JP5466402B2 - iNOSの発現制御作用を有するセンスオリゴヌクレオチド及びそれを含む組成物 - Google Patents

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Description

本発明は、iNOS(誘導型一酸化窒素合成酵素;inducible nitric oxide synthase)の発現制御を目的として、iNOS遺伝子のmRNAに相補的な塩基配列を持つ一本鎖RNA(アンチセンストランスクリプト)に相補的な配列を持つセンスオリゴヌクレオチドに関する。
生体内における一酸化窒素(NO)は、マクロファージ、血管内皮細胞、神経領域等各所から産生するとされ、その作用としては殺菌作用、血管弛緩作用、あるいは神経情報伝達物質としても作用している。
一酸化窒素が産生する際に介在しているのが、一酸化窒素合成酵素(NOS;nitric oxide synthase)であり、NOSは体内の作動場所により誘導型NOS(iNOS;inducible NOS)、神経型NOS(nNOS;neuronal NOS)、及び血管内皮型NOS(eNOS;endothelial NOS)の3つに分類され、特にiNOSによるNO産生はその他のNO合成システムである神経型NOS及び血管内皮型NOSに比較すると、長時間その活性が持続し、より多量のNO(1μM以上)が産生されることが知られている。
iNOSは主に、マクロファージ、血管内皮細胞、血管平滑筋細胞、消化管上皮細胞、気管支上皮細胞、肝細胞、ミクログリア細胞等において、細胞毒素や感染や炎症性病巣で産生されるIL−1β(Interleukin - 1β)、TNF−α(Tumor Necrosis Factor - α)、IFN−γ(Interferon - γ)等の炎症性サイトカインの攻撃をうけて発現し、NOを産生する。過剰に生成するNOは、生体の感染防御反応での主要な炎症性メディエーターとして機能している。
iNOSの発現は、炎症反応や細菌、真菌、ウイルス、原虫など多様な病原体の感染に伴いもたらされる。例えば、グラム陰性菌の普遍的な構成成分であるリポポリサッカライド(LPS)やグラム陽性菌の細胞壁の成分であるリポタイコ酸(LTA)の刺激により、あるいは炎症性サイトカインの間接的な産生誘導を介して、iNOSの誘導がもたらされることが知られている。また最近では、各種ウイルスの生体内増殖でも、NO合成の亢進が明らかにされており、この場合のiNOSの誘導は、主にIL−1β、IFN−γなどの炎症性サイトカインの産生を介していることが分かっている。
iNOS由来のNOは殺菌、抗ウイルス、抗寄生虫、抗腫瘍作用を示し、生体系の生命維持においてなくてはならない存在である。しかし一方、炎症反応等によってiNOSが活性化され過剰なNOを産生すると、活性酸素と反応して生じた強いパーオキシナイトライト(ペルオキシ亜硝酸、過酸化亜硝酸)はDNAを損傷し、突然変異や発がんを惹起する等の負の作用が起こる。
種々の要因によりiNOSが過剰に発現し、過剰なNOを産生することにより、毒性ショックやある種のサイトカインによる治療等による全身性血圧低下、血圧応答低下、自己免疫疾患、炎症、関節炎、リウマチ性関節炎、糖尿病、炎症性腸疾患、血管機能不全、病因性血管拡張、組織損傷、心臓血管系虚血、痛感過敏症、脳虚血、悪液質、がん等の種々の疾病を引き起こすことが明らかになっている。
従って、iNOSの発現を制御することは生体防御やNOの過剰産生が関与する疾患、例えば、発がんや炎症性疾患、細菌感染等によるエンドトキシンショックなどの治療・予防の面において非常に重要である。
従来、RNAi(RNA干渉:RNA interference)と呼ばれる、二本鎖のRNAで標的となるmRNAを切断して転写を抑制する方法が知られているが、通常RNAiは20塩基対程度の塩基長であり(特許文献1:特開2005−13224号公報)、その二本鎖オリゴヌクレオチド及びそのアンチセンスRNAのスクリーニング方法が開示されている。また、小核酸分子、例えば短干渉核酸(siNA)、短干渉RNA(siRNA)、二本鎖RNA(dsRNA)、マイクロRNA(miRNA)、および短ヘアピンRNA(shRNA)分子を用いるRNA干渉(RNAi)により、インターロイキン遺伝子、インターロイキンスーパーファミリー遺伝子、または遺伝子発現および/または活性のインターロイキン経路に関与する遺伝子の発現及び活性を調節するのに有用な化合物に関して開示されている(特許文献2:特開2005−524393号公報)。
細胞内にアンチセンスRNAが存在すると、それと相補的なmRNAとハイブリダイズし、mRNAからタンパク質への翻訳が阻害されるために遺伝子の発現を阻害することができる。人為的にアンチセンスRNAを細胞内に導入すれば、ターゲット遺伝子の発現を阻害することができるので、現在、遺伝子の機能を解明する技術として使われており、医薬品への応用も検討されている。iNOS遺伝子に関してはこれまで、アンチセンスRNAの存在は確認されていなかった。また、これまで、mRNAからの転写に際してmRNAの安定化に寄与しているタンパク質の存在が示唆されていた(非特許文献1:Eur. J. Pharmacol. 500: 255-266 (2004))が、その詳細については不明であり、iNOSの発現制御に関しては不明な点が多かった。
特開2005−13224号公報 特開2005−524393号公報 Eur. J. Pharmacol. 500: 255-266 (2004)
本発明は、iNOSの発現制御を目的として、iNOS遺伝子のmRNAに相補的な塩基配列を持つ一本鎖RNA(アンチセンストランスクリプト)に相補的な配列を持つセンスオリゴヌクレオチドを提供する。
本発明者らは、細胞内において、mRNAに相補的な配列を持つ一本鎖RNA(アンチセンス転写物(アンチセンストランスクリプト))が存在し、それが従来のアンチセンスRNAとは異なり、mRNAの安定化に寄与しているケースがあることを見出し、同日付で特許出願している。
本発明者らは、さらに、iNOSの発現制御に関して鋭意研究を重ねた結果、上記一本鎖RNA(アンチセンス転写物)に相補的な配列を持つセンスオリゴヌクレオチドを用いて、アンチセンス転写物にハイブリダイズしてそのはたらきを抑制することでmRNAの安定性に干渉し、その結果iNOSの発現を抑制し、NOの過剰産生を抑制する方法を見い出し、本発明を完成させた。
すなわち、本発明は以下のiNOSmRNAアンチセンスRNA(iNOSmRNAアンチセンス転写物)に相補的な配列を有するセンスオリゴヌクレオチド、NO産生抑制活性を有する組成物、及びiNOS産生量の抑制方法に関する。
1.iNOS(誘導型一酸化窒素合成酵素)mRNAに相補的な配列を有するiNOSmRNAアンチセンスRNA(iNOSmRNAアンチセンス転写物)に相補的な配列を有するセンスオリゴヌクレオチド。
2.配列番号1に示された核酸配列を含む前記iNOSmRNAアンチセンスRNA(iNOSmRNAアンチセンス転写物)に相補的な配列を有する前記1に記載のセンスオリゴヌクレオチド。
3.前記iNOSmRNAアンチセンスRNA(iNOSmRNAアンチセンス転写物)における熱力学的に安定でないループ構造に対応する領域に相補的な配列を有する前記1または2に記載のセンスオリゴヌクレオチド。
4.16塩基以上335塩基以下の塩基長を有する前記1〜3のいずれかに記載のセンスオリゴヌクレオチド。
5.核酸分解酵素による分解に対して安定化された前記1〜4のいずれかに記載のセンスオリゴヌクレオチドおよびその誘導体。
6.安定化がLNA、PNA、ENA、モルホリノおよびその他の修飾法による前記5に記載のセンスオリゴヌクレオチド。
7.前記1〜6のいずれかに記載のセンスオリゴヌクレオチドを含有し、iNOSmRNAの分解を促進するNO産生抑制活性を有する組成物。
8.細胞内にiNOSmRNAアンチセンスRNA(iNOSmRNAアンチセンス転写物)に相補的な配列を有するセンスオリゴヌクレオチドを導入することを特徴とするiNOS産生量の抑制方法。
本発明のiNOSmRNAに相補的な配列を持つアンチセンス転写物に相補的な配列を持つセンスオリゴヌクレオチド、及びそのフォスフォロチオエネート型、すなわちS化センスオリゴは、NOの過剰産生が関与する疾患である炎症性疾患や、細菌感染によるエンドトキシンショック、発がん等に対して有効な医薬組成物、すなわち医薬として、あるいはそれらに対して有効な健康食品組成物、すなわち健康食品として用いることができる。
本発明は、細胞内において、誘導型一酸化窒素合成酵素iNOS(inducible nitric oxide synthase)mRNAの安定化に寄与しているiNOSmRNAに相補的な配列を持つ一本鎖RNA(アンチセンス転写物)に相補的な配列を持つセンスオリゴヌクレオチドを用いて、アンチセンス転写物にハイブリダイズしてそのはたらきを抑制することでmRNAの安定性に干渉し、その結果iNOSの発現を抑制し、NOの過剰産生を抑制する。
iNOSmRNAに相補的な配列を持つ一本鎖RNAとは、配列番号1で表わされる塩基配列と同一又は実質的に同一な塩基配列を含むヌクレオチドである。実質的に同一なヌクレオチドは、配列番号1またはこれと75%以上、好ましくは90%以上、より好ましくは95%以上の相同性を有する塩基配列を含み、誘導型一酸化窒素合成酵素(iNOS)の合成量を増大させる物質であり、化学合成、公知の発現法および精製法あるいは実施例に記載の方法によって調製することができる。
本発明におけるiNOSmRNAの上記アンチセンス転写物に相補的な配列を持つセンスオリゴヌクレオチド(以下、これらを「本発明センスオリゴ」という。)とは、アンチセンス転写物とハイブリダイズ可能なオリゴヌクレオチドまたはその誘導体であり、核内の核酸分解酵素で分解されないように修飾されているものであればよい。
センスオリゴ設計は、Nucleic Acids Res. 31, 3406-3415 (2003)及びJ. Mol. Biol. 288, 911-940 (1999)に開示されたプログラム「mfold」(http://www.bioinfo.rpi.edu/~zukerm/rna/参照)を使用してRNAの2次構造を予測して行うことができる。センスオリゴの候補配列は、熱力学的に安定でない部分(たとえばステム・ループ(stem-loop)構造のstem部分以外の領域)、好ましくはステム・ループ構造のループ(loop)構造を含む部分に対するセンスオリゴヌクレオチドを設計する。
上記のセンスオリゴの候補配列について、細胞に配列非特異的な反応を起こす5’−CG−3’、5’−GGGG−3’、及び5’−GGGGG−3’等の配列を含まない配列を選び、ラットゲノムで相同性検索を行ない、類似の配列が存在しないことを確認して好ましい配列を選択する(J. Neurochem. 86, 374382 (2003)参照)。
センスオリゴとしては、配列番号2〜4で示されるオリゴヌクレオチド等が挙げられる(下記の配列は修飾を省略して示す。)。
5’−GCCTCATACTTCCTCAGAGC−3’(配列番号36)
5’−TAGCTGCATTGTGTACAGAT−3’(配列番号37)
5’−GTGTATAATTCCTTGATGAA−3’(配列番号38)
これらは、化学合成、公知の発現法および精製法あるいは実施例に記載の方法によって調製することができる。
本発明センスオリゴは、核内の核酸分解酵素で分解されないように修飾されていればよく、その修飾に特に制限はない。センスオリゴヌクレオチドは細胞内では、5’または3’末端から順にヌクレオチドをはずしていく酵素エキソヌクレアーゼ(exonuclease)により、両端から消化されることから、例えば、両端から1つ以上のリン酸結合P=OをP=Sに置換した、分解酵素に安定なPhosphorothioate(フォスフォロチオエート)型に修飾するのが好ましい(以下、これを「S化センスオリゴヌクレオチド(S化センスオリゴ)」という。)(J. Neurochem. 86 , 374-382 (2003)参照)。ただし、すべてのリン酸結合をS化すると光学異性が生じ、ハイブリダイゼーションの面から不利になる。
S化センスオリゴヌクレオチド(S化センスオリゴ)の具体例としては、
5’−G*C*C*TCATACTTCCTCAG*A*G*C−3’
5’−T*A*G*CTGCATTGTGTACA*G*A*T−3’
5’−G*T*G*TATAATTCCTTGAT*G*A*A−3’
(配列中、*はS化した部分を示す。)等が挙げられる。
他の修飾法としては、PNA(peptide nucleic acids)、LNA(Locked Nucleic Acids)、ENA(2'-O, 4'-C-Ethylene-bridged Nucleic Acids;シグマアルドリッチ社)、モルホリノ(Morpholino)オリゴ(Gene Tools社, OR, USA)等が挙げられる。
本発明センスオリゴは、iNOSmRNAのアンチセンス転写物の存在が確認された細胞内に導入することにより、アンチセンス転写物と反応(ハイブリダイズ)して、細胞内におけるアンチセンス転写物の有効量を低減させると考えられるので、センスオリゴの投与により本来の遺伝子産物(iNOS)の発現量を減少させ、NOの過剰産生を抑制することができる。
以下に実施例を示して本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらによって限定されるものではない。
(1)iNOSmRNAに相補的な配列であるアンチセンス転写物の配列と領域(塩基長)の決定方法
実施例1:ラットiNOSアンチセンス転写物
以下の方法により、ラットiNOSのmRNAに対して、遺伝子のアンチセンス鎖から転写された「アンチセンス転写物」が存在するかどうか調べ、この「アンチセンス転写物」がセンス遺伝子産物の産生の制御にどのように関わっているかを調べた。なお、ラットiNOSのmRNAの塩基配列は、DDBJ/EMBL/GenBank 国際塩基配列データベース(http://www.ddbj.nig.ac.jp/、http://www.ebi.ac.uk/embl/、http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Genbank/)によって既知である。
サイトカインや急性期タンパク質など、誘導的発現の起こる遺伝子のmRNAの3'非翻訳領域(3'UTR)には、AU-rich element(ARE)と呼ばれる配列、すなわち5’−AUUUA−3’または5’−AUUUUA−3’という配列が存在している(Proc Natl Acad Sci USA 83: 1670-1674 (1986)参照)。AREはヒト、ラット及びマウスのiNOSmRNAの3'UTRにも存在しているので、このAREを含む3'UTRに対応する(配列が相補的な)アンチセンス転写物が存在するかどうかを、鎖特異的RT−PCR法により調べた。本法はオリゴdTプライマーのように、mRNAだけにハイブリダイズする(ストランド(鎖)特異的な)プライマーを使って逆転写を行って相補的DNA(cDNA)を合成した後、PCR法を行ってcDNAを増幅し、mRNAの量を測定する方法である。
すなわち、以下に示すiNOS遺伝子のセンス鎖のプライマー:
5’−TGCCCCTCCCCCACATTCTCT−3’(配列番号2)
を用い、培地にIL−1βを添加してiNOS mRNAを誘導したラット初代培養肝細胞の全RNAに対してRT−PCRを行ないcDNAを合成した。
ラット初代培養肝細胞から調製したRNA(1μg)と2pmolのプライマーを混ぜてから、70℃、10分間加熱後、0℃に急冷した。これにReverTra Ace反応バッファー(東洋紡)、dNTP(N=A,C,G,T)(最終濃度1mMになるように)、20 units RNase inhibitor(東洋紡)、及び200 units ReverTra Ace逆転写酵素(東洋紡)を加え、全量を25μlとした。47℃で60分間保温して逆転写した後、70℃、15分間加温して逆転写酵素を失活させた。次に、5 unitsのTth RNase H(東洋紡)を加えて、37℃、20分間加温して鋳型RNAを分解した。合成したcDNAはエタノール沈澱を行なって回収し、20μlのTEバッファーで溶解した。
このようにして得られたcDNA 2μlに、PCR反応バッファー(ニッポンジーン社)、dNTP(N=A,C,G,T;ニッポンジーン社)(最終濃度125μMになるように)、下記2種類のプライマー、順方向(Forward)プライマー40pmol、逆方向(Reverse)プライマー40pmol、1 unit Gene Taq DNAポリメラーゼ(ニッポンジーン社)、及びanti-Taq high(=抗Taqポリメラーゼ抗体,東洋紡)#を加えて、全量を40μlとしてさらにPCRを行なった。
順方向:
5’−ACCAGGAGGCGCCATCCCGCTGC−3’(配列番号3)
逆方向:
5’−CTTGATCAAACACTCATTTTATTAAA−3’(配列番号4)
PCRの温度プロトコールには公知の方法、すなわちステップダウン法(Nishizawa M, Nakajima T, Yasuda K, Kanzaki H, Sasaguri Y, Watanabe K, and Ito S. Close kinship of human 20a-hydroxysteroid dehydrogenase gene with three aldo-keto reductase genes. Genes Cells (2000) 5, 111-125)参照)に従って行った。PCR産物のアガロースゲル電気泳動を行った結果、186塩基対(bp)のバンドの増幅が見られた。
このバンドをゲルから切り出して精製し、塩基配列を決定したところ、上記のプライマー配列に挟まれた、ラットiNOSmRNAの3’UTRの配列に相補的な配列であることを確認した。すなわち、iNOS遺伝子のセンスプライマーを用いた鎖特異的RT−PCR法により、アンチセンス転写物の存在を証明した。
さらにiNOS遺伝子のアンチセンス転写物の全構造を調べるために、RACE法(Frohman MA. Rapid amplification of complementary DNA ends for generation of full-length complementary DNAs: thermal RACE. Methods Enzymol. (1993) 218: 340-356参照)による解析を試みた。RACE法は既知のcDNA配列から鎖特異的なプライマーを作製して逆転写を行い、5'側及び3'側のcDNAの配列を決定する方法である。
[5’側のcDNAの配列決定]
ラット初代培養肝細胞にIL−1βを添加して、iNOS mRNAを誘導し、Trizol試薬(インビトロジェン)でRNAを調製した。このRNAを鋳型とし、配列番号2のプライマー(iNOSのセンス(forward)プライマー;5'-TGCCCCTCCCCCACATTCTCT-3')を使って二本鎖cDNAを合成した。このcDNAにCAカセットアダプター(cDNA PCR Library Kit(タカラバイオ(株))に添付)を連結した後、配列番号3のプライマー(iNOS mRNAの3’UTRに対するセンス(forward)プライマー)とCAプライマー(cDNA PCR Library Kit(タカラバイオ(株))に添付)を使ってPCRを行なった。反応液をアガロースゲル電気泳動したところ、約250bpのサイズのバンドが増幅していた。このバンドを切り出して、pGEM-T Easyベクター(プロメガ)にクローニングして、塩基配列を決定した。
[3’側のcDNAの配列決定]
上記と同様に、IL−1βで誘導したラット初代培養肝細胞からRNAを調製した。PolyATract mRNA Isolation System(プロメガ)を使って、PolyA画分のRNAを精製し、このRNAを鋳型とし、アンカー配列(下線部)を付けたランダムプライマー(アンカーランダムプライマー;5'-TTCCCTCCCGTTTTCTCTGCCACTAGAATTCTCGAGCGGCCGCNNNNNNN-3'(配列番号5))を使って二本鎖cDNAを合成した。このcDNAにCAカセットアダプターを連結した後、配列番号4のプライマー(iNOS mRNAの3’UTRに対するアンチセンス(reverse)プライマー)とCAプライマーを使ってPCRを行なった。この反応液を精製して鋳型とし、iNOS mRNAの3’UTRに対するアンチセンス(reverse)プライマー(5'-ATATTAGAGCAGCGGGATGGCGCCTC-3'(配列番号6))とアンカープライマー(上記の「アンカーランダムプライマー」のアンカー配列に対するプライマー;5'-ACTAGAATTCTCGAGCGGCCGC-3'(配列番号7))を使って2次PCRを行なった。反応液をアガロースゲル電気泳動したところ、200〜500bpのサイズのバンドが増幅していた。このバンドを切り出して、pGEM-T Easyベクターにクローニングして、塩基配列を決定した。
この結果、アンチセンス転写物の全長はほぼ600塩基以上と推定された。以下にその配列を示した(配列番号1;但し、cDNA配列として示す。)。すなわち、アンチセンス転写物はiNOS mRNAの3'UTRに対応し、転写開始点(5'側)はiNOS mRNAのポリA付加部位の相補鎖にあった。
実施例2:ヒトiNOSアンチセンス転写物
以下の方法により、ヒトiNOSのmRNAに対して、遺伝子のアンチセンス鎖から転写された「アンチセンス転写物」が存在するかどうか調べた。なお、ヒトiNOSのmRNAの塩基配列は、DDBJ/EMBL/GenBank 国際塩基配列データベース(http://www.ddbj.nig.ac.jp/、http://www.ebi.ac.uk/embl/、http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Genbank/)により既知である。
ヒトの組織(胎盤、肝臓、胃粘膜)または細胞(刺激していないリンパ球)から、常法に従いTrizol試薬(インビトロジェン社)を用いて、全RNAを抽出した。得られた全RNAは、DNaseを含むTURBO DNA-free Kit(アプライドバイオシステムズ社)で処理し、混入するゲノムDNAを除去した。この全RNAを鋳型として、以下に示すヒトiNOS遺伝子のセンス鎖のプライマー:
5’−CTGAGTGCACCACTTCAAGTGAC−3’(配列番号8)
を用い、逆転写を行ない、cDNAを合成した。具体的には、実施例1において、ラット初代培養肝細胞から調製したRNA1μgと配列番号2で表わされるプライマー2pmolの代わりに、ヒトの組織または細胞から調製した全RNA(1μg)と上記配列番号8で表わされる(2pmol)を用いた他は、同様の方法でcDNAを合成した。
このようにして得られたcDNA 2μlに、PCR反応バッファー(ニッポンジーン社)、dNTP(N=A,C,G,T;ニッポンジーン社)(最終濃度125μMになるように)、下記2種類のプライマー、順方向(Forward)プライマー40pmol、逆方向(Reverse)プライマー40pmol、1 unit Gene Taq DNAポリメラーゼ(ニッポンジーン社)、及びanti-Taq high(=抗Taqポリメラーゼ抗体,東洋紡)#を加えて、全量を40μlとしてさらにPCRを行なった。
順方向:
5’−CAGGAGGTGCTATCGCACCACT−3’(配列番号9)
逆方向:
5’−GCAATTCATGTAAATATCTCCATC−3’(配列番号10)
PCRの方法は実施例1と同様の方法で行った。PCR産物のアガロースゲル電気泳動を行った結果、ヒト胎盤由来のcDNAを用いたときに151塩基対(bp)のバンドの増幅が見られた。その他のcDNA(肝臓、胃粘膜または刺激していないリンパ球)では増幅が見られなかった。
増幅したバンドをゲルから切り出して精製し、塩基配列を決定したところ、上記のプライマー配列に挟まれた、ヒトiNOSmRNAの3’UTRに相補的な配列であることを確認した。すなわち、iNOS遺伝子のセンスプライマーを用いた鎖特異的RT−PCR法により、ヒトiNOSアンチセンス転写物の存在を証明した。ヒトiNOSアンチセンス転写物の配列を配列番号11に示す。但し、cDNA配列として示す。
実施例3:マウスiNOSアンチセンス転写物
以下の方法により、マウスiNOSのmRNAに対して、遺伝子のアンチセンス鎖から転写された「アンチセンス転写物」が存在するかどうか調べた。なお、マウスiNOSのmRNAの塩基配列は、DDBJ/EMBL/GenBank 国際塩基配列データベース(http://www.ddbj.nig.ac.jp/、http://www.ebi.ac.uk/embl/、http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Genbank/)により既知である。
RAW264細胞から、から、常法に従いTrizol試薬(インビトロジェン社)を用いて、全RNAを抽出した。得られた全RNAは、DNaseを含むTURBO DNA-free Kit(アプライドバイオシステムズ社)で処理し、混入するゲノムDNAを除去した。この全RNAを鋳型として、以下に示すマウスiNOS遺伝子のセンス鎖のプライマー:
5’−CCTTCTTCTCCACTCCCCAGCT−3’(配列番号12)
を用い、逆転写を行ない、cDNAを合成した。具体的には、実施例1において、ラット初代培養肝細胞から調製したRNA1μgと配列番号2で表わされるプライマー2pmolの替わりに、RAW264細胞から調製した全RNA(1μg)と配列番号12で表わされる(2pmol)を用いた他は、同様の方法でcDNAを合成した。
このようにして得られたcDNA 2μlに、PCR反応バッファー(ニッポンジーン社)、dNTP(N=A,C,G,T;ニッポンジーン社)(最終濃度125μMになるように)、下記2種類のプライマー、順方向(Forward)プライマー40pmol、逆方向(Reverse)プライマー40pmol、1 unit Gene Taq DNAポリメラーゼ(ニッポンジーン社)、及びanti-Taq high(=抗Taqポリメラーゼ抗体,東洋紡)#を加えて、全量を40μlとしてさらにPCRを行なった。
順方向:
5’−GACCACCAGGAGGCACCATGCCG−3’(配列番号13)
逆方向:
5’−ATACAGGAAAGGCCCAAGCCATC−3’(配列番号14)
PCRの方法は実施例1と同様の方法で行った。PCR産物のアガロースゲル電気泳動を行った結果、127塩基対(bp)のバンドの増幅が見られた。
増幅したバンドをゲルから切り出して精製し、塩基配列を決定したところ、上記のプライマー配列に挟まれた、マウスiNOS mRNAの3’UTRに相補的な配列であることを確認した。すなわち、iNOS遺伝子のセンスプライマーを用いた鎖特異的RT−PCR法により、マウスiNOSアンチセンス転写物の存在を証明した。マウスiNOSアンチセンス転写物の配列を配列番号15に示す。但し、cDNA配列として示す。
(2)iNOSmRNAに相補的なアンチセンス転写物(以下、単にアンチセンスと略す)によるiNOSmRNAの安定化
実施例4:ラットiNOSアンチセンス転写物によるiNOSmRNAの安定化
ラットアンチセンスがiNOSmRNAを安定化しているかどうかを明らかにするために、ラットアンチセンスに相補的な配列を持ち、ラットアンチセンスにハイブリダイズする性質を持つiNOSのセンスオリゴヌクレオチド(以下、センスオリゴと略す)をラット初代培養肝細胞に導入しiNOSmRNA量を調べた。
センスオリゴはオリゴヌクレオチドにおけるホスホジエステル結合のリン酸の酸素原子の一つを硫黄原子に置換(S化)することによって、細胞内における核酸分解酵によるオリゴヌクレオチドの分解を防いだ。IBA社(Gottingen, Germany)のMagnet assisted transfection法による遺伝子導入試薬キット(MATra-A Reagent)により、S化センスオリゴをラット初代培養肝細胞に導入した。
ラット初代培養肝細胞は公知の方法(J. Hepatol. 40, 616-623, 2004)で調製し、6穴プレートに(1ウェルあたり3×10細胞)蒔いた。2時間後に、1ウェルあたり1.5mlの新しい培地(Williams' E培地(WE)に、10%ウシ胎児血清、10nMデキサメタゾン及び10nMインスリンを含む培地。WES−DIと略す)と交換した。さらに4時間後、オリゴ(2μg)とWE(200μl)を混合し、次に2μlのMATra-A Reagent(IBA社)を混ぜて室温で20分間静置した後、肝細胞の入っているウェルに全量を滴下した。6穴プレートを磁石盤(IBA社)の上に載せ、室温で15分間静置してオリゴを細胞に導入した。10%ウシ胎児血清を含むWE(1ウェルあたり1.5ml)と交換してから、一晩37℃に置いた。翌朝、1nMのIL−1βを含むWEに培地交換し、4時間、37℃に置いた後、全RNAを調製した。
肝細胞をIL−1βで刺激すると、iNOSmRNAの量が顕著に増加するが、上記のS化センスオリゴを導入してIL−1βで刺激して、RT−PCR法及びリアルタイムPCR法によるmRNA量の測定を行った。この結果を図1及び2に示す。
ここで用いたiNOS遺伝子のセンス鎖配列、すなわちiNOSmRNAと同じ配列を持つS化オリゴヌクレオチドは以下の配列で示される。実験ではS2、S4とS5に相当する。
S2:5’−G*C*C*TCATACTTCCTCAG*A*G*C−3’
S4:5’−T*A*G*CTGCATTGTGTACA*G*A*T−3’
S5:5’−G*T*G*TATAATTCCTTGAT*G*A*A−3’
(S化した部分は*で示した。)
一方、陰性対照として塩基組成が同じでありながら配列が異なるため、iNOSmRNAやその転写物、あるいは他のRNAとハイブリダイズしないことが確認されている配列を持つ「スクランブルオリゴ」を導入した。スクランブルオリゴの配列を以下に示す。
Scr2:5’−G*G*T*ATTGCCCACCCAAC*T*C*T−3’
Scr4:5’−G*G*C*TCCATATGATTAGA*T*G*T−3’
Scr5:5’−G*A*T*TGTTACTTAGAGAC*T*A*T−3’
これらのスクランブルオリゴもセンスオリゴと同様、細胞内での分解を防ぐために、S化して用いた。「スクランブルオリゴ」についてはラットゲノムとの相同性検索により、類似の配列が存在しないことを確認してある。
さらに、もう一つの陰性対照として、iNOSmRNAのステム・ループ構造のステム部分に対するS化センスオリゴヌクレオチドS1を導入した。S1の配列を以下に示す。
S1:5‘−C*A*T*TCTCTTTCCTTTGC*C*T*C−3’
(*は前記と同様の意味を表わす。)
センス鎖(mRNAと同じ配列を持つ鎖)と同じ配列のプライマーを用いて鎖特異的RT−PCR法を行うと、「アンチセンス転写物」に対するcDNAのみが逆転写されるので、「アンチセンス転写物」の量を測定することができる。なお、逆転写を行なわずにPCRを行なった対照を置き、肝細胞の全RNAに混入したゲノムが、PCRによって増幅しないことを確認した。図の中ではRT(−)で示した。
この結果、S2、S4、及びS5のS化センスオリゴを導入した場合にはiNOSmRNAの量が減少した。これは、S化センスオリゴが、iNOSのアンチセンス転写物とハイブリダイズして、アンチセンス転写物が分解されたために、iNOSmRNAも分解されたことを示している。一方、スクランブルオリゴを導入した場合には、iNOSmRNAの量は大きく変動しなかった。また、ステム部分に対するS1を導入した場合にも、iNOSmRNAの量は大きく変動しなかった。
また、センスオリゴS5またはスクランブルオリゴScr5を肝細胞に導入した時に、IL-1βを添加後のiNOSmRNA量を、逆転写したcDNAを鋳型としてリアルタイムPCR法で測定した。その結果、スクランブルオリゴScr5を導入すると、iNOSmRNA量が2倍になるのに要した時間は119分間であった。これに対し、センスオリゴS5を導入した時には461分間であった(図2)。
iNOSと同様に、iNOS以外の初期応答遺伝子Cytokine-Induced Neutrophil Chemoattractant 1;CINC−1も肝細胞においてIL−1β刺激下で顕著なmRNAの誘導を起こす。そして、CINC−1のmRNAの3'非翻訳領域(3’UTR)にも、iNOSmRNAと同様にARE配列が存在する。iNOSのセンスオリゴを肝細胞に導入した際に、CINC−1のmRNA量を測定したところ、センスオリゴを入れない場合とmRNA量に差がなかった。すなわち、iNOSのセンスオリゴの働きはiNOSに限定されるものであることを示していた(図1)。
以上の結果を併せると、iNOSのセンスオリゴはiNOSアンチセンス転写物と特異的にハイブリダイズしてiNOSmRNAの分解を促進して、その結果としてiNOSmRNAの量を特異的に減少させることが示された。
実施例5:マウスiNOSアンチセンス転写物によるiNOSmRNAの安定化
マウスアンチセンスにハイブリダイズする性質を持つiNOSセンスオリゴヌクレオチドのS化センスオリゴを、マウスマクロファージ由来のRAW264細胞に導入して、マウスアンチセンス転写物によるiNOSmRNAの発現抑制を調べた。
以下に記載しない操作は実施例4と同様の方法により行なった。マウスRAW264細胞を、ウェルあたり5×105細胞蒔き、DMEM培地を交換してCO2恒温器で培養した。
IBA社(Gottingen, Germany)のMagnet assisted transfection法によりS化センスオリゴを、RAW264細胞に導入した。10%ウシ胎児血清を含むDMEM培地(1ウェルあたり1.5ml)と交換してから、一晩、37℃に置いた。翌朝、大腸菌LPS(1μg/ml)を含むDMEMに培地交換し、4時間、37℃に置いた後、全RNAを抽出しRT−PCRに供した。なお、全RNAは、DNaseを含むTURBO DNA-free Kit(アプライドバイオシステムズ社)で処理し、混入するゲノムDNAを除去した。
センスオリゴは、マウスアンチセンス転写物に対応する、マウスiNOSmRNAに対して作製した。
ここで用いられたマウスiNOS遺伝子のセンス鎖の配列、すなわちiNOSmRNAと同じ配列を持つS化オリゴヌクレオチドは配列で示される。実験ではS1、S2とS3に相当する。
S1:5’−G*A*A*GCACTTTGGGTGAC*C*A*C−3’
S2:5’−T*A*G*CTGCACTATGTACA*G*A*T−3’
S3:5’−C*A*G*ATATTTATACTTCA*T*A*T−3’
(S化した部分は*で示した。)
実施例4で行なった鎖特異的RT−PCR法に従って、マウスiNOSmRNAの量を測定した。
この結果、マウスiNOSmRNAの量が減少した。これは、S化センスオリゴが、iNOSのアンチセンス転写物とハイブリダイズして、アンチセンス転写物が分解または競合されたために、iNOSmRNAも分解されたことを示した(図3)。
[実施例1〜5まとめ]
実施例4及び5の結果から、ラットのみならず、マウスでもiNOSのセンスオリゴはiNOSアンチセンス転写物と特異的にハイブリダイズすることにより、iNOSmRNAの分解を促進して、その結果としてiNOSmRNAの量を特異的に減少させることが示された。
このように、ラット肝細胞でも、マウスの細胞でも、センスオリゴヌクレオチドを用いてiNOSmRNAの発現を抑制することができた。従って、センスオリゴヌクレオチドを用いたiNOSmRNAの発現抑制は、肝臓などの炎症時のiNOS誘導及びNO産生を軽減し、肝障害の有効な治療方法となるといえる。
(3)iNOS遺伝子以外の初期応答遺伝子のmRNAに相補的な配列であるアンチセンス転写物の配列と領域(塩基長)の決定方法
炎症の時に誘導されて発現する遺伝子(いわゆる「初期応答遺伝子」)には、iNOSのみならず、サイトカインやケモカインなどの生理活性物質の遺伝子が含まれる。これらの初期応答遺伝子は炎症を増悪させたり、改善させたりするなど、多彩な働きを持っている。初期応答遺伝子の発現を調節することは、最終的には炎症を調節することにつながる。そこで、iNOS遺伝子のアンチセンス転写物以外にも、他の初期応答遺伝子においてもアンチセンス転写物が発現しているかどうかを調べた。次に、種間でよく保存されており、かつ複数のARE配列を含んでいる3’UTRの配列に対して、アンチセンス転写物が発現されていると予想した。そして、この部分に対して、逆転写用のセンスプライマーと、PCR用の1対のプライマーをデザインし、ラットのiNOS遺伝子でアンチセンス転写物を検出した実施例4と同様に、鎖特異的RT−PCR法を行なって、ラット肝細胞においてアンチセンス転写物が発現しているかどうかを調べた。
iNOS以外の初期応答遺伝子のうち、3’UTRに複数のARE配列を含むもので、かつ種間(ヒト、マウス、ラット)で3’UTRの配列がよく類似している3つの典型的な遺伝子を例にとって調べた。すなわち、以下の3遺伝子である。
(a) Cytokine-Induced Neutrophil Chemoattractant 1(CINC−1):Chemokine (C-X-C motif) Ligand 1 (CXCL1)とも呼ばれ、IL-1βで刺激したラット肝細胞で誘導されるケモカインである。
(b) NF−κB p50:転写因子NF−κBのサブユニットの1つであり、炎症に深く関与しているタンパク質である。
(c) IκB−α:NF−κBの活性を抑制するタンパク質である。
なお、ヒト、マウス及びラットにおけるこれらのmRNAの塩基配列は、DDBJ/EMBL/GenBank国際塩基配列データベース(http://www.ddbj.nig.ac.jp/、http://www.ebi.ac.uk/embl/、http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Genbank/)により既知である。
実施例6:ラットCINC-1アンチセンス転写物
以下の方法により、ラットCINC-1のmRNAに対して、遺伝子のアンチセンス鎖から転写された「アンチセンス転写物」が存在するかどうか調べた。以下に特に記載のない操作は実施例1と同様の方法で行なった。
初代培養ラット肝細胞をIL-1βで刺激してから、常法に従いTrizol試薬(インビトロジェン社)を用いて、全RNAを抽出した。得られた全RNAは、DNaseを含むTURBO DNA-free Kit(アプライドバイオシステムズ社)で処理し、混入するゲノムDNAを除去した。この全RNAを鋳型として、以下に示すラットCINC-1遺伝子のセンス鎖のプライマー:
5’−TGTCTGGTGAACGCTGGCTTCTGA−3'(配列番号16)
を用い、逆転写を行ない、cDNAを合成した。
得られたcDNAと以下に示すラットCINC-1遺伝子のセンス鎖の2種類のプライマー:
順方向:
5’−TGTGGATGCGTTTCATCGATGGT−3'(配列番号17)
逆方向:
5’ −CTAGCACAGTGGTTGACACTTA−3'(配列番号18)
を用いて、実施例1と同様の方法のステップダウン法に従ってPCRを行なった。
PCR産物のアガロースゲル電気泳動を行った結果、122塩基対(bp)のバンドの増幅が見られた。この増幅したバンドをゲルから切り出して精製し、塩基配列を決定したところ、上記のプライマー配列に挟まれた、ラットCINC-1 mRNAの3’UTRの配列であることを確認した。すなわち、iNOS遺伝子のセンスプライマーを用いた鎖特異的RT−PCR法により、ラットCINC-1遺伝子のアンチセンス転写物の存在を証明した。ラットCINC-1遺伝子のアンチセンス転写物の配列を配列番号19に示す。但し、cDNA配列として示す。
実施例7:ラットNF-κB p50アンチセンス転写物
以下の方法により、ラットNF-κB p50のmRNAに対して、遺伝子のアンチセンス鎖から転写された「アンチセンス転写物」が存在するかどうか調べた。以下に特に記載のない操作は実施例6と同様の方法で行なった。
初代培養ラット肝細胞をIL-1βで刺激してから、常法に従いTrizol試薬(インビトロジェン社)を用いて、全RNAを抽出した。得られた全RNAは、DNaseを含むTURBO DNA-free Kit(アプライドバイオシステムズ社)で処理し、混入するゲノムDNAを除去した。この全RNAを鋳型として、以下に示すラットNF-κB p50遺伝子のセンス鎖のプライマー:
5’−CTGTCATTAAGGTATCGCAGTCC−3'(配列番号20)
を用い、逆転写を行ない、cDNAを合成した。
得られたcDNAと以下に示すラットNF-κB p50遺伝子のセンス鎖の2種類のプライマー:
順方向:
5’−CATCTACAGTACAGTCATGCACTC−3’(配列番号21)
逆方向:
5’−GGGAAAATACTATTTTCAGCACTGAT−3’(配列番号22)
を用いて、実施例1と同様の方法のステップダウン法に従ってPCRを行なった。
PCR産物のアガロースゲル電気泳動を行った結果、192塩基対(bp)のバンドの増幅が見られた。このバンドをゲルから切り出して精製し、塩基配列を決定したところ、上記のプライマー配列に挟まれた、ラットNF-κB p50 mRNAの3’UTRの配列であることを確認した。すなわち、iNOS遺伝子のセンスプライマーを用いた鎖特異的RT−PCR法により、ラットNF-κB p50遺伝子のアンチセンス転写物の存在を証明した。ラットNF-κB p50遺伝子のアンチセンス転写物の配列を配列番号23に示す。但し、cDNA配列として示す。
実施例8:ラットIκB-αアンチセンス転写物
以下の方法により、ラットIκB-αのmRNAに対して、遺伝子のアンチセンス鎖から転写された「アンチセンス転写物」が存在するかどうか調べた。以下に特に記載のない操作は実施例6と同様の方法で行なった。
初代培養ラット肝細胞をIL-1βで刺激してから、常法に従いTrizol試薬(インビトロジェン社)を用いて、全RNAを抽出した。得られた全RNAは、DNaseを含むTURBO DNA-free Kit(アプライドバイオシステムズ社)で処理し、混入するゲノムDNAを除去した。この全RNAを鋳型として、以下に示すラットIκB-α遺伝子のセンス鎖のプライマー:
5’−TCCAGAATCTGATAAAAGGACCAC−3'(配列番号24)
を用い、逆転写を行ない、cDNAを合成した。
得られたcDNAと以下に示すラットIκB−α遺伝子のセンス鎖の2種類のプライマー:
順方向:
5’−TGAACCGCCATAGACTGTAGCTG−3’(配列番号25)
逆方向:
5’−GCACATACCACTGAACACCTGGT−3'(配列番号26)
を用いて、実施例1と同様の方法のステップダウン法に従ってPCRを行なった。
PCR産物のアガロースゲル電気泳動を行った結果、102塩基対(bp)のバンドの増幅が見られた。このバンドをゲルから切り出して精製し、塩基配列を決定したところ、上記のプライマー配列に挟まれた、ラットIκB-α mRNAの3’UTRの配列であることを確認した。すなわち、iNOS遺伝子のセンスプライマーを用いた鎖特異的RT−PCR法により、ラットIκB-α遺伝子のアンチセンス転写物の存在を証明した。ラットIκB-α遺伝子のアンチセンス転写物の配列を配列番号27に示す。但し、cDNA配列として示す。
[実施例6〜8のまとめ]
炎症の時に発現する初期応答遺伝子として、iNOS以外の代表的な3つの遺伝子(CINC-1、NF-κB p50、IκB-α)を選んだが、いずれにおいても3’UTRに複数のARE配列を含み、かつ種間(ヒト、マウス、ラット)で3’UTRの配列がよく似ている。iNOSと同様に、この3遺伝子においてもアンチセンス転写物が発現していることが確認された。
このことから、アンチセンス転写物はARE配列を含み、かつ種間で3’UTRの配列がよく似ている初期応答遺伝子では共通に見られる分子であることが推察される。さらに、アンチセンス転写物がこれらのmRNAの安定性を調節している可能性が強く示唆される。したがって、肝臓などの炎症において初期応答遺伝子のアンチセンス転写物の働きを抑制することにより、炎症を抑える事が期待される。
(4)ラット急性肝不全モデルを用いた生体(in vivo)でのiNOSとアンチセンス転写物の発現誘導と肝臓保護剤(IGF-IとFR183998)によるiNOSとアンチセンス転写物の発現誘導の抑制効果
実施例1及び実施例4の結果より、ラット初代培養肝細胞(in vitro)の系において、iNOS誘導時にiNOSmRNAの3’−非翻訳領域(3’UTR)に対応するアンチセンス転写物が発現し、iNOSmRNAの安定化を促進することを示した。肝障害ラット(in vivo)においてもiNOS誘導に呼応して、iNOSアンチセンス転写物が発現することを以下に示す。さらに、Insulin-like growth factor-I(IGF-I)やNa+/H+ exchanger 阻害剤(FR183998)などの肝臓保護剤の投与による生存率の変化と炎症性サイトカイン、iNOSmRNA、及びアンチセンス転写物の誘導との関係を以下に示す。
実施例9
(I) 急性肝不全モデルの作製と肝臓保護剤の投与
雄Sprague-Dawleyラット(250−300 g)に、D−ガラクトサミン(D-galactosamine)(400 g/kg)と細菌エンドトキシンであるLPS(16 μg/kg)との混合液(D-GalN/LPS)を静注し、急性肝不全モデルを調製した。Insulin-like growth factor-I(IGF-I;3.2 mg/kg)あるいはNa+/H+ exchanger 阻害剤(FR183998; 1 mg/kg)をD-GalN/LPS処理の30分前に投与した。血中及び肝臓の炎症性サイトカイン(TNF-α, IL-1β, IL-6, インターフェロンγ, CINC-1)、MIP-2及び一酸化窒素(NO)を測定した。肝臓より全RNAを調製し、iNOSmRNA及びiNOSアンチセンス転写物をRT−PCRで検討した。
(II) RNAの解析
D−ガラクトサミンとLPS混合液の静注後、3または6時間後に、ラットの肝臓を取り出して、常法に従いTrizol試薬(インビトロジェン社)を用いて、全RNAを抽出した。
この全RNAを鋳型として、オリゴdTプライマーを用いて、逆転写を行ない、次に実施例1等と同様の方法でPCR(RT−PCR法)を行なった。iNOSmRNAや、内部標準となるelongation factor-1α(EFl)mRNAの定量には、逆転写のときオリゴdTプライマーを用い、PCRのときには
iNOSmRNA:
CCAACCTGCAGGTCTTCGATG(配列番号28)及び
GTCGATGCACAACTGGGTGAAC(配列番号29);及び
EFmRNA:
TCTGGTTGGAATGGTGACAACATGC(配列番号30)及び
CCAGGAAGAGCTTCACTCAAAGCTT(配列番号31)
を用いた。なお、PCR反応液にはanti-Taq high(=抗Taqポリメラーゼ抗体,東洋紡)を添加した。
また、iNOSアンチセンス転写物の定量は、実施例1の方法に従った。なお、逆転写を行なわずにPCRを行なった対照を置き、肝細胞の全RNAに混入したゲノムが、PCRによって増幅しないことを確認した。iNOSmRNA検出結果を図4に示し、iNOSアンチセンス転写物の検出結果を図5に示す。図中、RT(−)は逆転写(−)の陰性対照を示す。
(III) リアルタイムPCRによるmRNA及びアンチセンス転写物の定量
逆転写して合成したcDNAは、日本バイオラド社のiCycler Systemを用いて、リアルタイムPCRによっても定量を行なった。PCR反応液にSYBR Green I(ロシュ・ダイアグノスティクス社)及びanti-Taq high(=抗Taqポリメラーゼ抗体,東洋紡)を添加して、公知の方法であるタッチダウン法でPCRを行なった。実際のPCRプロトコールは次の通りである。
1サイクル(94℃, 1 min)、
50サイクル(94℃, 30 sec; (72−0.3×n) ℃, 1 min; 72℃, 30 sec);nはサイクル数。結果を図6に示す。図中、「*」は「p<0.05 vs. GalN/LPSラット(n= 3-6ラット/グループ)」を示す。
(IV) 肝臓保護剤によるiNOSmRNA及びiNOSアンチセンス転写物量の変化
肝臓保護剤を投与しなかった場合、D-GalN/LPSの静注後、約24時間でほとんどの動物(90%以上)が死亡した。血中及び肝臓に、経時的(1〜12時間)に炎症性メディエイター(TNF-α, IL-1β, IL-6, インターフェロンγ, CINC-1, MIP-2, NO)が増加した。肝臓のiNOSmRNA誘導に呼応してアンチセンス転写物が増加を示し(iNOSmRNA及びiNOSアンチセンス転写物とも6時間後に最大)、その結果過剰なNO産生が認められた。
IGF-Iの投与により死亡率は20〜30%以下に減少した。そして、上述の炎症性サイトカイン、NO産生に加えてiNOSmRNA及びアンチセンス転写物誘導の増加が同様に抑制された(図4〜6)。
FR183998の投与によっても死亡率は20〜30%以下に減少し、上述の炎症性サイトカイン、NO産生に加えてiNOSmRNA及びアンチセンス転写物誘導の増加が同様に抑制された(図7〜9)。
(IV-1) ラット急性肝不全モデルにおける肝臓保護剤IGF-IのiNOSmRNA及びアンチセンス転写物の発現誘導への効果
図4の結果より、D−ガラクトサミサンとLPSを投与したラット;GalN/LPSラットは、は3〜6時間でiNOSmRNAレベルが増加したが、IGF-Iを投与したラットはこの増加が抑制された。
図5及び6の結果より、RT(−)ではほとんど増幅したcDNAが見られないことから、全RNAに混入したゲノムDNAは極めて微量であると考えられる。GalN/LPSラットは3〜6時間でアンチセンス転写物レベルが増加したが、IGF-Iを投与したラットはこの増加が抑制された。
(IV-2) ラット急性肝不全モデルにおける肝臓保護剤FR183998のiNOSmRNA及びアンチセンス転写物の発現誘導への効果
図7の結果より、GalN/LPSラットは3〜6時間でiNOSmRNAレベルが増加したが、FR183998を投与したラットはこの増加が抑制された。
図8及び9の結果より、RT(−)ではほとんど増幅したcDNAが見られないことから、全RNAに混入したゲノムDNAは極めて微量であると考えられる。GalN/LPSラットは3〜6時間でアンチセンス転写物レベルが増加したが、FR183998を投与したラットはこの増加が抑制された。
(5)ラット肝細胞でのセンスオリゴの効果(iNOSタンパク質と一酸化窒素(NO)量の変化)
実施例10
実施例4と同様の方法で、実施例4において得られたセンスオリゴS5またはスクランブルオリゴScr5を肝細胞に導入し、培地中の一酸化窒素(NO)量をNitric Oxide Colorimetric Assay kits (ロシュ・ダイアグノスティクス社)で測定した。ただし、翌朝、1nMのIL-1βを含むWEに培地交換し、8〜10時間、37℃に置いた後、測定した。また、細胞から全タンパク質を抽出して、ECLキット(GEヘルスケア社)を用いたウェスタン法でiNOSタンパク質を検出した。結果を図10に示す。
その結果、ラット肝細胞にセンスオリゴS5を導入することで、iNOSタンパク質及び培地中の一酸化窒素(NO)量が減少することが示された。
(6)ノーザン法によるiNOSアンチセンス転写物の検出
実施例11
IL-1βで刺激したラット肝細胞において、iNOS遺伝子のアンチセンス転写物が存在することを、Northern blot analysis (以下、ノーザン法と略す)で確認した。
(I) RNAの調製
ラット肝細胞を一定時間、IL-1βで刺激してから、Trizol試薬(インビトロジェン社)を用いて、全RNAを抽出した。得られた全RNAは、DNaseを含むTURBO DNA-free Kit(アプライドバイオシステムズ社)で処理し、混入するゲノムDNAを除去した。Poly(A)+とpoly(A)- RNAは、PolyATract mRNA Isolation System(プロメガ社)で分画した。非特異的なハイブリダイゼーションを防ぐため、リボゾームRNA(rRNA)を、終濃度5%ポリエチレングリコール6000及び終濃度0.75M NaCl存在下で沈澱させて除き、上清をエタノール沈澱により回収して電気泳動に用いた。
(II) ノーザン法:電気泳動
上記のRNA、すなわち無刺激ラット肝細胞の全RNA、IL-1β刺激ラット肝細胞の全RNA、IL-1β刺激ラット肝細胞のPoly(A)+ RNA、及びIL-1β刺激ラット肝細胞のPoly(A)- RNAの4つを、2.2Mホルマリン含有アガロースで電気泳動を行ない、分離した。
(III) ノーザン法:ハイブリダイゼーション
常法に従い、ゲル中のRNAをNytran Nフィルター(ワットマン社)に移した。次に、DIG EasyHybバッファー(ロシュダイアグノスティクス社)中で、ディゴキシゲニン(DIG)標識したiNOSの3’UTRのセンスプローブと、73℃で一晩、ハイブリダイゼーションを行なった。翌朝、ロシュダイアグノスティクス社のマニュアルに従って、フィルターを洗った。なお、iNOSの3’UTRのセンスプローブは、DIG-11-UTP(ロシュダイアグノスティクス社)とT3 RNAポリメラーゼ(ストラタジーン社)を用いて、試験管内でRNAを合成することによって作製した。
(IV) ノーザン法:検出
ロシュダイアグノスティクス社のマニュアルに従って、ブロッキングを行ない、アルカリフォスファターゼと結合した抗DIG抗体(ロシュダイアグノスティクス社)とインキュベートした。洗浄後、基質であるCDP-Star(アプライドバイオシステムズ社)と反応させ、エックス線フィルムで、iNOSセンスプローブとハイブリダイズするRNAのバンドを検出した。
(V) 結果と考察
上記4種のRNAのノーザン法による解析結果(エックス線フィルムのオートラジオグラム)を図11に示す。
「IL-1β刺激ラット肝細胞の全RNA」と「IL-1β刺激ラット肝細胞のPoly(A)-RNA」では、600〜1000ヌクレオチド(nt)のスメア状の濃いバンドが観察された。iNOSの3’UTRのセンスプローブを用いているので、これらのスメア状バンドは、iNOSのアンチセンス転写物のバンドと考えられる。従って、iNOSのアンチセンス転写物の長さは一定ではなく、さまざまな長さ(600〜1000ヌクレオチド)の転写物の集合であることがわかった。
RACEの結果とリボヌクレアーゼプロテクションアッセイの結果とを併せると、図12に示すように、iNOSのアンチセンス転写物が合成されていると考えられた。図中、点線は600ヌクレオチド以上のさまざまなサイズのアンチセンス転写物ができていることを示す。図中の数字はiNOS遺伝子のエクソンの番号、黒い部分はタンパク質の翻訳領域で、白抜きのボックスはエクソン27にある3’UTRである。iNOSのmRNAは遺伝子の図中上側に示す。
(7)iNOSアンチセンス転写物の過剰発現によるmRNAの安定化
実施例12
ラット肝細胞において、iNOS遺伝子のアンチセンス転写物を過剰発現させると、iNOSの3’UTRを介してmRNAが安定化されることを確認した。
ふつうのレポーターの場合、iNOS遺伝子のプロモーターにルシフェラーゼ遺伝子を結合する。iNOS遺伝子のプロモーターは「誘導型プロモーター」であるため、ラット肝細胞においてはIL-1β刺激により、プロモーター活性が大きく変化してしまい、レポーター遺伝子の後に結合した3’UTRの働きがよく観察できない。そこで、刺激にかかわらず、一定量の発現を促す「構成的プロモーター」である、elongation factor-1α(EF)遺伝子のプロモーターを用いることにした。従って、EFプロモーターでコントロールされるルシフェラーゼ遺伝子やβガラクトシダーゼ遺伝子は、刺激にかかわらず、ほぼ一定量で発現する。これにより、ポリ(A)シグナル配列を含むiNOSmRNAの3’UTRが、ルシフェラーゼmRNAの安定性に与える影響のみを観察することができる。
以下の3種のベクターを、pGL3-Basicプラスミド(プロメガ社)をもとに構築した。構築したベクターの模式図を図13に示す。
(i)レポーター(ルシフェラーゼベクター):
EFプロモーター + ルシフェラーゼ遺伝子(Luc)+ iNOS 3’UTR
EFプロモーター+ルシフェラーゼ遺伝子(Luc)+ SVpA
(ルシフェラーゼmRNAが構成的に発現するが、ルシフェラーゼ遺伝子の後の部分でmRNAの安定性を制御されうる)
(ii)iNOSアンチセンス転写物発現ベクター:
CMVプロモーター + iNOS 3’UTRを逆方向に挿入 + SVpA
(iNOSアンチセンス転写物が、細胞内で過剰に発現する)
(iii)内部標準(βガラクトシダーゼベクター):
EFプロモーター + βガラクトシダーゼ(lacZ)遺伝子 + SVpA
(βガラクトシダーゼmRNAが構成的に発現する)
なお、SVpAとは、SV40ウイルス由来のポリ(A)シグナルの配列で、安定な3’UTRとして知られており、SVpAの付加されたmRNAは壊れにくい。iNOS 3’UTRの対照である。CMVプロモーターとは、サイトメガロウイルス由来で、EFプロモーターよりはるかに強い構成的プロモーターである。
(i)と(iii)のプラスミドを同時にラット肝細胞に導入したとき、ルシフェラーゼmRNA(Luc)とβガラクトシダーゼmRNA(βGal)の合成量は、EFプロモーターが構成的であることから、ほぼ一定である。さらにiNOSアンチセンス転写物発現ベクター(ii)を加えた時と加えない時で差があれば、Luc mRNA/βGal mRNA(Luc/βGal値)にも差があるはずである。もしLuc/βGal値が、iNOSアンチセンス転写物発現ベクターの有無により変化するならば、iNOSアンチセンス転写物の過剰発現が、iNOS 3’UTRを介してルシフェラーゼmRNAの安定性に影響を与えたことになる。
[方法]
(I) トランスフェクション
初代培養ラット肝細胞に、前述の方法(MATra)により以下のプラスミドを導入した。
(i)レポーター(400 ng/ウェル)、
±(ii)iNOSアンチセンス転写物発現ベクター(50 ng/ウェル)、
(iii)内部標準(400 ng/ウェル)。
iNOSアンチセンス転写物発現ベクターを入れたものはAS(+)、入れないものは
AS(−)とした。
(II) RNAの調製
トランスフェクションして、一晩経った肝細胞の培地を交換した後、経時的に全RNAを抽出した。常法に従いTrizol試薬(インビトロジェン社)を用いて行なった。得られた全RNAは、DNaseを含むTURBO DNA-free Kit(アプライドバイオシステムズ社)で処理し、混入するゲノムDNAを除去した。この全RNAを鋳型として、オリゴ(dT)プライマーを用いて逆転写を行ない、mRNAに対するcDNAを合成した。
(III) リアルタイムPCRによるmRNAの定量
合成したcDNAを用いて、リアルタイムPCRによって定量を行なった。日本バイオラド社のiCyclerシステムを用いた。PCR反応液にSYBR Green I (ロシュ・ダイアグノスティクス社) 及びanti-Taq high(=抗Taqポリメラーゼ抗体。東洋紡)を添加して、公知の方法であるタッチダウン法でPCRを行なった。実際のPCRプロトコールは次の通りである。
1サイクル (94℃, 1 min)、
50サイクル (94℃, 30 sec; (72 - 0.3×n)℃, 1 min; 72℃, 30 sec)(nはサイクル数)。
レポーターであるルシフェラーゼ(Luc)のmRNAのPCRに用いたプライマーは次の2種類である。
順方向:
5’−GCGAAGGTTGTGGATCTGGATAC−3'(配列番号32)
逆方向:
5’−GAGCCACCTGATAGCCTTTGTAC−3'(配列番号33)
内部標準であるβガラクトシダーゼ(βGal)のmRNAのPCRに用いたプライマーは次の2種類である。
順方向:
5’−GTCACACTACGTCTGAACGTCGA−3'(配列番号34)
逆方向:
5’−TGCAGAGGATGATGCTCGTGACG−3'(配列番号35)
リアルタイムPCRを行なった後、iCyclerシステムの解析ソフトウェアを用いて、ルシフェラーゼmRNA(Luc)とβガラクトシダーゼmRNA(βGal)のthreshold cycle(Ct)値を求めた後、除して、Luc/βGal値を求めた。
[結果]
iNOSアンチセンス転写物発現ベクターを加えた場合と加えない場合について、Luc/βGal値を経時的に示した。結果を図14に示す。
(i)レポーター(EFプロモーター + Luc + iNOS 3’UTR)、
±(ii)iNOSアンチセンス転写物発現ベクター、
(iii)内部標準。
この場合、iNOSアンチセンス転写物発現ベクターを加えたときAS(+)、加えないときAS(−)に比べると、有意にLuc/βGal値が増加した。図中、「**」は「p<0.01 versus AS(-)」を表わす。
すなわち、iNOSアンチセンス転写物はiNOS 3’UTRを介して、ルシフェラーゼmRNAが安定化させた。
対照として、SVpAを連結したレポーターを用いた結果を図15に示す。
(i)レポーター(EFプロモーター + Luc + SVpA)、
±(ii)iNOSアンチセンス転写物発現ベクター、
(iii)内部標準。
この場合、iNOSアンチセンス転写物発現ベクターを加えると[AS(+)]、加えないとき[AS(−)]に比べて、Luc/βGal値は増加しなかった。すなわち、SVpAではmRNAの安定性に影響を与えなかった。
[意義]
以上の結果(iNOSアンチセンス転写物の過剰発現実験)より、iNOSアンチセンス転写物には、iNOS 3’UTRに働きかけてmRNAを安定化させるという作用を有すると考えられる。S化センスオリゴヌクレオチドによるiNOSmRNAのノックダウン実験の結果と併せると、iNOSアンチセンス転写物が、iNOS 3’UTRを介して、iNOSmRNAを安定化させていることがいえる。
従って、iNOSアンチセンス転写物によるiNOSmRNAを安定性の制御機構は、肝臓などの炎症の際に重要な働きを果たしていることが強く示唆される。また、この機構はNOが関与している多くの疾病の治療のターゲットになり得る。
肝臓保護剤の投与により、iNOSmRNAとアンチセンス転写物の誘導が抑制された。以上の結果はアンチセンス転写物がインビボ(in vivo)においてもiNOSmRNA発現誘導の制御因子として関与していることを強く示唆する。従って、肝臓保護剤を用いたアンチセンス転写物の発現抑制は、肝臓などの炎症時のiNOS誘導及びNO産生を軽減し、肝障害の有効な治療方法となると考える。
RT−PCR法によるラット肝細胞におけるmRNA量の測定結果を示す電気泳動図である。 リアルタイムPCR法によるラット肝細胞におけるmRNA量の測定結果を示すグラフである。 マウスiNOSアンチセンス転写物により、iNOSmRNAが分解されたことを示す電気泳動図である。 肝臓保護剤(IGF-I)を投与したラットのiNOSmRNA増加が抑制されたことを示す鎖特異的RT−PCRによるiNOSmRNAの検出結果を示す電気泳動図である。 肝臓保護剤(IGF-I)を投与したラットのiNOSアンチセンス転写物増加が抑制されたことを示す鎖特異的RT−PCRによるiNOSアンチセンス転写物の検出結果(電気泳動図)である。 肝臓保護剤(IGF-I)を投与したラットのiNOSアンチセンス転写物の増加をリアルタイムPCRで定量した結果を示すグラフである。なお、図中、「*」はp<0.05 vs. GalN/LPSラット(n= 3-6ラット/グループ)を示す。 肝臓保護剤(FR183998)を投与したラットのiNOSmRNA増加が抑制されたことを示す鎖特異的RT−PCRによるiNOSmRNAの検出結果を示す電気泳動図でである。 肝臓保護剤(FR183998)を投与したラットのiNOSアンチセンス転写物増加が抑制されたことを示す鎖特異的RT−PCRによるiNOSアンチセンス転写物の検出結果を示す電気泳動図である。 肝臓保護剤(FR183998)を投与したラットのiNOSアンチセンス転写物の増加をリアルタイムPCRで定量した結果を示すグラフであるなお、図中、「*」はp<0.05 vs. GalN/LPSラット(n= 3-6ラット/グループ)を示す。 実施例10におけるiNOSタンパク質及び培地中の一酸化窒素(NO)量の測定結果を示す電気泳動図及びグラフである。 実施例11におけるRNA4種のノーザン法による解析結果を示すエックス線フィルムオートラジオグラムである。左から、「無刺激ラット肝細胞の全RNA」、「IL-1β刺激ラット肝細胞の全RNA」、「IL-1β刺激ラット肝細胞のPoly(A)+ RNA」、及び「IL-1β刺激ラット肝細胞のPoly(A)- RNA」の結果を示す。 実施例11におけるRACEの結果とリボヌクレアーゼプロテクションアッセイの結果を示す図である。 実施例12において構築したベクターの模式図である。 実施例12において、iNOSアンチセンス転写物発現ベクターを加えた場合(AS(+))と加えない場合(AS(−))についてのLuc/βGal値の経時的変化を示すグラフである。 実施例12において、対照としてSVpAを連結したレポーターを用いた場合のLuc/βGal値の経時的変化を示すグラフである。

Claims (7)

  1. iNOS(誘導型一酸化窒素合成酵素)mRNAの3’非翻訳領域の塩基配列に相補的な配列を有するiNOSmRNAアンチセンスRNA(iNOSmRNAアンチセンス転写物)に相補的な配列を有するセンスオリゴヌクレオチドを有効成分として含む、iNOSmRNAの分解を促進するNO産生抑制活性剤
  2. 前記センスオリゴヌクレオチドが、前記iNOSmRNAアンチセンスRNA(iNOSmRNAアンチセンス転写物)における熱力学的に安定でないループ構造に対応する領域に相補的な配列を有する請求項1に記載のNO産生抑制活性剤
  3. 前記センスオリゴヌクレオチドが、16塩基以上335塩基以下の塩基長を有する請求項1または2に記載のNO産生抑制活性剤
  4. 前記センスオリゴヌクレオチドが、核酸分解酵素で分解されないように修飾されたものである請求項1〜3のいずれか1項に記載のNO産生抑制活性剤
  5. 前記修飾が、ホスホロチオエート化、LNA、PNA、ENA、モルホリノまたはその他の修飾法による請求項4に記載のNO産生抑制活性剤
  6. 配列番号36,37または38で示される塩基配列からなるセンスオリゴヌクレオチド、またはそれらが核酸分解酵素で分解されないように修飾されたヌクレオチド。
  7. 前記修飾が、ホスホロチオエート化、LNA、PNA、ENA、モルホリノまたはその他の修飾法による請求項6に記載のヌクレオチド。
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