JP2013165732A - 遺伝子産物のスクリーニング方法 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】遺伝子産物に対応するmRNAの3’非翻訳領域の塩基配列に相補的な配列を含むアンチセンス転写物が細胞内に存在するか否かを判定する工程を含む遺伝子産物のスクリーニング方法。前記アンチセンス転写物の存在の判定は、例えば、前記遺伝子産物に対応するmRNAの3’非翻訳領域のセンス配列を含むプライマーを用いて細胞内mRNAから逆転写を行ない、逆転写産物の有無を確認することにより行なわれる。
【選択図】なし
Description
1.細胞内における遺伝子産物の産生量を増大させる方法であって、前記遺伝子産物に対応するmRNAの塩基配列に相補的な配列を含む物質もしくはその前駆体またはそれらと同等の作用を細胞内において有し得る物質を細胞内に導入する工程を含むことを特徴とする前記遺伝子産物の産生量を増大させる方法。
2.前記遺伝子産物に対応するmRNAの塩基配列に相補的な配列を含む物質もしくはその前駆体またはそれらと同等の作用を細胞内において有し得る物質が、細胞内においてmRNAの安定化に寄与する物質である前記1に記載の遺伝子産物の産生量を増大させる方法。
3.前記遺伝子産物がサイトカインまたはその前駆体である前記1または2に記載の遺伝子産物の産生量を増大させる方法。
4.前記遺伝子産物が誘導型一酸化窒素合成酵素(iNOS)である前記1〜3のいずれかに記載の遺伝子産物の産生量を増大させる方法。
5.遺伝子産物に対応するmRNAの塩基配列に相補的な配列を含むアンチセンス転写物が細胞内に存在するか否かを判定する工程を含む前記1に記載の産生量増大方法が適用され得る遺伝子産物のスクリーニング方法。
6.前記アンチセンス転写物の存在の判定が、前記遺伝子産物に対応するmRNAの5’末端及び3’末端またはこれらの近傍の一部のセンス配列を含むプライマーを用いて細胞内mRNAから逆転写を行ない、逆転写産物の有無を確認することにより行なわれる前記5に記載の遺伝子産物のスクリーニング方法。
7.アンチセンス転写物に含まれる塩基配列にハイブリダイズ可能なオリゴヌクレオチドまたはその誘導体を細胞内に導入し、前記遺伝子産物の産生量の増減を観察する工程をさらに含む前記5または6に記載の遺伝子産物のスクリーニング方法。
8.サイトカインmRNAの全部または一部の配列と相補的な配列を含み、前記サイトカインの合成量を増大させる物質。
9.前記8に記載の物質を含むサイトカイン産生量制御剤。
10.誘導型一酸化窒素合成酵素(iNOS)mRNAの全部または一部の配列と相補的な配列を含み、誘導型一酸化窒素合成酵素(iNOS)の合成量を増大させる物質。
11.配列番号1またはこれと75%以上の相同性を有する塩基配列を含み、誘導型一酸化窒素合成酵素(iNOS)の合成量を増大させる物質。
12.誘導型一酸化窒素合成酵素(iNOS)mRNAの5’末端及び3’末端またはこれらの近傍の一部の配列を含むプライマーを用いて、細胞内mRNAから逆転写により誘導されたcDNAから得られる配列に対応する塩基配列を含み、誘導型一酸化窒素合成酵素(iNOS)の合成量を増大させるRNA。
13.前記10〜12のいずれかに記載の物質を含むiNOSmRNA発現制御剤。
また、本発明は、これらのアンチセンス転写物等を含むサイトカイン産生量制御剤、特にiNOS産生量制御剤にも及ぶ。
5’−GCCTCATACTTCCTCAGAGC−3’(配列番号36)
5’−TAGCTGCATTGTGTACAGAT−3’(配列番号37)
5’−GTGTATAATTCCTTGATGAA−3’(配列番号38)
これらは、化学合成、公知の発現法および精製法あるいは実施例に記載の方法によって調製することができる。
5’−G*C*C*TCATACTTCCTCAG*A*G*C−3’
5’−T*A*G*CTGCATTGTGTACA*G*A*T−3’
5’−G*T*G*TATAATTCCTTGAT*G*A*A−3’
(配列中、*はS化した部分を示す。)等が挙げられる。
実施例1:ラットiNOSアンチセンス転写物
以下の方法により、ラットiNOSのmRNAに対して、遺伝子のアンチセンス鎖から転写された「アンチセンス転写物」が存在するかどうか調べ、この「アンチセンス転写物」がセンス遺伝子産物の産生の制御にどのように関わっているかを調べた。なお、ラットiNOSのmRNAの塩基配列は、DDBJ/EMBL/GenBank 国際塩基配列データベース(http://www.ddbj.nig.ac.jp/、http://www.ebi.ac.uk/embl/、http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Genbank/)によって既知である。
5’−TGCCCCTCCCCCACATTCTCT−3’(配列番号2)
を用い、培地にIL−1βを添加してiNOS mRNAを誘導したラット初代培養肝細胞の全RNAに対してRT−PCRを行ないcDNAを合成した。
順方向:
5’−ACCAGGAGGCGCCATCCCGCTGC−3’(配列番号3)
逆方向:
5’−CTTGATCAAACACTCATTTTATTAAA−3’(配列番号4)
このバンドをゲルから切り出して精製し、塩基配列を決定したところ、上記のプライマー配列に挟まれた、ラットiNOSmRNAの3’UTRの配列に相補的な配列であることを確認した。すなわち、iNOS遺伝子のセンスプライマーを用いた鎖特異的RT−PCR法により、アンチセンス転写物の存在を証明した。
[5’側のcDNAの配列決定]
ラット初代培養肝細胞にIL−1βを添加して、iNOS mRNAを誘導し、Trizol試薬(インビトロジェン)でRNAを調製した。このRNAを鋳型とし、配列番号2のプライマー(iNOSのセンス(forward)プライマー;5’-TGCCCCTCCCCCACATTCTCT-3’)を使って二本鎖cDNAを合成した。このcDNAにCAカセットアダプター(cDNA PCR Library Kit(タカラバイオ(株))に添付)を連結した後、配列番号3のプライマー(iNOS mRNAの3’UTRに対するセンス(forward)プライマー)とCAプライマー(cDNA PCR Library Kit(タカラバイオ(株))に添付)を使ってPCRを行なった。反応液をアガロースゲル電気泳動したところ、約250bpのサイズのバンドが増幅していた。このバンドを切り出して、pGEM-T Easyベクター(プロメガ)にクローニングして、塩基配列を決定した。
[3’側のcDNAの配列決定]
上記と同様に、IL−1βで誘導したラット初代培養肝細胞からRNAを調製した。PolyATract mRNA Isolation System(プロメガ)を使って、PolyA-画分のRNAを精製し、このRNAを鋳型とし、アンカー配列(下線部)を付けたランダムプライマー(アンカーランダムプライマー;5’-TTCCCTCCCGTTTTCTCTGCCACTAGAATTCTCGAGCGGCCGCNNNNNNN-3’(配列番号5))を使って二本鎖cDNAを合成した。このcDNAにCAカセットアダプターを連結した後、配列番号4のプライマー(iNOS mRNAの3’UTRに対するアンチセンス(reverse)プライマー)とCAプライマーを使ってPCRを行なった。この反応液を精製して鋳型とし、iNOS mRNAの3’UTRに対するアンチセンス(reverse)プライマー(5’-ATATTAGAGCAGCGGGATGGCGCCTC-3’(配列番号6))とアンカープライマー(上記の「アンカーランダムプライマー」のアンカー配列に対するプライマー;5’-ACTAGAATTCTCGAGCGGCCGC-3’(配列番号7))を使って2次PCRを行なった。反応液をアガロースゲル電気泳動したところ、200〜500bpのサイズのバンドが増幅していた。このバンドを切り出して、pGEM-T Easyベクターにクローニングして、塩基配列を決定した。
この結果、アンチセンス転写物の全長はほぼ600塩基以上と推定された。以下にその配列を示した(配列番号1;但し、cDNA配列として示す。)。すなわち、アンチセンス転写物はiNOS mRNAの3’UTRに対応し、転写開始点(5’側)はiNOS mRNAのポリA付加部位の相補鎖にあった。
以下の方法により、ヒトiNOSのmRNAに対して、遺伝子のアンチセンス鎖から転写された「アンチセンス転写物」が存在するかどうか調べた。なお、ヒトiNOSのmRNAの塩基配列は、DDBJ/EMBL/GenBank 国際塩基配列データベース(http://www.ddbj.nig.ac.jp/、http://www.ebi.ac.uk/embl/、http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Genbank/)により既知である。
5’−CTGAGTGCACCACTTCAAGTGAC−3’(配列番号8)
を用い、逆転写を行ない、cDNAを合成した。具体的には、実施例1において、ラット初代培養肝細胞から調製したRNA1μgと配列番号2で表わされるプライマー2pmolの代わりに、ヒトの組織または細胞から調製した全RNA(1μg)と上記配列番号8で表わされる(2pmol)を用いた他は、同様の方法でcDNAを合成した。
順方向:
5’−CAGGAGGTGCTATCGCACCACT−3’(配列番号9)
逆方向:
5’−GCAATTCATGTAAATATCTCCATC−3’(配列番号10)
増幅したバンドをゲルから切り出して精製し、塩基配列を決定したところ、上記のプライマー配列に挟まれた、ヒトiNOSmRNAの3’UTRに相補的な配列であることを確認した。すなわち、iNOS遺伝子のセンスプライマーを用いた鎖特異的RT−PCR法により、ヒトiNOSアンチセンス転写物の存在を証明した。ヒトiNOSアンチセンス転写物の配列を配列番号11に示す。但し、cDNA配列として示す。
以下の方法により、マウスiNOSのmRNAに対して、遺伝子のアンチセンス鎖から転写された「アンチセンス転写物」が存在するかどうか調べた。なお、マウスiNOSのmRNAの塩基配列は、DDBJ/EMBL/GenBank 国際塩基配列データベース(http://www.ddbj.nig.ac.jp/、http://www.ebi.ac.uk/embl/、http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Genbank/)により既知である。
5’−CCTTCTTCTCCACTCCCCAGCT−3’(配列番号12)
を用い、逆転写を行ない、cDNAを合成した。具体的には、実施例1において、ラット初代培養肝細胞から調製したRNA1μgと配列番号2で表わされるプライマー2pmolの替わりに、RAW264細胞から調製した全RNA(1μg)と配列番号12で表わされる(2pmol)を用いた他は、同様の方法でcDNAを合成した。
順方向:
5’−GACCACCAGGAGGCACCATGCCG−3’(配列番号13)
逆方向:
5’−ATACAGGAAAGGCCCAAGCCATC−3’(配列番号14)
増幅したバンドをゲルから切り出して精製し、塩基配列を決定したところ、上記のプライマー配列に挟まれた、マウスiNOS mRNAの3’UTRに相補的な配列であることを確認した。すなわち、iNOS遺伝子のセンスプライマーを用いた鎖特異的RT−PCR法により、マウスiNOSアンチセンス転写物の存在を証明した。マウスiNOSアンチセンス転写物の配列を配列番号15に示す。但し、cDNA配列として示す。
実施例4:ラットiNOSアンチセンス転写物によるiNOSmRNAの安定化
ラットアンチセンスがiNOSmRNAを安定化しているかどうかを明らかにするために、ラットアンチセンスに相補的な配列を持ち、ラットアンチセンスにハイブリダイズする性質を持つiNOSのセンスオリゴヌクレオチド(以下、センスオリゴと略す)をラット初代培養肝細胞に導入しiNOSmRNA量を調べた。
センスオリゴはオリゴヌクレオチドにおけるホスホジエステル結合のリン酸の酸素原子の一つを硫黄原子に置換(S化)することによって、細胞内における核酸分解酵によるオリゴヌクレオチドの分解を防いだ。IBA社(Gottingen, Germany)のMagnet assisted transfection法による遺伝子導入試薬キット(MATra-A Reagent)により、S化センスオリゴをラット初代培養肝細胞に導入した。
肝細胞をIL−1βで刺激すると、iNOSmRNAの量が顕著に増加するが、上記のS化センスオリゴを導入してIL−1βで刺激して、RT−PCR法及びリアルタイムPCR法によるmRNA量の測定を行った。この結果を図1及び2に示す。
S2:5’−G*C*C*TCATACTTCCTCAG*A*G*C−3’
S4:5’−T*A*G*CTGCATTGTGTACA*G*A*T−3’
S5:5’−G*T*G*TATAATTCCTTGAT*G*A*A−3’
(S化した部分は*で示した。)
Scr2:5’−G*G*T*ATTGCCCACCCAAC*T*C*T−3’
Scr4:5’−G*G*C*TCCATATGATTAGA*T*G*T−3’
Scr5:5’−G*A*T*TGTTACTTAGAGAC*T*A*T−3’
これらのスクランブルオリゴもセンスオリゴと同様、細胞内での分解を防ぐために、S化して用いた。「スクランブルオリゴ」についてはラットゲノムとの相同性検索により、類似の配列が存在しないことを確認してある。
S1:5‘−C*A*T*TCTCTTTCCTTTGC*C*T*C−3’
(*は前記と同様の意味を表わす。)
以上の結果を併せると、iNOSのセンスオリゴはiNOSアンチセンス転写物と特異的にハイブリダイズしてiNOSmRNAの分解を促進して、その結果としてiNOSmRNAの量を特異的に減少させることが示された。
マウスアンチセンスにハイブリダイズする性質を持つiNOSセンスオリゴヌクレオチドのS化センスオリゴを、マウスマクロファージ由来のRAW264細胞に導入して、マウスアンチセンス転写物によるiNOSmRNAの発現抑制を調べた。
以下に記載しない操作は実施例4と同様の方法により行なった。マウスRAW264細胞を、ウェルあたり5×105細胞蒔き、DMEM培地を交換してCO2恒温器で培養した。
IBA社(Gottingen, Germany)のMagnet assisted transfection法によりS化センスオリゴを、RAW264細胞に導入した。10%ウシ胎児血清を含むDMEM培地(1ウェルあたり1.5ml)と交換してから、一晩、37℃に置いた。翌朝、大腸菌LPS(1μg/ml)を含むDMEMに培地交換し、4時間、37℃に置いた後、全RNAを抽出しRT−PCRに供した。なお、全RNAは、DNaseを含むTURBO DNA-free Kit(アプライドバイオシステムズ社)で処理し、混入するゲノムDNAを除去した。
センスオリゴは、マウスアンチセンス転写物に対応する、マウスiNOSmRNAに対して作製した。
S1:5’−G*A*A*GCACTTTGGGTGAC*C*A*C−3’
S2:5’−T*A*G*CTGCACTATGTACA*G*A*T−3’
S3:5’−C*A*G*ATATTTATACTTCA*T*A*T−3’
(S化した部分は*で示した。)
この結果、マウスiNOSmRNAの量が減少した。これは、S化センスオリゴが、iNOSのアンチセンス転写物とハイブリダイズして、アンチセンス転写物が分解または競合されたために、iNOSmRNAも分解されたことを示した(図3)。
実施例4及び5の結果から、ラットのみならず、マウスでもiNOSのセンスオリゴはiNOSアンチセンス転写物と特異的にハイブリダイズすることにより、iNOSmRNAの分解を促進して、その結果としてiNOSmRNAの量を特異的に減少させることが示された。
このように、ラット肝細胞でも、マウスの細胞でも、センスオリゴヌクレオチドを用いてiNOSmRNAの発現を抑制することができた。従って、センスオリゴヌクレオチドを用いたiNOSmRNAの発現抑制は、肝臓などの炎症時のiNOS誘導及びNO産生を軽減し、肝障害の有効な治療方法となるといえる。
炎症の時に誘導されて発現する遺伝子(いわゆる「初期応答遺伝子」)には、iNOSのみならず、サイトカインやケモカインなどの生理活性物質の遺伝子が含まれる。これらの初期応答遺伝子は炎症を増悪させたり、改善させたりするなど、多彩な働きを持っている。初期応答遺伝子の発現を調節することは、最終的には炎症を調節することにつながる。そこで、iNOS遺伝子のアンチセンス転写物以外にも、他の初期応答遺伝子においてもアンチセンス転写物が発現しているかどうかを調べた。次に、種間でよく保存されており、かつ複数のARE配列を含んでいる3’UTRの配列に対して、アンチセンス転写物が発現されていると予想した。そして、この部分に対して、逆転写用のセンスプライマーと、PCR用の1対のプライマーをデザインし、ラットのiNOS遺伝子でアンチセンス転写物を検出した実施例4と同様に、鎖特異的RT−PCR法を行なって、ラット肝細胞においてアンチセンス転写物が発現しているかどうかを調べた。
(a) Cytokine-Induced Neutrophil Chemoattractant 1(CINC−1):Chemokine (C-X-C motif) Ligand 1 (CXCL1)とも呼ばれ、IL-1βで刺激したラット肝細胞で誘導されるケモカインである。
(b) NF−κB p50:転写因子NF−κBのサブユニットの1つであり、炎症に深く関与しているタンパク質である。
(c) IκB−α:NF−κBの活性を抑制するタンパク質である。
なお、ヒト、マウス及びラットにおけるこれらのmRNAの塩基配列は、DDBJ/EMBL/GenBank国際塩基配列データベース(http://www.ddbj.nig.ac.jp/、http://www.ebi.ac.uk/embl/、http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Genbank/)により既知である。
以下の方法により、ラットCINC-1のmRNAに対して、遺伝子のアンチセンス鎖から転写された「アンチセンス転写物」が存在するかどうか調べた。以下に特に記載のない操作は実施例1と同様の方法で行なった。
初代培養ラット肝細胞をIL-1βで刺激してから、常法に従いTrizol試薬(インビトロジェン社)を用いて、全RNAを抽出した。得られた全RNAは、DNaseを含むTURBO DNA-free Kit(アプライドバイオシステムズ社)で処理し、混入するゲノムDNAを除去した。この全RNAを鋳型として、以下に示すラットCINC-1遺伝子のセンス鎖のプライマー:
5’−TGTCTGGTGAACGCTGGCTTCTGA−3’(配列番号16)
を用い、逆転写を行ない、cDNAを合成した。
順方向:
5’−TGTGGATGCGTTTCATCGATGGT−3’(配列番号17)
逆方向:
5’ −CTAGCACAGTGGTTGACACTTA−3’(配列番号18)
を用いて、実施例1と同様の方法のステップダウン法に従ってPCRを行なった。
以下の方法により、ラットNF-κB p50のmRNAに対して、遺伝子のアンチセンス鎖から転写された「アンチセンス転写物」が存在するかどうか調べた。以下に特に記載のない操作は実施例6と同様の方法で行なった。
初代培養ラット肝細胞をIL-1βで刺激してから、常法に従いTrizol試薬(インビトロジェン社)を用いて、全RNAを抽出した。得られた全RNAは、DNaseを含むTURBO DNA-free Kit(アプライドバイオシステムズ社)で処理し、混入するゲノムDNAを除去した。この全RNAを鋳型として、以下に示すラットNF-κB p50遺伝子のセンス鎖のプライマー:
5’−CTGTCATTAAGGTATCGCAGTCC−3’(配列番号20)
を用い、逆転写を行ない、cDNAを合成した。
順方向:
5’−CATCTACAGTACAGTCATGCACTC−3’(配列番号21)
逆方向:
5’−GGGAAAATACTATTTTCAGCACTGAT−3’(配列番号22)
を用いて、実施例1と同様の方法のステップダウン法に従ってPCRを行なった。
以下の方法により、ラットIκB-αのmRNAに対して、遺伝子のアンチセンス鎖から転写された「アンチセンス転写物」が存在するかどうか調べた。以下に特に記載のない操作は実施例6と同様の方法で行なった。
初代培養ラット肝細胞をIL-1βで刺激してから、常法に従いTrizol試薬(インビトロジェン社)を用いて、全RNAを抽出した。得られた全RNAは、DNaseを含むTURBO DNA-free Kit(アプライドバイオシステムズ社)で処理し、混入するゲノムDNAを除去した。この全RNAを鋳型として、以下に示すラットIκB-α遺伝子のセンス鎖のプライマー:
5’−TCCAGAATCTGATAAAAGGACCAC−3’(配列番号24)
を用い、逆転写を行ない、cDNAを合成した。
順方向:
5’−TGAACCGCCATAGACTGTAGCTG−3’(配列番号25)
逆方向:
5’−GCACATACCACTGAACACCTGGT−3’(配列番号26)
を用いて、実施例1と同様の方法のステップダウン法に従ってPCRを行なった。
炎症の時に発現する初期応答遺伝子として、iNOS以外の代表的な3つの遺伝子(CINC-1、NF-κB p50、IκB-α)を選んだが、いずれにおいても3’UTRに複数のARE配列を含み、かつ種間(ヒト、マウス、ラット)で3’UTRの配列がよく似ている。iNOSと同様に、この3遺伝子においてもアンチセンス転写物が発現していることが確認された。
実施例1及び実施例4の結果より、ラット初代培養肝細胞(in vitro)の系において、iNOS誘導時にiNOSmRNAの3’−非翻訳領域(3’UTR)に対応するアンチセンス転写物が発現し、iNOSmRNAの安定化を促進することを示した。肝障害ラット(in vivo)においてもiNOS誘導に呼応して、iNOSアンチセンス転写物が発現することを以下に示す。さらに、Insulin-like growth factor-I(IGF-I)やNa+/H+ exchanger 阻害剤(FR183998)などの肝臓保護剤の投与による生存率の変化と炎症性サイトカイン、iNOSmRNA、及びアンチセンス転写物の誘導との関係を以下に示す。
(I) 急性肝不全モデルの作製と肝臓保護剤の投与
雄Sprague-Dawleyラット(250−300 g)に、D−ガラクトサミン(D-galactosamine)(400 g/kg)と細菌エンドトキシンであるLPS(16 μg/kg)との混合液(D-GalN/LPS)を静注し、急性肝不全モデルを調製した。Insulin-like growth factor-I(IGF-I;3.2 mg/kg)あるいはNa+/H+ exchanger 阻害剤(FR183998; 1 mg/kg)をD-GalN/LPS処理の30分前に投与した。血中及び肝臓の炎症性サイトカイン(TNF-α, IL-1β, IL-6, インターフェロンγ, CINC-1)、MIP-2及び一酸化窒素(NO)を測定した。肝臓より全RNAを調製し、iNOSmRNA及びiNOSアンチセンス転写物をRT−PCRで検討した。
D−ガラクトサミンとLPS混合液の静注後、3または6時間後に、ラットの肝臓を取り出して、常法に従いTrizol試薬(インビトロジェン社)を用いて、全RNAを抽出した。
この全RNAを鋳型として、オリゴdTプライマーを用いて、逆転写を行ない、次に実施例1等と同様の方法でPCR(RT−PCR法)を行なった。iNOSmRNAや、内部標準となるelongation factor-1α(EFl)mRNAの定量には、逆転写のときオリゴdTプライマーを用い、PCRのときには
iNOSmRNA:
CCAACCTGCAGGTCTTCGATG(配列番号28)及び
GTCGATGCACAACTGGGTGAAC(配列番号29);及び
EFmRNA:
TCTGGTTGGAATGGTGACAACATGC(配列番号30)及び
CCAGGAAGAGCTTCACTCAAAGCTT(配列番号31)
を用いた。なお、PCR反応液にはanti-Taq high(=抗Taqポリメラーゼ抗体,東洋紡)を添加した。
また、iNOSアンチセンス転写物の定量は、実施例1の方法に従った。なお、逆転写を行なわずにPCRを行なった対照を置き、肝細胞の全RNAに混入したゲノムが、PCRによって増幅しないことを確認した。iNOSmRNA検出結果を図4に示し、iNOSアンチセンス転写物の検出結果を図5に示す。図中、RT(−)は逆転写(−)の陰性対照を示す。
逆転写して合成したcDNAは、日本バイオラド社のiCycler Systemを用いて、リアルタイムPCRによっても定量を行なった。PCR反応液にSYBR Green I(ロシュ・ダイアグノスティクス社)及びanti-Taq high(=抗Taqポリメラーゼ抗体,東洋紡)を添加して、公知の方法であるタッチダウン法でPCRを行なった。実際のPCRプロトコールは次の通りである。
1サイクル(94℃, 1 min)、
50サイクル(94℃, 30 sec; (72−0.3×n) ℃, 1 min; 72℃, 30 sec);nはサイクル数。結果を図6に示す。図中、「*」は「p<0.05 vs. GalN/LPSラット(n= 3-6ラット/グループ)」を示す。
肝臓保護剤を投与しなかった場合、D-GalN/LPSの静注後、約24時間でほとんどの動物(90%以上)が死亡した。血中及び肝臓に、経時的(1〜12時間)に炎症性メディエイター(TNF-α, IL-1β, IL-6, インターフェロンγ, CINC-1, MIP-2, NO)が増加した。肝臓のiNOSmRNA誘導に呼応してアンチセンス転写物が増加を示し(iNOSmRNA及びiNOSアンチセンス転写物とも6時間後に最大)、その結果過剰なNO産生が認められた。
IGF-Iの投与により死亡率は20〜30%以下に減少した。そして、上述の炎症性サイトカイン、NO産生に加えてiNOSmRNA及びアンチセンス転写物誘導の増加が同様に抑制された(図4〜6)。
FR183998の投与によっても死亡率は20〜30%以下に減少し、上述の炎症性サイトカイン、NO産生に加えてiNOSmRNA及びアンチセンス転写物誘導の増加が同様に抑制された(図7〜9)。
(IV-1) ラット急性肝不全モデルにおける肝臓保護剤IGF-IのiNOSmRNA及びアンチセンス転写物の発現誘導への効果
図4の結果より、D−ガラクトサミサンとLPSを投与したラット;GalN/LPSラットは、は3〜6時間でiNOSmRNAレベルが増加したが、IGF-Iを投与したラットはこの増加が抑制された。
図5及び6の結果より、RT(−)ではほとんど増幅したcDNAが見られないことから、全RNAに混入したゲノムDNAは極めて微量であると考えられる。GalN/LPSラットは3〜6時間でアンチセンス転写物レベルが増加したが、IGF-Iを投与したラットはこの増加が抑制された。
(IV-2) ラット急性肝不全モデルにおける肝臓保護剤FR183998のiNOSmRNA及びアンチセンス転写物の発現誘導への効果
図7の結果より、GalN/LPSラットは3〜6時間でiNOSmRNAレベルが増加したが、FR183998を投与したラットはこの増加が抑制された。
図8及び9の結果より、RT(−)ではほとんど増幅したcDNAが見られないことから、全RNAに混入したゲノムDNAは極めて微量であると考えられる。GalN/LPSラットは3〜6時間でアンチセンス転写物レベルが増加したが、FR183998を投与したラットはこの増加が抑制された。
実施例10
実施例4と同様の方法で、実施例4において得られたセンスオリゴS5またはスクランブルオリゴScr5を肝細胞に導入し、培地中の一酸化窒素(NO)量をNitric Oxide Colorimetric Assay kits (ロシュ・ダイアグノスティクス社)で測定した。ただし、翌朝、1nMのIL-1βを含むWEに培地交換し、8〜10時間、37℃に置いた後、測定した。また、細胞から全タンパク質を抽出して、ECLキット(GEヘルスケア社)を用いたウェスタン法でiNOSタンパク質を検出した。結果を図10に示す。
その結果、ラット肝細胞にセンスオリゴS5を導入することで、iNOSタンパク質及び培地中の一酸化窒素(NO)量が減少することが示された。
実施例11
IL-1βで刺激したラット肝細胞において、iNOS遺伝子のアンチセンス転写物が存在することを、Northern blot analysis (以下、ノーザン法と略す)で確認した。
(I) RNAの調製
ラット肝細胞を一定時間、IL-1βで刺激してから、Trizol試薬(インビトロジェン社)を用いて、全RNAを抽出した。得られた全RNAは、DNaseを含むTURBO DNA-free Kit(アプライドバイオシステムズ社)で処理し、混入するゲノムDNAを除去した。Poly(A)+とpoly(A)- RNAは、PolyATract mRNA Isolation System(プロメガ社)で分画した。非特異的なハイブリダイゼーションを防ぐため、リボゾームRNA(rRNA)を、終濃度5%ポリエチレングリコール6000及び終濃度0.75M NaCl存在下で沈澱させて除き、上清をエタノール沈澱により回収して電気泳動に用いた。
上記のRNA、すなわち無刺激ラット肝細胞の全RNA、IL-1β刺激ラット肝細胞の全RNA、IL-1β刺激ラット肝細胞のPoly(A)+ RNA、及びIL-1β刺激ラット肝細胞のPoly(A)- RNAの4つを、2.2Mホルマリン含有アガロースで電気泳動を行ない、分離した。
常法に従い、ゲル中のRNAをNytran Nフィルター(ワットマン社)に移した。次に、DIG EasyHybバッファー(ロシュダイアグノスティクス社)中で、ディゴキシゲニン(DIG)標識したiNOSの3’UTRのセンスプローブと、73℃で一晩、ハイブリダイゼーションを行なった。翌朝、ロシュダイアグノスティクス社のマニュアルに従って、フィルターを洗った。なお、iNOSの3’UTRのセンスプローブは、DIG-11-UTP(ロシュダイアグノスティクス社)とT3 RNAポリメラーゼ(ストラタジーン社)を用いて、試験管内でRNAを合成することによって作製した。
ロシュダイアグノスティクス社のマニュアルに従って、ブロッキングを行ない、アルカリフォスファターゼと結合した抗DIG抗体(ロシュダイアグノスティクス社)とインキュベートした。洗浄後、基質であるCDP-Star(アプライドバイオシステムズ社)と反応させ、エックス線フィルムで、iNOSセンスプローブとハイブリダイズするRNAのバンドを検出した。
上記4種のRNAのノーザン法による解析結果(エックス線フィルムのオートラジオグラム)を図11に示す。
「IL-1β刺激ラット肝細胞の全RNA」と「IL-1β刺激ラット肝細胞のPoly(A)-RNA」では、600〜1000ヌクレオチド(nt)のスメア状の濃いバンドが観察された。iNOSの3’UTRのセンスプローブを用いているので、これらのスメア状バンドは、iNOSのアンチセンス転写物のバンドと考えられる。従って、iNOSのアンチセンス転写物の長さは一定ではなく、さまざまな長さ(600〜1000ヌクレオチド)の転写物の集合であることがわかった。
実施例12
ラット肝細胞において、iNOS遺伝子のアンチセンス転写物を過剰発現させると、iNOSの3’UTRを介してmRNAが安定化されることを確認した。
ふつうのレポーターの場合、iNOS遺伝子のプロモーターにルシフェラーゼ遺伝子を結合する。iNOS遺伝子のプロモーターは「誘導型プロモーター」であるため、ラット肝細胞においてはIL-1β刺激により、プロモーター活性が大きく変化してしまい、レポーター遺伝子の後に結合した3’UTRの働きがよく観察できない。そこで、刺激にかかわらず、一定量の発現を促す「構成的プロモーター」である、elongation factor-1α(EF)遺伝子のプロモーターを用いることにした。従って、EFプロモーターでコントロールされるルシフェラーゼ遺伝子やβガラクトシダーゼ遺伝子は、刺激にかかわらず、ほぼ一定量で発現する。これにより、ポリ(A)シグナル配列を含むiNOSmRNAの3’UTRが、ルシフェラーゼmRNAの安定性に与える影響のみを観察することができる。
(i)レポーター(ルシフェラーゼベクター):
EFプロモーター + ルシフェラーゼ遺伝子(Luc)+ iNOS 3’UTR
EFプロモーター+ルシフェラーゼ遺伝子(Luc)+ SVpA
(ルシフェラーゼmRNAが構成的に発現するが、ルシフェラーゼ遺伝子の後の部分でmRNAの安定性を制御されうる)
(ii)iNOSアンチセンス転写物発現ベクター:
CMVプロモーター + iNOS 3’UTRを逆方向に挿入 + SVpA
(iNOSアンチセンス転写物が、細胞内で過剰に発現する)
(iii)内部標準(βガラクトシダーゼベクター):
EFプロモーター + βガラクトシダーゼ(lacZ)遺伝子 + SVpA
(βガラクトシダーゼmRNAが構成的に発現する)
なお、SVpAとは、SV40ウイルス由来のポリ(A)シグナルの配列で、安定な3’UTRとして知られており、SVpAの付加されたmRNAは壊れにくい。iNOS 3’UTRの対照である。CMVプロモーターとは、サイトメガロウイルス由来で、EFプロモーターよりはるかに強い構成的プロモーターである。
(I) トランスフェクション
初代培養ラット肝細胞に、前述の方法(MATra)により以下のプラスミドを導入した。
(i)レポーター(400 ng/ウェル)、
±(ii)iNOSアンチセンス転写物発現ベクター(50 ng/ウェル)、
(iii)内部標準(400 ng/ウェル)。
iNOSアンチセンス転写物発現ベクターを入れたものはAS(+)、入れないものは
AS(−)とした。
トランスフェクションして、一晩経った肝細胞の培地を交換した後、経時的に全RNAを抽出した。常法に従いTrizol試薬(インビトロジェン社)を用いて行なった。得られた全RNAは、DNaseを含むTURBO DNA-free Kit(アプライドバイオシステムズ社)で処理し、混入するゲノムDNAを除去した。この全RNAを鋳型として、オリゴ(dT)プライマーを用いて逆転写を行ない、mRNAに対するcDNAを合成した。
合成したcDNAを用いて、リアルタイムPCRによって定量を行なった。日本バイオラド社のiCyclerシステムを用いた。PCR反応液にSYBR Green I (ロシュ・ダイアグノスティクス社) 及びanti-Taq high(=抗Taqポリメラーゼ抗体。東洋紡)を添加して、公知の方法であるタッチダウン法でPCRを行なった。実際のPCRプロトコールは次の通りである。
1サイクル (94℃, 1 min)、
50サイクル (94℃, 30 sec; (72 - 0.3×n)℃, 1 min; 72℃, 30 sec)(nはサイクル数)。
レポーターであるルシフェラーゼ(Luc)のmRNAのPCRに用いたプライマーは次の2種類である。
順方向:
5’−GCGAAGGTTGTGGATCTGGATAC−3’(配列番号32)
逆方向:
5’−GAGCCACCTGATAGCCTTTGTAC−3’(配列番号33)
内部標準であるβガラクトシダーゼ(βGal)のmRNAのPCRに用いたプライマーは次の2種類である。
順方向:
5’−GTCACACTACGTCTGAACGTCGA−3’(配列番号34)
逆方向:
5’−TGCAGAGGATGATGCTCGTGACG−3’(配列番号35)
リアルタイムPCRを行なった後、iCyclerシステムの解析ソフトウェアを用いて、ルシフェラーゼmRNA(Luc)とβガラクトシダーゼmRNA(βGal)のthreshold cycle(Ct)値を求めた後、除して、Luc/βGal値を求めた。
iNOSアンチセンス転写物発現ベクターを加えた場合と加えない場合について、Luc/βGal値を経時的に示した。結果を図14に示す。
(i)レポーター(EFプロモーター + Luc + iNOS 3’UTR)、
±(ii)iNOSアンチセンス転写物発現ベクター、
(iii)内部標準。
この場合、iNOSアンチセンス転写物発現ベクターを加えたときAS(+)、加えないときAS(−)に比べると、有意にLuc/βGal値が増加した。図中、「**」は「p<0.01 versus AS(-)」を表わす。
すなわち、iNOSアンチセンス転写物はiNOS 3’UTRを介して、ルシフェラーゼmRNAが安定化させた。
対照として、SVpAを連結したレポーターを用いた結果を図15に示す。
(i)レポーター(EFプロモーター + Luc + SVpA)、
±(ii)iNOSアンチセンス転写物発現ベクター、
(iii)内部標準。
この場合、iNOSアンチセンス転写物発現ベクターを加えると[AS(+)]、加えないとき[AS(−)]に比べて、Luc/βGal値は増加しなかった。すなわち、SVpAではmRNAの安定性に影響を与えなかった。
以上の結果(iNOSアンチセンス転写物の過剰発現実験)より、iNOSアンチセンス転写物には、iNOS 3’UTRに働きかけてmRNAを安定化させるという作用を有すると考えられる。S化センスオリゴヌクレオチドによるiNOSmRNAのノックダウン実験の結果と併せると、iNOSアンチセンス転写物が、iNOS 3’UTRを介して、iNOSmRNAを安定化させていることがいえる。
従って、iNOSアンチセンス転写物によるiNOSmRNAを安定性の制御機構は、肝臓などの炎症の際に重要な働きを果たしていることが強く示唆される。また、この機構はNOが関与している多くの疾病の治療のターゲットになり得る。
Claims (5)
- 遺伝子産物に対応するmRNAの3’非翻訳領域の塩基配列に相補的な配列を含むアンチセンス転写物が細胞内に存在するか否かを判定する工程を含む遺伝子産物のスクリーニング方法。
- 遺伝子産物に対応するmRNAの3’非翻訳領域の塩基配列に相補的な配列を含むアンチセンス転写物が細胞内に存在する場合において、前記アンチセンス転写物に含まれる塩基配列にハイブリダイズ可能なオリゴヌクレオチドまたはその誘導体を細胞内に導入し、前記遺伝子産物の産生量の増減を観察する工程を含む遺伝子産物のスクリーニング方法。
- 前記アンチセンス転写物の存在の判定が、前記遺伝子産物に対応するmRNAの3’非翻訳領域のセンス配列を含むプライマーを用いて細胞内mRNAから逆転写を行ない、逆転写産物の有無を確認することにより行なわれる請求項1に記載の遺伝子産物のスクリーニング方法。
- 前記遺伝子産物がサイトカインまたはその前駆体である請求項1〜3のいずれか1項に記載の遺伝子産物のスクリーニング方法。
- 前記遺伝子産物が誘導型一酸化窒素合成酵素(iNOS)である請求項1〜4のいずれか1項に記載の遺伝子産物のスクリーニング方法。
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