CN103320508A - 基因产物的筛选方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种基因产物的筛选方法，其使用下述的增加细胞内的基因产物产量的方法，并包括判断细胞内是否存在含有与和基因产物对应的mRNA的碱基序列互补的序列的反义转录物的工序；所述增加细胞内的基因产物产量的方法包括将含有与和所述基因产物对应的mRNA的碱基序列互补的序列的物质或其前体或者在细胞内可与它们具有同等作用的物质导入细胞内的工序。

Description

基因产物的筛选方法
本申请是申请日为2007年06月07日、优先权日为2006年06月08日、中国专利申请号为200780021112.3、发明名称为“控制基因产物产量的方法以及产量控制剂”的分案申请。
技术领域
本发明涉及控制细胞内的基因产物产量的方法，特别是增加产量的方法以及产量控制剂。
背景技术
以往，已知被称为RNAi（RNA干扰：RNA interference）的用双链RNA将目标mRNA切断以抑制转录的方法，但通常RNAi的碱基长为20个碱基对左右（专利文献1：日本特开2005-13224号公报），并且其双链寡核苷酸和其反义RNA的筛选方法已经公开了。另外，也公开了对于通过使用小核酸分子，例如短干扰核酸（siNA）、短干扰RNA（siRNA）、双链RNA（dsRNA）、微小RNA（miRNA）以及短发夹RNA（shRNA）分子的RNA干扰（RNAi）来调节白细胞介素基因、白细胞介素超家族基因、或与基因表达和/或活性的白细胞介素路径相关的基因的表达和活性有用的化合物（专利文献2：日本特开2005-524393号公报）。
当细胞内存在反义RNA时，由于和与其互补的mRNA发生杂交，阻碍从mRNA向蛋白质的翻译，因此能够阻碍基因的表达。如果人为地将反义RNA导入细胞内，则由于能够阻碍靶基因的表达，因此目前作为分析基因功能的技术而被使用，且在药品中的应用也正在研究之中。但是，对于细胞内RNA的存在方式有很多不清楚的地方，关于以从mRNA向蛋白质转录的过程为对象的对其表达的控制也有很多不清楚的地方。
专利文献1：日本特开2005-13224号公报
专利文献2：日本特开2005-524393号公报
发明内容
本发明提供控制细胞内的基因产物产量的方法，特别是增加产量的方法以及产量控制剂。
本发明人等发现在细胞内存在具有与mRNA互补的序列的单链RNA（反义转录物（antisense transcript），通常被认为是DNA的反义链的转录物，而无论其来源如何），其与现有的反义RNA不同，有助于mRNA的稳定化，从而完成了本发明。
即，本发明涉及以下的基因产物产量的控制方法，可使用该方法的基因产物的筛选方法以及产量控制剂。
1.一种增加细胞内的基因产物产量的方法，其特征在于，包括将含有与和所述基因产物对应的mRNA的碱基序列互补的序列的物质或其前体或者在细胞内可与它们具有同等作用的物质导入细胞内的工序。
2.如上述1所述的增加细胞内的基因产物产量的方法，其中，含有与和所述基因产物对应的mRNA的碱基序列互补的序列的物质或其前体或者在细胞内可与它们具有同等作用的物质是在细胞内有助于mRNA的稳定化的物质。
3.如上述1或2所述的增加细胞内的基因产物产量的方法，其中，所述基因产物为细胞因子或其前体。
4.如上述1～3任一项所述的增加细胞内的基因产物产量的方法，其中，所述基因产物为诱导型一氧化氮合酶（iNOS）。
5.一种基因产物的筛选方法，其可使用上述1所述的产量增加方法，并包括判断细胞内是否存在含有与和基因产物对应的mRNA的碱基序列互补的序列的反义转录物的工序。
6.如上述5所述的基因产物的筛选方法，其中，所述反义转录物存在的判断是如下进行的：通过使用含有和所述基因产物对应的mRNA的5’末端和3’末端或者它们附近的一部分的正义序列的引物，来进行从细胞内mRNA的逆转录，从而确认逆转录产物的有无。
7.如上述5或6所述的基因产物的筛选方法，其进一步包括将能够与反义转录物中所含的碱基序列杂交的寡核苷酸或其衍生物导入细胞内，从而观察所述基因产物产量的增减的工序。
8.一种增加细胞因子的合成量的物质，其含有与所述细胞因子mRNA的全部或部分序列互补的序列。
9.一种细胞因子产量控制剂，其含有上述8所述的物质。
10.一种增加诱导型一氧化氮合酶（iNOS）的合成量的物质，其含有与诱导型一氧化氮合酶（iNOS）mRNA的全部或部分序列互补的序列。
11.一种增加诱导型一氧化氮合酶（iNOS）的合成量的物质，其含有序列号1或与序列号1具有75％以上的同源性的碱基序列。
12.一种增加诱导型一氧化氮合酶（iNOS）的合成量的RNA，其包括与从cDNA获得的序列对应的碱基序列，所述cDNA是通过使用含有诱导型一氧化氮合酶（iNOS）mRNA的5’末端和3’末端或它们附近的一部分序列的引物，从细胞内mRNA利用逆转录诱导而获得的。
13.一种iNOSmRNA表达控制剂，其含有上述10～12任一项所述的物质。
根据本发明，若使用含有与基因的mRNA的碱基序列互补的序列的物质或其前体或者在细胞内可与它们具有同等作用的物质，则能够控制相应的基因产物的产生，从而可用于广阔的领域，例如用于包括癌或自身免疫疾病、炎症性疾病的疾病的治疗和预防。
附图说明
图1为表示利用RT-PCR法测定大鼠肝细胞的mRNA量的结果的电泳图。
图2为表示利用实时PCR法测定大鼠肝细胞的mRNA量的结果的图。
图3为表示利用小鼠iNOS反义转录物分解iNOSmRNA的电泳图。
图4为表示显示给予肝保护剂（IGF-I）后的大鼠的iNOSmRNA增加被抑制的利用链特异性RT-PCR法检测iNOSmRNA的结果的电泳图。
图5为表示显示给予肝保护剂（IGF-I）后的大鼠的iNOS反义转录物增加被抑制的利用链特异性RT-PCR法检测iNOS反义转录物的结果（电泳图）。
图6为表示利用实时PCR对给予肝保护剂（IGF-I）后的大鼠的iNOS反义转录物的增加进行定量的结果的图。其中，图中“*”表示相对于GalN/LPS大鼠（n＝3～6只大鼠/组），p＜0.05。
图7为表示显示给予肝保护剂（FR183998）后的大鼠的iNOSmRNA增加被抑制的利用链特异性RT-PCR法检测iNOSmRNA的结果的电泳图。
图8为表示显示给予肝保护剂（FR183998）后的大鼠的iNOS反义转录物增加被抑制的利用链特异性RT-PCR法检测iNOS反义转录物的结果的电泳图。
图9为表示利用实时PCR法对给予肝保护剂（FR183998）后的大鼠的iNOS反义转录物的增加进行定量的结果的图，其中，图中“*”表示相对于GalN/LPS大鼠（n＝3～6只大鼠/组），p＜0.05。
图10为表示实施例10中的iNOS蛋白质和培养基中的一氧化氮（NO）量的测定结果的电泳图和图。
图11为表示实施例11的4种RNA的通过Northern法的分析结果的X射线胶片放射自显影图。从左起，表示“未刺激大鼠肝细胞的全RNA”、“IL-1β刺激大鼠肝细胞的全RNA”、“IL-1β刺激大鼠肝细胞的Poly（A）＋RNA”和“IL-1β刺激大鼠肝细胞的Poly（A）-RNA”的结果。
图12为表示实施例11的RACE的结果和核糖核酸酶保护实验的结果的图。
图13为表示实施例12中构建的载体的示意图。
图14为表示实施例12中，加入iNOS反义转录物表达载体的情况（AS（＋））与未加入的情况（AS（-））的Luc/βGal值随时间变化的图。
图15为表示在实施例12中，作为对照的使用了连接有SVpA的报告基因（reporter）时的Luc/βGal值随时间变化的图。
具体实施方式
本发明中，使用含有与特定基因产物对应的mRNA的碱基序列互补的序列的物质或其前体或者在细胞内可与它们具有同等作用的物质，来增加上述基因产物的产量。
即，现有的利用反义RNA的表达量控制方法中，认为例如包括通过反义RNA与正义RNA（sense RNA）杂交，从而抑制其翻译的过程，但本发明中，与反义转录物相同或类似的物质使利用正义链的基因产物的产量增加。尽管其详细的机理尚不清楚，但认为是因为例如反义转录物在细胞内有助于正义mRNA的稳定化，其与现有的通过反义RNA的表达量控制方法的作用机理完全不同。另外，含有与mRNA的碱基序列互补的序列的物质或其前体或者在细胞内可与它们具有同等作用的物质，通常具有相对于该mRNA的碱基序列为30％以上、优选为50％以上，更优选为70％以上的碱基长即可。典型地为RNA链，但也可以部分地经修饰或与其他物质（例如，蛋白质、糖或低分子等）结合。前体只要是在导入的细胞内或给予的生物体内通过代谢能转变为上述物质的物质即可。
关于判断本发明的方法对于某些基因产物是否有效，首先，判断细胞内是否存在含有与和该基因产物对应的mRNA的碱基序列互补的序列的反义转录物。反义转录物存在的判断是如下进行的：使用含有和基因产物对应的mRNA的5’末端和3’末端或它们附近的一部分的正义序列的引物，来进行从细胞内的全RNA的逆转录，从而确认逆转录产物（cDNA）的有无。cDNA合成后，通过PCR法进行其cDNA的扩增，例如可以通过RACE法测定全结构。
在确认有反义转录物存在的情况下，将含有与mRNA的碱基序列互补的序列的物质或其前体或者在细胞内可与它们具有同等作用的物质（以下称它们为“本发明物质”。）导入细胞内，或将可与反义转录物中所含的碱基序列杂交的寡核苷酸（以下称它们为正义寡核苷酸）或者其衍生物导入细胞内，来观察上述基因产物的产量的增减。若给予本发明物质后，基因产物（原始的基因产物）的表达量增加，则可与现有的反义RNA相反地进行正控制。此外，认为通过将正义寡核苷酸与反义转录物反应（杂交），细胞内的反义转录物的有效量减少，因此若给予正义寡核苷酸使得基因产物（原始的基因产物）的表达量减少，则认为反义转录物与正表达量控制相关。
另外，本申请中称为“正表达量控制”的情况，不仅包括利用反义转录物增加表达量的情况，也包括在若不给予反义转录物则表达量减少的情况下维持表达量的情况。
如上所述，只要（1）对于对象基因产物，细胞内存在其反义转录物，（2）反义转录物有助于基因产物（原始的基因产物）的表达量控制（特别是正控制），则本发明的方法有效。因此，可适用的基因产物可以通过上述（1）和（2）的方法容易地进行筛选。近年来，已清楚存在相当多的这样的反义转录物的种类（参照Science309：1564-1566（2005）），因此，作为本发明物质可列举出各种物质。例如，用于基因产物为细胞因子、与炎症密切相关的环氧合酶2（cyclo-oxygenase2;COX-2）、趋化因子（chemokine）、CINC-1（细胞因子诱导的中性粒细胞趋化因子1：cytokine-induced neutrophilchemoattractant1）、NF-κB p50、IκB-α等，特别是诱导型一氧化氮合酶（iNOS）或其前体的情况。此外，无论基因产物来自的种类如何。
本发明中由与诱导型一氧化氮合酶（iNOS；inducible nitric oxidesynthase）mRNA互补的碱基序列构成的反义转录物含有和使用iNOSmRNA的正义链引物（包括仅与mRNA杂交的（链（Strand）特异性的）引物）来进行逆转录，而从互补的DNA（cDNA）获得的序列对应的碱基序列。
由与iNOS的mRNA互补的碱基序列构成的本发明物质为含有与序列号1表示的碱基序列相同或实质上相同的碱基序列的核苷酸。实质上相同的核苷酸包括序列号1或与序列号1具有75％以上、优选90％以上、更优选95％以上的同源性的碱基序列，其是增加诱导型一氧化氮合酶（iNOS）的合成量的物质。
含有与mRNA的碱基序列互补的序列的物质或其前体或者在细胞内可与它们具有同等的作用的本发明物质可以通过化学合成、公知的表达法以及精制法或者实施例中记载的方法来制备。
另外，本发明还涉及含有这些反义转录物等的细胞因子产量控制剂，特别是iNOS产量控制剂。
上述的具有与iNOSmRNA的反义转录物互补的序列的正义寡核苷酸是指可与反义转录物杂交的寡核苷酸或其衍生物，也可以是为了不被核内的核酸分解酶分解而被修饰的物质。
正义寡核苷酸设计可以使用Nucleic Acids Res.31,3406-3415（2003）和J.Mol.Biol.288,911-940（1999）中公开的程序“mfold”（参照http://www.bioinfo.rpi.edu/～zukerm/rna/）、预测RNA的2级结构来进行。正义寡核苷酸的候补序列设计与含有热力学上不稳定的部分（例如茎-环（stem-loop）结构的茎部分以外的区域）、优选茎-环结构的环（loop）结构的部分相对的正义寡核苷酸。
对于上述正义寡核苷酸的候补序列，选择不含有与细胞发生序列非特异性反应的5’-CG-3’、5’-GGGG-3’和5’-GGGGG-3’等序列的序列，用大鼠基因组进行同源性检索，确认不存在类似的序列，来选择优选的序列（参照J.Neurochem.86,374382（2003））。
作为正义寡核苷酸，可列举出以下所示的寡核苷酸等（下述序列的表示中省略了修饰）：
5’－GCCTCATACTTCCTCAGAGC－3’（序列号36）
5’－TAGCTGCATTGTGTACAGAT－3’（序列号37）
5’－GTGTATAATTCCTTGATGAA－3’（序列号38）
这些可以通过化学合成、公知的表达法以及精制法或者实施例中记载的方法来制备。
正义寡核苷酸为了不被核内的核酸分解酶分解可以被修饰，对于其修饰没有特别的限制。正义寡核苷酸在细胞内被核酸外切酶（exonuclease）从5’或3’末端依次切下核苷酸而从两端被消化，例如优选从两端将1个以上的磷酸键P＝O取代成P＝S，从而被修饰成对分解酶稳定的硫代磷酸酯（phosphorothioate）型（以下将其称为“S代正义寡核苷酸”）。（参照J.Neurochem.86,374-382（2003））。但是，若将全部的磷酸键S代则发生光学异构性，从杂交的角度出发变得不利。
作为S代正义寡核苷酸的具体例子，可列举出以下序列（序列中*表示被S代的部分）等。
5’－G*C*C*TCATACTTCCTCAG*A*G*C－3’
5’－T*A*G*CTGCATTGTGTACA*G*A*T－3’
5’－G*T*G*TATAATTCCTTGAT*G*A*A－3’
作为其它的修饰法，可列举出PNA（肽核酸）、LNA（锁核酸）、ENA（2’-O,4’-C-亚乙基－桥核酸；Sigma-Aldrich公司）、吗啉（morpholino）寡核苷酸（Gene Tools公司，OR，USA）等。
由于认为通过将正义寡核苷酸导入确认存在iNOSmRNA的反义转录物的细胞内，该正义寡核苷酸与反义转录物反应（杂交），而使细胞内的反义转录物的有效量降低，因此通过给予正义寡核苷酸使原始的基因产物（iNOS）的表达量减少，从而能够抑制NO的过量产生。
实施例
以下给出实施例以具体地说明本发明，但本发明并不受这些实施例的限定。
（1）与iNOSmRNA互补的序列的反义转录物的序列和区域（碱基长）的测定方法
实施例1：大鼠iNOS反义转录物
通过以下的方法，对大鼠iNOS的mRNA，研究从基因的反义链转录的“反义转录物”是否存在，并研究该“反义转录物”与正义基因产物的产生的控制具有怎样的关系。其中，大鼠iNOS的mRNA的碱基序列可由DDBJ/EMBL/GenBank国际碱基序列数据库（http://www.ddbj.nig.ac.jp/、http://www.ebi.ac.uk/embl/、http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Genbank/）获知。
在细胞因子或急性期蛋白质等发生诱导性表达的基因的mRNA的3’非翻译区域（3’UTR）存在被称为富AU单元（AU-rich element，ARE）的序列，即，5’-AUUUA-3’或5’-AUUUUA-3’的序列（参照Proc Natl Acad Sci USA83:1670-1674（1986））。由于ARE也存在于人、大鼠以及小鼠的iNOSmRNA的3’UTR，因此通过链特异性RT-PCR法研究和含有该ARE的3’UTR对应的（序列为互补性的）反义转录物是否存在。本方法使用如寡聚dT引物那样仅与mRNA杂交的（链（strand）特异性的）引物进行逆转录来合成互补性DNA（cDNA），然后进行PCR法扩增cDNA，从而测定mRNA的量。
即，使用下面所示的iNOS基因的正义链的引物，对向培养基中添加IL-1β而诱导iNOS mRAN的大鼠原代培养肝细胞的全RNA进行RT-PCR，从而合成cDNA。
5’－TGCCCCTCCCCCACATTCTCT－3’（序列号2）
将从大鼠原代培养肝细胞制备的RNA（1μg）与2pmol的引物混合，随后在70℃下加热10分钟，然后急冷到0℃。向其中加入ReverTra Ace反应缓冲液（东洋纺）、dNTP（N＝A、C、G、T）（使最终浓度为1mM）、20单位RNase抑制剂（RNase inhibitor，东洋纺）以及200单位ReverTra Ace逆转录酶（东洋纺），使总量为25μl。在47℃下保温60分钟进行逆转录后，在70℃下加热15分钟，使逆转录酶失活。接着，加入5单位的Tth RNase H（东洋纺），在37℃下加热20分钟，分解模板RNA。将合成的cDNA进行乙醇沉淀并回收，用20μl的TE缓冲液溶解。
向如此得到的cDNA2μl中加入PCR反应缓冲液（NIPPON GENE公司）、dNTP（N＝A、C、G、T；NIPPON GENE公司）（使最终浓度为125μM）、下述2种引物：正向引物40pmol、反向引物40pmol、1单位Gene Taq DNA聚合酶（NIPPON GENE公司）、以及anti-Taq high（＝抗Taq聚合酶抗体，东洋纺）＃，使总量为40μl，进一步进行PCR。
正向：5’－ACCAGGAGGCGCCATCCCGCTGC－3’（序列号3）
反向：5’－CTTGATCAAACACTCATTTTATTAAA－3’（序列号4）
PCR的温度方案按照公知的方法，即步减法（step down method）（参照Nishizawa M,Nakajima T,Yasuda K,Kanzaki H,Sasaguri Y,Watanabe K,and Ito S.Close Kinship of human20a-hydroxysteroid dehydrogenase gene withthree aldo-keto reductase genes.Genes Cells（2000）5,111-125）进行。对PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，其结果可见186个碱基对（bp）的条带的扩增。
将该条带从凝胶中切出并精制，对碱基序列进行测定，结果确认其为在上述引物序列中夹有的、与大鼠iNOSmRNA的3’UTR的序列互补的序列。即，通过采用了iNOS基因的正义引物的链特异性RT-PCR法，证明了反义转录物的存在。
另外，为了研究iNOS基因的反义转录物的全部结构，利用RACE法（参照Frohman MA.Rapid amplification of complementary DNA ends forgeneration of full-length complementary DNAs:thermal RACE.MethodsEnzymol.（1993）218:340-356）试着进行分析。RACE法是从已知的cDNA序列制作链特异性的引物并进行逆转录，从而测定5’侧和3’侧的cDNA的序列的方法。
[5’侧的cDNA的序列测定]
向大鼠原代培养肝细胞中添加IL-1β，诱导iNOS mRNA，用Trizol试剂（Invitrogen公司）制备RNA。以该RNA为模板，使用序列号2的引物（iNOS的正义（正向）引物；5’－TGCCCCTCCCCCACATTCTCT－3’）合成双链cDNA。将CA cassette adaptor（接头）（附带在cDNA PCR文库试剂盒（cDNA PCR library kit，TAKARA BIO株式会社）内）与该cDNA连接后，使用序列号3的引物（针对iNOS mRNA的3’UTR的正义（正向）引物）和CA引物（附带在cDNA PCR文库试剂盒（TAKARA BIO株式会社）内）进行PCR。对反应液进行琼脂糖凝胶电泳，结果扩增了约250bp大小的条带。将该条带切出，克隆（cloning）到pGEM-T Easy载体（Promega）上，从而测定碱基序列。
[3’侧的cDNA的序列测定]
与上述同样，从由IL-1β诱导的大鼠原代培养肝细胞制备RNA。使用PolyA Tract mRNA Isolation System（Promega），精制PolyA-级分的RNA，以该RNA为模板，使用带有锚定序列（下划线部分）的随机引物（锚定随机引物；5’－TTCCCTCCCGTTTTCTCTGCCACTAGAATTCTCGAGC GGCCGCNNNNNNN－3’（序列号5））合成双链cDNA。将CA cassetteadaptor与该cDNA连接后，使用序列号4的引物（针对iNOS mRNA的3’UTR的反义（反向）引物）和CA引物进行PCR。精制该反应液并以其为模板，使用针对iNOS mRNA的3’UTR的反义（反向）引物（5’－ATATTAGAGCAGCGGGATGGCGCCTC－3’（序列号6））和锚定引物（针对上述“锚定随机引物”的锚定序列的引物；5’－ACTAGAATTCTCGAGCGGCCGC－3’（序列号7））进行2次PCR。对反应液进行琼脂糖凝胶电泳，结果扩增了200～500bp大小的条带。将该条带切出，克隆到pGEM-T Easy载体上，从而测定碱基序列。
其结果，推定反义转录物的全长约为600碱基以上。以下示出其序列（序列号1；其中，作为cDNA序列表示。）。即，反义转录物和iNOS mRNA的3’UTR对应，转录起始点（5’侧）在iNOS mRNA的PolyA附加部位的互补链上。
实施例2：人iNOS反义转录物
通过以下的方法，针对人iNOS的mRNA，研究是否存在从基因的反义链转录的“反义转录物”。其中，人iNOS的mRNA的碱基序列可由DDBJ/EMBL/GenBank国际碱基序列数据库（http://www.ddbj.nig.ac.jp/、http://www.ebi.ac.uk/embl/、http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Genbank/）获知。
从人的组织（胎盘、肝脏、胃粘膜）或细胞（未刺激的淋巴细胞），按照常规方法、使用Trizol试剂（Invitrogen公司）提取全RNA。对得到的全RNA用含有DNase的TURBO DNA-free试剂盒（Applied Biosystems公司）进行处理，除去混入的基因组DNA。以该全RNA为模板，使用如下表示的人iNOS基因的有义链的引物5’-CTGAGTGCACCACTTCAAGTGAC-3’（序列号8）进行逆转录，合成cDNA：。具体而言，除了用从人的组织或细胞中制备的全RNA（1μg）和上述用序列号8表示的引物（2pmol）代替实施例1中的从大鼠原代培养肝细胞中制备的RNA1μg和序列号2表示的引物2pmol以外，按照同样的方法合成cDNA。
向如此得到的cDNA2μl中加入PCR反应缓冲液（NIPPON GENE公司）、dNTP（N＝A、C、G、T；NIPPON GENE公司）（使最终浓度为125μM）、下述2种引物：正向引物40pmol、反向引物40pmol、1单位Gene Taq DNA聚合酶（NIPPON GENE公司）、以及anti-Taq high（＝抗Taq聚合酶抗体，东洋纺）＃，使总量为40μl，进一步进行PCR。
正向：5’-CAGGAGGTGCTATCGCACCACT-3’（序列号9）
反向：5’-GCAATTCATGTAAATATCTCCATC-3’（序列号10）
PCR的方法按照与实施例1同样的方法进行。对PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，其结果可见在使用来自人胎盘的cDNA时为151个碱基对（bp）的条带的扩增。在其它的cDNA（肝脏、胃粘膜或未刺激的淋巴细胞）中未见扩增。
将经扩增的条带从凝胶中切出并精制，对碱基序列进行测定，结果确认其为在上述引物序列中夹有的、与人iNOSmRNA的3’UTR互补的序列。即，通过采用iNOS基因的正义引物的链特异性RT-PCR法，证明了人iNOS反义转录物的存在。人iNOS反义转录物的序列表示在序列号11。其中，作为cDNA序列表示。
实施例3：小鼠iNOS反义转录物
通过以下的方法，针对小鼠iNOS的mRNA，研究是否存在从基因的反义链转录的“反义转录物”。其中，小鼠iNOS的mRNA的碱基序列可由DDBJ/EMBL/GenBank国际碱基序列数据库（http://www.ddbj.nig.ac.jp/、http://www.ebi.ac.uk/embl/、http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Genbank/）获知。
从RAW264细胞，按照常规方法，使用Trizol试剂（Invitrogen公司）提取全RNA。对得到的全RNA用含有DNase的TURBO DNA-free试剂盒（Applied Biosystems公司）进行处理，除去混入的基因组DNA。以该全RNA为模板，使用如下所示的小鼠iNOS基因的反义链的引物5’-CCTTCTTCTCCACTCCCCAGCT-3’（序列号12）进行逆转录，合成cDNA。具体而言，除了用从RAW264细胞中制备的全RNA（1μg）和序列号12表示的引物（2pmol）代替实施例1中的从大鼠原代培养肝细胞中制备的RNA1μg和序列号2表示的引物2pmol以外，按照同样的方法合成cDNA。
向如此得到的cDNA2μl中加入PCR反应缓冲液（NIPPON GENE公司）、dNTP（N＝A、C、G、T；NIPPON GENE公司）（使最终浓度为125μM）、下述2种引物：正向引物40pmol、反向引物40pmol、1单位Gene Taq DNA聚合酶（NIPPON GENE公司）、以及anti-Taq high（＝抗Taq聚合酶抗体，东洋纺）＃，使总量为40μl，进一步进行PCR。
正向：5’-GACCACCAGGAGGCACCATGCCG-3’（序列号13）
反向：5’-ATACAGGAAAGGCCCAAGCCATC-3’（序列号14）
PCR的方法按照与实施例1同样的方法进行。对PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，其结果可见127个碱基对（bp）的条带的扩增。
将经扩增的条带从凝胶中切出并精制，对碱基序列进行测定，结果确认其为在上述引物序列中夹有、与小鼠iNOS mRNA的3’UTR互补的序列。即，通过采用iNOS基因的正义引物的链特异性RT-PCR法，证明了小鼠iNOS反义转录物的存在。小鼠iNOS反义转录物的序列表示在序列号15。其中，作为cDNA序列表示。
（2）与iNOSmRNA互补的反义转录物所带来的iNOSmRNA的稳定化
实施例4：大鼠iNOS反义转录物所带来的iNOSmRNA的稳定化
为了弄清楚大鼠反义转录物是否使iNOSmRNA稳定化，将具有与大鼠反义转录物互补的序列，且具有与大鼠反义转录物进行杂交的性质的iNOS的正义寡核苷酸导入大鼠原代培养肝细胞中，研究iNOSmRNA量。
正义寡核苷酸通过将寡核苷酸中的磷酸二酯键的磷酸的一个氧原子取代为硫原子（S代），从而防止寡核苷酸被细胞内的核酸分解酶分解。利用IBA公司（Gottingen，Germany）的根据磁辅助转染法（Magnet assistedtransfection method）的基因导入试剂盒（MATra-A试剂）将S代正义寡核苷酸导入大鼠原代培养肝细胞中。
按照公知的方法（J.Hepatol.40,616-623,2004）制备大鼠原代培养肝细胞，并接种到6孔板上（每孔3×105个细胞）。2小时后，每孔换为1.5ml的新培养基（为在William’s E培养基（WE）中含有10％胎牛血清、10nM地塞米松和10nM胰岛素的培养基，略记为WES-DI）。进而在4小时后将寡核苷酸（2μg）与WE（200μl）混合，接着混入2μl的MATra-A试剂（IBA公司），在室温下静置20分钟，然后全部滴加到加有肝细胞的孔中。将6孔板放置在磁盘（IBA公司）上，在室温下静置15分钟，将寡核苷酸导入细胞内。换为含有10％胎牛血清的WE（每孔1.5ml），然后在37℃下放置过夜。第二天早上，换为含有1nM的IL-1β的WE，在37℃下放置4小时后，制备全RNA。
当用IL-1β刺激肝细胞时，iNOSmRNA的量显著地增加，导入上述S代正义寡核苷酸并用IL-1β进行刺激，通过RT-PCR法和实时PCR对mRNA量进行测定。其结果表示在图1和2中。
这里使用的iNOS基因的正义链序列，即具有与iNOSmRNA相同的序列的S代寡核苷酸用以下的序列表示。试验中相当于S2、S4和S5。
S2：5’－G*C*C*TCATACTTCCTCAG*A*G*C－3’
S4：5’－T*A*G*CTGCATTGTGTACA*G*A*T－3’
S5：5’－G*T*G*TATAATTCCTTGAT*G*A*A－3’
（S代部分用*表示。）
另一方面，作为阴性对照，导入具有确认由于碱基组成相同而序列不同，而不与iNOSmRNA或其转录物、或者其它的RNA杂交的序列的“随机寡核苷酸（scramble oligos）”。随机寡核苷酸的序列表示如下。
Scr2：5’－G*G*T*ATTGCCCACCCAAC*T*C*T－3’
Scr4：5’－G*G*C*TCCATATGATTAGA*T*G*T－3’
Scr5：5’－G*A*T*TGTTACTTAGAGAC*T*A*T－3’
与正义寡核苷酸同样，为了防止在细胞内的分解，也将这些随机寡核苷酸S代后使用。对于随机寡核苷酸，通过与大鼠基因组的同源性检索，确认不存在类似的序列。
另外，作为另一个阴性对照，导入针对iNOSmRNA的茎-环结构的茎部分的S代正义寡核苷酸S1。S1的序列表示如下。
S1：5’－C*A*T*TCTCTTTCCTTTGC*C*T*C－3’
（*表示与上述同样的意义。）
当使用与正义链（具有与mRNA相同序列的链）序列相同的引物进行链特异性RT-PCR法时，由于仅逆转录针对“反义转录物”的cDNA，因此能够测定“反义转录物”的量。其中设置在不进行逆转录的情况下进行了PCR的对照，确认混入肝细胞全RNA中的基因组没有被PCR扩增。在图中用RT（-）表示。
其结果是，在导入了S2、S4和S5的S代正义寡核苷酸的情况下，iNOSmRNA的量减少。这是由于S代正义寡核苷酸与iNOS的反义转录物杂交，使得反义转录物被分解，表示iNOSmRNA也被分解了。另一方面，在导入了随机寡核苷酸的情况下，iNOSmRNA的量没有很大变化。此外，在导入了针对茎部分的S1的情况下，iNOSmRNA的量也没有很大变化。
此外，当将正义寡核苷酸S5或随机寡核苷酸Scr5导入肝细胞时，以逆转录的cDNA为模板通过实时PCR法测定添加IL-1β后的iNOSmRNA量。其结果为，当导入随机寡核苷酸Scr5时，iNOSmRNA量增至2倍需要的时间为119分钟。与此相对，导入正义寡核苷酸S5时为461分钟（图2）.
与iNOS同样，iNOS以外的早期应答基因细胞因子诱导的中性粒细胞趋化因子1CINC-1在肝细胞中在IL-1β刺激下也显著地诱导mRNA。因此，在CINC-1的mRNA的3’非翻译区域（3’UTR）也与iNOSmRNA同样地存在ARE序列。将iNOS的正义寡核苷酸导入肝细胞时，对CINC-1的mRNA量进行测定，结果与未导入正义寡核苷酸的情况相比mRNA的量没有差别。即，显示iNOS的正义寡核苷酸的作用限于iNOS（图1）。
综合上述结果，显示iNOS的正义寡核苷酸与iNOS反义转录物特异性地杂交，从而促进iNOSmRNA的分解，其结果特异性地使iNOSmRNA的量减少。
实施例5：小鼠iNOS反义转录物所带来的iNOSmRNA的稳定化
将具有与小鼠反义转录物进行杂交的性质的iNOS正义寡核苷酸的S代正义寡核苷酸导入来自小鼠巨噬细胞的RAW264细胞中，研究小鼠反义转录物所带来的iNOSmRNA的表达抑制。
以下未记载的操作按照与实施例4同样的方法进行。将小鼠RAW264细胞以每孔5×105个细胞接种，更换DMEM培养基,在CO2恒温器中培养。
将IBA公司（Gottingen，Germany）的按照磁辅助转染法的S代寡核苷酸导入RAW264细胞中。换为含有10％胎牛血清的DMEM培养基（每孔1.5ml），随后在37℃下放置过夜。第二天早上，换为含有大肠杆菌LPS（1μg/ml）的DMEM培养基，在37℃下放置4小时后，提取全RNA供于RT-PCR。另外，全RNA用含有DNase的TURBO DNA-free试剂盒（AppliedBiosystems公司）处理，除去混入的基因组DNA。
针对和小鼠反义转录物对应的小鼠iNOSmRNA制备正义寡核苷酸。
这里使用的小鼠iNOS基因的正义链序列，即具有与iNOSmRNA相同序列的S代寡核苷酸用序列表示。实验中相当于S1、S2和S3。
S1：5’－G*A*A*GCACTTTGGGTGAC*C*A*C－3’
S2：5’－T*A*G*CTGCACTATGTACA*G*A*T－3’
S3：5’－C*A*G*ATATTTATACTTCA*T*A*T－3’
（S代部分用*表示。）
按照实施例4中进行的链特异性RT-PCR法，对小鼠iNOSmRNA的量进行测定。
其结果是，小鼠iNOSmRNA的量减少。这是由于S代正义寡核苷酸与iNOS的反义转录物杂交，使得反义转录物被分解或竞合，表示iNOSmRNA也被分解了（图3）。
[实施例1～5总结]
实施例4和5的结果表示，不仅大鼠，而且小鼠iNOS的正义寡核苷酸也通过与iNOS反义转录物特异性地杂交，从而促进iNOSmRNA的分解，其结果是iNOSmRNA的量特异性地减少。
如此，无论大鼠肝细胞或小鼠的细胞，使用正义寡核苷酸都能够抑制iNOSmRNA的表达。因此，使用了正义寡核苷酸的iNOSmRNA的表达抑制能够减轻肝脏等炎症时的iNOS诱导和NO产生，因此可以说是肝功能障碍的有效的治疗方法。
（3）与iNOS基因以外的早期应答基因的mRNA互补的序列的反义转录物的序列和区域（碱基长）的测定方法
在炎症时被诱导表达的基因（所谓的“早期应答基因”）中，不仅包括iNOS，而且包括细胞因子或趋化因子等生理活性物质的基因。这些早期应答基因使炎症或者恶化或者改善等，发挥着各种各样的作用。对早期应答基因表达的调节，与最终对炎症的调节相关。因此，在iNOS基因的反义转录物以外，研究其它的早期应答基因中反义转录物是否表达。然后，预测对于种间高保守的、且包含多个ARE序列的3’UTR的序列，反义转录物得到了表达。而且，对于该部分，设计逆转录用的正义引物和PCR用的1对引物，与使用大鼠的iNOS基因检测反义转录物的实施例4同样地，进行链特异性RT-PCR法，研究大鼠肝细胞中的反义转录物是否表达。
iNOS以外的早期应答基因中，以在3’UTR中含有多个ARE序列、且种间（人、小鼠、大鼠）3’UTR的序列非常类似的3个典型的基因为例进行研究。即，以下的3个基因：
（a）细胞因子诱导的中性粒细胞趋化因子1（CINC-1）：也称之为趋化因子（C-X-C motif）配体1（CXCL1），其为在用IL-1β刺激的大鼠肝细胞中诱导得到的趋化因子。
（b）NF-κB p50：转录因子NF-κB的亚单位之一，其为与炎症密切相关的蛋白质。
（c）IκB-α：抑制NF-κB活性的蛋白质。
其中，人、小鼠以及大鼠的这些mRNA的碱基序列可由DDBJ/EMBL/GenBank国际碱基序列数据库（http://www.ddbj.nig.ac.jp/、http://www.ebi.ac.uk/embl/、http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Genbank/）获知。
实施例6：大鼠CINC-1反义转录物
通过以下的方法，针对大鼠CINC-1的mRNA，研究是否存在从基因的反义链转录的“反义转录物”。以下未特别记载的操作按照与实施例1同样的方法进行。
用IL-1β刺激原代培养大鼠肝细胞，随后按照常规方法，使用Trizol试剂（Invitrogen公司），提取全RNA。对得到的全RNA用含有DNase的TURBO DNA-free试剂盒（Applied Biosystems公司）进行处理，除去混入的基因组DNA。以该全RNA为模板，使用如下所示的大鼠CINC-1基因的正义链的引物进行逆转录，合成cDNA：5’-TGTCTGGTGAACGCTGGCTTCTGA-3’（序列号16）。
使用得到的cDNA和如下所示的大鼠CINC-1基因的正义链的2种引物，按照与实施例1同样的方法即步减法进行PCR：
正向：5’－TGTGGATGCGTTTCATCGATGGT－3’（序列号17）
反向：5’－CTAGCACAGTGGTTGACACTTA－3’（序列号18）。
对PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，其结果可见122个碱基对（bp）的条带的扩增。将经扩增的条带从凝胶中切出并精制，对碱基序列进行测定，结果确认其为在上述引物序列中夹有的、大鼠CINC-1mRNA的3’UTR的序列。即，通过采用iNOS基因的正义引物的链特异性RT-PCR法，证明了大鼠CINC-1基因的反义转录物的存在。大鼠CINC-1基因的反义转录物的序列表示在序列号19。其中，作为cDNA序列表示。
实施例7：大鼠NF-κB p50反义转录物
通过以下的方法，针对大鼠NF-κB p50的mRNA，研究是否存在从基因的反义链转录的“反义转录物”。以下未特别记载的操作按照与实施例6同样的方法进行。
用IL-1β刺激原代培养大鼠肝细胞，然后按照常规方法，使用Trizol试剂（Invitrogen公司），提取全RNA。对得到的全RNA用含有DNase的TURBO DNA-free试剂盒（Applied Biosystems公司）进行处理，除去混入的基因组DNA。以该全RNA为模板，使用如下所示的大鼠NF-κB p50基因的正义链的引物5’－CTGTCATTAAGGTATCGCAGTCC－3’（序列号20）进行逆转录，合成cDNA。
使用得到的cDNA和如下所示的大鼠NF-κB p50基因的正义链的2种引物，按照与实施例1同样的方法即步减法进行PCR：
正向：5’－CATCTACAGTACAGTCATGCACTC－3’（序列号21）
反向：5’－GGGAAAATACTATTTTCAGCACTGAT－3’（序列号22）。
对PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，其结果可见192个碱基对（bp）的条带的扩增。将该条带从凝胶中切出并精制，对碱基序列进行测定，结果确认其为在上述引物序列中夹有的、大鼠NF-κB p50mRNA的3’UTR的序列。即，通过采用iNOS基因的正义引物的链特异性RT-PCR法，证明了大鼠NF-κB p50基因的反义转录物的存在。大鼠NF-κB p50基因的反义转录物的序列表示在序列号23。其中，作为cDNA序列表示。
实施例8：大鼠IκB-α反义转录物
通过以下的方法，针对大鼠IκB-α的mRNA，研究是否存在从基因的反义链转录的“反义转录物”。以下未特别记载的操作按照与实施例6同样的方法进行。
用IL-1β刺激原代培养大鼠肝细胞，随后按照常规方法、使用Trizol试剂（Invitrogen公司），提取全RNA。对得到的全RNA用含有DNase的TURBO DNA-free试剂盒（Applied Biosystems公司）进行处理，除去混入的基因组DNA。以该全RNA为模板，使用如下所示的大鼠IκB-α基因的正义链的引物5’-TCCAGAATCTGATAAAAGGACCAC-3’（序列号24）进行逆转录，合成cDNA。
使用得到的cDNA和如下所示的大鼠IκB-α基因的正义链的2种引物，按照与实施例1同样的方法即步减法进行PCR：
正向：5’-TGAACCGCCATAGACTGTAGCTG-3’（序列号25）
反向：5’-GCACATACCACTGAACACCTGGT-3’（序列号26）。
对PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，其结果可见102个碱基对（bp）的条带的扩增。将该条带从凝胶中切出并精制，对碱基序列进行测定，结果确认其为在上述引物序列中夹有的、大鼠IκB-αmRNA的3’UTR的序列。即，通过采用iNOS基因的正义引物的链特异性RT-PCR法，证明了大鼠IκB-α基因的反义转录物的存在。大鼠IκB-α基因的反义转录物的序列表示在序列号27。其中，作为cDNA序列表示。
[实施例6～8的总结]
作为炎症时表达的早期应答基因，选择iNOS以外的3个代表性基因（CINC-1、NF-κB p50、IκB-α），它们任一个在3’UTR中都含有多个ARE序列，且种间（人、小鼠、大鼠）3’UTR的序列非常相似。与iNOS同样，在这3个基因中也确认了反义转录物的表达。
由此推测，反义转录物在含有ARE序列、且种间3’UTR的序列非常相似的早期应答基因中是共通地可观察到的分子。另外，强烈启示反义转录物可能调节这些mRNA的稳定性。因此，在肝等的炎症中，期望通过抑制早期应答基因的反义转录物的作用，从而抑制炎症。
（4）在使用了大鼠急性肝功能衰竭模型的活体（体内）中，iNOS、反义转录物的表达诱导以及肝保护剂（IGF-I和FR183998）所带来的iNOS和反义转录物的表达诱导的抑制效果
实施例1和实施例4的结果显示，在大鼠原代培养肝细胞（体外）的体系中，iNOS诱导时和iNOSmRNA的3’-非翻译区域（3’UTR）对应的反义转录物表达，从而促进了iNOSmRNA的稳定化。在肝功能障碍大鼠（体内），与iNOS诱导相呼应，iNOS反义转录物的表达如下所示。另外，给予胰岛素样生长因子-I（Insulin-like growth factor-I，IGF-I）或Na＋/H＋交换抑制剂（FR183998）等肝保护剂所带来的存活率的变化与炎症性细胞因子、iNOSmRNA以及反义转录物的诱导之间的关系如下所示。
实施例9
（I）急性肝功能衰竭模型的制作和肝保护剂的给予
给雄性Sprague-Dawley大鼠（250～300g）静脉注射D-半乳糖胺（D-galactosamine）（400g/kg）与细菌内毒素LPS（16μg/kg）的混合液（D-GalN/LPS），制备急性肝功能衰竭模型。将胰岛素样生长因子-I（IGF-I；3.2mg/kg）或Na＋/H＋交换抑制剂（FR183998；1mg/kg）在D-GalN/LPS处理的30分钟前给予。测定血中和肝的炎症性细胞因子（TNF-α，IL-1β、IL-6、干扰素γ、CINC-1）、MIP-2以及一氧化氮（NO）。从肝制备全RNA，用RT-PCR研究iNOSmRNA和iNOS反义转录物。
（II）RNA的分析
静脉注射D-半乳糖胺与LPS混合液后，在3或6小时后，取出大鼠肝脏，按照常规方法，使用Trizol试剂（Invitrogen公司）提取全RNA。以该全RNA为模板，使用寡聚dT引物，进行逆转录，然后按照与实施例1等同样的方法进行PCR（RT-PCR法）。对于iNOSmRNA或成为内部标准的延伸因子-1α（elongation factor-1α，EF1）mRNA的定量，逆转录时使用寡聚dT引物，PCR时使用下述引物。另外，在PCR反应液中添加anti-Taq high（＝抗Taq聚合酶抗体，东洋纺）。
iNOSmRNA:
CCAACCTGCAGGTCTTCGATG（序列号28）和
GTCGATGCACAACTGGGTGAAC（序列号29）；和
EFmRNA:
TCTGGTTGGAATGGTGACAACATGC（序列号30）和
CCAGGAAGAGCTTCACTCAAAGCTT（序列号31）
此外，iNOS反义转录物的定量按照实施例1的方法进行。另外，设置在不进行逆转录的情况下进行PCR的对照，以确认混入肝细胞的全RNA的基因组没有因PCR而扩增。iNOSmRNA检测结果表示在图4，iNOS反义转录物的检测结果表示在图5。图中RT（-）表示逆转录（-）的阴性对照。
（III）利用实时PCR的mRNA和反义转录物的定量
逆转录合成的cDNA也使用日本Bio-Rad公司的iCycler System通过实时PCR来定量。在PCR反应液中添加SYBR Green I（Roche Diagnostics公司）和anti-Taq high（＝抗Taq聚合酶抗体，东洋纺），通过公知的方法即触减法（touch down method）进行PCR。实际的PCR方案如下所述。
1个循环（94℃，1分钟）
50个循环（94℃，30秒钟；（70-0.3×n）℃，1分钟；72℃，30秒钟）；n为循环数。结果表示在图6。图中，“*”表示相对于GalN/LPS大鼠（n＝3～6只大鼠/组），p＜0.05。
（IV）肝保护剂所带来的iNOSmRNA和iNOS反义转录物量的变化
在不给予肝保护剂的情况下，静脉注射D-GalN/LPS后，约24小时内几乎所有的动物（90％以上）死亡。在血中和肝中，炎症性介质（TNF-α，IL-1β、IL-6、干扰素γ、CINC-1、MIP-2、NO）随着时间（1～12小时）增加。与肝的iNOSmRNA诱导相呼应，显示反义转录物增加（iNOSmRNA和iNOS反义转录物都在6小时后最大），其结果可见产生了过量的NO。
通过给予IGF-I，死亡率减少到20～30％以下。而且，除上述炎症性细胞因子、NO产生之外，iNOSmRNA和反义转录物诱导的增加也同样地受到抑制（图4～6）。
通过给予FR183998，死亡率减少到20～30％以下。而且，除上述炎症性细胞因子、NO产生之外，iNOSmRNA和反义转录物诱导的增加也同样地受到抑制（图7～9）。
（IV-1）大鼠急性肝功能衰竭模型中肝保护剂IGF-I诱导iNOSmRNA和反义转录物表达的效果
根据图4的结果，给予D-半乳糖胺和LPS的大鼠即GalN/LPS大鼠在3～6小时内iNOSmRNA水平增加，但给予IGF-I的大鼠该增加受到抑制。
根据图5和6的结果，在RT（－）中几乎未见经扩增的cDNA，因此认为混入全RNA中的基因组DNA极其微量。GalN/LPS大鼠在3～6小时内反义转录物水平增加，但给予IGF-I的大鼠该增加受到抑制。
（IV-2）大鼠急性肝功能衰竭模型中肝保护剂FR183998诱导iNOSmRNA和反义转录物表达的效果
根据图7的结果，GalN/LPS大鼠在3～6小时内iNOSmRNA水平增加，但给予FR183998的大鼠该增加受到抑制。
根据图8和9的结果，在RT（－）中几乎未见经扩增的cDNA，因此认为混入全RNA中的基因组DNA极其微量。GalN/LPS大鼠在3～6小时内反义转录物水平增加，但给予FR183998的大鼠该增加受到抑制。
（5）大鼠肝细胞中的正义寡核苷酸的效果（iNOS蛋白质和一氧化氮（NO）量的变化）
实施例10
按照与实施例4同样的方法，将在实施例4中得到的正义寡核苷酸S5或随机寡核苷酸Scr5导入肝细胞，使用一氧化氮比色法分析试剂盒（NitricOxide Colorimetric Assay kits，Roche Diagnostics公司）测定培养基中的一氧化氮（NO）量。第二天早上，换为含有1nM的IL-1β的WE培养基，在37℃下放置8～10小时后，进行测定。另外，从细胞提取全蛋白质，用ECL试剂盒（GE Healthcare公司）按照Western法检测iNOS蛋白质。结果表示在图10。
其结果表示，通过将正义寡核苷酸S5导入大鼠肝细胞，iNOS蛋白质和培养基中的一氧化氮（NO）量减少。
（6）利用Northern法的iNOS反义转录物的检测
实施例11
在用IL-1β刺激的大鼠肝细胞，通过Northern印迹分析（Northern blotanalysis，以下略记为Northern法）确认iNOS基因的反义转录物的存在。
（I）RNA的制备
用IL-1β刺激大鼠肝细胞一定时间，随后使用Trizol试剂（Invitrogen公司）提取全RNA。对得到的全RNA用含有DNase的TURBO DNA-free试剂盒（Applied Biosystems公司）进行处理，除去混入的基因组DNA。将Poly（A）+和Poly（A）-RNA用PolyATract mRNA Isolation System（Promega公司）进行分级。为了防止非特异性的杂交，使核糖体RNA（rRNA）在终浓度为5％的聚乙烯醇6000和终浓度为0.75M NaCl存在下沉淀并除去，通过醇沉淀回收上清，用于电泳。
（II）Northern法：电泳
上述4个RNA，即：未刺激大鼠肝细胞的全RNA、IL-1β刺激大鼠肝细胞的全RNA,IL-1β刺激大鼠肝细胞的Poly（A）+RNA和IL-1β刺激大鼠肝细胞的Poly（A）-RNA，将它们在含2.2M福尔马林琼脂糖中电泳，从而进行分离。
（III）Northern法：杂交
按照常规方法，将凝胶中的RNA移至Nytran N过滤器（Whatman公司）中。然后，在DIG EasyHyb缓冲液（Roche Diagnostics公司）中，在73°C下过夜，使之与地高辛（DIG）标记的iNOS的3’UTR的正义探针杂交。第二天早上，按照Roche Diagnostics公司的操作手册，清洗过滤器。其中，iNOS的3’UTR的正义探针通过使用DIG-11-UTP（Roche Diagnostics公司）和T3RNA聚合酶（Stratagene公司），在试管内合成RNA而制作。
（IV）Northern法：检测
按照Roche Diagnostics公司的操作手册，进行封闭，将其和与碱性磷酸酶结合的抗DIG抗体（Roche Diagnostics公司）一起孵育。洗涤后，使之与作为底物的CDP-Star（Applied Biosystems公司）反应，用X射线胶片检测与iNOS正义探针进行杂交的RNA的条带。
（V）结果与考察
上述4种RNA的利用Northern法的分析结果（X射线胶片的放射自显影图）表示在图11。
观察到“IL-1β刺激大鼠肝细胞的全RNA”与“IL-1β刺激大鼠肝细胞的Poly（A）-RNA”中的600～1000核苷酸（nt）的涂片状的深色条带。由于使用了iNOS的3’UTR的正义探针，因此这些涂片状条带被认为是iNOS的反义转录物的条带。因此，清楚了iNOS的反义转录物的长度并不恒定，而是各种长度（600～100核苷酸）的转录物的集合。
综合RACE的结果和核糖核酸酶保护实验的结果，如图12所示那样，认为合成了iNOS的反义转录物。图中，虚线表示合成了600核苷酸以上的各种大小的反义转录物。图中的数字表示iNOS基因的外显子的号码，黑色部分为蛋白质的翻译区，反白框为外显子27处的3’UTR。iNOS的mRNA表示在基因的图上侧。
（7）iNOS反义转录物的过量表达所带来的mRNA的稳定化
实施例12
在大鼠肝细胞中，使iNOS基因的反义转录物过量表达，可以确认借助于iNOS的3’UTR，mRNA被稳定化。
在普通的报告基因（reporter）的情况下，荧光素酶基因结合于iNOS基因的启动子。由于iNOS基因的启动子为“诱导型启动子”，因此在大鼠肝细胞中，由于IL-1β刺激，启动子的活性发生很大变化，无法很好地观察结合于报道基因后部的3’UTR的作用。因此，决定使用与刺激无关地促进恒定量表达的作为“组成型启动子（constitutive promotor）”的延伸因子-1α（elongation factor-1α，EF）基因的启动子。因此，被EF启动子控制的荧光素酶基因和β-半乳糖苷酶基因与刺激无关地基本以恒定量表达。由此可观察到，含有poly（A）信号序列的iNOSmRNA的3’UTR仅对荧光素酶mRNA的稳定性产生影响。
以pGL3-Basic质粒（Promega公司）为基础构建以下3种载体。构建的载体的示意图表示在图13。
（i）报告基因（荧光素酶载体）:
EF启动子+荧光素酶基因（Luc）+iNOS3’UTR
EF启动子+荧光素酶基因（Luc）+SVpA
（组成型地表达荧光素酶mRNA，但mRNA的稳定性可被荧光素酶基因后部的部分控制。）
（ii）iNOS反义转录物表达载体：
将CMV启动子+将iNOS3’UTR插入反向+SVpA
（iNOS反义转录物在细胞内过量地表达）
（iii）内部标准（β-半乳糖苷酶载体）：
EF启动子+β半乳糖苷酶（lacZ）基因+SVpA
（β-半乳糖苷酶mRNA组成型地表达）
其中，“SVpA”是指来自SV40病毒的poly（A）信号序列，已知其为稳定的3’UTR，且难以破坏加成有SVpA的mRNA。作为iNOS3’UTR的对照的CMV启动子是指来自巨细胞病毒、比EF启动子更强的组成型启动子。
将（i）和（iii）的质粒同时导入大鼠肝细胞时，由于EF启动子为组成型的，因此荧光素酶mRNA（Luc）与β半乳糖苷酶mRNA（β-Gal）的合成量基本恒定。另外，在加入iNOS反义转录物表达载体（ii）时与不加入时之间若存在差别，则在Luc mRNA/βGal mRNA（Luc/βGal值）间也存在差别。若Luc/βGal值根据iNOS反义转录物表达载体的有无而变化，则iNOS反义转录物的过量表达可借助于iNOS3’UTR而对荧光素酶mRNA的稳定性产生影响。
[方法]
（I）转染
通过上述方法（MATra）将下述质粒导入原代培养大鼠肝细胞中。
（i）报告基因（400ng/孔）
±（ii）iNOS反义转录物表达载体（50ng/孔）
（iii）内部标准（400ng/孔）
将加入有iNOS反义转录物表达载体的表示为AS（＋），将未加入的表示为AS（-）。
（II）RNA的制备
进行转染，更换经过一夜的肝细胞的培养基，然后随时间变化地提取全RNA。按照常规方法，使用Trizol试剂（Invitrogen公司）进行。对得到的全RNA用含有DNase的TURBO DNA-free试剂盒（Applied Biosystems公司）进行处理，除去混入的基因组DNA。以该全RNA为模板，用寡聚（dT）引物进行逆转录，从而合成针对mRNA的cDNA。
（III）利用实时PCR的mRNA的定量
使用合成的cDNA，利用实时PCR来定量。使用日本Bio-Rad公司的iCycler系统。在PCR反应液中添加SYBR Green I（Roche Diagnostics公司）和anti-Taq high（＝抗Taq聚合酶抗体，东洋纺），使用公知的方法即触减法进行PCR。实际的PCR方案如下所述。
1个循环（94℃，1分钟）
50个循环（94℃，30秒钟；（70-0.3×n）℃，1分钟；72℃，30秒钟）（n为循环数）。
在作为报告基因的荧光素酶（Luc）的mRNA的PCR中使用的引物为下述2种。
正向：
5’-GCGAAGGTTGTGGATCTGGATAC-3’（序列号32）
反向：
5’-GAGCCACCTGATAGCCTTTGTAC-3’（序列号33）
在作为内部标准的β半乳糖苷酶（βGal）的mRNA的PCR中使用的引物为下述2种：
正向：
5’-GTCACACTACGTCTGAACGTCGA-3’（序列号34）
反向：
5’-TGCAGAGGATGATGCTCGTGACG-3’（序列号35）
进行了实时PCR后，用iCycler系统的分析软件，求得荧光素酶mRNA（Luc）和β半乳糖苷酶mRNA（βGal）的循环域（threshold cycle，Ct）值，相除，求得Luc/βGal值。
[结果]
对于加入了iNOS反义转录物表达载体的情况与未加入的情况，随时间变化地表示Luc/βGal值。结果表示在图14.
（i）报告基因（EF启动子＋Luc＋iNOS3’UTR），
±（ii）iNOS反义转录物表达载体，
（iii）内部标准。
此时，将加入了iNOS反义转录物表达载体时的AS（＋），与未加入的情况AS（-）相比较，Luc/βGal值显著地增加。图中，“**”表示相对于AS（-），p＜0.01。
即，iNOS反义转录物借助于iNOS3’UTR使荧光素酶mRNA稳定化。
作为对照，使用连接SVpA的报告基因，其结果表示在图15中。
（i）报告基因（EF启动子＋Luc＋SVpA），
±（ii）iNOS反义转录物表达载体，
（iii）内部标准。
此时，将加入了iNOS反义转录物表达载体时的AS（＋），与未加入的情况AS（-）相比较，Luc/βGal值未增加。即，SVpA对RNA的稳定性没有影响。
[意义]
从上述结果（iNOS反义转录物的过量表达实验）可知，iNOS反义转录物具有作用于iNOS3’UTR而使mRNA稳定化的作用。综合使用S代正义寡核苷酸的iNOSmRNA的击倒（konck down）实验的结果，可以说，iNOS反义转录物借助于iNOS3’UTR使iNOSmRNA稳定化。
因此，强烈启示iNOS反义转录物所带来的iNOSmRNA稳定性的控制机理在肝等的炎症时发挥重要的作用。此外，该机理可成为与NO相关的许多疾病的治疗对象。
通过给予肝保护剂，iNOSmRNA与反义转录物的诱导被抑制。以上结果强烈启示反义转录物即使在体内也可作为iNOSmRNA表达诱导的控制因子而相关。因此使用了肝保护剂的反义转录物的表达抑制减轻了肝等炎症时的iNOS诱导以及NO产生，从而被认为是肝功能障碍的有效的治疗方法。
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Claims (6)

1.一种基因产物的筛选方法，其使用下述的增加细胞内的基因产物产量的方法，并包括判断细胞内是否存在含有与和基因产物对应的mRNA的碱基序列互补的序列的反义转录物的工序；所述增加细胞内的基因产物产量的方法包括将含有与和所述基因产物对应的mRNA的碱基序列互补的序列的物质或其前体或者在细胞内可与它们具有同等作用的物质导入细胞内的工序。
2.如权利要求1所述的基因产物的筛选方法，其中，含有与和所述基因产物对应的mRNA的碱基序列互补的序列的物质或其前体或者在细胞内可与它们具有同等作用的物质是在细胞内有助于mRNA的稳定化的物质。
3.如权利要求1或2所述的基因产物的筛选方法，其中，所述基因产物为细胞因子或其前体。
4.如权利要求1或2所述的基因产物的筛选方法，其中，所述基因产物为诱导型一氧化氮合酶（iNOS）。
5.如权利要求1所述的基因产物的筛选方法，其中，所述反义转录物存在的判断是如下进行的：通过使用含有与所述基因产物对应的mRNA的5’末端和3’末端或者它们附近的一部分的正义序列的引物，来进行从细胞内mRNA的逆转录，从而确认逆转录产物的有无。
6.如权利要求1或5所述的基因产物的筛选方法，其进一步包括将能够与反义转录物中所含的碱基序列杂交的寡核苷酸或其衍生物导入细胞内，从而观察所述基因产物产量的增减的工序。
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