WO2009148137A1 - 肥満細胞の脱顆粒を制御する核酸 - Google Patents

肥満細胞の脱顆粒を制御する核酸 Download PDF

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WO2009148137A1
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nucleic acid
microrna
degranulation
mast cells
base sequence
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恭子 小坂
陽史 山田
和美 三浦
達也 宮澤
哲郎 吉田
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協和発酵キリン株式会社
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    • C12N2330/00—Production
    • C12N2330/10—Production naturally occurring

Definitions

  • the present invention relates to a degranulation control agent for mast cells, a diagnostic or therapeutic agent for diseases caused by abnormal degranulation control of mast cells, a method for controlling degranulation of mast cells, and a screening method for a degranulation control agent for mast cells. .
  • MicroRNA which is a kind of nucleic acid, is a small non-coding single-stranded RNA consisting of about 22 nucleotides that are not translated into protein, and is known to exist in many organisms including humans (Non-patent Document 1). 2). MicroRNAs are generated from genes that are transcribed into single or clustered microRNA precursors. That is, the primary transcript, primary-microRNA (pri-miRNA), is first transcribed from the gene, and then in a stepwise process from pri-miRNA to mature microRNA, a precursor of about 70 bases with a characteristic hairpin structure. -microRNA (pre-miRNA) is generated from pri-miRNA. Furthermore, mature microRNA is generated from pre-miRNA by Dicer-mediated processing (Non-patent Document 3).
  • Mature microRNAs are thought to be involved in post-transcriptional control of gene expression by binding complementarily to the target mRNA and suppressing translation of the mRNA, or by degrading the mRNA.
  • the mechanism by which microRNA suppresses the expression of target mRNA is not completely clarified, an outline has been elucidated by recent studies.
  • MicroRNA binds to a partially complementary sequence in the 3 'terminal untranslated region (3'UTR) of the target mRNA, suppresses its translation, or suppresses expression by degrading the target mRNA To do.
  • 3'UTR 3 'terminal untranslated region
  • Non-patent Document 4 Is sometimes referred to as a “seed sequence” (Non-patent Document 4). It has been shown that microRNAs with a common seed sequence suppress the expression of a common target mRNA even if other sequences are different. Therefore, RNA having microRNA-like activity can be designed by using a sequence complementary to the sequence present at the 3′-end of any mRNA as a seed sequence. Unlike siRNA, microRNA usually refers only to RNA that is naturally present in a cell. Therefore, a microRNA-like sequence designed in this way may be particularly referred to as artificial microRNA.
  • Non-patent Document 5 the microRNA database miRBase (http://microrna.sanger.ac.uk/) contains 533 human and 5,071 microRNAs for all living species.
  • miR-181 Non-patent Document 5
  • miR-375 involved in insulin secretion
  • Non-Patent Documents 8 to 10 Mediators include a wide variety of amines, arachidonic acid metabolites, proteases, cytokines, and chemokines.
  • Non-patent document 12 For example, sodium cromoglycate, used as an inhibitor of inflammatory mediator release, markedly suppressed IgE-dependent release of inflammatory mediators in rat peritoneal mast cells, but was not strongly effective against human mast cells.
  • Azelastine hydrochloride suppressed histamine, PGD2, and LT release from human cultured mast cells, and production of GM-CSF and MIP-1 ⁇ at high concentrations, but none of the activities were strong.
  • suplatast tosylate used as an anti-cytokine drug showed an inhibitory action on inflammatory mediator release on rat mast cells, but no action on human mast cells (Non-patent Document 12).
  • Genes expressed in mast cells are important in that they can be targets for therapeutic agents for various allergic diseases.
  • agents acting on GPCR expressed in mast cells are inflammatory mediators from cultured human mast cells. It is known to significantly suppress the production of.
  • the ⁇ 2 adrenergic receptor agonist isoproterenol has a low concentration of 10 nmol / l and suppresses the release of histamine, LT, PGD2, GM-CSF and MIP-1 ⁇ from human cultured mast cells by 80% or more. (Non-Patent Document 13).
  • Non-Patent Document 6-Nature, 432, 226-230 (2004) Non-Patent Document 7-Nature Reviews Cancer, 6, 259-269 (2006)
  • Non-Patent Document 11-Blood 98, 1127-1134 (2001)
  • Non-Patent Document 12-Clin. Exp. Allergy, 28, 1228-1236 (1998)
  • Non-Patent Document 14-Blood 100, 3861-3868 (2002)
  • New therapeutics and diagnostics will be developed by identifying microRNAs and their precursors expressed in various human organs, analyzing their functions, and elucidating their relationship with diseases. There is expected.
  • nucleic acids such as microRNA acting on mast cells and their precursors is the differentiation and degranulation in mast cells, differentiation and degranulation of mast cells producing inflammatory mediators, cytokine production, chemokines It leads to elucidation of functions such as production, and development of mast cell isolation, culture, differentiation control, degranulation control, inflammatory mediator production control, cytokine production control, chemokine production control method and treatment of new allergic diseases using them It can be expected to lead to the law.
  • An object of the present invention is to provide a mast cell degranulation control agent using a nucleic acid or the like, a diagnostic or therapeutic agent for a disease caused by mast cell degranulation control, a mast cell degranulation control method, a mast cell degranulation control It is in providing the screening method of an agent.
  • a mast cell degranulation regulator comprising any of the following nucleic acids (a) to (h) as an active ingredient.
  • Nucleic acid comprising a base sequence represented by any of SEQ ID NOs: 1 to 1543 and 3372 to 3741
  • a nucleic acid consisting of a base sequence having at least 90% identity to the nucleic acid of 17 to 28 bases
  • SEQ ID NO: 1 to 1543 and 3372 to 3741 (d) A nucleic acid that hybridizes under stringent conditions with a complementary strand of a nucleic acid comprising the nucleotide sequence represented by any one of 1543 and 3372 to 3741
  • Nucleic acid containing the second to eighth base sequences (f) Nucleic acid containing the second to
  • a mast cell degranulation regulator comprising, as an active ingredient, a nucleic acid comprising a base sequence complementary to the base sequence of the nucleic acid described in (1).
  • a mast cell degranulation control agent comprising, as an active ingredient, a double-stranded nucleic acid comprising the nucleic acid according to (1) and a nucleic acid having a base sequence complementary to the base sequence of the nucleic acid.
  • a mast cell degranulation regulator comprising as an active ingredient the nucleic acid according to any one of (1) to (3) or the vector expressing the double-stranded nucleic acid according to (4).
  • a mast cell degranulation regulator comprising a substance that controls the expression or function of the nucleic acid according to (1) as an active ingredient.
  • a mast cell degranulation regulator comprising, as an active ingredient, a substance that suppresses the expression of the target gene of the nucleic acid according to (1).
  • the agent for controlling degranulation of mast cells according to (8), wherein the substance that suppresses the expression of the target sequence of nucleic acid is siRNA or antisense oligonucleotide.
  • a diagnostic or therapeutic agent for a disease caused by an abnormality in mast cells comprising the above substance as an active ingredient.
  • a diagnostic agent for diseases caused by abnormalities in mast cells which contains, as an active ingredient, a reagent for detecting the expression level of the nucleic acid, the mutation of the nucleic acid, or the mutation of the genome encoding the nucleic acid.
  • the diagnostic agent according to (10) or (11), wherein the disease caused by abnormal mast cells is a disease selected from the group consisting of atopic dermatitis, asthma, chronic obstructive pulmonary disease and allergic disease; Therapeutic drugs.
  • a method for treating a disease caused by abnormal mast cells comprising administering an effective amount of the degranulation inhibitor according to any one of (1) to (9) to a subject in need thereof.
  • the treatment method according to (13), wherein the disease caused by the abnormality of mast cells is a disease selected from the group consisting of atopic dermatitis, asthma, chronic obstructive pulmonary disease, and allergic disease.
  • the degranulation inhibitor according to any one of (1) to (9) for the manufacture of a therapeutic agent for a disease caused by abnormality of mast cells.
  • the disease caused by abnormality of mast cells is a disease selected from the group consisting of atopic dermatitis, asthma, chronic obstructive pulmonary disease and allergic disease.
  • the nucleic acid according to any one of (1) to (3), the double-stranded nucleic acid according to (4), the vector according to (5), or any one of (6) to (9) A method for controlling degranulation of mast cells, characterized by using the substance.
  • a screening method for a degranulation regulator of mast cells using as an index the promotion or suppression of the expression or function of the nucleic acid according to (1).
  • an agent for controlling degranulation of mast cells using a nucleic acid or the like, a diagnostic or therapeutic agent for a disease caused by degranulation control of mast cells, a method for controlling degranulation of mast cells, a degranulation control agent for mast cells A screening method can be provided.
  • the nucleic acid used in the present invention may be any molecule as long as nucleotides and molecules having functions equivalent to the nucleotides are polymerized, such as RNA that is a ribonucleotide polymer, DNA that is a deoxyribonucleotide polymer. , A polymer in which RNA and DNA are mixed, and a nucleotide polymer containing a nucleotide analog, and may be a nucleotide polymer containing a nucleic acid derivative.
  • the nucleic acid may be a single stranded nucleic acid or a double stranded nucleic acid.
  • the double-stranded nucleic acid also includes a double-stranded nucleic acid in which one strand is hybridized under stringent conditions to the other strand.
  • Nucleotide analogs include ribonucleic acid to improve or stabilize nuclease resistance, to increase affinity with complementary strand nucleic acids, to increase cell permeability, or to be visualized compared to RNA or DNA. Any molecule may be used as long as the molecule is a modification of nucleotide, deoxyribonucleotide, RNA or DNA. Examples thereof include sugar moiety-modified nucleotide analogs and phosphodiester bond-modified nucleotide analogs.
  • the sugar moiety-modified nucleotide analog may be any one obtained by adding or substituting any chemical structural substance to a part or all of the chemical structure of the sugar of the nucleotide.
  • any chemical structural substance for example, 2'-O-methyl Nucleotide analogues substituted with ribose, nucleotide analogues substituted with 2'-O-propylribose, nucleotide analogues substituted with 2'-methoxyethoxyribose, substituted with 2'-O-methoxyethylribose Nucleotide analogues, nucleotide analogues substituted with 2'-O- [2- (guanidinium) ethyl] ribose, nucleotide analogues substituted with 2'-O-fluororibose, introducing a bridging structure into the sugar moiety
  • BNA bridged structure type nucleic acid
  • the phosphodiester bond-modified nucleotide analog may be any one obtained by adding or substituting an arbitrary chemical substance to a part or all of the chemical structure of a phosphodiester bond of a nucleotide.
  • Examples include nucleotide analogs substituted with thioate linkages, nucleotide analogues substituted with N3'-P5 'phosphoramidate linkages (Cell engineering, 16, 1463-1473 (1997)) (RNAi method) And Antisense, Kodansha (2005)).
  • nucleic acid derivative in order to improve nuclease resistance, to stabilize, to increase affinity with a complementary strand nucleic acid, to increase cell permeability or to be visualized as compared with a nucleic acid, a different chemical is used.
  • examples include molecules with added substances. Examples include 5′-polyamine addition derivatives, cholesterol addition derivatives, steroid addition derivatives, bile acid addition derivatives, vitamin addition derivatives, Cy5 addition derivatives, Cy3 addition derivatives, 6-FAM addition derivatives, biotin addition derivatives, and the like.
  • nucleic acid used in the present invention examples include nucleic acids represented by the following (a) to (k).
  • Nucleic acid comprising a base sequence represented by any of SEQ ID NOs: 1 to 1543 and 3372 to 3741 (b) Nucleic acid comprising a base sequence represented by any of SEQ ID NOs: 1 to 1543 and 3372 to 3741 A nucleic acid comprising a nucleic acid sequence having a nucleotide sequence of 90% or more (d) SEQ ID NO: 1 A nucleic acid that hybridizes under stringent conditions with a complementary strand of a nucleic acid comprising the base sequence represented by any one of ⁇ 1543 and 3372 to 3741 (e) represented by any one of SEQ ID NOs: 1 to 1543 and 3372 to 3741 Nucleic acid comprising nucleic acids (f) (a) to (e) containing the second to eighth base sequences of the base sequence, and a nucleus comprising a base sequence complementary to the base sequence of the nucle
  • microRNA refers to single-stranded RNA having a length of 17 to 28 bases.
  • the surrounding genomic sequence containing the microRNA sequence has a sequence that can form a hairpin structure, and the microRNA can be excised from either strand of the hairpin.
  • MicroRNAs complementarily bind to their target mRNA and suppress mRNA translation, or promote post-transcriptional control of gene expression by promoting mRNA degradation.
  • microRNA used in the present invention examples include human microRNA having a base sequence represented by any of SEQ ID NOs: 1-150 and 3372-3406. Furthermore, as a microRNA having the same function as the human microRNA comprising the base sequence represented by any of SEQ ID NOs: 1-150 and 3372-3406, SEQ ID NOs: 151-1237 and 3407, which are orthologs of the human microRNA. A nucleic acid having a base sequence represented by any one of ⁇ 3684 can be mentioned. As a specific example, orthologs of the human microRNA of SEQ ID NO: 1 include those consisting of base sequences represented by SEQ ID NOs: 151 to 173 and 3407.
  • SEQ ID NOS: 1238 to 1543 and 385 to 3741 are microRNAs having the same nucleotide sequence at the 5 'end side 2-8 as the microRNA having the nucleotide sequence represented by any of SEQ ID NOS: 1-150 and 3372-3406
  • the nucleic acid which consists of a base sequence represented by can be mention
  • the microRNA for the microRNA of SEQ ID NO: 1, a microRNA having a base sequence represented by any of SEQ ID NOS: 1238 to 1286 can be mentioned.
  • Tables 2-1 to 2-8 show correspondence tables of microRNAs having the base sequences represented by SEQ ID NOs: 1 to 150 and 3372 to 3406 and microRNAs having the same base sequence on the 2 ′ to 8th side of the 5 ′ end. Shown in MicroRNAs having a common seed sequence are considered to have the same function because their target base sequences are considered identical.
  • a microRNA precursor is also preferably used.
  • the microRNA precursor is a nucleic acid having a length of about 50 to about 200 bases, more preferably about 70 to about 100 bases, including the nucleic acid used in the present invention, and can form a hairpin structure.
  • MicroRNA is produced from a microRNA precursor through processing by a protein called Dicer.
  • microRNA precursor used in the present invention for example, for the human microRNA of SEQ ID NO: 1, a nucleic acid having a base sequence represented by SEQ ID NOs: 1544 to 1545 can be mentioned.
  • SEQ ID NOs: 2 to 1543 and 3372 to 3741 nucleic acids having the base sequences represented by SEQ ID NOs: 1546 to 3371 and 3742 to 4147 can be mentioned.
  • Tables 3-1 to 3-39 show correspondence tables between microRNAs and microRNA precursors used in the present invention.
  • a nucleic acid having 90% or more identity with the base sequence represented by any of SEQ ID NOs: 1 to 4147 is BLAST (J. Mol. Biol., 215, 403 (1990)) or FASTA ( When calculated using an analysis software such as Methods in Enzymology, 183, 63 (1990)), the nucleic acid consisting of the nucleotide sequence represented by any of SEQ ID NOs: 1 to 3371 and at least 90% or more, preferably 93% More preferably, it means 95% or more, more preferably 96% or more, particularly preferably 97% or more, and most preferably 98% or more.
  • the stringent conditions in the above are 7.5 mL, 1M Na 2 HPO 4 (pH 7.2) 0.6 mL, 10% SDS 21 mL, 50x Denhardt's solution 0.6 mL, 10 mg for the membrane blotted on one strand.
  • the condition is such that the signal can be detected by washing, and further washing with 1 ⁇ SSC / 1% SDS solution at 50 ° C. for 10 minutes, and then removing the membrane and exposing it to an X-ray film.
  • any method may be used as long as it can detect the presence of nucleic acid such as microRNA or microRNA precursor in a sample.
  • any method may be used as long as it can detect the presence of nucleic acid such as microRNA or microRNA precursor in a sample.
  • Northern hybridization (2) dot blot hybridization, (3) in situ hybridization, (4) quantitative PCR, (5) differential hybridization, (6) microarray, (7) ribonuclease protection Assay and the like.
  • nucleic acid such as microRNA or microRNA precursor in the sample
  • Any method can be used as long as it can detect a mutation in the base sequence of, for example, a heteroduplex formed by hybridization of a nucleic acid having a non-mutated base sequence and a nucleic acid having a mutant base sequence.
  • the method include a method for directly determining a base sequence derived from a specimen and detecting the presence or absence of a mutation.
  • the microRNA used in the present invention is complementary to a continuous 7-base sequence present in a gene (target gene) having a target base sequence of the microRNA represented by any one of SEQ ID NOs: 1 to 1543 and 3372 to 3741
  • an artificial microRNA that is a single-stranded RNA having a length of 17 to 28 bases, which contains the sequence to be processed as the second to eighth base sequences.
  • a sequence comprising an artificial microRNA sequence and extending it back and forth forms a hairpin structure, and the microRNA sequence is RNA that can be excised from any one strand of the hairpin structure by a microRNA biosynthetic pathway in a cell.
  • the extended sequence is referred to as an artificial microRNA precursor.
  • Artificial microRNAs and artificial microRNA precursors can be designed using the above-described method using a gene whose expression is to be suppressed as a target gene.
  • the target base sequence of microRNA is a base sequence of a nucleic acid consisting of several bases recognized by the microRNA used in the present invention, and a base sequence in which the expression of mRNA having the base sequence is suppressed by the microRNA.
  • the base sequence complementary to the 2-8th base sequence on the 5 ′ end side of the microRNA is that translation of mRNA having the base sequence is suppressed by the microRNA (Current Biology, 15, R458-R460 (2005)), a base sequence complementary to the 2-8th base sequence on the 5 ′ end side of the microRNA used in the present invention can be mentioned as the target base sequence of the microRNA.
  • the gene having the target base sequence of the microRNA represented by any one of SEQ ID NOs: 1-1543 and 3372-3741 the National Institute of Biotechnology Information National Center for Biotechnology Information (NCBI) EntreGene database (Http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Entrez/)
  • NCBI National Institute of Biotechnology Information National Center for Biotechnology Information
  • Tables 4-1 to 4-148 represented by the names (Official Symbol and Gene ID) used in http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Entrez/ be able to.
  • the substance for controlling the expression or function of nucleic acid such as microRNA used in the present invention may be any substance such as a low molecular weight compound, an antibody, and siRNA as long as it inhibits the expression or function of the nucleic acid. Is preferred.
  • a substance that suppresses the expression of nucleic acids such as microRNA used in the present invention a substance that inhibits the function of factors essential for microRNA biosynthesis can also be used. Factors essential for microRNA biosynthesis include, for example, Dicer, TRBP, Exportin5, Drosha, DGCR8, and the like.
  • any method can be used as long as microRNA can finally be produced in the cell.
  • RNA that is a microRNA precursor
  • microRNA and the RNA
  • a method of introducing a double-stranded RNA consisting of a complementary strand of microRNA and of which both are completely complementary, and (3) a double-stranded RNA assuming a state after the microRNA has been cleaved into Dicer. can give.
  • Examples of products using such a method include miCENTURY OX Precursor (B-Bridge), miCENTURY OX siMature (B-Bridge), and miCENTURY OX miNatural (B-Bridge).
  • the method for producing the nucleic acid used in the present invention is not particularly limited, and the nucleic acid can be produced by a known method using chemical synthesis, an enzymatic transcription method, or the like.
  • methods using known chemical synthesis include phosphoramidite method, phosphorothioate method, phosphotriester method, etc.
  • synthesis with ABI3900 high-throughput nucleic acid synthesizer can do.
  • the enzymatic transcription method include transcription using a typical phage RNA polymerase, for example, T7, T3, or SP6 RNA polymerase, using a plasmid or DNA having the target base sequence as a template.
  • Examples of a method for screening a substance that controls the expression or function of the nucleic acid using the nucleic acid used in the present invention include, for example, introducing a vector that expresses the nucleic acid into a cell, and expressing an mRNA having the target base sequence. Alternatively, a method of screening for a substance that promotes or suppresses the function can be mentioned.
  • the medicament comprising the nucleic acid used in the present invention as an active ingredient can be used for diagnosis or treatment of diseases caused by abnormalities in mast cells.
  • abnormal mast cells include atopic dermatitis, asthma, chronic obstructive pulmonary disease, and allergic diseases. Since abnormalities of mast cells include abnormalities of degranulation, the nucleic acid used in the present invention can be used as an agent for controlling degranulation of mast cells, that is, a degranulation promoter or a degranulation inhibitor.
  • the mast cell degranulation inhibitor is suitably used as a preventive or therapeutic agent for atopic dermatitis, asthma, chronic obstructive pulmonary disease, and allergic diseases.
  • a mast cell degranulation promoter is preferably used as an immunization activator.
  • the present invention will be described in detail. 1. Method for Detecting Expression of Nucleic Acids such as MicroRNA and MicroRNA Precursor Expressed in Mast Cells (1-1) Acquisition and Culture of Mast Cells Human mast cells are particularly suitable if they can be acquired safely and efficiently Although not limited, for example, a known method (J. Immunol. Methods, 169, 153 (1994); J. Immunol., 138, 861 (1987); J. Allergy Clin.
  • a cell line established from human mast cells can also be used.
  • LAD2 Leuk. Res., 27, 671 (2003); Leuk. Res., 27, 677 (2003)
  • Etc. (1-2) Acquisition of RNA The method for extracting total RNA from mast cells acquired by the various methods described above is not particularly limited as long as it includes a low molecular RNA such as microRNA.
  • molecular cloning It can be performed by the method described in the third edition. Alternatively, extraction can be performed using Trizol (Invitrogen), ISOGEN (Nippon Gene), mirVana TM miRNA Isolation Kit (Ambion), miRNeasy Mini Kit (Qiagen), and the like.
  • low molecular weight RNA can be cloned from total RNA including low molecular weight RNA.
  • a method for cloning low molecular weight RNA specifically, low molecular weight RNA by 15% polyacrylamide gel electrophoresis according to the method described in Jeans & Development, 15, 188-200 (2000) The method of separating is mentioned. From this, 5'-terminal dephosphorylation, 3'-adapter ligation, phosphorylation, 5'-adapter ligation, reverse transcription, PCR amplification, concatamerization, and ligation to vector are sequentially cloned, and the clone is cloned. For example, a method for determining the nucleotide sequence.
  • RNA can also be obtained.
  • RNA Cloning Kit manufactured by Takara Bio Inc.
  • Identification of microRNA Whether a small RNA sequence is a microRNA can be determined by following the criteria described in RNA (RNA), 9, 277-279 (2003). For example, in the case of a low-molecular RNA newly acquired and its base sequence determined, it can be determined as follows.
  • Genomic sequences are publicly available and are available, for example, from UCSC Genome Bioinformatics (http://genome.ucsc.edu/).
  • RNAfold Nucleic Acids Research, 31, 3429-3431 (2003)
  • Mfold Nucleic Acids Research, 31, 3406-3415 (2003)
  • miRBase http://microrna.sanger.ac.uk/. It can be determined whether or not.
  • Method for detecting expression level of nucleic acid such as microRNA Examples of methods for detecting the expression level of nucleic acid such as microRNA and its precursor include (1) Northern hybridization and (2) dot blot high. Examples include hybridization, (3) in situ hybridization, (4) quantitative PCR, (5) differential hybridization, (6) microarray, and (7) ribonuclease protection assay.
  • the labeled probe is complementary to the nucleotide sequence of the nucleic acid by, for example, radioisotope, biotin, digoxigenin, fluorescent group, chemiluminescent group, etc. by methods such as nick translation, random priming or phosphorylation at the 5 ′ end. It can be prepared by incorporating it into DNA, RNA or LNA having a proper sequence. Since the binding amount of the labeled probe reflects the expression level of the nucleic acid, the expression level of the nucleic acid can be quantified by quantifying the amount of bound labeled probe. Electrophoresis, transfer to a membrane, probe preparation, hybridization, and nucleic acid detection can be performed by the methods described in Molecular Cloning 3rd edition.
  • RNA extracted from tissues or cells is spot-fixed on a membrane in a dotted manner, and then hybridized with a labeled polynucleotide that serves as a probe to detect RNA that specifically hybridizes with the probe. It is a method to do.
  • the probe the same probe as in Northern hybridization can be used. Preparation of RNA, RNA spot, hybridization, and detection of RNA can be performed by the methods described in Molecular Cloning 3rd edition.
  • In situ hybridization uses paraffin or cryostat sections of tissues obtained from living organisms or immobilized cells as specimens, performs hybridization and washing steps with labeled probes, and observes the tissues and cells of nucleic acids by microscopic observation. It is a method to investigate the distribution and localization in the method (Methods in Enzymology, 254, 419 (1995)).
  • the probe the same probe as in Northern hybridization can be used.
  • nucleic acids such as microRNA can be detected according to the method described in Nature Method, 3, 27 (2006).
  • cDNA synthesized from a sample-derived RNA using a reverse transcription primer and a reverse transcriptase (hereinafter, the cDNA is also referred to as a sample-derived cDNA) is used for measurement.
  • a random primer or a specific RT primer can be used as a reverse transcription primer for cDNA synthesis.
  • the specific RT primer refers to a primer having a sequence complementary to a nucleic acid and a base sequence corresponding to the surrounding genomic sequence.
  • a specimen-derived cDNA For example, after synthesizing a specimen-derived cDNA, using this as a template, from a base sequence corresponding to a nucleic acid such as microRNA or microRNA precursor used in the present invention and its surrounding genomic sequence, or a base sequence corresponding to a primer for reverse transcription Perform PCR using the designed template-specific primers, amplify the cDNA fragment containing the nucleic acid used in the present invention, and the amount of the nucleic acid of the present invention contained in the sample-derived RNA from the number of cycles until a certain amount is reached Is detected.
  • a nucleic acid such as microRNA or microRNA precursor used in the present invention and its surrounding genomic sequence
  • a primer for reverse transcription Perform PCR using the designed template-specific primers, amplify the cDNA fragment containing the nucleic acid used in the present invention, and the amount of the nucleic acid of the present invention contained in the sample-derived RNA from the number of cycles until a certain amount is reached Is detected
  • DNA or LNA consisting of a sequence of 20 to 40 bases from the 5 ′ end of the base sequence of the region, and the 3 ′ end
  • a DNA or LNA pair consisting of a sequence complementary to 20 to 40 bases can be used. Specifically, it can be carried out according to the method described in Nucleic Acids Research, 32, e43 (2004).
  • a specific RT primer having a stem / loop structure can be used as a reverse transcription primer for cDNA synthesis. Specifically, it can be performed by the method described in Nucleic Acid Research, 33, e179 (2005) or using TaqMan MicroRNA Assays (Applied Biosystems).
  • the sample is applied to a substrate or a substrate such as a glass or silicon on which DNA or LNA corresponding to a base sequence containing at least one nucleic acid such as microRNA or microRNA precursor used in the present invention is immobilized.
  • a change in the amount of the nucleic acid can be detected by hybridizing the derived cDNA and washing.
  • Examples of methods based on such hybridization include methods using differential hybridization (Trends Genet., 7, 314 (1991)) and microarray (Genome Res., 6, 639 (1996)). In either method, the difference in the amount of the nucleic acid between the control sample and the target sample can be accurately detected by immobilizing an internal control such as a nucleotide sequence corresponding to U6RNA on a filter or substrate.
  • labeled cDNA synthesis using differently labeled dNTPs mixturetures of dATP, dGTP, dCTP, and dTTP
  • RNA derived from the control sample and the target sample and two filters on one filter or one substrate.
  • the nucleic acid can be accurately quantified by simultaneously hybridizing the labeled cDNA.
  • nucleic acids such as microRNA can be detected using the microarray described in Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 101, 9740-9744 (2004), Nucleic Acid Research, 32, e188 (2004), etc. . Specifically, it can be detected or quantified using mirVana miRNA Bioarray (Ambion).
  • a promoter sequence such as a T7 promoter or SP6 promoter is bound to the 3 ′ end of a nucleotide sequence corresponding to a nucleic acid such as microRNA or microRNA precursor used in the present invention or its surrounding genomic sequence and labeled.
  • Labeled antisense RNA is synthesized by an in vitro transcription system using NTP (mixture of ATP, GTP, CTP, UTP) and RNA polymerase.
  • NTP mixture of ATP, GTP, CTP, UTP
  • the labeled antisense RNA is bound to the specimen-derived RNA to form an RNA-RNA hybrid, and then digested with ribonuclease A that degrades only single-stranded RNA.
  • the base sequence of DNA corresponding to the base sequence of RNA can be uniquely determined by replacing U (uracil) contained in the RNA sequence with T (thymine).
  • U uracil
  • T thymine
  • a polymer in which ribonucleotides and deoxyribonucleotides are mixed and a polymer containing nucleotide analogs can be synthesized in the same manner.
  • the method for synthesizing the nucleic acid used in the present invention is not particularly limited, and a method using a known chemical synthesis, an enzymatic transcription method or the like can be used.
  • methods using known chemical synthesis include phosphoramidite method, phosphorothioate method, phosphotriester method, etc.
  • synthesis with ABI3900 high-throughput nucleic acid synthesizer can do.
  • the enzymatic transcription method include a transcription method using a typical phage RNA polymerase such as T7, T3, or SP6 RNA polymerase using a plasmid or DNA having the target base sequence as a template. 3.
  • a method for detecting the function of a nucleic acid such as microRNA or a microRNA precursor As a method for detecting the function of a nucleic acid such as microRNA, a method for measuring the function based on whether or not the translation of mRNA having a target base sequence is suppressed Can give.
  • microRNA suppresses translation of mRNA containing the target base sequence in 3 'UTR (Current Biology, 15, R458-R460 (2005)). Therefore, a DNA in which the target base sequence for the single-stranded RNA to be measured is inserted into the 3′UTR of an appropriate reporter gene expression vector is prepared and introduced into a host cell suitable for the expression vector. Whether or not it has a function of microRNA can be detected by measuring the expression of the reporter gene when the double-stranded RNA is expressed.
  • the reporter gene expression vector may be any vector as long as it has a promoter upstream of the reporter gene and can express the reporter gene in the host cell.
  • Reporter genes include, for example, firefly luciferase gene, Renilla luciferase gene, chloramphenicol acetyltransferase gene, ⁇ -glucuronidase gene, ⁇ -galactosidase gene, ⁇ -lactamase gene, aequorin gene, green fluorescein Protein genes, DsRed fluorescent genes, etc. can be used.
  • the function of single-stranded RNA as microRNA can be detected as follows. First, host cells are cultured in a multiwell plate or the like to express a reporter gene expression vector having a target sequence and single-stranded RNA. Thereafter, the function of the microRNA can be detected by measuring the reporter activity and measuring the reporter activity when the single-stranded RNA is expressed, compared to the case where the single-stranded RNA is not expressed. 4).
  • Method for detecting mutations in nucleic acids such as microRNA and microRNA precursors As a method for detecting mutations in nucleic acids such as microRNAs and microRNA precursors, heterogeneous nucleic acids formed by hybridization of normal and mutant nucleic acids A method for detecting this strand can be used.
  • Methods for detecting heteroduplex include (1) heteroduplex detection by polyacrylamide gel electrophoresis (Trends genet., 7, 5 (1991)), (2) single strand conformation polymorphism analysis Legal (Genomics, 16, 325-332 (1993)), (3) Mismatch chemical cleavage methods (CCM, chemical cleavage of mismatches) (Human Genetics (1996), Tom Strachan and Andrew P. Read, BIOS Scientific Publishers Limited ), (4) Enzymatic cleavage method of mismatch (Nature Genetics, 9, 103-104 (1996)), (5) Denaturing gel electrophoresis (Mutat.atRes., 288, 103-112 (1993)) There are methods.
  • the heteroduplex detection method by polyacrylamide gel electrophoresis is performed as follows, for example. First, a sample-derived DNA or a sample-derived cDNA is amplified as a fragment smaller than 200 base pairs by using a primer designed based on the genomic base sequence including the base sequence of the nucleic acid used in the present invention, as a template. When heteroduplexes are formed, the mobility is slower than homoduplexes without mutations, and they can be detected as extra bands. If the fragment is smaller than 200 base pairs, most insertions, deletions and substitutions of 1 base or more can be detected. Heteroduplex analysis is preferably performed on a single gel combined with single-strand conformation analysis described below.
  • SSCP analysis single-strand conformation polymorphism analysis
  • primers designed based on the base sequence of the genome containing the base sequence of the nucleic acid of the present invention using the sample-derived DNA or the sample-derived cDNA as a template
  • the DNA amplified as a fragment smaller than 200 bp is denatured and then run in a native polyacrylamide gel.
  • the primer is labeled with an isotope or a fluorescent dye, or the unlabeled amplification product is stained with silver, whereby the amplified DNA can be detected as a band.
  • a fragment having a mutation can be detected from the difference in mobility.
  • CCM method a DNA fragment amplified with a primer designed based on the base sequence of the genome including the base sequence of the nucleic acid of the present invention using the sample-derived DNA or the sample-derived cDNA as a template, By hybridizing with a labeled nucleic acid in which an isotope or fluorescent label is incorporated into the nucleic acid, and treating with osmium tetroxide, one strand of DNA at the mismatched site can be cleaved to detect a mutation.
  • CCM is one of the most sensitive detection methods and can be applied to specimens of kilobase length.
  • the mismatch can be cleaved enzymatically by combining RNase A with an enzyme involved in mismatch repair in cells such as T4 phage resol base and endonuclease VII.
  • DGGE method denaturing gradient gel electrophoresis
  • nucleic acid mutation used in the present invention can be detected by directly determining and analyzing the base sequence of the sample-derived DNA or the sample-derived cDNA. 5. Method for Expressing Nucleic Acids such as MicroRNA and MicroRNA Precursor
  • the nucleic acid used in the present invention can be expressed by using a vector that is biosynthesized by introduction into a cell and transcription. Specifically, a DNA fragment containing a hairpin part is prepared based on the above nucleic acid or the genomic base sequence containing the base sequence, and inserted into the downstream of the promoter of the expression vector to construct an expression plasmid.
  • the above-mentioned nucleic acid can be expressed by introducing the expression plasmid into a host cell suitable for the expression vector.
  • a vector that can replicate autonomously in a host cell or can be integrated into a chromosome and contains a promoter at a position where a gene containing the nucleotide sequence of the nucleic acid of the present invention can be transcribed is used.
  • the promoter any promoter can be used so long as it can be expressed in the host cell.
  • RNA polymerase II (pol II) type promoter or U RNA or H1RNA transcription system such as RNA polymerase III (pol III) type promoter.
  • pol II promoter include cytomegalovirus (human CMV) IE (immediate early) gene promoter, SV40 early promoter, and the like.
  • Examples of expression vectors using them include pCDNA6.2-GW / miR (Invitrogen), pSilencer® 4.1-CMV (Ambion), and the like.
  • Examples of pol III promoters include U6 RNA, H1 RNA, and tRNA promoters.
  • Examples of expression vectors using them include pSINsi-hH1 DNA (Takara Bio), pSINsi-hU6 DNA (Takara Bio), pENTR / U6 (Invitrogen) and the like.
  • a gene containing the nucleic acid base sequence used in the present invention is inserted downstream of the promoter in the viral vector to construct a recombinant viral vector, and the vector is introduced into a packaging cell to produce a recombinant virus.
  • a gene containing the base sequence of the nucleic acid can also be expressed.
  • the packaging cell may be any cell as long as it can replenish the deficient protein of the recombinant viral vector deficient in any of the genes encoding the proteins required for viral packaging, for example, human kidney.
  • HEK293 cells derived from mouse, mouse fibroblast NIH3T3, and the like can be used.
  • Proteins supplemented by packaging cells include mouse retrovirus-derived proteins such as gag, pol, and env in the case of retrovirus vectors, and HIV virus-derived gag, pol, env, vpr, vpu, and so on in the case of lentivirus vectors. Proteins such as vif, tat, rev, and nef, adenovirus vectors such as E1A and E1B derived from adenovirus, and adeno-associated virus vectors such as Rep (p5, p19, p40), and Vp (Cap) Proteins can be used.
  • the nucleic acid used in the present invention can be directly introduced into a cell without using a vector.
  • the nucleic acid used in the present method in addition to DNA, RNA or nucleotide analogues, these chimeric molecules or derivatives of the nucleic acids can also be used.
  • the nucleic acid used in the present invention can be expressed in the same manner as Pre-miR TM miRNA Precursor Molecules (Ambion) or miRIDIAN microRNA Mimics (GE Healthcare).
  • any method may be used as long as microRNA can finally be produced in the cell, such as (1) single-stranded RNA that is a microRNA precursor, (2) microRNA, and A method of introducing a double-stranded RNA consisting of a complementary strand of the microRNA and a double strand in which both are completely complementary, and (3) a double-stranded RNA assuming a state after the microRNA is cleaved into Dicer Is given. Products using these methods include miCENTURY OX Precursor (B-Bridge), miCENTURY OX siMature (B-Bridge), and miCENTURY OX miNatural (B-Bridge). 6).
  • Nucleic acids such as microRNA and microRNA precursors used in the present invention are antisense technology (Bioscience and Industry, 50, 322 (1992), Chemistry, 46, 681 (1991), Biotechnology, 9, 358 (1992), Trends in Biotechnology, 10, 87 (1992), Trends in Biotechnology, 10, 152 (1992), Cell engineering, 16, 1463 (1997)), Triple ⁇ Helix technology (Trends in Biotechnology, 10, 132 (1992)), Ribozyme technology (Current Opinion in Chemical Biology, 3, 274 (1999), FEMS Microbiology Reviews, 23, 257 (1999), Frontiers in Bioscience, 4, D497 (1999), Chemistry & Biology, 6, R33 (1999), Nucleic Acids Research, 26, 5237 (1998), Trends In Biotechnology, 16, 438 (1998)), Decoy DNA method (Nippon Rinsho-Japanese Journal of Clinical Medicine) , 56, 563 (1998), Circulation Research, 82, 1023 (1998)
  • Antisense refers to a nucleic acid that can specifically hybridize a nucleic acid having a base sequence complementary to the base sequence of a certain target nucleic acid to suppress the expression of the target nucleic acid.
  • the nucleic acid used for antisense in addition to DNA, RNA or nucleotide analogs, these chimeric molecules or derivatives of the nucleic acids can also be used.
  • antisense can be produced and expression can be suppressed by following the method described in Nature, 432, 226 (2004) and the like.
  • the expression of the nucleic acid used in the present invention can be suppressed in the same manner as Anti-miR TM miRNA Inhibitors (Ambion) or miRIDIAN microRNA Inhibitors (GE Healthcare).
  • SiRNA is a short double-stranded RNA containing a base sequence of a certain target nucleic acid, which can suppress the expression of the target nucleic acid by RNA interference (RNAi).
  • RNAi RNA interference
  • the sequence of siRNA can be appropriately designed based on the conditions of the literature (Genes Dev., 13, 3191 (1999)) from the target nucleotide sequence.
  • a siRNA can be prepared by synthesizing and annealing two RNAs having a sequence of 19 bases selected and a complementary sequence with TT added to the 3 ′ end of each, using a nucleic acid synthesizer.
  • a siRNA expression vector such as pSilencer 1.0-U6 (Ambion) or pSUPER (OligoEngine).
  • the siRNA that can suppress the function of a nucleic acid such as microRNA used in the present invention may be any siRNA that can suppress the function of the nucleic acid, but an siRNA designed from the sequence information of SEQ ID NOs: 1 to 3371 is preferred.
  • the number of residues of the base constituting one strand of siRNA is preferably 17 to 30 residues, more preferably 18 to 25 residues, still more preferably 19 to 23 residues.
  • microRNA or microRNA precursor expressed in mast cells can be suppressed using antisense or siRNA specific to nucleic acids such as microRNA or microRNA precursor expressed in mast cells.
  • antisense or siRNA specific to nucleic acids such as microRNA or microRNA precursor expressed in mast cells.
  • the activity of the microRNA is suppressed, and the action of the microRNA or microRNA precursor in mast cells is controlled. be able to.
  • the function of mast cells can be obtained by administering to the patient an antisense oligonucleotide or siRNA specific to the microRNA or its precursor.
  • antisense oligonucleotides or siRNAs specific to nucleic acids such as microRNAs and their precursors are used as the above therapeutic agents
  • antisense oligonucleotides or siRNAs alone, or nucleic acids that encode them are retroviral vectors, After being inserted into an appropriate vector such as an adenovirus vector or an adeno-associated virus vector, it can be administered as a pharmaceutical preparation according to the conventional method described in 9 below. 7).
  • nucleic acid such as microRNA or microRNA precursor
  • expression of mRNA having target base sequence Any method may be used as long as it utilizes the activity of nucleic acids such as microRNA.
  • a method of suppressing the expression of a gene by suppressing the translation of mRNA having a target sequence by expressing a nucleic acid such as microRNA used in the present invention and increasing the amount of the nucleic acid in the cell can be mentioned. It can.
  • the nucleic acid of the present invention can be expressed by the method described in 5 above.
  • Examples of the mRNA having the target base sequence of the nucleic acid comprising the base sequence represented by any of SEQ ID NOs: 1 to 1543 and 3372 to 3741 include the gene groups shown in Table 4 above, for example.
  • the function of this target gene can be suppressed using siRNA with respect to the target gene shown in Table 4. 8).
  • Method for screening a substance that regulates expression or function of nucleic acid using nucleic acid such as microRNA or microRNA precursor Using nucleic acid used in the present invention, expression or function of nucleic acid such as microRNA or its precursor
  • Substances that control, ie promote or suppress can be screened. For example, from the base sequence of the microRNA used in the present invention or a precursor thereof, a base sequence to be screened is selected, and a selected microRNA or a cell thereof is selected using a cell that expresses a nucleic acid having the base sequence. Substances that promote or suppress precursor expression or function can be screened.
  • a vector that expresses a nucleic acid having the base sequence as described in 5 above is an animal cell. It is also possible to use transformed cells obtained by introduction into a host cell such as yeast or yeast, cells into which a nucleic acid having the base sequence is directly introduced without using a vector, and the like.
  • Specific screening methods include methods that use changes in the expression level of nucleic acids such as microRNAs or their precursors to be screened as indicators, as well as mRNAs that have nucleic acid target sequences such as microRNAs, and encoded by them.
  • a method using the change in the expression level of the gene product as an index can be mentioned.
  • Screening method using a change in the expression level of a microRNA or a precursor thereof as a target for screening as an indicator A test substance is contacted with a cell expressing the nucleic acid, and a change in the expression level of the selected nucleic acid is used as an indicator
  • a substance that promotes or suppresses the expression of nucleic acids such as microRNA and its precursor can be obtained.
  • the expression level of the nucleic acid can be detected by the method described in 3 above.
  • (B) Screening method using as an index the change in the expression level of mRNA having a nucleic acid target sequence such as microRNA to be screened and the gene product encoded by it Contact test cells with cells expressing the mRNA To obtain a substance that promotes or suppresses the expression or function of nucleic acids such as microRNAs and their precursors, using changes in the expression level of mRNA having the target sequence of the selected nucleic acid or gene product encoded thereby as an indicator. it can.
  • a DNA in which a target sequence of a nucleic acid such as the microRNA of the present invention is inserted into the 3′UTR of an appropriate reporter gene expression vector is prepared and introduced into a host cell suitable for the expression vector, and a test substance is introduced into the cell.
  • a substance that promotes or suppresses the expression or function of nucleic acids such as microRNAs and their precursors can be obtained using the change in the expression level of the reporter gene as an indicator.
  • Selection of the target sequence can be performed by the method described in 7 above, as mRNA having a nucleic acid target sequence such as a microRNA comprising a base sequence represented by any of SEQ ID NOs: 1 to 1543 and 3372 to 3741.
  • Mast cell degranulation regulator using nucleic acids such as microRNA and microRNA precursor Nucleic acids such as microRNA and microRNA precursor used in the present invention, and nucleic acids having a base sequence complementary to the base sequence, By controlling the expression of a gene having a target sequence, it can be used as a degranulation regulator for mast cells, that is, as a degranulation inhibitor or degranulation promoter.
  • Examples of the active ingredient of the mast cell degranulation inhibitor include the following nucleic acids (a) to (h).
  • Substances that promote the function or expression of the nucleic acids (a) to (h) can also be used as mast cell degranulation inhibitors.
  • a substance that suppresses the function or expression of the target gene of the nucleic acid (a) to (h) can also be used as an inhibitor of degranulation of mast cells.
  • Examples of the substance that suppresses the expression of the target gene include siRNA for the mRNA of the target gene and antisense for the target gene.
  • the following substances (i) to (p) that suppress the function or expression of the nucleic acid can also be used as mast cell degranulation inhibitors.
  • the substance that suppresses the function or expression of the nucleic acid include siRNA and antisense for the nucleic acid.
  • the active ingredient of the degranulation promoter for mast cells include the following nucleic acids (i) to (p).
  • nucleic acid comprising a base sequence represented by any one of SEQ ID NOs: 71 to 150, 582 to 1237, 1462 to 1543, 3372 to 3406, 3453 to 3741
  • SEQ ID NOs: 71 to 150, 582 to 1237, 1462 Containing a nucleic acid consisting of a base sequence represented by any one of ⁇ 1543, 3372-3406, 3453-3741, and a nucleic acid of 17 to 28 bases
  • k SEQ ID NOs: 71-150, 582-1237, 1462-1543
  • Substances that promote the function or expression of nucleic acids (i) to (p) above can also be used as mast cell degranulation promoters.
  • Substances that suppress the function or expression of the target gene of the nucleic acid (i) to (p) can also be used as a mast cell degranulation promoter.
  • Examples of the substance that suppresses the expression of the target gene include siRNA for the mRNA of the target gene and antisense for the target gene.
  • the substance that suppresses the function or expression of the nucleic acids (a) to (h) can also be used as a mast cell degranulation promoter.
  • the substance that suppresses the function or expression of the nucleic acid include siRNA and antisense for the nucleic acid.
  • vectors expressing the nucleic acids (a) to (h) and (i) to (p) can also be used.
  • the formulation form and administration method of the degranulation control agent for mast cells of the present invention are the same as those for diagnostic agents and therapeutic agents containing nucleic acids such as microRNA and microRNA precursor described later in 10. 10. Diagnostic and therapeutic agents containing nucleic acids such as microRNAs and microRNA precursors Nucleic acids such as microRNAs and microRNA precursors used in the present invention control the expression of genes having target sequences or are used in the present invention By controlling the expression of nucleic acids such as microRNA, it can be used as a therapeutic agent for diseases caused by abnormalities in mast cells. Moreover, siRNA against the target gene of the nucleic acid can be used as a therapeutic agent for diseases caused by abnormalities of mast cells, etc. by controlling the expression of the gene.
  • Abnormalities in mast cells include abnormalities such as mast cell differentiation and degranulation, inflammatory mediator production, cytokine production, and chemokine production.
  • Diseases resulting from them include atopic dermatitis, asthma, chronic obstructive lung Diseases, allergic diseases and the like can be mentioned.
  • the diagnostic agent containing the nucleic acid of the present invention is a reagent necessary for quantifying the nucleic acid used in the present invention or detecting a mutation, such as a buffer, a salt, a reaction enzyme, the present invention, according to the target diagnostic method. It may contain a labeled protein that binds to the nucleic acid, a color former for detection, and the like.
  • the therapeutic agent containing the nucleic acid used in the present invention as an active ingredient can be administered alone, but it is usually mixed with one or more pharmacologically acceptable carriers to prepare pharmaceutical technology. It is desirable to administer as a pharmaceutical formulation produced by any method well known in the art. It is desirable to use the most effective route for treatment, and oral administration or parenteral administration such as buccal, respiratory tract, rectal, subcutaneous, intramuscular and intravenous is desirable. Can be given intravenously.
  • Examples of the dosage form include sprays, capsules, tablets, granules, syrups, emulsions, suppositories, injections, ointments, tapes and the like.
  • Suitable formulations for oral administration include emulsions, syrups, capsules, tablets, powders, granules and the like.
  • Liquid preparations such as emulsions and syrups include sugars such as water, sucrose, sorbitol and fructose, glycols such as polyethylene glycol and propylene glycol, oils such as sesame oil, olive oil and soybean oil, p-hydroxybenzoic acid
  • Preservatives such as esters, and flavors such as strawberry flavor and peppermint can be used as additives.
  • excipients such as lactose, glucose, sucrose, mannitol, disintegrants such as starch and sodium alginate, lubricants such as magnesium stearate and talc, polyvinyl alcohol, hydroxy A binder such as propylcellulose and gelatin, a surfactant such as fatty acid ester, and a plasticizer such as glycerin can be used as additives.
  • Formulations suitable for parenteral administration include injections, suppositories, sprays and the like.
  • the injection is prepared using a carrier made of a salt solution, a glucose solution, or a mixture of both.
  • Suppositories are prepared using a carrier such as cocoa butter, hydrogenated fat or carboxylic acid.
  • the spray is prepared using a carrier that does not irritate the recipient's oral cavity and airway mucosa, and that facilitates absorption by dispersing the active ingredient as fine particles.
  • the carrier include lactose and glycerin.
  • preparations such as aerosols and dry powders are possible.
  • the components exemplified as additives for oral preparations can also be added.
  • the dose or frequency of administration varies depending on the intended therapeutic effect, administration method, treatment period, age, weight, etc., but is usually 10 ⁇ g / kg to 20 mg / kg per day for an adult.
  • the therapeutic agent containing the nucleic acid used in the present invention as an active ingredient can also be produced by preparing a vector for expressing the nucleic acid used in the present invention and a base used in the nucleic acid therapeutic agent (Nature Genet., 8, 42 (1994)).
  • the base used for the therapeutic agent of the present invention may be any base as long as it is usually used for injections, such as distilled water, sodium chloride or a salt solution such as a mixture of sodium chloride and an inorganic salt, mannitol, Examples thereof include solutions such as lactose, dextran and glucose, amino acid solutions such as glycine and arginine, organic acid solutions or a mixed solution of a salt solution and a glucose solution, and the like.
  • these bases are mixed with an osmotic pressure adjusting agent, a pH adjusting agent, a vegetable oil such as sesame oil or soybean oil, or an auxiliary agent such as a surfactant such as lecithin or a nonionic surfactant.
  • An injection may be prepared as a suspension or dispersion. These injections can be prepared as preparations for dissolution at the time of use by operations such as pulverization and freeze-drying.
  • the therapeutic agent of the present invention can be used for treatment as it is in the case of a liquid just before the treatment, or in the case of an individual, dissolved in the above sterilized base as necessary.
  • Examples of the vector for expressing a nucleic acid used in the present invention include the recombinant virus vector virus vector prepared by the above method 5, and more specifically, a retrovirus vector and a lentivirus vector.
  • a virus vector can be prepared by combining a nucleic acid used in the present invention with a polylysine-conjugated antibody specific for an adenovirus hexon protein, and then binding the resulting complex to an adenovirus vector. it can.
  • the virus vector stably reaches the target cell, is taken up into the cell by endosomes, is degraded in the cell, and the nucleic acid can be efficiently expressed.
  • viral vectors based on Sendai virus which is a (-) strand RNA virus
  • Sendai virus that expresses nucleic acids used in the present invention using the Sendai virus.
  • Vectors can be generated.
  • the nucleic acid used in the present invention can also be transferred by a non-viral nucleic acid transfer method. For example, calcium phosphate coprecipitation method (Virology, 52, 456-467 (1973); Science, 209, 1414-1422 (1980)), microinjection method (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77, 5399-5403 ( 1980); Proc. Natl. Acad. Sci.
  • the nucleic acid used in the present invention can be taken up and expressed locally in the tissue by directly administering the liposome preparation to the target tissue (Hum. Gene Ther., 3, 399 (1992)).
  • the target tissue Hum. Gene Ther., 3, 399 (1992)
  • receptor-mediated nucleic acid transfer can be performed by binding a nucleic acid to a protein ligand via polylysine. The ligand is selected based on the presence of the corresponding ligand receptor on the cell surface of the target cell or tissue.
  • the ligand-nucleic acid conjugate can be injected directly into the blood vessel, if desired, and can be directed to a target tissue where receptor binding and internalization of the nucleic acid-protein complex occurs.
  • adenovirus can be co-infected to disrupt endosomal function. 11.
  • Method of measuring the degree of mast cell activation Among nucleic acid such as microRNA or microRNA precursors against mast cells, activation inhibition, degranulation inhibition, inflammatory mediator production inhibition, cytokine production inhibition and chemokine production inhibition (I) degranulation is carried out by stimulating and releasing mast cells after introducing the nucleic acid used in the present invention or siRNA for the target gene of the nucleic acid into mast cells.
  • Histamine and ⁇ -hexosaminidase which are indicators of inflammatory mediators such as (ii) LTC4, LTD4, LTE4, PGD2, (iii) cytokines such as TNF- ⁇ and GM-CSF, (iv) IL-8, It can be confirmed by measuring chemokines such as I-309 and MIP-1 ⁇ and comparing them with the case where the nucleic acid used in the present invention or siRNA for the target gene of the nucleic acid was not introduced.
  • apoptosis induction effect Can be confirmed. Furthermore, after introducing a nucleic acid used in the present invention or siRNA for a target gene of the nucleic acid into a mast cell in a state where a substance that suppresses activation of mast cell is added, the mast cell is stimulated and the nucleic acid used in the present invention It can also be confirmed by comparing with the case where siRNA for the target gene of the nucleic acid was not introduced.
  • Methods for stimulating mast cells include, for example, a method of adding anti-IgE antibody after incubation with IgE, a method of adding compound 48/80, a method of adding polymyxin B, a method of adding dextran, calcium Method of adding ionophore, method of adding acetylcholine, method of adding carbachol, method of adding thrombin, method of adding concanavalin A, method of adding calcium ionophore, method of adding ATP, method of adding doxorubicin, Etc.
  • the substance that suppresses activation of mast cells include substances that inhibit the process of biosynthesis of microRNA from a microRNA precursor.
  • mast cells instead of degranulation, the activation of mast cells involves cytokine production such as TNF- ⁇ and GM-CSF, chemokine production such as IL-8, I-309, MIP-1 ⁇ , LTC4, LTD4, LTE4, PGD2, etc. It can also be examined by measuring inflammatory mediator production or the like (Blood, 100, 3861 (2002)).
  • cytokine production such as TNF- ⁇ and GM-CSF
  • chemokine production such as IL-8, I-309, MIP-1 ⁇ , LTC4, LTD4, LTE4, PGD2, etc. It can also be examined by measuring inflammatory mediator production or the like (Blood, 100, 3861 (2002)).
  • LAD2 is a recently established human mast cell line that is well known to retain the properties of human mast cells (Leuk. Res., 27, 671 (2003); Leuk. Res., 27, 677). (2003)). LAD2 was obtained from National Institute of Allergy and Infectious Diseases, National Institutes of Health (Bethesda, MD 20892-1881, USA) and cultured in Stem Pro-34 medium (Invitrogen) containing 100 ng / mL SCF.
  • LAD2 is seeded in a 96-well plate at 4 ⁇ 10 3 per well, and the microRNA precursor is lipofection method, specifically, the final concentration is 25 using TransIT-TKO (Mirus). Introduced to be nM.
  • MicroRNA precursors used were human miRNA libraries Ver.1 and Ver.2 synthesized by Ambion. Lipofection followed the method described in the instructions attached to the product.
  • human myeloma IgE (manufactured by Cosmo Bio) was added to a final concentration of 0.3 ⁇ g / mL, and in an incubator at 37 ° C. with 5% CO 2 concentration. Cultured overnight.
  • a rabbit anti-human IgE antibody (manufactured by Dako) was added to a final concentration of 10 ⁇ g / mL, and the mixture was incubated for 30 minutes in an incubator at 37 ° C. with 5% CO 2 concentration to induce degranulation. The degree of degranulation was evaluated by measuring the ⁇ -hexosaminidase activity of the intragranular enzyme released into the medium.
  • ⁇ -hexosaminidase activity was measured using Tyrode's buffer (126.1 mmol / L NaCl, 4.0 mmol / L KCl, 1.0 mmol / L CaCl 2 , 0.6 mmol / L MgCl 2 , 0.6 mmol / L KH in the medium).
  • hsa-miR-16 195, 17-3p, 18a, 18b, 20b, 21, 24, 25, 32, 26b, 30a-3p, 34a, 449, 449b, 107, 140, 148b, 190 , 199a, 199b, 202 *, 208, 210, 211, 214, 218, 299-5p, 325, 328, p329, 338, 345, 425-5p, 484, 485-5p, 486, 488, 510, 515- 3p, 515-5p, 517 *, 520d, 520f, 520h, 522, 525 *, 573, 587, 593, 595, 604, 612, 625, 634, 635, 637, 647, 650, 654, 658, 660, By introducing microRNA precursors corresponding to 668, 675, 765, and 766 (each of which is a nucleic acid having a base sequence represented by SEQ ID
  • degranulation activity was measured using a 6-well plate.
  • LAD2 is seeded in a 6-well plate at 5x10 5 per well, and the final concentration is 25 nM using lipofection method, specifically Gene Silencer (Genlantis), as microRNA precursor. Introduced.
  • the precursor of microRNA used what was synthesize
  • Tyrode buffer (126.1 mmol / L NaCl, 4.0 mmol / L KCl, 1.0 mmol / L CaCl 2 , 0.6 mmol / L MgCl 2 , 0.6 mmol / L KH 2 PO 4 , 10
  • mM HEPES 5.6 mmol / L D-glucose, 0.1% bovine serum albumin, pH 7.4
  • 1.5 mL of Tyrode buffer is added to suspend the cells, and the cells are suspended in a 96-well plate at 100 per well. A ⁇ L aliquot was dispensed.
  • a rabbit anti-human IgE antibody manufactured by Dako
  • a rabbit anti-human IgE antibody manufactured by Dako
  • ⁇ -hexosaminidase activity was measured in 4 mmol / L p-nitrophenyl N-acetyl- ⁇ -glucosaminide (Sigma) dissolved in 40 mmol / L citrate buffer (pH 4.5) in 50 ⁇ L of the collected supernatant. 50) ⁇ L, add 1 ⁇ L of 0.2 mol / L glycine (pH 10.7) at 100 °C ⁇ L, and measure the absorbance at 405 nm using a plate reader 1420 ARVOsx (Perkin Elmer) Evaluation was made by measuring.
  • the total ⁇ -hexosaminidase activity in LAD2 was measured by adding Triton X-100 having a final concentration of 1% instead of the rabbit anti-human IgE antibody and conducting the same experiment.
  • the percentage of degranulation was calculated as the percentage of ⁇ -hexosaminidase activity in the supernatant with respect to the total ⁇ -hexosaminidase activity (%), and the percentage of degranulation in the negative control (Gene Silencer only) for each.
  • the relative degranulation activity was calculated when 1.0 was 1.0.
  • human myeloma IgE (manufactured by Cosmo Bio) was added to a final concentration of 0.3 ⁇ g / mL, and an incubator at 37 ° C. with 5% CO 2 concentration was added. Incubated overnight. On the next day, a rabbit anti-human IgE antibody (manufactured by Dako) was added to a final concentration of 10 ⁇ g / mL, and the mixture was incubated for 30 minutes in an incubator at 37 ° C. with 5% CO 2 concentration to induce degranulation.
  • the degree of degranulation was evaluated by measuring the ⁇ -hexosaminidase activity of the intragranular enzyme released into the medium.
  • ⁇ -hexosaminidase activity was measured using Tyrode's buffer (126.1 mmol / L NaCl, 4.0 mmol / L KCl, 1.0 mmol / L CaCl, 0.6 mmol / L MgCl 2 , 0.6 mmol / L KH 2 in the medium).
  • the total ⁇ -hexosaminidase activity contained in LAD2 was measured by adding Triton X-100 to a final concentration of 1% in the medium and conducting the same experiment. The average value of wells not seeded with cells was calculated and subtracted from each measured value as background. The percentage of degranulation induced by the anti-IgE antibody was calculated as the ratio (%) of ⁇ -hexosaminidase activity to total ⁇ -hexosaminidase activity released by 1% Triton X-100. The relative activity of degranulation was evaluated based on the deviation from the median, and the median was subtracted from the degranulation efficiency and divided by the average deviation. The degranulation promoting activity was positive, and the degranulation inhibitory activity was negative. Two independent experiments were performed and the results are shown in Table 8.
  • human myeloma IgE (manufactured by Cosmo Bio) was added to a final concentration of 0.3 ⁇ g / mL 7 days after introduction of the antisense oligonucleotide for microRNA, and an incubator at 37 ° C. with 5% CO 2 concentration. Cultured overnight, the next day, degranulation was induced by adding rabbit anti-human IgE antibody, and the proportion of degranulation was measured. The results are shown in Table 9.
  • Dicer1-siRNA sicer of Dicer1 gene
  • LAD2 precursor of human microRNA into LAD2
  • LAD2 is seeded in a 96-well plate at 2 ⁇ 10 4 per well, and Dicer1-siRNA and microRNA precursors are each terminated using the lipofection method, specifically GeneSilencer (Genlantis). Co-introduction was performed so that the concentration was 25 nM.
  • siRNA sequence for the human Dicer1 gene Dicer1-siRNA (manufactured by Qiagen) using SEQ ID NO: 4148 as a target sequence was used.
  • a microRNA precursor used was a human miRNA library synthesized by Ambion.
  • siRNA allstars Qiagen
  • miR-negacon # 1 Pre-miR TM miRNA Precursor Negative Control # 1
  • the culture medium was mixed with tyrode buffer (126.1 mmol / L NaCl, 4.0 mmol / L KCl, 1.0 mmol / L CaCl 2 , 0.6 mmol / L MgCl 2 , 0.6 mmol / L KH 2 PO 4 , 10 mM HEPES, 5.6 mmol / L D-glucose, 0.1% bovine serum albumin, pH 7.4) and the cells were suspended.
  • tyrode buffer (126.1 mmol / L NaCl, 4.0 mmol / L KCl, 1.0 mmol / L CaCl 2 , 0.6 mmol / L MgCl 2 , 0.6 mmol / L KH 2 PO 4 , 10 mM HEPES, 5.6 mmol / L D-glucose, 0.1% bovine serum albumin, pH 7.4
  • the degree of degranulation was evaluated by measuring the ⁇ -hexosaminidase activity of the intragranular enzyme released into the culture supernatant.
  • ⁇ -hexosaminidase activity was measured by adding 4 mmol / L ⁇ ⁇ ⁇ 4-nitrophenyl N-acetyl- ⁇ -D-glucosaminide (Sigma-) dissolved in 40 mmol / L citrate buffer (pH 4.5) to the collected culture supernatant.
  • the ratio of degranulation induced by Compound 48/80 was calculated as the ratio (%) to ⁇ -hexosaminidase activity in the 1% Triton X-100 addition group.
  • the activity of miRNA that releases degranulation suppression by Dicer1-siRNA introduction is 0% in the degranulation ratio in the Dicer1-siRNA and miR-negacon # 1 co-introduction section, and in the siRNA allstars and miRNA-negacon # 1 co-introduction section Relative activity was calculated with the percentage of degranulation as 100%. The results are shown in Table 10.
  • LAD2 mRNA expression analysis of LAD2 overexpressed miR-142-3p precursor and miR-24 precursor
  • Human microRNA miR-142-3p and miR-24 precursors were introduced into LAD2, respectively, and the microRNA precursor A gene group whose expression level fluctuates by introduction of the body was exhaustively searched using an mRNA array.
  • LAD2 is seeded in a 6-well plate at 5 ⁇ 10 5 per well, and the final concentration is 30 nM using lipofection method, specifically GeneSilencer (Genlantis) for microRNA precursor Introduced.
  • the microRNA precursor used was pre-miR TM miRNA Precursor Molecules synthesized by Ambion.
  • Ambion's Pre-miR TM miRNA Precursor Negative Control # 2 (hereinafter, miR-negacon # 2) was used. Lipofection followed the method described in the instructions attached to the product.
  • RNA Cy3-labeled cRNA was hybridized to a microarray at 65 ° C for about 17 hours, washed, and then scanned using an Agilent technologies Microarray Scanner with a resolution of 5 ⁇ m, and the signal value was measured. I got it.
  • a mast cell degranulation regulator a diagnostic or therapeutic agent for a disease caused by mast cell degranulation control, a mast cell degranulation control method, and a screening method for a mast cell degranulation regulator. be able to. These are useful for diagnosis or treatment of diseases caused by control of degranulation of mast cells.
  • SEQ ID NO: 3916-n is a, c, g or u SEQ ID NO: 4148—Description of Artificial Sequence: Synthetic DNA

Abstract

核酸等を用いた肥満細胞の脱顆粒制御剤、肥満細胞の脱顆粒制御に起因する疾患の診断薬または治療薬、肥満細胞の脱顆粒制御方法、肥満細胞の脱顆粒制御剤のスクリーニング方法を提供する。これらは肥満細胞の脱顆粒制御に起因する疾患の診断または治療に有用である。

Description

肥満細胞の脱顆粒を制御する核酸
　本発明は、肥満細胞の脱顆粒制御剤、肥満細胞の脱顆粒制御の異常に起因する疾患の診断薬または治療薬、肥満細胞の脱顆粒制御方法、肥満細胞の脱顆粒制御剤のスクリーニング方法に関する。
　核酸の一種であるマイクロＲＮＡ(miRNA)は、蛋白質に翻訳されない約２２ヌクレオチドからなる小さな非コード一本鎖ＲＮＡであり、ヒトを含む生物に多数存在することが知られている（非特許文献１、２）。マイクロＲＮＡは、単一またはクラスター化されたマイクロＲＮＡ前駆体に転写される遺伝子から生成される。すなわち、まず遺伝子から一次転写産物であるprimary-microRNA (pri-miRNA)が転写され、次いでpri-miRNAから成熟型マイクロＲＮＡへの段階的プロセシングにおいて、特徴的なヘアピン構造を有する約70塩基のprecursor-microRNA (pre-miRNA)がpri-miRNAから生成される。さらに、Dicer介在によるプロセシングによりpre-miRNAから成熟型マイクロＲＮＡが生成される（非特許文献３）。
　成熟型マイクロＲＮＡは、標的となるmRNAに相補的に結合してmRNAの翻訳を抑制するか、あるいはmRNAを分解することにより、遺伝子発現の転写後制御に関与していると考えられている。
　マイクロＲＮＡが標的mRNAの発現を抑制するメカニズムについては完全には明らかになっていないが、近年の研究により概要が解明されつつある。マイクロＲＮＡは標的となるmRNAの3’末端側非翻訳領域(3’UTR)中の部分的に相補的な配列に結合し、その翻訳を抑制し、または標的mRNAを分解することで発現を抑制する。上記の相補性は完全でなくても良いが、特にマイクロＲＮＡの5’- 末端側から２番目から８番目までの塩基の相補性が重要であることが示されており、この領域をマイクロＲＮＡの「シード配列(seed sequence)」と呼ぶこともある（非特許文献４）。シード配列が共通するマイクロＲＮＡは他の配列が異なっていても、共通の標的mRNAの発現を抑制することが示されている。従って、任意のmRNAの3’-末端に存在する配列と相補的な配列をシード配列となるようにすることで、マイクロＲＮＡ様の活性を有するＲＮＡを設計することができる。マイクロＲＮＡはsiRNAとは異なり、通常は細胞内に天然に存在するＲＮＡのみを指すことが多いため、このようにして設計したマイクロＲＮＡ様配列を特に人工マイクロＲＮＡと呼ぶ場合がある。
　2007年8月現在、マイクロＲＮＡのデータベースmiRBase（http://microrna.sanger.ac.uk/）には、ヒトで533種、全生物種で5,071種のマイクロＲＮＡが登録されている。ヒトを含む哺乳類で発現するマイクロＲＮＡの中で、その生理的機能に関して知られているものは、血球系分化に関与するmiR-181（非特許文献５）やインシュリン分泌に関与するmiR-375（非特許文献６）などごく一部のみであり、多くはその生理的活性が未解明である。ただし、線虫やショウジョウバエを用いた研究からマイクロＲＮＡが生物の発生、分化に様々な重要な役割を果たしていることが明らかとなってきており、ヒト疾患との関係においても、特に癌との深い関係を示唆する報告がされている(非特許文献７)。
　肥満細胞は各種刺激により活性化され、脱顆粒を起こし、数多くの炎症性メディエーターを遊離、産生することが知られている（非特許文献８～１０）。メディエーターはアミン類、アラキドン酸代謝産物、プロテアーゼ、サイトカイン、ケモカインなど多種多様である。例えば、肥満細胞に抗原が認識されると、脱顆粒によりヒスタミンやトリプターゼが速やかに放出されると共に、プロスタグランジンD2（PGD2）、ロイコトリエン（LT）、血小板活性化因子（PAF）などのケミカルメディエーター、およびマクロファージ炎症性蛋白質（MIP）-1α等の各種のケモカインや顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（GM-CSF）等の各種サイトカインが新たに合成され、放出されることが知られている。また、これまで好酸球が作ると考えられていた細胞障害性蛋白質である主要塩基性蛋白質（major basic protein）に関しても、ヒトの場合は肥満細胞が多量につくることが最近明らかになっている（非特許文献１１）。
　このように、肥満細胞は種々のアレルギー疾患の病態形成において主要な役割を演じていると考えられることから、肥満細胞の機能を制御することにより、アレルギー疾患の治療が可能であると考えられる。
　肥満細胞からの炎症性メディエーター遊離を抑制する作用を有する種々の既存のアレルギー治療薬が知られているが、従来はげっ歯類の肥満細胞を用いた研究が主体であり、ヒト肥満細胞に対して実際に効果があるかについては充分検討されていなかった。しかし、最近、ヒト肥満細胞の調製法が確立され、既存薬のヒト肥満細胞に対する作用を解析することが可能になり、げっ歯類肥満細胞に対する作用と比較することが可能になった。その結果、げっ歯類肥満細胞とヒト肥満細胞では、薬剤への反応性が異なることが明らかになっている（非特許文献９）。例えば、炎症性メディエーター遊離抑制薬として使用されているクロモグリク酸ナトリウムは、ラット腹腔肥満細胞においてはIgE依存性の炎症性メディエーター遊離を顕著に抑制するが、ヒト肥満細胞に対する作用は強いものではなかった（非特許文献１２）。塩酸アゼラスチンは、高濃度においてはヒト培養肥満細胞からのヒスタミン、PGD2、LTの遊離、GM-CSFおよびMIP-1αの産生を抑制するが、いずれの活性も強いものではなかった。また、抗サイトカイン薬として使用されているトシル酸スプラタストは、ラット肥満細胞に対して炎症性メディエーター遊離抑制作用を示したが、ヒト肥満細胞に対する作用はなかった（非特許文献１２）。
　肥満細胞で発現する遺伝子は、種々のアレルギー疾患の治療薬のターゲットとなり得る点で重要であり、例えば、肥満細胞に発現しているGPCRに作用する薬剤が、ヒト培養肥満細胞からの炎症性メディエーターの産生を顕著に抑制することが知られている。具体的には、β2アドレナリン受容体刺激薬イソプロテレノールは10 nmol/lの低濃度で、ヒト培養肥満細胞からのヒスタミン、LT、PGD2、GM-CSFおよびMIP-1αの遊離を80％以上抑制する（非特許文献１３）。
　また、各種刺激により活性化されたヒト肥満細胞とマウス肥満細胞で発現が誘導される遺伝子について比較された結果、ヒトとマウスでは発現する遺伝子が必ずしも一致しないことが明らかになった（非特許文献１４）。しかも上述したようにヒトとマウスでは、薬剤の反応性にも種差がある。
　マイクロRNAが遺伝子発現制御に関わっていることを踏まえると、肥満細胞で発現するマイクロRNAも種々のアレルギー疾患の治療薬の候補となり得ると考えられる。現時点ではマウス骨髄由来肥満細胞で発現するマイクロRNAに関しての解析（非特許文献１５）があるだけであり、ヒト肥満細胞で発現するマイクロRNAについては報告されていない。ヒトとマウスの種差を考慮すると、マウス肥満細胞のマイクロRNAの発現情報をもとに、ヒト肥満細胞のマイクロRNAの発現情報を予測することは困難である。また、マイクロRNAの、肥満細胞の多用な機能に対する関与も知られていない。
非特許文献１－Science, 294, 853-858 (2001)
非特許文献２－Cell，113, 673-676 (2003)
非特許文献３－Nature Reviews Genetics, 5, 522-531 (2004)
非特許文献４－Current Biology, 15, R458-R460 (2005)
非特許文献５－Science, 303, 83-86 (2004)
非特許文献６－Nature, 432, 226-230 (2004)
非特許文献７－Nature Reviews Cancer, 6, 259-269 (2006)
非特許文献８－黒沢元博編，「肥満細胞の臨床」，先端医学社，p142 (2001)
非特許文献９－黒沢元博編，「肥満細胞の臨床」，先端医学社，p559 (2001)
非特許文献１０－Crit. Rev. Immunol., 22, 115-140 (2002)
非特許文献１１－Blood, 98, 1127-1134 (2001)
非特許文献１２－Clin. Exp. Allergy, 28, 1228-1236 (1998)
非特許文献１３－J. Allergy Clin. Immunol., 103, 421-426 (1999)
非特許文献１４－Blood, 100, 3861-3868 (2002)
非特許文献１５－Genome Biology, 6, R71 (2005)
　ヒトの種々の臓器で発現しているマイクロＲＮＡやその前駆体などの核酸を同定し、その機能を解析し、疾患との関係を解明することにより、新しい治療薬および診断薬が開発されることが期待される。
　特に、肥満細胞で作用しているマイクロＲＮＡやその前駆体などの核酸を見出すことは、肥満細胞における分化や脱顆粒、サイトカイン産生肥満細胞の分化や脱顆粒、炎症性メディエーター産生、サイトカイン産生、ケモカイン産生等の機能解明につながり、肥満細胞の単離・培養・分化制御・脱顆粒制御・炎症性メディエーター産生制御・サイトカイン産生制御・ケモカイン産生制御法の開発およびそれらを利用した新しいアレルギー疾患等の治療法につながると期待できる。
　本発明の目的は、核酸等を用いた肥満細胞の脱顆粒制御剤、肥満細胞の脱顆粒制御に起因する疾患の診断薬または治療薬、肥満細胞の脱顆粒制御方法、肥満細胞の脱顆粒制御剤のスクリーニング方法を提供することにある。
　本発明は以下の（１）～（１８）に関する。
（１）以下の（a）～（h）のいずれかの核酸を有効成分として含有する、肥満細胞の脱顆粒制御剤。
（a）配列番号１～１５４３および３３７２～３７４１のいずれかで表される塩基配列からなる核酸
（b）配列番号１～１５４３および３３７２～３７４１のいずれかで表される塩基配列からなる核酸を含有する、１７～２８塩基の核酸
（c）配列番号１～１５４３および３３７２～３７４１のいずれかで表される塩基配列と９０％以上の同一性を有する塩基配列からなる核酸
（d）配列番号１～１５４３および３３７２～３７４１のいずれかで表される塩基配列からなる核酸の相補鎖とストリンジェントな条件でハイブリダイズする核酸
（e）配列番号１～１５４３および３３７２～３７４１のいずれかで表される塩基配列の２～８番目の塩基配列を含む核酸
（f）配列番号１５４４～３３７１および３７４２～４１４７のいずれかで表される塩基配列からなる核酸
（g）配列番号１５４４～３３７１および３７４２～４１４７のいずれかで表される塩基配列と９０％以上の同一性を有する塩基配列からなる核酸
（h）配列番号１５４４～３３７１および３７４２～４１４７のいずれかで表される塩基配列からなる核酸の相補鎖とストリンジェントな条件でハイブリダイズする核酸
（２）核酸がマイクロＲＮＡまたはマイクロＲＮＡ前駆体である、（１）に記載の肥満細胞の脱顆粒制御剤。
（３）（１）に記載の核酸の塩基配列に対して相補的な塩基配列からなる核酸を有効成分として含有する、肥満細胞の脱顆粒制御剤。
（４）（１）に記載の核酸と、該核酸の塩基配列に対して相補的な塩基配列からなる核酸とからなる二本鎖核酸を有効成分として含有する、肥満細胞の脱顆粒制御剤。
（５）（１）～（３）のいずれかに記載の核酸または（４）に記載の二本鎖核酸を発現するベクターを有効成分として含有する、肥満細胞の脱顆粒制御剤。
（６）（１）に記載の核酸の発現または機能を制御する物質を有効成分として含有する、肥満細胞の脱顆粒制御剤。
（７）核酸の発現または機能を制御する物質がsiRNAまたはアンチセンスオリゴヌクレオチドである、（６）に記載の肥満細胞の脱顆粒制御剤。
（８）（１）に記載の核酸の標的遺伝子の発現を抑制する物質を有効成分として含有する、肥満細胞の脱顆粒制御剤。
（９）核酸の標的配列の発現を抑制する物質がsiRNAまたはアンチセンスオリゴヌクレオチドである、（８）に記載の肥満細胞の脱顆粒制御剤。
（１０）（１）～（３）のいずれかに記載の核酸、（４）に記載の二本鎖核酸、（５）に記載のベクター、または（６）～（９）のいずれかに記載の物質を有効成分として含有する、肥満細胞の異常に起因する疾患の診断薬または治療薬。
（１１）（１）に記載の核酸の発現量、該核酸の変異または該核酸をコードするゲノムの変異を検出する試薬を有効成分として含有する、肥満細胞の異常に起因する疾患の診断薬。
（１２）肥満細胞の異常に起因する疾患がアトピー性皮膚炎、喘息、慢性閉塞性肺疾患およびアレルギー疾患からなる群から選ばれる疾患である、（１０）または（１１）に記載の診断薬または治療薬。
（１３）（１）～（９）のいずれかに記載の脱顆粒抑制剤の有効量を、必要とする対象に投与することを含む、肥満細胞の異常に起因する疾患の治療方法。
（１４）肥満細胞の異常に起因する疾患がアトピー性皮膚炎、喘息、慢性閉塞性肺疾患およびアレルギー疾患からなる群から選ばれる疾患である、（１３）に記載の治療方法。
（１５）肥満細胞の異常に起因する疾患の治療薬の製造のための、（１）～（９）のいずれかに記載の脱顆粒抑制剤の使用。
（１６）肥満細胞の異常に起因する疾患がアトピー性皮膚炎、喘息、慢性閉塞性肺疾患およびアレルギー疾患からなる群から選ばれる疾患である、（１５）に記載の使用。
（１７）（１）～（３）のいずれかに記載の核酸、（４）に記載の二本鎖核酸、（５）に記載のベクター、または（６）～（９）のいずれかに記載の物質を用いることを特徴とする、肥満細胞の脱顆粒制御方法。
（１８）（１）に記載の核酸の発現または機能を促進または抑制させることを指標とする、肥満細胞の脱顆粒制御剤のスクリーニング方法。
　本発明により、核酸等を用いた肥満細胞の脱顆粒制御剤、肥満細胞の脱顆粒制御に起因する疾患の診断薬または治療薬、肥満細胞の脱顆粒制御方法、肥満細胞の脱顆粒制御剤のスクリーニング方法を提供することができる。
　本発明で用いる核酸としては、ヌクレオチドおよび該ヌクレオチドと同等の機能を有する分子が重合した分子であればいかなるものでもよく、例えば、リボヌクレオチドの重合体であるＲＮＡ、デオキシリボヌクレオチドの重合体であるＤＮＡ、ＲＮＡおよびＤＮＡが混合した重合体、ヌクレオチド類似体を含むヌクレオチド重合体をあげることができ、核酸誘導体を含むヌクレオチド重合体であってもよい。該核酸は、一本鎖核酸または二本鎖核酸であってもよい。また二本鎖核酸には、一方の鎖に対し、他方の鎖がストリンジェントな条件でハイブリダイズする二本鎖核酸も含まれる。
　ヌクレオチド類似体としては、ＲＮＡまたはＤＮＡと比較して、ヌクレアーゼ耐性の向上または、安定化させるため、相補鎖核酸とのアフィニティーをあげるため、あるいは細胞透過性をあげるため、あるいは可視化させるために、リボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド、ＲＮＡまたはＤＮＡに修飾を施した分子であれば、いかなる分子であってもよい。例えば、糖部修飾ヌクレオチド類似体やリン酸ジエステル結合修飾ヌクレオチド類似体等があげられる。
　糖部修飾ヌクレオチド類似体としては、ヌクレオチドの糖の化学構造の一部あるいは全てに対し、任意の化学構造物質を付加あるいは置換したものであればいかなるものでもよく、例えば、2’－O－メチルリボースで置換されたヌクレオチド類似体、2’－O－プロピルリボースで置換されたヌクレオチド類似体、2’－メトキシエトキシリボースで置換されたヌクレオチド類似体、2’－O－メトキシエチルリボースで置換されたヌクレオチド類似体、2’－O－［2－（グアニジウム）エチル］リボースで置換されたヌクレオチド類似体、2’－O－フルオロリボースで置換されたヌクレオチド類似体、糖部に架橋構造を導入することにより２つの環状構造を有する架橋構造型人工核酸（Bridged Nucleic Acid）(ＢＮＡ)、より具体的には、２’位の酸素原子と４’位の炭素原子がメチレンを介して架橋したロックト人工核酸（Locked Nucleic Acid）（ＬＮＡ）、およびエチレン架橋構造型人工核酸（Ethylene bridged nucleic acid）（ＥＮＡ）（Nucleic Acid Research, 32, e175(2004)）があげられ、さらにペプチド核酸（PNA）（Acc. Chem. Res., 32, 624 (1999)）、オキシペプチド核酸（ＯＰＮＡ）（J. Am. Chem. Soc., 123, 4653 (2001)）、およびペプチドリボ核酸（ＰＲＮＡ）（J. Am. Chem. Soc., 122, 6900 (2000)）等をあげることができる。
　リン酸ジエステル結合修飾ヌクレオチド類似体としては、ヌクレオチドのリン酸ジエステル結合の化学構造の一部あるいは全てに対し、任意の化学物質を付加あるいは置換したものであればいかなるものでもよく、例えば、ホスフォロチオエート結合に置換されたヌクレオチド類似体、N3'-P5'ホスフォアミデート結合に置換されたヌクレオチド類似体等をあげることができる（細胞工学, 16, 1463-1473 (1997)）（RNAi法とアンチセンス法、講談社(2005)）。
　核酸誘導体としては、核酸に比べ、ヌクレアーゼ耐性を向上させるため、安定化させるため、相補鎖核酸とのアフィニティーをあげるため、細胞透過性をあげるため、あるいは可視化させるために、該核酸に別の化学物質を付加した分子があげられる。例えば、5’－ポリアミン付加誘導体、コレステロール付加誘導体、ステロイド付加誘導体、胆汁酸付加誘導体、ビタミン付加誘導体、Cy5付加誘導体、Cy3付加誘導体、6－FAM付加誘導体、およびビオチン付加誘導体等をあげることができる。
　本発明で用いる核酸としては、例えば以下の(a)～(k)で示される核酸をあげることができる。
（a）配列番号１～１５４３および３３７２～３７４１のいずれかで表される塩基配列からなる核酸
（b）配列番号１～１５４３および３３７２～３７４１のいずれかで表される塩基配列からなる核酸を含む含有する、１７～２８塩基の核酸
（c）配列番号１～１５４３および３３７２～３７４１のいずれかで表される塩基配列と９０％以上の同一性を有する塩基配列からなる核酸
（d）配列番号１～１５４３および３３７２～３７４１のいずれかで表される塩基配列からなる核酸の相補鎖とストリンジェントな条件でハイブリダイズする核酸
（e）配列番号１～１５４３および３３７２～３７４１のいずれかで表される塩基配列の２～８番目の塩基配列を含む核酸
（f）（a）～（e）の核酸と、該核酸の塩基配列に対して相補的な塩基配列を含む核酸とからなる二本鎖核酸、または該二本鎖核酸を含有する核酸
（g）（a）～（e）の核酸と、該核酸とストリンジェントな条件でハイブリダイズする核酸とからなる二本鎖核酸、または該二本鎖核酸を含有する核酸
（h）（f）または（g）の二本鎖核酸が８～２８塩基からなるスペーサーオリゴヌクレオチドで連結されたヘアピン構造を有する一本鎖核酸、または該一本鎖核酸を含有する核酸
（i）配列番号１５４４～３３７１および３７４２～４１４７のいずれかで表される塩基配列からなる核酸
（j）配列番号１５４４～３３７１および３７４２～４１４７のいずれかで表される塩基配列と９０％以上の同一性を有する塩基配列からなる核酸
（k）配列番号１５４４～３３７１および３７４２～４１４７のいずれかで表される塩基配列からなる核酸の相補鎖とストリンジェントな条件でハイブリダイズする核酸。
　上記の核酸としては、マイクロＲＮＡが好ましく用いられる。マイクロＲＮＡとは、１７～２８塩基長からなる一本鎖ＲＮＡをいう。マイクロＲＮＡの該配列を含む周辺ゲノム配列はヘアピン構造を形成し得る配列を有しており、マイクロＲＮＡは該ヘアピンのいずれか片鎖から切り出され得る。マイクロＲＮＡは、その標的となるmRNAに相補的に結合してmRNAの翻訳を抑制し、あるいはmRNAの分解を促進することで遺伝子発現の転写後制御を行う。
　本発明で用いるマイクロＲＮＡとしては、例えば、配列番号１～１５０および３３７２～３４０６のいずれかで表される塩基配列からなるヒトマイクロＲＮＡをあげることができる。さらに配列番号１～１５０および３３７２～３４０６のいずれかで表される塩基配列からなるヒトマイクロＲＮＡと同一の機能を有するマイクロＲＮＡとして、該ヒトマイクロＲＮＡのオーソログである、配列番号１５１～１２３７および３４０７～３６８４のいずれかで表される塩基配列からなる核酸をあげることができる。具体的な例として、配列番号１のヒトマイクロＲＮＡのオーソログは配列番号１５１～１７３および３４０７で表される塩基配列からなるものがあげられる。配列番号１～１５０および３３７２～３４０６のいずれかで表される塩基配列からなるマイクロＲＮＡとそのオーソログの対応表を表１－１～表１－８に示す。なお、表１－１～表１－８の最上段において示される生物種はそれぞれ以下の通りである。hsa、Homo sapiens、ヒト；mmu、Mus musculus、マウス；rno、Rattus norvegicus、ラット；xla、Xenopus laevis、アフリカツメガエル；xtr、Xenopus tropicalis、ニシツメガエル；gga、Gallus gallus、ニワトリ；cfa、Canis familiaris、イヌ；mdo、Monodelphis domestica、ハイイロジネズミオポッサム；age、Ateles geoffroyi、アカクモザル；lla、Lagothrix lagotricha、フンボルトウーリーモンキー；sla、Saguinus labiatus、ムネアカタマリン；mml、Macaca mulatta、アカゲザル；mne、Macaca nemestrina、ブタオザル；pbi、Pygathrix bieti、クロキンシコウ；ggo、Gorilla gorilla、ゴリラ；ppa、Pan paniscus、ボノボ；ptr、Pan troglodytes、チンパンジー；ppy、Pongo pygmaeus、オランウータン；ssy、Symphalangus syndactylus、フクロテナガザル；lca、Lemur catta、ワオキツネザル；cgr、Cricetulus griseus、チャイニーズハムスター；bta、Bos taurus、ウシ；oar、Ovis aries、ヒツジ；ssc、Sus scrofa、ブタ；dre、Danio rerio、ゼブラフィッシュ；fru、Fugu rubripes、トラフグ；tni、Tetraodon nigroviridis、ミドリフグ。ヒト由来マイクロＲＮＡとそのオーソログは、その配列の同一性が高いことから、同様の機能を有していると考えられる。また、マイクロＲＮＡ名末尾に付加されたアルファベットによりサブグループ化されているマイクロＲＮＡ同士もまた、その配列の同一性が高いことから、同様の機能を有していると考えられる。
　［表１－１］
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000001
　［表１－２］
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000002
　［表１－３］
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000003
　［表１－４］
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000004
　［表１－５］
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000005
　［表１－６］
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000006
　［表１－７］
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000007
　［表１－８］
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000008
　マイクロＲＮＡがその標的遺伝子のmRNAの翻訳を抑制するメカニズムとして、マイクロＲＮＡの5’末端側2～8番目の塩基配列に対して相補的な塩基配列を有するmRNAは、マイクロＲＮＡ標的遺伝子として認識されることが知られている（Current Biology, 15, R458-R460 (2005)）。このメカニズムにより、該mRNAの発現がマイクロＲＮＡによって抑制される。従って、５’末端側2～8番目が同じ塩基配列を有するマイクロＲＮＡは、同じ標的遺伝子のmRNAの発現を抑制して同様の機能を有する。配列番号１～１５０および３３７２～３４０６のいずれかで表される塩基配列からなるマイクロＲＮＡと５’末端側2～8番目が同じ塩基配列を有するマイクロＲＮＡとして、配列番号１２３８～１５４３および３６８５～３７４１で表される塩基配列からなる核酸をあげることができる。該マイクロＲＮＡの具体的な例としては、配列番号１のマイクロＲＮＡに対しては、配列番号１２３８～１２８６のいずれかで表される塩基配列からなるマイクロＲＮＡをあげることができる。配列番号１～１５０および３３７２～３４０６で表される塩基配列からなるマイクロＲＮＡとその５’末端側2～8番目が同じ塩基配列を有するマイクロＲＮＡの対応表を表２－１～表２－８に示す。共通のシード配列を有するマイクロＲＮＡは、その標的塩基配列が同一と考えられることから、同様の機能を有していると考えられる。
　［表２－１］
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000009
　［表２－２］
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000010
　［表２－３］
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000011
　［表２－４］
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000012
　［表２－５］
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000013
　［表２－６］
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000014
　［表２－７］
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000015
　［表２－８］
　上記の核酸としては、マイクロＲＮＡ前駆体もまた好ましく用いられる。マイクロＲＮＡ前駆体とは、上記本発明で用いる核酸を含む約５０～約２００塩基長、より好ましくは約７０～約１００塩基長の核酸であり、ヘアピン構造を形成し得る核酸である。マイクロＲＮＡは、Dicerと呼ばれる蛋白質によるプロセシングを経て、マイクロＲＮＡ前駆体から生成される。
　本発明で用いるマイクロＲＮＡ前駆体として、例えば、配列番号１のヒトマイクロＲＮＡに対しては配列番号１５４４～１５４５で表される塩基配列からなる核酸をあげることができる。また、配列番号２～１５４３および３３７２～３７４１で表されるマイクロＲＮＡに対しては、配列番号１５４６～３３７１および３７４２～４１４７で表される塩基配列からなる核酸をあげることができる。本発明で用いるマイクロＲＮＡとマイクロＲＮＡ前駆体の対応表を表３－１～表３－３９に示す。
　［表３－１］
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000017
　［表３－２］
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000018
　［表３－３］
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000019
　［表３－４］
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000020
　［表３－５］
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000021
　［表３－６］
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000022
　［表３－７］
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000023
　［表３－８］
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000024
　［表３－９］
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000025
　［表３－１０］
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000026
　［表３－１１］
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000027
　［表３－１２］
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000028
　［表３－１３］
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000029
　［表３－１４］
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000030
　［表３－１５］
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000031
　［表３－１６］
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000032
　［表３－１７］
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000033
　［表３－１８］
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000034
　［表３－１９］
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000035
　［表３－２０］
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000036
　［表３－２１］
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000037
　［表３－２２］
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000038
　［表３－２３］
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000039
　［表３－２４］
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000040
　［表３－２５］
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000041
　［表３－２６］
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000042
　［表３－２７］
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000043
　［表３－２８］
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000044
　［表３－２９］
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000045
　［表３－３０］
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000046
　［表３－３１］
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000047
　［表３－３２］
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000048
　［表３－３３］
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000049
　［表３－３４］
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000050
　［表３－３５］
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000051
　［表３－３６］
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000052
　［表３－３７］
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000053
　［表３－３８］
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000054
　［表３－３９］
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000055
　本発明において、配列番号１～４１４７のいずれかで表される塩基配列と９０％以上の同一性を有する核酸とは、ＢＬＡＳＴ（J. Mol. Biol., 215, 403 (1990)）やＦＡＳＴＡ（Methods in Enzymology, 183, 63 (1990)）等の解析ソフトを用いて計算したときに、配列番号１～３３７１のいずれかで表される塩基配列からなる核酸と少なくとも９０％以上、好ましくは９３％以上、より好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９６％以上、特に好ましくは９７％以上、最も好ましくは９８％以上である核酸であることを意味する。
　また、上記においてストリンジェントな条件とは、一方の鎖をブロットしたメンブレンに対し、7.5 mL、1M Na2HPO4(pH7.2) 0.6 mL、10% SDS 21 mL、50xDenhardt's solution 0.6 mL、10 mg/mL sonicated salmon sperm DNA 0.3 mLからなるHybridization bufferに、32P-ATPで標識した他方の鎖を加え、50 ℃で一晩反応させた後、50 ℃で10分間、5xSSC/5%SDS液で洗浄し、更に50℃で10分間、1xSSC/1%SDS液で洗浄し、その後メンブレンを取り出し、Ｘ線フィルムに感光させることによりシグナルを検出できる条件である。
　本発明で用いる核酸を用いてマイクロＲＮＡなどの核酸の発現を検出する方法としては、検体中のマイクロＲＮＡあるいはマイクロＲＮＡ前駆体などの核酸の存在が検出できる方法であれば、いかなる方法でもよく、例えば、（１）ノーザンハイブリダイゼーション、（２）ドットブロットハイブリダイゼーション、（３）in situハイブリダイゼーション、（４）定量的ＰＣＲ、（５）デファレンシャル・ハイブリダイゼーション、（６）マイクロアレイ、（７）リボヌクレアーゼ保護アッセイ等があげられる。
　本発明で用いる核酸を用いてマイクロＲＮＡなどの核酸の発現量、該核酸の変異、該核酸をコードするゲノムの変異を検出する方法としては、検体中のマイクロＲＮＡあるいはマイクロＲＮＡ前駆体などの核酸の塩基配列の変異が検出できる方法であればいかなる方法でもよく、例えば、非変異型塩基配列を有する核酸と変異型塩基配列を有する核酸とのハイブリダイズにより形成されるヘテロ二本鎖を検出する方法や、あるいは、検体由来の塩基配列を直接配列決定して、変異の有無を検出する方法等をあげることができる。
　本発明で用いる核酸を発現するベクターとしては、細胞内に導入して転写されることにより本発明で用いるマイクロＲＮＡなどの核酸が生合成されるように設計されたベクターであればいかなるものであってもよい。細胞内で本発明で用いるマイクロＲＮＡなどの核酸を発現することができるベクターとしては、具体的には、pCDNA6.2-GW/miR（Invitrogen社製）、pSilencer 4.1-CMV（Ambion社製）、pSINsi-hH1 DNA（タカラバイオ社製）、pSINsi-hU6 DNA（タカラバイオ社製）、pENTR/U6（Invitrogen社製）等をあげることができる。
　本発明で用いるマイクロＲＮＡなどの核酸の標的塩基配列を有する遺伝子（以下、標的遺伝子ともいう）の発現を抑制する方法としては、該標的塩基配列を有する遺伝子の発現を抑制する方法であれば、いかなる方法でもよい。なお、発現を抑制するとは、mRNAの翻訳を抑制させる場合、およびmRNAを切断あるいは分解することによって、結果としてmRNAから翻訳される蛋白質の量を減少させる場合も含まれる。該標的塩基配列を有するmRNAの発現を抑制する物質としては、具体的にはsiRNAやアンチセンスオリゴヌクレオチドなどの核酸があげられる。該siRNAは、該mRNAの連続した配列情報を基に作製することができる（Genes Dev., 13, 3191 (1999)）。siRNAの一方の鎖を構成する塩基の残基数は、好ましくは１７～３０残基、より好ましくは１８～２５残基、さらに好ましくは１９～２３残基である。
　本発明で用いられるマイクロＲＮＡとしては、配列番号１～１５４３および３３７２～３７４１のいずれかで表されるマイクロＲＮＡの標的塩基配列を有する遺伝子（標的遺伝子）に存在する連続する７塩基の配列と相補する配列を２～８番目の塩基配列として含む、１７～２８塩基長からなる一本鎖ＲＮＡである人工マイクロＲＮＡも含まれる。人工マイクロＲＮＡ配列を含みそれを前後に延長させた配列がヘアピン構造を形成し、該マイクロＲＮＡ配列が細胞内でそのヘアピン構造のいずれか片鎖からマイクロＲＮＡの生合成経路によって切り出され得るＲＮＡである場合、その延長された配列を人工マイクロＲＮＡ前駆体という。発現を抑制したい遺伝子を標的遺伝子として、上記のような方法を用いて人工マイクロＲＮＡおよび人工マイクロＲＮＡ前駆体を設計することができる。
　マイクロＲＮＡの標的塩基配列とは、本発明で用いるマイクロＲＮＡによって認識される数塩基からなる核酸の塩基配列で、かつ、該塩基配列を有するmRNAの発現が該マイクロＲＮＡにより抑制される塩基配列をいう。マイクロＲＮＡの5’末端側2～8番目の塩基配列に対して相補的な塩基配列は、該塩基配列を有するmRNAが該マイクロＲＮＡによって翻訳が抑制されるので（Current Biology, 15, R458-R460 (2005)）、本発明で用いるマイクロＲＮＡの5’末端側2～8番目の塩基配列に対して相補的な塩基配列が、該マイクロＲＮＡの標的塩基配列としてあげることができる。例えば、マイクロＲＮＡの5’末端側2-8番目の塩基配列に対して相補的な標的配列を用意し、ヒトmRNAの3'UTR塩基配列群に対して、文字列探索などの方法で選抜することで、完全一致配列を含有するmRNAを決定することができる。ヒトmRNAの3'UTR塩基配列群は、「UCSC Human Genome Browser Gateway（http://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgGateway）」より取得できるゲノム配列および遺伝子位置情報を用いて作製することができる。
　配列番号１～１５４３および３３７２～３７４１のいずれかで表されるマイクロＲＮＡの標的塩基配列を有する遺伝子の具体的な例としては、米国国立バイオテクノロジー情報センターNational Center for Biotechnology Information(NCBI)のEntreGeneデータベース（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Entrez/）で使われている名前（Official SymbolとGene ID）で表記された表４－１～表４～１４８に記載の遺伝子をあげることができる。
　［表４－１］
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000056
　［表４－２］
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000057
　［表４－３］
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000058
　［表４－４］
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000059
　［表４－５］
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000060
　［表４－６］
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000061
　［表４－７］
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000062
　［表４－８］
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000063
　［表４－９］
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000064
　［表４－１０］
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000065
　［表４－１１］
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000066
　［表４－１２］
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000067
　［表４－１３］
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000068
　［表４－１４］
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000069
　［表４－１５］
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000070
　［表４－１６］
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000071
　［表４－１７］
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000072
　［表４－１８］
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000073
　［表４－１９］
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000074
　［表４－２０］
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000075
　［表４－２１］
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000076
　［表４－２２］
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000077
　［表４－２３］
　［表４－２４］
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000079
　［表４－２５］
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000080
　［表４－２６］
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000081
　［表４－２７］
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000082
　［表４－２８］
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000083
　［表４－２９］
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000084
　［表４－３０］
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000085
　［表４－３１］
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000086
　［表４－３２］
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000087
　［表４－３３］
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000088
　［表４－３４］
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000089
　［表４－３５］
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000090
　［表４－３６］
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000091
　［表４－３７］
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000092
　［表４－３８］
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000093
　［表４－３９］
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000094
　［表４－４０］
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000095
　［表４－４１］
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000096
　［表４－４２］
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000097
　［表４－４３］
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000098
　［表４－４４］
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000099
　［表４－４５］
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000100
　［表４－４６］
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000101
　［表４－４７］
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000102
　［表４－４８］
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000103
　［表４－４９］
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000104
　［表４－５０］
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000105
　［表４－５１］
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000106
　［表４－５２］
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000107
　［表４－５３］
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000108
　［表４－５４］
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000109
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　本発明で用いるマイクロＲＮＡなどの核酸の発現または機能を制御する物質としては、該核酸の発現または機能を阻害する物質であれば、低分子化合物、抗体、siRNAなどいかなる物質でも良いが、特にsiRNAが好ましい。本発明で用いるマイクロＲＮＡなどの核酸の発現を抑制する物質としては、マイクロＲＮＡの生合成に必須な因子の機能を阻害する物質を用いることもできる。マイクロＲＮＡの生合成に必須な因子としては、例えば、Dicer、TRBP、Exportin5、Drosha、DGCR8などがあげられる。
　本発明において、マイクロＲＮＡなどの核酸を細胞で発現させる方法としては、例えば、マイクロＲＮＡをコードする遺伝子の他、細胞内に導入された際にマイクロＲＮＡなどを発現する核酸を用いる方法があげられる。該核酸としては、DNA、RNAまたはヌクレオチド類似体の他、これらのキメラ分子、あるいは該核酸の誘導体も用いることができる。具体的には、Pre-miRTMmiRNA Precursor Molecules（Ambion社製）やmiRIDIAN microRNA Mimics（GEヘルスケア社製）と同様に該核酸を設計し、本発明のマイクロＲＮＡなどの核酸を細胞内で発現させることができる。マイクロＲＮＡを発現させる場合は、細胞内で最終的にマイクロＲＮＡができる状態になればいかなる方法でもよく、例えば、（１）マイクロＲＮＡ前駆体である一本鎖ＲＮＡ、（２）マイクロＲＮＡおよび該マイクロＲＮＡの相補鎖からなり、かつ両者が完全に相補する２本鎖からなるＲＮＡ、（３）マイクロＲＮＡがDicerに切断された後の状態を想定した２本鎖ＲＮＡを、それぞれ導入させる方法があげられる。こうした方法を使用した製品としては、それぞれ例えば、miCENTURY OX Precursor（B-Bridge社製）、miCENTURY OX siMature（B-Bridge社製）、miCENTURY OX miNatural（B-Bridge社製）をあげることができる。
　本発明で用いる核酸を製造する方法としては、特に限定されず、公知の化学合成を用いる方法、あるいは、酵素的転写法等にて製造することができる。公知の化学合成を用いる方法として、ホスホロアミダイト法、ホスフォロチオエート法、ホスホトリエステル法等をあげることができ、例えば、ABI3900ハイスループット核酸合成機（アプライドバイオシステムズ社製）により合成することができる。酵素的転写法としては、目的の塩基配列を有したプラスミドまたはDNAを鋳型として典型的なファージRNAポリメラーゼ、例えば、T7、T3、またはSP6 RNAポリメラーゼを用いた転写をあげることができる。
　本発明で用いる核酸を用いて、該核酸の発現または機能を制御する物質をスクリーニングする方法としては、例えば、該核酸を発現するベクターを細胞に導入し、それらの標的塩基配列を有するmRNAの発現または機能を促進または抑制する物質をスクリーニングする方法があげられる。
　本発明で用いる核酸を有効成分とする医薬は、肥満細胞の異常に起因する疾患の診断または治療に用いることができる。
　肥満細胞の異常に起因する疾患としては、具体的には、アトピー性皮膚炎、喘息、慢性閉塞性肺疾患、およびアレルギー疾患等をあげることができる。
　肥満細胞の異常としては、脱顆粒の異常があげられるため、本発明で用いる核酸は、肥満細胞の脱顆粒制御剤、すなわち脱顆粒促進剤または脱顆粒抑制剤として用いることができる。
　肥満細胞の脱顆粒抑制剤は、アトピー性皮膚炎、喘息、慢性閉塞性肺疾患、およびアレルギー疾患等の予防剤、治療剤として、好適に用いられる。
　肥満細胞の脱顆粒促進剤は、免疫付活化剤として、好適に用いられる。
　以下、本発明を詳細に説明する。
１．肥満細胞で発現するマイクロＲＮＡおよびマイクロＲＮＡ前駆体などの核酸の発現を検出する方法
（１－１）肥満細胞の取得、培養
　ヒト肥満細胞は、安全かつ効率的に取得される方法であれば特に限定されないが、例えば、ヒトの肺、皮膚、胎児肝臓などから公知の方法（J. Immunol. Methods, 169, 153 (1994); J. Immunol., 138, 861 (1987); J. Allergy Clin. Immunol., 107, 322 (2001); J. Immunol. Methods., 240, 101 (2000)）により調製することができる。また、公知の方法（J. Immunol., 157, 343, (1996); Blood, 91, 187 (1998); J. Allergy Clin. Immunol., 106, 141 (2000); Blood, 97, 1016 (2001); Blood, 98, 1127 (2001); Blood, 100, 3861 (2002); Blood, 97, 2045 (2001)）に従って、ヒトの臍帯血、末梢血、骨髄、肺あるいは皮膚から調製した単核球を、幹細胞因子（Stem Cell Factor, 以下、SCFと略す）の存在下で培養し、肥満細胞に分化させることにより、調製することができる。
　また、ヒト肥満細胞から樹立した細胞株を用いることもできる。ヒト肥満細胞株としては、ヒト肥満細胞の性質をよく保持していることが知られているLAD2（Leuk. Res., 27, 671 (2003); Leuk. Res., 27, 677 (2003)）等があげられる。
（１－２）RNAの取得
　上記の各種方法で取得した肥満細胞から全RNAを抽出する方法は、マイクロＲＮＡなどの低分子RNAが含まれる方法であれば特に限定されないが、例えば、モレキュラー・クローニング第３版に記載の方法により行うことができる。あるいは、Trizol（Invitrogen社製）、ISOGEN（ニッポンジーン社製）、mirVanaTMmiRNA Isolation Kit（Ambion社製）、miRNeasy Mini Kit（キアゲン社製）などを用いて抽出することもできる。
　また、低分子RNAを含む全RNAから低分子RNAをクローニングすることもできる。低分子RNAのクローニング法としては、具体的には、ジーンズ　アンド　デベロップメント（Genes & Development）, 15, 188-200 (2000)に記載の方法に準じて、15%ポリアクリルアミドゲル電気泳動による低分子RNAを分離する方法があげられる。これより5’末端脱リン酸化、3’－アダプターライゲーション、リン酸化、5’－アダプターライゲーション、逆転写、PCR増幅、コンカテマー化、ベクターへのライゲーションを順次経て、低分子RNAをクローニングし、そのクローンの塩基配列を決定する方法等があげられる。あるいは、例えば、サイエンス（Science）, 294, 858-862 (2001)に記載の方法に準じて、15%ポリアクリルアミドゲル電気泳動による低分子RNAの分離および切り出し、5’－アデニル化3’－アダプターライゲーション、5’－アダプターライゲーション、逆転写、PCR増幅、コンカテマー化、ベクターへのライゲーションを順次経て、低分子RNAをクローニングし、そのクローンの塩基配列を決定することもできる。
　また、Nucleic Acids Research, 34, 1765-1771 (2006)に記載の方法により、15%ポリアクリルアミドゲル電気泳動による低分子RNAの分離および切り出し、5’末端脱リン酸化、3’－アダプターライゲーション、リン酸化、5’－アダプターライゲーション、逆転写、PCR増幅、マイクロビーズベクターへのライゲーションを順次経て、低分子RNAをクローニングし、そのマイクロビーズの塩基配列を読み取ることで塩基配列を決定することにより低分子RNAを取得することもできる。
　低分子RNAを取得する他の方法として、small RNA Cloning Kit（タカラバイオ社製）を用いる方法があげられる。
（１－３）マイクロＲＮＡの同定
　低分子RNA配列がマイクロＲＮＡであるかは、アール　エヌ　エイ（RNA）, 9, 277-279 (2003)に記載の基準に従うか否かで判定できる。例えば、新たに取得して塩基配列を決定した低分子RNAの場合、以下のようにして判定することができる。
　取得した低分子RNA塩基配列に対応するDNA配列を5’末端側および3’末端側にそれぞれ50 塩基程度伸ばした周辺ゲノム配列を取得し、そのゲノム配列から転写されることが予測されるRNAの2次構造を予測する。その結果、ヘアピン構造を有し、且つ該低分子RNAの塩基配列がヘアピンの片鎖に位置する場合、該低分子RNAはマイクロＲＮＡであると判定できる。ゲノム配列は一般に公開されており、例えば、UCSC Genome Bioinformatics (http://genome.ucsc.edu/) から入手可能である。また、2次構造予測も様々なプログラムが公開されており、例えば、RNAfold （Nucleic Acids Research, 31, 3429-3431 (2003)）やMfold （Nucleic Acids Research, 31, 3406-3415 (2003)） 等を用いることができる。また、既存のマイクロＲＮＡ配列はmiRBase (http://microrna.sanger.ac.uk/) というデータベースに登録されており、ここに記載の配列と同一か否かで、既存のマイクロＲＮＡと同一か否かを判定することができる。
（１－４）マイクロＲＮＡなどの核酸の発現量の検出法
　マイクロＲＮＡおよびその前駆体などの核酸の発現量を検出する方法としては、例えば、（１）ノーザンハイブリダイゼーション、（２）ドットブロットハイブリダイゼーション、（３）in situハイブリダイゼーション、（４）定量的PCR、（５）デファレンシャル・ハイブリダイゼーション、（６）マイクロアレイ、（７）リボヌクレアーゼ保護アッセイ等による方法があげられる。
　ノーザンハイブリダイゼーションは、検体由来RNAをゲル電気泳動で分離後、ナイロンフィルター等の支持体に転写し、該核酸の塩基配列をもとに適宜標識をしたプローブを作製し、ハイブリダイゼーションおよび洗浄をおこなうことで、本発明の核酸に特異的に結合したバンドを検出する方法であり、具体的には、例えば、Science, 294, 853-858 (2001)に記載の方法等に従って行うことができる。
　標識プローブは、例えば、ニック・トランスレーション、ランダム・プライミングまたは5'末端のリン酸化等の方法により放射性同位体、ビオチン、ジゴキシゲニン、蛍光基、化学発光基等を、該核酸の塩基配列と相補的な配列を有するDNAやRNA、あるいはLNAに取り込ませることで調製できる。標識プローブの結合量は該核酸の発現量を反映することから、結合した標識プローブの量を定量することで該核酸の発現量を定量することができる。電気泳動、メンブレンへの移行、プローブの調製、ハイブリダイゼーション、核酸の検出については、モレキュラー・クローニング第３版に記載の方法により行うことができる。
　ドットブロットハイブリダイゼーションは、組織や細胞から抽出したRNAをメンブラン上に点状にスポットして固定し、プローブとなる標識したポリヌクレオチドとハイブリダイゼーションを行い、プローブと特異的にハイブリダイズするRNAを検出する方法である。プローブとしてはノーザンハイブリダイゼーションと同様のものを用いることができる。RNAの調製、RNAのスポット、ハイブリダイゼーション、RNAの検出については、モレキュラー・クローニング第３版に記載の方法により行なうことができる。
　in situハイブリダイゼーションは、生体から取得した組織のパラフィンまたはクリオスタット切片、あるいは固定化した細胞を検体として用い、標識したプローブとハイブリダイゼーションならびに洗浄の工程を行い、顕微鏡観察により、核酸の組織や細胞内での分布や局在を調べる方法である（Methods in Enzymology, 254, 419 (1995)）。プローブとしてはノーザンハイブリダイゼーションと同様のものを用いることができる。具体的には、Nature Method, 3, 27 (2006)に記載の方法に従って、マイクロＲＮＡなどの核酸を検出することができる。
　定量的PCRでは、検体由来RNAから、逆転写用プライマーと逆転写酵素を用いて合成したcDNA（以下、該cDNAを検体由来cDNAともいう）を測定に用いる。cDNA合成に供する逆転写用プライマーとして、ランダムプライマーあるいは特異的RTプライマー等を用いることができる。特異的RTプライマーとは、核酸およびその周辺ゲノム配列に対応する塩基配列に相補する配列を有するプライマーをいう。
　例えば、検体由来cDNAを合成後、これを鋳型とし、本発明で用いるマイクロＲＮＡやマイクロＲＮＡ前駆体などの核酸およびその周辺ゲノム配列に対応する塩基配列、あるいは逆転写用プライマーに対応する塩基配列から設計した鋳型特異的なプライマーを用いてPCRを行い、本発明で用いる核酸を含むcDNAの断片を増幅させ、ある一定量に達するまでのサイクル数から検体由来RNAに含まれる本発明の核酸の量を検出する。鋳型特異的なプライマーとしては、該核酸およびその周辺ゲノム配列に対応する適当な領域を選択し、その領域の塩基配列の5'端20～40塩基の配列からなるDNAまたはLNA、および3'端20～40塩基と相補的な配列からなるDNAまたはLNAの組を用いることができる。具体的には、Nucleic Acids Research, 32, e43 (2004)に記載の方法等に準じて行うことができる。
　または、cDNA合成に供する逆転写用プライマーとして、ステム・ループ構造を有した特異的RTプライマーを用いることもできる。具体的には、Nucleic Acid Research, 33, e179 (2005)に記載の方法により、あるいは、TaqMan MicroRNA Assays（アプライドバイオシステムズ社製）を用いて行うことができる。
　更に、本発明で用いるマイクロＲＮＡやマイクロＲＮＡ前駆体などの核酸を少なくとも1つ以上含む塩基配列に対応するDNAあるいはLNAを、固定化させたフィルターあるいはスライドガラスやシリコンなどの基盤に対して、検体由来cDNAをハイブリダイゼーションし、洗浄を行うことにより、該核酸の量の変動を検出することができる。このようなハイブリダイゼーションに基づく方法としては、ディファレンシャルハイブリダイゼーション（Trends Genet., 7, 314 (1991)）やマイクロアレイ（Genome Res., 6, 639 (1996)）を用いる方法があげられる。いずれの方法もフィルターあるいは基盤上にU6RNAに対応する塩基配列などの内部コントロールを固定化することで、対照検体と標的検体の間での該核酸の量の違いを正確に検出することができる。また対照検体と標的検体由来のRNAをもとにそれぞれ異なる標識のdNTP（dATP、dGTP、dCTP、dTTPの混合物）を用いて標識cDNA合成を行い、１枚のフィルターあるいは１枚の基盤に２つの標識cDNAを同時にハイブリダイズさせることで正確に該核酸の定量を行うことができる。例えば、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 101, 9740-9744 (2004)やNucleic Acid Research, 32, e188 (2004)等に記載のマイクロアレイを用いてマイクロＲＮＡなどの核酸を検出することができる。具体的には、mirVana miRNA Bioarray（Ambion社製）を用いて検出または定量することができる。
　リボヌクレアーゼ保護アッセイでは、まず本発明で用いるマイクロＲＮＡやマイクロＲＮＡ前駆体などの核酸あるいはその周辺ゲノム配列に対応する塩基配列の3'端にT7プロモーター、SP6プロモーターなどのプロモーター配列を結合し、標識したNTP（ATP、GTP、CTP、UTPの混合物）およびRNAポリメラーゼを用いたイン・ビトロの転写系により、標識したアンチセンスRNAを合成する。該標識アンチセンスRNAを、検体由来RNAと結合させて、RNA-RNAハイブリッドを形成させた後、１本鎖RNAのみを分解するリボヌクレアーゼAで消化する。該消化物をゲル電気泳動し、RNA-RNAハイブリッドを形成することにより消化から保護されたRNA断片を、該核酸として検出または定量する。具体的には、mirVana miRNA Detection Kit（Ambion社製）を用いて検出または定量することができる。
２．核酸の合成
　本発明で用いるマイクロＲＮＡおよびマイクロＲＮＡ前駆体などの核酸は、塩基配列に基づいてリボヌクレオチドの重合体であるRNAの他、デオキシリボヌクレオチドの重合体であるDNAも合成することができる。例えば、上記１で同定したマイクロＲＮＡの塩基配列をもとに、DNAの塩基配列を決定することができる。RNAの塩基配列に対応するDNAの塩基配列は、RNAの配列に含まれるU（ウラシル）をT（チミン）に読み替えることで一義的に決定できる。また、リボヌクレオチドとデオキシリボヌクレオチドが混合した重合体や、ヌクレオチド類似体を含む重合体も同様にして合成することができる。
　本発明で用いる核酸を合成する方法としては、特に限定されず、公知の化学合成を用いる方法、あるいは、酵素的転写法等を用いることができる。公知の化学合成を用いる方法として、ホスホロアミダイト法、ホスフォロチオエート法、ホスホトリエステル法等をあげることができ、例えば、ABI3900ハイスループット核酸合成機（アプライドバイオシステムズ社製）により合成することができる。酵素的転写法としては、目的の塩基配列を有したプラスミドまたはDNAを鋳型として典型的なファージＲＮＡポリメラーゼ、例えば、T7、T3、またはSP6RNAポリメラーゼを用いた転写による方法をあげることができる。
３．マイクロＲＮＡやマイクロＲＮＡ前駆体などの核酸の機能を検出する方法
　マイクロＲＮＡなどの核酸の機能を検出する方法としては、標的塩基配列を有するmRNAの翻訳を抑制するか否かで機能を測定する方法をあげることができる。
　マイクロＲＮＡは、その標的塩基配列を3’UTRに含むmRNAの翻訳を抑制することが知られている（Current Biology, 15, R458-R460 (2005)）。そこで、測定しようとする一本鎖RNAに対する標的塩基配列を、適当なレポーター遺伝子発現ベクターの3’UTRに挿入したDNAを作製して、発現ベクターに適合した宿主細胞に導入し、その細胞に一本鎖RNAを発現させた時に、レポーター遺伝子の発現を測定することで、マイクロＲＮＡの機能を有しているか否かを検出することができる。
　レポーター遺伝子発現ベクターは、レポーター遺伝子の上流にプロモーターを有しており、宿主細胞においてレポーター遺伝子が発現できるものであればいかなるものでもよい。レポーター遺伝子としては、例えば、ホタル・ルシフェラーゼ遺伝子、ウミシイタケ・ルシフェラーゼ遺伝子、クロラムフェニコール・アセチルトランスフェラーゼ遺伝子、β－グルクロニダーゼ遺伝子、β－ガラクトシダーゼ遺伝子、β-ラクタマーゼ遺伝子、エクオリン遺伝子、グリーン・フルオレッセント・プロテイン遺伝子、DsRed蛍光遺伝子等を用いることできる。こうした性質を有するレポーター遺伝子発現ベクターとして、例えば、psiCHECK-1（Promega社製）、psiCHECK-2（Promega社製）、pGL3-Control（Promega社製）、pGL4（Promega社製）、pRNAi-GL（タカラバイオ社製）、pCMV-DsRed-Express（CLONTECH社製）等をあげることができる。また、一本鎖RNAは、後述の５に記載した方法で発現させることができる。
　一本鎖ＲＮＡのマイクロＲＮＡとしての機能は、以下のようにして検出することができる。まず宿主細胞をマルチウェルプレート等に培養し、標的配列を有したレポーター遺伝子発現ベクターと一本鎖RNAを発現させる。その後、レポーター活性を測定し、一本鎖RNAを発現させない場合に比べて、一本鎖RNAを発現させた場合のレポーター活性を測定することで、マイクロRNAの機能を検出することができる。
４．マイクロＲＮＡやマイクロＲＮＡ前駆体などの核酸の変異を検出する方法
　マイクロＲＮＡやマイクロＲＮＡ前駆体などの核酸の変異を検出する方法として、正常型と変異型の核酸のハイブリダイズにより形成されるヘテロ二本鎖を検出する方法を用いることができる。
　ヘテロ二本鎖を検出する方法としては、（１）ポリアクリルアミドゲル電気泳動によるヘテロ二本鎖検出法 （Trends genet., 7, 5 (1991)）、（２）一本鎖コンフォメーション多型解析法 （Genomics, 16, 325-332 (1993)）、（３）ミスマッチの化学的切断法 (CCM, chemical cleavage of mismatches) （Human Genetics (1996), Tom Strachan and Andrew P. Read, BIOS Scientific Publishers Limited）、（４）ミスマッチの酵素的切断法 （Nature Genetics, 9, 103-104 (1996)）、（５）変性ゲル電気泳動法 （Mutat. Res., 288, 103-112 (1993)）等の方法があげられる。
　ポリアクリルアミドゲル電気泳動法によるヘテロ二本鎖検出法は、例えば、以下のようにして行う。まず、検体由来DNAあるいは検体由来cDNAをテンプレートに対し、本発明で用いる核酸の塩基配列を含むゲノムの塩基配列を基に設計したプライマーにより、200 塩基対よりも小さい断片として増幅する。ヘテロ二本鎖が形成された場合は、変異を持たないホモ二本鎖よりも移動度が遅く、それらは余分なバンドとして検出することができる。200 塩基対よりも小さい断片であれば、１塩基以上のほとんどの挿入、欠失、置換を検出することができる。ヘテロ二本鎖解析は、次に述べる一本鎖コンフォメーション解析と組み合わせた１枚のゲルで行うことが望ましい。
　一本鎖コンフォメーション多型解析（SSCP解析；single strand conformation polymorphism analysis）では、検体由来DNAあるいは検体由来cDNAをテンプレートにして、本発明の核酸の塩基配列を含むゲノムの塩基配列に基づき設計したプライマーを用いて、200bpよりも小さい断片として増幅したDNAを変性後に、未変性ポリアクリルアミドゲル中で泳動する。DNA増幅を行う際にプライマーを同位体あるいは蛍光色素で標識するか、または未標識の増幅産物を銀染色することにより、増幅したDNAをバンドとして検出することができる。野生型のパターンとの相違を明らかにするために、コントロールの検体も同時に泳動すると、移動度の違いから変異を持った断片を検出できる。
　ミスマッチ化学的切断法（CCM法）では、検体由来DNAあるいは検体由来cDNAをテンプレートに、本発明の核酸の塩基配列を含むゲノムの塩基配列に基づき設計したプライマーで増幅したDNA断片を、本発明の核酸に同位体あるいは蛍光標識をとり込ませた標識核酸とハイブリダイズさせ、四酸化オスミウムで処理することでミスマッチしている場所のDNAの一方の鎖を切断させ変異を検出することができる。CCMは最も感度の高い検出法の１つであり、キロベースの長さの検体にも適応できる。
　上記の四酸化オスミウムの代わりに、T4ファージリゾルベースとエンドヌクレアーゼVIIのような細胞内でミスマッチの修復に関与する酵素とRNaseAと組み合わせることで、酵素的にミスマッチを切断することもできる。
　変性ゲル電気泳動法（denaturing gradient gel electrophoresis：DGGE法）では、検体由来DNAあるいは検体由来cDNAをテンプレートに、本発明の核酸の塩基配列を含むゲノムの塩基配列に基づき設計したプライマーで増幅したDNA断片を化学的変性剤の濃度勾配や温度勾配を有するゲルを用いて電気泳動する。増幅したDNA断片はゲル内を一本鎖に変性する位置まで移動し、変性後は移動しなくなる。変異がある場合とない場合では増幅したDNAのゲル内での移動が異なることから、変異の存在を検出できる。検出感度を上げるにはそれぞれのプライマーにポリ（G:C）端末をつけるとよい。
　また、検体由来DNAあるいは検体由来cDNAの塩基配列を直接的に決定し、解析することにより、本発明で用いる核酸の変異を検出することもできる。
５．マイクロＲＮＡやマイクロＲＮＡ前駆体などの核酸を発現させる方法
　本発明で用いる核酸は、細胞内に導入して転写されることにより生合成されるようなベクターを用いることにより発現させることができる。具体的には、上記の核酸あるいは、その塩基配列を含むゲノムの塩基配列をもとに、ヘアピン部分を含むＤＮＡ断片を調製し、発現ベクターのプロモーター下流に挿入して発現プラスミドを造成し、次に該発現プラスミドを、該発現ベクターに適合した宿主細胞に導入することにより、上記の核酸を発現させることができる。
　発現ベクターとしては、宿主細胞において自立複製可能または染色体中への組込みが可能で、本発明の核酸の塩基配列を含む遺伝子を転写できる位置にプロモーターを含有しているものが用いられる。プロモーターとしては、宿主細胞中で発現できるものであれば、いかなるものでもよく、例えば、RNA polymerase II(pol II)系プロモーターやU6RNAやH1RNAの転写系であるRNA polymerase III(pol III)系プロモーター等をあげることができる。pol II系プロモーターとしては例えば、サイトメガロウィルス（ヒトCMV）のIE(immediate early)遺伝子のプロモーター、SV40の初期プロモーター等をあげることができる。それらを用いた発現ベクターとして、例えば、pCDNA6.2-GW/miR（Invitrogen社製）、pSilencer 4.1-CMV（Ambion社製）等を例示することができる。pol III系プロモーターとしてはU6 RNAやH1 RNAあるいはtRNAのプロモーターをあげることができる。それらを用いた発現ベクターとして、例えば、pSINsi-hH1 DNA（タカラバイオ社製）、pSINsi-hU6 DNA（タカラバイオ社製）、pENTR/U6（Invitrogen社製）等をあげることができる。
　または、本発明で用いる核酸の塩基配列を含む遺伝子をウィルスベクター内のプロモーター下流に挿入して組換えウィルスベクターを造成し、該ベクターをパッケージング細胞に導入して組換えウィルスを生産して、該核酸の塩基配列を含む遺伝子を発現させることもできる。
　パッケージング細胞はウィルスのパッケジ－ングに必要な蛋白質をコードする遺伝子のいずれかを欠損している組換えウィルスベクターの該欠損する蛋白質を補給できる細胞であればいずれの細胞もよく、例えばヒト腎臓由来のHEK293細胞、マウス繊維芽細胞NIH3T3などを用いることができる。パッケージング細胞で補給する蛋白質としては、レトロウィルスベクターの場合はマウスレトロウイルス由来のgag, pol, envなどの蛋白質、レンチウィルスベクターの場合はHIVウィルス由来のgag, pol, env, vpr, vpu, vif, tat, rev, nefなどの蛋白質、アデノウィルスベクターの場合はアデノウィルス由来のE1A,E1Bなどの蛋白質、また、アデノ随伴ウィルスベクターの場合はRep(p5, p19, p40), Vp(Cap)などの蛋白質を用いることができる。
　発現ベクターを用いる以外にも、本発明で用いる核酸を、ベクターを用いずに直接細胞に導入することもできる。本方法で用いられる該核酸としては、DNA、RNAまたはヌクレオチド類似体の他、これらのキメラ分子、あるいは該核酸の誘導体も用いることができる。具体的には、Pre-miRTM miRNA Precursor Molecules（Ambion社製）やmiRIDIAN microRNA Mimics（GEヘルスケア社製）と同様にして、本発明で用いる核酸を発現させることができる。マイクロＲＮＡを発現させる場合は、細胞内で最終的にマイクロＲＮＡができる状態になればいかなる方法でもよく、例えば、（１）マイクロＲＮＡ前駆体である一本鎖ＲＮＡ、（２）マイクロＲＮＡ、および該マイクロＲＮＡの相補鎖からなり、かつ両者が完全に相補する二本鎖からなるＲＮＡ、（３）マイクロＲＮＡがDicerに切断された後の状態を想定した二本鎖ＲＮＡを、それぞれ導入させる方法があげられる。こうした方法を使用した製品としては、miCENTURY OX Precursor（B-Bridge社製）、miCENTURY OX siMature（B-Bridge社製）、miCENTURY OX miNatural（B-Bridge社製）をあげることができる。
６．マイクロＲＮＡやマイクロＲＮＡ前駆体などの核酸の活性を抑制する方法
　本発明で用いるマイクロＲＮＡやマイクロＲＮＡ前駆体などの核酸は、アンチセンス技術（バイオサイエンスとインダストリー, 50, 322 (1992)、化学, 46, 681 (1991)、Biotechnology, 9, 358 (1992)、Trends in Biotechnology, 10, 87 (1992) 、Trends in Biotechnology, 10, 152 (1992)、細胞工学, 16, 1463 (1997)）、トリプル・ヘリックス技術（Trends in Biotechnology, 10, 132 (1992)）、リボザイム技術（Current Opinion in Chemical Biology, 3, 274 (1999)、FEMS Microbiology Reviews, 23, 257 (1999)、Frontiers in Bioscience, 4, D497 (1999)、Chemistry & Biology, 6, R33 (1999)、Nucleic Acids Research, 26, 5237 (1998)、Trends In Biotechnology, 16, 438 (1998)）、デコイDNA法（Nippon Rinsho - Japanese Journal of Clinical Medicine, 56, 563 (1998)、Circulation Research, 82, 1023 (1998)、Experimental Nephrology, 5, 429 (1997)、Nippon Rinsho - Japanese Journal of Clinical Medicine, 54, 2583 (1996)）、あるいはsiRNA（short interfering RNA）を用いて、その活性を抑制することができる。
　アンチセンスとは、ある標的核酸の塩基配列に相補的な塩基配列を有する核酸を塩基配列特異的にハイブリダイゼーションさせ、該標的核酸の発現を抑制できるものをいう。アンチセンスに用いる核酸はＤＮＡやＲＮＡまたはヌクレオチド類似体の他、これらのキメラ分子、あるいは該核酸の誘導体も用いることができる。具体的には、Nature, 432, 226 (2004)等に記載の方法に従うことでアンチセンスを作製し、発現を抑制することができる。具体的には、Anti-miRTM miRNA Inhibitors（Ambion社製）やmiRIDIAN microRNA Inhibitors（GEヘルスケア社製）と同様にして、本発明で用いる核酸の発現を抑制することができる。
　siRNAとは、ある標的核酸の塩基配列を含む短い二本鎖RNAであり、ＲＮＡ干渉（RNAi）により、該標的核酸の発現を抑制できるものをいう。siRNAの配列は、標的とする塩基配列から文献（Genes Dev., 13, 3191 (1999)）の条件に基づいて適宜設計することができる。選択した19塩基の配列および相補的な配列それぞれの3'端にTTを付加した配列を有する2本のＲＮＡを核酸合成機により合成し、アニーリングすることによりsiRNAを作製できる。また、pSilencer 1.0-U6 （Ambion社製）、pSUPER（OligoEngine社）等のsiRNA発現用ベクターに上記の選択した19塩基の配列に相当するDNAを挿入することにより、該遺伝子の発現を抑制できるsiRNAを発現するベクターを作製することができる。本発明で用いるマイクロＲＮＡなどの核酸の機能を抑制できるsiRNAとしては、該核酸の機能を抑制できるものであればいかなるものでもよいが、配列番号１～３３７１の配列情報から設計されたsiRNAが好ましい。siRNAの一方の鎖を構成する塩基の残基数は、好ましくは１７～３０残基、より好ましくは１８～２５残基、さらに好ましくは１９～２３残基である。
　肥満細胞で発現するマイクロＲＮＡやマイクロＲＮＡ前駆体などの核酸に特異的なアンチセンスまたはsiRNAを用いて、肥満細胞で発現するマイクロＲＮＡやマイクロＲＮＡ前駆体などの発現の抑制を行うことができる。例えば、該マイクロＲＮＡまたは該マイクロＲＮＡ前駆体に特異的なアンチセンスオリゴヌクレオチドまたはsiRNAを投与することにより該マイクロＲＮＡの活性を抑制し、肥満細胞におけるマイクロＲＮＡまたはマイクロＲＮＡ前駆体の作用を制御することができる。
　また、肥満細胞で発現するマイクロＲＮＡまたはその前駆体の発現異常による患者の場合、該マイクロＲＮＡやその前駆体に特異的なアンチセンスオリゴヌクレオチドまたはsiRNAを患者に投与することにより、肥満細胞の機能を制御し、上記発現異常により発症する疾患の治療をすることができる。すなわち、該マイクロＲＮＡまたはその前駆体に特異的なアンチセンスオリゴヌクレオチドまたはsiRNAは、肥満細胞の異常に起因する疾患の治療薬として有用である。
　マイクロＲＮＡやその前駆体などの核酸に特異的なアンチセンスオリゴヌクレオチドまたはsiRNAを上記の治療薬として使用する場合は、アンチセンスオリゴヌクレオチドまたはsiRNAを単独、あるいはこれらをコードする核酸をレトロウィルスベクター、アデノウィルスベクター、アデノ随伴ウィルスベクターなどの適当なベクターに挿入した後、下記９に記載した常法に従って医薬製剤とし、投与することができる。
７．マイクロＲＮＡやマイクロＲＮＡ前駆体などの核酸を用いて標的遺伝子の機能または発現を抑制する方法
　本発明で用いる核酸の標的遺伝子の機能または発現を抑制する方法としては、標的塩基配列を有するmRNAの発現をマイクロＲＮＡなどの核酸が抑制する活性を利用する方法であればいかなる方法を用いてもよい。例えば、本発明で用いるマイクロＲＮＡなどの核酸を発現させ、細胞内の該核酸の量を増加させることにより、標的配列を有するmRNAの翻訳を抑制し、遺伝子の発現を抑制する方法をあげることができる。なお、本発明の核酸を発現させるには、上記５で記載した方法により行なうことができる。配列番号１～１５４３および３３７２～３７４１のいずれかで表される塩基配列からなる核酸の標的塩基配列を有するmRNAとしては、例えば、それぞれ前述の表４で示される遺伝子群を例示することができる。
　また、表４で示される標的遺伝子に対するsiRNAを用いて、該標的遺伝子の機能を抑制することができる。
８．マイクロＲＮＡやマイクロＲＮＡ前駆体などの核酸を用いて該核酸の発現または機能を制御する物質をスクリーニングする方法
　本発明で用いる核酸を用いて、マイクロＲＮＡまたはその前駆体などの核酸の発現または機能を制御する、すなわち促進または抑制する物質をスクリーニングすることができる。例えば、本発明で用いるマイクロＲＮＡまたはその前駆体の塩基配列から、スクリーニングの標的とする塩基配列を選択して、該塩基配列を有する核酸を発現する細胞を利用して、選択したマイクロＲＮＡまたはその前駆体の発現または機能を促進または抑制させる物質をスクリーニングすることができる。
　スクリーニングに用いる、マイクロＲＮＡおよびマイクロＲＮＡ前駆体の塩基配列を有する核酸を発現する細胞としては、肥満細胞のほか、上記５で記載したように、該塩基配列を有する核酸を発現するベクターを動物細胞や酵母などの宿主細胞に導入して得られる形質転換細胞や、該塩基配列を有する核酸をベクターを用いずに直接導入した細胞等を用いることもできる。
　具体的なスクリーニング方法としては、スクリーニングの標的とするマイクロＲＮＡまたはその前駆体などの核酸の発現量の変化を指標にする方法の他、マイクロＲＮＡなどの核酸の標的配列を有するmRNAやそれにコードされる遺伝子産物の発現量の変化を指標にする方法をあげることができる。
（ａ）スクリーニングの標的とするマイクロＲＮＡまたはその前駆体の発現量の変化を指標にするスクリーニング方法
　該核酸を発現する細胞に対し、試験物質を接触させ、選択した核酸の発現量の変化を指標に、マイクロＲＮＡおよびその前駆体などの核酸の発現を促進または抑制させる物質を得ることができる。核酸の発現量は、上記３で記載した方法により検出することができる。
（ｂ）スクリーニングの標的とするマイクロＲＮＡなどの核酸の標的配列を有するmRNAやそれにコードされる遺伝子産物の発現量の変化を指標にするスクリーニング方法
　該mRNAを発現する細胞に対し、試験物質を接触させ、選択した核酸の標的配列を有するmRNAやそれにコードされる遺伝子産物の発現量の変化を指標に、マイクロＲＮＡおよびその前駆体などの核酸の発現または機能を促進または抑制させる物質を得ることができる。または、本発明のマイクロＲＮＡなどの核酸の標的配列を適当なレポーター遺伝子発現ベクターの3’UTRに挿入したDNAを作製して、発現ベクターに適合した宿主細胞に導入し、その細胞に試験物質を接触させ、レポーター遺伝子の発現量の変化を指標に、マイクロＲＮＡおよびその前駆体などの核酸の発現または機能を促進または抑制させる物質を得ることができる。
　標的配列の選択は、上記７で記載した方法により行なうことができ、配列番号１～１５４３および３３７２～３７４１のいずれかで表される塩基配列からなるマイクロＲＮＡなどの核酸の標的配列を有するmRNAとしては、例えば、それぞれ前述の表４で示される遺伝子群をあげることができる。
９．マイクロＲＮＡやマイクロＲＮＡ前駆体などの核酸を用いた肥満細胞の脱顆粒制御剤
　本発明で用いるマイクロＲＮＡやマイクロＲＮＡ前駆体などの核酸、およびその塩基配列と相補的な塩基配列を有する核酸は、標的配列を有する遺伝子の発現を制御することにより、肥満細胞の脱顆粒制御剤、すなわち脱顆粒抑制剤または脱顆粒促進剤として用いることができる。
　肥満細胞の脱顆粒抑制剤の有効成分としては、下記（a）～（h）の核酸があげられる。
（a）配列番号１～７０、１５１～５８１、１２３８～１４６１、３４０７～３４５２のいずれかで表される塩基配列からなる核酸
（b）配列番号１～７０、１５１～５８１、１２３８～１４６１、３４０７～３４５２のいずれかで表される塩基配列からなる核酸を含む含有する、１７～２８塩基の核酸
（c）配列番号１～７０、１５１～５８１、１２３８～１４６１、３４０７～３４５２のいずれかで表される塩基配列と９０％以上の同一性を有する塩基配列からなる核酸
（d）配列番号１～７０、１５１～５８１、１２３８～１４６１、３４０７～３４５２のいずれかで表される塩基配列からなる核酸の相補鎖とストリンジェントな条件でハイブリダイズする核酸
（e）配列番号１～７０、１５１～５８１、１２３８～１４６１、３４０７～３４５２のいずれかで表される塩基配列の２～８番目の塩基配列を含む核酸
（f）配列番号１５４４～１６２１、１６３４、１６６５～１６６８、１６８８、１７０９～２１９６、２８６２～２８６４、２９７８～３２８７、３３６５、３７８０～３８２８のいずれかで表される塩基配列からなる核酸
（g）配列番号１５４４～１６２１、１６３４、１６６５～１６６８、１６８８、１７０９～２１９６、２８６２～２８６４、２９７８～３２８７、３３６５、３７８０～３８２８のいずれかで表される塩基配列と９０％以上の同一性を有する塩基配列からなる核酸
（h）配列番号１５４４～１６２１、１６３４、１６６５～１６６８、１６８８、１７０９～２１９６、２８６２～２８６４、２９７８～３２８７、３３６５、３７８０～３８２８のいずれかで表される塩基配列からなる核酸の相補鎖とストリンジェントな条件でハイブリダイズする核酸
　上記核酸としては、マイクロＲＮＡ、マイクロＲＮＡ前駆体が好適に用いられる。
　上記（a）～（h）の核酸の機能または発現を促進する物質を、肥満細胞の脱顆粒抑制剤として用いることもできる。
　また、上記（a）～（h）の核酸の標的遺伝子の機能または発現を抑制する物質を肥満細胞の脱顆粒抑制剤として用いることもできる。標的遺伝子の発現を抑制する物質としては、該標的遺伝子のmRNAに対するsiRNAや該標的遺伝子に対するアンチセンス等をあげることができる。
　一方、下記（i）～（p）の核酸の機能または発現を抑制する物質を、肥満細胞の脱顆粒抑制剤として用いることもできる。該核酸の機能または発現を抑制する物質としては、該核酸に対するsiRNAやアンチセンス等をあげることができる。
　肥満細胞の脱顆粒促進剤の有効成分としては、下記（i）～（p）の核酸があげられる。
（i）配列番号７１～１５０、５８２～１２３７、１４６２～１５４３、３３７２～３４０６、３４５３～３７４１のいずれかで表される塩基配列からなる核酸
（j）配列番号７１～１５０、５８２～１２３７、１４６２～１５４３、３３７２～３４０６、３４５３～３７４１のいずれかで表される塩基配列からなる核酸を含む含有する、１７～２８塩基の核酸
（k）配列番号７１～１５０、５８２～１２３７、１４６２～１５４３、３３７２～３４０６、３４５３～３７４１のいずれかで表される塩基配列と９０％以上の同一性を有する塩基配列からなる核酸
（l）配列番号７１～１５０、５８２～１２３７、１４６２～１５４３、３３７２～３４０６、３４５３～３７４１のいずれかで表される塩基配列からなる核酸の相補鎖とストリンジェントな条件でハイブリダイズする核酸
（m）配列番号７１～１５０、５８２～１２３７、１４６２～１５４３、３３７２～３４０６、３４５３～３７４１のいずれかで表される塩基配列の２～８番目の塩基配列を含む核酸
（n）配列番号１５５７、１５７５、１５９０、１５９２～１５９３、１６２２～１７０８、１９１９～１９２５、１９２７～１９２９、２１１２、２１９７～２９７７、３０９２～３０９３、３１６２～３１６３、３１６９、３１７７、３２８１、３２８８～３３７１、３７４２～３７７９、３７９０～３７９２、３８０７、３８２９～４１４７のいずれかで表される塩基配列からなる核酸
（o）配列番号１５５７、１５７５、１５９０、１５９２～１５９３、１６２２～１７０８、１９１９～１９２５、１９２７～１９２９、２１１２、２１９７～２９７７、３０９２～３０９３、３１６２～３１６３、３１６９、３１７７、３２８１、３２８８～３３７１、３７４２～３７７９、３７９０～３７９２、３８０７、３８２９～４１４７のいずれかで表される塩基配列と９０％以上の同一性を有する塩基配列からなる核酸
（p）配列番号１５５７、１５７５、１５９０、１５９２～１５９３、１６２２～１７０８、１９１９～１９２５、１９２７～１９２９、２１１２、２１９７～２９７７、３０９２～３０９３、３１６２～３１６３、３１６９、３１７７、３２８１、３２８８～３３７１、３７４２～３７７９、３７９０～３７９２、３８０７、３８２９～４１４７のいずれかで表される塩基配列からなる核酸の相補鎖とストリンジェントな条件でハイブリダイズする核酸
　上記核酸としては、マイクロＲＮＡ、マイクロＲＮＡ前駆体が好適に用いられる。
　上記（i）～（p）の核酸の機能または発現を促進する物質を、肥満細胞の脱顆粒促進剤として用いることもできる。
　また、上記（i）～（p）の核酸の標的遺伝子の機能または発現を抑制する物質を肥満細胞の脱顆粒促進剤として用いることもできる。標的遺伝子の発現を抑制する物質としては、該標的遺伝子のmRNAに対するsiRNAや該標的遺伝子に対するアンチセンス等をあげることができる。
　一方、上記（a）～（h）の核酸の機能または発現を抑制する物質を、肥満細胞の脱顆粒促進剤として用いることもできる。該核酸の機能または発現を抑制する物質としては、該核酸に対するsiRNAやアンチセンス等をあげることができる。
　本発明の肥満細胞の脱顆粒制御剤としては、上記(a)～(h)および（i）～（p）の核酸を発現するベクターを用いることもできる。
　本発明の肥満細胞の脱顆粒制御剤の製剤形態や、投与方法などについては、１０で後述するマイクロＲＮＡやマイクロＲＮＡ前駆体などの核酸を含有する診断薬および治療薬と同様である。
１０．マイクロＲＮＡやマイクロＲＮＡ前駆体などの核酸を含有する診断薬および治療薬
　本発明で用いるマイクロＲＮＡやマイクロＲＮＡ前駆体などの核酸は、標的配列を有する遺伝子の発現を制御したり、本発明で用いるマイクロＲＮＡなどの核酸の発現を制御することにより、肥満細胞の異常等に起因する疾患の治療薬として用いることができる。また、該核酸の標的遺伝子に対するsiRNAは、当該遺伝子の発現を制御することにより、肥満細胞の異常等に起因する疾患の治療薬として用いることができる。肥満細胞の異常としては、肥満細胞の分化や脱顆粒、炎症性メディエーター産生、サイトカイン産生、ケモカイン産生等の異常があげられ、それに起因する疾患としては、アトピー性皮膚炎、喘息、慢性閉塞性肺疾患、アレルギー性疾患等をあげることができる。
　また、本発明の核酸の定量または変異の検出により、肥満細胞の異常等に起因する疾患の診断をすることができる。
　本発明の核酸を含有する診断薬は、目的の診断法に応じて、本発明で用いる核酸の定量あるいは変異の検出を行うために必要な試薬、例えば緩衝剤、塩、反応用酵素、本発明の核酸と結合する標識された蛋白、および検出用発色剤等を含んでもよい。
　本発明で用いる核酸を有効成分として含有する治療薬は、単独で投与することもできるが、通常は薬理学的に許容される１つあるいはそれ以上の担体と一緒に混合し、製剤学の技術分野においてよく知られる任意の方法により製造した医薬製剤として投与するのが望ましい。
　投与経路は、治療に際し最も効果的なものを使用するのが望ましく、経口投与、または口腔内、気道内、直腸内、皮下、筋肉内および静脈内などの非経口投与をあげることができ、望ましくは静脈内投与をあげることができる。
　投与形態としては、噴霧剤、カプセル剤、錠剤、顆粒剤、シロップ剤、乳剤、座剤、注射剤、軟膏、テープ剤などがあげられる。
　経口投与に適当な製剤としては、乳剤、シロップ剤、カプセル剤、錠剤、散剤、顆粒剤などがあげられる。
　乳剤およびシロップ剤のような液体調製物は、水、ショ糖、ソルビトール、果糖などの糖類、ポリエチレングリコール、プロピレングリコールなどのグリコール類、ごま油、オリーブ油、大豆油などの油類、p-ヒドロキシ安息香酸エステル類などの防腐剤、ストロベリーフレーバー、ペパーミントなどのフレーバー類などを添加剤として用いて製造できる。
　カプセル剤、錠剤、散剤、顆粒剤などは、乳糖、ブドウ糖、ショ糖、マンニトールなどの賦形剤、デンプン、アルギン酸ナトリウムなどの崩壊剤、ステアリン酸マグネシウム、タルクなどの滑沢剤、ポリビニルアルコール、ヒドロキシプロピルセルロース、ゼラチンなどの結合剤、脂肪酸エステルなどの界面活性剤、グリセリンなどの可塑剤などを添加剤として用いて製造できる。
　非経口投与に適当な製剤としては、注射剤、座剤、噴霧剤などがあげられる。
　注射剤は、塩溶液、ブドウ糖溶液あるいは両者の混合物からなる担体などを用いて調製される。座剤はカカオ脂、水素化脂肪またはカルボン酸などの担体を用いて調製される。また、噴霧剤は受容者の口腔および気道粘膜を刺激せず、かつ有効成分を微細な粒子として分散させ吸収を容易にさせる担体などを用いて調製される。
　担体として具体的には乳糖、グリセリンなどが例示される。本発明で用いる核酸、さらには用いる担体の性質により、エアロゾル、ドライパウダーなどの製剤が可能である。また、これらの非経口剤においても経口剤で添加剤として例示した成分を添加することもできる。
　投与量または投与回数は、目的とする治療効果、投与方法、治療期間、年齢、体重などにより異なるが、通常成人１日当たり10 μg/kg～20 mg/kgである。
　また、本発明で用いる核酸を有効成分として含有する治療薬は、本発明で用いる核酸を発現するベクターと核酸治療薬に用いる基剤とを調合することにより製造することもできる（Nature Genet., 8, 42(1994)）。
　本発明の治療薬に用いる基剤としては、通常注射剤に用いる基剤であればどのようなものでもよく、蒸留水、塩化ナトリウムまたは塩化ナトリウムと無機塩との混合物等の塩溶液、マンニトール、ラクトース、デキストラン、グルコース等の溶液、グリシン、アルギニン等のアミノ酸溶液、有機酸溶液または塩溶液とグルコース溶液との混合溶液等があげられる。また常法に従い、これらの基剤に浸透圧調整剤、pH調整剤、ゴマ油、ダイズ油等の植物油またはレシチンもしくは非イオン界面活性剤等の界面活性剤等の助剤を用いて、溶液、懸濁液、分散液として注射剤を調製してもよい。これらの注射剤を、粉末化、凍結乾燥等の操作により用時溶解用製剤として調製することもできる。本発明の治療剤は、治療の直前に液体の場合はそのままで、個体の場合は必要により滅菌処理をした上記の基剤に溶解して治療に使用することができる。
　本発明で用いる核酸を発現するベクターは、上記５の方法で作製した組換えウィルスベクターウィルスベクターをあげることができ、より具体的には、レトロウィルスベクターおよびレンチウィルスベクター等をあげることができる。
　また、本発明で用いる核酸を、アデノウィルス・ヘキソン蛋白質に特異的なポリリジン－コンジュゲート抗体と組み合わせてコンプレックスを作製し、得られたコンプレックスをアデノウィルスベクターに結合させることにより、ウィルスベクターを調製することができる。該ウィルスベクターは安定に目的の細胞に到達し、エンドソームによる細胞内に取り込まれ、細胞内で分解され核酸を効率的に発現させることができる。
　また、(-)鎖RNAウィルスであるセンダイウィルスをベースにしたウィルスベクターも開発されており（WO97/16538、WO97/16539）、当該センダイウィルスを用いて、本発明で用いる核酸を発現するセンダイウィルスベクターを作製することができる。
　本発明で用いる核酸は、非ウィルス核酸移入法によっても移入することができる。例えば、リン酸カルシウム共沈法（Virology, 52, 456-467 (1973)；Science, 209, 1414-1422 (1980)）、マイクロインジェクション法（Proc. Natl. Acad. Sci. USA，77, 5399-5403 (1980)；Proc. Natl. Acad. Sci. USA，77, 7380-7384 (1980)；Cell, 27, 223-231 (1981)；Nature, 294, 92-94 (1981)）、リポソームを介した膜融合-介在移入法（Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84, 7413-7417 (1987)；Biochemistry, 28, 9508-9514 (1989)；J. Biol. Chem., 264, 12126-12129 (1989)；Hum. Gene Ther., 3, 267-275, (1992)；Science, 249, 1285-1288 (1990)；Circulation, 83, 2007-2011 (1992)）あるいは直接DNA取り込みおよび受容体-媒介DNA移入法（Science, 247, 1465-1468 (1990)；J. Biol. Chem., 266, 14338-14342 (1991)；Proc. Natl. Acad. Sci. USA， 87, 3655-3659 (1991)；J. Biol. Chem., 264, 16985-16987 (1989)；BioTechniques, 11, 474-485 (1991)；Proc. Natl. Acad. Sci. USA，87, 3410-3414 (1990)；Proc. Natl. Acad. Sci. USA，88, 4255-4259 (1991)；Proc. Natl. Acad. Sci. USA， 87, 4033-4037 (1990)；Proc. Natl. Acad. Sci. USA， 88, 8850-8854 (1991)；Hum. Gene Ther., 3, 147-154 (1991)）等により移入することができる。
　リポソームを介した膜融合－介在移入法は、リポソーム調製物を目的とする組織に直接投与することにより、本発明で用いる核酸を当該組織の局所に取り込み、および発現させることができる（Hum. Gene Ther., 3, 399 (1992)）。核酸を病巣に直接ターゲッティングするには、核酸を直接取り込む技術を用いることが好ましい。
　受容体－媒介核酸移入は、例えば、ポリリジンを介して、蛋白質リガンドに核酸を結合することによって行う方法をあげることができる。リガンドは、目的細胞または組織の細胞表面上の対応するリガンド受容体の存在に基づいて選択する。当該リガンド－核酸コンジュゲートは、所望により、血管に直接注射することができ、受容体結合および核酸－蛋白質コンプレックスの内在化が起こる標的組織に指向し得る。核酸の細胞内破壊を防止するために、アデノウィルスを同時感染させて、エンドソーム機能を崩壊させることもできる。
１１．肥満細胞の活性化の程度を測定する方法
　マイクロＲＮＡまたはマイクロＲＮＡ前駆体などの核酸が肥満細胞に対し、活性化抑制、脱顆粒抑制、炎症性メディエーター産生抑制、サイトカイン産生抑制およびケモカイン産生抑制のうちの少なくとも１つの作用を有していることは、例えば、本発明で用いる核酸や該核酸の標的遺伝子に対するsiRNAを肥満細胞に導入した後、肥満細胞を刺激し、放出された(i)脱顆粒の指標となるヒスタミンやβ－ヘキソサミニダーゼ、(ii)LTC4、LTD4、LTE4、PGD2等の炎症性メディエーター、(iii)TNF-αやGM-CSF等のサイトカイン、(iv)IL-8、I-309、MIP-1α等のケモカイン等を測定し、本発明で用いる核酸や該核酸の標的遺伝子に対するsiRNAを導入しなかった場合と比較することにより確認できる。
　また肥満細胞に、本発明で用いる核酸や該核酸の標的遺伝子に対するsiRNAを導入し、アポトーシスが誘導されることを、クロマチンDNAの断片化の測定やTUNEL法等によって検出することより、アポトーシス誘導作用を有していることを確認できる。
　さらに、肥満細胞の活性化を抑制させる物質を添加させた状態で、本発明で用いる核酸や該核酸の標的遺伝子に対するsiRNAを肥満細胞に導入した後、肥満細胞を刺激し、本発明で用いる核酸や該核酸の標的遺伝子に対するsiRNAを導入しなかった場合と比較することにより確認できる。
　肥満細胞を刺激する方法としては、例えばIgEを添加して培養した後に抗IgE抗体を添加する方法や、コンパウンド48/80を添加する方法、ポリミキシンBを添加する方法、デキストランを添加する方法、カルシウムイオノフォアを添加する方法、アセチルコリンを添加する方法、カルバコールを添加する方法、トロンビンを添加する方法、コンカナバリンAを添加する方法、カルシウムイオノフォアを添加する方法、ATPを添加する方法、ドキソルビシンを添加する方法、等を挙げることができる。肥満細胞の活性化を抑制させる物質としては、例えば、マイクロＲＮＡ前駆体からマイクロＲＮＡが生合成される過程を阻害する物質があげられる。
　肥満細胞の活性化は、脱顆粒の代わりに、TNF-αやGM-CSF等のサイトカイン産生、IL-8、I-309、MIP-1α等のケモカイン産生、LTC4、LTD4、LTE4、PGD2等の炎症メディエーター産生等を測定することによっても調べることができる（Blood, 100, 3861（2002））。
　以下に実施例により、本発明を具体的に説明する。ただし、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
マイクロＲＮＡ前駆体の強制発現が、ヒト肥満細胞における脱顆粒に及ぼす作用
　ヒトマイクロＲＮＡの前駆体をヒト肥満細胞株であるLAD2に導入し、該マイクロＲＮＡ前駆体が脱顆粒に及ぼす影響を調べた。
　LAD2は近年樹立されたヒト肥満細胞株で、ヒト肥満細胞の性質をよく保持していることが知られている（Leuk. Res., 27, 671 (2003); Leuk. Res., 27, 677 (2003)）。National Institute of Allergy and Infectious Diseases, National Institutes of Health (Bethesda, MD 20892-1881, USA)よりLAD2を入手し、100 ng/mLのSCFを含むStem Pro-34培地（Invitrogen社製）で培養した。
　LAD2を96穴プレートに1穴あたり4×103個になるように播種し、マイクロRNA前駆体をリポフェクション法、具体的には、TransIT-TKO (Mirus社製)を用いて、終濃度が25 nMとなるよう導入した。マイクロRNAの前駆体はAmbion社で合成されたヒトmiRNAライブラリーVer.1およびVer.2を用いた。リポフェクションは、製品に添付された説明書に記載された方法に従った。
　リポフェクション法により該マイクロＲＮＡ前駆体を導入した2日後に、終濃度が0.3 μg/mLとなるようヒトミエローマIgE（コスモバイオ社製）を添加し、37℃の5％CO2濃度のインキュベーター中で一晩培養した。翌日、終濃度が10 μg/mLとなるようウサギ抗ヒトIgE抗体（ダコ社製）を加え、37℃の5％CO2濃度のインキュベーター中で30分間インキュベートし、脱顆粒を誘導した。脱顆粒の程度は、培地中に放出された顆粒内酵素のβ-ヘキソサミニダーゼ活性を測定することにより評価した。β-ヘキソサミニダーゼ活性の測定は、培地中にタイロード緩衝液（126.1 mmol/L NaCl、4.0 mmol/L KCl、1.0 mmol/L CaCl2、0.6 mmol/L MgCl2、0.6 mmol/L KH2PO4、10 mM HEPES 、5.6 mmol/L D-グルコース、0.1％ウシ血清アルブミン、pH7.4）に溶解した20 mmol/L 4-メチルアンベリフェリル-N-アセチル-β-D-グルコサミニド（シグマ社製）を40 μL加え、37℃で3時間インキュベートした後、450 nmにおける吸光度をプレートリーダーEnVision（パーキンエルマー社製）で測定することで行った。測定後、終濃度が1％となるようトリトンX-100を培地に添加して同様の実験を行うことにより、LAD2に含まれる全β-ヘキソサミニダーゼ活性を測定した。抗IgE抗体によって誘導された脱顆粒の割合は、1% トリトンX-100によって放出させた全β-ヘキソサミニダーゼ活性に対する割合（％）で算出した。脱顆粒の相対活性は中央値からの偏差で評価し、脱顆粒効率よりその中央値を差し引き、平均偏差で割って算出した。脱顆粒促進活性はプラスで、脱顆粒抑制活性はマイナスで表した。
　独立した実験を２回実施し、その結果を表５－１～表５－２に示した。
　［表５－１］
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000204
　［表５－２］
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000205
　また、該マイクロＲＮＡ前駆体を導入した7日後にも、終濃度が0.3 μg/mLとなるようヒトミエローマIgE（コスモバイオ社製）を添加し、37℃の5％CO2濃度のインキュベーター中で一晩培養し、翌日、ウサギ抗ヒトIgE抗体添加により脱顆粒を誘導して脱顆粒の割合を測定した。その結果を表６－１～表６－２に示した。
　［表６－１］
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000206
　［表６－２］
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000207
　これらの結果から、hsa-miR-16, 195, 17-3p, 18a, 18b, 20b, 21, 24, 25, 32, 26b, 30a-3p, 34a, 449, 449b, 107, 140, 148b, 190, 199a, 199b, 202*, 208, 210, 211, 214, 218, 299-5p, 325, 328, 329, 338, 345, 425-5p, 484, 485-5p, 486, 488, 510, 515-3p, 515-5p, 517*, 520d, 520f, 520h, 522, 525*, 573, 587, 593, 595, 604, 612, 625, 634, 635, 637, 647, 650, 654, 658, 660, 668, 675, 765, 766（以上、それぞれ配列番号１～６６で表される塩基配列からなる核酸）に対応するマイクロＲＮＡ前駆体の導入により脱顆粒の割合が減少し、逆にhsa-let-7e, hsa-miR-1, 206, 613, 9, 23b, 27b, 28, 31, 33b, 96, 100, 106a, 126*, 127, 128b, 129, 133a, 133b, 135b, 136, 142-5p, 146a, 181a, 182*, 183, 187, 192, 215, 200a*,  216, 217, 220, 222, 223, 224, 296, 302b*, 302c*, 362, 373*, 374, 376a, 378, 409-3p, 409-5p, 429, 432*, 448, 450, 451, 452, 487b, 489, 514, 517c, 518c, 524*, 542-3p, 544, 545, 550, 552, 596, 601, 608, 609, 617, 627, 632, 644, 659, 769-5p, 801（以上、それぞれ配列番号７１～１１８および１２０～１４６で表される塩基配列からなる核酸）に対応するマイクロＲＮＡ前駆体の導入により脱顆粒の割合が増加することが認められた。
　また、6穴プレートを用いての脱顆粒活性測定も実施した。LAD2を6穴プレートに１穴あたり5x105個になるように播種し、マイクロＲＮＡ前駆体をリポフェクション法、具体的には、Gene Silencer（Genlantis社製）を用いて、終濃度が25 nMとなるよう導入した。マイクロＲＮＡの前駆体は、Pre-miRTMmiRNA Precursor MoleculesとしてAmbion社で合成されたものを用いた。リポフェクションは、製品に添付された説明書に記載された方法に従った。
　リポフェクション法により該マイクロＲＮＡ前駆体を導入した2日後に、1.0 μg/mLのヒトミエローマIgE（コスモバイオ社製）を添加して37℃の5％CO2濃度のインキュベーター中で一晩培養した。翌日、遠心分離により培地を除き、タイロード緩衝液（126.1 mmol/L NaCl、4.0 mmol/L KCl、1.0 mmol/L CaCl2、0.6 mmol/L MgCl2、0.6 mmol/L KH2PO4、10 mM HEPES 、5.6 mmol/L D-グルコース、0.1％ウシ血清アルブミン、pH7.4）で洗浄した後、タイロード緩衝液を1.5 mL添加して細胞を懸濁し、96ウェル・プレートに1ウェルあたり100 μLずつ分注した。次いで、終濃度10 μg/mLとなるようウサギ抗ヒトIgE抗体（ダコ社製）を加え、37℃の5％CO2濃度のインキュベーター中で20分間インキュベートし、脱顆粒を誘導した。遠心により上清を回収し、上清中のβ-ヘキソサミニダーゼ活性を測定することにより、脱顆粒の程度を測定した。
　β-ヘキソサミニダーゼ活性は、回収した上清50 μLに、40 mmol/Lクエン酸緩衝液（pH 4.5）に溶解した4 mmol/L p-ニトロフェニルN-アセチル-β-グルコサミニド（シグマ社製）を50 μLを加え、37℃で1時間インキュベート後、0.2 mol/Lグリシン（pH 10.7）を100 μL加えたサンプルの405 nmにおける吸光度をプレートリーダー1420 ARVOsx（パーキンエルマー社製）を用いて測定することにより評価した。また、ウサギ抗ヒトIgE抗体の代わりに最終濃度1％のトリトンX-100を添加して同様の実験を行うことにより、LAD2中の全β-ヘキソサミニダーゼ活性を測定した。脱顆粒の割合を、全β-ヘキソサミニダーゼ活性に対する上清中のβ-ヘキソサミニダーゼ活性の割合（％）で算出し、それぞれについて陰性対照区（Gene Silencerのみ）の脱顆粒の割合を1.0とした時の脱顆粒相対活性を計算した。
　また、マイクロＲＮＡ前駆体を導入した7日後にも、終濃度が1.0 μg/mLとなるようヒトミエローマIgE（コスモバイオ社製）を添加し、37℃の5％CO2濃度のインキュベーター中で一晩培養し、翌日、ウサギ抗ヒトIgE抗体添加により脱顆粒を誘導して脱顆粒の割合を測定し、それぞれについて陰性対照区（Gene Silencerのみ）の脱顆粒の割合を1.0とした時の脱顆粒相対活性を計算した。
　それぞれ該マイクロＲＮＡ前駆体を導入した3日後および8日後における脱顆粒相対活性の結果を表７に示す。
　［表７］
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000208
　表７に示した通り、hsa-miR-200c, 142-3p, 200a, 361（以上、それぞれ配列番号１１９および１４８～１５０で表される塩基配列からなる核酸）に対応するマイクロＲＮＡ前駆体の導入により脱顆粒の割合が増加し、逆にhsa-miR-197, 221（以上、それぞれ配列番号６９および７０で表される塩基配列からなる核酸）の導入により脱顆粒の割合が減少することが認められた。
マイクロＲＮＡのアンチセンスを導入したヒト肥満細胞における脱顆粒活性
　hsa-miR-194、hsa-miR-500およびhsa-miR-365（以上、それぞれ配列番号６７、６８および１４７で表される塩基配列からなる核酸）のアンチセンスオリゴヌクレオチドを、リポフェクション法を用いて終濃度が25 nMとなるようLAD2に導入した。マイクロＲＮＡのアンチセンスオリゴヌクレオチドは、Anti-miRTMmiRNA Inhibitors (Ambion社製)を用いた。リポフェクションは製品に添付された説明書に記載された方法に従った。
　リポフェクション法により該マイクロＲＮＡアンチセンスオリゴヌクレオチドを導入した2日後に、終濃度が0.3 μg/mLとなるようヒトミエローマIgE（コスモバイオ社製）を添加し、37℃の5％CO2濃度のインキュベーター中で一晩培養した。翌日、終濃度が10 μg/mLとなるようウサギ抗ヒトIgE抗体（ダコ社製）を加え、37℃の5％CO2濃度のインキュベーター中で30分間インキュベートし、脱顆粒を誘導した。脱顆粒の程度は、培地中に放出された顆粒内酵素のβ-ヘキソサミニダーゼ活性を測定することにより評価した。β-ヘキソサミニダーゼ活性の測定は、培地中にタイロード緩衝液（126.1 mmol/L NaCl、4.0 mmol/L KCl、1.0 mmol/L CaCl、0.6 mmol/L MgCl2、0.6 mmol/L KH2PO4、10 mM HEPES 、5.6 mmol/L D-グルコース、0.1％ウシ血清アルブミン、pH7.4）に溶解した20 mmol/L 4-メチルアンベリフェリル-N-アセチル-β-D-グルコサミニド（シグマ社製）を40 μL加え、37℃で3時間インキュベートした後、450 nmにおける吸光度をプレートリーダーEnVision（パーキンエルマー社製）を用いることにより行った。
　測定後、さらに培地に終濃度が1％となるようトリトンX-100を添加して同様の実験を行うことにより、LAD2に含まれる全β-ヘキソサミニダーゼ活性を測定した。細胞を播種していないウェルの平均値を算出し、バックグランドとして各測定値から差し引いた。抗IgE抗体によって誘導された脱顆粒の割合は、1% トリトンX-100によって放出させた全β-ヘキソサミニダーゼ活性に対するβ-ヘキソサミニダーゼ活性の割合（％）で算出した。脱顆粒の相対活性は中央値からの偏差で評価し、脱顆粒効率よりその中央値を差し引き、平均偏差で割って算出した。脱顆粒促進活性はプラスで、脱顆粒抑制活性はマイナスで表した。独立した実験を２回実施し、その結果を表８に示す。
　［表８］
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000209
　また、マイクロＲＮＡに対するアンチセンスオリゴヌクレオチドを導入した7日後にも、終濃度が0.3 μg/mLとなるようヒトミエローマIgE（コスモバイオ社製）を添加し、37℃の5％CO2濃度のインキュベーター中で一晩培養し、翌日、ウサギ抗ヒトIgE抗体添加により脱顆粒を誘導して脱顆粒の割合を測定した。その結果を表９に示す。
　［表９］
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000210
　表８、９に示した通り、hsa-miR-194、hsa-miR-500に対するアンチセンスオリゴヌクレオチド導入により脱顆粒の割合が増加し、逆にhsa-miR-365に対するアンチセンスオリゴヌクレオチド導入により脱顆粒の割合が減少することが認められた。
マイクロＲＮＡ前駆体の強制発現が、脱顆粒が抑制された状態の肥満細胞における脱顆粒に及ぼす作用
　Dicer1遺伝子のsiRNA(以下、Dicer1-siRNA)とヒトマイクロＲＮＡの前駆体をLAD2に共導入し、該マイクロRNA前駆体がコンパウンド48/80によって刺激される脱顆粒に及ぼす影響を調べた。
　LAD2を96穴プレートに1穴あたり2×104個になるように播種し、Dicer1-siRNAとマイクロＲＮＡ前駆体をリポフェクション法、具体的には、GeneSilencer(Genlantis社製)を用いて、それぞれ終濃度が25 nMとなるよう共導入した。ヒトDicer1遺伝子に対するsiRNAの配列は配列番号４１４８を標的配列とするDicer1-siRNA（キアゲン社製）を用いた。マイクロＲＮＡの前駆体はAmbion社で合成されたヒトmiRNAライブラリーを用いた。siRNAとマイクロＲＮＡ前駆体の陰性対照にはそれぞれAll Stars Negative Control siRNA（以下、siRNA allstars）（キアゲン社製）とPre-miRTMmiRNA Precursor Negative Control #1（以下、miR-negacon#1）（Ambion社製）を用意し、同様にLAD2に導入した。リポフェクションは、製品に添付された説明書に記載された方法に従った。
　リポフェクション法により該マイクロＲＮＡ前駆体を導入した3日後に、培養培地をタイロード緩衝液（126.1 mmol/L NaCl、4.0 mmol/L KCl、1.0 mmol/L CaCl2、0.6 mmol/L MgCl2、0.6 mmol/L KH2PO4、10 mM HEPES 、5.6 mmol/L D-グルコース、0.1％ウシ血清アルブミン、pH7.4）に置換し、細胞を懸濁させた。次に、細胞懸濁液を等量ずつ96穴プレートの異なる2箇所に播種し、終濃度1.0 μg/mLのCompound 48/80（Sigma-Aldrich社製）と終濃度1%のトリトンX-100をそれぞれ添加した。37℃で20分間インキュベートして脱顆粒を誘導した後、遠心分離にて培養上清を回収した。
　脱顆粒の程度は、培養上清中に放出された顆粒内酵素のβ-ヘキソサミニダーゼ活性を測定することにより評価した。β-ヘキソサミニダーゼ活性は、回収した培養上清に40 mmol/Lクエン酸緩衝液（pH 4.5）に溶解した4 mmol/L 4-ニトロフェニルN-アセチル-β-D-グルコサミニド（Sigma-Aldrich社製）を50 mLを加え、37℃で1時間インキュベート後、0.2 mol/Lグリシン（pH 10.7）を100 mL加えたサンプルの405 nmにおける吸光度をプレートリーダー1420 ARVOsx（パーキンエルマー社製）を用いて測定することにより評価した。
　Compound48/80によって誘導された脱顆粒の割合は、1% トリトンX-100添加区のβ-ヘキソサミニダーゼ活性に対する割合（％）で算出した。Dicer1-siRNA導入による脱顆粒抑制を解除するmiRNAの活性は、Dicer1-siRNAとmiR-negacon#1共導入区における脱顆粒の割合を0%とし、siRNA allstarsとmiRNA-negacon#1共導入区における脱顆粒の割合を100%として相対活性を算出した。その結果を表１０に示す。
　［表１０］
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000211
miR-142-3p前駆体およびmiR-24前駆体を過剰発現させたLAD2のmRNA発現解析
　ヒトマイクロＲＮＡのmiR-142-3pとmiR-24の前駆体をそれぞれLAD2に導入し、該マイクロＲＮＡ前駆体の導入によって発現量が変動する遺伝子群をmRNAアレイにて網羅的に探索した。
　LAD2を6穴プレートに1穴あたり5×105個になるように播種し、マイクロRNA前駆体をリポフェクション法、具体的にはGeneSilencer(Genlantis社製)を用いて、終濃度が30 nMとなるよう導入した。マイクロRNA前駆体はPre-miRTM miRNA Precursor MoleculesとしてAmbion社で合成されたものを用いた。陰性対照にはAmbion社製のPre-miRTMmiRNA Precursor Negative Control#2(以下、miR-negacon#2)を用いた。リポフェクションは、製品に添付された説明書に記載された方法に従った。
　リポフェクション法により該マイクロＲＮＡ前駆体を導入した2日後に細胞を回収し、miRNeasy（キアゲン社製）を用いて細胞よりtotal RNAを精製した。
　精製したtotal RNAをAgilent Technologies社製のWhole Human Genome Oligo Microarrayを用いてmRNA発現解析をおこなった。解析方法はAgilent Technologies社のプロトコルに従った。具体的には、total RNAをCy3ラベルしたcRNAをマイクロアレイに対して65℃で約17時間のハイブリダイゼーションをおこない、洗浄した後、Agilent technologies Microarray Scannerを用いて5μmの解像度でスキャンし、シグナル値を取得した。
　miR-142-3pまたはmiR-24の前駆体導入区において発現変動する遺伝子群をそれぞれ調べるため、miR-negacon#2導入区において検出された各遺伝子のシグナル値を1.0として発現量の相対活性を算出した。miR-142-3pの前駆体およびmiR-24の前駆体の導入区において、相対活性が0.8以下に発現が抑制された遺伝子群を、それぞれ表１１および表１２－１～表１２－３に示す。
　［表１１］
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000212
　［表１２－１］
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000213
　［表１２－２］
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000214
　［表１２－３］
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000215
　本発明により、肥満細胞の脱顆粒制御剤、肥満細胞の脱顆粒制御に起因する疾患の診断薬または治療薬、肥満細胞の脱顆粒制御方法、肥満細胞の脱顆粒制御剤のスクリーニング方法を提供することができる。これらは肥満細胞の脱顆粒制御に起因する疾患の診断または治療に有用である。
配列番号３９１６－ｎはａ、ｃ、ｇ又はｕ
配列番号４１４８－人工配列の説明：合成ＤＮＡ

Claims (18)

  1. 以下の（a）～（h）のいずれかの核酸を有効成分として含有する、肥満細胞の脱顆粒制御剤。
    （a）配列番号１～１５４３および３３７２～３７４１のいずれかで表される塩基配列からなる核酸
    （b）配列番号１～１５４３および３３７２～３７４１のいずれかで表される塩基配列からなる核酸を含有する、１７～２８塩基の核酸
    （c）配列番号１～１５４３および３３７２～３７４１のいずれかで表される塩基配列と９０％以上の同一性を有する塩基配列からなる核酸
    （d）配列番号１～１５４３および３３７２～３７４１のいずれかで表される塩基配列からなる核酸の相補鎖とストリンジェントな条件でハイブリダイズする核酸
    （e）配列番号１～１５４３および３３７２～３７４１のいずれかで表される塩基配列の２～８番目の塩基配列を含む核酸
    （f）配列番号１５４４～３３７１および３７４２～４１４７のいずれかで表される塩基配列からなる核酸
    （g）配列番号１５４４～３３７１および３７４２～４１４７のいずれかで表される塩基配列と９０％以上の同一性を有する塩基配列からなる核酸
    （h）配列番号１５４４～３３７１のおよび３７４２～４１４７いずれかで表される塩基配列からなる核酸の相補鎖とストリンジェントな条件でハイブリダイズする核酸
  2. 核酸がマイクロＲＮＡまたはマイクロＲＮＡ前駆体である、請求項１に記載の肥満細胞の脱顆粒制御剤。
  3. 請求項１に記載の核酸の塩基配列に対して相補的な塩基配列からなる核酸を有効成分として含有する、肥満細胞の脱顆粒制御剤。
  4. 請求項１に記載の核酸と、該核酸の塩基配列に対して相補的な塩基配列からなる核酸とからなる二本鎖核酸を有効成分として含有する、肥満細胞の脱顆粒制御剤。
  5. 請求項１～３のいずれか１項に記載の核酸または請求項４に記載の二本鎖核酸を発現するベクターを有効成分として含有する、肥満細胞の脱顆粒制御剤。
  6. 請求項１に記載の核酸の発現または機能を制御する物質を有効成分として含有する、肥満細胞の脱顆粒制御剤。
  7. 核酸の発現または機能を制御する物質がsiRNAまたはアンチセンスオリゴヌクレオチドである、請求項６に記載の肥満細胞の脱顆粒制御剤。
  8. 請求項１に記載の核酸の標的遺伝子の発現を抑制する物質を有効成分として含有する、肥満細胞の脱顆粒制御剤。
  9. 核酸の標的配列の発現を抑制する物質がsiRNAまたはアンチセンスオリゴヌクレオチドである、請求項８に記載の肥満細胞の脱顆粒制御剤。
  10. 請求項１～３のいずれか１項に記載の核酸、請求項４に記載の二本鎖核酸、請求項５に記載のベクター、または請求項６～９のいずれか１項に記載の物質を有効成分として含有する、肥満細胞の異常に起因する疾患の診断薬または治療薬。
  11. 請求項１に記載の核酸の発現量、該核酸の変異または該核酸をコードするゲノムの変異を検出する試薬を有効成分として含有する、肥満細胞の異常に起因する疾患の診断薬。
  12. 肥満細胞の異常に起因する疾患がアトピー性皮膚炎、喘息、慢性閉塞性肺疾患およびアレルギー疾患からなる群から選ばれる疾患である、請求項１０または１１に記載の診断薬または治療薬。
  13. 請求項１～９のいずれか１項に記載の脱顆粒抑制剤の有効量を、必要とする対象に投与することを含む、肥満細胞の異常に起因する疾患の治療方法。
  14. 肥満細胞の異常に起因する疾患がアトピー性皮膚炎、喘息、慢性閉塞性肺疾患およびアレルギー疾患からなる群から選ばれる疾患である、請求項１３に記載の治療方法。
  15. 肥満細胞の異常に起因する疾患の治療薬の製造のための、請求項１～９のいずれか１項に記載の脱顆粒抑制剤の使用。
  16. 肥満細胞の異常に起因する疾患がアトピー性皮膚炎、喘息、慢性閉塞性肺疾患およびアレルギー疾患からなる群から選ばれる疾患である、請求項１５に記載の使用。
  17. 請求項１～３のいずれか１項に記載の核酸、請求項４に記載の二本鎖核酸、請求項５に記載のベクター、または請求項６～９のいずれか１項に記載の物質を用いることを特徴とする、肥満細胞の脱顆粒制御方法。
  18. 請求項１に記載の核酸の発現または機能を促進または抑制させることを指標とする、肥満細胞の脱顆粒制御剤のスクリーニング方法。
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