WO2007142304A1 - ｉＮＯＳの発現制御作用を有するセンスオリゴヌクレオチド及びそれを含む組成物 - Google Patents

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Tadayoshi Okumura
Mikio Nishizawa
Yasuo Kamiyama
Koji Wakame
Takehito Miura
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Amino Up Chemical Co., Ltd.
Kansai Medical University
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    • C12N2310/3233—Morpholino-type ring

Definitions

  • the present invention relates to a single-stranded RNA (antisense transcript) having a base sequence complementary to the mRNA of the iNOS gene for the purpose of controlling the expression of iNOS (inducible nitric oxide synthase). ) To a sense oligonucleotide having a complementary sequence.
  • Nitric oxide (N0) in vivo is said to be produced from various places such as macrophages, vascular endothelial cells, nerve regions, etc., and its action also acts as a bactericidal action, vascular relaxation action, or a neurotransmitter. ing.
  • NOS nitric oxide Nitric oxide synthase
  • iNOS induced NOS
  • Neuronal NOS nN0S; neuronal NOS
  • vascular endothelial NOS eN0S; end othelial NOS
  • NO production by iNOS is another NO synthesis system.
  • iNOS is mainly produced in macrophages, vascular endothelial cells, vascular smooth muscle cells, gastrointestinal epithelial cells, bronchial epithelial cells, hepatocytes, microglia cells, etc., and is produced by cytotoxins, infections, and inflammatory lesions. It is expressed under the attack of inflammatory site forces such as 1 (Interleukin-1), TNF-a (Tumor Necrosis Factor-a), IFN- ⁇ (Interferon- ⁇ ), and produces NO. Over-produced NO functions as a major inflammatory mediator in the body's defense response.
  • Interleukin-1 Interleukin-1
  • TNF-a Tumor Necrosis Factor-a
  • IFN- ⁇ Interferon- ⁇
  • iNOS is caused by an inflammatory reaction or infection of various pathogens such as bacteria, fungi, viruses and protozoa. For example, it is stimulated by lipopolysaccharide (LPS), a universal component of Gram-negative bacteria, and lipoteichoic acid (LTA), a component of the cell wall of Gram-positive bacteria.
  • LPS lipopolysaccharide
  • LTA lipoteichoic acid
  • iNOS is induced through indirect production of inflammatory site force-in.
  • iNOS induction mainly produces production of inflammatory sites such as IL-1 and IFN- ⁇ . I know that I ’m going through.
  • iNOS-derived ⁇ exhibits antibacterial, antiviral, antiparasitic, and antitumor effects, and is indispensable for maintaining the life of biological systems.
  • iNO S when iNO S is activated by an inflammatory reaction and produces excessive N ⁇ , strong peroxynitrite (peroxynitrite, peroxynitrite) generated by reacting with active oxygen damages DNA, Negative effects such as causing mutations and carcinogenesis occur.
  • RNAi RNA interference
  • RNAi RNA interference
  • a long method discloses a method for screening its double-stranded oligonucleotide and its antisense RNA.
  • RNA interference using small nucleic acid molecules such as short interfering nucleic acids (siNA), short interfering RNA (siRNA), double-stranded RNA (dsRNA), microRNA (miRNA), and short hairpin RNA (shRNA) molecules (RNAi) discloses compounds useful for modulating the expression and activity of interleukin genes, interleukin superfamily genes, or genes involved in gene expression and the Z or active interleukin pathway (patents). (Reference 2: JP 2005-524393 A).
  • antisense RNA When antisense RNA is present in a cell, its complementary mRNA and hybridize However, since translation from mRNA to protein is inhibited, gene expression can be inhibited. Artificial introduction of antisense RNA into cells can inhibit the expression of the target gene, so it is currently used as a technique to elucidate the function of the gene, and its application to pharmaceuticals is also being investigated. . Until now, the presence of antisense RNA has not been confirmed for the iNOS gene. In the past, the presence of proteins that contribute to mRNA stabilization during transcription from mRNA has been suggested (Non-Patent Document l: Eur. J. Pharmacol. 500: 255-266 (2004)). The details are unknown, and there are many unclear points regarding the regulation of iN0S expression.
  • Patent Document 1 Japanese Patent Laid-Open No. 2005-13224
  • Patent Document 2 JP 2005-524393 A
  • Non-Patent Document 1 Eur. J. Pharmacol. 500: 255-266 (2004)
  • the present invention provides a sense oligonucleotide having a sequence complementary to a single-stranded RNA (antisense transtalift) having a base sequence complementary to the mRNA of the iNOS gene for the purpose of controlling the expression of iNOS.
  • a sense oligonucleotide having a sequence complementary to a single-stranded RNA (antisense transtalift) having a base sequence complementary to the mRNA of the iNOS gene for the purpose of controlling the expression of iNOS.
  • the present inventors have single-stranded RNA (antisense transcript (antisense transcript)) having a sequence complementary to mRNA in a cell, which is different from conventional antisense RNA.
  • antisense transcript antisense transcript
  • antisense oligonucleotides having a sequence complementary to the single-stranded RNA as described above.
  • antisense transcript By hybridizing to the transcript and suppressing its function, it interfered with the stability of mRNA, and as a result, found a method of suppressing the expression of iNOS and suppressing the overproduction of NO, and completed the present invention.
  • the present invention provides a sense oligonucleotide having a sequence complementary to the following iNOS mRNA antisense RNA (iNO SmRNA antisense transcript), NO production inhibitory activity: And a method for suppressing iNOS production.
  • iNO SmRNA antisense transcript iNO SmRNA antisense transcript
  • NO production inhibitory activity iNO SmRNA antisense transcript
  • iNOS Inducible nitric oxide synthase
  • iNOS mRNA antisense transcript A sense oligonucleotide having a sequence complementary to iNOS mRNA antisense RNA (iNOS mRNA antisense transcript) having a sequence complementary to mRNA.
  • the sense oligonucleotide according to 1 above which has a sequence complementary to the iNOS mRNA antisense RNA (iN OS mRNA antisense transcript) comprising the nucleic acid sequence shown in SEQ ID NO: 1.
  • the sense oligonucleotide according to 1 or 2 having a sequence complementary to a region corresponding to a loop structure that is not thermodynamically stable.
  • a composition comprising the sense oligonucleotide according to any one of 1 to 6 above and having NO production inhibitory activity that promotes degradation of iNOS mRNA.
  • a method for suppressing iNOS production which comprises introducing a sense oligonucleotide having a complementary sequence to.
  • the sense oligonucleotide having a sequence complementary to the antisense transcript having a sequence complementary to the iNOS mRNA of the present invention, and its phosphorothioate type, that is, S-sense oligo, are involved in overproduction of NO.
  • Use as a pharmaceutical composition that is effective against inflammatory diseases that are diseases, endotoxin shock due to bacterial infection, carcinogenesis, etc., or as a health food composition that is effective against them, ie, health food Power S can be.
  • the present invention provides a single-stranded RNA having a sequence complementary to iNOS mRNA that contributes to the stabilization of inducible nitric oxide synthase (iNS) mRNA in cells.
  • iNS inducible nitric oxide synthase
  • a sense oligonucleotide having a sequence complementary to (antisense transcript) it interferes with the stability of mRNA by hybridizing to the antisense transcript and suppressing its function. Suppresses expression and suppresses overproduction of NO.
  • the single-stranded RNA having a sequence complementary to iNOS mRNA is a nucleotide having the same or substantially the same base sequence as the base sequence represented by SEQ ID NO: 1.
  • the substantially identical nucleotide includes SEQ ID NO: 1 or a base sequence having a homology of 75% or more, preferably 90% or more, more preferably 95% or more, and an inducible nitric oxide synthase (iNOS). ), And can be prepared by chemical synthesis, known expression methods and purification methods, or the methods described in the Examples.
  • Sense oligonucleotides having a sequence complementary to the above-mentioned antisense transcript of iNOS mRNA in the present invention are oligonucleotides that can hybridize with the antisense transcript. Or its derivatives that are not degraded by nucleolytic enzymes in the nucleus, or modified so that they are not.
  • the sense oligo design is based on the program “mfold” disclosed in Nucleic Acids Res. 31, 3406-3415 (2003) and J. Mol. Biol. 28 8, 911-940 (1999) (http: ⁇ www. bioinfo. ⁇ i.edu zu kerm / rna /)) to predict RNA secondary structure.
  • Sense oligo candidate sequences include thermodynamically stable segments (eg, regions other than the stem portion of a stem-norpe structure), preferably a stem-norpe loop structure. Design sense oligonucleotides for the moiety.
  • sequences containing sequences such as CG-3 ', 5'-GGGG3', and 5'-GGGGGG3 ' are selected (see J. Neurochem. 86, 374382 (2003)).
  • Examples of the sense oligo include oligonucleotides represented by SEQ ID NOs: 2 to 4 ( The following sequences are shown without modification. ).
  • the sense oligo of the present invention is not particularly limited as long as it is modified so that it is not degraded by a nucleolytic enzyme in the nucleus.
  • Sense oligonucleotides are digested from both ends by exonuclease by removing nucleotides in the order of 5 'or 3' terminal force in cells.
  • S-sense oligos include
  • PNA peptide nucleic acids
  • LNA Locked Nucleic Acids
  • ENA 2'-0, 4'-C-Ethylene-bridged Nucleic Acids; Sigma Aldrich
  • morpholino Mo ⁇ holino
  • the sense oligo of the present invention reacts (hybridizes) with an antisense transcript when introduced into a cell in which the presence of an antisense transcript of iNOS mRNA has been confirmed, and the antisense transcript is effective in the cell. Since it is thought that the amount is reduced, administration of sense oligo can reduce the expression level of the original gene product (iNOS) and suppress overproduction of NO.
  • iNOS original gene product
  • the base sequence of mRNA of Lac MNOS is the DDBJ / EMBL / GenBank international base sequence database (http://www.ddbj.mg.ac.jp/, http://www.ebi.ac.uk / embl /, http: //www.ncbi.nlm.n ih.gov/Genbank/).
  • ARE AU-rich element
  • This method uses reverse transcription with a primer that hybridizes only to mRNA (strand-specific), such as oligo dT primer, to synthesize complementary DNA (cDNA), and then perform PCR. This method amplifies cDNA and measures the amount of mRNA.
  • RT_PCR was performed on the total RNA of rat primary hepatocytes in which IL-1 j3 mRNA was induced by adding IL-1 j3 to the medium, and cDNA was synthesized.
  • RNA (1 ⁇ g) prepared from rat primary cultured hepatocytes and 2 pmol of primer were mixed, heated at 70 ° C for 10 minutes, and then rapidly cooled to 0 ° C.
  • the reverse transcriptase was inactivated by heating at 70 ° C for 15 minutes.
  • 5 units of Tth RNase H (Toyobo) was covered and heated at 37 ° C for 20 minutes to degrade the RNA.
  • the synthesized cDNA was recovered by ethanol precipitation and dissolved in 20 ⁇ l of cocoon buffer.
  • a known temperature protocol for PCR step-down method (Nishizawa M, Nakajima T, Yasuda K, Kanzaki H, Sasaguri, Watanabe K, and ito S. Close kinsh ip of human 20a-hydroxysteroid dehydrogenase gene with three aldo-keto reductase genes. See Genes Cells (2000) 5, 111-125)). As a result of agarose gel electrophoresis of the PCR product, an amplification of a band of 186 base pairs (bp) was observed.
  • This band was cut out by gel force and purified, and the nucleotide sequence was determined. As a result, it was confirmed that the sequence was complementary to the sequence of the 3 ′ UTR of the HNOS mRNA sandwiched between the above primer sequences. That is, the presence of the antisense transcript was proved by the strand-specific RT-PCR method using the iN0S gene sense primer.
  • the RACE method In order to examine the entire structure of the antisense transcript of the iNOS gene, the RACE method (Frohman MA. Rapid amplification of complementary DNA ends for generation or full-length complementary DNAs: thermal RACE. Methods Enzymol. (1993 ) 218: 340-356).
  • the RACE method is a method in which a strand-specific primer is prepared from a known cDNA sequence, reverse transcription is performed, and 5 ′ and 3 ′ cDNA sequences are determined. [Sequencing of 5 'cDNA]
  • IL-1 was added to rat primary cultured hepatocytes to induce iNOS mRNA, and RNA was prepared with Trizol reagent (Invitrogen). Double-stranded cDNA was synthesized using this RNA as a saddle and using the primer of SEQ ID NO: 2 (iNOS forward primer; 5'_TGCCCCTCCCCCACATTCTCT_3 ').
  • RNA was prepared from rat primary cultured hepatocytes induced with IL-li3. Using the Pol yATract mRNA Isolation System (Promega), the RNA of the PolyA-fraction is purified, and this RNA is converted into a saddle shape and an anchor primer 1J (underlined) is attached to the random primer
  • GCCGCNNNNNNN-3 ′ (SEQ ID NO: 5) was used to synthesize double-stranded cDNA. After ligating the CA cassette adapter to this cDNA, PCR was performed using the primer of SEQ ID NO: 4 (iNOS mRNA 3, antisense primer for UTR) and CA primer.
  • This reaction solution was purified into a saddle type, and an antisense primer (5'-ATATTAGAGCAGCGGGATGGCGCCTC-3 '(SEQ ID NO: 6)) for the 3' UTR of iNOS mRNA and an anchor primer (the above-mentioned “anchor random primer") Secondary PCR was performed using a primer for the anchor sequence; 5'-ACTAGAATTCTCGAGCGGCCGC_3 '(SEQ ID NO: 7)).
  • an antisense primer 5'-ATATTAGAGCAGCGGGATGGCGCCTC-3 '(SEQ ID NO: 6)
  • an anchor primer the above-mentioned “anchor random primer”
  • the total length of the antisense transcript was estimated to be approximately 600 bases or more.
  • the sequence is shown below (SEQ ID NO: 1; shown as cDNA sequence). That is, Antisen The transcription product corresponded to the 3'UTR of iNOS mRNA, and the transcription start point (5 'side) was in the complementary strand of the polyA addition site of iNOS mRNA.
  • Example 2 HI HNOS antisense transcript
  • the following method was used to examine whether the antisense strand strength of the gene was present on the mRNA of MNOS, and whether an “antisense transcript” transcribed from the mRNA was present.
  • the base sequence of HRNOS mRNA is DDBJ / EMBL / GenBank international base sequence database (http: ⁇ www.ddbj.mg.ac.jp/, http://www.ebi.ac.uk/embl/ Http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Genban k /).
  • the total RNA obtained was treated with a TURBO DNA-free Kit (Applied Biosystems) containing DNase to remove contaminating genomic DNA.
  • a TURBO DNA-free Kit Applied Biosystems
  • Example 2 was used for reverse transcription to synthesize cDNA. Specifically, in Example 1, instead of 1 ⁇ g of RNA prepared from rat primary cultured hepatocytes and 2 pmo 1 of the primer represented by SEQ ID NO: 2, total RNA prepared from human tissue or cells (1 ⁇ g) CDNA was synthesized by the same method except that (2 pmol) represented by SEQ ID NO: 8 was used.
  • PCR was performed in the same manner as in Example 1.
  • a 151 base pair (bp) band was amplified when cDNA derived from human placenta was used. No amplification was seen with other cDNAs (liver, gastric mucosa or unstimulated cells, lymphocytes).
  • the amplified band was cut out by gel force and purified, and the nucleotide sequence was determined. As a result, it was confirmed that the sequence was complementary to the 3 ′ UTR of HI HNOS mRNA sandwiched between the above primer sequences. In other words, the presence of HI HNOS antisense transcripts was proved by a strand-specific RT-PCR method using a sense primer for the iN0S gene.
  • the sequence of the MNOS antisense transcript is shown in SEQ ID NO: 11. However, it is shown as a cDNA sequence.
  • Example 3 Mouse iN0S antisense transcript
  • mouse iN0S mRNA is the DDBJ / EMBL / GenBank international base sequence database (http: / http://www.ebi.ac.uk/embl/, http://www.ncbi.nlm.mh.gov/Genbank/).
  • RNA was extracted from RAW264 cell force using Trizol reagent (Invitrogene) according to a conventional method. The obtained total RNA was treated with a TURBO DNA-free Kit (Applied Biosystems) containing DNase to remove contaminating genomic DNA. Using this total RNA as a type, the primer for the sense strand of the mouse iNOS gene shown below:
  • Example 2 was used for reverse transcription to synthesize cDNA. Specifically, in Example 1, instead of 1 ⁇ g of RNA prepared from rat primary cultured hepatocytes and primer 2pmo 1 represented by SEQ ID NO: 2, total RNA (1 ⁇ g) prepared from RAW264 cells and SEQ ID NO: CDNA was synthesized in the same manner except that (2 pmol) represented by 12 was used.
  • PCR reaction buffer Nibonbon Gene
  • dNTP A, C, G, T; Nibonbon Gene
  • Primer Forward primer 40pmol
  • Reverse primer 40pmol 1 unit Gene Taq DNA polymerase (Nitsubon Gene)
  • anti- Taq Ancho & 9 polymerase antibody, Toyobo
  • the PCR method was performed in the same manner as in Example 1. As a result of electrophoretic electrophoresis of the PCR product, a 127 base pair (bp) band was amplified.
  • the amplified band was cut out by gel force and purified, and the nucleotide sequence was determined. As a result, it was confirmed that the sequence was complementary to the 3 'UTR of mouse iN0S mRNA sandwiched between the above primer sequences. That is, the presence of a mouse iNOS antisense transcript was proved by a chain-specific RT_PCR method using a sense primer for the iN0S gene.
  • the sequence of the mouse iN0S antisense transcript is shown in SEQ ID NO: 15. However, it is shown as a cDNA sequence.
  • antisense transcript complementary to iN ⁇ S mRNA (hereinafter simply referred to as antisense)
  • Example 4 Stabilization of iNOS mRNA by Lac HNOS antisense transcript
  • iNOS sense oligonucleotides (hereinafter abbreviated as sense oligos) have a sequence complementary to rat antisense and have the property of hybridizing to rat antisense. ) was introduced into rat primary cultured hepatocytes and the amount of iNOS mRNA was examined.
  • Sense oligos prevented the degradation of oligonucleotides by intracellular nucleolytic fermentation by substituting (S) one sulfur atom of the phosphoric acid oxygen atom of the phosphodiester bond in the oligonucleotide.
  • S-sense oligos were introduced into rat primary hepatocytes using a gene transfer reagent kit (MATra-A Reagent) by Magnet assisted transfection method from IBA (Gottingen, Germany).
  • Rat primary cultured hepatocytes were prepared by a known method (J. Hepatol. 40, 616-623, 2004), and seeded in 6-well plates (3 ⁇ 10 5 cells per well). 2 hours later, 1.5ml fresh medium (Williams' E medium (WE) with 10% fetal bovine serum, ⁇ ⁇ dexamethasone And a medium containing 10 nM insulin. It was replaced with WES—DI. Four more hours later, oligo (2 ⁇ g) and WE (200 ⁇ 1) were mixed, then 2 ⁇ 1 MATra-A Reagent (IBA) was mixed and allowed to stand at room temperature for 20 minutes. The whole amount was dripped onto the well containing the cells.
  • WE Wiams' E medium
  • IBA MATra-A Reagent
  • the 6-well plate was placed on a magnet board (IBA) and allowed to stand at room temperature for 15 minutes to introduce the oligo into the cells. It was replaced with WE containing 1.5% fetal bovine serum (1.5 ml per tool) and placed at 37 ° C. The next morning, the medium was changed to WE containing InM IL-1j3, and after 4 hours at 37 ° C, total RNA was prepared.
  • IBA magnet board
  • the sense strand arrangement 1J of the iNOS gene used here that is, the S-oligonucleotide having the same sequence as iNOS mRNA is represented by the following sequence. In the experiment, it corresponds to S2, S4 and S5.
  • the base composition is the same, but the sequence is different, so “scrambled oligo” having a sequence that has been confirmed not to hybridize with iNOSmRNA, its transcript, or other RNA was introduced. did.
  • the sequence of the scrambled oligo is shown below.
  • scrambled oligos Like the sense oligos, these scrambled oligos were used in the form of S to prevent degradation in the cells. As for “scrambled oligo”, it has been confirmed by homology search with the rat genome that no similar sequence exists.
  • S1 for the stem part of the stem 'norep structure of iNOS mRNA was introduced.
  • the sequence of S1 is shown below. Sl: 5 '—C ⁇ A ⁇ T ⁇ TCTCTTTCCTTTGC ⁇ C ⁇ T ⁇ C— 3'
  • a strand-specific RT-PCR method is performed using a primer having the same sequence as the sense strand (a strand having the same sequence as the mRNA)
  • only the cDNA for the “antisense transcript” is reverse-transcribed.
  • the amount of “antisense transcript” can be measured.
  • a control that was subjected to PCR without reverse transcription was placed, and it was confirmed that it was not amplified by genomic force PCR mixed in the total RNA of hepatocytes. In the figure, it is indicated by RT (-).
  • the amount of iNOS mRNA decreased when S2, S4, and S5 S-sense oligos were introduced. This indicates that the iNOS mRNA was also degraded because the antisense transcript was degraded by hybridization with the antisense transcript of the S-sense oligonucleotide iNOS. On the other hand, when scrambled oligo was introduced, the amount of iNOS mRNA did not vary greatly. In addition, even when S1 was introduced to the stem part, the amount of iNOSmRNA did not fluctuate significantly.
  • the amount of iNOS mRNA after addition of ⁇ was measured by real-time PCR using reverse-transcribed cDNA as a saddle. As a result, when scrambled oligo Scr5 was introduced, it took 119 minutes to double the amount of iNOS mRNA. In contrast, when the sense oligo S5 was introduced, it took 461 minutes ( Figure 2).
  • CINC-1 Cytokine-Induced Neutrophil Chemoattractant 1
  • CINC-1 Cytokine-Induced Neutrophil Chemoattractant 1
  • the CINC-1 mRNA also has an ARE sequence in the 3 ′ untranslated region (3 ′ UTR) of the mRNA, as in iNOS mRNA.
  • iNOS sense oligo was introduced into hepatocytes, the amount of CINC-1 mRNA was measured. As a result, there was no difference in the amount of mRNA from when no sense oligo was added. In other words, it was shown that the iNOS sense oligo function is limited to iNOS (Fig. 1).
  • Example 5 Stabilization of iNOS mRNA by Mouse iNOS Antisense Transcript S-sense oligo of iNOS sense oligonucleotide having the property of hybridizing to mouse antisense was introduced into RAW264 cells derived from mouse macrophages, and The suppression of iNOS mRNA expression by antisense transcripts was examined.
  • Mouse RAW264 cells were seeded at 5 X 105 cells per tool, and cultured in a C02 incubator with the DMEM medium changed.
  • SiS oligo was introduced into RAW264 cells by Magnet assisted transfection method from IBA (Gottingen, Germany). The medium was replaced with DMEM medium (1.5 ml per well) containing 10% urine fetal serum, and then placed at 37 ° C. The next morning, the medium was changed to DMEM containing Escherichia coli LPS (1 ⁇ gZml), and after 4 hours at 37 ° C., total RNA was extracted and subjected to RT-PCR. Total RNA was treated with a TURBO DNA-free Kit containing DNase (Applied Systems) to remove contaminating genomic DNA.
  • Sense oligos were generated for mouse iNOS mRNA corresponding to the mouse antisense transcript.
  • the sense strand arrangement lj of the mouse iNOS gene used here that is, the S-modified oligonucleotide having the same sequence as the iNOS mRNA is represented by the sequence. In the experiment, it corresponds to Sl, S2 and S3.
  • mouse iNOS mRNA was measured according to the strand-specific RT-PCR method performed in Example 4.
  • Examples 1 to 5 Summary From the results of Examples 4 and 5, iNOS sense oligos specifically hybridized with iNOS antisense transcripts in not only rats but also mice, thereby promoting iNOS mRNA degradation. As a result, iNOS mRNA It was shown to specifically reduce the amount.
  • iNOS mRNA expression could be suppressed using sense oligonucleotides in both rat hepatocytes and mouse cells. Therefore, suppression of iNOS mRNA expression using sense oligonucleotides can be said to be an effective treatment method for liver damage by reducing iN0S induction and N0 production during inflammation of the liver.
  • R Genes induced and expressed at the time of inflammation
  • early response genes include not only iNOS but also genes of physiologically active substances such as cytokines and chemokines. These early response genes have various functions such as exacerbation and improvement of inflammation. Regulating early response gene expression ultimately leads to regulation of inflammation. Therefore, in addition to the antisense transcript of the iNOS gene, we investigated whether the antisense transcript was expressed in other early response genes. Next, we predicted that antisense transcripts were expressed against 3 'UTR sequences that are well conserved among species and contain multiple ARE sequences.
  • a sense primer for reverse transcription and a pair of primers for PCR were designed, and the strand-specific RT was detected in the same manner as in Example 4 where the antisense transcript was detected with the rat iNOS gene.
  • PCR was performed to determine whether antisense transcripts were expressed in rat hepatocytes.
  • 3 'UTRs contain multiple ARE sequences, and 3' UTR sequences are similar between species (human, mouse, rat) For example. That is, the following 3 genes.
  • NF-/ B p50 One of the subunits of the transcription factor NF- / B, a protein that is deeply involved in inflammation.
  • I / B-a A protein that suppresses the activity of NF- ⁇ .
  • nucleotide sequences of these mRNAs in humans, mice and rats are the DDBJ / EMBL / GenBank international bases' data base (http://www.ddbj.nig.ac.jp/, http: // www ebi. a c.uk/embl/, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Genbank/).
  • Example 7 Rat NF- ⁇ B p50 antisense transcript
  • Example 4 From the results of Example 1 and Example 4, an antisense transcript corresponding to the 3′-untranslated region (3 ′ UTR) of iNOS mRNA was expressed when iNOS was induced in rat primary cultured hepatocytes (in vitro). And demonstrated that iNOS mRNA is stabilized. It is shown below that iNOS antisense transcripts are expressed in response to iNOS induction in rats with liver damage (in vivo). In addition, changes in survival rate due to administration of hepatoprotective agents such as insulin—like growth factor-1 (IGF—I) and Na + / H + exchanger inhibitor (FR183998) The relationship with the induction of sense transcripts is shown below.
  • IGF—I insulin—like growth factor-1
  • FR183998 Na + / H + exchanger inhibitor
  • mice Male Sprague-Dawley rats (250-300 g) were mixed with D-galactosamine (D-galactosamine) (400 g / kg) and bacterial endotoxin LPS (16 ⁇ g / kg) (D-GalN / LPS). ) was intravenously injected to prepare an acute liver failure model. Insulin-like growth factor-I (IGF-I; 3.2 mg / kg) or Na + / H + exchanger inhibitor (FR183998; 1 mg / kg) was administered 30 minutes before D-GalN / LPS treatment.
  • IGF-I Insulin-like growth factor-I
  • FR183998 Na + / H + exchanger inhibitor
  • RNA was extracted using Trizol reagent (Invitrogene) according to a conventional method. Using this total RNA as a saddle, reverse transcription was performed using oligo dT primers, and then PCR (RT_PCR) was performed in the same manner as in Example 1 and the like.
  • RT_PCR elongation factor-1a
  • the iNOS antisense transcript was quantified according to the method of Example 1.
  • the control which performed PCR without performing the reverse copy was placed, and it was confirmed that it was not amplified by genomic force PCR mixed in the total RNA of hepatocytes.
  • the iNOS mRNA detection results are shown in FIG. 4, and the iNO S antisense transcript detection results are shown in FIG. In the figure, RT (-) indicates a negative control of reverse transcription (-).
  • CDNA synthesized by reverse transcription was also quantified by real-time PCR using the iCycler System of Biorad.
  • SYBR Green I Roche Diagnostics
  • anti-Taq high anti-Taq polymerase antibody, Toyobo
  • the actual PCR protocol is as follows.
  • IGF-I administration reduced mortality to 20-30% or less.
  • increases in iNOS mRNA and antisense transcript induction were similarly suppressed (FIGS. 4 to 6).
  • FR183998 also reduced mortality to 20-30% or less, and similarly suppressed iNOS mRNA and antisense transcript induction in addition to the above-mentioned inflammatory cytokines and NO production ( Figures 7-9). ).
  • RT (-) shows almost no amplified cDNA, suggesting that the amount of genomic DNA contaminated with total RNA is extremely small.
  • GalN / LPS rats increased the antisense transcript level in 3 to 6 hours. Rats treated with IGF-I suppressed this increase.
  • RT (-) shows almost no amplified cDNA. Genomic DNA contaminated with total RNA is considered to be extremely small. GalN / LPS rats had increased antisense transcript levels in 3-6 hours. Rats treated with FR183998 inhibited this increase.
  • Example 4 the sense oligo S5 or scrambled oligo Scr5 obtained in Example 4 was introduced into hepatocytes, and the amount of nitric oxide (NO) in the medium was determined from Nitric Oxide Colorimetric Assay kits (Roche (Diagno Stakes). However, the following morning, the medium was changed to WE containing IL-1 ⁇ of In M, and the cells were measured after being placed at 37 ° C for 8 to 10 hours. In addition, total protein was extracted from the cells, and iN0S protein was detected by the western method using an ECL kit (GE Healthcare). The result is shown in FIG.
  • NO Nitric Oxide Colorimetric Assay kits
  • Rat hepatocytes were stimulated with IL-1 ⁇ for a certain period of time, and then total RNA was extracted using Trizol reagent (Invitrogen). The total RNA obtained was treated with TURBO DNA-free Kit (Applied Biosystems) containing DNase to remove contaminating genomic DNA. Poly (A) + and poly (A) -RNA were fractionated using PolyATract mRNA Isolation System (Promega). To prevent non-specific hybridization, ribosomal RNA (rRNA) is removed by precipitation in the presence of 5% polyethylene glycol 6000 and 0.75M NaCl at a final concentration of 5%, and the supernatant is recovered by ethanol precipitation. Used for electrophoresis.
  • RNA above total RNA of unstimulated rat hepatocytes, total of IL-1 ⁇ -stimulated rat hepatocytes Electrophoresis of RNA, Poly (A) + RNA of IL-1 ⁇ -stimulated rat hepatocytes, and Poly (A) -RNA of IL-1 ⁇ -stimulated rat hepatocytes, using 2.2M formalin-containing agarose, separated.
  • RNA in the gel was transferred to a Nytran N filter (Whatman).
  • DIG digoxigenin
  • D IG EasyHyb buffer Roche Diagnostics
  • the iNOS 3, UTR sense probe was prepared by synthesizing RNA in vitro using DIG-11-UTP (Roche Diagnostics) and T3 RNA polymerase (Stratagene).
  • Fig. 11 shows the results of analysis of the above four RNAs by the Northern method (X-ray film autoradiogram).
  • IL_1 ⁇ -stimulated rat hepatocyte total RNA and “IL_1 ⁇ -stimulated rat hepatocyte poly (A) -RNA”, a smear-like dark band of 600 to 1000 nucleotides (nt) was observed. Since the iNOS 3 'UTR sense probe is used, these smear-like bands are considered to be the bands of iNOS anti-sense transcripts. Therefore, the length of the iNOS antisense transcript was found to be a collection of transcripts of various lengths (600 to 1000 nucleotides).
  • the luciferase gene is linked to the iNOS gene promoter. Since the promoter of the iNOS gene is an “inducible promoter,” promoter activity in rat hepatocytes is greatly altered by IL-1 ⁇ stimulation, and the action of the 3 ′ UTR bound after the reporter gene Cannot be observed well. Therefore, we decided to use the elongation factor-1a (EF) gene promoter, which is a “constitutive promoter” that promotes a certain amount of expression regardless of stimulation. Therefore, the luciferase gene and i3 galactosidase gene controlled by the EF promoter are expressed in almost constant amounts regardless of stimulation. Thus, only the effect of iNOS mRNA containing the poly (A) signal sequence on the 3 ′ UTR force luciferase mRNA stability can be observed.
  • EF elongation factor-1a
  • SVpA is a poly (A) signal sequence derived from the SV40 virus, and is known as a stable 3, UTR. The mRNA with SVpA added is unlikely to break. iNOS 3 'UTR reference.
  • the CMV promoter is a constitutive promoter derived from cytomegalovirus and much stronger than the EF promoter.
  • the overexpression ability of the iNOS antisense transcript affected the stability of luciferase mRNA via the iN OS 3 'UTR. become.
  • the following plasmids were introduced into primary cultured rat hepatocytes by the method described above (MATra).
  • AS (+) was used for the iNOS antisense transcript expression vector, and AS (—) for those not.
  • a Trizol reagent (Invitrogen) was used.
  • the obtained total RNA was treated with a TURBO DNA-free Kit containing DNase (Applied Biosystems) to remove contaminating genomic DNA.
  • a TURBO DNA-free Kit containing DNase Applied Biosystems
  • reverse transcription was performed using an oligo (dT) primer to synthesize cDNA for mRNA.
  • ⁇ Gal ⁇ galactosidase
  • the iN0S antisense transcript was stabilized by luciferase mRNA via the iN0S 3 'UTR.
  • iNOS antisense transcript acts on the iNOS 3 ′ UTR to stabilize mRNA.
  • iNOS antisense transcripts can stabilize iNOS mRNA via the iNOS 3 'UTR.
  • the regulation mechanism of iNOS mRNA stability by the iNOS antisense transcript plays an important role in inflammation of the liver and the like. This mechanism can also be a target for the treatment of many diseases involving NO.
  • FIG. 1 is an electrokinetic diagram showing the results of measuring the amount of mRNA in rat hepatocytes by RT_PCR.
  • FIG. 2 is a graph showing the results of measuring the amount of mRNA in rat hepatocytes by real-time PCR.
  • FIG. 3 is an electrophoretogram showing that iNOS mRNA was degraded by mouse iNOS antisense transcript.
  • FIG. 4 is an electrophoretogram showing the results of iNOS mRNA detection by strand-specific RT-PCR showing that iNOS mRNA increase was suppressed in rats administered with a hepatoprotectant (IGF-I).
  • FIG. 6 is a graph showing the results of quantifying the increase in iNOS antisense transcripts in rats administered with hepatoprotectant (IGF-I) by real-time PCR.
  • FIG. 7 is an electrophoretogram showing the detection results of iNOS mRNA by strand-specific RT-PCR showing that the increase in iNOS mRNA in rats administered with a hepatoprotectant (FR183998) was suppressed.
  • FIG. 8 Electrophoretic diagram showing the results of detection of iNOS antisense transcripts by strand-specific RT-PCR showing that the increase in iNOS antisense transcripts in rats administered with a hepatoprotectant (FR183998) was suppressed. It is.
  • FIG. 9 A graph showing the results of real-time PCR quantification of the increase in iNOS antisense transcripts in rats administered with a hepatoprotectant (FR183998).
  • FIG. 10 is an electrophoretogram and a graph showing the measurement results of iNOS protein and the amount of nitric oxide (NO) in the medium in Example 10.
  • FIG. 11 is an X-ray film autoradiogram showing the analysis results of the four RNA types in Example 11 by the Northern method. From left, "Total RNA of unstimulated rat hepatocytes", riL-1 The results of “total RNA of intense rat hepatocytes”, “Poly (A) + RNA of IL-1 ⁇ -stimulated rat hepatocytes” and “Poly (A) -RNA of IL_1 ⁇ -stimulated rat hepatocytes” are shown.
  • FIG. 12 shows the results of RACE and ribonuclease protection assay in Example 11.
  • FIG. 13 A schematic diagram of the vector constructed in Example 12.
  • Example 12 when the iNOS antisense transcript expression vector was prepared (AS (+)), in addition to the case (AS (—)), the Luc / ⁇ Gal value It is a graph which shows a change over time.
  • FIG. 15 is a graph showing changes over time in Luc / ⁇ Gal values when a reporter linked with SVpA was used as a control in Example 12.

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Abstract

　本発明は、ｉＮＯＳ（誘導型一酸化窒素合成酵素；inducible nitric oxide synthase）の発現制御を目的とする、ｉＮＯＳ遺伝子のｍＲＮＡに相補的な塩基配列を持つ一本鎖ＲＮＡ（アンチセンストランスクリプト）に相補的な配列を持つセンスオリゴヌクレオチドに関する。本発明の持つセンスオリゴヌクレオチドを用いれば、ｉＮＯＳの発現を制御することができ、生体防御やＮＯの過剰産生が関与する疾患、例えば、発がんや炎症性疾患、細菌感染等によるエンドトキシンショックなどの治療及び予防に有用である。

Description

明 細 書
iNOSの発現制御作用を有するセンスオリゴヌクレオチド及びそれを含む 組成物
技術分野
[0001] 本発明は、 iNOS (誘導型一酸化窒素合成酵素； inducible nitric oxide synthase)の 発現制御を目的として、 iNOS遺伝子の mRNAに相補的な塩基配列を持つ一本鎖 RNA (アンチセンストランスクリプト）に相補的な配列を持つセンスオリゴヌクレオチド に関する。
背景技術
[0002] 生体内における一酸化窒素（N〇）は、マクロファージ、血管内皮細胞、神経領域等 各所から産生するとされ、その作用としては殺菌作用、血管弛緩作用、あるいは神経 情報伝達物質としても作用している。
[0003] 一酸化窒素が産生する際に介在しているの力 一酸化窒素合成酵素（N〇S ; nitric oxide synthase)であり、 NOSは体内の作動場所により誘導型 NOS (iNOS ; inducibl e NOS)、神経型 NOS (nN〇S ; neuronal NOS)、及び血管内皮型 NOS (eN〇S ; end othelial NOS)の 3つに分類され、特に iNOSによる N〇産生はその他の NO合成シス テムである神経型 N〇S及び血管内皮型 N〇Sに比較すると、長時間その活性が持 続し、より多量の NO ( 1 μ Μ以上）が産生されることが知られてレ、る。
[0004] iNOSは主に、マクロファージ、血管内皮細胞、血管平滑筋細胞、消化管上皮細胞 、気管支上皮細胞、肝細胞、ミクログリア細胞等において、細胞毒素や感染や炎症 性病巣で産生される IL— 1 (Interleukin - 1 ）、 TNF— a (Tumor Necrosis Facto r - a )、 IFN— γ (Interferon - γ )等の炎症性サイト力インの攻撃をうけて発現し、 NOを産生する。過剰に生成する NOは、生体の感染防御反応での主要な炎症性メ ディエーターとして機能してレ、る。
[0005] iNOSの発現は、炎症反応や細菌、真菌、ウィルス、原虫など多様な病原体の感染 に伴いもたらされる。例えば、グラム陰性菌の普遍的な構成成分であるリポポリサッカ ライド (LPS)やグラム陽性菌の細胞壁の成分であるリポタイコ酸 (LTA)の刺激により 、あるいは炎症性サイト力インの間接的な産生誘導を介して、 iNOSの誘導がもたらさ れることが知られている。また最近では、各種ウィルスの生体内増殖でも、 NO合成の 亢進が明らかにされており、この場合の iNOSの誘導は、主に IL— 1 、 IFN— γな どの炎症性サイト力インの産生を介してレ、ることが分かってレ、る。
[0006] iNOS由来の Ν〇は殺菌、抗ウィルス、抗寄生虫、抗腫瘍作用を示し、生体系の生 命維持においてなくてはならない存在である。し力 一方、炎症反応等によって iNO Sが活性化され過剰な N〇を産生すると、活性酸素と反応して生じた強いパーォキシ ナイトライト（ペルォキシ亜硝酸、過酸化亜硝酸）は DNAを損傷し、突然変異や発が んを惹起する等の負の作用が起こる。
[0007] 種々の要因により iNOSが過剰に発現し、過剰な N〇を産生することにより、毒性シ ョックやある種のサイト力インによる治療等による全身性血圧低下、血圧応答低下、 自 己免疫疾患、炎症、関節炎、リウマチ性関節炎、糖尿病、炎症性腸疾患、血管機能 不全、病因性血管拡張、組織損傷、心臓血管系虚血、痛感過敏症、脳虚血、悪液 質、がん等の種々の疾病を引き起こすことが明らかになつている。
[0008] 従って、 iNOSの発現を制御することは生体防御や NOの過剰産生が関与する疾 患、例えば、発がんや炎症性疾患、細菌感染等によるエンドトキシンショックなどの治 療 ·予防の面にぉレ、て非常に重要である。
[0009] 従来、 RNAi (RNA干渉： RNA interference)と呼ばれる、二本鎖の RNAで標的と なる mRNAを切断して転写を抑制する方法が知られている力 通常 RNAiは 20塩基 対程度の塩基長であり（特許文献 1：特開 2005— 13224号公報）、その二本鎖オリ ゴヌクレオチド及びそのアンチセンス RNAのスクリーニング方法が開示されている。 また、小核酸分子、例えば短干渉核酸（siNA)、短干渉 RNA (siRNA)、二本鎖 RN A (dsRNA)、マイクロ RNA (miRNA)、および短ヘアピン RNA (shRNA)分子を用 いる RNA干渉（RNAi)により、インターロイキン遺伝子、インターロイキンスーパーフ アミリー遺伝子、または遺伝子発現および Zまたは活性のインターロイキン経路に関 与する遺伝子の発現及び活性を調節するのに有用な化合物に関して開示されてい る（特許文献 2 :特開 2005— 524393号公報)。
[0010] 細胞内にアンチセンス RNAが存在すると、それと相補的な mRNAとハイブリダィズ し、 mRNAからタンパク質への翻訳が阻害されるために遺伝子の発現を阻害するこ とができる。人為的にアンチセンス RNAを細胞内に導入すれば、ターゲット遺伝子の 発現を阻害することができるので、現在、遺伝子の機能を解明する技術として使われ ており、医薬品への応用も検討されている。 iNOS遺伝子に関してはこれまで、アン チセンス RNAの存在は確認されていなかった。また、これまで、 mRNAからの転写 に際して mRNAの安定化に寄与しているタンパク質の存在が示唆されていた（非特 許文献 l : Eur. J. Pharmacol. 500: 255-266 (2004))が、その詳細については不明で あり、 iN〇Sの発現制御に関しては不明な点が多かった。
[0011] 特許文献 1 :特開 2005— 13224号公報
特許文献 2 :特開 2005— 524393号公報
非特許文献 1 : Eur. J. Pharmacol. 500: 255-266 (2004)
発明の開示
発明が解決しょうとする課題
[0012] 本発明は、 iNOSの発現制御を目的として、 iNOS遺伝子の mRNAに相補的な塩 基配列を持つ一本鎖 RNA (アンチセンストランスタリブト）に相補的な配列を持つセ ンスオリゴヌクレオチドを提供する。 課題を解決するための手段
[0013] 本発明者らは、細胞内において、 mRNAに相補的な配列を持つ一本鎖 RNA (ァ ンチセンス転写物（アンチセンストランスクリプト） )が存在し、それが従来のアンチセン ス RNAとは異なり、 mRNAの安定化に寄与しているケースがあることを見出し、同日 付で特許出願している。
[0014] 本発明者らは、さらに、 iNOSの発現制御に関して鋭意研究を重ねた結果、上記一 本鎖 RNA (アンチセンス転写物）に相補的な配列を持つセンスオリゴヌクレオチドを 用いて、アンチセンス転写物にハイブリダィズしてそのはたらきを抑制することで mR NAの安定性に干渉し、その結果 iNOSの発現を抑制し、 N〇の過剰産生を抑制す る方法を見い出し、本発明を完成させた。
[0015] すなわち、本発明は以下の iNOSmRNAアンチセンス RNA (iN〇SmRNAアンチ センス転写物）に相補的な配列を有するセンスオリゴヌクレオチド、 NO産生抑制活性 を有する組成物、及び iNOS産生量の抑制方法に関する。
1. iNOS (誘導型一酸化窒素合成酵素) mRNAに相補的な配列を有する iNOSmR NAアンチセンス RNA (iNOSmRNAアンチセンス転写物）に相補的な配列を有す るセンスオリゴヌクレオチド。
2.配列番号 1に示された核酸配列を含む前記 iNOSmRNAアンチセンス RNA (iN OSmRNAアンチセンス転写物）に相補的な配列を有する前記 1に記載のセンスオリ ゴヌクレオチド。 る熱力学的に安定でないループ構造に対応する領域に相補的な配列を有する前記 1または 2に記載のセンスオリゴヌクレオチド。
4. 16塩基以上 335塩基以下の塩基長を有する前記 1〜3のいずれかに記載のセン スオリゴヌクレオチド。
5.核酸分解酵素による分解に対して安定化された前記:!〜 4のいずれかに記載の センスオリゴヌクレオチドおよびその誘導体。
6.安定化力 SLNA、 PNA、 ENA、モルホリノおよびその他の修飾法による前記 5に 記載のセンスオリゴヌクレオチド。
7.前記 1〜6のいずれかに記載のセンスオリゴヌクレオチドを含有し、 iNOSmRNA の分解を促進する NO産生抑制活性を有する組成物。 に相補的な配列を有するセンスオリゴヌクレオチドを導入することを特徴とする iNOS 産生量の抑制方法。
発明の効果
本発明の iNOSmRNAに相補的な配列を持つアンチセンス転写物に相補的な配 列を持つセンスオリゴヌクレオチド、及びそのフォスフォロチォェネート型、すなわち S 化センスオリゴは、 NOの過剰産生が関与する疾患である炎症性疾患や、細菌感染 によるエンドトキシンショック、発がん等に対して有効な医薬組成物、すなわち医薬と して、あるいはそれらに対して有効な健康食品組成物、すなわち健康食品として用い ること力 Sできる。 発明を実施するための最良の形態
[0017] 本発明は、細胞内において、誘導型一酸化窒素合成酵素 iN〇S (inducible nitric o xide synthase) mRNAの安定化に寄与している iNOSmRNAに相補的な配列を持 つ一本鎖 RNA (アンチセンス転写物）に相補的な配列を持つセンスオリゴヌクレオチ ドを用いて、アンチセンス転写物にハイブリダィズしてそのはたらきを抑制することで mRNAの安定性に干渉し、その結果 iN〇Sの発現を抑制し、 N〇の過剰産生を抑制 する。
[0018] iNOSmRNAに相補的な配列を持つ一本鎖 RNAとは、配列番号 1で表わされる 塩基配列と同一又は実質的に同一な塩基配列を含むヌクレオチドである。実質的に 同一なヌクレオチドは、配列番号 1またはこれと 75%以上、好ましくは 90%以上、より 好ましくは 95%以上の相同性を有する塩基配列を含み、誘導型一酸化窒素合成酵 素 (iNOS)の合成量を増大させる物質であり、化学合成、公知の発現法および精製 法あるいは実施例に記載の方法によって調製することができる。
[0019] 本発明における iNOSmRNAの上記アンチセンス転写物に相補的な配列を持つ センスオリゴヌクレオチド（以下、これらを「本発明センスオリゴ」という。）とは、アンチ センス転写物とハイブリダィズ可能なオリゴヌクレオチドまたはその誘導体であり、核 内の核酸分解酵素で分解されなレ、ように修飾されてレ、るものであればょレ、。
[0020] センスオリゴ設計は、 Nucleic Acids Res. 31, 3406-3415 (2003)及び J. Mol. Biol. 28 8， 911-940 (1999)に開示されたプログラム「mfold」（http：〃 www.bioinfo.卬 i.edu zu kerm/rna/参照）を使用して RNAの 2次構造を予測して行うことができる。センスオリ ゴの候補配列は、熱力学的に安定でなレ、部分（たとえばステム 'ノレープ（stem-loop) 構造の stem部分以外の領域）、好ましくはステム'ノレープ構造のループ (loop)構造 を含む部分に対するセンスオリゴヌクレオチドを設計する。
[0021] 上記のセンスオリゴの候補配列について、細胞に配列非特異的な反応を起こす 5 '
CG— 3 '、 5 '— GGGG 3 '、及び 5 '— GGGGG 3 '等の配列を含まなレ、配列 を選び、ラットゲノムで相同性検索を行ない、類似の配列が存在しないことを確認して 好ましい配列を選択する（J. Neurochem. 86, 374382 (2003)参照）。
[0022] センスオリゴとしては、配列番号 2〜4で示されるオリゴヌクレオチド等が挙げられる（ 下記の配列は修飾を省略して示す。）。
5' - GCCTCATACTTCCTCAGAGC - 3 ' (配列番号 36)
5， -TAGCTGCATTGTGTACAGAT- 3 ' (配列番号 37)
5， - GTGTATAATTCCTTGATGAA - 3 ' (配列番号 38)
これらは、化学合成、公知の発現法および精製法あるいは実施例に記載の方法によ つて調製することができる。
[0023] 本発明センスオリゴは、核内の核酸分解酵素で分解されないように修飾されていれ ばよぐその修飾に特に制限はなレ、。センスオリゴヌクレオチドは細胞内では、 5'また は 3 '末端力 順にヌクレオチドをはずしてレ、く酵素ェキソヌクレアーゼ（exonuclease) により、両端から消化されることから、例えば、両端から 1つ以上のリン酸結合 P = 0を P = Sに置換した、分解酵素に安定な Phosphorothioate (フォスフォロチォエート）型 に修飾するのが好ましレヽ（以下、これを「S化センスオリゴヌクレオチド（S化センスオリ ゴ）」という。 ) (J. Neurochem. 86 , 374-382 (2003)参照）。ただし、すべてのリン酸結 合を S化すると光学異性が生じ、ハイブリダィゼーシヨンの面から不利になる。
[0024] S化センスオリゴヌクレオチド（S化センスオリゴ）の具体例としては、
5'— G氺 C氺 C氺 TCATACTTCCTCAG氺 A氺 G氺 C 3 '
5，一 T氺 A氺 G氺 CTGCATTGTGTACA氺 G氺 A氺 T 3 '
5'— G氺 T氺 G氺 TATAATTCCTTGAT氺 G氺 A氺 A— 3 '
(配列中、 *は S化した部分を示す。）等が挙げられる。
[0025] 他の修飾法としては、 PNA (peptide nucleic acids)、 LNA (Locked Nucleic Acids) 、 ENA (2'-0, 4'-C-Ethylene-bridged Nucleic Acids；シグマアルドリッチ社）、モルホ リノ（Mo卬 holino)オリゴ（Gene Tools社， OR, USA)等が挙げられる。
[0026] 本発明センスオリゴは、 iNOSmRNAのアンチセンス転写物の存在が確認された 細胞内に導入することにより、アンチセンス転写物と反応 (ハイブリダィズ)して、細胞 内におけるアンチセンス転写物の有効量を低減させると考えられるので、センスオリ ゴの投与により本来の遺伝子産物 (iNOS)の発現量を減少させ、 NOの過剰産生を 抑制することができる。
実施例 [0027] 以下に実施例を示して本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらによって限 定されるものではない。
[0028] (1) iNOSmRNAに相補的な配列であるアンチセンス転写物の配列と領域 (塩基長） の決定方法
実施例 1：ラット iN〇Sアンチセンス転写物
以下の方法により、ラッ HNOSの mRNAに対して、遺伝子のアンチセンス鎖力、ら転 写された「アンチセンス転写物」が存在するかどうか調べ、この「アンチセンス転写物」 がセンス遺伝子産物の産生の制御にどのように関わっているかを調べた。なお、ラッ MNOSの mRNAの塩基配列は、 DDBJ/EMBL/GenBank国際塩基配列データべ一 ス (http://www.ddbj.mg.ac.jp/、 http://www.ebi.ac.uk/ embl/、 http://www.ncbi. nlm.n ih.gov/Genbank/)によって既知である。
[0029] サイト力インや急性期タンパク質など、誘導的発現の起こる遺伝子の mRNAの 3'非 翻訳領域（3'UTR)には、 AU-rich element (ARE)と呼ばれる配列、すなわち 5 '— A UUUA- 3 'または 5 ' -AUUUUA- 3 'とレ、う配列が存在してレ、る（Proc Natl Acad Sci USA 83: 1670-1674 (1986)参照）。 AREはヒト、ラット及びマウスの iNOSmRNA の 3'UTRにも存在しているので、この AREを含む 3'UTRに対応する（配列が相補 的な）アンチセンス転写物が存在するかどうかを、鎖特異的 RT— PCR法により調べ た。本法はオリゴ dTプライマーのように、 mRNAだけにハイブリダィズする（ストランド (鎖）特異的な）プライマーを使って逆転写を行って相補的 DNA(cDNA)を合成し た後、 PCR法を行って cDNAを増幅し、 mRNAの量を測定する方法である。
[0030] すなわち、以下に示す iNOS遺伝子のセンス鎖のプライマー：
5' -TGCCCCTCCCCCACATTCTCT- 3 ' (配歹' J番号 2)
を用レ、、培地に IL—1 j3を添カ卩して iN〇S mRNAを誘導したラット初代培養肝細胞 の全 RNAに対して RT_ PCRを行なレ、 cDNAを合成した。
[0031] ラット初代培養肝細胞から調製した RNA (1 β g)と 2pmolのプライマーを混ぜてか ら、 70°C、 10分間加熱後、 0°Cに急冷した。これに ReverTra Ace反応バッファー（東 洋紡）、 dNTP (N=A， C, G, T) (最終濃度 ImMになるように）、 20 units RNase inh ibitor (東洋紡）、及び 200 units ReverTra Ace逆転写酵素（東洋紡）をカロえ、全量を 2 5 /i lとした。 47°Cで 60分間保温して逆転写した後、 70°C、 15分間加温して逆転写 酵素を失活させた。次に、 5 unitsの Tth RNase H (東洋紡）をカ卩えて、 37°C、 20分間 加温して铸型 RNAを分解した。合成した cDNAはエタノール沈澱を行なって回収し 、 20 μ 1の ΤΕバッファーで溶解した。
[0032] このようにして得られた cDNA 2 μ 1に、 PCR反応バッファー（二ツボンジーン社）、 d NTP (N=A， C, G, T ;二ツボンジーン社）（最終濃度 125 μ Μになるように）、下記 2種類のプライマー、順方向（Forward)プライマー 40pmol、逆方向（Reverse)プライ マー 40pmol、 1 unit Gene Taq DNAポリメラーゼ（二ツボンジーン社）、及び anti- Taq high ( =抗 Taqポリメラーゼ抗体，東洋紡） #を加えて、全量を 40 μ 1としてさらに PCRを 行なった。
順方向：
5， -ACCAGGAGGCGCCATCCCGCTGC- 3 ' (配列番号 3)
逆方向：
5， - CTTG ATC AAAC ACTC ΑΤΤΤΤΑΤΤΑΑΑ - 3，（配列番号 4)
[0033] PCRの温度プロトコールには公知の方法、すなわちステップダウン法（Nishizawa M , Nakajima T, Yasuda K, Kanzaki H, Sasaguri , Watanabe K, and ito S. Close kinsh ip of human 20a-hydroxysteroid dehydrogenase gene with three aldo—keto reductase genes. Genes Cells (2000) 5， 111-125)参照）に従って行った。 PCR産物のァガロー スゲル電気泳動を行った結果、 186塩基対 (bp)のバンドの増幅が見られた。
このバンドをゲル力 切り出して精製し、塩基配列を決定したところ、上記のプライ マー配列に挟まれた、ラッ HNOSmRNAの 3 ' UTRの配列に相補的な配列であるこ とを確認した。すなわち、 iN〇S遺伝子のセンスプライマーを用いた鎖特異的 RT—P CR法により、アンチセンス転写物の存在を証明した。
[0034] さらに iNOS遺伝子のアンチセンス転写物の全構造を調べるために、 RACE法（Fr ohman MA. Rapid amplification of complementary DNA ends for generation or full-le ngth complementary DNAs: thermal RACE. Methods Enzymol. (1993) 218: 340-356 参照）による解析を試みた。 RACE法は既知の cDNA配列から鎖特異的なプライマ 一を作製して逆転写を行レ、、 5'側及び 3'側の cDNAの配列を決定する方法である。 [5'側の cDNAの配列決定]
ラット初代培養肝細胞に IL—1 を添加して、 iNOS mRNAを誘導し、 Trizol試薬 (インビトロジェン）で RNAを調製した。この RNAを铸型とし、配列番号 2のプライマ 一（iNOSのセンス (forward)プライマー； 5'_TGCCCCTCCCCCACATTCTCT_3') を使って二本鎖 cDNAを合成した。この cDNAに CAカセットアダプター（cDNA PCR Library Kit (タカラバイオ (株)）に添付）を連結した後、配列番号 3のプライマー（iN〇 S mRNAの 3， UTRに対するセンス（forward)プライマー）と CAプライマー（cDNA P CR Library Kit (タカラバイオ (株)）に添付）を使って PCRを行なった。反応液をァガロ ースゲル電気泳動したところ、約 250bpのサイズのバンドが増幅していた。このバンド を切り出して、 pGEM-T Easyベクター（プロメガ）にクローニングして、塩基配列を決 定した。
[3'側の cDNAの配列決定]
上記と同様に、 IL- l i3で誘導したラット初代培養肝細胞から RNAを調製した。 Pol yATract mRNA Isolation System (プロメガ)を使って、 PolyA—画分の RNAを精製し、 この RNAを铸型とし、アンカー配歹 1J(下線部)を付けたランダムプライマー（アンカーラ
GCCGCNNNNNNN-3' (配列番号 5) )を使って二本鎖 cDNAを合成した。この cDN Aに CAカセットアダプターを連結した後、配列番号 4のプライマー（iNOS mRNAの 3， UTRに対するアンチセンス（reverse)プライマー）と CAプライマーを使って PCRを 行なった。この反応液を精製して铸型とし、 iNOS mRNAの 3 ' UTRに対するアンチ センス（reverse)プライマー（5'- ATATTAGAGCAGCGGGATGGCGCCTC- 3' (配列 番号 6) )とアンカープライマー（上記の「アンカーランダムプライマー」のアンカー配列 に対するプライマー； 5'-ACTAGAATTCTCGAGCGGCCGC_3' (配列番号 7) )を使 つて 2次 PCRを行なった。反応液をァガロースゲル電気泳動したところ、 200〜500b pのサイズのバンドが増幅していた。このバンドを切り出して、 pGEM_T Easyベクター にクローユングして、塩基配列を決定した。
この結果、アンチセンス転写物の全長はほぼ 600塩基以上と推定された。以下にそ の配列を示した（配列番号 1 ;但し、 cDNA配列として示す。）。すなわち、アンチセン ス転写物は iNOS mRNAの 3'UTRに対応し、転写開始点（5'側）は iNOS mRNA のポリ A付加部位の相補鎖にあった。
[0035] 実施例 2 :ヒ HNOSアンチセンス転写物
以下の方法により、ヒ MNOSの mRNAに対して、遺伝子のアンチセンス鎖力、ら転 写された「アンチセンス転写物」が存在するかどうか調べた。なお、ヒ HNOSの mRN Aの塩基配列は、 DDBJ/EMBL/GenBank国際塩基配列データベース（http：〃 www. ddbj.mg.ac.jp/、 http://www.ebi.ac.uk/ embl/、 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ Genban k/)により既知である。
[0036] ヒトの組織 (胎盤、肝臓、胃粘膜)または細胞 (刺激していないリンパ球)から、常法 に従レ、 Trizol試薬（インビトロジヱン社）を用いて、全 RNAを抽出した。得られた全 RN Aは、 DNaseを含む TURBO DNA- free Kit (アプライドバイオシステムズ社）で処理し、 混入するゲノム DNAを除去した。この全 RNAを铸型として、以下に示すヒト iNOS遺 伝子のセンス鎖のプライマー：
5， - CTGAGTGCACCACTTCAAGTGAC - 3，（配列番号 8)
を用い、逆転写を行ない、 cDNAを合成した。具体的には、実施例 1において、ラット 初代培養肝細胞から調製した RNA1 μ gと配列番号 2で表わされるプライマー 2pmo 1の代わりに、ヒトの組織または細胞から調製した全 RNA(1 μ g)と上記配列番号 8で 表わされる（2pmol)を用いた他は、同様の方法で cDNAを合成した。
[0037] このようにして得られた cDNA 2 β 1に、 PCR反応バッファー（二ツボンジーン社）、 d NTP (N=A, C, G, T;二ツボンジーン社）（最終濃度 125 μ Μになるように）、下記 2種類のプライマー、順方向（Forward)プライマー 40pmol、逆方向（Reverse)プライ マー 40pmol、 1 unit Gene Taq DNAポリメラーゼ（二ツボンジーン社）、及び anti- Taq high ( =抗 Taqポリメラーゼ抗体，東洋紡） #を加えて、全量を 40 μ 1としてさらに PCRを 行なった。
順方向：
5， - CAGGAGGTGCTATCGCACCACT- 3 ' (配列番号 9)
逆方向：
5， - GCAATTCATGTAAATATCTCCATC - 3， (配列番号 10) [0038] PCRの方法は実施例 1と同様の方法で行った。 PCR産物のァガロースゲル電気泳 動を行った結果、ヒト胎盤由来の cDNAを用いたときに 151塩基対 (bp)のバンドの 増幅が見られた。その他の cDNA (肝臓、胃粘膜または刺激していなレ、リンパ球）で は増幅が見られなかった。
増幅したバンドをゲル力 切り出して精製し、塩基配列を決定したところ、上記のプ ライマー配列に挟まれた、ヒ HNOSmRNAの 3 ' UTRに相補的な配列であることを 確認した。すなわち、 iN〇S遺伝子のセンスプライマーを用いた鎖特異的 RT—PCR 法により、ヒ HNOSアンチセンス転写物の存在を証明した。ヒ MNOSアンチセンス転 写物の配列を配列番号 11に示す。但し、 cDNA配列として示す。
[0039] 実施例 3 :マウス iN〇Sアンチセンス転写物
以下の方法により、マウス iNOSの mRNAに対して、遺伝子のアンチセンス鎖から 転写された「アンチセンス転写物」が存在するかどうか調べた。なお、マウス iN〇Sの mRNAの塩基配列は、 DDBJ/EMBL/GenBank国際塩基配列データベース（http:/
Figure imgf000012_0001
http://www.ebi.ac.uk/ embl/、 http://www.ncbi.nlm.mh.gov/ G enbank/)により既知である。
[0040] RAW264細胞力 、から、常法に従い Trizol試薬（インビトロジヱン社）を用いて、全 RNAを抽出した。得られた全 RNAは、 DNaseを含む TURBO DNA-free Kit (アプライ ドバイオシステムズ社）で処理し、混入するゲノム DNAを除去した。この全 RNAを铸 型として、以下に示すマウス iNOS遺伝子のセンス鎖のプライマー：
5， - CCTTCTTCTCCACTCCCCAGCT- 3 ' (配列番号 12)
を用い、逆転写を行ない、 cDNAを合成した。具体的には、実施例 1において、ラット 初代培養肝細胞から調製した RNA1 μ gと配列番号 2で表わされるプライマー 2pmo 1の替わりに、 RAW264細胞から調製した全 RNA(1 μ g)と配列番号 12で表わされ る（2pmol)を用いた他は、同様の方法で cDNAを合成した。
[0041] このようにして得られた cDNA 2 μ 1に、 PCR反応バッファー（二ツボンジーン社）、 d NTP (N=A， C, G, T;二ツボンジーン社）（最終濃度 125 μ Μになるように）、下記 2種類のプライマー、順方向（Forward)プライマー 40pmol、逆方向（Reverse)プライ マー 40pmol、 1 unit Gene Taq DNAポリメラーゼ（二ツボンジーン社）、及び anti- Taq ( =抗丁&9ポリメラーゼ抗体，東洋紡) #を加えて、全量を 40 μ 1としてさらに PCRを 行なった。
順方向：
5， - GACCACCAGGAGGCACCATGCCG - 3 ' (配列番号 13)
逆方向：
5， -ATACAGGAAAGGCCCAAGCCATC - 3 ' (配列番号 14)
[0042] PCRの方法は実施例 1と同様の方法で行った。 PCR産物のァガロースゲル電気泳 動を行った結果、 127塩基対（bp)のバンドの増幅が見られた。
増幅したバンドをゲル力 切り出して精製し、塩基配列を決定したところ、上記のプ ライマー配列に挟まれた、マウス iN〇S mRNAの 3 ' UTRに相補的な配列であること を確認した。すなわち、 iN〇S遺伝子のセンスプライマーを用いた鎖特異的 RT_ PC R法により、マウス iNOSアンチセンス転写物の存在を証明した。マウス iN〇Sアンチ センス転写物の配列を配列番号 15に示す。但し、 cDNA配列として示す。
[0043] (2) iN〇SmRNAに相補的なアンチセンス転写物（以下、単にアンチセンスと略す） による iNOSmRNAの安定化
実施例 4：ラッ HNOSアンチセンス転写物による iNOSmRNAの安定化
ラットアンチセンスが iNOSmRNAを安定化しているかどうかを明らかにするために 、ラットアンチセンスに相補的な配列を持ち、ラットアンチセンスにハイブリダィズする 性質を持つ iNOSのセンスオリゴヌクレオチド（以下、センスオリゴと略す）をラット初代 培養肝細胞に導入し iNOSmRNA量を調べた。
センスオリゴはオリゴヌクレオチドにおけるホスホジエステル結合のリン酸の酸素原 子の一つを硫黄原子に置換 (S化）することによって、細胞内における核酸分解酵に よるオリゴヌクレオチドの分解を防いだ。 IBA社（Gottingen, Germany)の Magnet assis ted transfection法による遺伝子導入試薬キット（MATra- A Reagent)により、 S化セン スオリゴをラット初代培養肝細胞に導入した。
[0044] ラット初代培養肝細胞は公知の方法（J. Hepatol. 40, 616-623， 2004)で調製し、 6 穴プレートに（1ゥエルあたり 3 X 105細胞）蒔いた。 2時間後に、 1ウエノレあたり 1. 5ml の新しい培地（Williams' E培地（WE)に、 10%ゥシ胎児血清、 Ι ΟηΜデキサメタゾン 及び 10nMインスリンを含む培地。 WES— DIと略す）と交換した。さらに 4時間後、ォ リゴ（2 μ g)と WE (200 μ 1)を混合し、次に 2 μ 1の MATra-A Reagent (IBA社）を混ぜ て室温で 20分間静置した後、肝細胞の入っているゥエルに全量を滴下した。 6穴プ レートを磁石盤 (IBA社）の上に載せ、室温で 15分間静置してオリゴを細胞に導入し た。 10%ゥシ胎児血清を含む WE (1ゥヱルあたり 1.5ml)と交換してから、ー晚 37°C に置いた。翌朝、 InMの IL—1 j3を含む WEに培地交換し、 4時間、 37°Cに置いた 後、全 RNAを調製した。
肝細胞を IL_1 j3で刺激すると、 iNOSmRNAの量が顕著に増加する力 上記の S化センスオリゴを導入して IL—1 /3で刺激して、 RT—PCR法及びリアルタイム PCR 法による mRNA量の測定を行った。この結果を図 1及び 2に示す。
[0045] ここで用いた iN〇S遺伝子のセンス鎖配歹 1J、すなわち iNOSmRNAと同じ配列を持 つ S化オリゴヌクレオチドは以下の配列で示される。実験では S2、 S4と S5に相当す る。
S2:5'—G氺 C氺 C氺 TCATAC丁丁 CCTCAG氺 A氺 G氺 C— 3'
S4:5' T氺 A氺 G氺 CTGCATTGTGTACA氺 G氺 A氺 T 3'
S5:5'—G氺 T氺 G氺 TA丁 AA丁丁 CC丁丁 GA丁氺 G氺 A氺 A—3'
(S化した部分は *で示した。 )
[0046] 一方、陰性対照として塩基組成が同じでありながら配列が異なるため、 iNOSmRN Aやその転写物、あるいは他の RNAとハイブリダィズしないことが確認されている配 列を持つ「スクランブルオリゴ」を導入した。スクランブルオリゴの配列を以下に示す。
Scr2:5， 一G氺 G氺 T氺 ATTGCCCACCCAAC氺 T氺 C氺 T—3'
Scr4:5' -G*G*C*TCCATATGATTAGA*T*G*T-3'
Scr5 :5' -G*A*T* TGTTACTTAGAGACネ Tネ Aネ T_ 3 '
これらのスクランブルオリゴもセンスオリゴと同様、細胞内での分解を防ぐために、 S 化して用いた。 「スクランブルオリゴ」についてはラットゲノムとの相同性検索により、類 似の配列が存在しなレ、ことを確認してある。
[0047] さらに、もう一つの陰性対照として、 iNOSmRNAのステム'ノレープ構造のステム部 分に対する S化センスオリゴヌクレオチド S 1を導入した。 S 1の配列を以下に示す。 Sl : 5 '—C ^ A ^ T ^ TCTCTTTCCTTTGC ^ C ^ T ^ C— 3'
( *は前記と同様の意味を表わす。）
[0048] センス鎖（mRNAと同じ配列を持つ鎖）と同じ配列のプライマーを用いて鎖特異的 RT—PCR法を行うと、「アンチセンス転写物」に対する cDNAのみが逆転写されるの で、「アンチセンス転写物」の量を測定することができる。なお、逆転写を行なわずに PCRを行なった対照を置き、肝細胞の全 RNAに混入したゲノム力 PCRによって増 幅しないことを確認した。図の中では RT (―)で示した。
[0049] この結果、 S2、 S4、及び S5の S化センスオリゴを導入した場合には iNOSmRNA の量が減少した。これは、 S化センスオリゴカ iNOSのアンチセンス転写物とハイブリ ダイズして、アンチセンス転写物が分解されたために、 iNOSmRNAも分解されたこ とを示している。一方、スクランブルオリゴを導入した場合には、 iNOSmRNAの量は 大きく変動しなかった。また、ステム部分に対する S1を導入した場合にも、 iNOSmR NAの量は大きく変動しな力 た。
[0050] また、センスオリゴ S5またはスクランブルオリゴ Scr5を肝細胞に導入した時に、 IL-1
βを添加後の iNOSmRNA量を、逆転写した cDNAを铸型としてリアルタイム PCR 法で測定した。その結果、スクランブルオリゴ Scr5を導入すると、 iNOSmRNA量が 2倍になるのに要した時間は 119分間であった。これに対し、センスオリゴ S5を導入 した時には 461分間であった（図 2)。
[0051] iNOSと同様に、 iNOS以外の初期応答遺伝子 Cytokine-Induced Neutrophil Che moattractant 1 ; CINC— 1も肝細胞において IL— 1 j3刺激下で顕著な mRNAの誘 導を起こす。そして、 CINC— 1の mRNAの 3'非翻訳領域（3 ' UTR)にも、 iNOSm RNAと同様に ARE配列が存在する。 iNOSのセンスオリゴを肝細胞に導入した際に 、 CINC—1の mRNA量を測定したところ、センスオリゴを入れない場合と mRNA量 に差がなかった。すなわち、 iNOSのセンスオリゴの働きは iNOSに限定されるもので あることを示していた（図 1)。
以上の結果を併せると、 iNOSのセンスオリゴは iNOSアンチセンス転写物と特異的 にハイブリダィズして iNOSmRNAの分解を促進して、その結果として iNOSmRNA の量を特異的に減少させることが示された。 [0052] 実施例 5：マウス iNOSアンチセンス転写物による iNOSmRNAの安定化 マウスアンチセンスにハイブリダィズする性質を持つ iNOSセンスオリゴヌクレオチド の S化センスオリゴを、マウスマクロファージ由来の RAW264細胞に導入して、マウス アンチセンス転写物による iNOSmRNAの発現抑制を調べた。
以下に記載しない操作は実施例 4と同様の方法により行なった。マウス RAW264 細胞を、ゥヱルあたり 5 X 105細胞蒔き、 DMEM培地を交換して C〇2恒温器で培養し た。
IBA社 (Gottingen, Germany)の Magnet assisted transfection法により Sィ匕センスオリ ゴを、 RAW264細胞に導入した。 10%ゥシ胎児血清を含む DMEM培地（1ゥエル あたり 1. 5ml)と交換してから、ー晚、 37°Cに置いた。翌朝、大腸菌 LPS (1 μ gZml )を含む DMEMに培地交換し、 4時間、 37°Cに置いた後、全 RNAを抽出し RT— P CRに供した。なお、全 RNAは、 DNaseを含む TURBO DNA-free Kit (アプライドバイ ォシステムズ社）で処理し、混入するゲノム DNAを除去した。
センスオリゴは、マウスアンチセンス転写物に対応する、マウス iNOSmRNAに対し て作製した。
[0053] ここで用いられたマウス iNOS遺伝子のセンス鎖の配歹 lj、すなわち iNOSmRNAと 同じ配列を持つ S化オリゴヌクレオチドは配列で示される。実験では Sl、 S2と S3に 相当する。
Sl : 5 ' G氺 A氺 A氺 GCACTTTGGGTGAC氺 C氺 A氺 C 3'
S2 : 5 ' T氺 A氺 G氺 CTGCAC丁 ATGTACA氺 G氺 A氺 T 3'
S3 : 5 '—C氺 A氺 G氺 ATATTTA丁 ACTTCA氺 T氺 A氺 T—3'
(S化した部分は *で示した。 )
[0054] 実施例 4で行なった鎖特異的 RT— PCR法に従って、マウス iNOSmRNAの量を 測定した。
この結果、マウス iNOSmRNAの量が減少した。これは、 S化センスオリゴが、 iN〇 Sのアンチセンス転写物とハイブリダィズして、アンチセンス転写物が分解または競合 されたために、 iNOSmRNAも分解されたことを示した（図 3)。
[0055] [実施例 1〜5まとめ] 実施例 4及び 5の結果から、ラットのみならず、マウスでも iNOSのセンスオリゴは iN OSアンチセンス転写物と特異的にハイブリダィズすることにより、 iNOSmRNAの分 解を促進して、その結果として iNOSmRNAの量を特異的に減少させることが示され た。
このように、ラット肝細胞でも、マウスの細胞でも、センスオリゴヌクレオチドを用いて i NOSmRNAの発現を抑制することができた。従って、センスオリゴヌクレオチドを用 いた iNOSmRNAの発現抑制は、肝臓などの炎症時の iN〇S誘導及び N〇産生を 軽減し、肝障害の有効な治療方法となるといえる。
[0056] (3) iN〇S遺伝子以外の初期応答遺伝子の mRNAに相補的な配列であるアンチセ ンス転写物の配列と領域 (塩基長）の決定方法
炎症の時に誘導されて発現する遺伝子（レ、わゆる「初期応答遺伝子」 )には、 iNOS のみならず、サイトカインゃケモカインなどの生理活性物質の遺伝子が含まれる。こ れらの初期応答遺伝子は炎症を増悪させたり、改善させたりするなど、多彩な働きを 持っている。初期応答遺伝子の発現を調節することは、最終的には炎症を調節する ことにつながる。そこで、 iNOS遺伝子のアンチセンス転写物以外にも、他の初期応 答遺伝子においてもアンチセンス転写物が発現しているかどうかを調べた。次に、種 間でよく保存されており、かつ複数の ARE配列を含んでいる 3' UTRの配列に対して 、アンチセンス転写物が発現されていると予想した。そして、この部分に対して、逆転 写用のセンスプライマーと、 PCR用の 1対のプライマーをデザインし、ラットの iNOS 遺伝子でアンチセンス転写物を検出した実施例 4と同様に、鎖特異的 RT— PCR法 を行なって、ラット肝細胞においてアンチセンス転写物が発現しているかどうかを調 ベた。
[0057] iNOS以外の初期応答遺伝子のうち、 3 ' UTRに複数の ARE配列を含むもので、 かつ種間（ヒト、マウス、ラット）で 3 ' UTRの配列がよく類似している 3つの典型的な遺 伝子を例にとって調べた。すなわち、以下の 3遺伝子である。
) し ytokme—Induced Neutrophil し hemoattractant 1 (し INC— 1)： Chemokme (し- X- C motif) Ligand 1 (CXCL1)とも呼ばれ、 IL-l βで刺激したラット肝細胞で誘導される ケモカインである。 (b) NF - / B p50 :転写因子 NF— / Bのサブユニットの 1つであり、炎症に深く関 与してレ、るタンパク質である。
(c) I / B - a： NF - κ Βの活性を抑制するタンパク質である。
なお、ヒト、マウス及びラットにおけるこれらの mRNAの塩基配列は、 DDBJ/EMBL/ GenBank国際塩基 ΰ歹 'Jテータベース (http://www.ddbj.nig.ac.jp/、 http://www.ebi. a c.uk/embl/、 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ Genbank/)により既夭口である。
[0058] 実施例 6：ラット CINC-1アンチセンス転写物
以下の方法により、ラット CINC-1の mRNAに対して、遺伝子のアンチセンス鎖から 転写された「アンチセンス転写物」が存在するかどうか調べた。以下に特に記載のな レ、操作は実施例 1と同様の方法で行なった。
初代培養ラット肝細胞を IL-1 βで刺激してから、常法に従い Trizol試薬 (インビトロ ジェン社）を用いて、全 RNAを抽出した。得られた全 RNAは、 DNaseを含む TURBO DNA-free Kit (アプライドバイオシステムズ社）で処理し、混入するゲノム DNAを除去 した。この全 RNAを铸型として、以下に示すラット CINC-1遺伝子のセンス鎖のプライ マー：
5， -TGTCTGGTGAACGCTGGCTTCTGA- 3' (配列番号 16)
を用い、逆転写を行ない、 cDNAを合成した。
[0059] 得られた cDNAと以下に示すラット CINC-1遺伝子のセンス鎖の 2種類のプライマー 順方向：
5， -TGTGGATGCGTTTCATCGATGGT - 3' (配列番号 17)
逆方向：
5， - CTAGCACAGTGGTTGACACTTA- 3' (配列番号 18)
を用いて、実施例 1と同様の方法のステップダウン法に従って PCRを行なった。
[0060] PCR産物のァガロースゲル電気泳動を行った結果、 122塩基対（bp)のバンドの増 幅が見られた。この増幅したバンドをゲル力 切り出して精製し、塩基配列を決定し たところ、上記のプライマー配列に挟まれた、ラット CINC-1 mRNAの 3 ' UTRの配列 であることを確認した。すなわち、 iNOS遺伝子のセンスプライマーを用いた鎖特異 的 RT— PCR法により、ラット CINC-l遺伝子のアンチセンス転写物の存在を証明した 。ラット CINC-1遺伝子のアンチセンス転写物の配列を配列番号 19に示す。但し、 cD NA配列として示す。
[0061] 実施例 7：ラット NF- κ B p50アンチセンス転写物
以下の方法により、ラット NF- κ B p50の mRNAに対して、遺伝子のアンチセンス鎖 力 転写された「アンチセンス転写物」が存在するかどうか調べた。以下に特に記載 のない操作は実施例 6と同様の方法で行なった。
初代培養ラット肝細胞を IL-1 βで刺激してから、常法に従い Trizol試薬 (インビトロ ジェン社）を用いて、全 RNAを抽出した。得られた全 RNAは、 DNaseを含む TURBO DNA-free Kit (アプライドバイオシステムズ社）で処理し、混入するゲノム DNAを除去 した。この全 RNAを錡型として、以下に示すラット NF- κ B p50遺伝子のセンス鎖の プライマー：
5， - CTGTCATTAAGGTATCGCAGTCC - 3 ' (配列番号 20)
を用い、逆転写を行ない、 cDNAを合成した。
[0062] 得られた cDNAと以下に示すラット NF- κ Β ρ50遺伝子のセンス鎖の 2種類のプライ マー：
順方向：
5， - CATCTACAGTACAGTCATGCACTC - 3， (配列番号 21 )
逆方向：
5 ' - GGGAAAATACTATTTTCAGCACTGAT- 3 ' (配列番号 22)
を用いて、実施例 1と同様の方法のステップダウン法に従って PCRを行なった。
[0063] PCR産物のァガロースゲル電気泳動を行った結果、 192塩基対（bp)のバンドの増 幅が見られた。このバンドをゲル力 切り出して精製し、塩基配列を決定したところ、 上記のプライマー配列に挟まれた、ラット NF- κ B p50 mRNAの 3 ' UTRの配列であ ることを確認した。すなわち、 iNOS遺伝子のセンスプライマーを用いた鎖特異的 RT — PCR法により、ラット NF- κ B p50遺伝子のアンチセンス転写物の存在を証明した。 ラット NF- κ B p50遺伝子のアンチセンス転写物の配列を配列番号 23に示す。但し、 cDNA配列として示す。 [0064] 実施例 8：ラッ H f B- αアンチセンス転写物
以下の方法により、ラッ H / B- aの mRNAに対して、遺伝子のアンチセンス鎖から 転写された「アンチセンス転写物」が存在するかどうか調べた。以下に特に記載のな レ、操作は実施例 6と同様の方法で行なった。
初代培養ラット肝細胞を IL-1 βで刺激してから、常法に従い Trizol試薬 (インビトロ ジェン社）を用いて、全 RNAを抽出した。得られた全 RNAは、 DNaseを含む TURBO DNA-free Kit (アプライドバイオシステムズ社）で処理し、混入するゲノム DNAを除去 した。この全 RNAを錡型として、以下に示すラット I κ B-ひ遺伝子のセンス鎖のプライ マー：
5 ' -TCCAGAATCTGATAAAAGGACCAC - 3' (配列番号 24)
を用レ、、逆転写を行ない、 cDNAを合成した。
[0065] 得られた cDNAと以下に示すラット I κ B _ ひ遺伝子のセンス鎖の 2種類のプライマ 順方向：
5， -TGAACCGCCATAGACTGTAGCTG - 3 ' (配列番号 25)
逆方向：
5 ' - GCACATACCACTGAACACCTGGT - 3' (配列番号 26)
を用いて、実施例 1と同様の方法のステップダウン法に従って PCRを行なった。
[0066] PCR産物のァガロースゲル電気泳動を行った結果、 102塩基対（bp)のバンドの増 幅が見られた。このバンドをゲル力 切り出して精製し、塩基配列を決定したところ、 上記のプライマー配列に挟まれた、ラッ H / B- α mRNAの 3 ' UTRの配列であるこ とを確認した。すなわち、 iN〇S遺伝子のセンスプライマーを用いた鎖特異的 RT—P CR法により、ラット I κ Β- α遺伝子のアンチセンス転写物の存在を証明した。ラッ Η κ Β-ひ遺伝子のアンチセンス転写物の配列を配列番号 27に示す。但し、 cDNA配列 として示す。
[0067] [実施例 6〜8のまとめ]
炎症の時に発現する初期応答遺伝子として、 iNOS以外の代表的な 3つの遺伝子 (CINC- 1、 NF_ /c B p50、 I /c B -ひ）を選んだが、いずれにおいても 3 ' UTRに複数の ARE配列を含み、かつ種間（ヒト、マウス、ラット）で 3' UTRの配列がよく似ている。 i NOSと同様に、この 3遺伝子においてもアンチセンス転写物が発現していることが確 p' c! "れ /こ。
[0068] このこと力、ら、アンチセンス転写物は ARE配列を含み、かつ種間で 3' UTRの配列 力はく似ている初期応答遺伝子では共通に見られる分子であることが推察される。さ らに、アンチセンス転写物がこれらの mRNAの安定性を調節してレ、る可能性が強く 示唆される。したがって、肝臓などの炎症において初期応答遺伝子のアンチセンス 転写物の働きを抑制することにより、炎症を抑える事が期待される。
[0069] (4)ラット急性肝不全モデルを用いた生体（in vivo)での iNOSとアンチセンス転写物 の発現誘導と肝臓保護剤（IGF-Iと FR183998)による iN〇Sとアンチセンス転写物の 発現誘導の抑制効果
実施例 1及び実施例 4の結果より、ラット初代培養肝細胞 (in vitro)の系において、 i NOS誘導時に iNOSmRNAの 3'—非翻訳領域（3' UTR)に対応するアンチセンス 転写物が発現し、 iNOSmRNAの安定化を促進することを示した。肝障害ラット (in vi vo)においても iNOS誘導に呼応して、 iNOSアンチセンス転写物が発現することを 以下に示す。さらに、 Insulin— like growth factor- 1 (IGF— I)や Na+/H+ exchanger阻害 剤（FR183998)などの肝臓保護剤の投与による生存率の変化と炎症性サイト力イン、 i N〇SmRNA、及びアンチセンス転写物の誘導との関係を以下に示す。
[0070] 実施例 9
(I)急性肝不全モデルの作製と肝臓保護剤の投与
雄 Sprague-Dawleyラット（250— 300 g)に、 D—ガラクトサミン（D-galactosamine) (400 g/kg)と細菌エンドトキシンである LPS (16 μ g/kg)との混合液（D- GalN/LPS)を静注 し、急性肝不全モデルを調製した。 Insulin-like growth factor-I (IGF-I； 3.2 mg/kg)あ るいは Na+/H+ exchanger阻害剤（FR183998; 1 mg/kg)を D-GalN/LPS処理の 30分 前に投与した。血中及び肝臓の炎症性サイト力イン (TNF-ひ， IL-1 β , IL-6,インタ 一フエロン γ , CINC_1)、 ΜΙΡ-2及び一酸化窒素（NO)を測定した。肝臓より全 RNA を調製し、 iNOSmRNA及び iNOSアンチセンス転写物を RT— PCRで検討した。
[0071] (II) RNAの解析 D—ガラクトサミンと LPS混合液の静注後、 3または 6時間後に、ラットの肝臓を取り 出して、常法に従い Trizol試薬 (インビトロジヱン社）を用いて、全 RNAを抽出した。 この全 RNAを铸型として、オリゴ dTプライマーを用いて、逆転写を行ない、次に実施 例 1等と同様の方法で PCR (RT_ PCR法）を行なった。 iNOSmRNAや、内部標準 となる elongation factor- 1 a (EFl) mRNAの定量には、逆転写のときオリゴ dTプライ マーを用い、 PCRのときには
iNOSmRNA :
CCAACCTGCAGGTCTTCGATG (配列番号 28)及び
GTCGATGCACAACTGGGTGAAC (配列番号 29)；及び
EFmRNA :
TCTGGTTGGAATGGTGACAACATGC (配列番号 30)及び
CCAGGAAGAGCTTCACTCAAAGCTT (配列番号 31 )
を用いた。なお、 PCR反応液には ant Taq high (=抗丁&(1ポリメラーゼ抗体，東洋紡） を添加した。
また、 iNOSアンチセンス転写物の定量は、実施例 1の方法に従った。なお、逆転 写を行なわずに PCRを行なった対照を置き、肝細胞の全 RNAに混入したゲノム力 PCRによって増幅しないことを確認した。 iNOSmRNA検出結果を図 4に示し、 iNO Sアンチセンス転写物の検出結果を図 5に示す。図中、 RT (-)は逆転写（-)の陰 性対照を示す。
(III)リアルタイム PCRによる mRNA及びアンチセンス転写物の定量
逆転写して合成した cDNAは、 日本バイオラド社の iCycler Systemを用いて、リアル タイム PCRによっても定量を行なった。 PCR反応液に SYBR Green I (ロシュ ·ダイァグ ノステイクス社）及び anti-Taq high (=抗 Taqポリメラーゼ抗体，東洋紡）を添加して、 公知の方法であるタツチダウン法で PCRを行なった。実際の PCRプロトコールは次 の通りである。
1サイクル（94。C， 1 min)、
50サイクル（94。C， 30 sec; (72— 0.3 X n)。C， 1 min; 72°C, 30 sec)； nはサイクル数。 結果を図 6に示す。図中、「*」は「p<0.05 vs. GalN/LPSラット (n= 3-6ラット /グループ)」 を示す。
(IV)肝臓保護剤による iNOSmRNA及び iNOSアンチセンス転写物量の変化 肝臓保護剤を投与しなかった場合、 D-GalN/LPSの静注後、約 24時間でほとんど の動物（90%以上）が死亡した。血中及び肝臓に、経時的（1〜： 12時間）に炎症性メ ディエイター（TNF- α , IL-1 β， IL-6,インターフェロン γ， CINC-1, MIP-2, NO)が 増加した。肝臓の iNOSmRNA誘導に呼応してアンチセンス転写物が増加を示し (i NOSmRNA及び iNOSアンチセンス転写物とも 6時間後に最大）、その結果過剰な N〇産生が認められた。
IGF-Iの投与により死亡率は 20〜30%以下に減少した。そして、上述の炎症性サ イト力イン、 NO産生に加えて iNOSmRNA及びアンチセンス転写物誘導の増加が 同様に抑制された（図 4〜6)。
FR183998の投与によっても死亡率は 20〜30%以下に減少し、上述の炎症性サイ トカイン、 NO産生に加えて iNOSmRNA及びアンチセンス転写物誘導の増加が同 様に抑制された（図 7〜9)。
(IV- 1)ラット急性肝不全モデルにおける肝臓保護剤 IGF-Iの iNOSmRNA及びァ ンチセンス転写物の発現誘導への効果
図 4の結果より、 D—ガラクトサミサンと LPSを投与したラット； GalN/LPSラットは、は 3 〜6時間で iNOSmRNAレベルが増加した力 IGF-Iを投与したラットはこの増加が 抑制された。
図 5及び 6の結果より、 RT (—）ではほとんど増幅した cDNAが見られないことから、 全 RNAに混入したゲノム DNAは極めて微量であると考えられる。 GalN/LPSラットは 3〜6時間でアンチセンス転写物レベルが増加した力 IGF-Iを投与したラットはこの 増加が抑制された。
(IV-2)ラット急性肝不全モデルにおける肝臓保護斉 ljFR183998の iNOSmRNA及 びアンチセンス転写物の発現誘導への効果
図 7の結果より、 GalN/LPSラットは 3〜6時間で iNOSmRNAレベルが増加したが、 FR183998を投与したラットはこの増加が抑制された。
図 8及び 9の結果より、 RT (―)ではほとんど増幅した cDNAが見られないことから、 全 RNAに混入したゲノム DNAは極めて微量であると考えられる。 GalN/LPSラットは 3〜6時間でアンチセンス転写物レベルが増加した力 FR183998を投与したラットは この増加が抑制された。
[0074] (5)ラット肝細胞でのセンスオリゴの効果 (iNOSタンパク質と一酸化窒素（NO)量の 変化）
実施例 10
実施例 4と同様の方法で、実施例 4において得られたセンスオリゴ S5またはスクラン ブルオリゴ Scr5を肝細胞に導入し、培地中の一酸化窒素（NO)量を Nitric Oxide Co lorimetric Assay kits (ロシュ ·ダイァグノステイクス社)で測定した。ただし、翌朝、 In Mの IL-1 βを含む WEに培地交換し、 8〜10時間、 37°Cに置いた後、測定した。ま た、細胞から全タンパク質を抽出して、 ECLキット（GEヘルスケア社）を用いたウェス タン法で iN〇Sタンパク質を検出した。結果を図 10に示す。
その結果、ラット肝細胞にセンスオリゴ S5を導入することで、 iNOSタンパク質及び 培地中の一酸化窒素（NO)量が減少することが示された。
[0075] (6)ノーザン法による iNOSアンチセンス転写物の検出
実施例 11
IL-1 βで刺激したラット肝細胞において、 iNOS遺伝子のアンチセンス転写物が存 在することを、 Northern blot analysis (以下、ノーザン法と略す)で確認した。
(I) RNAの調製
ラット肝細胞を一定時間、 IL-1 βで刺激してから、 Trizol試薬 (インビトロジェン社)を 用いて、全 RNAを抽出した。得られた全 RNAは、 DNaseを含む TURBO DNA-free K it (アプライドバイオシステムズ社）で処理し、混入するゲノム DNAを除去した。 Poly(A )+と poly(A)- RNAは、 PolyATract mRNA Isolation System (プロメガ社）で分画した。 非特異的なハイブリダィゼーシヨンを防ぐため、リボゾーム RNA (rRNA)を、終濃度 5% ポリエチレングリコール 6000及び終濃度 0.75M NaCl存在下で沈澱させて除き、上 清をエタノール沈澱により回収して電気泳動に用いた。
[0076] (II)ノーザン法：電気泳動
上記の RNA、すなわち無刺激ラット肝細胞の全 RNA、 IL-1 β刺激ラット肝細胞の全 RNA、 IL-1 β刺激ラット肝細胞の Poly(A)+ RNA、及び IL-1 β刺激ラット肝細胞の Poly( A)- RNAの 4つを、 2.2Mホルマリン含有ァガロースで電気泳動を行ない、分離した。
[0077] (III)ノーザン法：ハイブリダィゼーシヨン
常法に従い、ゲル中の RNAを Nytran Nフィルター（ワットマン社）に移した。次に、 D IG EasyHybバッファー（ロシュダイァグノステイタス社）中で、ディゴキシゲニン（DIG) 標識した iN〇Sの 3，UTRのセンスプローブと、 73。Cでー晚、ハイブリダィゼーシヨン を行なった。翌朝、ロシュダイァグノステイタス社のマニュアルに従って、フィルターを 洗った。なお、 iNOSの 3， UTRのセンスプローブは、 DIG-11-UTP (ロシュダイァグノ ステイタス社）と T3 RNAポリメラーゼ（ストラタジーン社）を用いて、試験管内で RNAを 合成することによって作製した。
[0078] (IV)ノーザン法：検出
ロシュダイァグノステイタス社のマニュアルに従って、ブロッキングを行なレ、、アルカリ フォスファターゼと結合した抗 DIG抗体（ロシュダイァグノステイタス社）とインキュベー トした。洗浄後、基質である CDP-Star (アプライドバイオシステムズ社）と反応させ、ェ ックス線フィルムで、 iNOSセンスプローブとハイブリダィズする RNAのバンドを検出 した。
[0079] (V)結果と考察
上記 4種の RNAのノーザン法による解析結果（エックス線フィルムのオートラジオグ ラム）を図 11に示す。
「IL_1 β刺激ラット肝細胞の全 RNA」と「IL_1 β刺激ラット肝細胞の Poly(A)-RNA」で は、 600〜1000ヌクレオチド (nt)のスメァ状の濃いバンドが観察された。 iNOSの 3 ' UT Rのセンスプローブを用いているので、これらのスメァ状バンドは、 iNOSのアンチセ ンス転写物のバンドと考えられる。従って、 iNOSのアンチセンス転写物の長さは一 定ではなぐさまざまな長さ（600〜1000ヌクレオチド）の転写物の集合であることがわ かった。
[0080] RACEの結果とリボヌクレアーゼプロテクションアツセィの結果とを併せると、図 12 に示すように、 iNOSのアンチセンス転写物が合成されていると考えられた。図中、点 線は 600ヌクレオチド以上のさまざまなサイズのアンチセンス転写物ができていること を示す。図中の数字は iNOS遺伝子のェクソンの番号、黒い部分はタンパク質の翻 訳領域で、白抜きのボックスはェクソン 27にある 3 ' UTRである。 iNOSの mRNAは 遺伝子の図中上側に示す。
[0081] (7) iNOSアンチセンス転写物の過剰発現による mRNAの安定化
実施例 12
ラット肝細胞において、 iNOS遺伝子のアンチセンス転写物を過剰発現させると、 i N〇Sの 3 ' UTRを介して mRNAが安定化されることを確認した。
ふつうのレポーターの場合、 iNOS遺伝子のプロモーターにルシフェラーゼ遺伝子 を結合する。 iNOS遺伝子のプロモーターは「誘導型プロモーター」であるため、ラッ ト肝細胞においては IL-1 β刺激により、プロモーター活性が大きく変化してしまレ、、レ ポーター遺伝子の後に結合した 3 ' UTRの働きがよく観察できない。そこで、刺激に かかわらず、一定量の発現を促す「構成的プロモーター」である、 elongation factor- 1 a (EF)遺伝子のプロモーターを用いることにした。従って、 EFプロモーターでコント ロールされるルシフェラーゼ遺伝子や i3ガラクトシダーゼ遺伝子は、刺激にかかわら ず、ほぼ一定量で発現する。これにより、ポリ（A)シグナル配列を含む iNOSmRNA の 3 ' UTR力 ルシフェラーゼ mRNAの安定性に与える影響のみを観察することが できる。
[0082] 以下の 3種のベクターを、 pGL3-Basicプラスミド（プロメガ社)をもとに構築した。構 築したベクターの模式図を図 13に示す。
(i)レポーター（ルシフェラーゼベクター）：
EFプロモーター +ルシフェラーゼ遺伝子（Luc) + iNOS 3 ' UTR EFプロモータ" ~ " hルシフェラーゼ遺伝子（Luc) + SVpA
(ルシフェラーゼ mRNAが構成的に発現する力 ルシフェラーゼ遺伝子の後の部 分で mRNAの安定性を制御されうる）
(ii) iNOSアンチセンス転写物発現ベクター：
CMVプロモーター + iNOS 3 ' UTRを逆方向に揷入 + SVpA
(iNOSアンチセンス転写物力 細胞内で過剰に発現する）
(iii)内部標準（ j3ガラクトシダーゼベクター）： EFプロモーター + j3ガラクトシダーゼ（lacZ)遺伝子 + SVpA
( βガラクトシダーゼ mRNAが構成的に発現する）
なお、 SVpAとは、 SV40ウィルス由来のポリ（A)シグナルの配列で、安定な 3，UTR として知られており、 SVpAの付加された mRNAは壊れにくい。 iNOS 3 ' UTRの対 照である。 CMVプロモーターとは、サイトメガロウィルス由来で、 EFプロモーターより はるかに強レ、構成的プロモーターである。
[0083] (i)と（iii)のプラスミドを同時にラット肝細胞に導入したとき、ルシフェラーゼ mRNA( Luc)と βガラクトシダーゼ mRNA ( j3 Gal)の合成量は、 EFプロモーターが構成的 であることから、ほぼ一定である。さらに iNOSアンチセンス転写物発現ベクター（ii) を加えた時と加えない時で差があれば、 Luc mRNA/ β Gal mRNA (Luc/ β Ga 1値）にも差があるはずである。もし Luc/ β Gal値力 iNOSアンチセンス転写物発現 ベクターの有無により変化するならば、 iNOSアンチセンス転写物の過剰発現力 iN OS 3' UTRを介してルシフェラーゼ mRNAの安定性に影響を与えたことになる。
[0084] [方法]
(I)トランスフエクシヨン
初代培養ラット肝細胞に、前述の方法 (MATra)により以下のプラスミドを導入した。
(i)レポーター（400 ng/ウエノレ）、
土（ii) iNOSアンチセンス転写物発現ベクター（50 ng/ゥエル）、
(iii)内部標準 (400 ng/ゥエル)。
iNOSアンチセンス転写物発現ベクターを入れたものは AS ( + )、入れないものは AS (—）とした。
[0085] (II) RNAの調製
トランスフエクシヨンして、ー晚経った肝細胞の培地を交換した後、経時的に全 RN Aを抽出した。常法に従い Trizol試薬 (インビトロジェン社)を用いて行なった。得られ た全 RNAは、 DNaseを含む TURBO DNA- free Kit (アプライドバイオシステムズ社）で 処理し、混入するゲノム DNAを除去した。この全 RNAを铸型として、オリゴ（dT)プラ イマ一を用いて逆転写を行なレ、、 mRNAに対する cDNAを合成した。
[0086] (III)リアルタイム PCRによる mRNAの定量 合成した cDNAを用いて、リアルタイム PCRによって定量を行なった。 日本バイオラ ド社の iCyclerシステムを用いた。 PCR反応液に SYBR Green I (ロシュ ·ダイァグノステ イクス社）及び anti-Taq high ( =抗Taqポリメラーゼ抗体。東洋紡）を添加して、公知の 方法であるタツチダウン法で PCRを行なった。実際の PCRプロトコールは次の通りで ある。
1サイクノレ （94°C, 1 min),
50サイクル (94°C, 30 sec; (72 - 0.3 X n)°C, 1 min; 72°C, 30 sec) (nはサイクル数) レポーターであるルシフェラーゼ（Luc)の mRNAの PCRに用いたプライマーは次 の 2種類である。
順方向：
5， - GCGAAGGTTGTGGATCTGGATAC - 3 ' (配列番号 32)
逆方向：
5' -GAGCCACCTGATAGCCTTTGTAC- 3' (配列番号 33)
内部標準である βガラクトシダーゼ（ β Gal)の mRNAの PCRに用いたプライマーは 次の 2種類である。
順方向：
5， -GTCACACTACGTCTGAACGTCGA- 3' (配列番号 34)
逆方向：
5，一 TGCAGAGGATGATGCTCGTGACG— 3' (配列番号 35)
リアルタイム PCRを行なった後、 iCyclerシステムの解析ソフトウェアを用いて、ルシ フェラーゼ mRNA (Luc)と βガラクトシダーゼ mRNA ( j3 Gal)の threshold cycle (Ct M直を求めた後、除して、 Luc/ /3 Gal値を求めた。
[結果]
iN〇Sアンチセンス転写物発現ベクターをカ卩えた場合と加えなレ、場合にっレ、て、 L uc/ β Gal値を経時的に示した。結果を図 14に示す。
(i)レポーター（EFプロモータ^ ~ " h Luc + iNOS 3，UTR)、
土（ii) iN〇Sアンチセンス転写物発現ベクター、 (iii)内部標準。
この場合、 iNOSアンチセンス転写物発現ベクターを加えたとき AS ( + )、加えないと き AS (—）に比べると、有意に Luc/ Gal値が増加した。図中、「**」は く 0.01 ver sus AS (-) Jを表わす。
すなわち、 iN〇Sアンチセンス転写物は iN〇S 3 ' UTRを介して、ルシフェラーゼ mR NAが安定化させた。
対照として、 SVpAを連結したレポーターを用いた結果を図 15に示す。
(i)レポーター（EFプロモータ^—— h Luc + SVpA)、
土（ii) iN〇Sアンチセンス転写物発現ベクター、
(iii)内部標準。
この場合、 iN〇Sアンチセンス転写物発現ベクターを加えると [AS ( + ) ]、カロえないと き [AS (―) ]に比べて、 Luc/ j3 Gal値は増加しなかった。すなわち、 SVpAでは m RNAの安定性に影響を与えなかった。
[0088] [意義]
以上の結果（iNOSアンチセンス転写物の過剰発現実験）より、 iNOSアンチセンス 転写物には、 iNOS 3 ' UTRに働きかけて mRNAを安定化させるという作用を有す ると考えられる。 S化センスオリゴヌクレオチドによる iNOSmRNAのノックダウン実験 の結果と併せると、 iNOSアンチセンス転写物が、 iNOS 3 ' UTRを介して、 iNOSm RNAを安定化させてレ、ることがレ、える。
従って、 iNOSアンチセンス転写物による iNOSmRNAを安定性の制御機構は、肝 臓などの炎症の際に重要な働きを果たしていることが強く示唆される。また、この機構 は NOが関与している多くの疾病の治療のターゲットになり得る。
産業上の利用可能性
[0089] 肝臓保護剤の投与により、 iNOSmRNAとアンチセンス転写物の誘導が抑制され た。以上の結果はアンチセンス転写物がインビボ（in vivo)においても iNOSmRNA 発現誘導の制御因子として関与していることを強く示唆する。従って、肝臓保護剤を 用いたアンチセンス転写物の発現抑制は、肝臓などの炎症時の iNOS誘導及び NO 産生を軽減し、肝障害の有効な治療方法となると考える。 図面の簡単な説明
[図 1]RT_PCR法によるラット肝細胞における mRNA量の測定結果を示す電気泳 動図である。
[図 2]リアルタイム PCR法によるラット肝細胞における mRNA量の測定結果を示すグ ラフである。
[図 3]マウス iNOSアンチセンス転写物により、 iNOSmRNAが分解されたことを示す 電気泳動図である。
[図 4]肝臓保護剤（IGF-I)を投与したラットの iNOSmRNA増加が抑制されたことを示 す鎖特異的 RT— PCRによる iNOSmRNAの検出結果を示す電気泳動図である。
[図 5]肝臓保護剤 (IGF-I)を投与したラットの iNOSアンチセンス転写物増加が抑制さ れたことを示す鎖特異的 RT— PCRによる iNOSアンチセンス転写物の検出結果（電 気泳動図）である。
[図 6]肝臓保護剤 (IGF-I)を投与したラットの iNOSアンチセンス転写物の増加をリア ルタイム PCRで定量した結果を示すグラフである。なお、図中、「*」は pく 0.05 vs. Gal N/LPSラット (n= 3-6ラット /グループ)を示す。
[図 7]肝臓保護剤（FR183998)を投与したラットの iNOSmRNA増加が抑制されたこと を示す鎖特異的 RT—PCRによる iNOSmRNAの検出結果を示す電気泳動図でで ある。
[図 8]肝臓保護剤（FR183998)を投与したラットの iNOSアンチセンス転写物増加が抑 制されたことを示す鎖特異的 RT—PCRによる iNOSアンチセンス転写物の検出結 果を示す電気泳動図である。
[図 9]肝臓保護剤（FR183998)を投与したラットの iNOSアンチセンス転写物の増加を リアルタイム PCRで定量した結果を示すグラフであるなお、図中、「*」は pく 0.05 vs. G alN/LPSラッ Kn= 3-6ラット /グループ)を示す。
[図 10]実施例 10における iNOSタンパク質及び培地中の一酸化窒素（NO)量の測 定結果を示す電気泳動図及びグラフである。
[図 11]実施例 11における RNA4種のノーザン法による解析結果を示すエックス線フ イルムオートラジオグラムである。左から、「無刺激ラット肝細胞の全 RNA」、 riL-1 激ラット肝細胞の全 RNA」、「IL-1 β刺激ラット肝細胞の Poly(A)+ RNA」、及び「IL_1 β 刺激ラット肝細胞の Poly(A)- RNA」の結果を示す。
[図 12]実施例 11における RACEの結果とリボヌクレアーゼプロテクションアツセィの 結果を示す図である。
園 13]実施例 12において構築したベクターの模式図である。
園 14]実施例 12において、 iNOSアンチセンス転写物発現ベクターをカ卩えた場合 (A S ( + ) )と加えなレ、場合 (AS (—））につレ、ての Luc/ β Gal値の経時的変化を示す グラフである。
[図 15]実施例 12において、対照として SVpAを連結したレポーターを用いた場合の Luc/ β Gal値の経時的変化を示すグラフである。

Claims

請求の範囲
[1] iNOS (誘導型一酸化窒素合成酵素) mRNAに相補的な配列を有する iNOSmR
NAアンチセンス RNA (iNOSmRNAアンチセンス転写物）に相補的な配列を有す るセンスオリゴヌクレオチド。
[2] 配列番号 1に示された核酸配列を含む前記 iNOSmRNAアンチセンス RNA (iN〇
SmRNAアンチセンス転写物）に相補的な配列を有する請求項 1に記載のセンスオリ ゴヌクレオチド。 る熱力学的に安定でないループ構造に対応する領域に相補的な配歹 1Jを有する請求 項 1または 2に記載のセンスオリゴヌクレオチド。
[4] 16塩基以上 335塩基以下の塩基長を有する請求項 1〜3のいずれかに記載のセ ンスオリゴヌクレオチド。
[5] 核酸分解酵素による分解に対して安定化された請求項:!〜 4のいずれかに記載の センスオリゴヌクレオチドおよびその誘導体。
[6] 安定化が LNA、 PNA、 ENA、モルホリノおよびその他の修飾法による請求項 5に 記載のセンスオリゴヌクレオチド。
[7] 請求項 1〜6のいずれかに記載のセンスオリゴヌクレオチドを含有し、 iNOSmRNA の分解を促進する N〇産生抑制活性を有する組成物。 相補的な配列を有するセンスオリゴヌクレオチドを導入することを特徴とする iNOS産 生量の抑制方法。
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