JP2018538287A - 多発性嚢胞腎の処置のためのアンチセンスオリゴマー - Google Patents

多発性嚢胞腎の処置のためのアンチセンスオリゴマー Download PDF

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Abstract

ＰＣ−２の発現を増加させるための、および、被験体、例えば、ＰＣ−２タンパク質発現が不足している被験体、あるいは多発性嚢胞腎（ＰＫＤ）を抱える被験体を処置するための方法と組成物が本明細書で提供される。【選択図】図１

Description

＜相互参照＞
本出願は、２０１５年１２月１４日に出願された米国仮出願第６２／２６７，２５２号の利益を主張するものであり、当該出願は参照により本明細書に組み込まれる。配列リストへの言及
本出願は、ＡＳＣＩＩフォーマットで電子的に提出され、参照によって本明細書に組み込まれる配列表を含んでいる。２０１６年１２月９日に作成された上記のＡＳＣＩＩコピーは、４７９９１＿７０７＿６０１＿ＳＬ．ｔｘｔと命名され、２５３，３３２バイトのサイズである。
常染色体優性多発性嚢胞腎（ＡＤＰＫＤ）は、腎嚢胞の進行と様々な腎外の徴候を特徴とした疾病である、最も一般的な遺伝性の嚢胞性腎疾患の１つである（Ｔｏｒｒｅｓ ａｎｄ Ｈａｒｒｉｓ， ２００９， Ｋｉｄｎｅｙ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ （２００９） ７６， １４９−１６８）。ＡＤＰＫＤに苛まれている患者は一般に、７０歳までに末期の腎疾患（ＥＳＲＤ）を進行させ、これは最終的には腎透析などの介入を必要とする。生まれながらのＡＤＰＫＤの罹患率は１：４００〜１：１，０００の間であり、米国で約６００，０００人に影響を与えていると推測される。
ＰＫＤ１あるいはＰＫＤ２遺伝子のいずれかの突然変異は、ＡＤＰＫＤとして現れ、ＰＫＤ２の突然変異はＡＤＰＫＤの後期の発症形態の原因であることが分かっている。ＰＫＤ１とＰＫＤ２の遺伝子はＰＣ−１とＰＣ−２のタンパク質をそれぞれコードする。こうしたタンパク質は、尿細管上皮の分化した表現型を維持するのに必要不可欠であると考えられている（Ｔｏｒｒｅｓ ａｎｄ Ｈａｒｒｉｓ， ２００９）。
いくつかの実施形態では、被験体の細胞によって標的タンパク質または機能的ＲＮＡの発現を増加させることにより、被験体の多発性嚢胞腎を処置する方法が本明細書で開示され、ここで、細胞は、保持されたイントロン含有ｍＲＮＡ前駆体（ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体）を有し、ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体は、保持されたイントロン、５’スプライス部位に隣接するエクソン、３’スプライス部位に隣接するエクソンを含み、および、ここで、ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体は標的タンパク質または機能的ＲＮＡをコードし、当該方法は、標的タンパク質または機能的ＲＮＡをコードするＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体の標的部分に相補的なアンチセンスオリゴマー（ＡＳＯ）に、被験体の細胞を接触させる工程を含み、これによって、保持されたイントロンは、標的タンパク質または機能的ＲＮＡをコードするＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体から構成的にスプライシングされ、それにより、標的タンパク質または機能的ＲＮＡをコードするｍＲＮＡのレベルを増加させ、被験体の細胞中の標的タンパク質あるいは機能的ＲＮＡの発現を増加させる。
さらにいくつかの実施形態では、保持されたイントロン含有ｍＲＮＡ前駆体（ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体）を有する細胞により、ＰＣ−２である標的タンパク質の発現を増加させる方法が本明細書に開示され、ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体は、保持されたイントロン、保持されたイントロンの５’スプライス部位に隣接するエクソン、保持されたイントロンの３’スプライス部位に隣接するエクソンを含み、および、ここで、ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体はＰＣ−２タンパク質をコードし、当該方法は、ＰＣ−２タンパク質をコードするＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体の標的部分に相補的なアンチセンスオリゴマー（ＡＳＯ）に、細胞を接触させる工程を含み、これによって、保持されたイントロンは、ＰＣ−２タンパク質をコードするＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体から構成的にスプライシングされ、それにより、ＰＣ−２タンパク質をコードするｍＲＮＡのレベルを増加させ、細胞中のＰＣ−２タンパク質の発現を増加させる。
前述の方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態において、標的タンパク質はＰＣ−２である。いくつかの実施形態において、標的タンパク質または機能的ＲＮＡは、被験体において量あるいは活性が不足している標的タンパク質あるいは機能的ＲＮＡを機能的に増大させるか、これに取って代わる、補償タンパク質あるいは補償機能的ＲＮＡである。いくつかの実施形態において、細胞は、ＰＣ−２タンパク質の不足している量または活性によって引き起こされた疾病を抱える被験体中のものであるか、該被検体からのものである。
前述の方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態において、標的タンパク質の不足している量は、標的タンパク質のハプロ不全によって引き起こされ、ここで、被験体は機能的な標的タンパク質をコードする第１の対立遺伝子と、標的タンパク質が生成されない第２の対立遺伝子、あるいは非機能的標的タンパク質をコードする第２の対立遺伝子とを有し、ここで、アンチセンスオリゴマーは、第１の対立遺伝子から転写されたＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体の標的部分に結合する。いくつかの実施形態において、被験体は、標的タンパク質の量または機能の不足に起因する障害により引き起こされた疾病を抱えており、ここで、被験体は、（ａ）（ｉ）標的タンパク質が野生型対立遺伝子からの生成と比較して、減少したレベルで生成され、（ｉｉ）標的タンパク質が同等の野性型タンパク質と比較して機能が低下した形態で生成され、あるいは、（ｉｉｉ）標的タンパク質が生成されない、第１の変異対立遺伝子と、（ｂ）（ｉ）標的タンパク質が野生型対立遺伝子からの生成と比較して、減少したレベルで生成され、（ｉｉ）標的タンパク質が同等の野性型タンパク質と比較して機能が低下した形態で生成され、あるいは、（ｉｉｉ）標的タンパク質が生成されない、第２の変異対立遺伝子とを有し、ここで、被験体が第１の変異対立遺伝子（ａ）（ｉｉｉ）を有するとき、第２の変異対立遺伝子は（ｂ）（ｉ）あるいは（ｂ）（ｉｉ）であり、ここで、被験体が第２の変異対立遺伝子（ｂ）（ｉｉｉ）を有するとき、第１の変異対立遺伝子は（ａ）（ｉ）あるいは（ａ）（ｉｉ）であり、ここで、ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体は、（ａ）（ｉ）あるいは（ａ）（ｉｉ）である第１の変異対立遺伝子、および／または、（ｂ）（ｉ）あるいは（ｂ）（ｉｉ）である第２の変異対立遺伝子から転写される。いくつかの実施形態において、標的タンパク質は、同等の野性型タンパク質と比較して、機能が低下した形態で生成される。いくつかの実施形態において、標的タンパク質は、同等の野性型タンパク質と比較して、十分に機能的な形態で生成される。
前述の方法のいずれかのいくつかの実施形態において、ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体の標的部分は、保持されたイントロンの５’スプライス部位に対して＋６〜保持されたイントロンの３’スプライス部位に対して−１６までの領域内の保持されたイントロンにある。いくつかの実施形態において、ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体の標的部分は、以下の内部の保持されたイントロンにある：（ａ）保持されたイントロンの５’スプライス部位に対して＋６〜＋４９７の領域；あるいは（ｂ）保持されたイントロンの３’スプライス部位に対して−１６〜−４９６の領域。いくつかの実施形態において、ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体の標的部分は、以下の内部にある：（ａ）保持されたイントロンの５’スプライス部位に隣接するエクソン中の＋２ｅ〜−４ｅの領域；あるいは（ｂ）保持されたイントロンの３’スプライス部位に隣接するエクソン中の＋２ｅ〜−４ｅの領域。いくつかの実施形態において、ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体の標的部分は、以下の内部の保持されたイントロンにある：（ａ）保持されたイントロンの５’スプライス部位に対して−４ｅ〜−１，０５４ｅの領域；（ｂ）保持されたイントロンの５’スプライス部位に対して＋６〜＋４９９の領域；（ｃ）保持されたイントロンの３’スプライス部位に対して−１６〜−４９６の領域；あるいは、（ｄ）保持されたイントロンの３’スプライス部位に対して＋２ｅ〜＋１，９１２ｅの領域。いくつかの実施形態において、標的タンパク質はＰＣ−２である。
前述の方法のいずれかのいくつかの実施形態において、ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２に少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、あるいは１００％の配列同一性を備えた配列を含む。いくつかの実施形態において、ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、あるいは１００％の配列同一性を備えた遺伝子配列によってコードされる。いくつかの実施形態において、ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体の標的部分は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２８１の少なくとも８つの隣接する核酸を含む領域に少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、あるいは１００％の配列同一性を備えた配列を含む。いくつかの実施形態において、ＡＳＯは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３−２８０のいずれか１つに少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、あるいは１００％相補的な配列を含む。いくつかの実施形態において、ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体の標的部分は、保持されたイントロン５の５’スプライス部位に対して−２０４ｅ〜＋４９７までの領域内、あるいは保持されたイントロン５の３’スプライス部位に対して−４９６〜＋２１２ｅの領域内にある。いくつかの実施形態において、ＡＳＯは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３−２８０のいずれか１つに少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、あるいは１００％相補的な配列を含む。いくつかの実施形態において、ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体の標的部分は、保持されたイントロン５の５’スプライス部位に対して−２０４ｅ〜−４ｅの領域内のエクソン５にある。いくつかの実施形態において、ＡＳＯは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３−４３のいずれか１つに少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、あるいは１００％相補的な配列を含む。いくつかの実施形態において、ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体の標的部分は、保持されたイントロンの５’スプライス部位に対して＋６〜＋４９７の領域内の保持されたイントロン５にある。いくつかの実施形態において、ＡＳＯは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４４−１４０のいずれか１つに少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、あるいは１００％相補的な配列を含む。いくつかの実施形態において、ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体の標的部分は、保持されたイントロンの３’スプライス部位に対して−１６〜−４９６の領域内の保持されたイントロン５にある。いくつかの実施形態において、ＡＳＯは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４１−２３７のいずれか１つに少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、あるいは１００％相補的な配列を含む。いくつかの実施形態において、ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体の標的部分は、保持されたイントロン５の３’スプライス部位に対して＋２ｅ〜＋２１２ｅの領域内のエクソン６にある。いくつかの実施形態において、ＡＳＯは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３８−２８０のいずれか１つに少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、あるいは１００％相補的な配列を含む。
前述の方法のいずれかのいくつかの実施形態において、アンチセンスオリゴマーは、機能的ＲＮＡまたは標的タンパク質をコードする遺伝子から転写されたｍＲＮＡ前駆体の選択的スプライシングを調節することにより、標的タンパク質または機能的ＲＮＡの量を増加させない。いくつかの実施形態において、アンチセンスオリゴマーは、標的タンパク質または機能的ＲＮＡをコードする遺伝子の突然変異に起因する異常なスプライシングを調節することにより、標的タンパク質または機能的ＲＮＡの量を増加させない。いくつかの実施形態において、ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体は、全長のｍＲＮＡ前駆体の部分的なスプライシング、または野生型のｍＲＮＡ前駆体の部分的なスプライシングによって生成された。いくつかの実施形態において、標的タンパク質または機能的ＲＮＡをコードするｍＲＮＡは、全長の成熟ｍＲＮＡ、あるいは野生型の成熟ｍＲＮＡである。いくつかの実施形態において、生成された標的タンパク質は全長のタンパク質あるいは野生型のタンパク質である。いくつかの実施形態において、アンチセンスオリゴマーと接触させた細胞中で生成された標的タンパク質または機能的ＲＮＡをコードするｍＲＮＡの総量は、対照細胞中で生成された標的タンパク質または機能的ＲＮＡをコードするｍＲＮＡの総量と比較して、約１．１〜約１０倍、約１．５〜約１０倍、約２〜約１０倍、約３〜約１０倍、約４〜約１０倍、約１．１〜約５倍、約１．１〜約６倍、約１．１〜約７倍、約１．１〜約８倍、約１．１〜約９倍、約２〜約５倍、約２〜約６倍、約２〜約７倍、約２〜約８倍、約２〜約９倍、約３〜約６倍、約３〜約７倍、約３〜約８倍、約３〜約９倍、約４〜約７倍、約４〜約８倍、約４〜約９倍、少なくとも約１．１倍、少なくとも約１．５倍、少なくとも約２倍、少なくとも約２．５倍、少なくとも約３倍、少なくとも約３．５倍、少なくとも約４倍、少なくとも約５倍、あるいは少なくとも約１０倍増加する。いくつかの実施形態において、アンチセンスオリゴマーと接触させた細胞によって生成された標的タンパク質の総量は、対照細胞によって生成された標的タンパク質の総量と比較して、約１．１〜約１０倍、約１．５〜約１０倍、約２〜約１０倍、約３〜約１０倍、約４〜約１０倍、約１．１〜約５倍、約１．１〜約６倍、約１．１〜約７倍、約１．１〜約８倍、約１．１〜約９倍、約２〜約５倍、約２〜約６倍、約２〜約７倍、約２〜約８倍、約２〜約９倍、約３〜約６倍、約３〜約７倍、約３〜約８倍、約３〜約９倍、約４〜約７倍、約４〜約８倍、約４〜約９倍、少なくとも約１．１倍、少なくとも約１．５倍、少なくとも約２倍、少なくとも約２．５倍、少なくとも約３倍、少なくとも約３．５倍、少なくとも約４倍、少なくとも約５倍、あるいは少なくとも約１０倍増加する。
前述の方法のいずれかのいくつかの実施形態において、アンチセンスオリゴマーは、ホスホロチオエート結合またはホスホロジアミデート結合を含む骨格修飾を含む。いくつかの実施形態において、アンチセンスオリゴマーはホスホロジアミデートモルホリノ、ロックド核酸、ペプチド核酸、２’−Ｏ−メチル、２’−フルオロ、あるいは２’−Ｏ−メトキシエチル部分を含む。いくつかの実施形態において、アンチセンスオリゴマーは少なくとも１つの修飾された糖部分を含む。いくつかの実施形態において、それぞれの糖部分は修飾された糖部分である。いくつかの実施形態において、アンチセンスオリゴマーは、８〜５０の核酸塩基、８〜４０の核酸塩基、８〜３５の核酸塩基、８〜３０の核酸塩基、８〜２５の核酸塩基、８〜２０の核酸塩基、８〜１５の核酸塩基、９〜５０の核酸塩基、９〜４０の核酸塩基、９〜３５の核酸塩基、９〜３０の核酸塩基、９〜２５の核酸塩基、９〜２０の核酸塩基、９〜１５の核酸塩基、１０〜５０の核酸塩基、１０〜４０の核酸塩基、１０〜３５の核酸塩基、１０〜３０の核酸塩基、１０〜２５の核酸塩基、１０〜２０の核酸塩基、１０〜１５の核酸塩基、１１〜５０の核酸塩基、１１〜４０の核酸塩基、１１〜３５の核酸塩基、１１〜３０の核酸塩基、１１〜２５の核酸塩基、１１〜２０の核酸塩基、１１〜１５の核酸塩基、１２〜５０の核酸塩基、１２〜４０の核酸塩基、１２〜３５の核酸塩基、１２〜３０の核酸塩基、１２〜２５の核酸塩基、１２〜２０の核酸塩基、あるいは１２〜１５の核酸塩基からなる。いくつかの実施形態において、アンチセンスオリゴマーは、タンパク質をコードするＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体の標的部分に少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、あるいは１００％相補的である。
前述の方法のいずれかのいくつかの実施形態において、細胞は、標的タンパク質または機能的ＲＮＡをコードする遺伝子から転写されたＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体の集団を含み、ここで、ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体の集団は少なくとも１つの保持されたイントロンを含み、および、ここで、アンチセンスオリゴマーは、ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体の集団で最も豊富な保持されたイントロンに結合する。いくつかの実施形態において、最も豊富な保持されたイントロンに対するアンチセンスオリゴマーの結合は、標的タンパク質または機能的ＲＮＡをコードするｍＲＮＡを生成するＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体の集団からの少なくとも１つの保持されたイントロンのスプライシングアウトを誘発する。いくつかの実施形態において、細胞は、標的タンパク質または機能的ＲＮＡをコードする遺伝子から転写されたＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体の集団を含み、ここで、ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体の集団は２つ以上の保持されたイントロンを含み、および、ここで、アンチセンスオリゴマーは、ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体の集団で２番目に豊富な保持されたイントロンに結合する。いくつかの実施形態において、２番目に豊富な保持されたイントロンに対するアンチセンスオリゴマーの結合は、標的タンパク質または機能的ＲＮＡをコードするｍＲＮＡを生成するＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体の集団からの２つ以上の保持されたイントロンのスプライシングアウトを誘発する。いくつかの実施形態において、当該方法はＰＣ−２タンパク質発現を評価する工程をさらに含む。
前述の方法のいずれかのいくつかの実施形態において、アンチセンスオリゴマーはＰＫＤ２ ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体の標的部分に結合し、ここで、標的部分はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３−２８０から選択される配列である。いくつかの実施形態では、被験体はヒトである。いくつかの実施形態では、被験体はヒト以外の動物である。いくつかの実施形態において、被験体は胎児、胚、あるいは子供である。いくつかの実施形態では、細胞はエクスビボである。いくつかの実施形態において、アンチセンスオリゴマーは、被験体の腹腔内注射、筋肉内注射、皮下注射、あるいは静脈内注射によって投与される。いくつかの実施形態において、５’スプライス部位に隣接するエクソンの−３ｅ〜−１ｅと、保持されたイントロンの＋１〜＋６にある９つのヌクレオチドは、対応する野性型配列と同一である。いくつかの実施形態において、保持されたイントロンの−１５〜−１と３’スプライス部位に隣接するエクソンの＋１ｅにある１６のヌクレオチドは、対応する野性型配列と同一である。いくつかの実施形態では、前述の方法のいずれかに記載されるようなアンチセンスオリゴマーが本明細書に開示される。
いくつかの実施形態では、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３−２８０のいずれか１つに対して少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、あるいは１００％の配列同一性を備えた配列を含むアンチセンスオリゴマーが本明細書で開示される。
さらにいくつかの実施形態では、前述のアンチセンスオリゴマーのいずれかと賦形剤を含む医薬組成物が本明細書で開示される。
いくつかの実施形態では、腹腔内注射、筋肉内注射、皮下注射、あるいは静脈内注射によって前述の医薬組成物のいずれかを投与することにより、必要としている被験体を処置する方法が本明細書で開示される。
いくつかの実施形態では、不足しているタンパク質または不足している機能的ＲＮＡに関連付けられる被験体の多発性嚢胞腎を処置するために細胞によって標的タンパク質あるいは機能的ＲＮＡの発現を増加させる方法で使用されるアンチセンスオリゴマーを含む組成物が本明細書で開示される。ここで、不足しているタンパク質または不足している機能的ＲＮＡは、被験体において量あるいは活性が不足しており、ここで、アンチセンスオリゴマーは、標的タンパク質または機能的ＲＮＡをコードする、保持されたイントロン含有ｍＲＮＡ前駆体（ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体）の構成的なスプライシングを増強し、ここで、標的タンパク質は：（ａ）不足しているタンパク質；あるいは（ｂ）被験体において不足しているタンパク質を機能的に増大させるか、これに取って代わる、補償タンパク質であり、ここで、機能的ＲＮＡは：（ｃ）不足しているＲＮＡ；あるいは（ｄ）被験体の不足している機能的ＲＮＡを機能的に増大させるか、これに取って代わる、補償機能的ＲＮＡであり、ここで、ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体は、保持されたイントロン、５’スプライス部位に隣接するエクソン、および３’スプライス部位に隣接するエクソンを含み、ここで、保持されたイントロンは、標的タンパク質または機能的ＲＮＡをコードするＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体からスプライシングされ、それによって、被験体の標的タンパク質あるいは機能的ＲＮＡの生成あるいは活性を増加させる。
いくつかの実施形態では、被験体においてＰＣ−２タンパク質に関連する疾病を処置する方法で使用されるアンチセンスオリゴマーを含む組成物が本明細書で開示され、当該方法は、被験体の細胞によってＰＣ−２タンパク質の発現を増加させる工程を含み、ここで、細胞は、保持されたイントロン、保持されたイントロンの５’スプライス部位に隣接するエクソン、保持されたイントロンの３’スプライス部位に隣接するエクソンを含む、保持されたイントロン含有ｍＲＮＡ前駆体を有し、および、ここで、ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体はＰＣ−２タンパク質をコードし、当該方法は、アンチセンスオリゴマーに細胞を接触させる工程を含み、これによって、保持されたイントロンは、ＰＣ−２タンパク質をコードするＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体転写産物から構成的にスプライシングされ、それにより、被験体の細胞においてＰＣ−２タンパク質をコードするｍＲＮＡのレベルを増加させ、ＰＣ−２タンパク質の発現を増加させる。いくつかの実施形態では、疾病は疾患または障害である。いくつかの実施形態において、疾患または障害は多発性嚢胞腎である。いくつかの実施形態において、標的タンパク質とＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体はＰＫＤ２遺伝子によってコードされる。
前述の組成物のいずれかのいくつかの実施形態において、アンチセンスオリゴマーは、保持されたイントロンの５’スプライス部位に対して＋６から、保持されたイントロンの３’スプライス部位に対して−１６までの領域内の保持されたイントロンにあるＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体の一部を標的とする。いくつかの実施形態において、アンチセンスオリゴマーはＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体の一部を標的とし、これは、以下の内部の保持されたイントロンにある：（ａ）保持されたイントロンの５’スプライス部位に対して＋６〜＋４９７の領域；あるいは（ｂ）保持されたイントロンの３’スプライス部位に対して−１６〜−４９６の領域。いくつかの実施形態において、アンチセンスオリゴマーは、少なくとも１つの保持されたイントロンの５’スプライス部位の約１００ヌクレオチド下流から、少なくとも１つの保持されたイントロンの３’スプライス部位の約１００ヌクレオチド上流までの領域内にあるＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体の一部を標的とする。いくつかの実施形態において、ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体の標的部分は、以下の内部にある：（ａ）保持されたイントロンの５’スプライス部位に隣接するエクソン中の＋２ｅ〜−４ｅの領域；あるいは（ｂ）保持されたイントロンの３’スプライス部位に隣接するエクソン中の＋２ｅ〜−４ｅの領域。いくつかの実施形態において、ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体の標的部分は、以下の内部にある：（ａ）保持されたイントロンの５’スプライス部位に対して−４ｅ〜−１，０５４ｅの領域；（ｂ）保持されたイントロンの５’スプライス部位に対して＋６〜＋４９９の領域；（ｃ）保持されたイントロンの３’スプライス部位に対して−１６〜−４９６の領域；あるいは、（ｄ）保持されたイントロンの３’スプライス部位に対して＋２ｅ〜＋１，９１２ｅの領域。いくつかの実施形態において、標的タンパク質はＰＣ−２である。いくつかの実施形態において、ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２に少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、あるいは１００％の配列同一性を備えた配列を含む。いくつかの実施形態において、ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、あるいは１００％の配列同一性を備えた遺伝子配列によってコードされる。いくつかの実施形態において、ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体の標的部分は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２８１の少なくとも８つの隣接する核酸を含む領域に少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、あるいは１００％の配列同一性を備えた配列を含む。いくつかの実施形態において、ＡＳＯは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３−２８０のいずれか１つに少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、あるいは１００％相補的な配列を含む。いくつかの実施形態において、ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体の標的部分は、保持されたイントロン５の５’スプライス部位に対して−２０４ｅ〜＋４９７までの領域内、あるいは保持されたイントロン５の３’スプライス部位に対して−４９６〜＋２１２ｅの領域内にある。いくつかの実施形態において、ＡＳＯは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３−２８０のいずれか１つに少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、あるいは１００％相補的な配列を含む。いくつかの実施形態において、ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体の標的部分は、保持されたイントロン５の５’スプライス部位に対して−２０４ｅ〜−４ｅの領域内のエクソン５にある。いくつかの実施形態において、ＡＳＯは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３−４３のいずれか１つに少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、あるいは１００％相補的な配列を含む。いくつかの実施形態において、ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体の標的部分は、保持されたイントロンの５’スプライス部位に対して＋６〜＋４９７の領域内の保持されたイントロン５にある。いくつかの実施形態において、ＡＳＯは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４４−１４０のいずれか１つに少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、あるいは１００％相補的な配列を含む。いくつかの実施形態において、ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体の標的部分は、保持されたイントロンの３’スプライス部位に対して−１６〜−４９６の領域内の保持されたイントロン５にある。いくつかの実施形態において、ＡＳＯは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４１−２３７のいずれか１つに少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、あるいは１００％相補的な配列を含む。いくつかの実施形態において、ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体の標的部分は、保持されたイントロン５の３’スプライス部位に対して＋２ｅ〜＋２１２ｅの領域内のエクソン６にある。いくつかの実施形態において、ＡＳＯは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３８−２８０のいずれか１つに少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、あるいは１００％相補的な配列を含む。
前述の組成物のいずれかのいくつかの実施形態において、アンチセンスオリゴマーは、標的タンパク質または機能的ＲＮＡをコードする遺伝子から転写されたｍＲＮＡ前駆体の選択的スプライシングを調節することにより、標的タンパク質または機能的ＲＮＡの量を増加させない。いくつかの実施形態において、アンチセンスオリゴマーは、標的タンパク質または機能的ＲＮＡをコードする遺伝子の突然変異に起因する異常なスプライシングを調節することにより、機能的ＲＮＡまたは機能的タンパク質の量を増加させない。いくつかの実施形態において、ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体は、全長のｍＲＮＡ前駆体、あるいは野生型のｍＲＮＡ前駆体の部分的なスプライシングによって生成された。いくつかの実施形態において、標的タンパク質または機能的ＲＮＡをコードするｍＲＮＡは、全長の成熟ｍＲＮＡ、あるいは野生型の成熟ｍＲＮＡである。いくつかの実施形態において、生成された標的タンパク質は全長のタンパク質あるいは野生型のタンパク質である。いくつかの実施形態において、保持されたイントロンは律速イントロンである。いくつかの実施形態において、保持されたイントロンは前記ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体で最も豊富な保持されたイントロンである。いくつかの実施形態において、保持されたイントロンは前記ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体で２番目に豊富な保持されたイントロンである。
前述の組成物のいずれかのいくつかの実施形態において、アンチセンスオリゴマーは、ホスホロチオエート結合またはホスホロジアミデート結合を含む骨格修飾を含む。いくつかの実施形態では、アンチセンスオリゴマーはアンチセンスオリゴヌクレオチドである。いくつかの実施形態において、アンチセンスオリゴマーはホスホロジアミデートモルホリノ、ロックド核酸、ペプチド核酸、２’−Ｏ−メチル、２’−フルオロ、あるいは２’−Ｏ−メトキシエチル部分を含む。いくつかの実施形態において、アンチセンスオリゴマーは少なくとも１つの修飾された糖部分を含む。いくつかの実施形態において、それぞれの糖部分は修飾された糖部分である。いくつかの実施形態において、アンチセンスオリゴマーは、８〜５０の核酸塩基、８〜４０の核酸塩基、８〜３５の核酸塩基、８〜３０の核酸塩基、８〜２５の核酸塩基、８〜２０の核酸塩基、８〜１５の核酸塩基、９〜５０の核酸塩基、９〜４０の核酸塩基、９〜３５の核酸塩基、９〜３０の核酸塩基、９〜２５の核酸塩基、９〜２０の核酸塩基、９〜１５の核酸塩基、１０〜５０の核酸塩基、１０〜４０の核酸塩基、１０〜３５の核酸塩基、１０〜３０の核酸塩基、１０〜２５の核酸塩基、１０〜２０の核酸塩基、１０〜１５の核酸塩基、１１〜５０の核酸塩基、１１〜４０の核酸塩基、１１〜３５の核酸塩基、１１〜３０の核酸塩基、１１〜２５の核酸塩基、１１〜２０の核酸塩基、１１〜１５の核酸塩基、１２〜５０の核酸塩基、１２〜４０の核酸塩基、１２〜３５の核酸塩基、１２〜３０の核酸塩基、１２〜２５の核酸塩基、１２〜２０の核酸塩基、あるいは１２〜１５の核酸塩基からなる。
いくつかの実施形態では、前述のアンチセンスオリゴマーのいずれかと賦形剤を含む医薬組成物が本明細書で開示される。いくつかの実施形態では、腹腔内注射、筋肉内注射、皮下注射、あるいは静脈内注射によって前述の医薬組成物を投与することにより、必要としている被験体を処置する方法が本明細書で開示される。
いくつかの実施形態において、医薬組成物が本明細書に開示され、該医薬組成物は、不足しているＰＫＤ２ ｍＲＮＡ転写産物の標的配列にハイブリダイズされるアンチセンスオリゴマーであって、不足しているＰＫＤ２ ｍＲＮＡ転写産物が保持されたイントロンを含み、アンチセンスオリゴマーが不足しているＰＫＤ２ ｍＲＮＡ転写産物からの保持されたイントロンのスプライシングアウトを誘発する、アンチセンスオリゴマーと、薬学的に許容可能な賦形剤とを含む。いくつかの実施形態において、不足しているＰＫＤ２ ｍＲＮＡ転写産物はＰＫＤ２ ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体転写産物である。いくつかの実施形態において、ＰＫＤ２ ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体転写産物の標的部分は、保持されたイントロンの５’スプライス部位に対して＋５００〜保持されたイントロンの３’スプライス部位に対して−５００までの領域内の保持されたイントロンにある。いくつかの実施形態において、ＰＫＤ２ ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体転写産物は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に対して少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、あるいは１００％の配列同一性を備えた遺伝子配列によってコードされる。いくつかの実施形態において、ＰＫＤ２ ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体転写産物は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２に対して少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、あるいは１００％の配列同一性を備えた配列を含む。いくつかの実施形態において、アンチセンスオリゴマーは、ホスホロチオエート結合またはホスホロジアミデート結合を含む骨格修飾を含む。いくつかの実施形態では、アンチセンスオリゴマーはアンチセンスオリゴヌクレオチドである。いくつかの実施形態において、アンチセンスオリゴマーは、ホスホロジアミデートモルホリノ、ロックド核酸、ペプチド核酸、２’−Ｏ−メチル、２’−フルオロ、あるいは２’−Ｏ−メトキシエチル部分を含む。いくつかの実施形態において、アンチセンスオリゴマーは少なくとも１つの修飾された糖部分を含む。いくつかの実施形態において、アンチセンスオリゴマーは、８〜５０の核酸塩基、８〜４０の核酸塩基、８〜３５の核酸塩基、８〜３０の核酸塩基、８〜２５の核酸塩基、８〜２０の核酸塩基、８〜１５の核酸塩基、９〜５０の核酸塩基、９〜４０の核酸塩基、９〜３５の核酸塩基、９〜３０の核酸塩基、９〜２５の核酸塩基、９〜２０の核酸塩基、９〜１５の核酸塩基、１０〜５０の核酸塩基、１０〜４０の核酸塩基、１０〜３５の核酸塩基、１０〜３０の核酸塩基、１０〜２５の核酸塩基、１０〜２０の核酸塩基、１０〜１５の核酸塩基、１１〜５０の核酸塩基、１１〜４０の核酸塩基、１１〜３５の核酸塩基、１１〜３０の核酸塩基、１１〜２５の核酸塩基、１１〜２０の核酸塩基、１１〜１５の核酸塩基、１２〜５０の核酸塩基、１２〜４０の核酸塩基、１２〜３５の核酸塩基、１２〜３０の核酸塩基、１２〜２５の核酸塩基、１２〜２０の核酸塩基、あるいは１２〜１５の核酸塩基を含む。いくつかの実施形態において、アンチセンスオリゴマーは、ＰＫＤ２ ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体転写産物の標的部分に少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、あるいは１００％相補的である。いくつかの実施形態において、ＰＫＤ２ ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体転写産物の標的部分は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２８１内にある。いくつかの実施形態において、アンチセンスオリゴマーは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３−２８０のいずれか１つに対して少なくとも約８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、あるいは９９％の配列同一性であるヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、アンチセンスオリゴマーは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３−２８０から選択されたヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、医薬組成物は、髄腔内注射、脳室内注射、腹腔内注射、筋肉内注射、皮下注射、あるいは静脈内注射のために製剤される。
いくつかの実施形態では、ＰＣ−２タンパク質の機能的な形態をコードする十分に処理されたＰＫＤ２ ｍＲＮＡ転写産物を生成するべく、保持されたイントロンの除去を促すために不足しているＰＫＤ２ ｍＲＮＡ転写産物の処理を誘発する方法が本明細書で開示され、該方法は：（ａ）被験体の標的細胞へアンチセンスオリゴマーを接触させる工程と、（ｂ）不足しているＰＫＤ２ ｍＲＮＡ転写産物へアンチセンスオリゴマーをハイブリダイズする工程であって、不足しているＰＫＤ２ ｍＲＮＡ転写産物が、ＰＣ−２タンパク質の機能的な形態をコードすることができ、少なくとも１つの保持されたイントロンを含む、工程と、（ｃ）ＰＣ−２タンパク質の機能的な形態をコードする十分に処理されたＰＫＤ２ ｍＲＮＡ転写産物を生成するために不足しているＰＫＤ２ ｍＲＮＡ転写産物から少なくとも１つの保持されたイントロンを除去する工程と、（ｄ）十分に処理されたＰＫＤ２ ｍＲＮＡ転写産物からＰＣ−２タンパク質の機能的な形態を翻訳する工程を含む。いくつかの実施形態において、保持されたイントロンは保持されたイントロン全体である。いくつかの実施形態において、不足しているＰＫＤ２ ｍＲＮＡ転写産物はＰＫＤ２ ｍＲＮＡ前駆体転写産物である。
いくつかの実施形態では、ＰＣ２タンパク質の量と活性の不足によって引き起こされた疾病を抱える被験体を処置する方法が本明細書で開示され、該方法は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３−２８０のいずれか１つに対して少なくとも約８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、あるいは９９％の配列同一性を備えたヌクレオチド配列を含むアンチセンスオリゴマーを被験体に投与する工程を含む。
＜参照による組み込み＞
本明細書で言及される出願公開、特許、および特許出願はすべて、あたかも個々の出願公開、特許、あるいは特許出願がそれぞれ参照により組み込まれるように具体的かつ個々に指示されるかのような同じ程度、参照により本明細書に組み込まれる。
本発明の新規な特徴は、とりわけ添付の特許請求の範囲において説明される。本発明の諸原則が利用される例示の実施形態について説明する以下の詳細な記載と、添付の図面を参照することで、本発明の特徴および利点についてのよりよい理解が得られるであろう。
保持されたイントロン含有（ＲＩＣ）ｍＲＮＡ前駆体の転写産物の例示的概略図を示す。図１では、５’スプライス部位コンセンサス配列は、−３ｅから−１ｅおよび＋１から＋６（「ｅ」と標識された数字はエクソンであり、標識されていない数字はイントロンである）の、下線部の文字（文字はヌクレオチド、大文字はエクソン部分、小文字はイントロン部分）で示される。３’スプライス部位コンセンサス配列は、−１５から−１および＋１ｅ（「ｅ」と標識された数字はエクソンであり、標識されていない数字はイントロンである）の、下線部の文字（文字はヌクレオチド、大文字はエクソン部分、小文字はイントロン部分）で示される。ＡＳＯスクリーニングの、イントロンの標的領域は、保持されたイントロンの５’スプライス部位（左の矢印）に対する＋６から、保持されたイントロンの３’スプライス部位（右の矢印）に対する−１６のヌクレオチドを含む。実施形態では、ＡＳＯスクリーニングの、イントロンの標的領域は、保持されたイントロンの５’スプライス部位に対して＋６から＋１００、および保持されたイントロンの３’スプライス部位に対して−１６から−１００のヌクレオチドを含む。エクソンの標的領域は、イントロンの５’スプライス部位に隣接するエクソンの＋２ｅから−４ｅ、および保持されたイントロンの３’スプライス部位に隣接するエクソンの＋２ｅから−４ｅのヌクレオチドを含む。「ｎ」あるいは「Ｎ」はヌクレオチドを表し、「ｙ」はピリミジンを表す。図示された配列は、哺乳動物のスプライス部位のコンセンサス配列を表し、個々のイントロンおよびエクソンはすべての位置でコンセンサス配列を一致させる必要はない。 核内遺伝子出力の標的とされた増強（ＴＡＮＧＯ）アプローチの概略図を示す。図２Ａは、核と細胞質区画に分割された細胞を示す。核では、エクソン（長方形）およびイントロン（接続ライン）から成る標的遺伝子のｍＲＮＡ前駆体の転写産物は、ｍＲＮＡを産生するためにスプライシングを受け、このｍＲＮＡは細胞質に輸送され、標的タンパク質に翻訳される。この標的遺伝子については、イントロン１のスプライシングは非効率的であり、保持されたイントロン含有（ＲＩＣ）ｍＲＮＡ前駆体は、主として核に蓄積し、細胞質に輸送された場合は標的タンパク質産生に至ることなく劣化する。 核内遺伝子出力の標的とされた増強（ＴＡＮＧＯ）アプローチの概略図を示す。図２Ｂは、核と細胞質区画に分割された同じ細胞の例を示す。アンチセンスオリゴマー（ＡＳＯ）による処置は、イントロン１のスプライシングを促進し、ｍＲＮＡの増加をもたらし、これは順に、高位レベルの標的タンパク質に翻訳される。 イントロン５をもつＰＫＤ２遺伝子におけるイントロン保持を詳細に示す。ＲＮＡ配列決定（ＲＮＡｓｅｑ）を用いた、ＰＫＤ２遺伝子におけるイントロン保持事象の特定は、ＵＣＳＣゲノムブラウザで視覚化されて示される。上パネルは、腎臓の上皮細胞内に発現し、細胞質（上部）あるいは核分画（底部）のいずれかに局在するＰＫＤ２転写産物に相当する読み取り密度を示す。このパネルの下部に、ＰＫＤ２遺伝子を図示したものが、スケールに合わせて示される。読み取り密度は、ピークで示される。最も高い読み取り密度は、エクソン（ブラックボックス）に相当する。一方、いずれの細胞分画においてもイントロンの大半で読み取りは観察されない。細胞質分画と比較してより高い読み取り密度は、核分画のイントロン５（矢印が示す部分）に対して検知され、これはイントロン５のスプライシング効率が低く、結果としてイントロン保持をもたらすことを示している。保持されたイントロン含有ｍＲＮＡ前駆体の転写産物は、核内に保持され、細胞質には輸送されない。腎臓の上皮細胞内のイントロン５の読み取り密度は、下パネルに詳細に示される。 例示的ＰＫＤ２遺伝子イントロン５（ＩＶＳ ５）ＡＳＯウォーク（ｗａｌｋ）を示す。２’−Ｏ−Ｍｅ ＡＳＯ、ＰＳ骨格を使用して、５’スプライス部位のすぐ下流、あるいは３’スプライス部位の上流にある配列を標的とする、ＰＫＤ２ ＩＶＳ ５に対して行われたＡＳＯウォークが図示される。ＡＳＯは、一度に５つのヌクレオチドの位置を変えることによりこれらの領域をカバーするように設計された。ＰＫＤ２エクソン−イントロン構造はスケールに合わせて示される。 ＮＭ＿０００２９７に相応するＰＫＤ２のＲｅｆＳｅｑ Ｇｅｎｅの概略を図示する。イントロン５のイントロン保持率（ＰＩＲ）が詳述される。
１つを超えるイントロンを有するタンパク質コード遺伝子の一次転写産物に含まれる個々のイントロンは、異なる効率性で一次転写産物からスプライシングされる。ほとんどの場合、完全にスプライシングされたｍＲＮＡだけが、続く細胞質での翻訳のために核膜孔を通って輸送される。スプライシングされていない、あるいは部分的にスプライシングされた転写産物は、核内で検出可能である。完全にスプライシングされていない転写産物の核内蓄積は、タンパク質に翻訳されることもある、細胞質中の有害な恐れのあるｍＲＮＡの蓄積を防止するメカニズムであると一般的に考えられる。いくつかの遺伝子については、最も効率性の低いイントロンのスプライシングは、細胞質での翻訳に先立ち、遺伝子発現における律速的な転写後の工程である。
遺伝病である多発性嚢胞腎で不足しているＰＣ−２タンパク質をコードする、かなりのレベルの部分的にスプライシングされたＰＫＤ２遺伝子の転写産物が、ヒト細胞の核内で発見されている。これらのＰＫＤ２ ｍＲＮＡ前駆体種は少なくとも１つの保持されたイントロンを含む。本発明は、完全にスプライシングされた成熟ｍＲＮＡの定常状態の産生と翻訳されたＰＣ−２タンパク質レベルを増加させるための、遺伝子発現の核段階において律速的である１つ以上の保持されたＰＫＤ２イントロンのスプライシングを増加させるための組成物と方法を提供する。これらの組成物および方法は、核に蓄積する保持されたイントロン含有ＰＫＤ２ ｍＲＮＡ前駆体のイントロンスプライス部位における構成的スプライシングを促進するアンチセンスオリゴマー（ＡＳＯ）を活用する。したがって、実施形態では、ＰＣ−２欠損症に起因する疾病を処置するために、本発明の方法を用いてＰＣ−２タンパク質を増加させる。
他の実施形態では、必要とする被験体の疾病を処置するために、本発明の方法を使用してＰＣ−２産生を増加させる。実施形態では、被験体は、ＰＣ−２が野性型に対して必ずしも不足していないが、それにも関わらずＰＣ−２の増加が疾病を緩和する疾病を有する。実施形態では、疾病はＰＣ−２ハプロ不全によって引き起こされる。
多発性嚢胞腎
多発性嚢胞腎（ＰＫＤ）は、腎嚢胞の発達および様々な腎外の症状発現に特徴づけられる常染色体優性多系統障害である（Ｔｏｒｒｅｓ ａｎｄ Ｈａｒｒｉｓ， ２００９）。主たる臨床的および病理的所見は、腎嚢胞の発達および腫脹に起因する腎疾患であり、それは結果として嚢腫体積の増加と直接関連する腎臓体積の増加のような、腎臓の症状発現をもたらす。他のＰＫＤ発現は、高血圧症、内皮の血管拡張、収縮性の一酸化窒素合成酵素活性、多発性肝嚢胞症、頭蓋内動脈瘤、胸部大動脈解離、および冠動脈瘤を含む脈管の症状発現、年齢７０までに末期腎疾患（ＥＳＲＤ）へと至る進行性の腎不全を含む。胎児の超音波検査を用いることで、子宮内で、あるいは出生時に、ＰＫＤを診断することができるが、ＰＫＤは一般的に腎臓の超音波によって判定される腎嚢胞の検出により老年期に診断される。世界的なＰＫＤ有病率は、〜１．２男女比率で、１：４００から１：１０００の間にあると推測される（Ｔｏｒｒｅｓ ａｎｄ Ｈａｒｒｉｓ， ２００９）。
ＰＫＤ１あるいはＰＫＤ２遺伝子いずれかの突然変異は、ＰＫＤを引き起こすと報告されている。ＰＫＤ１の突然変異は典型的に、ＰＫＤ２よりも若年期に発現し（ＥＳＲＤ時の年齢はそれぞれ、ＰＫＤ１は５４．３、ＰＫＤ２は７４．０）、結果として、典型的により若年期の嚢腫発現に起因するより重篤な疾病状態をもたらす（Ｔｏｒｒｅｓ ａｎｄ Ｈａｒｒｉｓ， ２００９）。病態生理学におけるこの違いゆえに、ＰＫＤの遅発性の形態は、一般的にＰＫＤ２遺伝子中の突然変異から発生する。ＰＫＤ２は、ＰＣ−２タンパク質、繊毛モチーフのある短いＮ末端細胞質領域を含む９６８アミノ酸タンパク質、６つの膜貫通領域、および短いＣ末端部分をコードする。ＰＫＤ２遺伝子のヒトゲノム配列は、ＮＣＢＩ Ｇｅｎｅ ＩＤ ５３１１に明らかにされており、タンパク質はＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ：Ｑ１３５６３−１に明らかにされており、例えば、Ｍｏｔｃｈｉｚｕｋｉ Ｔ，ｅｔ ａｌ．，１９９６，“ＰＫＤ２，ａ ｇｅｎｅ ｆｏｒ ｐｏｌｙｃｙｓｔｉｃ ｋｉｄｎｅｙ ｄｉｓｅａｓｅ ｔｈａｔ ｅｎｃｏｄｅｓ ａｎ ｉｎｔｅｇｒａｌ ｍｅｍｂｒａｎｃｅ ｐｒｏｔｅｉｎ，”Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７２：１３３９−１３４２に記載され、参照により本明細書に組み込まれる。ＰＫＤ２ ｍＲＮＡ配列は、ＮＣＢＩ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ：ＮＭ＿０００２９７．３．２に明らかにされており、Ｙａｎｇ Ｙ，ｅｔ ａｌ．，２０１５，“Ｏｌｉｇｏｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｐｏｌｙｃｙｓｔｉｎ−２ Ｃ−ｔｅｒｍｉｎａｌ ｔａｉｌ ａｎｄ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｎ ｉｔｓ Ｃａ２＋ ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ，”Ｊ．Ｂｉｏ Ｃｈｅｍ．２９０（１６），１０５４４−１０５５４に記載され、いずれの文献も参照により本明細書に組み込まれる。ＰＫＤ２における突然変異は、最も蔓延している遺伝性の嚢胞性腎疾患である遅発性常染色体優性ＰＫＤ（ＡＤＰＫＤ）をもたらす。
ＰＫＤ２遺伝子は、１５のエクソンから成り、染色体４ｐ２２．１に位置する。ＰＫＤにおけるＰＫＤ２の突然変異はＡＤＰＫＤ Ｍｕｔａｔｉｏｎ Ｄａｔａｂａｓｅ（ＰＫＤ Ｆｏｕｎｄａｎｔｉｏｎ，８３３０ Ｗａｒｄ Ｐａｒｋｗａｙ，Ｓｕｉｔｅ ５１０，Ｋａｎｓａｓ Ｃｉｔｙ，ＭＯ ６４１１４により管理）で報告されたように、ＰＫＤ２の９５の短縮型変異を伴い、全タンパク質に広がる。ＰＫＤ２におけるホモ接合の不足は、出生と適合しないと予測されるため、ハプロ不全はＡＤＰＫＤ疾患の発現をもたらすもっとも有力なメカニズムである（Ｔｏｒｒｅｓ ａｎｄ Ｈａｒｒｉｓ， ２００９）。ナンセンスおよび挿入／欠失などの突然変異は、一般的なＡＤＰＫＤ２表現型表示機能ハプロ不全に関連する。結果としてＰＣ−２−Ｄ５１１Ｖタンパク質発現をもたらすＰＫＤミスセンス変異は、安定性の観点から、野生型ＰＣ−２と判別不能であると予測された（Ｒｅｙｎｏｌｄｓ，ｅｔ ａｌ．，１９９９，Ｊ．Ａｍ．Ｓｏｃ．Ｎｅｐｈｒｏｌ．１０：２３４２−２３５１）。ＰＣ−２−Ｄ５１１Ｖ変異体は、その安定性にもかかわらず、イオンチャネルとして作用する能力の予測された崩壊が原因で、機能不全を示した。したがって、初期活性が崩壊させられた場合、安定した変異体であっても表現型を引き起こす場合がある。その疾患は、例えば、参照により本明細書に組み込まれるＯＭＩＭ＃６１３０９５（Ｏｎｌｉｎｅ Ｍｅｎｄｅｌｉａｎ Ｉｎｈｅｒｉｔａｎｃｅ ｉｎ Ｍａｎ，Ｊｏｈｎｓ Ｈｏｐｋｉｎｓ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，１９６６−２０１５）に記載されている。
保持されたイントロン含有ｍＲＮＡ前駆体（ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体）
実施形態では、本明細書に開示される方法は、細胞核内でＰＫＤ２遺伝子から転写され、ＰＣ−２タンパク質をコードする、保持されたイントロン含有ｍＲＮＡ前駆体（ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体）の存在を活用する。成熟し、完全にスプライシングされたＰＫＤ２ ｍＲＮＡを産生するための、特定されたＰＫＤ２ ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体種のスプライシングは、保持されたイントロンのスプライシングアウトを刺激するＡＳＯを用いて誘発される。結果としてもたらされる成熟ＰＫＤ２ ｍＲＮＡは、細胞質に輸送され翻訳されうる。それによって被験体の細胞中のＰＣ−２タンパク質量を増加させ、多発性嚢胞腎疾患の症状を緩和する。この方法は以下でさらに詳述されるが、核内遺伝子出力の標的とされた増強（ＴＡＮＧＯ）として知られる。
ＰＫＤ２核の転写産物
本明細書の実施例に記載されるように、ＰＫＤ２遺伝子はイントロン保持事象に対して分析を施され、イントロン５の保持が観察された。ＵＣＳＣゲノムブラウザによって視覚化されたＲＮＡ配列決定（ＲＮＡｓｅｑ）は、腎臓の上皮細胞に発現したＰＫＤ２転写産物を示し、細胞質あるいは核分画のいずれかに局在した。いずれの分画においても、読み取りは大多数のイントロンにおいて観察されなかった。しかしながら、細胞質分画と比較してより高い読み取り密度が、核分画のイントロン５に対して検知され、これはイントロン５のスプライシング効率が低く、結果としてイントロン保持をもたらすことを示す。保持されたイントロン含有ｍＲＮＡ前駆体の転写産物は、主として核内に蓄積し、ＰＣ−２タンパク質に翻訳されない。イントロン５の読み取り密度は、１８％のイントロン保持を示した（図５）。イントロン５のイントロン保持率（ＰＩＲ）の値は、４つの値（２３、１３、２２および１４）を平均化することにより得られた。それぞれの値は、４つの異なるアルゴリズムのうちの１つを使用して、腎臓の上皮細胞において決定された。イントロン保持事象を特定するための、ＥＮＣＯＤＥデータの分析（例えば、Ｔｉｌｇｎｅｒ，ｅｔ ａｌ．，２０１２，“Ｄｅｅｐ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｏｆ ｓｕｂｃｅｌｌｕｌａｒ ＲＮＡ ｆｒａｃｔｉｏｎｓ ｓｈｏｗｓ ｓｐｌｉｃｉｎｇ ｔｏ ｂｅ ｐｒｅｄｏｍｉｎａｎｔｌｙ ｃｏ−ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ ｉｎ ｔｈｅ ｈｕｍａｎ ｇｅｎｏｍｅ ｂｕｔ ｉｎｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｆｏｒ ｌｎｃＲＮＡｓ、”Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ２２（９）：１６１６−２５に記載）は、イントロン５を保持されたものとして判定しなかった。
いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるＡＳＯは、ＰＫＤ２ゲノム配列から転写されたＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体を標的とする。いくつかの実施形態では、ＡＳＯは、保持されたイントロン５を含むＰＫＤ２のゲノム配列からのＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体の転写産物を標的とする。いくつかの実施形態では、ＡＳＯは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１のＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体の転写産物を標的とする。いくつかの実施形態では、ＡＳＯは、保持されたイントロン５を含むＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１のＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体の転写産物を標的とする。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるＡＳＯは、ＰＫＤ２ ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体配列を標的とする。いくつかの実施形態では、ＡＳＯは、保持されたイントロン５を含むＰＫＤ２ ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体配列を標的とする。いくつかの実施形態では、ＡＳＯは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２で示されるＰＫＤ２ ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体配列を標的とする。いくつかの実施形態では、ＡＳＯは、保持されたイントロン５を含むＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２で示されるＰＫＤ２ ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体配列を標的とする。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるＡＳＯは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２８１を標的とする。いくつかの実施形態では、ＡＳＯは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３−２８０で示されるいずれか１つの配列を有する。
いくつかの実施形態では、ＡＳＯは、保持されたイントロン５を含むＰＫＤ２ ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体のエクソン５を標的とする。いくつかの実施形態では、ＡＳＯは、保持されたイントロン５を含むＰＫＤ２ ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体の５’スプライス部位よりも上流（あるいは５’）のエクソン５配列を標的とする。いくつかの実施形態では、ＡＳＯは、保持されたイントロン５を含むＰＫＤ２ ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体の５’スプライス部位よりも約４から約２０４のヌクレオチド上流（あるいは５’）のエクソン配列を標的とする。いくつかの実施形態では、ＡＳＯは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３−４３で示されるいずれか１つの配列を有する。
いくつかの実施形態では、ＡＳＯは、保持されたイントロン５を含むＰＫＤ２ ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体内のイントロン５を標的とする。いくつかの実施形態では、ＡＳＯは、保持されたイントロン５を含むＰＫＤ２ ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体の５’スプライス部位よりも下流（あるいは３’）のイントロン５配列を標的とする。いくつかの実施形態では、ＡＳＯは、保持されたイントロン５を含むＰＫＤ２ ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体の５’スプライス部位よりも約６から約４９７のヌクレオチド下流（あるいは３’）の、イントロン５配列を標的とする。いくつかの実施形態では、ＡＳＯは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４４−１４０で示されるいずれか１つの配列を有する。
いくつかの実施形態では、ＡＳＯは、保持されたイントロン５を含むＰＫＤ２ ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体の３’スプライス部位よりも上流（あるいは５’）のイントロン５配列を標的とする。いくつかの実施形態では、ＡＳＯは、保持されたイントロン５を含むＰＫＤ２ ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体の３’スプライス部位よりも約１６から約４９６のヌクレオチド上流（あるいは５’）のイントロン５配列を標的とする。いくつかの実施形態では、ＡＳＯは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４１−２３７で示されるいずれか１つの配列を有する。
いくつかの実施形態では、ＡＳＯは、保持されたイントロン５を含むＰＫＤ２ ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体内のエクソン６を標的とする。いくつかの実施形態では、ＡＳＯは、保持されたイントロン５を含むＰＫＤ２ ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体の３’スプライス部位よりも下流（あるいは３’）のエクソン６配列を標的とする。いくつかの実施形態では、ＡＳＯは、保持されたイントロン５を含むＰＫＤ２ ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体の３’スプライス部位よりも約２から約２１２のヌクレオチド下流（あるいは３’）のエクソン６配列を標的とする。いくつかの実施形態では、ＡＳＯは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３８−２８０で示されるいずれか１つの配列を有する。
実施形態では、ＰＫＤ２ ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体の標的部分はイントロン５にある。本明細書で使用されるＰＫＤ２イントロンの番号付けは、ＮＭ＿０００２９７．３におけるｍＲＮＡ配列に相当する。実施形態では、ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体の標的部分へのＡＳＯのハイブリダイゼーションは、結果として、保持されたイントロン５のスプライス部位（５’スプライス部位あるいは３’スプライス部位）におけるスプライシングの増強と、その後のＰＣ−２タンパク質産生の増加をもたらす。異なるＰＫＤ２ ｍＲＮＡアイソフォーム配列を参照することで、イントロンの番号付けは変更しうると解される。当業者は、本明細書で提供されるイントロン配列に基づき、あるいはＮＭ＿０００２９７．３におけるｍＲＮＡ配列を参照して得られるイントロン番号を使用することで、任意のＰＫＤ２アイソフォームにおいて対応するイントロン番号を判定することができる。当業者はさらに、本明細書で提供されるイントロン配列に基づき、あるいはＮＭ＿０００２９７．３におけるｍＲＮＡ配列を参照して得られるイントロン番号を使用することで、本発明の方法を使用して標的とする任意のＰＫＤ２アイソフォームの隣接するエクソンの配列を判定することができる。実施形態では、本発明の組成物および方法は、例えば参照により本明細書に組み込まれた、Ｇｅｎｅ ＩＤ ５３１１でのＮＣＢＩ Ｇｅｎｅ ＩＤデータベース（生体および科学の情報のＮＣＢＩリポジトリ、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ， Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｌｉｂｒａｒｙ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ， ８６００ Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ Ｐｉｋｅ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ ＵＳＡ ２０８９４によって運営される）に記載される等の、任意の既知のＰＫＤ２アイソフォームの発現を増加させるために使用される。
ＰＣ−２タンパク質発現
上述したように、ＡＤＰＫＤにおけるＰＣ−２突然変異はＡＤＰＫＤ Ｍｕｔａｔｉｏｎ Ｄａｔａｂａｓｅ（ＰＫＤ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ）で報告されたように、９５ ＰＣ−２短縮型変異を伴い、全タンパク質に広がる。
実施形態では、本明細書において記載される方法は、機能的ＰＣ−２タンパク質産生を増加させるために使用される。本明細書において使用される用語「機能的」は、例えば多発性嚢胞腎のような、処置される疾病の１つ以上の症状を除去するのに必要な活性または量未満の、ＰＣ−２タンパク質の活性あるいは機能の量を指す。実施形態では、部分的機能的ＰＣ−２タンパク質産生を増加させるために、前記方法は使用される。本明細書において使用される「部分的機能的」の用語は、疾患または疾病の１つ以上の症状を除去あるいは予防するために必要なＰＣ−２タンパク質の活性あるいは機能の量を指す。いくつかの実施形態では、部分的機能的タンパク質あるいはＲＮＡは、完全な機能的タンパク質あるいはＲＮＡに比して、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、８５％、少なくとも９０％、あるいは少なくとも９５％少ない活性を持つだろう。
実施形態では、該方法は、ＰＣ−２タンパク質をコードするＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体を有する被験体の細胞によって、ＰＣ−２タンパク質の発現を増加させる方法であり、該被験体は、ＰＣ−２タンパク質活性の量の不足に起因する多発性嚢胞腎を有し、および該ＰＣ−２タンパク質量の不足は、ＰＣ−２タンパク質のハプロ不全に起因する。そのような実施形態では、被験体は、機能的ＰＣ−２タンパク質をコードする第１の対立遺伝子と、ＰＣ−２タンパク質が産生されない第２の対立遺伝子を有する。別のそのような実施形態では、被験体は、機能的ＰＣ−２タンパク質をコードする第１の対立遺伝子と、非機能的ＰＣ−２タンパク質をコードする第２の対立遺伝子を有する。別のそのような実施形態では、被験体は、機能的ＰＣ−２タンパク質をコードする第１の対立遺伝子と、部分的機能的ＰＣ−２タンパク質をコードする第２の対立遺伝子を有する。これらの実施形態のいずれの場合でも、アンチセンスオリゴマーは、第１の対立遺伝子（機能的ＰＣ−２タンパク質をコードする）から転写されたＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体の標的部分に結合し、それによって、ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体からの保持されたイントロンの構成的スプライシングを誘発し、機能的ＰＣ−２タンパク質をコードする成熟ｍＲＮＡレベルの増加と、被験体の細胞中のＰＣ−２タンパク質発現の増加をもたらす。
実施形態では、被験体は、機能的ＰＣ−２タンパク質をコードする第１の対立遺伝子と、部分的機能的ＰＣ−２タンパク質をコードする第２の対立遺伝子を有し、アンチセンスオリゴマーは、第１の対立遺伝子（機能的ＰＣ−２タンパク質をコードする）から転写されたＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体の標的部分、または第２の対立遺伝子（部分的機能的ＰＣ−２タンパク質をコードする）から転写されたＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体の標的部分に結合し、それによって、ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体からの保持されたイントロンの構成的スプライシングを誘発し、機能的ＰＣ−２タンパク質をコードする成熟ｍＲＮＡレベルの増加と、被験体の細胞中の機能的あるいは部分的機能的ＰＣ−２タンパク質発現の増加をもたらす。
関連する実施形態では、該方法は、タンパク質あるいは機能的ＲＮＡの発現を増加させるためにＡＳＯを用いる方法である。実施形態では、ＡＳＯは、ＰＣ−２タンパク質をコードするＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体を有する被験体の細胞中のＰＣ−２タンパク質発現を増加させるために使用され、該被験体は、ＰＣ−２タンパク質の量または機能の不足、例えば多発性嚢胞腎を有する。
実施形態では、疾患または疾病の原因となる、タンパク質をコードするＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体の転写産物は、本明細書に記載されるＡＳＯによって標的化される。いくつかの実施形態では、疾患の原因ではない、タンパク質をコードするＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体の転写産物は、ＡＳＯによって標的化される。例えば、特定の経路における第１のタンパク質の突然変異または不足の結果として生じる疾患は、第２のタンパク質をコードするＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体を標的とすることによって改善され得、それによって第２のタンパク質産生は増加する。いくつかの実施形態では、第２のタンパク質の機能は、第１のタンパク質の突然変異または不足を補うことができる。
実施形態では、被験体は：
（ａ）（ｉ）ＰＣ−２タンパク質が、野生型対立遺伝子からの産生と比較して、減少したレベルで産生され、
（ｉｉ）ＰＣ−２タンパク質が、同等の野性型タンパク質と比較して機能が低下した形態で産生され、あるいは
（ｉｉｉ）ＰＣ−２タンパク質または機能的ＲＮＡが産生されない、第１の変異対立遺伝子；および
（ｂ）（ｉ）ＰＣ−２タンパク質が、野生型対立遺伝子からの産生と比較して、減少したレベルで産生され、
（ｉｉ）ＰＣ−２タンパク質が、同等の野性型タンパク質と比較して機能が低下した形態で産生され、あるいは
（ｉｉｉ）ＰＣ−２タンパク質が産生されない、第２の変異対立遺伝子を有し、ここで、
ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体は、第１の対立遺伝子および／または第２の対立遺伝子から転写される。これらの実施形態では、ＡＳＯは、第１の対立遺伝子または第２の対立遺伝子から転写されたＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体の標的部分に結合することで、ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体からの保持されたイントロンの構成的スプライシングを誘発し、ＰＣ−２タンパク質をコードするｍＲＮＡレベルの増加を引き起こし、被験体の細胞中の標的タンパク質または機能的ＲＮＡの発現の増加をもたらす。
これらの実施形態では、ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体からの保持されたイントロンの構成的スプライシングの結果として生じる、発現レベルの増加を有する標的タンパク質あるいは機能的ＲＮＡは、同等の野性型タンパク質と比較して機能性の低い形態（部分的機能的）、あるいは同等の野性型タンパク質と比較して完全な機能性を有する形態（完全機能的）、のいずれかであり得る。
実施形態では、ＰＣ−２タンパク質をコードするｍＲＮＡのレベルは、例えば、アンチセンスオリゴマーで処置されない、あるいはＰＫＤ２ ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体の標的部分と結合しないアンチセンスオリゴマーで処置された、対照細胞内で産生されたＰＣ−２をコードするｍＲＮＡの量と比較した場合、１．１倍から１０倍に増加する。
実施形態では、ＰＣ−２タンパク質の量あるいは活性の不足に起因する疾病は、ＡＳＯが標的とされる保持されたイントロンの選択的スプライシングあるいは異常スプライシングに起因する疾病ではない。実施形態では、ＰＣ−２タンパク質の量あるいは活性の不足に起因する疾病は、ＰＣ−２タンパク質をコードするＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体内の保持されたイントロンの、選択的スプライシングあるいは異常スプライシングに起因する疾病ではない。実施形態では、選択的スプライシングあるいは異常スプライシングが、遺伝子から転写されたｍＲＮＡ前駆体に生じうる。しかしながら、本発明の組成物および方法は、ｍＲＮＡ前駆体内の選択的スプライシングあるいは異常スプライシングを予防しないし、修正しない。
実施形態では、本発明の方法を使用して処置された被験体は、１つの対立遺伝子から部分的機能的ＰＣ−２タンパク質を発現し、その部分的機能的ＰＣ−２タンパク質は、フレームシフト変異、ナンセンス変異、ミスセンス変異、あるいは部分的な遺伝子欠失に起因する。実施形態では、本発明の方法を使用して処置された被験体は、１つの対立遺伝子から非機能的ＰＣ−２タンパク質を発現し、その非機能的ＰＣ−２タンパク質は、１つの対立遺伝子中の、フレームシフト変異、ナンセンス変異、ミスセンス変異、あるいは部分的な遺伝子欠失に起因する。実施形態では、本発明の方法を用いて処置された被験体は、１つの対立遺伝子にＰＫＤ２全遺伝子欠失を有する。
実施形態では、被験体は、Ｍ１Ｋ、Ｐ２４Ｌ、Ｒ２８Ｐ、Ａ３５Ｄ、Ｒ６０Ｎ、Ｓ８０Ｌ、Ｑ１０７Ｄ、Ｒ１１９Ｈ、Ｇ１２１Ａ、Ｇ１３５Ｖ、Ａ１４７Ｖ、Ａ１９０Ｔ、Ｖ２６２Ｍ、Ｗ２９２Ｃ、Ｒ３０６Ｑ、Ｌ３１４Ｖ、Ｒ３２２Ｗ、Ｒ３２２Ｑ、Ｒ３２５Ｐ、Ｒ３２５Ｑ、Ｃ３３１Ｓ、Ｓ３３２Ａ、Ｙ３２４Ｃ、Ｓ３４９Ｐ、Ａ３５６Ｐ、Ａ３８４Ｐ、Ｇ３９０Ｓ、Ｗ４１４Ｇ、Ｇ４１８Ｖ、Ｔ４１９Ａ、Ｒ４２０Ｇ、Ａ４２１Ｓ、Ｒ４４０Ｓ、Ｔ４４８Ｋ、Ｉ４５２Ｖ、Ｆ４８２Ｃ、Ｙ４８７Ｈ、Ｄ５１１Ｖ、Ｖ５１６Ｌ、Ｌ５１７Ｒ、Ｖ５１９Ｍ、Ａ５５２Ｐ、Ｉ５５６Ｖ、Ｎ５７８Ｄ、Ｎ５８０Ｋ、Ｍ５８３Ｉ、Ａ６１５Ｔ、Ｆ６２９Ｓ、Ｃ６３２Ｒ、Ｒ６３８Ｃ、Ｌ６５６Ｗ、Ｌ７１５Ｉ、Ｉ７５８Ｖ、Ｒ７９８Ｃ、Ｍ８００Ｌ、Ｓ８０４Ｎ、Ｒ８０７Ｑ、Ｒ８４８Ｑ、Ｄ８８６Ｇ、Ｒ８９３Ｇ、Ｖ９０９Ｉ、Ｄ９１９Ｎ、Ｔ９３１Ｍ、Ｒ９４５Ｈ、あるいはＳ９４９Ｆから選択されたＰＣ−２ミスセンス変異を有する。実施形態では、被験体は、ＥＸ１＿ＥＸ１３ｄｅｌ、ＩＶＳ２＿３’（ＡＢＣＧ２）ｄｅｌ８０ｋｂ＊、ＩＶＳ２＿３’（ＡＢＣＧ２）ｄｅｌ９８ｋｂ、ＩＶＳ４＋１４５２＿ＩＶＳ５−９６５ｄｅｌ５７２２、Ｓ３７８ｄｅｌ、Ｆ６０５ｄｅｌ、ＩＶＳ９＿３’ｄｅｌ２８ｋｂ、２１８２＿２１８３ｄｅｌＡＧ、Ｌ７３６＿Ｎ７３７ｄｅｌ２、またはＲ８７８ｄｅｌから選択されたＰＣ−２欠失突然変異を有する。実施形態では、被験体はＰＣ−２重複突然変異Ｅｘ３ｄｕｐ＊を有する。実施形態では、当技術分野において既知の、あるいは、例えばＣｈａｎｇ，ｅｔ ａｌ．，２００５，Ｒｅｎ Ｆａｉｌ ２７：９５−１００の文献に記載された任意のＰＣ−２突然変異を有する被験体が、本発明の方法および組成物を用いて処置される。
ＰＣ−２タンパク質発現を増加させるためのＴＡＮＧＯの使用
前述したように、実施形態では、核内遺伝子出力の標的とされた増強（ＴＡＮＧＯ）は、ＰＣ−２タンパク質の発現を増加させるために、本発明の方法において使用される。これらの実施形態では、ＰＣ−２タンパク質をコードする保持されたイントロン含有ｍＲＮＡ前駆体（ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体）は、細胞の核内にある。ＰＣ−２タンパク質をコードする、保持されたイントロン、５’スプライス部位に隣接するエクソン、および３’スプライス部位に隣接するエクソンを含むＰＫＤ２ ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体を有する細胞を、ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体の標的部分に対して相補的な、アンチセンスオリゴマー（ＡＳＯ）と接触させる。ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体の標的部分へのＡＳＯのハイブリダイゼーションは、保持されたイントロンのスプライス部位（５’スプライス部位あるいは３’スプライス部位）のスプライシングを増強し、その後の標的タンパク質産生を増加させる。
用語「ｍＲＮＡ前駆体」および「ｍＲＮＡ前駆体の転写産物」は、交換可能に使用され、少なくとも１つのイントロンを含むｍＲＮＡ前駆体種を指す。実施形態では、ｍＲＮＡ前駆体またはｍＲＮＡ前駆体の転写産物は、５’−７−メチルグアノシンキャップ、および／またはポリＡ末端を含む。実施形態では、ｍＲＮＡ前駆体またはｍＲＮＡ前駆体の転写産物は、５’−７−メチルグアノシンキャップおよびポリＡ末端の両方を含む。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡ前駆体の転写産物は、５’−７−メチルグアノシンキャップ、および／またはポリＡ末端を含まない。タンパク質に翻訳されない場合（あるいは核から細胞質へと輸送された場合）、ｍＲＮＡ前駆体の転写産物は非生産的メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）分子である。
本明細書において使用されるように、「保持されたイントロン含有ｍＲＮＡ前駆体」（「ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体」）は、少なくとも１つの保持されたイントロンを含むｍＲＮＡ前駆体の転写産物である。ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体は、保持されたイントロン、保持されたイントロンの５’スプライス部位に隣接するエクソン、保持されたイントロンの３’スプライス部位に隣接するエクソンを含み、標的タンパク質をコードする。「標的タンパク質をコードするＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体」は、完全にスプライシングされた場合に、標的タンパク質をコードすると解される。「保持されたイントロン」は、同じ遺伝子によってコードされた、隣接するイントロン等の１つ以上の他のイントロンが、同じｍＲＮＡ前駆体の転写産物からスプライシングアウトされた場合に、ｍＲＮＡ前駆体の転写産物に存在するイントロンである。いくつかの実施形態では、保持されたイントロンは、標的タンパク質をコードするＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体において最も豊富なイントロンである。実施形態では、保持されたイントロンは、細胞内の標的タンパク質をコードする遺伝子から転写されたＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体の集団において最も豊富なイントロンであり、当該ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体の集団は２つ以上の保持されたイントロンを含む。実施形態では、標的タンパク質をコードするＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体の集団において最も豊富なイントロンに標的とされたアンチセンスオリゴマーは、アンチセンスオリゴマーが標的とされた、あるいは結合する保持されたイントロンを含む集団内の、２つ以上の保持されたイントロンのスプライシングアウトを誘発する。実施形態では、標的タンパク質をコードする成熟ｍＲＮＡは、それによって産生される。「成熟ｍＲＮＡ」および「完全にスプライシングされたｍＲＮＡ」の用語は、標的タンパク質をコードする完全に処理されたｍＲＮＡ（例えば、核から細胞質へと輸送され、標的タンパク質に翻訳されたｍＲＮＡ）、あるいは完全に処理された機能的ＲＮＡを記載するように、本明細書において交換可能に使用される。用語「生産的ｍＲＮＡ」もまた、標的タンパク質をコードする完全に処理されたｍＲＮＡについて記載するように使用することができる。実施形態では、標的領域は、ＰＣ−２タンパク質をコードするＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体に最も豊富に存在するイントロンである、保持されたイントロンにある。実施形態では、ＰＣ−２タンパク質をコードするＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体に最も保持されたイントロンは、イントロン５である。
実施形態では、保持されたイントロンは、少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、あるいは少なくとも約５０％の保定の保持率に基づき、保持されたイントロンとして特定されたイントロンである。実施形態では、保持されたイントロンは、約５％から約１００％、約５％から約９５％、約５％から約９０％、約５％から約８５％、約５％から約８０％、約５％から約７５％、約５％から約７０％、約５％から約６５％、約５％から約６０％、約５％から約５５％、約５％から約５０％、約５％から約４５％、約５％から約４０％、約５％から約３５％、約５％から約３０％、約５％から約２５％、約５％から約２０％、約５％から約１５％、約１０％から約１００％、約１０％から約９５％、約１０％から約９０％、約１０％から約８５％、約１０％から約８０％、約１０％から約７５％、約１０％から約７０％、約１０％から約６５％、約１０％から約６０％、約１０％から約５５％、約１０％から約５０％、約１０％から約４５％、約１０％から約４０％、約１０％から約３５％、約１０％から約３０％、約１０％から約２５％、約１０％から約２０％、約１５％から約１００％、約１５％から約９５％、約１５％から約９０％、約１５％から約８５％、約１５％から約８０％、約１５％から約７５％、約１５％から約７０％、約１５％から約６５％、約１５％から約６０％、約１５％から約５５％、約１５％から約５０％、約１５％から約４５％、約１５％から約４０％、約１５％から約３５％、約１５％から約３０％、約１５％から約２５％、約２０％から約１００％、約２０％から約９５％、約２０％から約９０％、約２０％から約８５％、約２０％から約８０％、約２０％から約７５％、約２０％から約７０％、約２０％から約６５％、約２０％から約６０％、約２０％から約５５％、約２０％から約５０％、約２０％から約４５％、約２０％から約４０％、約２０％から約３５％、約２０％から約３０％、約２５％から約１００％、約２５％から約９５％、約２５％から約９０％、約２５％から約８５％、約２５％から約８０％、約２５％から約７５％、約２５％から約７０％、約２５％から約６５％、約２５％から約６０％、約２５％から約５５％、約２５％から約５０％、約２５％から約４５％、約２５％から約４０％、あるいは約２５％から約３５％の、保定の保持率に基づき、保持されたイントロンとして特定されたイントロンである。
本明細書において使用されるように、用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、あるいは「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」または「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」等の変化形は、列挙された特徴（例えば、アンチセンスオリゴマーの場合、定義された核酸塩基配列）を含むが、他のいかなる特徴をも除外しないことを示すと解されるべきである。したがって、本明細書において使用されるように、用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」は包含的で、追加の列挙されていない特徴（例えば、アンチセンスオリゴマーの場合、追加の列挙されていない核酸塩基の存在）を除外しない。
本明細書において提供される組成物および方法のいずれかの実施形態において、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」は「から本質的に成る（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ）」または「から成る（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ）」と置換可能である。「から本質的に成る（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ）」という句は、特定された特徴（例えば核酸塩基配列）と共に、請求される本発明の性質または機能に実質的に影響しない特徴も必要とするために本明細書で使用される。本明細書で使用されるように、用語「成る（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ）」は、列挙された特徴（例えば核酸塩基配列）単独の存在を示すために使用される（その結果、特定された核酸塩基配列から成るアンチセンスオリゴマーの場合には、追加の列挙されていない核酸塩基の存在は除外される）。
実施形態では、ＡＳＯは、ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体において保持されていないイントロン内にある標的領域に相補的である。実施形態では、ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体の標的部分は、保持されていないイントロンの５’スプライス部位に対して＋６から＋１００の領域；または保持されていないイントロンの３’スプライス部位に対して−１６から−１００の領域内にある。実施形態では、ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体の標的部分は、保持されていないイントロンの５’スプライス部位に対して＋１００の領域から、保持されていないイントロンの３’スプライス部位に対して−１００の領域内にある。領域または配列の場所を特定するために使用されるように、「内（ｗｉｔｈｉｎ）」は、列挙される位置で残基を含むように理解される。例えば、＋６から＋１００の領域は、位置＋６および＋１００で残基を含む。それによって、実施形態では、標的タンパク質をコードする完全にスプライシングされた（成熟）ＲＮＡが産生される。
実施形態では、ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体の保持されたイントロンは、非効率的にスプライシングされたイントロンである。本明細書で使用されるように、「非効率的にスプライシングされた」は、ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体における別のスプライス部位でのスプライシングの頻度と比較した、保持されたイントロンに隣接しているスプライス部位（５’スプライス部位または３’スプライス部位）でのスプライシングの比較的低い頻度を指し得る。用語「非効率的にスプライシングされた」はまた、スプライス部位でのスプライシングの相対速度または動態（ｋｉｎｅｔｉｃｓ）を指し得、ここで、「非効率的にスプライシングされた」イントロンは、ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体における別のイントロンと比較して、より遅い速度でスプライシングされ得るかまたは除去され得る。
実施形態では、５’スプライス部位に隣接しているエクソンの−３ｅから−１ｅおよび保持されたイントロンの＋１から＋６での９−ヌクレオチド配列は、対応する野生型配列と同一である。実施形態では、保持されたイントロンの−１５から−１および３’スプライス部位に隣接しているエクソンの＋１ｅでの１６ヌクレオチド配列は、対応する野生型配列と同一である。本明細書に使用されるように、「野生型配列」は、生体および科学の情報のＮＣＢＩリポジトリに寄託された公開された参照ゲノムにおけるＰＫＤ２遺伝子に対するヌクレオチド配列を指す。本明細書に使用されるように、「野生型配列」は、ＮＣＢＩ Ｇｅｎｅ ＩＤ５３１１で見られるＰＫＤ２遺伝子に対する標準配列を指す。また本明細書で使用されるように、「ｅ」で示されたヌクレオチド位置は、ヌクレオチドがエクソン（例えば、５’スプライス部位に隣接しているエクソンまたは３’スプライス部位に隣接しているエクソン）の配列中に存在することを示す。
該方法は、細胞を、ＰＣ−２タンパク質をコードするｍＲＮＡ前駆体の一部に相補的であるＡＳＯと接触させる工程であって、結果としてＰＣ−２の発現が増加する工程を含む。本明細書で使用されるように、「接触させる工程」または細胞に投与する工程は、ＡＳＯと細胞が相互作用するように、ＡＳＯを細胞に即座に近接させる方法を指す。ＡＳＯと接触させられる細胞は、ＡＳＯを細胞へと取り込むまたは輸送する。該方法は、疾病または疾患に関係するまたは疾病または疾患に関連する細胞を、本明細書に記載されるＡＳＯのいずれかと接触させる工程を含む。いくつかの実施形態では、ＡＳＯは、ＡＳＯを細胞型に対して標的とする、ＡＳＯと疾病または疾患に関係するまたは疾病または疾患に関連する細胞との間の接触を増強する、またはＡＳＯの取り込みを増強するために、さらに修飾され得るかまたは別の分子に結合され得る（例えば、共有結合される）。
本明細書で使用されるように、用語「タンパク質産生を増加させる」または「標的タンパク質の発現を増加させる」は、細胞においてｍＲＮＡから翻訳されるタンパク質の量を増加させることを意味する。「標的タンパク質」は、発現／産生の増加が望まれるタンパク質であり得る。
実施形態では、ＰＫＤ２ ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体を発現する細胞をＰＫＤ２ ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体の転写産物の標的部分に相補的であるＡＳＯと接触させる工程は、結果として、ｍＲＮＡ前駆体によってコードされたＰＣ−２タンパク質（例えば標的タンパク質）の量の測定可能な増加をもたらす。タンパク質の産生を測定または検出する方法は、当業者に明白となり、あらゆる既知の方法、例えば、ウェスタンブロッティング、フローサイトメトリー、免疫蛍光顕微鏡検査法、およびＥＬＩＳＡを含む。
実施形態では、細胞をＰＫＤ２ ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体の転写産物の標的部分に相補的であるＡＳＯと接触させる工程は、結果として、ＡＳＯの欠如／処置の欠如下における細胞によって産生されたタンパク質の量と比較して、少なくとも１０、２０、３０、４０、５０、６０、８０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、または１０００％の産生されたＰＣ−２タンパク質の量の増加をもたらす。実施形態では、アンチセンスオリゴマーが接触させられた細胞によって産生されたＰＣ−２タンパク質の合計量は、約１．１倍から約１０倍、約１．５倍から約１０倍、約２倍から約１０倍、約３倍から約１０倍、約４倍から約１０倍、約１．１倍から約５倍、約１．１倍から約６倍、約１．１倍から約７倍、約１．１倍から約８倍、約１．１倍から約９倍、約２倍から約５倍、約２倍から約６倍、約２倍から約７倍、約２倍から約８倍、約２倍から約９倍、約３倍から約６倍、約３倍から約７倍、約３倍から約８倍、約３倍から約９倍、約４倍から約７倍、約４倍から約８倍、約４倍から約９倍、少なくとも約１．１倍、少なくとも約１．５倍、少なくとも約２倍、少なくとも約２．５倍、少なくとも約３倍、少なくとも約３．５倍、少なくとも約４倍、少なくとも約５倍、または少なくとも約１０倍増加される。対照化合物は、例えば、ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体の標的部分に相補的でないオリゴヌクレオチドであり得る。
いくつかの実施形態では、細胞をＰＫＤ２ ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体の転写産物の標的部分に相補的であるＡＳＯと接触させる工程は、結果として、標的タンパク質をコードする成熟ｍＲＮＡを含む、ＰＣ−２をコードするｍＲＮＡの量の増加をもたらす。いくつかの実施形態では、ＰＣ−２タンパク質をコードするｍＲＮＡ、またはＰＣ−２タンパク質をコードする成熟ｍＲＮＡの量は、ＡＳＯの欠如／処置の欠如下における細胞によって産生されたタンパク質の量と比較して、少なくとも１０、２０、３０、４０、５０、６０、８０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、または１０００％増加される。実施形態では、アンチセンスオリゴマーが接触させられた細胞において産生されたＰＣ−２タンパク質をコードするｍＲＮＡ、またはＰＣ−２タンパク質をコードする成熟ｍＲＮＡの合計量は、未処理の細胞、例えば、未処理の細胞または対照化合物で処理された細胞において産生された成熟ＲＮＡの量と比較して、約１．１倍から約１０倍、約１．５倍から約１０倍、約２倍から約１０倍、約３倍から約１０倍、約４倍から約１０倍、約１．１倍から約５倍、約１．１倍から約６倍、約１．１倍から約７倍、約１．１倍から約８倍、 約１．１倍から約９倍、約２倍から約５倍、約２倍から約６倍、約２倍から約７倍、約２倍から約８倍、約２倍から約９倍、約３倍から約６倍、約３倍から約７倍、約３倍から約８倍、約３倍から約９倍、約４倍から約７倍、約４倍から約８倍、 約４倍から約９倍、少なくとも約１．１倍、少なくとも約１．５倍、少なくとも約２倍、少なくとも約２．５倍、少なくとも約３倍、少なくとも約３．５倍、少なくとも約４倍、少なくとも約５倍、 または少なくとも約１０倍増加される。対照化合物は、例えば、ＰＫＤ２ ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体の標的部分に相補的でないオリゴヌクレオチドであり得る。
＜ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体からの保持されたイントロンの構成的スプライシング＞
本明細書に提供される方法およびアンチセンスオリゴヌクレオチド組成物は、ＰＣ−２タンパク質をコードするｍＲＮＡ、またはＰＣ−２タンパク質をコードする成熟ｍＲＮＡのレベルを増加させることによって、例えば、ＰＣ−２タンパク質の量または活性の不足によって引き起こされた多発性嚢胞腎を有している被験体において細胞におけるＰＣ−２タンパク質の発現を増加させることに有用である。特に、本明細書に記載されるような方法および組成物は、ＰＣ−２タンパク質をコードするＰＫＤ２ ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体の転写産物から保持されたイントロンの構成的スプライシングを誘発し、それによって、ＰＣ−２タンパク質をコードするｍＲＮＡ、またはＰＣ−２タンパク質をコードする成熟ｍＲＮＡのレベルが増大し、ＰＣ−２タンパク質の発現が増大する。
ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体からの保持されたイントロンの構成的スプライシングは、保持されたイントロンをＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体から正しく除去し、ここで保持されたイントロンは、野生型スプライス配列を有する。構成的スプライシングは、本明細書で使用されるように、遺伝子または対立遺伝子から転写されたｍＲＮＡ前駆体の選択的スプライシングまたは異常スプライシングを引き起こす突然変異を有する遺伝子または対立遺伝子から転写されたＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体からの保持されたイントロンのスプライシングを包含しない。例えば、本明細書で提供される方法およびアンチセンスオリゴヌクレオチドを使用して誘発された、保持されたイントロンの構成的スプライシングは、ｍＲＮＡ前駆体における異常スプライシングを訂正しないか、またはｍＲＮＡ前駆体の選択的スプライシングに影響せず、結果的に標的タンパク質または機能性ＲＮＡの発現が増加される。
実施形態では、構成的スプライシングは、保持されたイントロンをＰＫＤ２ ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体から正しく除去し、ここでＰＫＤ２ ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体は、完全に機能的な標的タンパク質または機能性ＲＮＡをコードする、野生型遺伝子または対立遺伝子あるいは多形性遺伝子または対立遺伝子から転写され、遺伝子または対立遺伝子は、保持されたイントロンの選択的スプライシングまたは異常スプライシングを引き起こす突然変異を有さない。
いくつかの実施形態では、ＰＣ−２タンパク質をコードするＰＫＤ２ ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体からの保持されたイントロンの構成的スプライシングは、ＰＣ−２タンパク質をコードするＰＫＤ２ ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体から保持されたイントロンを正しく除去し、ここでＰＫＤ２ ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体は、遺伝子または対立遺伝子から転写され、そこから、標的遺伝子または機能性ＲＮＡが野生型対立遺伝子からの産生と比較して低下したレベルで産生され、および遺伝子または対立遺伝子は、保持されたイントロンの選択的スプライシングまたは異常スプライシングを引き起こす突然変異を有さない。これらの実施形態では、構成的にスプライシングした保持されたイントロンの正しい除去は、結果として、等価な野生型タンパク質または機能性ＲＮＡと比較したときに機能的である標的タンパク質または機能性ＲＮＡの産生をもたらす。
他の実施形態では、構成的スプライシングは、保持されたイントロンをＰＫＤ２ ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体から正しく除去し、ここでＰＫＤ２ ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体は、等価な野生型タンパク質または機能性ＲＮＡと比較して低下した機能を有する形態で産生された標的タンパク質または機能性ＲＮＡをコードする遺伝子または対立遺伝子から転写され、遺伝子または対立遺伝子は、保持されたイントロンの選択的スプライシングまたは異常スプライシングを引き起こす突然変異を有さない。これらの実施形態では、構成的にスプライシングした保持されたイントロンの正しい除去は、結果として、部分的に機能的な標的タンパク質、または等価な野生型タンパク質または機能性ＲＮＡと比較したときに部分的に機能的である機能性ＲＮＡの産生をもたらす。
構成的スプライシングによる保持されたイントロンの「正しい除去」は、エクソンの部分の除去がない、全イントロンの除去を指す。
実施形態では、本明細書に記載されるようなまたは本明細書に記載される方法に使用されるアンチセンスオリゴマーは、ＰＣ−２タンパク質をコードするｍＲＮＡの量またはＰＫＤ２遺伝子から転写されたｍＲＮＡ前駆体の選択的スプライシングまたは異常スプライシングを調節することによるＰＣ−２タンパク質の量を増加させない。選択的スプライシングまたは異常スプライシングの調節は、ＲＮＡ種の配列および長さを解析する既知の方法を使用して、例えば、ＲＴ−ＰＣＲによって、および本明細書および文献中で別記される方法を使用して測定することができる。実施形態では、選択的スプライシングまたは異常スプライシングの調節は、少なくとも１０％または１．１倍の対象のスプライシングされた種の量の増加または減少に基づいて判定される。実施形態では、調節は、本発明の方法においてＰＣ−２タンパク質をコードするｍＲＮＡの増加の判定に関して本明細書に記載されるように、少なくとも１０％から１００％または１．１倍から１０倍であるレベルでの増加または減少に基づいて判定される。
実施形態では、本明細書に記載される方法は、ＰＫＤ２ ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体が、野生型ＰＫＤ２ ｍＲＮＡ前駆体の部分的スプライシングによって産生された方法である。実施形態では、該方法は、ＰＫＤ２ ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体が、全長野生型ＰＫＤ２ ｍＲＮＡ前駆体の部分的スプライシングによって産生された方法である。実施形態では、ＰＫＤ２ ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体は、全長ＰＫＤ２ ｍＲＮＡ前駆体の部分的スプライシングによって産生された。これらの実施形態では、全長ＰＫＤ２ ｍＲＮＡ前駆体は、野生型スプライス部位配列を有する保持されたイントロンのスプライシングと比較して、保持されたイントロンの正しいスプライシングを損なわない保持されたイントロンのスプライス部位に多型性を有し得る。
実施形態では、ＰＣ−２タンパク質をコードするｍＲＮＡは、全長成熟ｍＲＮＡまたは野生型成熟ｍＲＮＡである。これらの実施形態では、全長成熟ｍＲＮＡは、野生型成熟ｍＲＮＡによってコードされたＰＣ−２タンパク質の活性と比較して、成熟ｍＲＮＡによってコードされた標的タンパク質または機能性ＲＮＡの活性に影響しない多型性を有し得る。
＜アンチセンスオリゴマー＞
本開示の一態様は、ＰＫＤ２ ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体の標的部分に結合することによってスプライシングを増強するアンチセンスオリゴマーを含む組成物である。本明細書で使用されるように、用語「ＡＳＯ」および「アンチセンスオリゴマー」は、交換可能に使用され、ワトソン・クリック塩基対またはゆらぎ塩基対（Ｇ−Ｕ）によって標的核酸（例えば、ＰＫＤ２ ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体）の配列にハイブリダイズする、核酸塩基を含む、ポリヌクレオチドなどのオリゴマーを指す。ＡＳＯは、標的配列に相補的なまたはほぼ相補性的である（例えば、標的配列に結合し、スプライス部位でスプライシングを増強させるのに十分な相補性）正確な配列を有し得る。ＡＳＯは、標的核酸（例えば、ｍＲＮＡ前駆体の転写産物の標的部分）に結合し（ハイブリダイズし）、生理学的条件下でハイブリダイズされたままであるように設計されている。典型的に、ＡＳＯは、意図した（標的とされた）核酸配列以外の部位にハイブリダイズする場合、標的核酸でない限られた数の配列に（標的核酸以外の少数の部位に）ハイブリダイズする。ＡＳＯの設計は、ｍＲＮＡ前駆体の転写産物の標的部分の核酸配列、またはゲノムまたは細胞ｍＲＮＡ前駆体またはトランスクリプトームにおける他の場所での十分類似した核酸配列の発生を考慮に入れることができ、その結果、ＡＳＯが他の部位に結合し「オフターゲット」効果を引き起こす可能性は限定される。例えば、発明の名称「Ｒｅｄｕｃｉｎｇ Ｎｏｎｓｅｎｓｅ−Ｍｅｄｉａｔｅｄ ｍＲＮＡ Ｄｅｃａｙ」のＷＯ２０１５／０３５０９１として公開されたＰＣＴ国際出願番号ＰＣＴ／ＵＳ２０１４／０５４１５１におけるものなどの、当業者に既知のアンチセンスオリゴマーは、本明細書に記載される方法を実施するために使用され得る。
いくつかの実施形態では、ＡＳＯは、標的核酸またはＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体の標的部分に「特異的にハイブリダイズする」または「特異的である」。典型的に、そのようなハイブリダイゼーションは、３７℃より実質的に高い融解温度（Ｔｍ）で、好ましくは少なくとも５０℃で、および典型的に６０℃からおよそ９０℃の間で生じる。そのようなハイブリダイゼーションは、好ましくは、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件に対応している。与えられたイオン強度およびｐＨで、Ｔｍは、標的配列の５０％が相補的オリゴヌクレオチドにハイブリダイズする温度である。
オリゴヌクレオチドなどのオリゴマーは、ハイブリダイゼーションが２つの一本鎖ポリヌクレオチド間の逆平行構成で生じるときに、互いに「相補的」である。二本鎖ポリヌクレオチドは、ハイブリダイゼーションが第１のポリヌクレオチドの鎖の１つと第２のポリヌクレオチドの鎖の１つとの間に生じる場合に、別のポリヌクレオチドに「相補的」であり得る。相補性（１つのポリヌクレオチドが別のポリヌクレオチドと相補的である程度）は、一般に容認された塩基対合則に従って、互いに水素結合を形成すると予期される対向する鎖における塩基の割合（例えばパーセンテージ）の点から数量化できる。アンチセンスオリゴマー（ＡＳＯ）の配列は、ハイブリダイズするその標的核酸の配列に１００％相補的である必要はない。特定の実施形態では、ＡＳＯは、標的とされる標的核酸配列内の標的部位に対して、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列相補性を含むことができる。例えば、オリゴマー化合物の２０の核酸塩基のうちの１８が標的部位に相補的であり、それ故、特異的にハイブリダイズするＡＳＯは、９０パーセントの相補性を表わす。この例において、残りの相補的でない核酸塩基は、ともにクラスター化され得るか、または相補的な核酸塩基と分散され（ｉｎｔｅｒｓｐｅｒｓｅｄ）、互いにまたは相補的な核酸塩基に隣接している必要はない。ＡＳＯの標的核酸の領域とのパーセント相補性は、当該技術分野で既知のＢＬＡＳＴプログラム（基礎的なローカルアライメント検索ツール）およびＰｏｗｅｒＢＬＡＳＴプログラム（Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．， １９９０， ２１５， ４０３−４１０； Ｚｈａｎｇ ａｎｄ Ｍａｄｄｅｎ， Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ．， １９９７， ７， ６４９−６５６）を慣例的に使用して判定され得る。
ＡＳＯは、標的配列におけるすべての核酸塩基にハイブリダイズする必要はなく、それがハイブリダイズする核酸塩基は、隣接しているかまたは隣接していないかもしれない。ＡＳＯは、ｍＲＮＡ前駆体の転写産物の１つ以上のセグメントにわたってハイブリダイズし得、その結果、介在するまたは隣接するセグメントは、ハイブリダイゼーション事象に関係しない（例えば、ループ構造またはヘアピン構造が形成され得る）。特定の実施形態では、ＡＳＯは、標的ｍＲＮＡ前駆体の転写産物において隣接していない核酸塩基にハイブリダイズする。例えば、ＡＳＯは、ＡＳＯがハイブリダイズしない１つ以上の核酸塩基によって分離される、ｍＲＮＡ前駆体の転写産物における核酸塩基にハイブリダイズすることができる。
本明細書に記載されるＡＳＯは、ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体の標的部分に存在する核酸塩基に相補的である核酸塩基を含む。用語「ＡＳＯ」は、オリゴヌクレオチド、および標的ｍＲＮＡ上の相補的な核酸塩基にハイブリダイズすることができる核酸塩基を含むが、ペプチド核酸（ＰＮＡ）などの糖部を含まない、他のオリゴマー分子を具体化する。ＡＳＯは、自然発生のヌクレオチド、ヌクレオチドアナログ、修飾されたヌクレオチド、またはそれらの２つまたは３つの任意の組み合わせを含み得る。用語「自然発生のヌクレオチド」は、デオキシリボヌクレオチドおよびリボヌクレオチドを含む。用語「修飾されたヌクレオチド」は、修飾されたまたは置換された糖類および／または修飾された骨格を有するヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、ＡＳＯのヌクレオチドのすべてが、修飾されたヌクレオチドである。本明細書に記載される方法および組成物と適合性のあるＡＳＯの化学修飾およびのＡＳＯの成分は、当業者に明白であり、例えば、米国特許第８，２５８，１０９号 Ｂ２、米国特許第５，６５６，６１２号、米国特許公開番号２０１２／０１９０７２８、およびＤｉａｓ ａｎｄ Ｓｔｅｉｎ，Ｍｏｌ． Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒ．２００２，３４７−３５５で見られ得、それら全体が引用によって本明細書に組み込まれる。
ＡＳＯの核酸塩基は、アデニン、グアニン、シトシン、チミンおよびウラシルなどの自然発生の未修飾の核酸塩基、または標的ｍＲＮＡ前駆体上に存在する核酸塩基との水素結合が可能であるように未修飾の核酸塩基に十分類似している合成または修飾された核酸塩基であり得る。修飾された核酸塩基の例としては、限定されないが、ヒポキサンチン、キサンチン、７−メチルグアニン、５，６−ジヒドロウラシル、５−メチルシトシン、および５−ヒドロキシメチルシトシンが挙げられる。
本明細書に記載されるＡＳＯはまた、オリゴマーの成分に結合する骨格構造を含む。用語「骨格構造」および「オリゴマー連鎖」は、交換可能に使用され、ＡＳＯの単量体間の結合を指し得る。自然発生のオリゴヌクレオチドでは、骨格は、オリゴマーの糖部を結合する３’−５’ホスホジエステル連鎖を含む。本明細書に記載されるＡＳＯの骨格構造またはオリゴマー連鎖は、（限定されないが）ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホロセレノエート、ホスホロジセレノエート、ホスホロアニロチオエート、ホスホラニラデート（ｐｈｏｓｐｈｏｒａｎｉｌａｄａｔｅ）、ホスホラミデート（ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄａｔｅ）などを含む。例えば、ＬａＰｌａｎｃｈｅ， ｅｔ ａｌ．， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １４：９０８１ （１９８６）； Ｓｔｅｃ， ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ａｍ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ． １０６：６０７７ （１９８４）， Ｓｔｅｉｎ， ｅｔ ａｌ．， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １６：３２０９ （１９８８）， Ｚｏｎ， ｅｔ ａｌ．， Ａｎｔｉ Ｃａｎｃｅｒ Ｄｒｕｇ Ｄｅｓｉｇｎ ６：５３９ （１９９１）； Ｚｏｎ， ｅｔ ａｌ．， Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ａｎｄ Ａｎａｌｏｇｕｅｓ： Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ， ｐｐ． ８７−１０８ （Ｆ． Ｅｃｋｓｔｅｉｎ， Ｅｄ．， Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｏｘｆｏｒｄ Ｅｎｇｌａｎｄ （１９９１））； Ｓｔｅｃ， ｅｔ ａｌ．，米国特許第５，１５１，５１０号； Ｕｈｌｍａｎｎ ａｎｄ Ｐｅｙｍａｎ， Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ９０：５４３ （１９９０）を参照。いくつかの実施形態では、ＡＳＯの骨格構造は、亜リン酸を含有していないが、例えば、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、またはカルバミン酸塩、アミド、および直鎖および環式の炭化水素基を含む連結基において、ペプチド結合を含有している。いくつかの実施形態では、骨格修飾は、ホスホロチオエート連鎖である。いくつかの実施形態では、骨格修飾は、ホスホラミデート連鎖である。
実施形態では、ＡＳＯ骨格のリンヌクレオチド間の連鎖の各々での立体化学は、ランダムである。実施形態では、ＡＳＯ骨格のリンヌクレオチド間の連鎖の各々での立体化学は、制御され、ランダムではない。例えば、引用によって本明細書に組み込まれた米国特許公開番号２０１４／０１９４６１０、「Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｉｚｅｄ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ」は、核酸オリゴマーにおいて各リン原子でキラリティーの利き手（ｈａｎｄｅｄｎｅｓｓ）を独立して選択する方法について記載している。実施形態では、限定されないが、本明細書で表１に明記されるＡＳＯのいずれかを含む、本開示の方法に使用されるＡＳＯは、ランダムでないリンヌクレオチド間の連鎖を有するＡＳＯを含む。実施形態では、本発明の方法に使用される組成物は、純粋なジアステレオマーＡＳＯを含む。実施形態では、本発明の方法に使用される組成物は、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％ある、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％含む、少なくとも約９９％、約１００％、約９０％〜約１００％、約９１％〜約１００％、約９２％〜約１００％、約９３％〜約１００％、約９４％〜約１００％、約９５％〜約１００％、約９６％〜約１００％、約９７％〜約１００％、約９８％〜約１００％、または約９９％〜約１００％のジアステレオマー純度を有するＡＳＯを含む。
実施形態では、ＡＳＯは、そのリンヌクレオチド間の連鎖でＲｐおよびＳｐの構成のランダムでない混合物を有している。例えば、ＲｐとＳｐの混合物が、アンチセンスオリゴヌクレオチドにおいて、優れた活性とヌクレアーゼ安定性との間のバランスを達成する必要があることが示唆されてきた（Ｗａｎ， ｅｔ ａｌ．， ２０１４，「Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ， ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ａｎｄ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｓｅｃｏｎｄ ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ａｎｔｉｓｅｎｓｅ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ｃｈｉｒａｌ ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｔｈｉｏａｔｅ ｌｉｎｋａｇｅｓ，」Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ４２（２２）： １３４５６−１３４６８、引用によって本明細書に組み込まれる）。実施形態では、限定されないが、本明細書で表１に明記されるＡＳＯのいずれかを含む、本発明の方法に使用されるＡＳＯは、約５−１００％のＲｐ、少なくとも約５％のＲｐ、少なくとも約１０％のＲｐ、少なくとも約１５％のＲｐ、少なくとも約２０％のＲｐ、少なくとも約２５％のＲｐ、少なくとも約３０％のＲｐ、少なくとも約３５％のＲｐ、少なくとも約４０％のＲｐ、少なくとも約４５％のＲｐ、少なくとも約５０％のＲｐ、少なくとも約５５％のＲｐ、少なくとも約６０％のＲｐ、少なくとも約６５％のＲｐ、少なくとも約７０％のＲｐ、少なくとも約７５％のＲｐ、少なくとも約８０％のＲｐ、少なくとも約８５％のＲｐ、少なくとも約９０％のＲｐ、または少なくとも約９５％のＲｐと、残りのＳｐ、あるいは約１００％のＲｐを含む。実施形態では、限定されないが、本明細書で表１に明記されるＡＳＯのいずれかを含む、本発明の方法に使用されるＡＳＯは、約１０％から約１００％のＲｐ、約１５％から約１００％のＲｐ、約２０％から約１００％のＲｐ、約２５％から約１００％のＲｐ、約３０％から約１００％のＲｐ、約３５％から約１００％のＲｐ、約４０％から約１００％のＲｐ、約４５％から約１００％のＲｐ、約５０％から約１００％のＲｐ、約５５％から約１００％のＲｐ、約６０％から約１００％のＲｐ、約６５％から約１００％のＲｐ、約７０％から約１００％のＲｐ、約７５％から約１００％のＲｐ、約８０％から約１００％のＲｐ、約８５％から約１００％のＲｐ、約９０％約１００％のＲｐ、または約９５％から約１００％のＲｐ、約２０％から約８０％のＲｐ、約２５％から約７５％のＲｐ、約３０％から約７０％のＲｐ、約４０％から約６０％のＲｐ、または約４５％から約５５％のＲｐと、残りのＳｐを含む。
実施形態では、限定されないが、本明細書で表１に明記されるＡＳＯのいずれかを含む、本発明の方法に使用されるＡＳＯは、約５−１００％のＳｐ、少なくとも約５％のＳｐ、少なくとも約１０％のＳｐ、少なくとも約１５％のＳｐ、少なくとも約２０％のＳｐ、少なくとも約２５％のＳｐ、少なくとも約３０％のＳｐ、少なくとも約３５％のＳｐ、少なくとも約４０％のＳｐ、少なくとも約４５％のＳｐ、少なくとも約５０％のＳｐ、少なくとも約５５％のＳｐ、少なくとも約６０％のＳｐ、少なくとも約６５％のＳｐ、少なくとも約７０％のＳｐ、少なくとも約７５％のＳｐ、少なくとも約８０％のＳｐ、少なくとも約８５％のＳｐ、少なくとも約９０％のＳｐ、または少なくとも約９５％のＳｐと、残りのＲｐ、あるいは約１００％のＳｐを含む。実施形態では、限定されないが、本明細書で表１に明記されるＡＳＯのいずれかを含む、本発明の方法に使用されるＡＳＯは、約１０％から約１００％のＳｐ、約１５％から約１００％のＳｐ、約２０％から約１００％のＳｐ、約２５％から約１００％のＳｐ、約３０％から約１００％のＳｐ、約３５％から約１００％のＳｐ、約４０％から約１００％のＳｐ、約４５％から約１００％のＳｐ、約５０％から約１００％のＳｐ、約５５％から約１００％のＳｐ、約６０％から約１００％のＳｐ、約６５％から約１００％のＳｐ、約７０％から約１００％のＳｐ、約７５％から約１００％のＳｐ、約８０％から約１００％のＳｐ、約８５％から約１００％のＳｐ、約９０％から約１００％のＳｐ、または約９５％から約１００％のＳｐ、約２０％から約８０％のＳｐ、約２５％から約７５％のＳｐ、約３０％から約７０％のＳｐ、約４０％から約６０％のＳｐ、または約４５％から約５５％のＳｐと、残りのＲｐを含む。
本明細書に記載されるＡＳＯのいずれかは、自然発生のヌクレオチド中に存在する、リボースまたはデオキシリボースを含む糖部、あるいはモルホリン環を含む、修飾された糖部または糖アナログを含有し得る。修飾された糖部の限定しない例としては、２’−Ｏ−メチル（２’−Ｏ−Ｍｅ）、２’−Ｏ−メトキシエチル（２’ＭＯＥ）、２’−Ｏ−アミノエチル、２’Ｆ；Ｎ３’−＞Ｐ５’ホスホラミデート、２’ジメチルアミノオキシエトキシ、２’ジメチルアミノエトキシエトキシ、２’−グアニジニウム（ｇｕａｎｉｄｉｎｉｄｉｕｍ）、２’−Ｏ−グアニジニウムエチル、カルバミン酸塩修飾した糖、および二環式修飾した糖などの、２’置換基が挙げられる。いくつかの実施形態では、糖部修飾は、２’−Ｏ−Ｍｅ、２’Ｆ、および２’ＭＯＥから選択される。いくつかの実施形態では、糖部修飾は、ロックド核酸（ＬＮＡ）におけるような追加の架橋結合である。いくつかの実施形態では、糖アナログは、ホスホロジアミデートモルホリノ（ＰＭＯ）などのモルホリン環を含有している。いくつかの実施形態では、糖部は、リボフラノシルまたは２’デオキシリボフラノシルの修飾を含む。いくつかの実施形態では、糖部は、２’４’抑制された（ｃｏｎｓｔｒａｉｎｅｄ）２’Ｏ−メチルオキシエチル（ｃＭＯＥ）修飾を含む。いくつかの実施形態では、糖部は、ｃＥｔ ２’，４抑制された２’−ＯエチルＢＮＡ修飾を含む。いくつかの実施形態では、糖部は、トリシクロＤＮＡ（ｔｃＤＮＡ）修飾を含む。いくつかの実施形態では、糖部は、エチレン核酸（ＥＮＡ）修飾を含む。いくつかの実施形態では、糖部は、ＭＣＥ修飾を含む。修飾は当該技術分野で既知であり、文献、例えば、Ｊａｒｖｅｒ， ｅｔ ａｌ．， ２０１４，「Ａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｖｉｅｗ ｏｆ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ｆｏｒ Ｅｘｏｎ Ｓｋｉｐｐｉｎｇ ａｎｄ Ｒｅｌａｔｅｄ Ｄｒｕｇ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，」Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ ２４（１）： ３７−４７に記載され、これは、この目的のための引用によって本明細書に組み込まれる。
いくつかの例では、ＡＳＯの各単量体は、同じ方法で修飾され、例えば、ＡＳＯの骨格の各連鎖はホスホロチオエート連鎖を含む、または各リボース糖部は２’Ｏ−メチル修飾を含む。ＡＳＯの単量体成分の各々の上に存在する、そのような修飾は、「均一な修飾」と呼ばれる。いくつかの例では、異なる修飾の組み合わせが望まれ得、例えば、ＡＳＯは、ホスホロジアミデート連鎖とモルホリン環を含む糖部（モルホリノ）との組み合わせを含み得る。ＡＳＯへの異なる修飾の組み合わせは、「混合修飾」または「混合化学作用」と呼ばれる。
いくつかの実施形態では、ＡＳＯは、１つ以上の骨格修飾を含む。いくつかの実施形態では、ＡＳＯは、１つ以上の糖部修飾を含む。いくつかの実施形態では、ＡＳＯは、１つ以上の骨格修飾および１つ以上の糖部修飾を含む。いくつかの実施形態では、ＡＳＯは、２’ＭＯＥ修飾およびホスホロチオエート骨格を含む。いくつかの実施形態では、ＡＳＯは、ホスホロジアミデートモルホリノ（ＰＭＯ）を含む。いくつかの実施形態では、ＡＳＯは、ペプチド核酸（ＰＮＡ）を含む。本明細書に記載されるＡＳＯのいずれかまたはＡＳＯの成分（例えば、核酸塩基、糖部、骨格）は、ＡＳＯの望ましい特性または活性を達成するためにまたはＡＳＯの望ましくない特性または活性を減少させるために修飾されてもよい。例えば、ＡＳＯまたは任意のＡＳＯの１つ以上の成分は、ｍＲＮＡ前駆体の転写産物上の標的配列への結合親和性を増強する；非標的配列への結合を減少させる；細胞のヌクレアーゼ（つまり、ＲＮａｓｅ Ｈ）による分解を減少させる；細胞および／または細胞の核へのＡＳＯの取り込みを改善する；ＡＳＯの薬物動態（ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃｓ）または薬力（ｐｈａｒｍａｃｏｄｙｎａｍｉｃｓ）を変更する；およびＡＳＯの半減期を調節するために修飾され得る。
いくつかの実施形態では、ＡＳＯは、２’−Ｏ−（２−メトキシエチル）（ＭＯＥ）のホスホロチオエート修飾されたヌクレオチドで構成される。そのようなヌクレオチドで構成されたＡＳＯは、特に、本明細書で開示される方法によく適しており、そのような修飾を有しているオリゴマーは、ヌクレアーゼ分解に対する著しく増強された耐性および増加したバイオアベイラビリティを有すると示されており、これによって、例えば、本明細書に記載されるいくつかの実施形態における経口送達に適するようになる。例えば、Ｇｅａｒｙ， ｅｔ ａｌ．， Ｊ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ Ｅｘｐ Ｔｈｅｒ． ２００１； ２９６（３）：８９０−７； Ｇｅａｒｙ， ｅｔ ａｌ．， Ｊ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ Ｅｘｐ Ｔｈｅｒ． ２００１； ２９６（３）：８９８−９０４を参照。
ＡＳＯを合成する方法は当業者に既知である。代替的にまたは加えて、ＡＳＯは商用源から得られ得る。
他に明記されない限り、一本鎖核酸（例えば、ｍＲＮＡ前駆体の転写産物、オリゴヌクレオチド、ＡＳＯなど）配列の左端は、５’末端であり、一本鎖または二本鎖の核酸配列の左方向は、５’方向と呼ばれる。同様に、核酸配列（一本鎖または二本鎖）の右端または右方向は、３’末端または３’方向である。一般に、核酸中の基準点に対する５’にある領域または配列は、「上流」として言及され、核酸中の基準点に対する３’にある領域または配列は、「下流」として言及される。一般に、ｍＲＮＡの５’方向または５’末端は、開始コドン（ｉｎｉｔｉａｔｉｏｎ ｏｒ ｓｔａｒｔ ｃｏｄｏｎ）が位置する場所であり、一方で、３’末端または３’方向は、終止コドンが位置する場所である。いくつかの態様では、核酸中の基準点の上流にあるヌクレオチドは、負の数によって指定され、基準点の下流にあるヌクレオチドは、正の数によって指定され得る。例えば、基準点（例えば、ｍＲＮＡ中のエクソン−エクソン連結）は「ゼロ」部位として指定され得、基準点に直接隣接しその上流にあるヌクレオチドは、「マイナス１」、例えば「−１」と指定され、一方で、基準点に直接隣接しその下流にあるヌクレオチドは、「プラス１」、例えば「＋１」と指定される。
いくつかの実施形態において、ＡＳＯは、ＰＫＤ２ ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体において保持されたイントロンの５’スプライス部位の下流（３’の方向）であるＰＫＤ２ ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体の標的部分（例えば５’スプライス部位に対して、正の数で示された方向）に対して相補的であ（り、その部分に結合す）る（図１）。いくつかの実施形態において、ＡＳＯは、保持されたイントロンの５’スプライス部位に対して、約＋６から約＋５００の領域内にあるＰＫＤ２ ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体の標的部分に対して相補的である。いくつかの実施形態において、ＡＳＯは、５’スプライス部位に対して、＋１から＋５までのヌクレオチド（５’スプライス部位の下流に位置付けられた最初の５つのヌクレオチド）に対して相補的ではない。いくつかの実施形態において、ＡＳＯは、保持されたイントロンの５’スプライス部位に対して、約＋６から約＋４９７の間の領域内にあるＰＫＤ２ ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体の標的部分に対して相補的であることもある。いくつかの態様では、ＡＳＯは、保持されたイントロンの５’スプライス部位に対する、約＋６から約＋５００、約＋６から約＋４９０、約＋６から約＋４８０、約＋６から約＋４７０、約＋６から約＋４６０、約＋６から約＋４５０、約＋６から約＋４４０、約＋６から約＋４３０、約＋６から約＋４２０、約＋６から約＋４１０、約＋６から約＋４００、約＋６から約＋３９０、約＋６から約＋３８０、約＋６から約＋３７０、約＋６から約＋３６０、約＋６から約＋３５０、約＋６から約＋３４０、約＋６から約＋３３０、約＋６から約＋３２０、約＋６から約＋３１０、約＋６から約＋３００、約＋６から約＋２９０、約＋６から約＋２８０、約＋６から約＋２７０、約＋６から約＋２６０、約＋６から約＋２５０、約＋６から約＋２４０、約＋６から約＋２３０、約＋６から約＋２２０、約＋６から約＋２１０、約＋６から約＋２００、約＋６から約＋１９０、約＋６から約＋１８０、約＋６から約＋１７０、約＋６から約＋１６０、約＋６から約＋１５０、約＋６から約＋１４０、約＋６から約＋１３０、約＋６から約＋１２０、約＋６から約＋１１０、約＋６から約＋１００、約＋６から約＋９０、約＋６から約＋８０、約＋６から約＋７０、約＋６から約＋６０、約＋６から約＋５０、約＋６から約＋４０、約＋６から約＋３０、または約＋６から約＋２０の領域内の標的部分に対して相補的である。
いくつかの実施形態において、ＡＳＯは、ＰＫＤ２ ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体において保持されたイントロンの５’スプライス部位の上流（５’の方向）であるＰＫＤ２ ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体の標的部分（例えば５’スプライス部位に対して、負の数で示された方向）に対して相補的であ（り、その部分に結合す）る（図１）。いくつかの実施形態において、ＡＳＯは、保持されたイントロンの５’スプライス部位に対して、約−４ｅから約−２１０ｅの領域内にあるＰＫＤ２ ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体の標的部分に対して相補的である。いくつかの実施形態において、ＡＳＯは、５’スプライス部位に対して、−１ｅから−３ｅまでのヌクレオチド（５’スプライス部位の上流に位置付けられた最初の５つのヌクレオチド）には相補的ではない。いくつかの実施形態において、ＡＳＯは、保持されたイントロンの５’スプライス部位に対して、−４ｅから約−２０４ｅの間の領域内にあるＰＫＤ２ ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体の標的部分に対して相補的であることもある。いくつかの態様では、ＡＳＯは、保持されたイントロンの５’スプライス部位に対する、約−４ｅから約−２１０ｅ、約−４ｅから約−２００ｅ、約−４ｅから約−１９０ｅ、約−４ｅから約−１８０ｅ、約−４ｅから約−１７０ｅ、約−４ｅから約−１６０ｅ、約−４ｅから約−１５０ｅ、約−４ｅから約−１４０ｅ、約−４ｅから約−１３０ｅ、約−４ｅから約−１２０ｅ、約−４ｅから約−１１０ｅ、約−４ｅから約−１２０ｅ、約−４ｅから約−１１０ｅ、約−４ｅから約−９０ｅ、約−４ｅから約−８０ｅ、約−４ｅから約−７０ｅ、約−４ｅから約−５０ｅ、約−４ｅから約−４０ｅ、約−４ｅから約−３０ｅ、または約−４ｅから約−２０ｅの領域内にある標的部分に対して相補的である。
いくつかの実施形態において、ＡＳＯは、ＰＫＤ２ ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体において保持されたイントロンの３’スプライス部位の上流（５’の方向）であるＰＫＤ２ ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体の標的領域（例えば負の数で示された方向）に対して相補的である（図１）。いくつかの実施形態において、ＡＳＯは、保持されたイントロンの３’スプライス部位に対して、約−１６から約−５００の領域内にあるＰＫＤ２ ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体の標的部分に対して相補的である。いくつかの実施形態において、ＡＳＯは、３’スプライス部位に対して、−１から−１５までのヌクレオチド（３’スプライス部位の上流に位置付けられた最初の１５のヌクレオチド）には相補的ではない。いくつかの実施形態において、ＡＳＯは、保持されたイントロンの３’スプライス部位に対して、−１６から−４９６の領域内にあるＰＫＤ２ ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体の標的部分に対して相補的である。いくつかの態様では、ＡＳＯは、保持されたイントロンの３’スプライス部位に対する、約−１６から約−５００、約−１６から約−４９０、約−１６から約−４８０、約−１６から約−４７０、約−１６から約−４６０、約−１６から約−４５０、約−１６から約−４４０、約−１６から約−４３０、約−１６から約−４２０、約−１６から約−４１０、約−１６から約−４００、約−１６から約−３９０、約−１６から約−３８０、約−１６から約−３７０、約−１６から約−３６０、約−１６から約−３５０、約−１６から約−３４０、約−１６から約−３３０、約−１６から約−３２０、約−１６から約−３１０、約−１６から約−３００、約−１６から約−２９０、約−１６から約−２８０、約−１６から約−２７０、約−１６から約−２６０、約−１６から約−２５０、約−１６から約−２４０、約−１６から約−２３０、約−１６から約−２２０、約−１６から約−２１０、約−１６から約−２００、約−１６から約−１９０、約−１６から約−１８０、約−１６から約−１７０、約−１６から約−１６０、約−１６から約−１５０、約−１６から約−１４０、約−１６から約−１３０、約−１６から約−１２０、約−１６から約−１１０、約−１６から約−１００、約−１６から約−９０、約−１６から約−８０、約−１６から約−７０、約−１６から約−６０、約−１６から約−５０、約−１６から約−４０、または約−１６から約−３０の領域内にある標的部分に対して相補的である。
いくつかの実施形態において、ＡＳＯは、ＰＫＤ２ ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体において保持されたイントロンの３’スプライス部位の下流（３’の方向）であるＰＫＤ２ ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体の標的領域（例えば正の数で示された方向）に対して相補的である（図１）。いくつかの実施形態において、ＡＳＯは、保持されたイントロンの３’スプライス部位に対して、約＋２ｅから約＋２２０ｅの領域内にあるＰＫＤ２ ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体の標的部分に対して相補的である。いくつかの実施形態において、ＡＳＯは、３’スプライス部位に対して、＋１ｅのヌクレオチド（３’スプライス部位の下流に位置付けられた最初の５つのヌクレオチド）には相補的ではない。いくつかの実施形態において、ＡＳＯは、保持されたイントロンの３’スプライス部位に対して、約＋２ｅから約＋２１２ｅの間の領域内にあるＰＫＤ２ ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体の標的部分に対して相補的であることもある。いくつかの態様では、ＡＳＯは、保持されたイントロンの３’スプライス部位に対する、約＋２ｅから約＋２２０ｅ、約＋２ｅから約＋２１０ｅ、約＋２ｅから約＋２００ｅ、約＋２ｅから約＋１９０ｅ、約＋２ｅから約＋１８０ｅ、約＋２ｅから約＋１７０ｅ、約＋２ｅから約＋１６０ｅ、約＋２ｅから約＋１５０ｅ、約＋２ｅから約＋１４０ｅ、約＋２ｅから約＋１３０ｅ、約＋２ｅから約＋１２０ｅ、約＋２ｅから約＋１１０ｅ、約＋２ｅから約＋１００ｅ、約＋２ｅから約＋９０ｅ、約＋２ｅから約＋８０ｅ、約＋２ｅから約＋７０ｅ、約＋２ｅから約＋６０ｅ、約＋２ｅから約＋５０ｅ、約＋２ｅから約＋４０ｅ、約＋２ｅから約＋３０ｅ、約＋２ｅから約＋２０ｅ、または約＋２ｅから約＋１０ｅの領域内にある標的部分に対して相補的である。
実施形態において、ＰＫＤ２ ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体の標的部分は、保持されたイントロンの５’スプライス部位に対する＋１００から、保持されたイントロンの３’スプライス部位に対する−１００までの領域内に存在する。
ＡＳＯは、スプライシングの特異的結合および効果的な増強作用に適する任意の長さでありうる。いくつかの実施形態において、ＡＳＯは８から５０の核酸塩基から成る。例えば、ＡＳＯは長さが、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、４５または５０の核酸塩基であってもよい。いくつかの実施形態において、ＡＳＯは５０よりも多い核酸塩基から成る。いくつかの実施形態において、ＡＳＯは長さが、８から５０の核酸塩基、８から４０の核酸塩基、８から３５の核酸塩基、８から３０の核酸塩基、８から２５の核酸塩基、８から２０の核酸塩基、８から１５の核酸塩基、９から５０の核酸塩基、９から４０の核酸塩基、９から３５の核酸塩基、９から３０の核酸塩基、９から２５の核酸塩基、９から２０の核酸塩基、９から１５の核酸塩基、１０から５０の核酸塩基、１０から４０の核酸塩基、１０から３５の核酸塩基、１０から３０の核酸塩基、１０から２５の核酸塩基、１０から２０の核酸塩基、１０から１５の核酸塩基、１１から５０の核酸塩基、１１から４０の核酸塩基、１１から３５の核酸塩基、１１から３０の核酸塩基、１１から２５の核酸塩基、１１から２０の核酸塩基、１１から１５の核酸塩基、１２から５０の核酸塩基、１２から４０の核酸塩基、１２から３５の核酸塩基、１２から３０の核酸塩基、１２から２５の核酸塩基、１２から２０の核酸塩基、１２から１５の核酸塩基、１３から５０の核酸塩基、１３から４０の核酸塩基、１３から３５の核酸塩基、１３から３０の核酸塩基、１３から２５の核酸塩基、１３から２０の核酸塩基、１４から５０の核酸塩基、１４から４０の核酸塩基、１４から３５の核酸塩基、１４から３０の核酸塩基、１４から２５の核酸塩基、１４から２０の核酸塩基、１５から５０の核酸塩基、１５から４０の核酸塩基、１５から３５の核酸塩基、１５から３０の核酸塩基、１５から２５の核酸塩基、１５から２０の核酸塩基、２０から５０の核酸塩基、２０から４０の核酸塩基、２０から３５の核酸塩基、２０から３０の核酸塩基、２０から２５の核酸塩基、２５から５０の核酸塩基、２５から４０の核酸塩基、２５から３５の核酸塩基、または２５から３０の核酸塩基である。いくつかの実施形態において、ＡＳＯは長さが１８ヌクレオチドである。いくつかの実施形態において、ＡＳＯは長さが１５ヌクレオチドである。いくつかの実施形態において、ＡＳＯは長さが２５ヌクレオチドである。
いくつかの実施形態において、異なる化学的性質を有するが、ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体の同じ標的部分に対して相補的である２つ以上のＡＳＯが使用される。いくつかの実施形態において、ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体の異なる標的部分に対して相補的である２つ以上のＡＳＯが使用される。
実施形態では、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、１つ以上の部分または抱合体、例えば、オリゴヌクレオチドの活性または細胞取り込みを増強する標的部分または他の抱合体に化学的に連結される。そのような部分には、限定されないが、例えば、コレステロール部分、コレステリル部分、例えばドデカンジオールまたはウンデシル残基などの脂肪族鎖、ポリアミンまたはポリエチレングリコール鎖、または、アダマンタン酢酸として、脂質部分が含まれる。親油性部分を含むオリゴヌクレオチドおよび調製方法は、公開文献において述べられている。実施形態において、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、限定されないが、脱塩基ヌクレオチド、ポリエーテル、ポリアミン、ポリアミド、ペプチド、例えばＮ−アセチルガラクトサミン（ＧｌｕＮＡｃ）、Ｎ−Ａｃグルコサミン（ＧａｌＮＡｃ）などの炭水化物、もしくはマンノース（例えばマンノース−６−リン酸）、脂質、またはポリ炭化水素化合物を含む部分で抱合される。抱合体は、当該技術分野で理解され文献に記載されるように、例えばリンカーを用いて、糖、塩基またはリン酸基上のいくつかの位置のうちのいずれかでアンチセンスオリゴヌクレオチドを含む任意のヌクレオチドの１つ以上に連結されうる。リンカーは二価または三価の分岐したリンカーを含むことができる。実施形態において、抱合体はアンチセンスオリゴヌクレオチドの３’末端に付いている。オリゴヌクレオチド抱合体を調製する方法は、例えば米国特許第８，４５０，４６７号の「Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ ａｓ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ａｇｅｎｔｓ ｆｏｒ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ」に記載されており、引用することで本明細書に組み込まれる。
いくつかの実施形態において、ＡＳＯによって標的とされる核酸は、真核細胞などの細胞内に発現したＰＫＤ２ ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体である。いくつかの実施形態において、用語「細胞」は、細胞の集団を指すこともある。いくつかの実施形態において、細胞は被験体内に存在する。いくつかの実施形態において、細胞は被験体から単離されている。いくつかの実施形態において、細胞はエクスビボである。いくつかの実施形態において、細胞は疾病もしくは疾患関連細胞、または細胞株である。いくつかの実施形態において、細胞はインビトロである（例えば細胞培養液中）。
＜医薬組成物＞
記載された組成物のアンチセンスオリゴヌクレオチドを含み、上記方法のいずれかにおいて使用するための医薬組成物または製剤は、医薬品産業において周知の従来の技術に従って調製することができ、かつ公開文献においても記載されている。実施形態において、被験体を処置するための医薬組成物または製剤は、上記のような任意のアンチセンスオリゴマーの有効量を含むか、または薬学的に許容可能な塩、溶媒和物、それらの水和物もしくはエステル、および薬学的に許容可能な希釈液を含む。医薬製剤のアンチセンスオリゴマーはさらに、薬学的に許容可能な賦形剤、希釈液または担体を含むこともある。
薬学的に許容可能な塩は、過度の毒性反応、刺激反応、アレルギー反応等を持たないヒトおよび下等動物の組織に接する使用に適しており、かつ適切なベネフィット・リスク比に見合う。（例えば、本発明の目的のために引用によって本明細書に組み込まれたＳ．Ｍ．Ｂｅｒｇｅ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，６６：１−１９（１９７７）を参照）。その塩は、化合物の最終的な単離および精製中に、または遊離塩基の官能基を適切な有機酸と個別に反応させることにより、インサイチュで調製されうる。薬学的に許容可能で無毒な酸付加塩の例は、塩化水素、臭化水素酸、リン酸、硫酸、および過塩素酸などの無機酸か、酢酸、シュウ酸、マレイン酸、酒石酸、クエン酸、コハク酸もしくはマロン酸などの有機酸か、またはイオン交換などの他の文書で立証された方法を用いることによって形成されたアミノ基の塩である。他の薬学的に許容可能な塩は、アジピン酸塩、アルギン酸塩、アスコルビン酸塩、アスパラギン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、安息香酸塩、重硫酸塩、ホウ酸塩、酪酸塩、樟脳酸塩、樟脳スルホン酸塩、クエン酸塩、シクロペンタンプロピオン酸塩、ジグルコン酸塩、ドデシル硫酸塩、エタンスルホン酸塩、ギ酸塩、フマル酸塩、グルコヘプトン酸塩、グリセロリン酸塩、グルコン酸塩、ヘミ硫酸塩、ヘプタン酸塩、ヘキサン酸塩、ヨウ化水素酸塩、２−ヒドロキシ−エタンスルホン酸塩、ラクトビオン酸塩、乳酸塩、ラウリン酸塩、ラウリル硫酸塩、リンゴ酸塩、マレイン酸塩、マロン酸塩、メタンスルホン酸塩、２−ナフタレンスルホン酸塩、ニコチン酸塩、硝酸塩、オレイン酸塩、シュウ酸塩、パルミチン酸塩、パモ酸塩、ペクチン酸塩、過硫酸塩、３−フェニルプロピオン酸塩、リン酸塩、ピクリン酸塩、ピバル酸塩、プロピオン酸塩、ステアリン酸塩、コハク酸塩、硫酸塩、酒石酸、チオシアン酸塩、ｐ−トルエンスルホン酸塩、ウンデカン酸塩、吉草酸塩などを含む。代表的なアルカリまたはアルカリ土類金属の塩は、ナトリウム、リチウム、カリウム、カルシウム、マグネシウムなどを含む。さらに薬学的に許容可能な塩は、適切な場合、ハロゲン化物、水酸化物、カルボン酸塩、硫酸塩、リン酸塩、硝酸塩、低級アルキルのスルホン酸塩、およびアリールスルホン酸塩などの対イオンを使用して形成された、無毒なアンモニウム、第四級アンモニウム、およびアミンのカチオンを含む。
実施形態において、組成物は、限定されないが、錠剤、カプセル剤、ゲルカプセル剤、液体シロップ剤、ソフトゲル剤、坐薬および浣腸剤などの多くの可能な剤形いずれかへと製剤される。実施形態において、組成物は、水性媒体、非水性媒体、または混合媒体状の懸濁液として製剤される。水性懸濁液は、例えばカルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトール、および／またはデキストランを含む懸濁液の粘度を増加させる物質をさらに含むこともある。その懸濁液は、安定化剤も含むこともある。実施形態において、本発明の医薬製剤または組成物は、限定されないが、溶液、エマルジョン、マイクロエマルジョン、発泡体またはリポソーム含有製剤（例えばカチオンリポソームまたは非カチオンリポソーム）を含む。
本発明の医薬組成物または製剤は、適切で当業者に周知なように、または公開文献において記載されているように、１つ以上の透過促進剤、担体、賦形剤、または他の活性成分もしくは非活性成分を含むこともある。実施形態において、リポソームは立体的に安定したリポソーム、例えば１つ以上の特定の脂質を含むリポソームも含む。これらの特定の脂質は、循環寿命が増強されたリポソームを結果としてもたらす。実施形態において、立体的に安定したリポソームは、１つ以上の糖脂質を含むか、またはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）部分などの１つ以上の親油性高分子を用いて誘導される。実施形態において、界面活性剤は医薬製剤または組成物中に含まれる。薬物製品、製剤およびエマルジョンにおける界面活性剤の使用は、当技術分野においてよく知られている。実施形態において、本発明は、アンチセンスオリゴヌクレオチドの効率的な送達を成し遂げるために透過促進剤を利用し、例えば、細胞膜を介する拡散を補助する、および／または親油性薬物の浸透性を高める。実施形態において、透過促進剤は、界面活性剤、脂肪酸、胆汁塩、キレート剤、または非キレート非界面活性剤である。
実施形態において、医薬製剤は複数のアンチセンスオリゴヌクレオチドを含む。実施形態において、アンチセンスオリゴヌクレオチドは他の薬物または治療剤と組み合わせて投与される。実施形態において、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、当技術分野において知られている任意の方法によって、血液脳関門を介する主題のアンチセンスオリゴヌクレオチドの浸透を促進することができる１つ以上の薬剤と共に投与される。例えば、筋組織内の運動ニューロンへアデノウイルスベクターを投与することによる薬剤の送達は、引用によって本明細書に組み込まれる米国特許第６，６３２，４２７号「Ａｄｅｎｏｖｉｒａｌ−ｖｅｃｔｏｒ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ｇｅｎｅ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｉｎｔｏ ｍｅｄｕｌｌａｒｙ ｍｏｔｏｒ ｎｅｕｒｏｎｓ」に記載されている。脳、例えば線条体、視床、海馬、黒質へのベクターの直接的な送達は、例えば、引用によって本明細書に組み込まれる米国特許第６，７５６，５２３号「Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ ｖｅｃｔｏｒｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｏｆ ｆｏｒｅｉｇｎ ｇｅｎｅｓ ｉｎｔｏ ｃｅｌｌｓ ｏｆ ｔｈｅ ｃｅｎｔｒａｌ ｎｅｒｖｏｕｓ ｓｙｓｔｅｍ ｐａｒｔｉｃｕｌａｒｌｙ ｉｎ ｂｒａｉｎ」に記載されている。
実施形態において、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、望ましい薬理学的性質または薬力学的性質を提供する薬剤に結合されるか抱合される。実施形態において、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、血液脳関門を介する浸透または輸送を促進するために当技術分野において知られている物質、例えばトランスフェリン受容体に対する抗体に連結される。実施形態において、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、例えば、アンチセンス組成物をより効果的にするために、または血液脳関門を介する輸送を増加させるためにウイルスベクターに結合される。実施形態において、浸透性の血液脳関門の破壊は、砂糖、例えばメソエリスリトール、キシリトール、Ｄ（＋）ガラクトース、Ｄ（＋）ラクトース、Ｄ（＋）キシロース、ズルシトール、ミオ−イノシトール、Ｌ（−）フルクトース、Ｄ（−）マンニトール、Ｄ（＋）グルコース、Ｄ（＋）アラビノース、Ｄ（−）アラビノース、セロビオース、Ｄ（＋）マルトース、Ｄ（＋）ラフィノース、Ｌ（＋）ラムノース、Ｄ（＋）メリビオース、Ｄ（−）リボース、アドニトール、Ｄ（＋）アラビトール、Ｌ（−）アラビトール、Ｄ（＋）フコース、Ｌ（−）フコース、Ｄ（−）リキソース、Ｌ（＋）リキソース、およびＬ（−）リキソース、またはアミノ酸、例えばグルタミン、リジン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン酸、グリシン、ヒスチジン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、トレオニン、チロシン、バリン、およびタウリンを注入することにより促進される。血液脳関門の浸透性を高める方法および材料は、例えば米国特許第４，８６６，０４２号「Ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｔｈｅ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｏｆ ｇｅｎｅｔｉｃ ｍａｔｅｒｉａｌ ａｃｒｏｓｓ ｔｈｅ ｂｌｏｏｄ ｂｒａｉｎ ｂａｒｒｉｅｒ」、米国特許第６，２９４，５２０号「Ｍａｔｅｒｉａｌ ｆｏｒ ｐａｓｓａｇｅ ｔｈｒｏｕｇｈ ｔｈｅ ｂｌｏｏｄ−ｂｒａｉｎ ｂａｒｒｉｅｒ」、および米国特許第６，９３６，５８９号「Ｐａｒｅｎｔｅｒａｌ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｓｙｓｔｅｍｓ」に記載されており、各々は引用によって本明細書に組み込まれる。
実施形態では、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、１つ以上の部分または抱合体、例えば、オリゴヌクレオチドの活性または細胞取り込みを増強する標的部分または他の抱合体に化学的に結合される。そのような部分には、限定されないが、例えば、コレステロール部分、コレステリル部分などの脂質部分、例えばドデカンジオールまたはウンデシルの残基、ポリアミンまたはポリエチレングリコール鎖などの脂肪族鎖、または、アダマンタン酢酸が含まれる。親油性部分を含むオリゴヌクレオチドおよび調製方法は、公開された文献に記載されている。実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、限定されないが、脱塩基ヌクレオチド、ポリエーテル、ポリアミン、ポリアミド、ペプチド、炭水化物、例えばＮ−アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）、Ｎ−Ａｃ−グルコサミン（ＧｌｕＮＡｃ）、またはマンノース（例えばマンノース６−リン酸）、脂質、ポリ炭化水素化合物）を含む部分と結合する。当該技術分野で理解され文献に記載されるように、例えばリンカーを用いて、抱合体は、糖、塩基またはリン酸基上のいくつかの位置のうちのいずれかでアンチセンスオリゴヌクレオチドを含む任意のヌクレオチドの１つ以上に連結することができる。リンカーは二価または三価の分枝リンカーを含み得る。実施形態では、抱合体はアンチセンスオリゴヌクレオチドの３’末端に付いている。オリゴヌクレオチド抱合体を調製する方法は、例えば、米国特許第８，４５０，４６７号「Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ ａｓ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ａｇｅｎｔｓ ｆｏｒ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ」に記載され、参照により本明細書に組み込まれる。
被験体の処置
本明細書に提供される組成物のうちのいずれかが個体に投与されうる。「個体」は、「被験体」または「患者」と交換可能に使用されてもよい。個体は哺乳動物でもよく、例えば人間、または、人類以外の霊長類、げっ歯類、ウサギ、ラット、マウス、馬、ロバ、ヤギ、猫、犬、雌牛、ブタ、あるいは羊などの動物である。実施形態では、個体はヒトである。実施形態では、個体は胎児、胚、または小児である。他の実施形態では、個体は植物などの別の真核生物であってもよい。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される化合物は細胞にエクスビボで投与される。
いくつかの実施形態では、本明細書に提供される組成物は、疾患または障害を処置する方法として個体に投与される。いくつかの実施形態では、個体は、本明細書に記述された疾患のいずれかなどの遺伝病を有する。いくつかの実施形態では、個体は、本明細書に記述された疾患のいずれかなどの疾患を有するリスクがある。いくつかの実施形態では、個体は、不十分な量のタンパク質または不十分な活性のタンパク質により引き起こされる疾患または障害を有するリスクが増大している。個体が、不十分な量のタンパク質または不十分な活性のタンパク質により引き起こされる疾患または障害を有するリスクが増大している場合、方法は防止的または予防的な処置を含む。例えば、個体は、その疾患の家族健康歴のために、そのような疾患または障害を有するリスクが増大している場合がある。典型的には、そのような疾患または障害を有するリスクが増大している個体は、予防的処置（例えば、疾患または障害の発症または悪化を予防するかまたは遅らせることによる）から利益を受ける。
本発明のＡＳＯの投与に適切な経路は、ＡＳＯの送達が所望される細胞型に応じて変わりうる。多数の組織および器官は多発性嚢胞腎によって影響を受け、腎臓が最も著しく影響を受ける組織である。本発明のＡＳＯは、例えば、腹腔内注射、筋肉内注射、皮下注射または静脈内注射によって、患者に非経口的に投与されてもよい。
被験体は、任意の適切なマーカーを使用して、処置への反応について評価される。実施形態では、腎臓病の被験者は、クレアチニン、クレアチニンクリアランス、血圧、２４時間の尿量、２４時間の尿タンパク、ｖＷＡｇおよびアラキドン酸による血小板凝集を含む、腎臓病についての特定のマーカーを測定することにより、処置への反応について評価される。
スプライシングを増強する追加のＡＳＯを特定する方法
本発明の範囲内にはまた、特に標的イントロンでのＰＫＤ２ ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体のスプライシングを増強する追加のＡＳＯを特定する（判定する）方法がある。ｍＲＮＡ前駆体の標的領域内で様々なヌクレオチドに特異的にハイブリダイズするＡＳＯは、標的イントロンのスプライシングの速度および／または程度を改善するＡＳＯを特定する（判定する）ためにスクリーニングされてもよい。いくつかの実施形態では、ＡＳＯはスプライシング抑制因子／サイレンサーの結合部位をブロックまたは妨害することがある。当該技術分野において既知の任意の方法が、イントロンの標的領域にハイブリダイズされた時に所望の効果（例えばスプライシング、タンパク質または機能的ＲＮＡ産生の増強）をもたらすＡＳＯを特定する（判定する）ために使用されてもよい。これらの方法はまた、保持されたイントロンに隣接するエクソン中、または保持されていないイントロン中の標的領域へ結合することにより、保持されたイントロンのスプライシングを増強するＡＳＯの特定のために使用することができる。使用されうる方法の一例が下記に提供される。
ｍＲＮＡ前駆体の標的領域にハイブリダイズするように設計されたＡＳＯを用いて、ＡＳＯ「ウォーク」（ｗａｌｋ）と呼ばれる、一ラウンドのスクリーニングを行いうる。例えば、ＡＳＯウォークに使用されるＡＳＯは、保持されたイントロンの５’スプライス部位のおよそ１００ヌクレオチド上流（例えば、標的とされた／保持されたイントロンの上流に位置するエクソンの配列の一部）から、標的とされた／保持されたイントロンの５’スプライス部位のおよそ１００ヌクレオチド下流まで、および／または、保持されたイントロンの３’スプライス部位のおよそ１００ヌクレオチド上流から、標的とされた／保持されたイントロンの３’スプライス部位のおよそ１００ヌクレオチド下流（例えば、標的とされた／保持されたイントロンの下流に位置するエクソンの配列の一部）まで、５つのヌクレオチドごとに敷き詰められ得る。例えば、１５ヌクレオチドの長さの第１のＡＳＯは、標的とされた／保持されたイントロンの５’スプライス部位に対しヌクレオチド＋６から＋２０に特異的にハイブリダイズするように設計され得る。第２のＡＳＯは、標的とされた／保持されたイントロンの５’スプライス部位に対するヌクレオチド＋１１から＋２５に特異的にハイブリダイズするように設計されている。ＡＳＯは、ｍＲＮＡ前駆体の標的領域に及ぶように設計されている。実施形態では、ＡＳＯは、より密に、例えば、１、２、３、または４つのヌクレオチドごとに敷き詰められ得る。さらに、ＡＳＯは、５’スプライス部位の１００ヌクレオチド下流から、３’スプライス部位の１００ヌクレオチド上流まで敷き詰められ得る。いくつかの実施形態では、ＡＳＯは、５’スプライス部位の約２１０ヌクレオチド上流から、５’スプライス部位の約５００ヌクレオチド下流まで敷き詰められ得る。いくつかの実施形態では、ＡＳＯは、３’スプライス部位の約５００ヌクレオチド上流から、３’スプライス部位の約２２０ヌクレオチド下流まで敷き詰められ得る。
１つ以上のＡＳＯ、または１つの対照ＡＳＯ（標的領域にハイブリダイズするとは予期されていない配列である、スクランブル配列を有するＡＳＯ）は、例えばトランスフェクションによって、標的ｍＲＮＡ前駆体（例えば、本明細書で別記されるＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体）を発現する疾患関連の細胞株へと送達される。ＡＳＯの各々のスプライシングを誘発する効果は、本明細書で記載されるように、当該技術分野で既知の方法、例えば、スプライスジャンクションに及ぶプライマーを使用する逆転写酵素（ＲＴ）−ＰＣＲによって評価され得る（「イントロン保持事象の特定」を参照）。対照ＡＳＯ処理された細胞と比較して、ＡＳＯ処理された細胞におけるスプライスジャンクションに及ぶプライマーを使用して生成されたＲＴ−ＰＣＲ産物が減少または欠如していることは、標的イントロンのスプライシングが増強されたことを示している。いくつかの実施形態では、スプライシング効率、スプライシングされていないｍＲＮＡ前駆体に対するスプライシングされたｍＲＮＡ前駆体の比率、スプライシングの速度、またはスプライシングの程度は、本明細書に記載のＡＳＯを使用して改善され得る。標的ｍＲＮＡ前駆体によってコードされるタンパク質または機能的ＲＮＡの量も、各ＡＳＯが所望の効果（例えば、タンパク質産生の増強）を達成したかどうかを判定するために評価され得る。ウェスタンブロッティング、フローサイトメトリー、免疫蛍光顕微鏡検査法、およびＥＬＩＳＡなどの、タンパク質産生を評価および／または定量するための当該技術分野で既知の方法も使用することができる。
ＡＳＯ「ミクロウォーク」（ｍｉｃｒｏ−ｗａｌｋ）と呼ばれる第２ラウンドのスクリーニングは、ｍＲＮＡ前駆体の標的領域にハイブリダイズするように設計されたＡＳＯを使用して実行され得る。ＡＳＯミクロウォークに使用されるＡＳＯは、ＡＳＯでハイブリダイズされたときに結果的にスプライシングを増強させるｍＲＮＡ前駆体のヌクレオチド酸配列をさらに改良する（ｒｅｆｉｎｅ）ために、１つのヌクレオチドごとに敷き詰められる。
標的イントロンのスプライシングを促進するＡＳＯによって定義される領域は、１−ｎｔ工程（１−ｎｔ ｓｔｅｐｓ）で配置されたＡＳＯ、ならびに、典型的には１８−２５ｎｔである、より長いＡＳＯを含む、ＡＳＯ「ミクロウォーク」によって、より詳細に調査される。
上記でＡＳＯウォークに関して記載されたように、１つ以上のＡＳＯ、または対照ＡＳＯ（標的領域にハイブリダイズすると予期されていない配列である、スクランブル配列を有するＡＳＯ）を、例えばトランスフェクションによって、標的ｍＲＮＡ前駆体を発現する疾患関連細胞株へと送達することにより、ＡＳＯミクロウォークが実行される。ＡＳＯの各々のスプライシングを誘発する効果は、本明細書で記載されるように、当該技術分野で既知の方法、例えば、スプライスジャンクションに及ぶプライマーを使用する逆転写酵素（ＲＴ）−ＰＣＲによって評価され得る（「イントロン保持事象の特定」を参照）。対照ＡＳＯ処理された細胞と比較して、ＡＳＯ処理された細胞におけるスプライスジャンクションに及ぶプライマーを使用して生成されたＲＴ−ＰＣＲ産物が減少または欠如することは、標的イントロンのスプライシングが増強されたことを示している。いくつかの実施形態では、スプライシング効率、スプライシングされていないｍＲＮＡ前駆体に対するスプライシングされたｍＲＮＡ前駆体の割合、スプライシングの速度、またはスプライシングの程度は、本明細書に記載されるＡＳＯを使用して改善され得る。標的ｍＲＮＡ前駆体によってコード化されるタンパク質または機能的ＲＮＡの量も、各ＡＳＯが所望の効果（例えば、タンパク質産生の増強）を達成したかどうかを判定するために評価され得る。ウェスタンブロッティング、フローサイトメトリー、免疫蛍光顕微鏡検査法、およびＥＬＩＳＡなどの、タンパク質産生を評価しおよび／または定量するための、当該技術分野で既知の方法も使用することができる。
ｍＲＮＡ前駆体の領域にハイブリダイズされたときに、結果的にスプライシングを増強させ、タンパク質産生を増加させるＡＳＯは、動物モデル、例えば、全長ヒト遺伝子がノックインされたトランスジェニックマウスモデルまたは疾患のヒト化マウスモデルを使用して、インビボで試験され得る。ＡＳＯの投与に適した経路は、ＡＳＯの送達が望まれる疾患および／または細胞型に応じて変化し得る。ＡＳＯは、例えば、腹腔内注射、筋肉注射、皮下注射、または静脈注射によって投与され得る。投与後に、モデル動物の細胞、組織、および／または臓器は、当該技術分野に既知の方法および本明細書に記載される方法によって、例えば、スプライシング（効率、速度、程度）およびタンパク質産生を評価することにより、ＡＳＯ処置の効果を判定するために評価され得る。動物モデルはまた、疾患または疾患重症度の表現型の徴候または行動的な徴候であり得る。
＜実施例＞
以下の実施例は本発明の例証的な実施形態を提供する。当業者であれば、本開示の精神または範囲を変更することなく実行され得る多数の修正および変更を認識するであろう。こうした修正と変更は本開示の範囲内に包含される。実施例はいかなる意味でも本明細書中に記載される開示を限定するものではない。
実施例１：次世代配列決定を用いたＲＮＡｓｅｑによるＰＫＤ２転写産物のイントロン保持事象の特定
イントロン保持事象を特定するためにＰＫＤ２遺伝子によって生成された転写産物のスナップショットを明らかにするために、次世代配列決定を使用して、全トランスクリプトームのショットガン配列決定を実行した。このために、腎上皮細胞の核および細胞質の分画からのｐｏｌｙＡ＋ ＲＮＡを分離し、ＩｌｌｕｍｉｎａのＴｒｕＳｅｑ Ｓｔｒａｎｄｅｄ ｍＲＮＡライブラリＰｒｅｐキットを用いてｃＤＮＡライブラリを構築した。
ライブラリを対末端配列決定（ｐａｉｒ−ｅｎｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅｄ）し、結果として、ヒトゲノムにマッピングされた１００ヌクレオチドの読み取りをもたらした（２００９年２月、ＧＲＣｈ３７／ｈｇ１９アセンブリ）。ＰＫＤ２についての配列決定の結果を、図３に示す。簡潔に言うと、図３は（ＵＣＳＣ Ｇｅｎｏｍｅ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ Ｇｒｏｕｐ （Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ ＆ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ， Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ， Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ， １１５６ Ｈｉｇｈ Ｓｔｒｅｅｔ， Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ， ＣＡ ９５０６４）によって操作され、かつ、例えばＲｏｓｅｎｂｌｏｏｍ， ｅｔ ａｌ．， ２０１５，”Ｔｈｅ ＵＣＳＣ Ｇｅｎｏｍｅ Ｂｒｏｗｓｅｒ ｄａｔａｂａｓｅ： ２０１５ ｕｐｄａｔｅ，”Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ４３， Ｄａｔａｂａｓｅ Ｉｓｓｕｅ ｄｏｉ： １０．１０９３／ｎａｒ／ｇｋｕ１１７７に記載された）ＵＣＳＣのゲノムブラウザを使用して視覚化されたマッピングされた読み取りを示し、読み取りの範囲および数はピーク信号によって推論され得る。ピークの高さは、特定の領域における読み取り密度によって与えられた発現のレベルを示している。ピークをＰＫＤ２エクソン領域およびイントロン領域に一致させられるように、（読み取りシグナルの下に）ＵＣＳＣゲノムブラウザによってＰＫＤ２の模式図（縮尺通りに描かれている）が提供される。このディスプレイに基づいて、ＨＣＮの核分画において高い読み取り密度を有するが、（図３の下のダイアグラム中のイントロン５について示されるように）これらの細胞の細胞質分画においては読み取りが非常に低いかまたは無い、一つのイントロン（示されるように、イントロン５）を特定した。これは、イントロン５が保持され、イントロン５含有転写産物が核内に残っていることを示し、この保持されたＰＫＤ２ ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体が、細胞質に排出されないので、非生産的であることを示唆している。
実施例２：ＰＫＤ２のＡＳＯウォーク標的イントロン５の設計
ＡＳＯウォークは、本明細書中（図４；表１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯＳ：３〜２８０）に記載された方法を使用して、イントロン５を標的とするよう設計された。ヌクレオチド＋４９７から−２０４ｅにおよびントロン５の５’スプライス部位のすぐ上流および下流の領域、および、およびヌクレオチド−４９６から２１２ｅに及ぶイントロン５の３’スプライス部位のすぐ上流および下流の領域が、保持されたイントロン５ ＰＫＤ２ ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体を標的とするようにＡＳＯを設計するために利用される。表１は、設計された例示的なＡＳＯおよびそれらの標的配列を列挙する。この設計から、５ヌクレオチド間隔だけシフトした２’−Ｏ−ＭｅＲＮＡ、ＰＳ骨格、１８量体ＡＳＯを産生し、ＰＣ−２タンパク質産生を増加させるために、ＰＫＤ２ ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体を標的化するよう利用することができる。
実施例３：ＰＫＤ２イントロン５のＡＳＯ標的化による改善したスプライシング効率は転写レベルを増加させる
ＡＳＯを使用してＰＫＤ２イントロン５のスプライシング効率を改善することにより、ＰＫＤ２発現における増加を達成しうるかどうかを判断するために、本明細書に記述された方法が使用されうる。対象の細胞株（例えばＡＲＰＥ−１９細胞、すなわちヒトの網膜の上皮細胞株（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ （ＡＴＣＣ），ＵＳＡ）、またはＨｕｈ−７、すなわちヒトの肝細胞腫細胞株（ＮＩＢＩＯＨＮ，Ｊａｐａｎ）、またはＳＫ−Ｎ−ＡＳ、すなわちヒトの神経芽細胞腫細胞株（ＡＴＣＣ））は、偽トランスフェクト（ｍｏｃｋ−ｔｒａｎｓｆｅｃｔ）されるか、または表１に記載の標的ＡＳＯでトランスフェクトされる。細胞を、製造業者の仕様書に従って、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ＲＮＡｉＭａｘトランスフェクション試薬（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）を用いてトランスフェクトする。簡潔に述べると、ＡＳＯを９６ウェル組織培養プレートに播種し、Ｏｐｔｉ−ＭＥＭで希釈したＲＮＡｉＭａｘと組み合わせる。トリプシンを用いて細胞を剥離し、完全培地に再懸濁し、約２５，０００個の細胞をＡＳＯ−トランスフェクション混合物に加える。トランスフェクション実験は三通りのプレート複製において実行される。最終的なＡＳＯ濃度は８０ｎＭである。製造業者の仕様書に従って、培地をトランスフェクションの６時間後に交換し、細胞をＣｅｌｌｓ−ｔｏ−Ｃｔ溶解試薬を用い、ＤＮＡｓｅ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）で試薬を補充し、２４時間で採取する。製造業者の仕様書に従い、ｃＤＮＡをＣｅｌｌｓ−ｔｏ−Ｃｔ ＲＴ試薬（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）で生成する。対象のイントロンでのスプライシングの量を定量化するために、表１に列挙した、対応するエクソン−エクソンジャンクションに及ぶプローブでＴａｑｍａｎアッセイ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）を用いて、定量ＰＣＲが実行される。Ｔａｑｍａｎアッセイは、ＱｕａｎｔＳｔｕｄｉｏ ７Ｆｌｅｘ Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ ＰＣＲシステム（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）上で製造業者の仕様書に従い実行される。標的遺伝子アッセイ値を、ＲＰＬ３２（ｄｅｌｔａＣｔ）およびプレート適合偽トランスフェクションサンプル（ｄｅｌｔａ−ｄｅｌｔａ Ｃｔ）に対して正規化し、モック定量（２＾−（ｄｅｌｔａ−ｄｅｌｔａ Ｃｔ）に対して倍率変化を生成する。３つのプレート複製のモック（ｍｏｃｋ）に対する平均倍率変化をプロットする。標的遺伝子発現を閾値量の分増加させるものと特定されたＡＳＯは、その標的イントロンでのスプライシングの増加を示唆する。標的イントロン（図３）の保持を確認する全トランスクリプトームデータと共に、これらの結果は、ＡＳＯが律速のイントロンのスプライシング効率を改善し得ることを確認する。
本発明の好ましい実施形態が本明細書中に示され記述された一方、そのような実施形態が一例としてしか提供されていないことは当業者にとって明白だろう。多くの変更、変化および置換が、本発明から逸脱することなく、当業者の心に思い浮かぶであろう。本明細書に記載される本発明の実施形態の様々な代案が、本発明の実施において利用されるかもしれないことを理解されたい。以下の請求項は本発明の範囲を定義するものであり、この請求項とその均等物の範囲内の方法および構造体がそれによって包含されるものであるということが意図されている。

Claims (118)

  1. 被験体の細胞によって標的タンパク質または機能的ＲＮＡの発現を増加させることにより、被験体の多発性嚢胞腎を処置する方法であって、
    細胞は、保持されたイントロン含有ｍＲＮＡ前駆体（ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体）を有し、ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体は、保持されたイントロン、５’スプライス部位に隣接するエクソン、３’スプライス部位に隣接するエクソンを含み、および、ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体は標的タンパク質または機能的ＲＮＡをコードし、
    前記方法は、
    標的タンパク質または機能的ＲＮＡをコードするＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体の標的部分に相補的なアンチセンスオリゴマー（ＡＳＯ）に、被験体の細胞を接触させる工程を含み、これによって、保持されたイントロンは、標的タンパク質または機能的ＲＮＡをコードするＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体から構成的にスプライシングされ、それにより、標的タンパク質または機能的ＲＮＡをコードするｍＲＮＡのレベルを増加させ、被験体の細胞中の標的タンパク質あるいは機能的ＲＮＡの発現を増加させる、方法。
  2. 保持されたイントロン含有ｍＲＮＡ前駆体（ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体）を有する細胞により、ＰＣ−２である標的タンパク質の発現を増加させる方法であって、
    ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体は、保持されたイントロン、保持されたイントロンの５’スプライス部位に隣接するエクソン、保持されたイントロンの３’スプライス部位に隣接するエクソンを含み、および、ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体はＰＣ−２タンパク質をコードし、
    前記方法は、
    ＰＣ−２タンパク質をコードするＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体の標的部分に相補的なアンチセンスオリゴマー（ＡＳＯ）に、被験体の細胞を接触させる工程を含み、これによって、保持されたイントロンは、ＰＣ−２タンパク質をコードするＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体から構成的にスプライシングされ、それにより、ＰＣ−２タンパク質をコードするｍＲＮＡのレベルを増加させ、細胞中のＰＣ−２タンパク質の発現を増加させる、方法。
  3. 標的タンパク質はＰＣ−２である、請求項１に記載の方法。
  4. 標的タンパク質または機能的ＲＮＡは、被験体において量あるいは活性が不足している標的タンパク質あるいは機能的ＲＮＡを機能的に増大させるか、これに取って代わる、補償タンパク質あるいは補償機能的ＲＮＡである、請求項１に記載の方法。
  5. 細胞は、ＰＣ−２タンパク質の不足している量または活性によって引き起こされた疾病を抱える被験体中のものであるか、該被検体からのものである、請求項２に記載の方法。
  6. 標的タンパク質の不足している量は、標的タンパク質のハプロ不全によって引き起こされ、ここで、被験体は機能的な標的タンパク質をコードする第１の対立遺伝子と、標的タンパク質が生成されない第２の対立遺伝子、あるいは非機能的標的タンパク質をコードする第２の対立遺伝子とを有し、ここで、アンチセンスオリゴマーは、第１の対立遺伝子から転写されたＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体の標的部分に結合する、請求項１−５のいずれか１つに記載の方法。
  7. 被験体は、標的タンパク質の量または機能の不足に起因する障害により引き起こされた疾病を抱えており、ここで、被験体は、
    （ａ）
    （ｉ）標的タンパク質が野生型対立遺伝子からの生成と比較して、減少したレベルで生成され、
    （ｉｉ）標的タンパク質が同等の野性型タンパク質と比較して機能が低下した形態で生成され、あるいは、
    （ｉｉｉ）標的タンパク質が生成されない、
    第１の変異対立遺伝子と、
    （ｂ）
    （ｉ）標的タンパク質が野生型対立遺伝子からの生成と比較して、減少したレベルで生成され、
    （ｉｉ）標的タンパク質が同等の野性型タンパク質と比較して機能が低下した形態で生成され、あるいは、
    （ｉｉｉ）標的タンパク質が生成されない、
    第２の変異対立遺伝子とを有し、
    ここで、被験体が第１の変異対立遺伝子（ａ）（ｉｉｉ）を有するとき、第２の変異対立遺伝子は（ｂ）（ｉ）あるいは（ｂ）（ｉｉ）であり、ここで、被験体が第２の変異対立遺伝子（ｂ）（ｉｉｉ）を有するとき、第１の変異対立遺伝子は（ａ）（ｉ）あるいは（ａ）（ｉｉ）であり、ここで、ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体は、（ａ）（ｉ）あるいは（ａ）（ｉｉ）である第１の変異対立遺伝子、および／または、（ｂ）（ｉ）あるいは（ｂ）（ｉｉ）である第２の変異対立遺伝子のいずれかから転写される、請求項１−５のいずれか１つに記載の方法。
  8. 標的タンパク質は、同等の野性型タンパク質と比較して、機能が低下した形態で生成される、請求項７に記載の方法。
  9. 標的タンパク質は、同等の野性型タンパク質と比較して、十分に機能的な形態で生成される、請求項７に記載の方法。
  10. ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体の標的部分は、保持されたイントロンの５’スプライス部位に対して＋６〜保持されたイントロンの３’スプライス部位に対して−１６までの領域内の保持されたイントロンにある、請求項１−９のいずれか１つに記載の方法。
  11. ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体の標的部分は、
    （ａ）保持されたイントロンの５’スプライス部位に対して＋６〜＋４９７の領域、あるいは、
    （ｂ）保持されたイントロンの３’スプライス部位に対して−１６〜−４９６の領域、
    の内部の保持されたイントロンにある、請求項１−９のいずれか１つに記載の方法。
  12. ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体の標的部分は、
    （ａ）保持されたイントロンの５’スプライス部位に隣接するエクソン中の＋２ｅ〜−４ｅの領域、あるいは
    （ｂ）保持されたイントロンの３’スプライス部位に隣接するエクソン中の＋２ｅ〜−４ｅの領域、
    の内部にある、請求項１−９のいずれか１つに記載の方法。
  13. ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体の標的部分は、
    （ａ）保持されたイントロンの５’スプライス部位に対して−４ｅ〜−１，０５４ｅの領域、
    （ｂ）保持されたイントロンの５’スプライス部位に対して＋６〜＋４９９の領域、
    （ｃ）保持されたイントロンの３’スプライス部位に対して−１６〜−４９６の領域、あるいは、
    （ｄ）保持されたイントロンの３’スプライス部位に対して＋２ｅ〜＋１，９１２ｅの領域、
    の内部の保持されたイントロンにある、請求項１−９のいずれか１つに記載の方法。
  14. 標的タンパク質はＰＣ−２である、請求項１−１３のいずれか１つに記載の方法。
  15. ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２に少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、あるいは１００％の配列同一性を備えた配列を含む、請求項１４に記載の方法。
  16. ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、あるいは１００％の配列同一性を備えた遺伝子配列によってコードされる、請求項１４に記載の方法。
  17. ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体の標的部分は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２８１の少なくとも８つの隣接する核酸を含む領域に少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、あるいは１００％の配列同一性を備えた配列を含む、請求項１４に記載の方法。
  18. ＡＳＯは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３−２８０のいずれか１つに少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、あるいは１００％相補的な配列を含む、請求項１４に記載の方法。
  19. ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体の標的部分は、保持されたイントロン５の５’スプライス部位に対して−２０４ｅ〜＋４９７までの領域内、あるいは保持されたイントロン５の３’スプライス部位に対して−４９６〜＋２１２ｅの領域内にある、請求項１４に記載の方法。
  20. ＡＳＯは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３−２８０のいずれか１つに少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、あるいは１００％相補的な配列を含む、請求項１９に記載の方法。
  21. ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体の標的部分は、保持されたイントロン５の５’スプライス部位に対して−２０４ｅ〜−４ｅの領域内のエクソン５にある、請求項１４に記載の方法。
  22. ＡＳＯは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３−４３のいずれか１つに少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、あるいは１００％相補的な配列を含む、請求項２１に記載の方法。
  23. ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体の標的部分は、保持されたイントロンの５’スプライス部位に対して＋６〜＋４９７の領域内の保持されたイントロン５にある、請求項１４に記載の方法。
  24. ＡＳＯは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４４−１４０のいずれか１つに少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、あるいは１００％相補的な配列を含む、請求項２３に記載の方法。
  25. ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体の標的部分は、保持されたイントロンの３’スプライス部位に対して−１６〜−４９６の領域内の保持されたイントロン５にある、請求項１４に記載の方法。
  26. ＡＳＯは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４１−２３７のいずれか１つに少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、あるいは１００％相補的な配列を含む、請求項２５に記載の方法。
  27. ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体の標的部分は、保持されたイントロン５の３’スプライス部位に対して＋２ｅ〜＋２１２ｅの領域内のエクソン６にある、請求項１４に記載の方法。
  28. ＡＳＯは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３８−２８０のいずれか１つに少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、あるいは１００％相補的な配列を含む、請求項２７に記載の方法。
  29. アンチセンスオリゴマーは、機能的ＲＮＡまたは標的タンパク質をコードする遺伝子から転写されたｍＲＮＡ前駆体の選択的スプライシングを調節することにより、標的タンパク質または機能的ＲＮＡの量を増加させない、請求項１−２８のいずれか１つに記載の方法。
  30. アンチセンスオリゴマーは、標的タンパク質または機能的ＲＮＡをコードする遺伝子の突然変異に起因する異常なスプライシングを調節することにより、標的タンパク質または機能的ＲＮＡの量を増加させない、請求項１−２９のいずれか１つに記載の方法。
  31. ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体は、全長のｍＲＮＡ前駆体の部分的なスプライシング、または野生型のｍＲＮＡ前駆体の部分的なスプライシングによって生成された、請求項１−３０のいずれか１つに記載の方法。
  32. 標的タンパク質または機能的ＲＮＡをコードするｍＲＮＡは、全長の成熟ｍＲＮＡ、あるいは野生型の成熟ｍＲＮＡである、請求項１−３１のいずれか１つに記載の方法。
  33. 生成された標的タンパク質は、全長のタンパク質あるいは野生型のタンパク質である、請求項１−３２のいずれか１つに記載の方法。
  34. アンチセンスオリゴマーと接触させた細胞中で生成された標的タンパク質または機能的ＲＮＡをコードするｍＲＮＡの総量は、対照細胞中で生成された標的タンパク質または機能的ＲＮＡをコードするｍＲＮＡの総量と比較して、約１．１〜約１０倍、約１．５〜約１０倍、約２〜約１０倍、約３〜約１０倍、約４〜約１０倍、約１．１〜約５倍、約１．１〜約６倍、約１．１〜約７倍、約１．１〜約８倍、約１．１〜約９倍、約２〜約５倍、約２〜約６倍、約２〜約７倍、約２〜約８倍、約２〜約９倍、約３〜約６倍、約３〜約７倍、約３〜約８倍、約３〜約９倍、約４〜約７倍、約４〜約８倍、約４〜約９倍、少なくとも約１．１倍、少なくとも約１．５倍、少なくとも約２倍、少なくとも約２．５倍、少なくとも約３倍、少なくとも約３．５倍、少なくとも約４倍、少なくとも約５倍、あるいは少なくとも約１０倍増加する、請求項１−３３のいずれか１つに記載の方法。
  35. アンチセンスオリゴマーと接触させた細胞によって生成された標的タンパク質の総量は、対照細胞によって生成された標的タンパク質の総量として、約１．１〜約１０倍、約１．５〜約１０倍、約２〜約１０倍、約３〜約１０倍、約４〜約１０倍、約１．１〜約５倍、約１．１〜約６倍、約１．１〜約７倍、約１．１〜約８倍、約１．１〜約９倍、約２〜約５倍、約２〜約６倍、約２〜約７倍、約２〜約８倍、約２〜約９倍、約３〜約６倍、約３〜約７倍、約３〜約８倍、約３〜約９倍、約４〜約７倍、約４〜約８倍、約４〜約９倍、少なくとも約１．１倍、少なくとも約１．５倍、少なくとも約２倍、少なくとも約２．５倍、少なくとも約３倍、少なくとも約３．５倍、少なくとも約４倍、少なくとも約５倍、あるいは少なくとも約１０倍増加する、請求項１−３４のいずれか１つに記載の方法。
  36. アンチセンスオリゴマーは、ホスホロチオエート結合またはホスホロジアミデート結合を含む骨格修飾を含む、請求項１−３５のいずれか１つに記載の方法。
  37. アンチセンスオリゴマーはホスホロジアミデートモルホリノ、ロックド核酸、ペプチド核酸、２’−Ｏ−メチル、２’−フルオロ、あるいは２’−Ｏ−メトキシエチル部分を含む、請求項１−３６のいずれか１つに記載の方法。
  38. アンチセンスオリゴマーは少なくとも１つの修飾された糖部を含む、請求項１−３７のいずれか１つに記載の方法。
  39. それぞれの糖部は修飾された糖部である、請求項３８に記載の方法。
  40. アンチセンスオリゴマーは、８〜５０の核酸塩基、８〜４０の核酸塩基、８〜３５の核酸塩基、８〜３０の核酸塩基、８〜２５の核酸塩基、８〜２０の核酸塩基、８〜１５の核酸塩基、９〜５０の核酸塩基、９〜４０の核酸塩基、９〜３５の核酸塩基、９〜３０の核酸塩基、９〜２５の核酸塩基、９〜２０の核酸塩基、９〜１５の核酸塩基、１０〜５０の核酸塩基、１０〜４０の核酸塩基、１０〜３５の核酸塩基、１０〜３０の核酸塩基、１０〜２５の核酸塩基、１０〜２０の核酸塩基、１０〜１５の核酸塩基、１１〜５０の核酸塩基、１１〜４０の核酸塩基、１１〜３５の核酸塩基、１１〜３０の核酸塩基、１１〜２５の核酸塩基、１１〜２０の核酸塩基、１１〜１５の核酸塩基、１２〜５０の核酸塩基、１２〜４０の核酸塩基、１２〜３５の核酸塩基、１２〜３０の核酸塩基、１２〜２５の核酸塩基、１２〜２０の核酸塩基、あるいは１２〜１５の核酸塩基からなる、請求項１−３９のいずれか１つに記載の方法。
  41. アンチセンスオリゴマーは、タンパク質をコードするＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体の標的部分に少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、あるいは１００％相補的である、請求項１−４０のいずれか１つに記載の方法。
  42. 細胞は、標的タンパク質または機能的ＲＮＡをコードする遺伝子から転写されたＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体の集団を含み、ここで、ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体の集団は少なくとも１つの保持されたイントロンを含み、および、ここで、アンチセンスオリゴマーは、ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体の集団で最も豊富な保持されたイントロンに結合する、請求項１−４１のいずれか１つに記載の方法。
  43. 最も豊富な保持されたイントロンに対するアンチセンスオリゴマーの結合は、標的タンパク質または機能的ＲＮＡをコードするｍＲＮＡを生成するＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体の集団からの少なくとも１つの保持されたイントロンのスプライシングアウトを誘発する、請求項４２に記載の方法。
  44. 細胞は、標的タンパク質または機能的ＲＮＡをコードする遺伝子から転写されたＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体の集団を含み、ここで、ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体の集団は２つ以上の保持されたイントロンを含み、および、ここで、アンチセンスオリゴマーは、ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体の集団で２番目に豊富な保持されたイントロンに結合する、請求項１−４３のいずれか１つに記載の方法。
  45. ２番目に豊富な保持されたイントロンに対するアンチセンスオリゴマーの結合は、標的タンパク質または機能的ＲＮＡをコードするｍＲＮＡを生成するＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体の集団からの２つ以上の保持されたイントロンのスプライシングアウトを誘発する、請求項４４に記載の方法。
  46. 前記方法はＰＣ−２タンパク質発現を評価する工程をさらに含む、請求項１−４５のいずれか１つに記載の方法。
  47. アンチセンスオリゴマーはＰＫＤ２ ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体の標的部分に結合し、ここで、標的部分はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３−２８０から選択される配列である、請求項１−４６のいずれか１つに記載の方法。
  48. 被験体はヒトである、請求項１−４７のいずれか１つに記載の方法。
  49. 被験体はヒト以外の動物である、請求項１−４７のいずれか１つに記載の方法。
  50. 被験体は胎児、胚、あるいは子供である、請求項１−４８のいずれか１つに記載の方法。
  51. 細胞はエクスビボである、請求項１−４７のいずれか１つに記載の方法。
  52. アンチセンスオリゴマーは、被験体の腹腔内注射、筋肉内注射、皮下注射、あるいは静脈内注射によって投与される、請求項１−５１のいずれか１つに記載の方法。
  53. ５’スプライス部位に隣接するエクソンの−３ｅ〜−１ｅと、保持されたイントロンの＋１〜＋６にある９つのヌクレオチドは、対応する野性型配列と同一である、請求項１−５２のいずれか１つに記載の方法。
  54. 保持されたイントロンの−１５〜−１と３’スプライス部位に隣接するエクソンの＋１ｅにある１６のヌクレオチドは、対応する野性型配列と同一である、請求項１−５３のいずれか１つに記載の方法。
  55. 請求項１−５４のいずれか１つの方法で使用されるアンチセンスオリゴマー。
  56. ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３−２８０のいずれか１つに対して少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、あるいは１００％の配列同一性を備えた配列を含む、アンチセンスオリゴマー。
  57. 請求項５５または５６のアンチセンスオリゴマーと、薬学的に許容可能な賦形剤、希釈剤、または担体とを含む医薬組成物。
  58. 腹腔内注射、筋肉内注射、皮下注射、あるいは静脈内注射によって、請求項５７の医薬組成物を投与することにより被験体を処置する方法。
  59. 不足しているタンパク質または不足している機能的ＲＮＡに関連付けられる被験体の多発性嚢胞腎を処置するために細胞によって標的タンパク質あるいは機能的ＲＮＡの発現を増加させる方法で使用されるアンチセンスオリゴマーを含む組成物であって、
    不足しているタンパク質または不足している機能的ＲＮＡは、被験体において量あるいは活性が不足しており、ここで、アンチセンスオリゴマーは、標的タンパク質または機能的ＲＮＡをコードする、保持されたイントロン含有ｍＲＮＡ前駆体（ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体）の構成的なスプライシングを増強し、
    ここで、
    標的タンパク質は、
    （ａ）不足しているタンパク質、あるいは
    （ｂ）被験体において不足しているタンパク質を機能的に増大させるか、これに取って代わる、補償タンパク質であり、
    ここで、
    機能的ＲＮＡは、
    （ｃ）不足しているＲＮＡ、あるいは、
    （ｄ）被験体の不足している機能的ＲＮＡを機能的に増大させるか、これに取って代わる、補償機能的ＲＮＡであり、
    ここで、
    ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体は、保持されたイントロン、５’スプライス部位に隣接するエクソン、および３’スプライス部位に隣接するエクソンを含み、ここで、保持されたイントロンは、標的タンパク質または機能的ＲＮＡをコードするＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体からスプライシングされ、それによって、被験体の標的タンパク質あるいは機能的ＲＮＡの生成あるいは活性を増加させる、組成物。
  60. 被験体においてＰＣ−２タンパク質に関連する疾病を処置する方法で使用されるアンチセンスオリゴマーを含む組成物であって、
    当該方法は、被験体の細胞によってＰＣ−２タンパク質の発現を増加させる工程であって、細胞が、保持されたイントロン、保持されたイントロンの５’スプライス部位に隣接するエクソン、保持されたイントロンの３’スプライス部位に隣接するエクソンを含む、保持されたイントロン含有ｍＲＮＡ前駆体を有し、および、ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体がＰＣ−２タンパク質をコードする、工程と、アンチセンスオリゴマーに細胞を接触させる工程であって、これによって、保持されたイントロンは、ＰＣ−２タンパク質をコードするＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体転写産物から構成的にスプライシングされ、それにより、被験体の細胞においてＰＣ−２タンパク質をコードするｍＲＮＡのレベルを増加させ、ＰＣ−２タンパク質の発現を増加させる、工程を含む、組成物。
  61. 疾病は疾患または障害である、請求項６０に記載の組成物。
  62. 疾患または障害は多発性嚢胞腎である、請求項６１に記載の組成物。
  63. 標的タンパク質とＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体はＰＫＤ２遺伝子によってコードされる、請求項６２に記載の組成物。
  64. アンチセンスオリゴマーは、保持されたイントロンの５’スプライス部位に対して＋６から、保持されたイントロンの３’スプライス部位に対して−１６までの領域内の保持されたイントロンにあるＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体の一部を標的とする、請求項５９−６３のいずれか１つに記載の組成物。
  65. アンチセンスオリゴマーはＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体の一部を標的とし、これは、
    （ａ）保持されたイントロンの５’スプライス部位に対して＋６〜＋４９７の領域、あるいは、
    （ｂ）保持されたイントロンの３’スプライス部位に対して−１６〜−４９６の領域、
    の内部の保持されたイントロンにある、請求項５９−６４のいずれか１つに記載の組成物。
  66. アンチセンスオリゴマーは、少なくとも１つの保持されたイントロンの５’スプライス部位の約１００ヌクレオチド下流から、少なくとも１つの保持されたイントロンの３’スプライス部位の約１００ヌクレオチド上流までの領域内にあるＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体の一部を標的とする、請求項５９−６３のいずれか１つに記載の組成物。
  67. ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体の標的部分は、
    （ａ）保持されたイントロンの５’スプライス部位に隣接するエクソン中の＋２ｅ〜−４ｅの領域、あるいは、
    （ｂ）保持されたイントロンの３’スプライス部位に隣接するエクソン中の＋２ｅ〜−４ｅの領域、
    の内部にある、請求項５９−６３のいずれか１つに記載の組成物。
  68. ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体の標的部分は、
    （ａ）保持されたイントロンの５’スプライス部位に対して−４ｅ〜−１，０５４ｅの領域、
    （ｂ）保持されたイントロンの５’スプライス部位に対して＋６〜＋４９９の領域、
    （ｃ）保持されたイントロンの３’スプライス部位に対して−１６〜−４９６の領域、あるいは、
    （ｄ）保持されたイントロンの３’スプライス部位に対して＋２ｅ〜＋１，９１２ｅの領域、
    の内部にある、請求項５９−６３のいずれか１つに記載の組成物。
  69. 標的タンパク質はＰＣ−２である、請求項５９−６８のいずれか１つに記載の組成物。
  70. ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２に少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、あるいは１００％の配列同一性を備えた配列を含む、請求項６９に記載の組成物。
  71. ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、あるいは１００％の配列同一性を備えた遺伝子配列によってコードされる、請求項６９に記載の組成物。
  72. ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体の標的部分は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２８１の少なくとも８つの隣接する核酸を含む領域に少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、あるいは１００％の配列同一性を備えた配列を含む、請求項６９に記載の組成物。
  73. ＡＳＯは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３−２８０のいずれか１つに少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、あるいは１００％相補的な配列を含む、請求項６９に記載の組成物。
  74. ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体の標的部分は、保持されたイントロン５の５’スプライス部位に対して−２０４ｅ〜＋４９７までの領域内、あるいは保持されたイントロン５の３’スプライス部位に対して−４９６〜＋２１２ｅの領域内にある、請求項６９に記載の組成物。
  75. ＡＳＯは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３−２８０のいずれか１つに少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、あるいは１００％相補的な配列を含む、請求項７４に記載の組成物。
  76. ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体の標的部分は、保持されたイントロン５の５’スプライス部位に対して−２０４ｅ〜−４ｅの領域内のエクソン５にある、請求項６９に記載の組成物。
  77. ＡＳＯは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３−４３のいずれか１つに少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、あるいは１００％相補的な配列を含む、請求項７６に記載の組成物。
  78. ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体の標的部分は、保持されたイントロンの５’スプライス部位に対して＋６〜＋４９７の領域内の保持されたイントロン５にある、請求項６９に記載の組成物。
  79. ＡＳＯは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４４−１４０のいずれか１つに少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、あるいは１００％相補的な配列を含む、請求項７８に記載の組成物。
  80. ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体の標的部分は、保持されたイントロンの３’スプライス部位に対して−１６〜−４９６の領域内の保持されたイントロン５にある、請求項６９に記載の組成物。
  81. ＡＳＯは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４１−２３７のいずれか１つに少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、あるいは１００％相補的な配列を含む、請求項８０に記載の組成物。
  82. ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体の標的部分は、保持されたイントロン５の３’スプライス部位に対して＋２ｅ〜＋２１２ｅの領域内のエクソン６にある、請求項６９に記載の組成物。
  83. ＡＳＯは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３８−２８０のいずれか１つに少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、あるいは１００％相補的な配列を含む、請求項８２に記載の組成物。
  84. アンチセンスオリゴマーは、標的タンパク質または機能的ＲＮＡをコードする遺伝子から転写されたｍＲＮＡ前駆体の選択的スプライシングを調節することにより、標的タンパク質または機能的ＲＮＡの量を増加させない、請求項５９−８３のいずれか１つに記載の組成物。
  85. アンチセンスオリゴマーは、標的タンパク質または機能的ＲＮＡをコードする遺伝子の突然変異に起因する異常なスプライシングを調節することにより、機能的ＲＮＡまたは機能的タンパク質の量を増加させない、請求項５９−８４のいずれか１つに記載の組成物。
  86. ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体は、全長のｍＲＮＡ前駆体、あるいは野生型のｍＲＮＡ前駆体の部分的なスプライシングによって生成された、請求項５９−８５のいずれか１つに記載の組成物。
  87. 標的タンパク質または機能的ＲＮＡをコードするｍＲＮＡは、全長の成熟ｍＲＮＡ、あるいは野生型の成熟ｍＲＮＡである、請求項５９−８６のいずれか１つに記載の組成物。
  88. 生成された標的タンパク質は、全長のタンパク質あるいは野生型のタンパク質である、請求項５９−８７のいずれか１つに記載の組成物。
  89. 保持されたイントロンは律速イントロンである、請求項５９−８８のいずれか１つに記載の組成物。
  90. 前記保持されたイントロンは前記ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体で最も豊富な保持されたイントロンである、請求項５９−８９のいずれか１つに記載の組成物。
  91. 保持されたイントロンは前記ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体で２番目に豊富な保持されたイントロンである、請求項５９−８９のいずれか１つに記載の組成物。
  92. アンチセンスオリゴマーは、ホスホロチオエート結合またはホスホロジアミデート結合を含む骨格修飾を含む、請求項５９−９１のいずれか１つに記載の組成物。
  93. 前記アンチセンスオリゴマーはアンチセンスオリゴヌクレオチドである、請求項５９−９２のいずれか１つに記載の組成物。
  94. アンチセンスオリゴマーはホスホロジアミデートモルホリノ、ロックド核酸、ペプチド核酸、２’−Ｏ−メチル、２’−フルオロ、あるいは２’−Ｏ−メトキシエチル部分を含む、請求項５９−９３のいずれか１つに記載の組成物。
  95. アンチセンスオリゴマーは少なくとも１つの修飾された糖部を含む、請求項５９−９４のいずれか１つに記載の組成物。
  96. それぞれの糖部は修飾された糖部である、請求項９５に記載の組成物。
  97. アンチセンスオリゴマーは、８〜５０の核酸塩基、８〜４０の核酸塩基、８〜３５の核酸塩基、８〜３０の核酸塩基、８〜２５の核酸塩基、８〜２０の核酸塩基、８〜１５の核酸塩基、９〜５０の核酸塩基、９〜４０の核酸塩基、９〜３５の核酸塩基、９〜３０の核酸塩基、９〜２５の核酸塩基、９〜２０の核酸塩基、９〜１５の核酸塩基、１０〜５０の核酸塩基、１０〜４０の核酸塩基、１０〜３５の核酸塩基、１０〜３０の核酸塩基、１０〜２５の核酸塩基、１０〜２０の核酸塩基、１０〜１５の核酸塩基、１１〜５０の核酸塩基、１１〜４０の核酸塩基、１１〜３５の核酸塩基、１１〜３０の核酸塩基、１１〜２５の核酸塩基、１１〜２０の核酸塩基、１１〜１５の核酸塩基、１２〜５０の核酸塩基、１２〜４０の核酸塩基、１２〜３５の核酸塩基、１２〜３０の核酸塩基、１２〜２５の核酸塩基、１２〜２０の核酸塩基、あるいは１２〜１５の核酸塩基からなる、請求項５９−９６のいずれか１つに記載の組成物。
  98. 請求項５９−９７の組成物のいずれか１つのアンチセンスオリゴマーと、薬学的に許容可能な賦形剤、希釈剤、または担体とを含む医薬組成物。
  99. 腹腔内注射、筋肉内注射、皮下注射、あるいは静脈内注射によって請求項９８の医薬組成物を投与することにより被験体を処置する方法。
  100. 不足しているＰＫＤ２ ｍＲＮＡ転写産物の標的配列にハイブリダイズされるアンチセンスオリゴマーであって、不足しているＰＫＤ２ ｍＲＮＡ転写産物が保持されたイントロンを含み、アンチセンスオリゴマーが不足しているＰＫＤ２ ｍＲＮＡ転写産物からの保持されたイントロンのスプライシングアウトを誘発する、アンチセンスオリゴマーと、
    薬学的に許容可能な賦形剤、希釈剤、または担体とを含む、
    医薬組成物。
  101. 不足しているＰＫＤ２ ｍＲＮＡ転写産物はＰＫＤ２ ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体転写産物である、請求項１００に記載の医薬組成物。
  102. ＰＫＤ２ ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体転写産物の標的部分は、保持されたイントロンの５’スプライス部位に対して約＋５００〜保持されたイントロンの３’スプライス部位に対して約−５００までの領域内の保持されたイントロンにある、請求項１００または１０１に記載の医薬組成物。
  103. ＰＫＤ２ ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体転写産物は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に対して少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、あるいは１００％の配列同一性を備えた遺伝子配列によってコードされる、請求項１００または１０１に記載の医薬組成物。
  104. ＰＫＤ２ ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体転写産物は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２に対して少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、あるいは１００％の配列同一性を備えた配列を含む、請求項１００または１０１に記載の医薬組成物。
  105. アンチセンスオリゴマーは、ホスホロチオエート結合またはホスホロジアミデート結合を含む骨格修飾を含む、請求項１００に記載の医薬組成物。
  106. アンチセンスオリゴマーはアンチセンスオリゴヌクレオチドである、請求項１００に記載の医薬組成物。
  107. アンチセンスオリゴマーは、ホスホロジアミデートモルホリノ、ロックド核酸、ペプチド核酸、２’−Ｏ−メチル、２’−フルオロ、あるいは２’−Ｏ−メトキシエチル部分を含む、請求項１００に記載の医薬組成物。
  108. アンチセンスオリゴマーは少なくとも１つの修飾された糖部を含む、請求項１００に記載の医薬組成物。
  109. アンチセンスオリゴマーは、８〜５０の核酸塩基、８〜４０の核酸塩基、８〜３５の核酸塩基、８〜３０の核酸塩基、８〜２５の核酸塩基、８〜２０の核酸塩基、８〜１５の核酸塩基、９〜５０の核酸塩基、９〜４０の核酸塩基、９〜３５の核酸塩基、９〜３０の核酸塩基、９〜２５の核酸塩基、９〜２０の核酸塩基、９〜１５の核酸塩基、１０〜５０の核酸塩基、１０〜４０の核酸塩基、１０〜３５の核酸塩基、１０〜３０の核酸塩基、１０〜２５の核酸塩基、１０〜２０の核酸塩基、１０〜１５の核酸塩基、１１〜５０の核酸塩基、１１〜４０の核酸塩基、１１〜３５の核酸塩基、１１〜３０の核酸塩基、１１〜２５の核酸塩基、１１〜２０の核酸塩基、１１〜１５の核酸塩基、１２〜５０の核酸塩基、１２〜４０の核酸塩基、１２〜３５の核酸塩基、１２〜３０の核酸塩基、１２〜２５の核酸塩基、１２〜２０の核酸塩基、あるいは１２〜１５の核酸塩基を含む、請求項１００に記載の医薬組成物。
  110. アンチセンスオリゴマーは、ＰＫＤ２ ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体転写産物の標的部分に少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、あるいは１００％相補的である、請求項１００または１０１に記載の医薬組成物。
  111. ＰＫＤ２ ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体転写産物の標的部分は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２８１内にある、請求項１００または１０１に記載の医薬組成物。
  112. アンチセンスオリゴマーは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３−２８０のいずれか１つに対して少なくとも約８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、あるいは９９％の配列同一性であるヌクレオチド配列を含む、請求項１００に記載の医薬組成物。
  113. アンチセンスオリゴマーは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３−２８０から選択されたヌクレオチド配列を含む、請求項１００に記載の医薬組成物。
  114. 医薬組成物は、髄腔内注射、脳室内注射、腹腔内注射、筋肉内注射、皮下注射、あるいは静脈内注射のために製剤される、請求項１００−１１３のいずれか１つに記載の医薬組成物。
  115. ＰＣ−２タンパク質の機能的な形態をコードする十分に処理されたＰＫＤ２ ｍＲＮＡ転写産物を生成するべく、保持されたイントロンの除去を促すために不足しているＰＫＤ２ ｍＲＮＡ転写産物の処理を誘発する方法であって、
    前記方法は、
    （ａ）被験体の標的細胞へアンチセンスオリゴマーを接触させる工程と、
    （ｂ）不足しているＰＫＤ２ ｍＲＮＡ転写産物へアンチセンスオリゴマーをハイブリダイズする工程であって、不足しているＰＫＤ２ ｍＲＮＡ転写産物が、ＰＣ−２タンパク質の機能的な形態をコードすることができ、少なくとも１つの保持されたイントロンを含む、工程と、
    （ｃ）ＰＣ−２タンパク質の機能的な形態をコードする十分に処理されたＰＫＤ２ ｍＲＮＡ転写産物を生成するために不足しているＰＫＤ２ ｍＲＮＡ転写産物から少なくとも１つの保持されたイントロンを除去する工程と、
    （ｄ）十分に処理されたＰＫＤ２ ｍＲＮＡ転写産物からＰＣ−２タンパク質の機能的な形態を翻訳する工程、
    を含む、方法。
  116. 保持されたイントロンは保持されたイントロン全体である、請求項１１５に記載の方法。
  117. 不足しているＰＫＤ２ ｍＲＮＡ転写産物はＰＫＤ２ ｍＲＮＡ前駆体転写産物である、請求項１１５に記載の方法。
  118. ＰＣ２タンパク質の量と活性の不足によって引き起こされた疾病を抱える被験体を処置する方法であって、
    ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３−２８０のいずれか１つに対して少なくとも約８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、あるいは９９％の配列同一性を備えたヌクレオチド配列を含むアンチセンスオリゴマーを被験体に投与する工程を含む、方法。
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