproximadamente 3 a aproximadamente 9 veces, de aproximadamente 4 a aproximadamente 7 veces, de aproximadamente 4 a aproximadamente 8 veces, de aproximadamente 4 a aproximadamente 9 veces, al menos aproximadamente 1,1 veces, al menos aproximadamente 1,5 veces, al menos aproximadamente 2 veces, al menos aproximadamente 2,5 veces, al menos aproximadamente 3 veces, al menos aproximadamente 3,5 veces, al menos aproximadamente 4 veces, al menos aproximadamente 5 veces o al menos aproximadamente 10 veces, en comparación con la cantidad de ARN maduro producido en una célula no tratada, por ejemplo, una célula no tratada o una célula tratada con un compuesto de control. Un compuesto de control puede ser, por ejemplo, un oligonucleótido que no es complementario a la porción dirigida del RIC pre-mRNA de SYNGAP1 o SCN1A.
Splicing constitutivo de un intrón retenido a partir de un RIC pre-mRNA
Los procedimientos y las composiciones de oligonucleótidos antisentido en esta invención son útiles para aumentar la expresión de la proteína SYNGAP1 o SCN1A en las células, por ejemplo, en un sujeto que tiene retraso mental AD 5 o síndrome de Dravet causado por una deficiencia en la cantidad o actividad de la proteína SYNGAP 1 o SCN1A, aumentando el nivel de mRNA que codifica la proteína SYNGAP1 o SCN1A, o el mRNA maduro que codifica la proteína SYNGAP1 o SCN1A. En particular, los procedimientos y composiciones como se describen en esta invención inducen el splicing constitutivo de un intrón retenido de un transcrito de RIC pre-mRNA de SYNGAP1 o SCN1A que codifica la proteína SYNGAP1 o SCN1A, aumentando así el nivel de mRNA que codifica la proteína SYNGAP1 o SCN1A, o el mRNA maduro que codifica la proteína SYNGAP1 o SCN1A y aumentando la expresión de la proteína SYNGAP 1 o SCN1A.
El splicing constitutivo de un intrón retenido de un RIC pre-mRNA elimina correctamente el intrón retenido del RIC pre-mRNA, donde el intrón retenido tiene secuencias de splicing de tipo silvestre. El splicing constitutivo, como se usa en esta invención, no incluye el splicing de un intrón retenido de un RIC pre-mRNA transcrito de un gen o alelo que tiene una mutación que causa un splicing alternativo o un splicing aberrante de un pre-mRNA transcrito del gen o alelo. Por ejemplo, el splicing constitutivo de un intrón retenido, como se induce usando los procedimientos y oligonucleótidos antisentido en esta invención, no corrige el splicing aberrante ni influye en el splicing alternativo de un pre-mRNA para dar como resultado una expresión aumentada de una proteína diana o ARN funcional.
En las realizaciones, el splicing constitutivo elimina correctamente un intrón retenido de un RIC pre-mRNA de SCN1A, donde el RIC pre-mRNA de SCN1A se transcribe a partir de un gen o alelo de tipo silvestre, o un gen o alelo polimórfico, que codifica una proteína diana completamente funcional o ARN funcional, y donde el gen o alelo no tiene una mutación que provoque un splicing alternativo o un splicing aberrante del intrón retenido.
En algunas realizaciones, el splicing constitutivo de un intrón retenido de un RIC pre-mRNA de SCN1A que codifica la proteína SCN1A elimina correctamente un intrón retenido de un RIC pre-mRNA de SCN1A que codifica la proteína SCN1A, donde el RIC pre-mRNA de SCN1A se transcribe a partir de un gen o alelo a partir del cual el gen diana o el ARN funcional se produce a un nivel reducido en comparación con la producción a partir de un alelo de tipo silvestre, y donde el gen o alelo no tienen una mutación que provoque un splicing alternativo o un splicing aberrante del intrón retenido. En estas realizaciones, la eliminación correcta del intrón retenido de splicing constitutivo da como resultado la producción de proteína diana o ARN funcional que es funcional cuando se compara con una proteína de tipo silvestre o ARN funcional equivalente.
En otras realizaciones, el splicing constitutivo elimina correctamente un intrón retenido de un RIC pre-mRNA de SCN1A, donde el RIC pre-mRNA de SCN1A se transcribe a partir de un gen o alelo que codifica una proteína diana o ARN funcional producido en una forma que tiene una función reducida en comparación con una proteína de tipo silvestre equivalente o ARN funcional, y donde el gen o alelo no tienen una mutación que provoque un splicing alternativo o un splicing aberrante del intrón retenido. En estas realizaciones, la eliminación correcta del intrón retenido de splicing constitutivo da como resultado la producción de proteína diana parcialmente funcional , o ARN funcional que es parcialmente funcional cuando se compara con una proteína de tipo silvestre o ARN funcional equivalente.
La "eliminación correcta" del intrón retenido por splicing constitutivo se refiere a la eliminación del intrón completo, sin eliminar ninguna parte de un exón.
En las realizaciones, un oligómero antisentido como se describe en esta invención o se usa en cualquier procedimiento descrito en esta invención no aumenta la cantidad de mRNA que codifica la proteína SCN1A o la cantidad de proteína SCN1A modulando el splicing alternativo o el splicing aberrante de un pre-mRNA transcrito de SCNIA.La modulación de splicing alternativo o splicing aberrante se puede medir usando cualquier procedimiento conocido para analizar la secuencia y longitud de especies de ARN, por ejemplo, mediante RT-PCR y usando procedimientos descritos en otra parte en esta invención y en la bibliografía. En las realizaciones, la modulación del splicing alternativo o aberrante se determina basándose en un aumento o disminución en la cantidad de especies de interés sometidas a splicing de al menos un 10 % o 1,1 veces. En las realizaciones, la modulación se determina basándose en un aumento o disminución a un nivel que es al menos del 10 % al 100 % o de 1,1 a 10 veces, como se describe en esta invención con respecto a la determinación de un aumento en el mRNA que codifica la proteína SCN1A en los procedimientos.
El procedimiento puede ser un procedimiento donde el RIC pre-mRNA de SYNGAP1 o SCN1A se produjo mediante splicing parcial de un pre-mRNA de SYNGAP1 o SCN1A de tipo silvestre. El procedimiento puede ser un procedimiento donde el RIC pre-mRNA de SYNGAP1 o SCN1A se produjo mediante splicing parcial de un premRNA de SYNGAP1 o SCN1A de tipo silvestre de longitud completa. El RiC pre-mRNA de SYNGAP1 o SCN1A puede producirse mediante splicing parcial de un pre-mRNA de SYNGAP1 o SCN1A de longitud completa. En estos casos, un pre-mRNA de SYNGAP1 o SCN1A de longitud completa puede tener un polimorfismo en un sitio de splicing del intrón retenido que no afecta el splicing correcto del intrón retenido en comparación con el splicing del intrón retenido que tiene la secuencia del sitio de splicing de tipo silvestre.
En las realizaciones, el mRNA que codifica la proteína SCN1A es un mRNA maduro de longitud completa o un mRNA maduro de tipo silvestre. En estas realizaciones, un mRNA maduro de longitud completa puede tener un polimorfismo que no afecta la actividad de la proteína diana o el ARN funcional codificado por el mRNA maduro, en comparación con la actividad de la proteína SCN1A codificada por el mRNA maduro de tipo silvestre.
üligómeros antisentido
Un aspecto de la presente descripción es una composición que comprende oligómeros antisentido que mejora el splicing uniéndose a una porción dirigida de un RIC pre-mRNA de SYNGAP1 (no reivindicado) o SCN1A. Como se usa en esta invención, los términos "ASO" y "oligómero antisentido" se usan indistintamente y se refieren a un oligómero como un polinucleótido, que comprende nucleobases que se hibridan con una secuencia de ácidos nucleicos diana (por ejemplo, un RiC pre-mRNA de SYNGAP1 o SCN1A por emparejamiento de bases Watson-Crick o emparejamiento de bases oscilantes (GU). El ASO puede tener una secuencia exacta complementaria a la secuencia diana o una complementariedad cercana (por ejemplo, una complementariedad suficiente para unir la secuencia diana y mejorar el splicing en un sitio de splicing). Los ASO se diseñan para que se unan (hibriden) a un ácido nucleico diana (por ejemplo, una porción dirigida de un transcrito de pre-mRNA) y permanezcan hibridados en condiciones fisiológicas. Típicamente, si se hibridan con un sitio distinto de la secuencia de ácido nucleico pretendida (dirigida), se hibridan con un número limitado de secuencias que no son un ácido nucleico diana (con unos pocos sitios distintos de un ácido nucleico diana). El diseño de un ASO puede tener en cuenta la aparición de la secuencia de ácido nucleico de la porción dirigida del transcrito de pre-mRNA o una secuencia de ácido nucleico suficientemente similar en otras ubicaciones en el genoma o pre-mRNA o transcriptoma celular, de modo que la probabilidad de que el ASO se una a otros sitios y cause efectos "fuera del objetivo" es limitada. Cualquier oligómero antisentido conocido en la técnica, por ejemplo, en la Solicitud PCT n.° PCT/US2014/054151, publicada como el documento WO 2015/035091, titulado "Reducing Nonsense-Mediated mRNA Decay,", se puede usar para poner en práctica los procedimientos descritos en esta invención.
En algunas realizaciones, los ASO "se hibridan específicamente" o son "específicos" de un ácido nucleico diana o una porción dirigida de un RIC pre-mRNA. Típicamente, dicha hibridación se produce con una Tm sustancialmente superior a 37 °C, preferentemente al menos 50 °C, y típicamente de entre 60 °C a aproximadamente 90 °C. Dicha hibridación corresponde preferentemente a condiciones de hibridación rigurosas. A una fuerza iónica y un pH dados, la Tm es la temperatura a la cual el 50 % de una secuencia diana se hibrida con un polinucleótido complementario.
Los oligómeros, como los oligonucleótidos, son "complementarios" entre sí cuando se produce la hibridación en una configuración antiparalela entre dos polinucleótidos monocatenarios. Un polinucleótido bicatenario puede ser "complementario" de otro polinucleótido, si puede producirse la hibridación entre una de las hebras del primer polinucleótido y el segundo. La complementariedad (el grado en que un polinucleótido es complementario con otro) es cuantificable en términos de la proporción (por ejemplo, el porcentaje) de bases en hebras opuestas que se espera que formen enlaces de hidrógeno entre sí, según las reglas de emparejamiento de bases generalmente aceptadas. La secuencia de un oligómero antisentido (ASO) no necesita ser el 100 % complementaria a la de su ácido nucleico diana para hibridar. En determinadas realizaciones, los ASO pueden comprender al menos el 70 %, al menos el 75 %, al menos el 80 %, al menos el 85 %, al menos el 90 %, al menos el 95 %, al menos el 96 %, al menos el 97 %, al menos el 98 % o al menos el 99 % de complementariedad de secuencia con una región diana dentro de la secuencia de ácido nucleico diana a la que se dirigen. Por ejemplo, un ASO en el que 18 de las 20 nucleobases del compuesto antisentido son complementarias a una región diana y, por lo tanto, hibridarían específicamente, representaría el 90 por ciento de complementariedad. En este ejemplo, las nucleobases no complementarias restantes pueden agruparse o intercalarse con nucleobases complementarias y no necesitan ser contiguas entre sí o a nucleobases complementarias. El porcentaje de complementariedad de un ASO con una región de un ácido nucleico diana se puede determinar de forma habitual con programas BLAST (herramientas de búsqueda de alineación local básica) y programas PowerBLAST conocidos en la técnica (Altschul y col., J. Mol. Biol., 1990, 215, 403-410; Zhang y Madden, Genome Res., 1997, 7, 649-656).
Un ASO no necesita hibridar con todas las nucleobases en una secuencia diana y las nucleobases con las que hibrida pueden ser contiguas o no contiguas. Los ASO puede hibridarse sobre uno o más segmentos de un transcrito de pre-mRNA, de modo que segmentos intermedios o adyacentes no estén implicados en el evento de hibridación (por ejemplo, se puede formar una estructura en bucle o una estructura de horquilla). En determinadas realizaciones, un ASO se hibrida con nucleobases no contiguas en un transcrito de pre-mRNA diana. Por ejemplo, un ASO puede hibridar con nucleobases en un transcrito de pre-mRNA que están separados por una o más nucleobase(s) con las que el ASO no hibrida.
Los ASO descritos en esta invención comprenden nucleobases que son complementarias a las nucleobases presentes en una porción diana de un RIC pre-mRNA. El término ASO incluye oligonucleótidos y cualquier otra molécula oligomérica que comprenda nucleobases capaces de hibridar con una nucleobase complementaria en un mRNA diana, pero no comprenda un resto de azúcar, tal como un ácido nucleico peptídico (PNA). Los ASO pueden comprender nucleótidos naturales, análogos de nucleótidos, nucleótidos modificados o cualquier combinación de dos o tres de los anteriores. El término "nucleótidos naturales" incluye desoxirribonucleótidos y ribonucleótidos. El término "nucleótidos modificados" incluye nucleótidos con grupos de azúcar modificados o sustituidos y/o que tienen una cadena principal modificada. En algunas realizaciones, todos los nucleótidos del ASO son nucleótidos modificados. Las modificaciones químicas de los ASO o los componentes de los ASO que son compatibles con los procedimientos y composiciones descritos en esta invención serán evidentes para un experto en la materia y se pueden encontrar, por ejemplo, en la Patente de EE. UU. n.° 8.258.109 B2, la Patente de Ee . UU. n.° 5.656.612, la Publicación de Patente de EE. UU. n.° 2012/0190728 y Dias y Stein, Mol. Cancer Ther. 2002, 347-355.
La nucleobase de un ASO puede ser cualquier nucleobase natural no modificada, como adenina, guanina, citosina, timina y uracilo, o cualquier nucleobase sintética o modificada que sea lo suficientemente similar a una nucleobase no modificada de modo que sea capaz de formar enlaces de hidrógeno con una nucleobase presente en un premRNA diana. Los ejemplos de nucleobases modificadas incluyen, sin limitación, hipoxantina, xantina, 7-metilguanina, 5, 6-dihidrouracilo, 5-metilcitosina y 5-hidroximetoilcitosina.
Los ASO descritos en esta invención también comprenden una estructura principal que conecta los componentes de un oligómero. La expresión "estructura principal" y "enlaces oligoméricos" se pueden usar indistintamente y se refieren a la conexión entre los monómeros del ASO. En los oligonucleótidos naturales, la cadena principal comprende un enlace fosfodiéster 3'-5 'que conecta restos de azúcar del oligómero. La estructura principal o los enlaces oligoméricos de los ASO descritos en esta invención pueden incluir (pero no se limitan a) fosforotioato, fosforoditioato, fosforoselenoato, fosforodiselenoato, fosforoanilotioato, fosforaniladato, fosforamidato y similares. Véase, por ejemplo, LaPlanche, y col., Nucleic Acids Res. 14:9081 (1986); Stec y col., J. Am. Chem. Soc. 106:6077 (1984),Stein y col., Nucleic Acids Res. 16:3209 (1988),Zon, y col., Anti Cancer Drug Design 6:539 (1991); Zon, y col., Oligonucleotides and Analogues: A Practical Approach, págs. 87-108 (F. Eckstein, Ed., Oxford University Press, Oxford Inglaterra (1991)); Stec, y col., la Patente de EE.UU. n.° 5.151.510; Uhlmann y Peyman, Chemical Reviews 90:543 (1990). En algunas realizaciones, la estructura principal del ASO no contiene fósforo sino que contiene enlaces peptídicos, por ejemplo, en un ácido nucleico peptídico (PNA), o grupos de enlace que incluyen carbamato, amidas y grupos hidrocarbonados lineales y cíclicos. En algunas realizaciones, la modificación de la cadena principal es un enlace fosfotioato. En algunas realizaciones, la modificación de la cadena principal es un enlace fosforamidato.
En las realizaciones, la estereoquímica en cada uno de los enlaces internucleotídicos de fósforo de la cadena principal de ASO es aleatoria. En las realizaciones, la estereoquímica en cada uno de los enlaces internucleotídicos de fósforo de la cadena principal de ASO está controlada y no es aleatoria. Por ejemplo, la Pub de Solic. de Patente de EE.UU. n.° 2014/0194610, "Methods for the Synthesis of Functionalized Nucleic Acids", describe procedimientos para seleccionar independientemente la destreza de la quiralidad en cada átomo de fósforo en un oligómero de ácido nucleico. En las realizaciones, un ASO usado en los procedimientos de la invención, que incluye, pero no se limita a, cualquiera de los ASO establecidos en esta invención en la Tabla 1, comprende un ASO que tiene enlaces internucleotídicos de fósforo que no son aleatorios. En las realizaciones, una composición usada en los procedimientos de la invención comprende un ASO diastereomérico puro. En las realizaciones, una composición utilizada en los procedimientos de la invención comprende un ASO que tiene una pureza diastereomérica de al menos aproximadamente el 90 %, al menos aproximadamente el 91 %, al menos aproximadamente el 92 %, al menos aproximadamente el 93 %, al menos aproximadamente el 94 %, al menos aproximadamente el 95 %, al menos aproximadamente el 96 %, al menos aproximadamente el 97 %, al menos aproximadamente el 98 %, al menos aproximadamente el 99 %, aproximadamente el 100 %, de aproximadamente el 90 % a aproximadamente el 100 %, de aproximadamente el 91 % a aproximadamente el 100 %, de aproximadamente el 92 % a aproximadamente el 100 %, de aproximadamente el 93 % a aproximadamente el 100 %, de aproximadamente el 94 % a aproximadamente el 100 %, de aproximadamente el 95 % a aproximadamente el 100 %, de aproximadamente el 96 % a aproximadamente el 100 %, de aproximadamente el 97 % a aproximadamente el 100 %, de aproximadamente el 98 % a aproximadamente el 100% o de aproximadamente el 99 % a aproximadamente el 100 %.
En las realizaciones, el ASO tiene una mezcla no aleatoria de configuraciones Rp y Sp en sus enlaces internucleotídicos de fósforo. Por ejemplo, se ha sugerido que se requiere una mezcla de Rp y Sp en oligonucleótidos antisentido para lograr un equilibrio entre buena actividad y estabilidad de nucleasa (Wan, y col., 2014, "Synthesis, biophysical properties and biological activity of second generation antisense oligonucleotides containing chiral phosphorothioate linkages" ("Síntesis, propiedades biofísicas y actividad biológica de los oligonucleótidos antisentido de segunda generación que contienen enlaces fosforotioato quirales"), Nucleic Acids Research 42(22): 13456-13468). En las realizaciones, un ASO usado en los procedimientos de la invención, que incluye, pero no se limita a, cualquiera de los ASO establecidos en esta invención en la Tabla 1, comprende aproximadamente el 5-100 % de Rp, al menos aproximadamente el 5 % de Rp, al menos aproximadamente el 10 % de Rp, al menos aproximadamente el 15 % de Rp, al menos aproximadamente el 20 % de Rp, al menos aproximadamente el 25 % de Rp, al menos aproximadamente el 30 % de Rp, al menos aproximadamente el 35 % de Rp, al menos aproximadamente el 40 % de Rp, al menos aproximadamente el 45 % de Rp, al menos aproximadamente el 50 % de Rp, al menos aproximadamente el 55 % de Rp, al menos aproximadamente el 60 % de Rp, al menos aproximadamente el 65 % de Rp, al menos aproximadamente el 70 % de Rp, al menos aproximadamente el 75 % de Rp, al menos aproximadamente el 80 % de Rp, al menos aproximadamente el 85 % de Rp, al menos aproximadamente el 90 % de Rp o al menos aproximadamente el 95 % de Rp, con el resto de Sp, o aproximadamente el 100 % de Rp. En las realizaciones, un ASO usado en los procedimientos de la invención, que incluye, pero no se limita a, cualquiera de los ASO establecidos en esta invención en la Tabla 1, comprende aproximadamente del 10 % a aproximadamente el 100 % de Rp, de aproximadamente el 15 % a aproximadamente el 100 % de Rp, de aproximadamente el 20 % a aproximadamente el 100 % de Rp, de aproximadamente el 25 % a aproximadamente el 100 % de Rp, de aproximadamente el 30 % a aproximadamente el 100 % de Rp, de aproximadamente el 35 % a aproximadamente el 100 % de Rp, de aproximadamente el 40 % a aproximadamente el 100 % de Rp, de aproximadamente el 45 % a aproximadamente el 100 % de Rp, de aproximadamente el 50 % a aproximadamente el 100 % de Rp, de aproximadamente el 55 % a aproximadamente el 100 % de Rp, de aproximadamente el 60 % a aproximadamente el 100 % de Rp, de aproximadamente el 65 % a aproximadamente el 100 % de Rp, de aproximadamente el 70 % a aproximadamente el 100 % de Rp, de aproximadamente el 75 % a aproximadamente el 100 % de Rp, de aproximadamente el 80 % a aproximadamente el 100 % de Rp, de aproximadamente el 85 % a aproximadamente el 100 % de Rp, de aproximadamente el 90 % a aproximadamente el 100 % de Rp o de aproximadamente el 95 % a aproximadamente el 100 % de Rp, de aproximadamente el 20 % a aproximadamente el 80 % de Rp, de aproximadamente el 25 % a aproximadamente el 75 % de Rp, de aproximadamente el 30 % a aproximadamente el 70 % de Rp, de aproximadamente el 40 % a aproximadamente el 60 % de Rp o de aproximadamente el 45 % a aproximadamente el 55 % de Rp, con el resto de Sp.
En las realizaciones, un ASO usado en los procedimientos de la invención, que incluye, pero no se limita a, cualquiera de los ASO establecidos en esta invención en la Tabla 1, comprende aproximadamente el 5-100 % de Sp, al menos aproximadamente el 5 % de Sp, al menos aproximadamente el 10 % de Sp, al menos aproximadamente el 15 % de Sp, al menos aproximadamente el 20 % de Sp, al menos aproximadamente el 25 % de Sp, al menos aproximadamente el 30 % de Sp, al menos aproximadamente el 35 % de Sp, al menos aproximadamente el 40 % de Sp, al menos aproximadamente el 45 % de Sp, al menos aproximadamente el 50 % de Sp, al menos aproximadamente el 55 % de Sp, al menos aproximadamente el 60 % de Sp, al menos aproximadamente el 65 % de Sp, al menos aproximadamente el 70 % de Sp, al menos aproximadamente el 75 % de Sp, al menos aproximadamente el 80 % de Sp, al menos aproximadamente el 85 % de Sp, al menos aproximadamente el 90 % de Sp o al menos aproximadamente el 95 % de Sp, con el resto de Rp, o aproximadamente el 100 % de Sp. En las realizaciones, un ASO usado en los procedimientos de la invención, que incluye, pero no se limita a, cualquiera de los ASO establecidos en esta invención en la Tabla 1, comprende aproximadamente del 10 % a aproximadamente el 100 % de Sp, de aproximadamente el 15 % a aproximadamente el 100 % de Sp, de aproximadamente el 20 % a aproximadamente el 100 % de Sp, de aproximadamente el 25 % a aproximadamente el 100 % de Sp, de aproximadamente el 30 % a aproximadamente el 100 % de Sp, de aproximadamente el 35 % a aproximadamente el 100 % de Sp, de aproximadamente el 40 % a aproximadamente el 100 % de Sp, de aproximadamente el 45 % a aproximadamente el 100 % de Sp, de aproximadamente el 50 % a aproximadamente el 100 % de Sp, de aproximadamente el 55 % a aproximadamente el 100 % de Sp, de aproximadamente el 60 % a aproximadamente el 100 % de Sp, de aproximadamente el 65 % a aproximadamente el 100 % de Sp, de aproximadamente el 70 % a aproximadamente el 100 % de Sp, de aproximadamente el 75 % a aproximadamente el 100 % de Sp, de aproximadamente el 80 % a aproximadamente el 100 % de Sp, de aproximadamente el 85 % a aproximadamente el 100 % de Sp, de aproximadamente el 90 % a aproximadamente el 100 % de Sp o de aproximadamente el 95 % a aproximadamente el 100 % de Sp, de aproximadamente el 20 % a aproximadamente el 80 % de Sp, de aproximadamente el 25 % a aproximadamente el 75 % de Sp, de aproximadamente el 30 % a aproximadamente el 70 % de Sp, de aproximadamente el 40 % a aproximadamente el 60 % de Sp o de aproximadamente el 45 % a aproximadamente el 55 % de Sp, con el resto de Rp.
Cualquiera de los ASO descritos en esta invención puede contener un resto de azúcar que comprende ribosa o desoxirribosa, tal como está presente en los nucleótidos naturales, o un resto de azúcar modificado o análogo de azúcar, incluido un anillo de morfolina. Los ejemplos no limitantes de restos de azúcar modificados incluyen sustituciones 2' tales como 2'-O-metilo (2'-O-Me), 2'-O-metoxietilo (2'MOE), 2'-O-aminoetilo, 2'F; N3'->P5' fosforamidato, 2'dimetilaminooxietoxi, 2'dimetilaminoetoxietoxi, 2'-guanidinidio, etilo de 2'-O-guanidinio, azúcares modificados con carbamato y azúcares modificados bicíclicos. En algunas realizaciones, la modificación del resto de azúcar se selecciona de entre 2'-O-Me, 2'F y 2'MOE. En algunas realizaciones, la modificación del resto de azúcar es un enlace puente adicional, como en un ácido nucleico bloqueado (LNA). En algunas realizaciones, el análogo de azúcar contiene un anillo de morfolina, tal como fosforodiamidato morfolino (PMO). En algunas realizaciones, el resto de azúcar comprende una modificación de ribofuransilo o 2'desoxirribofuransilo. En algunas realizaciones, el resto de azúcar comprende modificaciones de 2'O-metiloxietilo (cMOE) restringidas en 2'4'. En algunas realizaciones, el resto de azúcar comprende modificaciones de BNA cEt, 2'-O etilo restringidas en 2', 4'. En algunas realizaciones, el resto de azúcar comprende modificaciones de tricicloDNA (tcDNA). En algunas realizaciones, el resto de azúcar comprende modificaciones de ácido etileno nucleico (ENA). En algunas realizaciones, el resto de azúcar comprende modificaciones de MCE. Se conocen modificaciones en la técnica y se describen en la bibliografía, por ejemplo, por Jarver, y col., 2014, "A Chemical View of Oligonucleotides for Exon Skipping and Related Drug Applications", Nucleic Acid Therapeutics 24(1): 37-47.
En algunos ejemplos, cada monómero del ASO se modifica de la misma manera, por ejemplo, cada enlace de la cadena principal del ASO comprende un enlace fosforotioato o cada resto de azúcar ribosa comprende una modificación 2'O-metilo. Tales modificaciones que están presentes en cada uno de los componentes monoméricos de un ASO se denominan "modificaciones uniformes". En algunos ejemplos, se puede desear una combinación de diferentes modificaciones, por ejemplo, un ASO puede comprender una combinación de enlaces fosforodiamidato y restos de azúcar que comprenden anillos de morfolina (morfolinos). Las combinaciones de diferentes modificaciones de un ASO se denominan "modificaciones mixtas" o "químicas mixtas".
En algunas realizaciones, el ASO comprende una o más modificaciones de la cadena principal. En algunas realizaciones, el ASO comprende una o más modificaciones de restos de azúcar. En algunas realizaciones, el ASO comprende una o más modificaciones de la cadena principal y una o más modificaciones de restos de azúcar. En algunas realizaciones, el ASO comprende modificaciones 2'MOE y una cadena principal de fosforotioato. En algunas realizaciones, el ASO comprende un fosforodiamidato morfolino (PMO). En algunas realizaciones, el ASO comprende un ácido nucleico peptídico (PNA). Cualquiera de los ASO o cualquier componente de un ASO (por ejemplo, una nucleobase, resto de azúcar, cadena principal) descritos en esta invención puede modificarse para lograr las propiedades o actividades deseadas del ASO o reducir las propiedades o actividades no deseadas del ASO. Por ejemplo, un ASO o uno o más componentes de cualquier ASO pueden modificarse para mejorar la afinidad de unión a una secuencia diana en un transcrito de pre-mRNA; reducir la unión a cualquier secuencia no diana; reducir la degradación por nucleasas celulares (es decir, RNasa H); mejorar la captación del ASO en una célula y/o en el núcleo de una célula; alterar la farmacocinética o la farmacodinamica del ASO; y modular la vida media del ASO.
En algunas realizaciones, los ASO están compuestos por nucleótidos modificados con 2'-O-(2-metoxietil) (MOE) fosforotioato. Los ASO compuestos por tales nucleótidos son especialmente adecuados para los procedimientos descritos en esta invención; se ha demostrado que los oligómeros que tienen tales modificaciones tienen una resistencia significativamente mejorada a la degradación por nucleasas y una mayor biodisponibilidad, haciéndolos adecuados, por ejemplo, para la administración oral en algunas realizaciones descritas en esta invención. Véase, por ejemplo, Geary y col., J Pharmacol Exp Ther. 2001; 296(3):890-7; Geary y col., J Pharmacol Exp Ther. 2001; 296(3):898-904.
Los expertos en la materia conocerán procedimientos para sintetizar ASO. Alternativamente o además, los ASO se pueden obtener de una fuente comercial.
A menos que se especifique lo contrario, el extremo izquierdo de las secuencias de ácido nucleico monocatenario (por ejemplo, transcripto de pre-mRNA, oligonucleótido, ASO, etc.) es el extremo 5' y la dirección izquierda de las secuencias de ácido nucleico monocatenario o bicatenario se denomina dirección 5'. De manera similar, el extremo o dirección derecha de una secuencia de ácido nucleico (monocatenario o bicatenario) es el extremo o dirección 3'. Generalmente, una región o secuencia que está en 5' con respecto a un punto de referencia en un ácido nucleico se denomina "aguas arriba", y una región o secuencia que está en 3' con respecto a un punto de referencia en un ácido nucleico se denomina "aguas abajo". Generalmente, la dirección o el extremo 5' de un mRNA es donde se ubica el codón de inicio o inicio, mientras que el extremo o la dirección 3' es donde se ubica el codón de terminación. En algunos aspectos, los nucleótidos que están aguas arriba de un punto de referencia en un ácido nucleico pueden designarse con un número negativo, mientras que los nucleótidos que están aguas abajo de un punto de referencia pueden designarse con un número positivo. Por ejemplo, un punto de referencia (por ejemplo, una unión exón-exón en el mRNA) se puede designar como el sitio "cero", y un nucleótido que está directamente adyacente y aguas arriba del punto de referencia se designa como "menos uno", por ejemplo, "-1,"mientras que un nucleótido que está directamente adyacente y aguas abajo del punto de referencia se designa "más uno" , por ejemplo, "+1."
En algunas realizaciones, los ASO son complementarios a (y se unen a) una porción dirigida de un RIC pre-mRNA de SCN1A que está aguas abajo (en la dirección 3') del sitio de splicing 5' del intrón retenido en un RIC pre-mRNA de SCN1A (por ejemplo, la dirección designada por números positivos en relación con el sitio de splicing 5') (FIG. 1). En algunas realizaciones, los ASO son complementarios a una porción dirigida del RIC pre-mRNA de SCN1A que está dentro de la región de aproximadamente 6 a aproximadamente 500 en relación con el sitio de splicing 5' del intrón retenido. En algunas realizaciones, el ASO no es complementario a los nucleótidos 1 a 5 en relación con el sitio de splicing 5' (los cinco primeros nucleótidos ubicados aguas abajo del sitio de splicing 5'). En algunas realizaciones, los ASO pueden ser complementarios a una porción dirigida de un RIC pre-mRNA de SCN1A que está dentro de la región entre los nucleótidos 6 y 496 en relación con el sitio de splicing 5' del intrón retenido. En algunos aspectos, los ASO son complementarios a una porción dirigida que está dentro de la región de aproximadamente 6 a aproximadamente 500, de aproximadamente 6 a aproximadamente 490, de aproximadamente 6 a aproximadamente 480, de aproximadamente 6 a aproximadamente 470, de aproximadamente 6 a aproximadamente 460, de aproximadamente 6 a aproximadamente 450, de aproximadamente 6 a aproximadamente 440, de aproximadamente 6 a aproximadamente 430, de aproximadamente 6 a aproximadamente 420, de aproximadamente 6 a aproximadamente 410, de aproximadamente 6 a aproximadamente 400, de aproximadamente 6 a aproximadamente 390, de aproximadamente 6 a aproximadamente 380, de aproximadamente 6 a aproximadamente 370, de aproximadamente 6 a aproximadamente 360, de aproximadamente 6 a aproximadamente 350, de aproximadamente 6 a aproximadamente 340, de aproximadamente 6 a aproximadamente 330, de aproximadamente 6 a aproximadamente 320, de aproximadamente 6 a aproximadamente 310, de aproximadamente 6 a aproximadamente 300, de aproximadamente 6 a aproximadamente 290, de aproximadamente 6 a aproximadamente 280, de aproximadamente 6 a aproximadamente 270, de aproximadamente 6 a aproximadamente 260, de aproximadamente 6 a aproximadamente 250, de aproximadamente 6 a aproximadamente 240, de aproximadamente 6 a aproximadamente 230, de aproximadamente 6 a aproximadamente 220, de aproximadamente 6 a aproximadamente 210, de aproximadamente 6 a aproximadamente 200, de aproximadamente 6 a aproximadamente 190, de aproximadamente 6 a aproximadamente 180, de aproximadamente 6 a aproximadamente 170, de aproximadamente 6 a aproximadamente 160, de aproximadamente 6 a aproximadamente 150, de aproximadamente 6 a aproximadamente 140, de aproximadamente 6 a aproximadamente 130, de aproximadamente 6 a aproximadamente 120, de aproximadamente 6 a aproximadamente 110, de aproximadamente 6 a aproximadamente 100, de aproximadamente 6 a aproximadamente 90, de aproximadamente 6 a aproximadamente 80, de aproximadamente 6 a aproximadamente 70, de aproximadamente 6 a aproximadamente 60, de aproximadamente 6 a aproximadamente 50, de aproximadamente 6 a aproximadamente 40, de aproximadamente 6 a aproximadamente 30 o de aproximadamente 6 a aproximadamente 20 en relación con el sitio de splicing 5' del intrón retenido.
En algunas realizaciones, los ASO son complementarios a una región dirigida de un RIC pre-mRNA de SCN1A que está aguas arriba (en la dirección 5') del sitio de splicing 3' del intrón retenido en un RIC pre-mRNA de SCN1A (por ejemplo, en la dirección designada por números negativos)) (FIG. 1). En algunas realizaciones, los ASO son complementarios a una porción dirigida del RIC pre-mRNA de SCN1A que está dentro de la región de aproximadamente -4e a aproximadamente -270e en relación con el sitio de splicing 5' del intrón retenido. En algunas realizaciones, el ASO no es complementario a los nucleótidos --1e a -3e en relación con el sitio de splicing 5' (los tres primeros nucleótidos ubicados aguas arriba del sitio de splicing 5'). En algunas realizaciones, los ASO pueden ser complementarios a una porción dirigida de un RIC pre-mRNA de SCN1A que está dentro de la región de entre los nucleótidos -4e y -264e en relación con el sitio de splicing 5' del intrón retenido. En algunos aspectos, los ASO son complementarios a una porción dirigida que está dentro de la región de aproximadamente -4e a aproximadamente -270e, de aproximadamente - 4e a aproximadamente -260e, de aproximadamente -4e a aproximadamente -250e, de aproximadamente -4e a aproximadamente -240e, de aproximadamente -4e a aproximadamente -230e, de aproximadamente -4e a aproximadamente -220e, de aproximadamente -4e a aproximadamente -210e, de aproximadamente -4e a aproximadamente -200e, de aproximadamente -4e a aproximadamente -190e, de aproximadamente -4e a aproximadamente -180e, de aproximadamente -4e a aproximadamente -170e, de aproximadamente -4e a aproximadamente -160e, de aproximadamente -4e a aproximadamente -150e, de aproximadamente -4e a aproximadamente -140e, de aproximadamente -4e a aproximadamente -130e, de aproximadamente -4e a aproximadamente -120e, de aproximadamente -4e a aproximadamente -110e, de aproximadamente -4e aproximadamente -100e, de aproximadamente -4e a aproximadamente -90e, de aproximadamente -4e a aproximadamente -80e, de aproximadamente -4e a aproximadamente -70e, de aproximadamente -4e a aproximadamente -60e, de aproximadamente -4e a aproximadamente -50e, de aproximadamente -4e a aproximadamente -40e, de aproximadamente -4e a aproximadamente -30e o de aproximadamente -4e a aproximadamente -20e en relación con el sitio de splicing 5' del intrón retenido.
En algunas realizaciones, los ASO son complementarios a una región dirigida de un RIC pre-mRNA de SCN1A que está aguas arriba (en la dirección 5') del sitio de splicing 3' del intrón retenido en un RIC pre-mRNA de SCN1A (por ejemplo, en la dirección designada por números negativos)) (FIG. 1). En algunas realizaciones, los ASO son complementarios a una porción dirigida del RIC pre-mRNA de SCN1A que está dentro de la región de aproximadamente -16 a aproximadamente -500 en relación con el sitio de splicing 3' del intrón retenido. En algunas realizaciones, el ASO no es complementario a los nucleótidos -1 a -15 en relación con el sitio de splicing 3' (los 15 primeros nucleótidos ubicados aguas arriba del sitio de splicing 3'). En algunas realizaciones, los ASO son complementarios a una porción dirigida del RIC pre-mRNA de SCN1A que está dentro de la región de -16 a -496 en relación con el sitio de splicing 3' del intrón retenido. En algunos aspectos, los ASO son complementarios a una porción dirigida que está dentro de la región de aproximadamente -16 a aproximadamente -500, de aproximadamente -16 a aproximadamente -490, de aproximadamente -16 a aproximadamente -480, de aproximadamente -16 a aproximadamente -470, de aproximadamente -16 a aproximadamente -460, de aproximadamente -16 a aproximadamente -450, de aproximadamente -16 a aproximadamente -440, de aproximadamente -16 a aproximadamente -430, de aproximadamente -16 a aproximadamente -420, de aproximadamente -16 a aproximadamente -410, de aproximadamente -16 a aproximadamente -400, de aproximadamente -16 a aproximadamente -390, de aproximadamente -16 a aproximadamente -380, de aproximadamente -16 a aproximadamente -370, de aproximadamente -16 a aproximadamente -360, de aproximadamente -16 a aproximadamente -350, de aproximadamente -16 a aproximadamente 340, de aproximadamente -16 a aproximadamente -330, de aproximadamente -16 a aproximadamente -320, de aproximadamente -16 a aproximadamente -310, de aproximadamente -16 a aproximadamente -300, de aproximadamente -16 a aproximadamente -290, de aproximadamente -16 a aproximadamente -280, de aproximadamente -16 a aproximadamente -270, de aproximadamente -16 a aproximadamente -260, de aproximadamente -16 a aproximadamente -250, de aproximadamente -16 a aproximadamente -240, de aproximadamente -16 a aproximadamente -230, de aproximadamente -16 a aproximadamente -220, de aproximadamente -16 a aproximadamente -210, de aproximadamente -16 a aproximadamente -200, de aproximadamente -16 a aproximadamente -190, de aproximadamente -16 a aproximadamente -180, de aproximadamente -16 a aproximadamente -170, de aproximadamente -16 a aproximadamente -160, de aproximadamente -16 a aproximadamente -150, de aproximadamente -16 a aproximadamente -140, de aproximadamente -16 a aproximadamente -130, de aproximadamente -16 a aproximadamente -120, de aproximadamente -16 a aproximadamente -110, de aproximadamente -16 a aproximadamente -100, de aproximadamente -16 a aproximadamente -90, de aproximadamente -16 a aproximadamente -80, de aproximadamente -16 a aproximadamente -70, de aproximadamente -16 a aproximadamente -60, de aproximadamente -16 a aproximadamente -50, de aproximadamente -16 a aproximadamente -40 o de aproximadamente -16 a aproximadamente -30 en relación con el sitio de splicing 3' del intrón retenido.
En algunas realizaciones, los ASO son complementarios a una región dirigida de un RIC pre-mRNA de SCN1A que está aguas arriba (en la dirección 5') del sitio de splicing 3' del intrón retenido en un RIC pre-mRNA de SCN1A (por ejemplo, en la dirección designada por números negativos)) (FIG. 1). En algunas realizaciones, los ASO son complementarios a una porción dirigida del RIC pre-mRNA de SCN1A que está dentro de la región de aproximadamente 2e a aproximadamente 40e en relación con el sitio de splicing 3' del intrón retenido. En algunas realizaciones, el ASO no es complementario a los nucleótidos 1e en relación con el sitio de splicing 3' (el primer nucleótido ubicado aguas abajo del sitio de splicing 3'). En algunas realizaciones, los ASO pueden ser complementarios a una porción dirigida de un RIC pre-mRNA de SCN1A que está dentro de la región de entre los nucleótidos 2e y 37e en relación con el sitio de splicing 3' del intrón retenido. En algunos aspectos, los ASO son complementarios a una porción dirigida que está dentro de la región de aproximadamente 2e a aproximadamente 40e, de aproximadamente 2e a aproximadamente 30e, de aproximadamente 2e a aproximadamente 20e o de aproximadamente 2e a aproximadamente 10e en relación con el sitio de splicing 3' del intrón retenido.
En las realizaciones, la porción dirigida del RIC pre-mRNA de SCN1A está dentro de la región 100 en relación con el sitio de splicing 5' del intrón retenido a -100 en relación con el sitio de splicing 3' del intrón retenido.
Los ASO pueden tener cualquier longitud adecuada para una unión específica y una mejora eficaz del splicing. En algunas realizaciones, los ASO consisten en de 8 a 50 nucleobases. Por ejemplo, el ASO puede tener 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 40, 45 o 50 nucleobases de longitud. En algunas realizaciones, los ASO consisten en más de 50 nucleobases. En algunas realizaciones, el ASO tiene de 8 a 50 nucleobases, de 8 a 40 nucleobases, de 8 a 35 nucleobases, de 8 a 30 nucleobases, de 8 a 25 nucleobases, de 8 a 20 nucleobases, de 8 a 15 nucleobases, de 9 a 50 nucleobases, de 9 a 40 nucleobases, de 9 a 35 nucleobases, de 9 a 30 nucleobases, de 9 a 25 nucleobases, de 9 a 20 nucleobases, de 9 a 15 nucleobases, de 10 a 50 nucleobases, de 10 a 40 nucleobases, de 10 a 35 nucleobases, de 10 a 30 nucleobases, de 10 a 25 nucleobases, de 10 a 20 nucleobases, de 10 a 15 nucleobases, de 11 a 50 nucleobases, de 11 a 40 nucleobases, de 11 a 35 nucleobases, de 11 a 30 nucleobases, de 11 a 25 nucleobases, de 11 a 20 nucleobases, de 11 a 15 nucleobases, de 12 a 50 nucleobases, de 12 a 40 nucleobases, de 12 a 35 nucleobases, de 12 a 30 nucleobases, de 12 a 25 nucleobases, de 12 a 20 nucleobases, de 12 a 15 nucleobases, de 13 a 50 nucleobases, de 13 a 40 nucleobases, de 13 a 35 nucleobases, de 13 a 30 nucleobases, de 13 a 25 nucleobases, de 13 a 20 nucleobases, de 14 a 50 nucleobases, de 14 a 40 nucleobases, de 14 a 35 nucleobases, de 14 a 30 nucleobases, de 14 a 25 nucleobases, de 14 a 20 nucleobases, de 15 a 50 nucleobases, de 15 a 40 nucleobases, de 15 a 35 nucleobases, de 15 a 30 nucleobases, de 15 a 25 nucleobases, de 15 a 20 nucleobases, de 20 a 50 nucleobases, de 20 a 40 nucleobases, de 20 a 35 nucleobases, de 20 a 30 nucleobases, de 20 a 25 nucleobases, de 25 a 50 nucleobases, de 25 a 40 nucleobases, de 25 a 35 nucleobases o de 25 a 30 nucleobases de longitud. En algunas realizaciones, los ASO tienen 18 nucleótidos de longitud. En algunas realizaciones, los ASO tienen 15 nucleótidos de longitud. En algunas realizaciones, los ASO tienen 25 nucleótidos de longitud.
En algunas realizaciones, se utilizan dos o más ASO con diferentes químicas, pero complementarias a la misma porción dirigida del RIC pre-mRNA. En algunas realizaciones, se utilizan dos o más ASO que son complementarios a diferentes porciones dirigidas del RIC pre-mRNA.
En las realizaciones, los oligonucleótidos antisentido de la invención se unen químicamente a uno o más restos o conjugados, por ejemplo, un resto de direccionamiento u otro conjugado que mejora la actividad o captación celular del oligonucleótido. Dichos restos incluyen, pero no se limitan a, un resto lipídico, por ejemplo, como un resto de colesterol, un resto de colesterilo, una cadena alifática, por ejemplo, residuos de dodecandiol o undecilo, una poliamina o una cadena de polietilenglicol, o ácido adamantano acético. En la bibliografía publicada se han descrito oligonucleótidos que comprenden restos lipofílicos y procedimientos de preparación. En las realizaciones, el oligonucleótido antisentido se conjuga con un resto que incluye, pero no se limita a, un nucleótido abásico, un poliéter, una poliamina, una poliamida, un péptido, un carbohidrato, por ejemplo, N-acetilgalactosamina (GalNAc), N-Ac-Glucosamina (GluNAc) o manosa (por ejemplo, manosa-6-fosfato), un lípido o un compuesto de polihidrocarburo. Los conjugados pueden unirse a uno o más de cualesquiera nucleótidos que comprenden el oligonucleótido antisentido en cualquiera de varias posiciones en el azúcar, base o grupo fosfato, como se entiende en la técnica y se describe en la bibliografía, por ejemplo, usando un enlazador. Los enlazadores pueden incluir un enlazador ramificado bivalente o trivalente. En las realizaciones, el conjugado se une al extremo 3' del oligonucleótido antisentido. Los procedimientos de preparación de conjugados de oligonucleótidos se describen, por ejemplo, en, la Patente de EE.UU. n.° 8.450.467, "Carbohydrate conjugates as delivery agents for oligonucleotides,".
En algunas realizaciones, el ácido nucleico al que se dirige un ASO es un RIC pre-mRNA de SCN1A expresado en una célula, tal como una célula eucariota. En algunas realizaciones, el término "célula" puede referirse a una población de células. En algunas realizaciones, la célula está en un sujeto. En algunas realizaciones, la célula se aísla de un sujeto. En algunas realizaciones, la célula está ex vivo. En algunas realizaciones, la célula es una célula o línea celular relevante para una afección o enfermedad. En algunas realizaciones, la célula está in vitro (por ejemplo, en cultivo celular).
Composiciones Farmacéuticas
Las composiciones o formulaciones farmacéuticas que comprenden el oligonucleótido antisentido de las composiciones descritas y para su uso en cualquiera de los procedimientos descritos pueden prepararse según técnicas convencionales bien conocidas en la industria farmacéutica y descritas en la bibliografía publicada. En las realizaciones, una composición o formulación farmacéutica para tratar a un sujeto comprende una cantidad efectiva de cualquier oligómero antisentido como se describió anteriormente, o una sal, solvato, hidrato o éster farmacéuticamente aceptable del mismo y un diluyente farmacéuticamente aceptable. El oligómero antisentido de una formulación farmacéutica puede comprender además un excipiente, diluyente o vehículo farmacéuticamente aceptable.
Las sales farmacéuticamente aceptables son adecuadas para su uso en contacto con los tejidos humanos y de animales inferiores sin producir toxicidad indebida, irritación, respuesta alérgica etc. y son proporcionales a una relación razonable de beneficio/riesgo. (Véase, por ejemplo, SM Berge y col., J. Pharmaceutical Sciences, 66: 1-19 (1977). Las sales se pueden preparar in situ durante el aislamiento final y la purificación de los compuestos o por separado haciendo reaccionar la función de base libre con un ácido orgánico adecuado. Los ejemplos de sales de adición de ácido no tóxicas, farmacéuticamente aceptables, son sales de un grupo amino formado por ácidos inorgánicos tales como ácido clorhídrico, ácido bromhídrico, ácido fosfórico, ácido sulfúrico y ácido perclórico o por ácidos orgánicos tales como ácido acético, ácido oxálico, ácido maleico, ácido tartárico, ácido cítrico, ácido succínico o ácido malónico o utilizando otras metodologías documentadas como el intercambio iónico. Otras sales farmacéuticamente aceptables incluyen adipato, alginato, ascorbato, aspartato, bencenosulfonato, benzoato, bisulfato, borato, butirato, alcanfor, alcanfor sulfonato, citrato, ciclopentanopropionato, digluconato, dodecilsulfato, etanosulfonato, formiato, fumarato, glucoheptonato, glicerofosfato, gluconato, hemisulfato, heptanoato, hexanoato, hidroyoduro, 2-hidroxi-etanosulfonato, lactobionato, lactato, laurato, lauril sulfato, malato, maleato, malonato, metanosulfonato, 2-naftalensulfonato, nicotinato, nitrato, oleato, oxalato, palmitato, pamoato, pectinato, persulfato, 3-fenilpropionato, fosfato, picrato, pivalato, propionato, estearato, succinato, sulfato, tartrato, tiocianato, ptoluensulfonato, undecanoato, sales de valerato y similares. Las sales representativas de metales alcalinos o alcalinotérreos incluyen sodio, litio, potasio, calcio, magnesio y similares. Otras sales farmacéuticamente aceptables incluyen, cuando sea apropiado, cationes de amonio no tóxico, amonio cuaternario y amina formados mediante contraiones tales como haluro, hidróxido, carboxilato, sulfato, fosfato, nitrato, alquil sulfonato inferior y arilsulfonato.
En las realizaciones, las composiciones se formulan en cualquiera de las muchas formas de dosificación posibles tales como, pero no se limitan a, comprimidos, cápsulas, cápsulas de gel, jarabes líquidos, geles blandos, supositorios y enemas. En las realizaciones, las composiciones se formulan como suspensiones en medios acuosos, no acuosos o mixtos. Las suspensiones acuosas pueden contener además sustancias que aumentan la viscosidad de la suspensión que incluyen, por ejemplo, carboximetilcelulosa sódica, sorbitol y/o dextrano. La suspensión también puede contener estabilizantes. En las realizaciones, una formulación o composición farmacéutica de la presente invención incluye, pero no se limita a, una solución, emulsión, microemulsión, espuma o formulación que contiene liposomas (por ejemplo, liposomas catiónicos o no catiónicos).
La composición o formulación farmacéutica de la presente invención puede comprender uno o más potenciadores de la penetración, vehículos, excipientes u otros ingredientes activos o inactivos según sea apropiado y bien conocido por los expertos en la materia o descritos en la bibliografía publicada. En las realizaciones, los liposomas también incluyen liposomas "estéricamente estabilizados", por ejemplo, liposomas que comprenden uno o más lípidos especializados. Estos lípidos especializados dan como resultado liposomas con una mayor vida útil de circulación. En las realizaciones, un liposoma estéricamente estabilizado comprende uno o más glucolípidos o se derivatiza con uno o más polímeros hidrófilos, tales como un resto de polietilenglicol (PEG). En las realizaciones, se incluye un tensioactivo en la formulación o composiciones farmacéuticas. El uso de tensioactivos en productos farmacéuticos, formulaciones y emulsiones es bien conocido en la técnica. En las realizaciones, la presente invención emplea un potenciador de la penetración para efectuar el suministro eficiente del oligonucleótido antisentido, por ejemplo, para ayudar a la difusión a través de las membranas celulares y/o mejorar la permeabilidad de un fármaco lipofílico. En las realizaciones, los potenciadores de la penetración son un tensioactivo, ácido graso, sal biliar, agente quelante o no tensioactivo no quelante.
En las realizaciones, la formulación farmacéutica comprende múltiples oligonucleótidos antisentido. En las realizaciones, el oligonucleótido antisentido se administra en combinación con otro fármaco o agente terapéutico.
Tratamiento de sujetos
Cualquiera de las composiciones proporcionadas en esta invención puede administrarse a un individuo. "Individuo" puede usarse indistintamente con "sujeto" o "paciente". Un individuo puede ser un mamífero, por ejemplo, un ser humano o un animal como un primate no humano, un roedor, un conejo, una rata, un ratón, un caballo, un burro, una cabra, un gato, un perro, una vaca, un cerdo o una oveja. En las realizaciones, el individuo es un ser humano. En las realizaciones, el individuo es un feto, un embrión o un niño. En otras realizaciones, el individuo puede ser otro organismo eucariota, como una planta. En algunas realizaciones, las composiciones proporcionadas en esta invención se administran a una célula ex vivo.
En algunas realizaciones, las composiciones proporcionadas en esta invención se administran a un individuo como un procedimiento para tratar una enfermedad o trastorno. En algunas realizaciones, el individuo tiene una enfermedad genética, como cualquiera de las enfermedades descritas en esta invención. En algunas realizaciones, el individuo corre el riesgo de tener la enfermedad, como cualquiera de las enfermedades descritas en esta invención. En algunas realizaciones, el individuo tiene un mayor riesgo de tener una enfermedad o trastorno causado por una cantidad insuficiente de una proteína o una actividad insuficiente de una proteína. Si un individuo tiene "un mayor riesgo" de tener una enfermedad o trastorno causado por una cantidad insuficiente de una proteína o una actividad insuficiente de una proteína, el procedimiento implica un tratamiento preventivo o profiláctico. Por ejemplo, un individuo puede tener un mayor riesgo de tener tal enfermedad o trastorno debido a los antecedentes familiares de la enfermedad. Típicamente, los individuos con un mayor riesgo de tener tal enfermedad o trastorno se benefician del tratamiento profiláctico (por ejemplo, previniendo o retrasando el inicio o la progresión de la enfermedad o trastorno). En las realizaciones, un feto se trata en el útero, por ejemplo, administrando la composición de ASO al feto directa o indirectamente (por ejemplo, a través de la madre).
Las vías adecuadas para la administración de los ASO de la presente invención pueden variar dependiendo del tipo celular al que se desee la administración de los ASO. Múltiples tejidos y órganos se ven afectados por el retraso mental AD 5 y el síndrome de Dravet, siendo el cerebro el tejido más significativamente afectado. Los ASO de la presente invención pueden administrarse a pacientes por vía parenteral, por ejemplo, mediante inyección intratecal, inyección intracerebroventricular, inyección intraperitoneal, inyección intramuscular, inyección subcutánea o inyección intravenosa.
En las realizaciones, el oligonucleótido antisentido se administra con uno o más agentes capaces de promover la penetración del oligonucleótido antisentido objeto a través de la barrera hematoencefálica mediante cualquier procedimiento conocido en la técnica. Por ejemplo, el suministro de agentes mediante la administración de un vector de adenovirus a neuronas motoras en tejido muscular se describe en la Patente de EE.UU. n.° 6.632.427, "Adenoviral-vector-mediated gene transfer into medullary motor neurons,". El suministro de vectores directamente al cerebro, por ejemplo, el cuerpo estriado, el tálamo, el hipocampo, o la sustancia negra se describe, por ejemplo, en la Patente de EE.UU. n.° 6.756.523, "Adenovirus vectors for the transfer of foreign genes into cells of the central nervous system particularly in brain,".
En las realizaciones, los oligonucleótidos antisentido se unen o conjugan con agentes que proporcionan propiedades farmacéuticas o farmacodinámicas deseables. En las realizaciones, el oligonucleótido antisentido se acopla a una sustancia, conocida en la técnica por promover la penetración o el transporte a través de la barrera hematoencefálica, por ejemplo, un anticuerpo contra el receptor de la transferrina. En las realizaciones, el oligonucleótido antisentido se une con un vector viral, por ejemplo, para hacer que el compuesto antisentido sea más eficaz o aumentar el transporte a través de la barrera hematoencefálica. En las realizaciones, la rotura osmótica de la barrera hematoencefálica es asistida por la infusión de azúcares, por ejemplo, mesoeritritol, xilitol, D(+) galactosa, D(+) lactosa, D(+) xilosa, dulcitol, mioinositol, L(-) fructosa, D(-) manitol, D(+) glucosa, D(+) arabinosa, D(-) arabinosa, celobiosa, D(+) maltosa, D+) rafinosa, L(+) ramnosa, D(+) melibiosa, D(-) ribosa, adonitol, D(+) arabitol, L(-) arabitol, D(+) fucosa, L(-) fucosa, D(-) lixosa, L(+) lixosa y L(-) lixosa, o aminoácidos, por ejemplo, glutamina, lisina, arginina, asparagina, ácido aspártico, cisteína, ácido glutámico, glicina, histidina, leucina, metionina, fenilalanina, prolina, serina, treonina, tirosina, valina y taurina. Los procedimientos y materiales para mejorar la penetración de la barrera hematoencefálica se describen, por ejemplo, en la Patente de EE.UU. n.° 9.193.969, "Compositions and methods for selective delivery of oligonucleotide molecules to specific neuron types," la Patente de EE.UU. n.° 4.866.042, "Method for the delivery of genetic material across the blood brain barrier," la Patente de EE.UU. n.° 6.294.520, "Material for passage through the blood-brain barrier" y la Patente de EE.UU. n.° 6.936.589, "Parenteral delivery systems,".
En las realizaciones, un ASO de la invención se acopla a un inhibidor de la recaptación de dopamina (DRI), un inhibidor selectivo de la recaptación de serotonina (ISRS), un inhibidor de la recaptación de noradrenalina (NRI), un inhibidor de la recaptación de norepinefrina-dopamina (NDRI) y un inhibidor de la recaptación de serotoninanorepinefrina-dopamina (SNDRI), usando procedimientos descritos en, por ejemplo, laPatente de EE.UU. n.° 9.193.969.
Los sujetos tratados usando los procedimientos y composiciones pueden evaluarse para mejorar su afección usando cualquier procedimiento conocido y descrito en la técnica.
Procedimientos de identificación de ASO adicionales que mejoran el splicing
También se describen en esta invención procedimientos para identificar (determinar) ASO adicionales que mejoran el splicing de un RIC pre-mRNA de SYNGAP1 o SCN1A, específicamente en el intrón diana. Los ASO que se hibridan específicamente con diferentes nucleótidos dentro de la región diana del pre-mRNA se pueden cribar para identificar (determinar) los ASO que mejoran la velocidad y/o grado de splicing del intrón diana. El ASO puede bloquear o interferir con el(los) sitio(s) de unión de un represor(es)/silenciador de splicing. Puede usarse cualquier procedimiento conocido en la técnica para identificar (determinar) un ASO que cuando se hibrida con la región diana del intrón da como resultado el efecto deseado (por ejemplo, splicing mejorado, producción de proteína o ARN funcional). Estos procedimientos también pueden usarse para identificar ASO que mejoran el splicing del intrón retenido al unirse a una región dirigida en un exón que flanquea el intrón retenido, o en un intrón no retenido. A continuación se proporciona un ejemplo de un procedimiento que se puede utilizar.
Se puede realizar una ronda de cribado, denominada "caminata" de ASO, utilizando ASO que se han diseñado para hibridar con una región diana de un pre-mRNA. Por ejemplo, los ASO utilizados en la caminata de ASO se pueden colocar en mosaico cada 5 nucleótidos desde aproximadamente 100 nucleótidos aguas arriba del sitio de splicing 5' del intrón retenido (por ejemplo, una porción de la secuencia del exón ubicada aguas arriba del intrón diana/retenido) hasta aproximadamente 100 nucleótidos aguas abajo del sitio de splicing 5' del intrón diana/retenido y/o desde aproximadamente 100 nucleótidos aguas arriba del sitio de splicing 3' del intrón retenido hasta aproximadamente 100 nucleótidos aguas abajo del sitio de splicing 3' del intrón diana/retenido (por ejemplo, una porción de la secuencia del exón ubicada aguas abajo del intrón diana/retenido). Por ejemplo, un primer ASO de 15 nucleótidos de longitud puede diseñarse para hibridar específicamente con los nucleótidos 6 a 20 en relación con el sitio de splicing 5' del intrón diana/retenido. Un segundo ASO está diseñado para hibridar específicamente con los nucleótidos 11 a 25 en relación con el sitio de splicing 5' del intrón diana/retenido. Los ASO están diseñados como tales abarcando la región diana del pre-mRNA. Los ASO se pueden colocar en mosaico más estrechamente, por ejemplo, cada 1, 2, 3 o 4 nucleótidos. Además, los ASO se pueden colocar en mosaico desde 100 nucleótidos aguas abajo del sitio de splicing 5', hasta 100 nucleótidos aguas arriba del sitio de splicing 3'. Además, los ASO se pueden colocar en mosaico desde 1160 nucleótidos aguas arriba del sitio de splicing 5', hasta aproximadamente 500 nucleótidos aguas abajo del sitio de splicing 5'. Los ASO se pueden colocar en mosaico desde 500 nucleótidos aguas arriba del sitio de splicing 3', hasta aproximadamente 1920 nucleótidos aguas abajo del sitio de splicing 3'.
Uno o más ASO, o un ASO de control (un ASO con una secuencia codificada, secuencia que no se espera que hibride con la región diana) se administran, por ejemplo, por transfección, en una línea celular relevante para la enfermedad que expresa el pre-mRNA diana (por ejemplo, el RIC pre-mRNA descrito en otra parte de esta invención). Los efectos de inducción de splicing de cada uno de los ASO se pueden evaluar mediante cualquier procedimiento conocido en la técnica, por ejemplo, mediante transcriptasa inversa (RT)-PCR usando cebadores que abarcan la unión de splicing, como se describe en esta invención (véase, por ejemplo, el Ejemplo 1). Una reducción o ausencia del producto de RT-PCR producido usando los cebadores que abarcan la unión de splicing en células tratadas con ASO en comparación con las células tratadas con ASO de control indica que se ha mejorado el splicing del intrón diana. La eficiencia de splicing, la relación de pre-mRNA con splicing y sin splicing, la velocidad de splicing o el grado del splicing pueden mejorarse usando los ASO descritos en esta invención. La cantidad de proteína o ARN funcional que está codificado por el pre-mRNA diana también puede evaluarse para determinar si cada ASO logró el efecto deseado (por ejemplo, producción de proteína mejorada). Se puede utilizar cualquier procedimiento conocido en la técnica para evaluar y/o cuantificar la producción de proteínas, tales como Western blotting, citometría de flujo, microscopía de inmunofluorescencia y ELISA.
Se puede realizar una segunda ronda de cribado, denominada "microcaminata" de ASO, utilizando ASO que se han diseñado para hibridar con una región diana de un pre-mRNA. Los ASO utilizados en la microcaminata de ASO se colocan en mosaico cada 1 nucleótido para refinar aún más la secuencia de ácidos nucleotídicos del pre-mRNA que cuando se hibrida con un ASO da como resultado un splicing mejorado.
Las regiones definidas por los ASO que promueven el splicing del intrón diana se exploran con mayor detalle por medio de una "microcaminata" de ASO, que involucra ASO espaciados en pasos de 1 nt, así como ASO más largos, típicamente de 18-25 nt.
Como se describió anteriormente para la caminata de ASO, la microcaminata de ASO se realiza administrando uno o más ASO, o un ASO de control (un ASO con una secuencia codificada, secuencia que no se espera que se hibride con la región diana), por ejemplo, mediante transfección, en una línea celular relevante para la enfermedad que expresa el pre-mRNA diana. Los efectos de inducción de splicing de cada uno de los ASO se pueden evaluar mediante cualquier procedimiento conocido en la técnica, por ejemplo, mediante transcriptasa inversa (RT)-PCR usando cebadores que abarcan la unión de splicing, como se describe en esta invención (véase, por ejemplo, el Ejemplo 1). Una reducción o ausencia del producto de RT-PCR producido usando los cebadores que abarcan la unión de splicing en células tratadas con ASO en comparación con las células tratadas con ASO de control indica que se ha mejorado el splicing del intrón diana. En algunas realizaciones, la eficiencia de splicing, la relación de premRNA con splicing y sin splicing, la velocidad de splicing o el grado del splicing pueden mejorarse usando los ASO descritos en esta invención. La cantidad de proteína o ARN funcional que está codificado por el pre-mRNA diana también puede evaluarse para determinar si cada ASO logró el efecto deseado (por ejemplo, producción de proteína mejorada). Se puede utilizar cualquier procedimiento conocido en la técnica para evaluar y/o cuantificar la producción de proteínas, tales como Western blotting, citometría de flujo, microscopía de inmunofluorescencia y ELISA.
Los ASO que cuando se hibridan con una región de un pre-mRNA dan como resultado un splicing mejorado y una mayor producción de proteínas pueden probarse in vivo utilizando modelos animales, por ejemplo, modelos de ratones transgénicos en los que el gen humano de longitud completa se ha incorporado o en modelos de ratón humanizado de la enfermedad. Las vías adecuadas para la administración de ASO pueden variar según la enfermedad y/o los tipos celulares a los que se desea el suministro de los ASO. Los ASO pueden administrarse, por ejemplo, mediante inyección intratecal, inyección intracerebroventricular, inyección intraperitoneal, inyección intramuscular, inyección subcutánea o inyección intravenosa. Después de la administración, las células, tejidos y/u órganos de los animales modelo pueden evaluarse para determinar el efecto del tratamiento con ASO, por ejemplo, evaluando el splicing
(eficiencia, velocidad, grado) y producción de proteínas mediante procedimientos conocidos en la técnica y descritos en esta invención. Los modelos animales también pueden ser cualquier indicación fenotípica o conductual de la enfermedad o de la gravedad de la enfermedad.
EJEMPLOS
La presente descripción se ilustrará más específicamente mediante los siguientes ejemplos.
Ejemplo 1: identificación de eventos de retención de intrones en transcritos de SYNGAP1 por RNAseq usando secuenciación de próxima generación (ilustrativo)
La secuenciación aleatoria completa del transcriptoma se llevó a cabo utilizando la secuenciación de próxima generación para revelar una captura de los transcritos producidos por el gen SYNGAP1 para identificar eventos de retención de intrones. Para este propósito, se aisló el ARN poliA+ de fracciones nucleares y citoplasmáticas de HCN (neuronas corticales humanas) y se construyeron bibliotecas de cDNA utilizando el kit de preparación de bibliotecas de mRNA trenzado TruSeq de Illumina. Las bibliotecas se secuenciaron en pares, lo que dio como resultado lecturas de 100 nucleótidos que se mapearon en el genoma humano (febrero de 2009, ensamblaje GRCh37/hg19). Los resultados de la secuenciación para SYNGAP1 se muestran en la FIG. 3. Brevemente, la FIG. 3 muestra las lecturas mapeadas visualizadas usando el navegador del genoma de UCSC (operado por UCSC Genome Informatics Group (Center for Biomolecular Science & Engineering (Centro de Ciencia Biomolecular e Ingeniería)), Universidad de California, Santa Cruz, 1156 High Street, Santa Cruz, CA 95064) y descrito por, porejemplo, Rosenbloom, y col., 2015, "The UCSC Genome Browser database: 2015 update," Nucleic Acids Research 43, número de base de datos, doi: 10.1093/nar/gku1177) y la cobertura y el número de lecturas pueden inferirse mediante las señales de pico. La altura de los picos indica el nivel de expresión dado por la densidad de las lecturas en una región en particular. El navegador del genoma UCSC (debajo de las señales de lectura) proporciona una representación esquemática de SYNGAP1 (dibujada a escala) para que los picos se puedan emparejar con las regiones exónicas e intrónicas de SYNGAP1. Con base en esta pantalla, se identificaron tres intrones (15, 18 y 19 indicados por flechas; correspondientes al intrón 15 NM_006772, intrón 18 NM_006772 e intrón 19 NM_006772, respectivamente) que tienen una alta densidad de lectura en la fracción nuclear de HCN, pero tienen lecturas muy bajas o nulas en la fracción citoplásmica de estas células (como se muestra para el intrón 15 en el diagrama inferior de la FIG. 3 y para los intrones 18 y 19 en el diagrama inferior de la FIG. 5). Esto indica que estos intrones se retienen y que los transcritos que contienen intrón-15, intrón-18 e intrón-19 permanecen en el núcleo, y sugiere que estos RIC premRNA de SYNGAP1 retenidos no son productivos, ya que no se exportan al citoplasma.
Ejemplo 2: Diseño de caminata ASO que se dirige al intrón 15 de SYNGAP (ilustrativo)
Se diseñó una caminata ASO para dirigirse al intrón 15 usando el procedimiento descrito en esta invención (FIG. 4; Tabla 1, SEQ ID NO: 1510 a 1814 y 2287 a 2591). Para diseñar ASO para dirigirse a los RIC pre-mRNA de SYNGAP1 del intrón retenido 15, se utilizaron una región inmediatamente aguas arriba y aguas abajo del sitio de splicing 5' del intrón 15 que abarca los nucleótidos 251 a -1054e y una región inmediatamente aguas arriba y agua abajo del sitio de splicing 3' del intrón 15 que abarca los nucleótidos -256 a 157e. La Tabla 1 enumera los ASO ejemplares que se diseñaron y sus secuencias diana. A partir de este diseño, se produjeron ASO 2'-O-Me ARN, cadena principal de PS, de 18 mers desplazados por intervalos de 5 nucleótidos y se utilizaron para dirigirse a RIC pre-ARNm de SYNGAP1 para aumentar la producción de proteína SYNGAP1 (véase la FIG. 4 y la FIG. 7B).
Tabla 1. Lista de ASO diri idos a SYNGAP1
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Ejemplo 3: Diseño de caminata ASO que se dirige al intrón 18 y 19 de SYNGAP1 (ilustrativo)
Se diseñó una caminata ASO para dirigirse a los intrones 18 y 19 usando el procedimiento descrito en esta invención (FIG. 6; Tabla 1, SEQ ID NO: 1815 a 2286 y 1038 a 1509). Para diseñar ASO para dirigirse a los RIC premRNA de SYNGAP1 del intrón retenido 18 o 19, se utilizaron una región inmediatamente aguas arriba y aguas abajo del sitio de splicing 5' del intrón 18 que abarca los nucleótidos 499 a -73e a y una región inmediatamente aguas arriba y aguas abajo del sitio de splicing 3' del intrón 19 que abarca los nucleótidos-496 a 1912e. La Tabla 1 enumera los ASO ejemplares que se diseñaron y sus secuencias diana. A partir de este diseño, se produjeron ASO 2'-O-Me ARN, cadena principal de PS, de 18 mers desplazados por intervalos de 5 nucleótidos y se utilizaron para dirigirse a RIC pre-mRNA de SYNGAP1 para aumentar la producción de proteína SYNGAP1 (véase la FIG. 6 y las FIG. 7DE). Las regiones intrónicas del sitio de splicing que flanquean el exón alternativo 19 no están dirigidas a evitar afectar el nivel de inclusión del exón 19.
Ejemplo 4: La eficiencia de splicing mejorada a través del direccionamiento ASO de los intrones 15, 18 o 19 de s Yn GAPI aumenta el nivel de transcritos (ilustrativo)
Para determinar un aumento en la eficiencia de splicing del intrón del gen diana con los ASO, se utilizó el procedimiento descrito en esta invención. Las células ARPE-19, una línea celular del epitelio retiniano humano (American Type Culture Collection (ATCC), EE. UU.) se transfectaron de forma simulada o se transfectaron con los ASO de direccionamiento descritos en los Ejemplos 2 y 3. Las células se transfectaron usando el reactivo de transfección Lipofectamine RNAiMax (Thermo Fisher) según las especificaciones del proveedor. Brevemente, los ASO se sembraron en placas de cultivo de tejidos de 96 pocillos y se combinaron con RNAiMax diluido en Opti-MEM. Las células se separaron usando tripsina y se resuspendieron en medio completo, y se añadieron aproximadamente 25.000 células a la mezcla de transfección de ASO. Los experimentos de transfección se llevaron a cabo en placas por triplicado. La concentración final de ASO fue de 80 nM. El medio se cambió 6 h después de la transfección y las células se recogieron a las 24 h, utilizando el reactivo de lisis Cells-to-Ct, suplementado con DNAse (Thermo Fisher), según las especificaciones del proveedor. Se generó cDNA con reactivos RT Cells-to-Ct (Thermo Fisher) según las especificaciones del proveedor. Para cuantificar la cantidad de splicing en el intrón de interés, se llevó a cabo una pCr cuantitativa usando ensayos Taqman con sondas que abarcan la unión exón-exón correspondiente (Thermo Fisher). Los ensayos Taqman se llevaron a cabo según las especificaciones del proveedor, en un sistema de PCR en tiempo real QuantStudio 7 Flex (Thermo Fisher). Los valores del ensayo de genes diana se normalizaron a RPL32 (deltaCt) y a muestras transfectadas simuladas con placa emparejadas (deltadelta Ct), lo que generó un nivel de cambio mayor sobre la cuantificación simulada (2A-(delta-deltaCt). El nivel de cambio promedio mayor sobre el simulado de las tres réplicas de placa para los ASO que se dirigen al intrón retenido 15 se representa en la FIG. 7B. Los ASO dirigidos a las posiciones -31 y -36 demostraron un aumento de la expresión del gen diana en >1,5 veces, lo que implica un aumento en el splicing en ese intrón diana. El nivel de cambio promedio mayor sobre el simulado de las tres réplicas de placa para los ASO que se dirigen al intrón retenido 18 se representa en la FIG. 7D. Los ASO dirigidos a las posiciones 36 y 41 demostraron un aumento de la expresión del gen diana en >~2 veces, lo que implica un aumento en el splicing en ese intrón diana. El nivel de cambio promedio mayor sobre el simulado de las tres réplicas de placa para los ASO que se dirigen al intrón retenido 19 se representa en la FIG. 7E. Los ASO dirigidos a las posiciones -55 y -60 demostraron un aumento de la expresión del gen diana en > 2 veces, lo que implica un aumento en el splicing en ese intrón diana. Junto con los datos completos del transcriptoma que confirman la retención del intrón diana (Ejemplo 1), estos resultados confirman que los ASO pueden mejorar la eficiencia de splicing de un intrón limitante de la velocidad.
Ejemplo 5: identificación de eventos de retención de intrones en transcritos de SCN1A por RNAseq usando secuenciación de próxima generación
La retención del intrón 21 de SCN1A se confirmó usando un ensayo de RT-PCR descrito en la Figura 8C. El intrón 21 se retiene en las células SK-N-AS y RenCell VM indicado por la presencia de una banda en la fracción nuclear.
Ejemplo 6: Diseño de caminata ASO que se dirige al intrón 21 de SCN1A
Se diseñé una caminata ASO para dirigirse al intrón 21 usando el procedimiento descrito en esta invención (Tabla 2, SEQ ID NO: 10-266 y 524-1037). Para diseñar ASO para dirigirse a los RIC pre-mRNA de SCN1A del intrén retenido 23, se utilizaron una región inmediatamente aguas arriba y agua abajo del sitio de splicing 5' del intrén 23 que abarca los nucleétidos -264e a 496 y una región inmediatamente aguas arriba y aguas abajo del sitio de splicing 3' del intrén 23 que abarca los nucleétidos-496 a 37e. La Tabla 2 enumera Ios ASO ejemplares que se diseñaron y sus secuencias diana. A partir de este diseño, se produjeron ASO 2'-0-Me ARN, cadena principal de PS, de 18 mers desplazados por intervalos de 5 nucleétidos y se utilizaron para dirigirse a RIC pre-mRNA de SCNIA para aumentar la producción de proteína SCN1A (véase las FIG. 8 D-E, Tabla 3-4).
Tabla 2. Lista de ASO diri idos a SCN1A
Figure imgf000031_0001
Tabla 3. Macrocaminata ASO del intrón 21 de SCN1A
Figure imgf000031_0002
Figure imgf000032_0001
Tabla 4. Microcaminata ASO del intrón 21 de SCN1A
Figure imgf000032_0002
Figure imgf000033_0001
Ejemplo 7: Diseño de caminata ASO que se dirige al intrón 23 de SCN1A
Se puede diseñar una caminata ASO para dirigirse al intrón 23 usando los procedimientos descritos en esta invención (Tabla 2, SEQ ID NO: 267-523). Para diseñar ASO para dirigirse a los RIC pre-mRNA de SCN1A del intrón retenido 23, se utilizaron una región inmediatamente aguas arriba y agua abajo del sitio de splicing 5' del intrón 23 que abarca los nucleótidos -264e a 496 y una región inmediatamente aguas arriba y aguas abajo del sitio de splicing 3' del intrón 23 que abarca los nucleótidos496 a 37e. La Tabla 2 enumera los ASO ejemplares que se diseñaron y sus secuencias diana. A partir de este diseño, se pueden producir ASO 2'-O-Me ARN, cadena principal de PS, de 18 mers desplazados por intervalos de 5 nucleótidos y utilizarse para dirigirse a RIC pre-mRNA de SCN1A para aumentar la producción de proteína SCN1A.
Ejemplo 8: La eficiencia de splicing mejorada a través del direccionamiento ASO de los intrones retenidos de SCN1A aumenta los niveles de transcritos
Para determinar si se puede lograr un aumento en la expresión de SCN1A mejorando la eficiencia de splicing del intrón 21 de SCN1A usando ASO, los productos de RT-PCR se evalúan mediante Taqman RT-qPCR. Con este fin, las células se transfectan de forma simulada o se transfectan con los ASO descritos para el intrón 21 en la Tabla 3, de forma independiente, usando el reactivo de suministro RNAiMAX (Invitrogen). Los experimentos se realizan utilizando ASO 80 nM durante 24 h. Para cuantificar la cantidad de splicing en el intrón de interés, se llevó a cabo una PCR cuantitativa usando ensayos Taqman con sondas que abarcan la unión exón-exón correspondiente (Thermo Fisher). Los ensayos Taqman se llevaron a cabo según las especificaciones del proveedor, en un sistema de PCR en tiempo real QuantStudio 7 Flex (Thermo Fisher). Los valores del ensayo de genes diana se normalizaron a RPL32 (deltaCt) y a muestras transfectadas simuladas con placa emparejadas (delta-delta Ct), lo que generó un nivel de cambio mayor sobre la cuantificación simulada (2A-(delta-deltaCt). El nivel de cambio promedio mayor sobre el simulado de las tres réplicas de placa se representa en las FIG. 8D-E. Se identificaron varios ASO que aumentan la expresión del gen diana en >~1,25 veces, lo que implica un aumento en el splicing en ese intrón diana.
Aunque las realizaciones preferidas de la invención se han mostrado y descrito en esta invención, será obvio para los expertos en la materia que dichas realizaciones se proporcionan solo a modo de ejemplo. A los expertos en la materia se les ocurrirán numerosas variaciones, cambios y sustituciones sin apartarse de la invención. Debe entenderse que pueden emplearse diversas alternativas a las realizaciones descritas en esta invención para poner en práctica las realizaciones.

Claims (15)

REIVINDICACIONES
1. Una composición farmacéutica que comprende un oligómero antisentido (ASO), donde el ASO es complementario a una porción dirigida de un pre-mRNA que contiene intrón retenido (RIC pre-mRNA) que codifica la proteína SCN1A, donde el RIC pre-mRNA comprende un intrón retenido, un exón que flanquea el sitio de splicing 5' del intrón retenido y un exón que flanquea el sitio de splicing 3' del intrón retenido, y donde la unión del ASO al RIC pre-mRNA hará que un intrón retenido experimente splicing constitutivo del RIC pre-mRNA en células que expresan el RIC pre-mRNA, aumentando así el nivel de ARN funcional que codifica la proteína SCN1A en las células.
2. Una composición farmacéutica según la reivindicación 1 para su uso como medicamento.
3. Una composición farmacéutica según la reivindicación 1 para su uso en el tratamiento del síndrome de Dravet (SD) en un sujeto.
4. Una composición farmacéutica según la reivindicación 1 o una composición farmacéutica para su uso según la reivindicación 2 o 3, donde el intrón retenido es el intrón 21 y la porción dirigida del RIC pre-mRNA está dentro de la región 6 en relación con el sitio de splicing 5' del intrón retenido 21 a -16 en relación con el sitio de splicing 3' del intrón retenido 21.
5. Una composición farmacéutica según la reivindicación 1 o la reivindicación 4 o una composición farmacéutica para su uso según cualquiera de las reivindicaciones 2 a 4, donde el RIC pre-mRNA comprende una secuencia con al menos el 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 97 % o 100 % de identidad de secuencia con una secuencia seleccionada de entre las SEQ ID NO: 4-7.
6. Una composición farmacéutica según la reivindicación 1, la reivindicación 4 o la reivindicación 5, o una composición farmacéutica para su uso según cualquiera de las reivindicaciones 2 a 5, donde la porción dirigida del RIC pre-mRNA comprende una secuencia con al menos el 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 97 % o 100 % de identidad de secuencia con una región que comprende al menos 8 ácidos nucleicos contiguos de SEQ ID NO: 2593.
7. Una composición farmacéutica según la reivindicación 1 o cualquiera de las reivindicaciones 4 a 6, o una composición farmacéutica para su uso según cualquiera de las reivindicaciones 2 a 6, donde el ASO comprende una secuencia con al menos el 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 97 % o 100 % de identidad con una secuencia seleccionada de entre las SEQ ID NO: 246, 255, 10-245, 247-254, 256-266 o 524-1037, preferentemente las SEQ ID NO: 246 o 255.
8. Una composición farmacéutica según la reivindicación 1 o cualquiera de las reivindicaciones 4 a 7, o una composición farmacéutica para su uso según cualquiera de las reivindicaciones 2 a 7, donde:
i) la proteína SCN1A se produce en una forma que tiene una función reducida en comparación con una proteína equivalente de tipo silvestre; o
ii) la proteína SCN1A se produce en una forma que es completamente funcional en comparación con una proteína equivalente de tipo silvestre.
9. Una composición farmacéutica según la reivindicación 1 o cualquiera de las reivindicaciones 4 a 8, o una composición farmacéutica para su uso según cualquiera de las reivindicaciones 2 a 8, donde el ASO comprende una modificación de la cadena principal que comprende un enlace fosforotioato o un enlace fosforodiamidato; o un resto de azúcar modificado o un análogo de azúcar, que opcionalmente comprende un fosforodiamidato morfolino, un ácido nucleico bloqueado, un ácido nucleico peptídico, un resto 2'-O-metilo, un resto 2'-fluoro o un resto 2'-O-metoxietilo.
10. Una composición farmacéutica según la reivindicación 1 o cualquiera de las reivindicaciones 4 a 9, o una composición farmacéutica para su uso según cualquiera de las reivindicaciones 2 a 9, donde el ASO consiste en de 8 a 50 nucleobases.
11. Una composición farmacéutica para su uso según cualquiera de las reivindicaciones 2 a 10, donde la proteína SCN1A es deficiente en cantidad o actividad en el sujeto a tratar.
12. Una composición farmacéutica para su uso según cualquiera de las reivindicaciones 2 a 11, donde la proteína SCN1A es deficiente en cantidad o actividad en el sujeto a tratar, y la cantidad deficiente de la proteína SCN1A es causada por la haploinsuficiencia de la proteína SCN1A, donde el sujeto tiene un primer alelo que codifica una proteína SCN1A funcional, y un segundo alelo a partir del cual no se produce la proteína SCN1A, o un segundo alelo que codifica una proteína SCN1A no funcional, y donde el ASO se une a una porción dirigida de un RIC pre-mRNA transcrito desde el primer alelo.
13. Una composición farmacéutica para su uso según cualquiera de las reivindicaciones 2 a 11, donde la proteína SCN1A es deficiente en cantidad o actividad en el sujeto a tratar, y el sujeto tiene
a. un primer alelo muíante a partir del cual
i. la proteína SCN1A se produce a un nivel reducido en comparación con la producción a partir de un alelo de tipo silvestre,
ii. la proteína SCN1A se produce en una forma que tiene una función reducida en comparación con una proteína SCN1A equivalente de tipo silvestre, o
iii. no se produce la proteína SCN1A, y
b. un segundo alelo mutante a partir del cual
i. la proteína SCN1A se produce a un nivel reducido en comparación con la producción a partir de un alelo de tipo silvestre,
ii. la proteína SCN1A se produce en una forma que tiene una función reducida en comparación con una proteína SCN1A equivalente de tipo silvestre, o
iii. no se produce la proteína SCN1A, y
donde cuando el sujeto tiene un primer alelo mutante a.iii., el segundo alelo mutante es bi o b.ii., donde cuando el sujeto tiene un segundo alelo mutante b.iii., el primer alelo mutante es ai o a.ii., y donde el RIC pre-mRNA se transcribe a partir del primer alelo mutante que es ai o a.ii. o el segundo alelo que es bi o b.ii.
14. Una composición farmacéutica para su uso según cualquiera de las reivindicaciones 2 a 13, donde el ASO se administra mediante inyección intratecal, inyección intracerebroventricular, inyección intraperitoneal, inyección intramuscular, inyección subcutánea o inyección intravenosa del sujeto.
15. Una composición farmacéutica según la reivindicación 1 o cualquiera de las reivindicaciones 4 a 8, o una composición farmacéutica para su uso según cualquiera de las reivindicaciones 2 a 14, donde el ASO no aumenta la cantidad de proteína SCN1A o ARN funcional que codifica la proteína SCN1A en las células. modulando el splicing alternativo del pre-mRNA transcrito a partir de un gen que codifica el ARN funcional o la proteína SCN1A.
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