TWI419898B - 具有ｉＮＯＳ表現調控作用之正義寡核苷酸及含有該核苷酸之組成物 - Google Patents

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TWI419898B
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Mikio Nishizawa
Yasuo Kamiyama
Koji Wakame
Takehito Miura
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Amino Up Chemical Co Ltd
Univ Kansai Medical
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Description

具有iNOS表現調控作用之正義寡核苷酸及含有該核苷酸之組成物
本發明係以調控iNOS(誘導型一氧化氮合成酶；inducible nitric oxide synthase)之表現為目的，係有關具有與iNOS基因之mRNA為互補之鹼基序列之單股RNA(反義轉錄物(antisense transcript))之互補序列的正義寡核苷酸(senseoligonuclecotide)。
生體內之一氧化氮(NO)從巨噬細胞、血管內皮細胞、神經領域等各處產生，其作用為殺菌作用、血管鬆弛作用，亦作為神經情報傳達物質之作用。
在一氧化氮產生時存在者為一氧化氮合成酶(NOS；nitric acid synthase)，NOS係根據在體內動作之場所分為誘導型NOS(iNOS；inducible NOS)、神經型NOS(nNOS；neuronal NOS)及血管內皮型NOS(eNOS；endothelial NOS)3類，已知特別是經由iNOS產生NO之情況與其他NO合成系統之神經型NOS及血管內皮型NOS相較，其持續長時間之活性，產生更多量之NO(1μ M以上)。
iNOS主要係在巨噬細胞、血管內皮細胞、血管平滑肌細胞、消化道上皮細胞、支氣管上皮細胞、肝細胞、粒線體細胞等中，受到細胞毒素、感染或在炎症性病巢產生之IL－1β (介白素(Interleukin)－1β )、TNF－α (腫瘤壞死因子(Tumor Necrosis Factor)－α )、IFN－γ (干擾素(Interferon)－γ )等炎症性細胞激素(cytokine)攻擊而表現，而產生NO。過剩生成之NO則係作為生體感染防禦反應主要之炎症性媒介機能。
iNOS之表現係伴隨炎症反應或細菌、真菌、病毒、原蟲等多樣病原體之感染。已知例如經由革蘭氏陰性菌普遍構成成分之脂多醣(lipopolysaccharide)(LPS)或革蘭氏陽性菌細胞壁成分之脂壁酸(lipoteichoic acid，LTA)之刺激或藉由炎症性細胞激素間接產生誘導而誘導iNOS。最近明瞭即使各種病毒在生體內增殖，NO合成之亢進明顯，此時iNOS之誘導明瞭主要係由於IL－1β 、IFN－γ 等炎症性細胞激素之產生。
源自iNOS之NO顯示殺菌、抗病毒、抗寄生蟲、抗腫瘍作用，對維持生體系之生命而言非存在不可。惟’另一方面，若經由炎症反應等而iNOS活化，則產生過剩之NO，而其與活性氧反應產生之強烈過氧化亞硝酸(過氧亞硝酸、過氧化亞硝酸)會損傷DNA，引起突變或癌症等負作用。
經由種種要因，iNOS過剩表現，其產生之過剩NO會引起毒性休克或經某種細胞激素之治療引起之全身性血壓降低、血壓對應降低、自體免疫疾病、炎症、關節炎、風濕性關節炎、糖尿病、炎症性腸疾病、血管機能不全、病因性血管擴張、組織損傷、心臟血管系缺血、痛感過敏症、腦缺血、惡液質、癌等種種疾病。
因此，調控iNOS之表現對生體防禦或與NO過剩產生相關之疾病，例如癌症或炎症性疾病、因細菌感染等引起之內毒素休克等之治療．預防上非常重要。
以往已知有稱為RNAi(RNA干擾：RNA interference)之將以成為雙股RNA為標的之mRNA切斷而抑制轉錄之方法，揭示有一般RNAi為20鹼基對程度之鹼基長(專利文獻：特開2005－13224號公報)，篩選該雙股寡核苷酸(oligonucleotide)及其反義RNA(antisense RNA)之方法。又，揭示藉由使用小核酸分子，例如短干擾核酸(siNA)、短干擾RNA(siRNA)、雙股RNA(dsRNA)、微型RNA(miRNA)及短髮夾型RNA(shRNA)分子之RNA干擾(RNAi)，而可調節介白素(Interleukin)基因、介白素超家族(superfamily)基因、參予基因表現及/或活性介白素路徑之基因之表現及活性的有用化合物(專利文獻2：特開2005－524393號公報)。
細胞內若有反義RNA存在，則與其互補之mRNA雜交，阻礙自mRNA轉譯為蛋白質，而可阻礙基因之表現。只要係人為的將反義RNA導入細胞內，則可阻礙標靶基因之表現，因而現在作為解說基因機能之技術使用，亦研究應用於醫藥品。關於iNOS基因至今未確認有反義RNA存在。又，至今雖暗示從mRNA轉錄時，有賦予mRNA安定化之蛋白質存在(非專利文獻1：Eur.J.Pharmacol.500：255－266(2004)，惟其詳細情形尚不明白，關於iNOS表現之調控有許多不明之點。
[專利文獻1]特開2005－13224號公報[專利文獻2]特開2005－524393號公報
[非專利文獻1]Eur.J.Pharmacol.500：255－266(2004)
本發明係以調控iNOS表現為目的，提供與具有與iNOS基因之mRNA為互補鹼基序列的單股RNA(反義轉錄物(antisense transcript))為互補之序列的正義寡核苷酸。
本發明人等發現在細胞內，有與mRNA為互補序列之單股RNA(反義轉錄物(antisense transcript))存在，該等與以往之反義RNA不同，有賦予mRNA安定化之實例，於同日提出專利申請。
本發明人等另對於iNOS表現之調控進行深入研究，結果發現使用具有與上述單股RNA(反義轉錄物)為互補序列之正義寡核苷酸，與反義轉錄物進行雜交，而抑制該等作用並干擾mRNA之安定性，結果可抑制iNOS之表現，而抑制NO過剩產生之方法，因而完成本發明。
亦即，本發明係有關以下具有與iNOSmRNA反義RNA(iNOSmRNA反義轉錄物)為互補序列之正義寡核苷酸、具有抑制NO產生活性之組成物及抑制iNOS產生量之方法。
1.具有：與具有與iNOS(誘導型一氧化氮合成酶)mRNA為互補序列之iNOSmRNA反義RNA(iNOSmRNA反義轉錄物)為互補序列之正義寡核苷酸。
2.具有與包含序列編號1所示核酸序列之上述iNOSmRNA反義RNA(iNOSmRNA反義轉錄物)為互補之序列之上述1項記載之正義寡核苷酸。
3.具有與對應上述iNOSmRNA反義RNA(iNOSmRNA反義轉錄物)在熱力學為不安定之環(loop)構造對應之領域為互補之序列之上述1或2項記載之正義寡核苷酸。
4.具有16鹼基以上335鹼基以下之鹼基長之上述1至3項中任一項記載之正義寡核苷酸。
5.對核酸分解酵素分解為安定化之上述1至4項中任一項記載之正義寡核苷酸及其衍生體。
6.安定化係經由LNA、PNA、ENA、嗎福啉基及其他修飾法之上述5項記載之正義寡核苷酸。
7.含有上述1至6項中任一項記載之正義寡核苷酸，具有促進iNOSmRNA分解，抑制NO產生之活性之組成物。
8.以在細胞內導入具有與iNOSmRNA反義RNA(iNOSmRNA反義轉錄物)為互補之序列之正義寡核苷酸為特徵之抑制iNOS產生量之方法。
本發明之具有與iNOSmRNA為互補序列之反義轉錄物之互補序列之正義寡核苷酸及其硫代磷酸酯(phosphorothioate)型，亦即S化正義寡核苷酸，對於與NO過剩產生相關之疾病如炎症性疾病或因細菌感染引起之內毒素休克、癌症等為有效之醫藥組成物，亦即可作為醫藥或對於該等疾病有效之健康食品組成物，亦即健康食品使用。
 (實施本發明之最佳形態)
本發明係使用具有與賦予誘導型一氧化氮合成酶iNOS(inducible nitric oxide synthase)mRNA安定化之iNOSmRNA為互補序列之單股RNA(反義轉錄產物)為互補之序列之正義寡核苷酸，在細胞內與反義轉錄物進行雜交，抑制該等作用，干擾mRNA之安定性，其結果抑制iNOS表現，並抑制NO過剩產生。
具有與iNOSmRNA為互補序列之單股RNA係指含有序列編號1所示鹼基序列及相同或實質上相同之鹼基序列之核苷酸。實質上相同之核苷酸可由含有序列編號1或含有具有與其75%以上，較好90%以上，更好95%以上相同性之鹼基序列，使誘導型一氧化氮合成酶(iNOS)合成量增大之物質，可經由化學合成、公知之表現法及精製法或實施例記載之方法調製。
本發明中具有與iNOSmRNA之上述反義轉錄物為互補之序列之正義寡核苷酸(以下將稱為「本發明正義寡核苷酸」)為可與反義轉錄物雜交之寡核苷酸或其衍生物，經修飾成不會被核內之核酸分解酵素分解者即可。
正義寡核苷酸設計可使用Nucleic Acids Res.31,3406－3415(2003)及J.Mol.Biol.288,911－940(1999)揭示之程式「mfold」(參照http：//www.bioinfo.rpi.edu/zukerm/rna/ )，即可預測RNA之2次構造。正義寡核苷酸之候補序列係熱力學不安定之部分(例如莖．環(stem－loop)結構之莖部分以外之領域)，較好對於含有莖．環構造之環(loop)結構之部分設計正義寡核苷酸。
有關上述正義寡核苷酸之候補序列係選擇對於細胞不會引起序列非特異性反應，不含5’－CG－3’、5’－GGGG－3’及5’－GGGGG－3’等序列之序列，用老鼠基因組進行相同性檢索，確認無類似之序列存在，選擇較佳之序列(參照J.Neurochem.86,374－382(2003))。
正義寡核苷酸可列舉序列編號2至4所示之寡核苷酸等(以下表示之序列省略修飾)。
5’－GCCTCATACTTCCTCAGAGC－3’(序列編號36)5’－TAGCTGCATTGTGTACAGAT－3’(序列編號37)5’－GTGTATAATTCCTTGATGAA－3’(序列編號38)該等可經由化學合成、公知之表現法及精製法或實施例記載之方法調製。
本發明之正義寡核苷酸只要可修飾成為不被核內之核酸分解酵素分解即可，該修飾並無特別限制。正義寡核苷酸係在細胞內經由核酸外切酶(exonuclease)，從5’或3’末端依序將核苷酸切除從兩端分解，例如以從兩端將1個以上之磷酸結合P＝O置換為P＝S，修飾為對分解酵素安定之硫代磷酸酯(phosphorothioate)型較佳(以下，稱為「S化正義寡核苷酸(S化senseoligo)」)(參照J.Neurochem.86,374－382(2003))。惟，若將所有之磷酸結合S化，則會產生光學異構性，不利於雜交反應(hybridization)。
S化正義寡核苷酸(S化senseoligo)之具體例可列舉如5’－G＊ C＊ C＊ TCATACTTCCTCAG＊ A＊ G＊ C－3’ 5’－T＊ A＊ G＊ CTGCATTGTGTACA＊ G＊ A＊ T－3’ 5’－G＊ T＊ G＊ TATAATTCCTTGAT＊ G＊ A＊ A－3’(序列中，＊ 表示S化部分)等。
其他之修飾法可列舉PNA(肽核酸(peptide nucleic acids)、LNA(Locked Nucleic Acids)、ENA(2’－0,4’－C－Ethylene－bridge Nucleic Acids；席格瑪愛奇(Sigma－Aldrich)公司製造)、嗎褔啉(Morpholino)Oligo(Gene Tools公司製造，OR，USA)等。
本發明之正義寡核苷酸咸認係經由導入至確認有iNOSmRNA之反義轉錄物存在之細胞內，與反義轉錄物反應(雜交)，而減低細胞內反義轉錄物之有效量，因而經由投予正義寡核苷酸以減少本來基因產物(iNOS)之表現量，即可抑制一氧化氮之過剩產生。
(實施例)
以下，以實施例對本發明作具體之說明，惟，本發明並不只限於該等實施例。
(1)與iNOSmRNA為互補序列之反義轉錄物之序列及領域(鹼基長)之決定方法
實施例1：老鼠iNOS反義轉錄物
根據以下之方法對於老鼠iNOS之mRNA檢視由基因之反義股轉錄之「反義轉錄物」是否存在，並研究該「反義轉錄物」對正義基因產物產生之控制有何種關係。又，老鼠iNOS之mRNA之鹼基序列係根據DDBJ/EMBL/GenBank國際鹼基序列資料庫(http：//www.ddbj.nig.ac.jp/ 、http：//www.ebi.ac.uk/embl/ 、http：//www.ncbi.n1m.nih.gov/GenBank/ )得知。
引起細胞激素或急性期蛋白質等誘導表現之基因之mRNA3’非轉譯領域(3’UTR)存在有稱為AU－rich element(ARE,富含AU之元件)之序列，亦即5’－AUUUA－3’或5’－AUUUUA－3’之序列(參照Proc Natl Acad Sci USA 83：1670－1674(1986))。ARE亦存在於人類、老鼠及小鼠之iNOSmRNA之3’UTR，因而根據股特異性RT－PCR法研究是否存在有與含有該ARE之3’UTR(序列為互補)對應之反義轉錄物存在。本法係使用如寡dT引子，僅與mRNA雜交(股(strand)特異性)之引子進行逆轉錄，合成互補之DNA(cDNA)後進行PCR法將cDNA放大，而測定mRNA量之方法。
亦即，使用以下表示之iNOS基因之正義股(sense strand)之引子：5’－TGCCCCTCCCCCACATTCTCT－3’(序列編號2)在培養基中添加IL－1β，對誘導iNOSmRNA之老鼠初代培養肝細胞之總RNA進行RT－PCR，合成cDNA。
將從老鼠初代培養肝細胞調製之RNA(1μg)及2pmol之引子混合，於70℃加熱10分鐘後急冷至0℃，於其中加入ReverTra Ace反應緩衝劑(東洋紡公司製造)、dNTP(N＝A,C,G,T)(使最終濃度成為1mM)、20單位(units)RNase inhibitor(東洋紡公司製造)及200單位之ReverTra Ace逆轉錄酵素(東洋紡公司製造)使全量為25μL。於47℃保溫60分鐘進行逆轉錄後於70℃加溫15分鐘，使逆轉錄酵素失去活性。接著，加入5單位之Tth RNase H(東洋紡製造)，於37℃保溫20分鐘，使模板RNA分解。合成之cDNA進行乙醇沉澱回收，以20μL之TE緩衝液溶解。
在由此獲得之cDNA2μL中加入PCR反應緩衝液(日本基因(Nippongene)公司製造)、dNTP(N＝A,C,G,T；日本基因公司製造)(使最終濃度成為125μM)、下述2種引子、前置(Forward)引子40pmol、反置(Reverse)引子40pmol、1單位Gene Taq DNA聚合酶(日本基因公司製造)及anti－Taq high(＝抗Taq聚合酶抗體，東洋紡公司製造)#，使全量為40μL，再進行PCR。
前置：5’－ACCAGGAGGCGCCATCCCGCTGC－3’(序列編號3)反置：5’－CTTGATCAAACACTCATTTTATTAAA－3’(序列編號4)
PCR之溫度協定係根據公知之方法，亦即根據降階檢定(Step－Down)法(參照Nishizawa M,Nakajima T,Yasuda K,Kanzaki H,Sasaguri Y,Watanabe K,and Ito S.Close kinship of human 20a－hydroxysteroid dehydrogenase gene with three aldo－keto reductase genes.Gene Cells(2000)5,111－125)進行。進行PCR產物之瓊脂糖電泳之結果看到186鹼基對(bp)帶之增幅。
將該帶從凝膠切出、精製，決定其鹼基序列時確認係挾在上述引子序列之與老鼠iNOSmRNA之3’UTR序列互補之序列。亦即，經由使用iNOS基因之正股引子(sense primer)之股特異性RT－PCR法，證明反義轉錄物存在。
為了研究iNOS基因之反義轉錄物之全構造，根據RACE法(參照Frohman MA,Rapid amplification of complementary DNA ends for generation of full－length complementary DNAs：thermal RACE.Methods Enzymol.(1993)218：340－356)試行解析。RACE法為從既知之cDNA序列製作股特異性引子，進行逆轉錄，以決定5’側及3’側cDNA序列之方法。
[決定5’側cDNA之序列]在老鼠初代培養肝細胞中添加IL－1β，誘導iNOSmRNA，用Trizol試藥(Invitrogene公司)調製RNA。以該RNA作為模板,使用序列編號2之引子(iNOS之正股(亦稱為正義股)(sense)前置(forward)引子；5’－TGCCCCTCCCCCACATTCTCT－3’)，合成雙股cDNA。在該cDNA中連結CA匣式連接器(付有cDNA PCR Library Kit(宝生物(TaKaRaBio)(股)公司製造)後，使用序列編號3之引子(對於iNOSmRNA之3’UTR之正股(前置)引子)及CA引子(付有cDNA PCR Library Kit(宝生物(股)公司製造)，進行PCR。將反應液進行瓊脂糖電泳，其增幅為約250bp大小之帶。將該帶切出，在pGEM－T Easy載體(vector)(普洛麥格(Promega)公司製造)進行選殖，決定鹼基序列。
[決定3’側cDNA之序列]與上述相同，從用IL－1β誘導之老鼠初代培養肝細胞調製RNA。使用PolyATract mRNA Isolation System(普洛麥格公司製造)，將Poly A－ 區分之RNA精製，以該RNA為模板，使用附有錨定序列(anchor sequence)(劃底線部)之隨機引子(錨定隨機引子；5’－TTCCCTCCCGTTTTCTCTGCCACTAGAATTCTCGAGCGGCCGC NNNNNNN－3’(序列編號5))，合成雙股cDNA。連結該cDNA與CA匣式連接器後，使用序列編號4之引子(對iNOSmRNA之3’UTR為反置(reverse)之引子)及CA引子，進行PCR。將該反應液精製，作為模板，使用對iNOSmRNA之3’UTR為反置(reverse)之引子(5’－ATATTAGAGCAGCGGGATGGCGCCTC－3’(序列編號6))及錨定引子(相對於上述「錨定隨機引子」之錨定序列之引子；5’－ACTAGAATTCTCGAGCGGCCGC－3’(序列編號7))，進行2次PCR。將反應液進行瓊脂糖電泳，其增幅為約200至500bp大小之帶。將該帶切出，在pGEM－T Easy載體進行選殖，決定鹼基序列。
其結果推定反義轉錄物之全長大致為600鹼基以上。以下表示其序列(序列編號1；惟，以cDNA序列表示)。亦即，反義轉錄物為對應iNOSmRNA之3’UTR，轉錄開始點(5’側)為iNOSmRNA之聚A付加部位之互補股。
實施例2：人類iNOS反義轉錄物
根據以下之方法對於人類iNOS之mRNA，檢視其從基因之反義股轉錄之「反義轉錄物」是否存在。人類iNOS之mRNA之鹼基序列係根據DDBJ/EMBL/GenBank國際鹼基序列資料庫(http：//www.ddbj.nig.ac.jp/ 、http：//www.ebi.ac.uk/embl/ 、http：//www.ncbi.n1m.nih.gov/GenBank/ )得知。
從人類組織(胎盤、肝臟、胃黏膜)或細胞(未刺激之淋巴球)，根據常法，使用Trizol試藥(Invitrogene公司)，萃取總RNA。獲得之總RNA用含有DNase之TURBO DNA－free Kit(Applied Biosystems公司)處理，除去混入之基因組DNA。以該總RNA作為模板，使用以下表示之人類iNOS基因之正義股之引子：5’－CTGAGTGCACCACTTCAAGTGAC－3’(序列編號8)進行逆轉錄，合成cDNA。具體而言，於實施例1，除了使用從人類組織或細胞調製之總RNA(1μg)及上述序列編號8表示之引子(2pmol)替代從老鼠初代培養肝細胞調製之RNA 1μg及序列編號2表示之引子2pmol以外，以同樣之方法合成cDNA。
在由此獲得之cDNA2μL中加入PCR反應緩衝液(日本基因公司製造)、dNTP(N＝A,C,G,T；日本基因公司製造)(使最終濃度成為125μM)、下述2種引子、前置(Forward)引子40pmol、反置(Reverse)引子40pmol、1unit Gene Taq DNA聚合酶(日本基因公司製造)及anti－Taq high(＝抗Taq聚合酶抗體，東洋紡製造)#，使全量為40μL，再進行PCR。
前置：5’－CAGGAGGTGCTATCGCACCACT－3’(序列編號9)反置：5’－GCAATTCATGTAAATATCTCCATC－3’(序列編號10)
PCR之方法係以與實施例1相同之方法進行。PCR產物之瓊脂糖電泳之結果在使用源自人類胎盤之cDNA時，看到151鹼基對(bp)帶之增幅。其他之cDNA(肝臟、胃黏膜或未刺激之淋巴球)則未看到增幅。
在將該增幅帶從凝膠切出、精製，決定鹼序列時，確認挾在上述引子序列之序列係與人類iNOSmRNA之3’UTR序列互補之序列。亦即，經由使用iNOS基因之正股引子(sense primer)之股特異性RT－PCR法，證明iNOS反義轉錄物之存在。序列編號11表示人類iNOS反義轉錄物之序列。惟，只表示cDNA序列。
實施例3：老鼠iNOS反義轉錄物
根據以下之方法對於老鼠iNOS之mRNA，檢視從基因之反義股轉錄之「反義轉錄物」是否存在。老鼠iNOS之mRNA之鹼基序列係根據DDBJ/EMBL/GenBank國際鹼基序列資料庫(http：//www.ddbj.nig.ac.jp/ 、http：//www.ebi.ac.uk/embl/ 、http：//www.ncbi.n1m.nih.gov/GenBank/ )得知。
從RAW264細胞根據常法，使用Trizol試藥(Invitrogene公司)，萃取總RNA。獲得之總RNA用含有DNase之TURBO DNA－free Kit(Applied Biosystems公司)處理，除去混入之基因組DNA。以該總RNA作為模板，使用以下表示之老鼠iNOS基因之正股引子：5’－CCTTCTTCTCCACTCCCCAGCT－3’(序列編號12)進行逆轉錄，合成cDNA。具體而言，於實施例1，除了使用從RAW264細胞調製之總RNA(1μg)及上述序列編號12表示之引子(2pmol)替代從老鼠初代培養肝細胞調製之RNA1μg及序列編號2表示之引子2pmol以外，以同樣之方法合成cDNA。
在由此獲得之cDNA2μL中加入PCR反應緩衝液(日本基因公司製造)、dNTP(N＝A,C,G,T；日本基因公司製造)(使最終濃度成為125μM)、下述2種引子、前置(Forward)引子40pmol、反置(Reverse)引子40pmol、1unit Gene Taq DNA聚合酶(日本基因公司製造)及anti－Taq high(＝抗Taq聚合酶抗體，東洋紡製造)#，使全量為40μL，再進行PCR。
前置：5’－GACCACCAGGAGGCACCATGCCG－3’(序列編號13)反置：5’－ATACAGGAAAGGCCCAAGCCATC－3’(序列編號14)
PCR之方法係以與實施例1相同之方法進行。PCR產物經瓊脂糖電泳之結果看到127鹼基對(bp)帶之增幅。
將該經增幅之帶從凝膠切出、精製以決定鹼序列，確認挾在上述引子序列之序列係與老鼠iNOSmRNA之3’UTR序列互補之序列。亦即，經由使用iNOS基因之正股引子之股特異性RT－PCR法，證明老鼠iNOS反義轉錄物之存在。序列編號15表示老鼠iNOS反義轉錄物之序列。惟，只表示cDNA序列。
(2)經由與iNOSmRNA互補之反義轉錄物(以下簡稱為反義)iNOSmRNA之安定化
實施例4：經由老鼠iNOS反義轉錄物iNOSmRNA之安定化
為了明瞭老鼠反義是否使iNOSmRNA安定化，將具有與老鼠反義互補之序列，在具有與老鼠反義雜交之性質之iNOS之正義寡核苷酸(以下簡稱senseoligo)導入老鼠初代培養肝細胞中，檢視iNOSmRNA量。
正義寡核苷酸係經由將寡核苷酸中磷酸二酯結合之磷酸之1個氧原子置換為硫原子(S化)，防止細胞內經由核酸分解酵素引起之寡核苷酸之分解。根據IBA公司(Gottingen,Germany)之Magnet assisted transfection法，經由基因導入試藥套組(MATra－A Reagent)將S化正義寡核苷酸導入老鼠初代培養肝細胞中。
用公知之方法(J.Hepatol,40,616－623,2004)調製老鼠初代培養肝細胞，播種於6洞盤中(每洞3×105 細胞)。2小時後每洞以1.5mL之新培養基(於Williams’ E培養基(WE)中含有10%牛胎兒血清、10nM德薩美他松(dexamethasone)及10nM胰島素之培養基。簡稱為WES－DI)進行交換。再於4小時後將oligo(2μg)及WE(200μL)混合，接著將2μL之MATra－A Reagent(IBA公司)混合，於室溫靜置20分鐘後，在放入肝細胞之洞中滴下全量。將6洞盤載於磁石盤(IBA公司)上，於室溫靜置15分鐘，將寡核苷酸導入細胞中。與含有10%牛胎兒血清之WE(每洞1.5mL)交換後，於37℃靜置一晚。隔日早晨用含有1nM IL－1β之WE進行培養基交換，於37℃放置4小時後調製總RNA。
肝細胞若用IL－1β刺激，則iNOSmRNA之量顯著增加，導入上述之S化正義寡核苷酸，用IL－1β刺激，並以RT－PCR法及即時PCR法測定mRNA量。其結果表示於第1圖及第2圖。
此處使用之iNOS基因之正義股序列，亦即具有與iNOSmRNA相同序列之S化寡核苷酸係以下述序列表示。實驗係相當於S2、S4及S5。
S2：5’－G＊ C＊ C＊ TCATACTTCCTCAG＊ A＊ G＊ C－3’ S4：5’－T＊ A＊ G＊ CTGCATTGTGTACA＊ G＊ A＊ T－3’ S5：5’－G＊ T＊ G＊ TATAATTCCTTGAT＊ G＊ A＊ A－3’(S化部分以＊ 表示)
另一方面，陰性對照係鹼基組成相同但是序列不同，因而導入iNOSmRNA、其轉錄物或具有確認不與其他RNA雜交之序列的「錯義(scramble)寡核苷酸」。錯義寡核苷酸之序列表示於下。
Scr2：5’－G＊ G＊ T＊ ATTGCCCACCCAAC＊ T＊ C＊ T－3’ Scr4：5’－G＊ G＊ C＊ TCCATATGATTAGA＊ T＊ G＊ T－3’ Scr5：5’－G＊ A＊ T＊ TGTTACTTAGAGAC＊ T＊ A＊ T－3’
該等錯義寡核苷酸與正義寡核苷酸相同，為了防止在細胞內之分解進行S化後使用。對於「錯義寡核苷酸」進行與老鼠基因組之相同性檢索，確認無類似之序列存在。
另一陰性對照係對於iNOSmRNA之莖－環構造之莖部分導入S化正義寡核苷酸S1。S1序列表示於下。
S1：5’－C＊ A＊ T＊ TCTCTTTCCTTTGC＊ C＊ T＊ C－3’(＊ 與上述者同意義)
使用與正股(具有與mRNA相同序列之股)相同序列之引子，進行股特異性RT－PCR法，則由於僅對「反義轉錄物」之cDNA逆轉錄，所以可測定「反義轉錄物」之量。又，設置不進行逆轉錄而進行PCR之對照，混入肝細胞總RNA之基因組確認經由PCR未增幅。於圖中以RT(－)表示。
該結果在導入S2、S4及S5之S化正義寡核苷酸時，iNOSmRNA之量減少。表示S化正義寡核苷酸與iNOS之反義轉錄物雜交，由於反義轉錄物被分解，顯示iNOSmRNA亦被分解。另一方面，導入錯義寡核苷酸時，iNOSmRNA之量無大變動。又，對於莖部分導入S1時，iNOSmRNA之量亦無大變動。
將正義寡核苷酸S5或錯義寡核苷酸Scr5導入肝細胞時，將添加IL－1β後之iNOSmRNA量、以逆轉錄之cDNA為模板，以即時PCR法測定。其結果若導入錯義寡核苷酸Scr5，則iNOSmRNA量成為2倍量所需之時間為119分鐘。相對於此，導入正義寡核苷酸S5時為461分鐘(第2圖)。
與iNOS相同，於iNOS以外之初期反應基因Cytokine－Induced Neutrophil Chemoattractant 1；CINC－1在肝細胞用IL－1β刺激下引起顯著之mRNA誘導。因此，在CINC－1之mRNA之3’非轉譯領域(3’UTR)與iNOSmRNA相同，存在有ARE序列。將iNOS之正義寡核苷酸導入肝細胞時，測定CINC－1之mRNA量，與未放入正義寡核苷酸之情況，其mRNA量無差異。亦即，表示iNOS之正義寡核苷酸之作用不只限定於iNOS(第1圖)。
合併以上之結果，iNOS之正義寡核苷酸係與iNOS反義轉錄物進行特異性雜交，促進iNOSmRNA之分解，其結果顯示iNOSmRNA之量特異性地減少。
實施例5：經由小鼠iNOS反義轉錄物引起之iNOSmRNA之安定化
在具有與小鼠反義雜交性質之iNOS正義寡核苷酸的S化正義寡核苷酸導入至源自小鼠巨噬細胞之RAW264細胞中，檢視經由小鼠反義轉錄物對iNOSmRNA表現之抑制。
以下未記載之操作根據與實施例4相同之方法進行。在每洞播種小鼠RAW264細胞5×105 細胞，以DMEM培養基進行交換，用CO2 恒溫器培養。
根據IBA公司(Gottingen,Germany)之Magnet assisted transfection法，將S化之正義寡核苷酸導入至RAW264細胞。與含有10%牛胎兒血清之DMEM培養基(每洞1.5mL)交換後，於37℃放置一晚。隔日早晨用含有大腸菌LPS(1μg/mL)之DMEM培養基交換，於37℃放置4小時後萃取總RNA，供RT－PCR。又，總RNA係以含有DNase之TURBO DNA－free kit(Applied Biosystems公司)處理，除去混入之基因組DNA。
正義寡核苷酸係相對於對應於小鼠反義轉錄物之小鼠iNOSmRNA而製作。
此處使用之小鼠iNOS基因之正義股序列，亦即具有與iNOSmRNA相同序列之S化寡核苷酸係以序列表示。實驗係相當於S1、S2及S3。
S1：5’－G＊ A＊ A＊ GCACTTTGGGTGAC＊ C＊ A＊ C－3’ S2：5’－T＊ A＊ G＊ CTGCACTATGTACA＊ G＊ A＊ T－3’ S3：5’－C＊ A＊ G＊ ATATTTATACTTCA＊ T＊ A＊ T－3’(S化部分以＊ 表示)
根據實施例4進行之股特異性RT－PCR法測定小鼠iNOSmRNA之量該結果小鼠iNOSmRNA之量減少。此乃表示S化正義寡核苷酸與iNOS之反義轉錄物進行雜交，由於反義轉錄物分解或競爭，iNOSmRNA亦分解(第3圖)。
以下，以實施例對本發明作具體之說明，惟，本發明並不只限於該等實施例。
(1)與iNOSmRNA為互補序列之反義轉錄物之序列及領域(鹼基長)之決定方法
實施例1：老鼠iNOS反義轉錄物
根據以下之方法對於老鼠iNOS之mRNA檢視由基因之反義股轉錄之「反義轉錄物」是否存在，並檢視該「反義轉錄物」對於正義基因產物產生之控制有何種關係。又，老鼠iNOS之mRNA之鹼基序列係根據DDBJ/EMBL/GenBank國際鹼基序列資料庫(http：//www.ddbi.nig.ac.jp/、http：//www.ebi.ac.uk/embl/ 、http：//www.ncbi.n1m.nih.gov/GenBank/ )得知。
引起細胞激素或急性期蛋白質等誘導表現之基因之mRNA之3’非轉譯領域(3’UTR)存在有稱為AU－rich element(富含AU之元件，ARE)之序列，亦即5’－AUUUA－3’或5’－AUUUUA－3’之序列(參照Proc Natl Acad Sci USA 83：1670－1674(1986))。ARE亦存在於人類、老鼠及小鼠之iNOSmRNA之3’UTR，因而根據股特異性RT－PCR法研究是否存在有與含有該ARE之3’UTR(序列為互補)對應之反義轉錄物。本法係使用如寡dT引子，僅與mRNA雜交(股(strand)特異性)之引子進行逆轉錄，合成互補之DNA(cDNA)後進行PCR法將cDNA放大，而測定mRNA量之方法。
亦即，使用以下表示之iNOS基因之正義股(sense strand)之引子：5’－TGCCCCTCCCCCACATTCTCT－3’(序列編號2)在培養基中添加IL－1β ，對誘導iNOSmRNA之老鼠初代培養肝細胞之總RNA進行RT－PCR，合成cDNA。
將從老鼠初代培養肝細胞調製之RNA(1μg)及2pmol之引子混合，於70℃加熱10分鐘後急冷至0℃，於其中加入ReverTra Ace反應緩衝液(東洋紡公司製造)、dNTP(N＝A,C,G,T)(使最終濃度成為1mM)、20單位(units)之RNase inhibitor(東洋紡公司製造)及200單位之ReverTra Ace逆轉錄酶(東洋紡公司製造)使全量為25μ L。於47℃保溫60分鐘進行逆轉錄後於70℃加溫15分鐘，使逆轉錄酶失去活性。接著，加入5單位之Tth RNase H(東洋紡製造)，於37℃加溫20分鐘，使模板RNA分解。合成之cDNA進行乙醇沉澱回收，並以20μ L之TE緩衝液溶解之。
在由此獲得之cDNA2μ L中加入PCR反應緩衝液(日本基因(Nippongene)公司製造)、dNTP(N＝A,C,G,T；日本基因公司製造)(使最終濃度成為125μ M)、下述2種引子、前置(Forward)引子40pmol、反置(Reverse)引子40pmol、1單位Gene Taq DNA聚合酶(日本基因公司製造)及anti－Taq high(＝抗Taq聚合酶抗體，東洋紡公司製造)#，使全量為40μL，再進行PCR。
前置：5’－ACCAGGAGGCGCCATCCCGCTGC－3’(序列編號3)反置：5’－CTTGATCAAACACTCATTTTATTAAA－3’(序列編號4)
PCR之溫度協定係根據公知之方法，亦即根據降階檢定(Step－Down)法(參照Nishizawa M,Nakajima T,Yasuda K,Kanzaki H,Sasaguri Y,Watanabe K,and Ito S.Close kinship of human 20a－hydroxysteroid dehydrogenase gene with three aldo－keto reductase genes.Gene Cells(2000)5,111－125)進行。進行PCR產物之瓊脂糖電泳之結果看到186鹼基對(bp)帶之增幅。
將該帶從凝膠切出、精製，決定其鹼基序列時確認挾在上述引子序列之序列係與老鼠iNOSmRNA之3’UTR序列互補之序列。亦即，經由使用iNOS基因之正股引子(sense primer，亦稱為正義股引子)之股特異性RT－PCR法，證明反義轉錄物存在。
為了研究iNOS基因之反義轉錄物之全構造，根據RACE法(參照Frohman MA,Rapid amplification of complementary DNA ends for generation of full－length complementary DNAs：thermal RACE.Methods Enzymol.(1993)218：340－356)試行解析。RACE法為從既知之cDNA序列製作股特異性引子，進行逆轉錄，以決定5’側及3’側cDNA序列之方法。
[決定5’側cDNA之序列]在老鼠初代培養肝細胞中添加IL－1β，誘導iNOSmRNA，用Trizol試藥(Invitrogen公司)調製RNA。以該RNA作為模板，使用序列編號2之引子(iNOS之正股(sense)(前置(forward))引子；5’－TGCCCCTCCCCCACATTCTCT－3’)，合成雙股cDNA。在該cDNA中連結CA匣式連接器(附有cDNA PCR Library Kit(寶生物(TaKaRaBio)(股)公司製造)後，使用序列編號3之引子(對iNOSmRNA之3’UTR之正股(前置)引子)及CA引子(附有cDNA PCR Library Kit(寶生物(股)公司製造)，進行PCR。將反應液進行瓊脂糖電泳，其增幅為約250bp大小之帶。將該帶切出，在pGEM－T Easy載體(vector)(普洛麥格(Promega)公司製造)進行選殖，決定鹼基序列。
[決定3’側cDNA之序列]與上述相同，從用IL－1β誘導之老鼠初代培養肝細胞調製RNA。使用PolyATract mRNA Isolation System(普洛麥格公司)，將Poly A－ 區分之RNA精製，以該RNA作為模板，使用附有錨定序列(anchor sequence)(底線部)之隨機引子(錨定隨機引子；5’－TTCCCTCCCGTTTTCTCTGCCACTAGAATTCTCGAGCGGCCGC NNNNNNN－3’(序列編號5))，合成雙股cDNA。連結該cDNA與CA匣式連接器後，使用序列編號4之引子(對iNOSmRNA之3’UTR為反義(反置)之引子)及CA引子，進行PCR。將該反應液精製，作為模板，使用iNOSmRNA之3’UTR之反義(反置)引子(5’－ATATTAGAGCAGCGGGATGGCGCCTC－3’(序列編號6))及錨定引子(相對於上述「錨定隨機引子」之錨定序列之引子；5’－ACTAGAATTCTCGAGCGGCCGC－3’(序列編號7))，進行2次PCR。將反應液進行瓊脂糖電泳，其增幅約為200至500bp大小之帶。將該帶切出，在pGEM－T Easy載體進行選殖，決定鹼基序列。
其結果推定反義轉錄物之全長大致為600鹼基以上。以下表示其序列(序列編號1；惟，以cDNA序列表示)。亦即，反義轉錄物為對應iNOSmRNA之3’UTR，轉錄開始點(5’側)為iNOSmRNA之聚A付加部位之互補股。
實施例2：人類iNOS反義轉錄物
根據以下之方法對於人類iNOS之mRNA，檢視其從基因之反義股轉錄之「反義轉錄物」是否存在。人類iNOS之mRNA之鹼基序列係根據DDBJ/EMBL/GenBank國際鹼基序列資料庫(http：//www.ddbj.nig.ac.jp/ 、http：//www.ebi.ac.uk/embl/ 、http：//www.ncbi.n1m.nih.gov/GenBank/ )得知。
從人類組織(胎盤、肝臟、胃黏膜)或細胞(未刺激之淋巴球)，根據常法，使用Trizol試藥(Invitrogene公司)，萃取總RNA。獲得之總RNA用含有DNase之TURBO DNA－free Kit(Applied Biosystems公司)處理，除去混入之基因組DNA。以該總RNA為模板，使用以下所示之人類iNOS基因之正義股之引子：5’－CTGAGTGCACCACTTCAAGTGAC－3’(序列編號8)進行逆轉錄，合成cDNA。具體而言，於實施例1，除了使用從人類組織或細胞調製之總RNA(1μ g)及上述序列編號8表示之引子(2pmol)替代從老鼠初代培養肝細胞調製之RNA1μ g及序列編號2表示之引子2pmol以外，以同樣之方法合成cDNA。
在由此獲得之cDNA2μ L中加入PCR反應緩衝液(日本基因公司製造)、dNTP(N＝A,C,G,T；日本基因公司製造)(使最終濃度成為125μ M)、下述2種引子、前置(Forward)引子40pmol、反置(Reverse)引子40pmol、1unit Gene Taq DNA聚合酶(日本基因公司製造)及anti－Taq high(＝抗Taq聚合酶抗體，東洋紡製造)#，使全量為40μL，再進行PCR。
前置：5’－CAGGAGGTGCTATCGCACCACT－3’(序列編號9)反置：5’－GCAATTCATGTAAATATCTCCATC－3’(序列編號10)
PCR之方法係以與實施例1相同之方法進行。PCR產物之瓊脂糖電泳之結果，在使用源自人類胎盤之cDNA時看到151鹼基對(bp)帶之增幅。其他之cDNA(肝臟、胃黏膜或未刺激之淋巴球)則未看到增幅。
在將該增幅帶從凝膠切出、精製，決定鹼基序列時，確認挾在上述引子序列之序列係與人類iNOSmRNA之3’UTR序列互補之序列。亦即，經由使用iNOS基因之正股引子(sense primer)之股特異性RT－PCR法，證明iNOS反義轉錄物之存在。序列編號11表示人類iNOS反義轉錄物之序列。惟，只表示cDNA序列。
實施例3：老鼠iNOS反義轉錄物
根據以下之方法對於老鼠iNOS之mRNA，檢視從基因之反義股轉錄之「反義轉錄物」是否存在。老鼠iNOS之mRNA之鹼基序列係根據DDBJ/EMBL/GenBank國際鹼基序列資料庫(http：//www.ddbj.nig.ac.jp/ 、http：//www.ebi.ac.uk/embl/ 、http：//www.ncbi.n1m.nih.gov/GenBank/ )得知。
從RAW264細胞根據常法，使用Trizol試藥(Invitrogen公司)，萃取總RNA。獲得之總RNA用含有DNase之TURBO DNA－free Kit(Applied Biosystems公司)處理，除去混入之基因組DNA。以該總RNA為模板，使用以下表示之老鼠iNOS基因之正義股之引子：5’－CCTTCTTCTCCACTCCCCAGCT－3’(序列編號12)進行逆轉錄，合成cDNA。具體而言，於實施例1，除了使用從RAW264細胞調製之總RNA(1μ g)及上述序列編號12表示之引子(2pmol)替代從老鼠初代培養肝細胞調製之RNA1μ g及序列編號2表示之引子2pmol以外，以同樣之方法合成cDNA。
在由此獲得之cDNA2μ L中加入PCR反應緩衝液(日本基因公司製造)、dNTP(N＝A,C,G,T；日本基因公司製造)(使最終濃度成為125μ M)、下述2種引子、前置(Forward)引子40pmol、反置(Reverse)引子40pmol、1unit Gene Taq DNA聚合酶(日本基因公司製造)及anti－Taq high(＝抗Taq聚合酶抗體，東洋紡製造)#，使全量為40μL，再進行PCR。
前置：5’－GACCACCAGGAGGCACCATGCCG－3’(序列編號13)反置：5’－ATACAGGAAAGGCCCAAGCCATC－3’(序列編號14)
PCR之方法係以與實施例1相同之方法進行。PCR產物經瓊脂糖電泳之結果看到127鹼基對(bp)帶之增幅。
在將該經增幅之帶從凝膠切出、精製，決定鹼基序列時，確認挾在上述引子序列之序列係與老鼠iNOSmRNA之3’UTR互補之序列。亦即，經由使用iNOS基因之正股引子之股特異性RT－PCR法，證明老鼠iNOS反義轉錄物之存在。序列編號15表示老鼠iNOS反義轉錄物之序列。惟，只表示cDNA序列。
(2)經由與iNOSmRNA互補之反義轉錄物(以下簡稱為反義)之iNOSmRNA之安定化
實施例4：經由老鼠iNOS反義轉錄物之iNOSmRNA之安定化
為了明瞭老鼠反義是否使iNOSmRNA安定化，將具有與老鼠反義互補之序列，且具有與老鼠反義雜交之性質之iNOS之正義寡核苷酸(以下簡稱senseoligo)導入老鼠初代培養肝細胞，檢視iNOSmRNA量。
正義寡核苷酸係由將寡核苷酸中磷酸二酯結合之磷酸之1個氧原子置換為硫原子(S化)，而防止細胞內經由核酸分解酵素引起之寡核苷酸之分解。根據IBA公司(Gottingen,Germany)之Magnet assisted transfection法，經由基因導入試藥套組(MATra－A Reagent)將S化正義寡核苷酸導入老鼠初代培養肝細胞中。
用公知之方法(J.Hepatol,40,616－623,2004)調製老鼠初代培養肝細胞，播種於6洞盤中(每洞3×105 細胞)。2小時後每洞以1.5mL之新培養基(於Williams’ E培養基(WE)中含有10%牛胎兒血清、10nM德薩美他松(dexamethasone)及10nM胰島素之培養基。簡稱為WES－DI)進行交換。再於4小時後將寡核苷酸(2μ g)及WE(200μ L)混合，接著將2μ L之MATra－A Reagent(IBA公司)混合，於室溫靜置20分鐘後，在放入肝細胞之洞中滴下全量。將6洞盤載於磁石盤(IBA公司)上，於室溫靜置15分鐘，將寡核苷酸導入細胞中。與含有10%牛胎兒血清之WE(每洞1.5mL)交換後，於37℃靜置一晚。隔日早晨用含有1nM IL－1β之WE進行培養基交換，於37℃放置4小時後調製總RNA。
肝細胞若用IL－1β刺激，則iNOSmRNA之量顯著增加，導入上述之S化正義寡核苷酸，用IL－1β刺激，並以RT－PCR法及即時PCR法測定mRNA量。其結果表示於第1圖及第2圖。
此處使用之iNOS基因之正義股序列，亦即具有與iNOSmRNA相同序列之S化寡核苷酸係以下述序列表示。實驗係相當於S2、S4及S5。
S2：5’－G＊ C＊ C＊ TCATACTTCCTCAG＊ A＊ G＊ C－3’ S4：5’－T＊ A＊ G＊ CTGCATTGTGTACA＊ G＊ A＊ T－3’ S5：5’－G＊ T＊ G＊ TATAATTCCTTGAT＊ G＊ A＊ A－3’(S化部分以＊ 表示)
另一方面，陰性對照係鹼基組成相同但是序列不同，因而係導入iNOSmRNA、其轉錄物或具有確認不與其他RNA雜交之序列的「錯義(scramble)寡核苷酸」。錯義寡核苷酸之序列表示於下。
Scr2：5’－G＊ G＊ T＊ ATTGCCCACCCAAC＊ T＊ C＊ T－3’ Scr4：5’－G＊ G＊ C＊ TCCATATGATTAGA＊ T＊ G＊ T－3’ Scr5：5’－G＊ A＊ T＊ TGTTACTTAGAGAC＊ T＊ A＊ T－3’
該等錯義寡核苷酸與正義寡核苷酸相同，為了防止在細胞內分解，因而進行S化後使用。對於「錯義寡核苷酸」進行與老鼠基因組之相同性檢索，確認無類似序列存在。
另一陰性對照，係對於iNOSmRNA之莖－環構造之莖部分導入S化正義寡核苷酸S1。S1序列表示於下。
S1：5’－C＊ A＊ T＊ TCTCTTTCCTTTGC＊ C＊ T＊ C－3’(＊ 與上述者同意義)
使用與正義股(具有與mRNA相同序列之股)相同序列之引子，進行股特異性RT－PCR法，則由於僅對「反義轉錄物」之cDNA進行逆轉錄，所以可測定「反義轉錄物」之量。又，設置不進行逆轉錄而進行PCR之對照，混入於肝細胞總RNA之基因組，確認經由PCR未增幅。於圖中以RT(－)表示。
其結果在導入S2、S4及S5之S化正義寡核苷酸時，iNOSmRNA之量減少。表示S化正義寡核苷酸與iNOS之反義轉錄物雜交，由於反義轉錄物被分解，顯示iNOSmRNA亦被分解。另一方面，導入錯義寡核苷酸時，iNOSmRNA之量無大變動。又，對於莖部分導入S1時，iNOSmRNA之量亦無大變動。
將正義寡核苷酸S5或錯義寡核苷酸Scr5導入肝細胞時，添加IL－1β後之iNOSmRNA量，以逆轉錄之cDNA為模板，以即時PCR法測定。其結果若導入錯義寡核苷酸Scr5，則iNOSmRNA量成為2倍量所需之時間為119分鐘。相對於此，導入正義寡核苷酸S5時為461分鐘(第2圖)。
與iNOS相同，iNOS以外之初期應答基因Cytokine－Induced Neutrophil Chemoattractant 1；CINC－1在肝細胞中用IL－1β刺激下引起顯著之mRNA誘導。因此，CINC－1之mRNA之3’非轉譯領域(3’UTR)與iNOSmRNA相同，存在有ARE序列。將iNOS之正義寡核苷酸導入肝細胞時，測定CINC－1之mRNA量，與未放入正義寡核苷酸之情況，其mRNA量無差異。亦即，表示iNOS之正義寡核苷酸之作用係限定於iNOS(第1圖)。
合併以上之結果，iNOS之正義寡核苷酸係與iNOS反義轉錄物進行特異性雜交，促進iNOSmRNA之分解，其結果顯示iNOSmRNA之量係特異性地減少。
實施例5：經由小鼠iNOS反義轉錄物引起之iNOSmRNA之安定化
將具有與小鼠反義雜交之性質之iNOS正義寡核苷酸的S化正義寡核苷酸導入至源自小鼠巨噬細胞之RAW264細胞中，檢視經由小鼠反義轉錄物對iNOSmRNA表現之抑制。
以下未記載之操作係根據與實施例4相同之方法進行。在每洞播種小鼠RAW264細胞5×105 細胞，以DMEM培養基進行交換，用CO2 恒溫器培養。
根據IBA公司(Gottingen,Germany)之Magnet assisted transfection法，將S化之正義寡核苷酸導入至RAW264細胞。與含有10%牛胎兒血清之DMEM培養基(每洞1.5mL)交換後，於37℃放置一晚。隔日早晨用含有大腸菌LPS(1μ g/mL)之DMEM培養基交換，於37℃放置4小時後萃取總RNA，供RT－PCR。又，總RNA係以含有DNase之TURBO DNA－free kit(Applied Biosystems公司)處理，除去混入之基因組DNA。
正義寡核苷酸係相對於與小鼠反義轉錄物對應之小鼠iNOSmRNA而製作。
此處使用之小鼠iNOS基因之正義股序列，亦即具有與iNOSmRNA相同序列之S化寡核苷酸係以序列表示。實驗係相當於S1、S2及S3。
S1：5’－G＊ A＊ A＊ GCACTTTGGGTGAC＊ C＊ A＊ C－3’ S2：5’－T＊ A＊ G＊ CTGCACTATGTACA＊ G＊ A＊ T－3’ S3：5’－C＊ A＊ G＊ ATATTTATACTTCA＊ T＊ A＊ T－3’(S化部分以＊ 表示)
根據實施例4進行之股特異性RT－PCR法測定小鼠iNOSmRNA之量其結果小鼠iNOSmRNA之量減少。此乃表示S化正義寡核苷酸與iNOS之反義轉錄物進行雜交，由於反義轉錄物分解或競爭，iNOSmRNA亦分解(第3圖)。
[歸納實施例1至5]實施例4及5之結果表示，不僅是老鼠，於小鼠亦然，iNOS之正義寡核苷酸經由與iNOS反義轉錄物特異性雜交，促進iNOSmRNA分解，其結果iNOSmRNA之量特異性地減少。
如此，於老鼠肝細胞、小鼠肝細胞亦然，使用正義寡核苷酸，可抑制iNOSmRNA之表現。因此，使用正義寡核苷酸抑制iNOSmRNA之表現，可減輕肝臟等炎症時之iNOS誘導及一氧化氮之產生，為肝障礙之有效治療方法。
(3)決定與iNOS基因以外之初期應答基因之mRNA互補序列之反義轉錄物之序列及領域(鹼基長)之方法炎症時誘導而表現之基因(亦即「早期應答基因(early－response gene)」)不僅包含iNOS，亦包含細胞激素或趨化素(Chemokine)等生理活性物質之基因。該等早期應答基因具有使炎症增惡、改善等多種作用。調節早期應答基因之表現，最終可調節炎症。此處，除了iNOS基因之反義轉錄物以外，亦研究其他早期應答基因中，反義轉錄物是否表現。接著，對於在種間充分保存且含有複數ARE序列之3’UTR序列，預測反義轉錄物係表現。因此，對於該部分，設計逆轉錄用之正義寡核苷酸及PCR用之1對引子，與以老鼠之iNOS基因檢出反義轉錄物之實施例4同樣地進行股特異性RT－PCR法，研究在老鼠肝細胞中，反義轉錄物是否表現。
iNOS以外之早期應答基因中，對3’TUR中含有複數ARE序列者，以種間(人類、小鼠、老鼠)3’UTR序列非常類似之3個典型基因作為例子，進行研究。亦即，以下之3基因。
(a)Cytokine－Induced Neutrophil Chemoattractant 1CINC－1)：亦稱為趨化素(Chemokine)(C－X－C motif)Ligand 1(CXCL1)，係以IL－1β 刺激之老鼠肝細胞誘導之趨化素。(b)NF－κ B p50：為轉錄因子NF－κ B之亞單位之一，為與炎症有極深關聯之蛋白質。
(c)Iκ B－α ：為抑制NF－κ B活性之蛋白質。
人類、小鼠及老鼠之該等mRNA之鹼基序列係根據DDBJ/EMBL/GenBank國際鹼基序列資料庫(http：//www.ddbj.nig.ac.jp/ 、http：//www.ebi.ac.uk/embl/ 、http：//www.ncbi.n1m.nih.gov/GenBank/ )得知。
實施例6：老鼠CINC－1反義轉錄物
根據以下之方法，對老鼠CINC－1之mRNA，檢視從基因之反義股轉錄之「反義轉錄物」是否存在。以下，未特別記載之操作係以與實施例1相同之方法進行。
將初代培養老鼠肝細胞用IL－1β刺激後，根據常法，使用Trizol試藥(Invitrogene公司)萃取總RNA。獲得之總RNA用含有DNase之TURBO DNA－free Kit(Applied Biosystems公司)處理，除去混入之基因組DNA。以該總RNA為模板，使用以下所示之老鼠CINC－1基因之正義股之引子：5’－TGTCTGGTGAACGCTGGCTTCTGA－3’(序列編號16)進行逆轉錄，合成cDNA。
使用獲得之cDNA及以下所示之老鼠CINC－1基因正義股之2種引子：前置：5’－TGTGGATGCGTTTCATCGATGGT－3’(序列編號17)反置：5’－CTAGCACAGTGGTTGACACTTA－3’(序列編號18)根據與實施例1相同方法之降階檢定(Step－Down)法進行PCR。
PCR產物進行瓊脂糖電泳之結果，看到122鹼基對(bp)帶之增幅。將該增幅帶從凝膠切出、精製，決定鹼基序列，確認挾在上述引子序列之老鼠CINC－1mRNA之3’UTR序列。亦即，經由使用iNOS基因之正股引子(sense primer)之股特異性RT－PCR法，證明老鼠CINC－1基因之反義轉錄物存在。老鼠CINC－1基因之反義轉錄物之序列係示於序列編號19。惟，以cDNA序列表示。
實施例7：老鼠NF－κ B p50反義轉錄物
根據以下之方法，對於老鼠NF－κ B p50之mRNA，檢視從基因之反義股轉錄之「反義轉錄物」是否存在。以下，無特別記載之操作係以與實施例6相同之方法進行。
將初代培養老鼠肝細胞用IL－1β刺激，根據常法，使用Trizol試藥(Invitrogene公司)萃取總RNA。獲得之總RNA用含有DNase之TURBO DNA－free Kit(Applied Biosystems公司)處理，除去混入之基因組DNA。以該總RNA為模板，使用以下所示之老鼠NF－κ B p50基因之正義股之引子：5’－CTGTCATTAAGGTATCGCAGTCC－3’(序列編號20)進行逆轉錄，合成cDNA。
使用獲得之cDNA及以下所示之老鼠NF－κ B p50基因之正義股之2種引子：前置：5’－CATCTACAGTACAGTCATGCACTC－3’(序列編號21)反置：5’－GGGAAAATACTATTTTCAGCACTGAT－3’(序列編號22)根據與實施例1相同方法之降階檢定法進行PCR。
PCR產物進行瓊脂糖電泳之結果，看到192鹼基對(bp)帶之增幅。將該帶從凝膠切出、精製，決定鹼基序列時確認挾在上述引子序列之序列係老鼠NF－B p50mRNA之3’UTR序列。亦即，經由使用iNOS基因之正股引子之股特異性RT－PCR法，證明老鼠NF－κ B p50基因之反義轉錄物存在。老鼠NF－κ B p50基因之反義轉錄物之序列係示於序列編號23。惟，以cDNA序列表示。
實施例8：老鼠Iκ B－α 反義轉錄物
根據以下之方法，對於老鼠Iκ B－α 之mRNA，檢視從基因之反義股轉錄之「反義轉錄物」是否存在。以下，無特別記載之操作係以與實施例6相同之方法進行。
將初代培養老鼠肝細胞用IL－1β刺激，根據常法，使用Trizol試藥(Invitrogene公司)萃取總RNA。獲得之總RNA用含有DNase之TURBO DNA－free Kit(Applied Biosystems公司)處理，除去混入之基因組DNA。以該總RNA為模板，使用以下所示之老鼠Iκ B－α 基因之正義股之引子：5’－TCCAGAATCTGATAAAAGGACCAC－3’(序列編號24)進行逆轉錄，合成cDNA。
使用獲得之cDNA及以下所示之老鼠Iκ B－α 基因之正義股之2種引子：前置：5’－TGAACCGCCATAGACTGTAGCTG－3’(序列編號25)反置：5’－GCACATACCACTGAACACCTGGT－3’(序列編號26)根據與實施例1相同方法之降階檢定法進行PCR。
PCR產物進行瓊脂糖電泳之結果，看到102鹼基對(bp)帶之增幅。將該帶從凝膠切出、精製，決定鹼基序列時確認挾在上述引子序列之序列係老鼠Iκ B－α mRNA之3’UTR序列。亦即，經由使用iNOS基因之正股引子之股特異性RT－PCR法，證明老鼠Iκ B－α 基因之反義轉錄物存在。老鼠Iκ B－α 基因之反義轉錄物之序列係示於序列編號27。惟，以cDNA序列表示。
[歸納實施例6至8]炎症時表現之早期應答基因係選擇iNOS以外之代表性3個基因(CINC－1、NF－κ B p50、Iκ B－α )，任一者在3’UTR都含有複數ARE序列，且種間(人類、小鼠、老鼠)3’UTR序列非常類似。與iNOS相同，確認在該3個基因中反義轉錄物亦表現。
經由此，推測反義轉錄物含有ARE序列且為種間3’UTR序列非常類似之早期應答基因係共同見到的分子。又，強烈啟示反義轉錄物調節該等mRNA安定性之可能性。因此，在肝臟等之炎症中，經由抑制早期應答基因之反義轉錄物之作用，可期待抑制炎症。
(4)在使用老鼠急性肝不全模型之活體內(in vivo)，經由iNOS與反義轉錄物之表現誘導及肝臟保護劑(IGF－I及FR183998)，抑制iNOS及反義轉錄物之表現誘導之效果根據實施例1及實施例4之結果，在老鼠初代培養肝細胞(活體外)系中，在iNOS誘導時，對應iNOSmRNA之3’－非轉譯領域(3’UTR)之反義轉錄物表現，顯示促進iNOSmRNA之安定化。在肝障礙老鼠(活體內)亦呼應iNOS誘導，iNOS反義轉錄物之表現如下示。又，經由投予Insulin－like growth factor－1(IGF－I(似胰島素生長因子))或Na＋ /H＋ 交換(exchanger)抑制劑(FR183998)等肝臟保護劑，生存率之變化及與炎症性細胞激素、iNOSmRNA及反義轉錄物誘導之關係表示於下。
實施例9
(I)急性肝不全模型之製作及肝臟保護劑之投予對雄Sprague－Dawley老鼠(250至300g)靜脈注射D－半乳糖胺(D－galactosamine)(400g/kg)及細菌內毒素(endotoxin)之LPS(16μ g/kg)之混合液(D－GalN/LPS)，調製急性肝不全模型。將Insulin－like growth factor－1(IGF－I；3.2mg/kg)或Na＋ /H＋ 交換抑制劑(FR183998；1mg/kg)在D－GalN/LPS處理前30分鐘投予。測定血中及肝臟之炎症性細胞激素(TNF－α 、IL－1β、IL－6、干擾素γ ，CINC－1)、MIP－2及一氧化氮(NO)。從肝臟調製總RNA，用RT－PCR檢視iNOSmRNA及iNOS反義轉錄物。
(II)RNA之解析靜脈注射D－半乳糖胺及LPS混合液後，於3或6小時後取出老鼠之肝臟，根據常法，使用Trizol試藥(Invitrogene公司)，萃取總RNA。以該總RNA為模板，使用寡dT引子，進行逆轉錄，接著以與實施例1等相同之方法進行PCR(RT－PCR法)。有關iNOSmRNA或作為內部標準之elongation factor－1α (EF1)mRNA之定量，逆轉錄時使用寡dT引子，PCR時使用iNOSmRNA：CCAACCTGCAGGTCTTCGATG(序列編號28)及GTCGATGCACAACTGGGTGAAC(序列編號29)；及EFmRNA：TCTGGTTGGAATGGTGACAACATGC(序列編號30)及CCAGGAAGAGCTTCACTCAAAGCTT(序列編號31)又，於PCR反應液中添加anti－Taq high(＝抗Taq聚合酶抗體，東洋紡織公司製造)。
又，iNOS反義轉錄物之定量係根據實施例1之方法。又，以不進行逆轉錄而進行PCR者為對照，確認混入至肝細胞總RNA中之基因組經由PCR未增幅。INOSmRNA之檢測結果表示於第4圖，iNOS反義轉錄物之檢測結果表示於第5圖。圖中，RT(－)表示逆轉錄(－)之陰性對照。
(Ⅲ)根據即時PCR法之mRNA及反義轉錄物之定量進行逆轉錄而合成之cDNA係使用日本BioRad公司之iCycler System，根據即時PCR進行定量。在PCR反應液中添加SYBR Green I(Roche．Diagonstics Inc.製造)及anti－Taq high(＝抗Taq聚合酶抗體，東洋紡織公司製造)，用公知方法之降階檢定法進行PCR。實際之PCR操作手冊如下所述。
1循環(94℃，1分鐘)50循環(94℃，30秒鐘；(72－0.3×n)℃，1分鐘；72℃，30秒)；n為循環數。結果表示於第6圖。「＊ 」表示「p<0.05 vs.GalN/LPS老鼠(n＝3－6老鼠/群)」。
(Ⅳ)肝臟保護劑引起之iNOSmRNA及iNOS反義轉錄物量之變化在未投予肝臟保護劑時，靜脈注射D－GalN/LPS後，在約24小時所有動物幾乎全死亡(90%以上)。血中及肝臟中經時性(1至12小時)炎症性媒介物(TNF－α、IL－1β、IL－6、干擾素γ，CINC－1、MIP－2、NO)增加。顯示與肝臟之iNOSmRNA誘導呼應，而反義轉錄物增加(iNOSmRNA及iNOS反義轉錄物均於6小時後最大)，其結果確認NO過剩產生。
經由投予IGF－I，死亡率減少至20至30%以下。除了上述之炎症性細胞激素、NO產生外，亦同樣抑制iNOSmRNA及反義轉錄物誘導之增加(第4圖至第6圖)。
經由投予FR183998，死亡率減少至20至30%以下。除了上述之炎症性細胞激素、NO產生外，亦同樣地抑制iNOSmRNA及反義轉錄物誘導之增加(第7圖至第9圖)。
(Ⅳ－1)在老鼠急性肝不全模型中，肝臟保護劑IGF－I誘導iNOSmRNA及反義轉錄物表現之效果根據第4圖之結果，投予D－半乳糖胺及LPS之老鼠；GalN/LPS老鼠在3至6小時iNOSmRNA水平增加，投予IGF－I之老鼠則抑制其增加。
根據第5圖及第6圖之結果，由於在RT(－)幾乎未看到增幅之cDNA，咸認混入總RNA中之基因組係極微量。GalN/LPS老鼠在3至6小時反義轉錄物水平增加，投予IGF－I之老鼠則抑制其增加。
(Ⅳ－2)在老鼠急性肝不全模型中，肝臟保護劑FR183998誘導iNOSmRNA及反義轉錄物表現之效果根據第7圖之結果，GalN/LPS老鼠在3至6小時iNOSmRNA水平增加，投予FR183998之老鼠則抑制其增加。
根據第8圖及第9圖之結果，由於在RT(－)幾乎未看到增幅之cDNA，咸認混入總RNA中之基因組係極微量。GalN/LPS老鼠在3至6小時反義轉錄物水平增加，投予FR183998之老鼠則抑制其增加。
(5)正義寡核苷酸在老鼠肝細胞之效果(iNOS蛋白質及一氧化氮(NO)量之變化)
實施例10
以與實施例4相同之方法將實施例4獲得之正義寡核苷酸S5或錯義寡核苷酸Scr5導入肝細胞中，用一氧化氮比色分析組套(Nitric Oxide Colorimetric Assay kits)(羅氏．診斷公司製造)測定培養基中一氧化氮(NO)之量。惟，隔日早晨更換為含有1nM之IL－1β之WE，於37℃放置8至10小時後測定。又，從細胞萃取總蛋白質，以使用ECL組套(GE健康照護(health care)公司製造)之西方點墨分析(Western blotting)法檢測iNOS蛋白質。結果表示於第10圖。
其結果顯示在老鼠肝細胞中導入正義寡核苷酸S5，則iNOS蛋白質及培養基中一氧化氮(NO)之量減少。
(6)根據北方墨漬法檢測iNOS反義轉錄物
實施例11
對以IL－1β刺激之老鼠肝細胞，使用北方墨漬分析法(Northern blot analysis)(以下簡稱為北方墨漬法)確認iNOS基因之反義轉錄物存在(I)調製RNA將老鼠肝細胞以IL－1β刺激一定時間，使用Trizol試藥(Invitrogene公司)萃取總RNA。獲得之總RNA用含有DNase之TURBO DNA－free Kit(Applied Biosystems公司)處理，除去混入之基因組DNA。Poly(A)＋及Poly(A)－RNA係用PolyATract mRNA Isolation System(Promega公司製造)區分。為了防止非特異性之雜交，將核糖核蛋白體RNA(rRNA)在最終濃度為5%之聚乙二醇6000及最終濃度0.75M氯化鈉之存在下使沉澱並除去，將上清液經由乙醇沉澱回收，使用於電泳。
(II)北方墨漬法：電泳將4種上述之RNA，亦即無刺激老鼠肝細胞之總RNA、IL－1β刺激老鼠肝細胞之總RNA、IL－1β刺激老鼠肝細胞之Poly(A)＋RNA及IL－1β刺激老鼠肝細胞之Poly(A)－RNA以含有2.2M福馬林之瓊脂糖進行電泳而加以分離。
(Ⅲ)北方墨漬法：雜交根據常法，將凝膠中之RNA移至Nytran N過濾器(瓦德曼公司製造)。接著，在DIG EasyHyb緩衝液(羅氏診斷公司製造)中與經毛地黃素(digoxigenin,DIG)標識之iNOS之3’UTR正義探針(sense probe，亦稱為同義探針)於73℃進行雜交一晚。隔日早晨根據羅氏診斷公司之手冊將過濾器洗淨。又，iNOS之3’UTR正義探針係使用DIG－11－UTP(羅氏診斷公司製造)及T3 RNA聚合酶(史特拉達基因公司製造)，在試驗管內合成RNA而製作。
(Ⅳ)北方墨漬法：檢測根據羅氏診斷公司之手冊進行封鎖(blocking)，與和鹼性磷酸酶結合之抗DIG抗體(羅氏診斷公司製造)進行培養。洗淨後與作為基質之CDP－Star(Applied Biosystems公司製造)進行反應，以X線軟片檢測與iNOS正義探針進行雜交之RNA帶。
(V)結果及考察上述4種RNA以北方墨漬法解析之結果(X線軟片之自動顯影圖)表示於第11圖。
「IL－1β刺激老鼠肝細胞之總RNA」及「IL－1β刺激老鼠肝細胞之Poly(A)－RNA」觀察到600至1000核苷酸(nt)塗片(smear)狀之深色帶。由於使用iNOS之3’UTR之正義探針，因而該等塗片狀帶，咸認是iNOS之反義轉錄物之帶。而可明瞭iNOS反義轉錄物之長度並非一定，而係各種長度(600至1000核苷酸)轉錄物之集合。
若將RACE之結果及核糖核酸酶保護分析之結果合併，則如第12圖所示，咸認係合成iNOS之反義轉錄物。圖中，點線表示600核苷酸以上之各種大小之反義轉錄物。圖中之數字為iNOS基因之外顯子(exon)編號，黑色部分為蛋白質之轉譯領域，反白部分為外顯子27之3’UTR。iNOS之mRNA表示於基因之圖中之上方。
(7)經由iNOS反義轉錄物過剩表現而使mRNA安定化
實施例12
在老鼠肝細胞中，iNOS基因之反義轉錄物若過剩表現，則確認藉由iNOS之3’UTR而使mRNA安定化。
為一般報導子(reporter)時，蟲螢光素酶基因與iNOS基因之促進子(promoter，亦稱為啟動子)結合。由於iNOS基因之促進子為「誘導型促進子」，在老鼠肝細胞經由IL－1β刺激，促進子活性產生極大變化，於報導子後結合之3’UTR之作用不能充分觀察。因此，無關刺激，仍使用促進一定量表現之「構成促進子」之延長因子－1α (elongation factor－1α ；EF)基因之促進子。用EF促進子控制之蟲螢光素酶基因或β－半乳糖苷酶基因無關刺激，仍大致以一定量表現。經由此可觀察到含有聚(A)信號序列之iNOSmRNA之3’UTR只對於蟲螢光素酶mRNA之安定性有影響。
將以下之3種載體(vector)以pGL3－Basic質體(Promega公司製造)為基礎構築。經構築之載體模式圖示於第13圖。
(i)報導子(蟲螢光素酶載體)：EF促進子＋蟲螢光素酶基因(Luc)＋iNOS 3’UTR EF促進子＋蟲螢光素酶基因(Luc)＋SVpA(蟲螢光素酶mRNA雖以構成性地表現，但在蟲螢光素酶基因之後部分可控制mRNA之安定性)(ii)iNOS反義轉錄物表現載體：CMV促進子＋反置插入iNOS 3’UTR＋SVpA(iNOS反義轉錄物在細胞內過剩表現)(iii)內部標準(β半乳糖苷酶載體)：EF促進子＋β半乳糖苷酶(lacZ)基因＋SVpA(β半乳糖苷酶mRNA構成性地表現)又，SVpA已知為源自SV40病毒之聚(A)信號之序列，為安定之3’UTR，附加SVpA之mRNA不易崩壞。為iNOS3’UTR之對照。CMV促進子係源自巨細胞病毒(cytomegalovirus)，為遠比EF促進子更強構成之促進子。
將(i)及(iii)之質體同時導入老鼠肝細胞時，蟲螢光素酶mRNA(Luc)與β半乳糖苷酶mRNA(βGal)之合成量，由於EF促進子為構成性，大致為一定。另，在加入或未添加iNOS反義轉錄物表現載體(ii)時若有差異，則Luc mRNA/βGal mRNA(Luc/βGal值)應亦有差異。若Luc/βGal值係根據有無iNOS反義轉錄物表現載體而變化，則iNOS反義轉錄物之過剩表現係藉由iNOS 3’UTR而影響蟲螢光素酶mRNA之安定性。
[方法](I)轉染(transfection)對初代培養老鼠之肝細胞，根據上述之方法(MATra)導入以下之質體。
(i)報導子(400ng/洞)、±(ii)iNOS反義轉錄物表現載體(50ng/洞)、(iii)內部標準(400ng/洞)。
以放入iNOS反義轉錄物表現載體者為AS(＋)，未放入者為AS(－)。
(II)調製RNA進行轉染，將經過一晚之肝細胞培養基進行交換後經時地萃取總RNA。根據常法，使用Trizol試藥(Invitrogene公司)進行。獲得之總RNA以含有DNase之TURBO DNA－free Kit(Applied Biosystems公司)處理，除去混入之基因組DNA。以該總RNA為模板，使用寡(dT)引子進行逆轉錄，合成對應於mRNA之cDNA。
(Ⅲ)經由即時PCR定量mRNA使用合成之cDNA，經由即時PCR進行定量。使用日本Bio－Rad公司之iCycler系統。在PCR反應液中加入SYBR Green I(羅氏．診斷公司製造)及anti－Taq high(＝抗Taq聚合酶抗體。東洋紡公司製造)，以公知方法之遞減(touchdown)法進行PCR。實際之PCR操作手冊係如下述。
1循環(94℃，1分鐘)50循環(94℃，30秒鐘；(72－0.3×n)℃，1分鐘；72℃，30秒)(n為循環數)。
為報導子之蟲螢光素酶(Luc)mRNA之PCR所使用之引子為下述2種。
前置：5’－GCGAAGGTTGTGGATCTGGATAC－3’(序列編號32)反置：5’－GAGCCACCTGATAGCCTTTGTAC－3’(序列編號33)
為內部標準之β 半乳糖苷酶(β Gal)mRNA之PCR所使用之引子為下述2種。
前置：5’－GTCACACTACGTCTGAACGTCGA－3’(序列編號34)反置：5’－TGCAGAGGATGATGCTCGTGACG－3’(序列編號35)
進行即時PCR後使用iCycler系統之解析軟體，求得蟲螢光素酶mRNA(Luc)及β 半乳糖苷酶mRNA(β Gal)之循環數閥值(threshold cycle(Ct))值後相除，求得Luc/β Gal值。
[結果]對有關加入及未加入iNOS反義轉錄物表現載體之情況，經時地表示Luc/β Gal值。結果示於第14圖。
(i)報導子(EF促進子＋Luc＋iNOS 3’UTR)、±(ii)iNOS反義轉錄物表現載體、(iii)內部標準。
此種情況下，將加入iNOS反義轉錄物表現載體時之AS(＋)與未加入時之AS(－)相比，則Luc/β Gal值有意義地增加。圖中，「＊＊ 」表示「p<0.01 versus AS(－)」。
亦即，iNOS反義轉錄物係藉由iNOS 3’UTR使蟲螢光素酶mRNA安定化。
以使用連結SVpA之報導子之結果作為對照，示於第15圖。
(i)報導子(EF促進子＋Luc＋SVpA)、±(ii)iNOS反義轉錄物表現載體、(iii)內部標準。
此種情況下，將加入iNOS反義轉錄物表現載體之[AS(＋)]與未加入時之[AS(－)]相比，則Luc/β Gal值未增加。亦即，SVpA對於mRNA之安定性無影響。
[意義]根據以上之結果(iNOS反義轉錄物之過剩表現實驗)認為iNOS反義轉錄物對iNOS 3’UTR作用而具有使mRNA安定化之作用。若與經由S化正義寡核苷酸之iNOSmRNA基因降低(knockdown)實驗結果合併，則iNOS反義轉錄物藉由iNOS 3’UTR而將iNOSmRNA安定化。
因此，強烈顯示經由iNOS反義轉錄物控制iNOSmRNA安定性之機構，在肝臟等炎症時果然扮演重要的角色。又，該機構可為NO參予之多種疾病之治療指標。
(產業上利用之可能性)
經由投予肝臟保護劑而抑制iNOSmRNA及反義轉錄物之誘導。以上之結果強烈啟示反義轉錄物在活體內(in vivo)亦參予作為iNOSmRNA表現誘導之控制因子。因此，使用肝臟保護劑抑制反義轉錄物之表現，咸認為可減輕肝臟等炎症時之iNOS誘導及NO產生，為肝障礙之有效治療方法。
第1圖表示根據RT－PCR法測定老鼠肝細胞中mRNA量之結果之電泳圖。
第2圖表示根據即時PCR法測定老鼠肝細胞中mRNA量之結果之電泳圖。
第3圖表示藉由老鼠iNOS反義轉錄物而iNOSmRNA分解之電泳圖。
第4圖表示經由投予肝臟保護劑(IGF－I)之老鼠顯示抑制iNOSmRNA增加之股特異性RT－PCR檢測iNOSmRNA之結果之電泳圖。
第5圖表示以投予肝臟保護劑(IGF－I)之老鼠顯示抑制iNOS反義轉錄物增加之股特異性RT－PCR檢測iNOS反義轉錄物之結果(電泳圖)。
第6圖表示以即時PCR定量投予肝臟保護劑(IGF－I)之老鼠iNOS反義轉錄物增加之結果之圖表。又，圖中，「＊ 」表示p<0.05 vs.GalN/LPS老鼠(n＝3－6老鼠/群)。
第7圖表示經由投予肝臟保護劑(FR183998)之老鼠顯示抑制iNOSmRNA增加之股特異性RT－PCR檢測iNOSmRNA之結果之電泳圖。
第8圖表示經由在投予肝臟保護劑(FR183998)之老鼠抑制iNOS反義轉錄物增加之股特異性RT－PCR檢測iNOS反義轉錄物之結果之電泳圖。
第9圖表示以即時PCR定量投予肝臟保護劑(FR183998)之老鼠iNOS反義轉錄物增加之結果之圖。又，圖中，「＊ 」表示p<0.05 vs.GalN/LPS老鼠(n＝3－6老鼠/群)。
第10圖表示測定實施例10中iNOS蛋白質及培養基中一氧化氮(NO)量之結果之電泳圖及圖。
第11圖表示根據實施例11中RNA 4種之北方墨漬法解析結果之X線軟片自動顯影圖。從左起為「無刺激老鼠肝細胞之總RNA」、「IL－1 β刺激老鼠肝細胞之總RNA」、「IL－1 β刺激老鼠肝細胞之Poly(A)＋RNA」及「IL－1 β刺激老鼠肝細胞之Poly(A)－RNA」之結果。
第12圖表示於實施例11之RACE之結果及核糖核酸酶保護性分析法(ribonuclease protection assay)結果之圖。
第13圖係於實施例12構築之載體之模式圖。
第14圖表示在實施例12中，對於加入iNOS反義轉錄物表現載體之情況(AS(＋))及未加入之情況(AS(－))之Luc/β Gal值之經時變化圖。
第15圖表示在實施例12中，使用連結SVpA之報導子作為對照時，Luc/β Gal值之經時變化圖。
<110> 阿米諾渥普化學股份有限公司學校法人關西醫科大學
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無元件符號

Claims (7)

  1. 一種促進iNOSmRNA分解之正義寡核苷酸(senseoligo)，其係具有：與具有iNOS(誘導型一氧化氮合成酶)mRNA之互補序列的iNOSmRNA反義RNA(iNOSmRNA反義轉錄物)為互補之序列者。
  2. 如申請專利範圍第1項之正義寡核苷酸，其中，該正義寡核苷酸係具有與含有序列編號1所示核酸序列之上述iNOSmRNA反義RNA(iNOSmRNA反義轉錄物)為互補之序列者。
  3. 如申請專利範圍第1項或第2項之正義寡核苷酸，其中，具有與對應上述iNOSmRNA反義RNA(iNOSmRNA反義轉錄物)在熱力學不安定之環構造之領域為互補之序列者。
  4. 如申請專利範圍第1項或第2項之正義寡核苷酸，其中，具有16鹼基以上335鹼基以下之鹼基長者。
  5. 如申請專利範圍第1項或第2項之正義寡核苷酸及其衍生體，係使其對核酸分解酵素引起之分解安定化者。
  6. 如申請專利範圍第5項之正義寡核苷酸，其中，該安定化為經由LNA、PNA、ENA、嗎福啉基(morpholino)及其他修飾法者。
  7. 一種組成物，其含有如申請專利範圍第1項至第6項中任何一項之正義寡核苷酸，且具有促進iNOSmRNA分解，而抑制NO產生之活性者。
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