CN113498437A - 包含末端尿苷酰基转移酶4/7表达调控因子的用于预防或治疗癌症的药学组合物 - Google Patents

包含末端尿苷酰基转移酶4/7表达调控因子的用于预防或治疗癌症的药学组合物 Download PDF

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Abstract

本发明涉及包含末端尿苷酰基转移酶4/7(TUT4/7)表达调控因子的用于预防或治疗癌症的药学组合物，本发明的药学组合物可通过抑制末端尿苷酰基转移酶4/7的功能来防止细胞分裂并抑制癌症的发展，可以增加miR‑324‑5p的量且抑制miR‑324‑3p.1的功能，因此可有效地用于癌症的预防、治疗或者诊断。

Description

包含末端尿苷酰基转移酶4/7表达调控因子的用于预防或治 疗癌症的药学组合物
技术领域
本发明涉及包含末端尿苷酰基转移酶4/7表达调控因子的用于预防或治疗癌症的药学组合物，更详细地，涉及包含调控末端尿苷酰基转移酶4/7表达的核酸序列的用于预防或治疗癌症的药学组合物。
本发明是在韩国卫生福利部的支持下以项目编号1711079098进行的，上述项目的研究管理专业机构为基础科学研究院，研究项目名称为“基础科学研究院研究运营成本支持”，研究项目名称为“基于核糖核酸(RNA)调控细胞命运的研究”，主管机构为基础科学研究院，研究期限为2018年01月01日～2018年12月31日。
本专利申请要求于2019年2月26日向韩国知识产权局提交的韩国专利申请第10-2019-0022551号的优选权，上述专利申请的公开事项作为参照并入本说明书。
背景技术
产生微小核糖核酸(micro RNA；miRNA)的过程伴随如下过程：通过基于Drosha及Dicer的切割过程制备双螺旋核糖核酸，并从构成上述双螺旋核糖核酸的2条链(5p及3p)中选择一条链。由于2条链具有显着不同的序列并且可以调控多个不同基因的表达，因此确定选择哪条链的链选择(strand selection)过程在生物学上很重要。
另一方面，主要选择的微小核糖核酸链可能根据细胞类型改变，这被称为替代链(alternative processing)选择(或者“臂切换(arm switching)”)。替代链选择可能影响组织分化以及癌症的发展。但是，这种替代链选择如何受到调控等其分子机制及生理意义仍然是模棱两可的。
发明内容
技术问题
本发明人确认到，由末端尿苷酰基转移酶4及末端尿苷酰基转移酶7(TUT4/7)引起的尿苷化现象通过调控pre-mir-324的Dicer切割位置来生成功能不同的3种微小核糖核酸(5p及2种3p异构体)，从而研究出可以通过抑制末端尿苷酰基转移酶4/7的功能来防止细胞分裂并抑制癌症的发展，并通过增加miR-324-5p的量且抑制miR-324-3p.1的功能来可表现出相同的效果，由此完成了本发明。
因此，本发明的目的在于，提供用于预防或治疗癌症的药学组合物，其包含选自由如下组组成的组中的至少一种：包含SEQ ID NO：1及SEQ ID NO：2的碱基序列的微小核糖核酸；由SEQ ID NO：4的碱基序列组成的核酸；以及包含选自由SEQ ID NO：5至SEQ ID NO：20组成的组中的至少一种碱基序列的小干扰核糖核酸(small interfering RNA；siRNA)。
本发明的再一目的在于，提供利用如下药学组合物的治疗癌症的方法：包含SEQID NO：1及SEQ ID NO：2的碱基序列的微小核糖核酸；由SEQ ID NO：4的碱基序列组成的核酸；以及包含选自由SEQ ID NO：5至SEQ ID NO：20组成的组中的至少一种碱基序列的小干扰核糖核酸。
本发明的另一目的在于，提供如下药学组合物在治疗癌症中的用途：包含SEQ IDNO：1及SEQ ID NO：2的碱基序列的微小核糖核酸；由SEQ ID NO：4的碱基序列组成的核酸；以及包含选自由SEQ ID NO：5至SEQ ID NO：20组成的组中的至少一种碱基序列的小干扰核糖核酸。
本发明的还一目的在于，提供用于诊断癌症的组合物，其包含用于测定miR-324-5p或者miR-324-3p.1的微小核糖核酸的表达水平的制剂。
本发明的又一目的在于，提供用于诊断癌症的试剂盒，其包含用于测定miR-324-5p或者miR-324-3p.1的微小核糖核酸的表达水平的制剂。
本发明的又一目的在于，提供用于诊断癌症的组合物，其包含用于测定末端尿苷酰基转移酶4(Terminal uridylyl transferases 4)或者末端尿苷酰基转移酶7(Terminaluridylyl transferases 7)的基因信使核糖核酸(mRNA)或者其蛋白质的水平的制剂。
本发明的又一目的在于，提供用于诊断癌症的试剂盒，其包含用于测定末端尿苷酰基转移酶4或者末端尿苷酰基转移酶7的基因信使核糖核酸或者其蛋白质的水平的制剂。
技术方案
本发明人确认到，由末端尿苷酰基转移酶4及末端尿苷酰基转移酶7(TUT4/7)引起的尿苷化现象通过调控pre-mir-324的Dicer切割位置来生成功能不同的3种微小核糖核酸(5p及2种3p异构体，从而研究出可以通过抑制末端尿苷酰基转移酶4/7的功能来防止细胞分裂并抑制癌症的发展，并通过增加miR-324-5p的量且抑制miR-324-3p.1的功能来可表现出相同的效果。
以下，将更详细地说明本发明。
本发明的一方面涉及用于预防或治疗癌症的药学组合物，其包含选自由如下组组成的组中的至少一种：
包含SEQ ID NO：1及SEQ ID NO：2的碱基序列的微小核糖核酸；
由SEQ ID NO：4的碱基序列组成的核酸；以及
包含选自由SEQ ID NO：5至SEQ ID NO：20组成的组中的至少一种碱基序列的小干扰核糖核酸。
上述癌症可以是脑瘤、结肠癌、结肠直肠癌、肺癌、肝癌、胃癌、食道癌、胰腺癌、胆囊癌、肾癌、膀胱癌、前列腺癌、睾丸癌、宫颈癌、子宫内膜癌、绒毛膜癌、卵巢癌、乳腺癌、甲状腺癌、脑癌、头颈癌和/或恶性黑色素瘤，但不限于此。
在本发明中，“微小核糖核酸”是指通过与信使核糖核酸的3’非编码区(UTR)位点的碱基结合来起到转录后阻遏物作用的大致22nt的非翻译核糖核酸，上述微小核糖核酸具有调控基因表达的作用。
本发明的上述微小核糖核酸可以包含SEQ ID NO：1及SEQ ID NO：2的碱基序列。
具体地，上述微小核糖核酸(5p双联体微小核糖核酸)可以是包含上述SEQ ID NO：1的碱基序列的微小核糖核酸(miR-324-5p)与包含上述SEQ ID NO：2的碱基序列的微小核糖核酸(miR-324-3p.2)相结合的一个双联体(duplex)。
磷酸盐(phosphate)(5phos)可位于上述SEQ ID NO：1及SEQ ID NO：2的碱基序列的5’末端。
在本发明中，“核酸”意味着包含任何脱氧核糖核酸或者核糖核酸，例如，存在于组织样本中的染色体、线粒体、病毒和/或细菌核酸。上述核酸包含双链核酸分子的一条或者两条链，并且包含完整核酸分子的任何片段或者一部分。
本发明的核酸被解释为包含化学修饰的脱氧核糖核酸(DNA)或者核糖核酸。本领域普通技术人员可以利用该技术领域公知的方法来以期望的方式合成和修饰上述核酸。
本发明的上述核酸可以由SEQ ID NO：4的碱基序列(CAGCAGCACCTGGGGCAG)组成。
在本发明中，“小干扰核糖核酸”为双链核糖核酸被Dicer切割所产生的大小为18～23核苷酸的小的核糖核酸片段，上述小干扰核糖核酸与具有互补序列的信使核糖核酸特异性结合来起到抑制该蛋白质表达的作用。
本发明的小干扰核糖核酸被解释为包含化学修饰的小干扰核糖核酸，以防止基于核酸降解酶在生物体内快速降解。本领域普通技术人员可以利用该技术领域公知的方法来以期望的方式合成和修饰上述小干扰核糖核酸。
本发明的组合物可以与公知的核酸载体一起导入到细胞内，以提高向细胞内导入的效率。
本发明的上述小干扰核糖核酸可以包含SEQ ID NO：5至SEQ ID NO：20的碱基序列。
具体地，上述小干扰核糖核酸(siTUT4)可以是包含上述SEQ ID NO：5至SEQ IDNO：8中的一个碱基序列的小干扰核糖核酸与包含上述SEQ ID NO：9至SEQ ID NO：12中的一个碱基序列的小干扰核糖核酸相结合的一个复合体。
并且，具体地，上述小干扰核糖核酸(siTUT7)可以是包含上述SEQ ID NO：13至SEQID NO：16中的一个碱基序列的小干扰核糖核酸与包含上述SEQ ID NO：17至SEQ ID NO：20中的一个碱基序列的小干扰核糖核酸相结合的一个复合体。
在本发明中，上述微小核糖核酸、核酸和/或小干扰核糖核酸的治疗有效剂量是指为了期待癌症治疗效果而需要给药的量。因此，可根据包括与疾病的种类、疾病的严重程度、给药的核酸种类、剂型、患者的年龄、体重、一般健康状态、性别、日常饮食、给药时间、给药途径、治疗时间以及同时使用的化学抗癌剂等药物的多种因子来调控上述治疗有效剂量。
本发明的组合物可通过各种途径来给药，包括口服、经皮、皮下、静脉或者肌肉给药，为此，除了根据本发明的微小核糖核酸、核酸和/或小干扰核糖核酸之外，还可以包含其他添加剂。
本发明的组合物的剂型可以是片剂、丸剂、粉剂、囊剂、酏剂、混悬剂、乳剂、液剂、糖浆剂、气雾剂、胶囊剂、无菌注射剂以及无菌粉剂等形式，优选地，配制为静脉注射、皮下注射、皮内注射以及肌肉注射等注射剂。
根据本发明所属技术领域的普通技术人员能够容易实施的方法，利用药剂学上可接受的载体和/或赋形剂来配制，从而可将本发明的药学组合物制备成单位容量形式或者以注入至大容量容器内的方式被制备。在此情况下剂型可以是精油、水性介质中的溶液、混悬液或者乳化液形式，或者还可以是浸膏剂、散剂、栓剂、粉剂、颗粒剂、片剂或者胶囊剂形式，并且还可包括分散剂或者稳定剂。
可包含在本发明的药学组合物的药剂学上可接受的载体通常在配制时使用，上述载体包括但不限于乳糖、右旋糖、蔗糖、山梨糖醇、甘露醇、淀粉、阿拉伯胶、磷酸钙、藻酸盐、明胶、硅酸钙、微晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、纤维素、水、糖浆、甲基纤维素、羟基苯甲酸甲酯、羟基苯甲酸丙酯、滑石、硬脂酸镁及矿物油等。本发明的药剂组合物除了包含上述成分外，还可以包含润滑剂、湿润剂、甜味剂、香味剂、乳化剂、混悬剂及防腐剂等。合适的药剂学上可接受的载体及制剂在《雷明顿药物科学》(等19版，1995)(Remington'sPharmaceutical Sciences(19th ed.,1995))中有详细描述。
本发明的药学组合物可以口服和非口服给药，例如可通过静脉内注入、皮下注入、肌肉注入、腹腔注入、局部给药、鼻腔内给药、肺内给药、直肠内给药、鞘内给药、眼部给药、皮肤给药以及经皮给药等方式给药。
本发明的药学组合物的合适的给药量根据诸如制剂化方法、给药方式、患者的年龄、体重、性别、病理状态、食物、给药时间、给药途径、排泄速度及反应灵敏度之类的因素而改变，通常，熟练的医生可容易地确定并开出对所需治疗或者预防有效的给药量。
本发明的再一方面涉及用于诊断癌症的组合物，其包含用于测定选自由miR-324-5p及miR-324-3p.1组成的组中的至少一种微小核糖核酸的表达水平的制剂。
上述微小核糖核酸(miR-324-5p)可包含SEQ ID NO：1的碱基序列，上述微小核糖核酸(miR-324-3p.1)可包含SEQ ID NO：3(ACUGCCCCAGGUGCUGCUGG)的碱基序列。
具体地，上述微小核糖核酸(miR-324-3p.1)包含上述SEQ ID NO：3的碱基序列且在3’末端进一步包含1个或一个以上的尿嘧啶(U)。
并且，上述微小核糖核酸可从由MIR324基因(基因库SEQ ID NO：：442898)产生的一个转录体(transcript)中被Drosha及Dicer切割而成。
在本说明书中，“诊断”包括判断个体对某种疾病或者疾病的个体的易感性(susceptibility)，判断个体是否患有某种疾病或者疾病，判断患有某种疾病或者疾病的个体的预后(prognosis),或者度量疗法(therametrics)(例如，监测个体的状态以提供关于治疗功效的信息)。
在本说明书中，“个体”、“对象”或者“患者”是指需要治疗的任何单一个体，包括人、牛、狗、豚鼠、兔子、鸡及昆虫等，并且，上述对象包括参与临床研究试验且未表现出任何疾病临床表现的任何对象或者参与流行病学研究的对象或者用作对照组的对象。
除非在本说明书中另有说明，否则在本说明书中所使用的表达“测定微小核糖核酸的表达水平”意味着在相应试样内检测待检测的对象。
本发明中的待检测的对象为试样内相应微小核糖核酸。即，可通过检测微小核糖核酸来确定上述癌症是否发作。
例如，上述微小核糖核酸的表达水平可从怀疑患有癌症的患者的生物试样中测定。
在本发明中，确认到与未患有癌症的情况相比，在患有癌症的情况下，生物体内miR-324-5p的表达水平显著减少，而miR-324-3p.1的表达水平显著增加，基于这一点，将miR-324-5p及miR-324-3p.1用作判断癌症是否发作的诊断标志物。
本发明的用于测定微小核糖核酸的表达水平的制剂是指如下可用于检测标志物的分子分子，其通过在癌症发作的情况下，在对象的生物试样的临床标本中确认表达水平降低的标志物-微小核糖核酸以及表达水平进一步增加的标志物-微小核糖核酸，来检测标志物。
具体地，用于测定上述微小核糖核酸的表达水平的制剂可以是与上述微小核糖核酸特异性结合的引物或者探针。
即，核酸检测可通过使用与加密基因的核酸分子或者上述核酸分子的互补物杂交的至少一种寡核苷酸引物的扩增反应来进行。
例如，利用引物的微小核糖核酸的检测能够以如下方式进行：在使用诸如聚合酶链式反应之类的扩增方法扩增基因序列之后，以本领域公知的方法确认基因是否被扩增。
引物是指具有短游离3’羟基(free 3’hydroxyl group)的核酸序列，其为可以与互补模板(template)形成碱基对(base pair)，并起到用于模板链复制的起点功能的短核酸序列。引物可在合适的缓冲溶液及温度下，在存在用于聚合反应(即，脱氧核糖核酸聚合酶或者反转录酶)的试剂及4种不同的核苷三磷酸的情况下，引发脱氧核糖核酸合成。在本发明中，可通过利用与上述至少一种微小核糖核酸特异性结合的正义引物及反义引物，进行聚合酶链式反应扩增来确认表达水平，从而诊断癌症是否发作。聚合酶链式反应条件、正义引物及反义引物的长度可基于本领域公知的技术来进行修饰。
探针是指对应于几个碱基至几十个碱基的核糖核酸或者脱氧核糖核酸等的核酸片段，并且被标记。探针可被制备成寡核苷酸(oligonucleotide)探针、单链脱氧核糖核酸(single stranded DNA)探针、双链脱氧核糖核酸(double stranded DNA)探针及核糖核酸探针等形式。在本发明中，可通过利用与上述至少一种微小核糖核酸互补的探针进行杂交来确认表达水平，从而诊断癌症是否发作。可以基于本领域公知的技术来修饰合适的探针的选择和杂交条件。
这种引物或者探针可以基于公知的序列由本领域普通技术人员适当地进行设计。
例如，引物或者探针可通过利用亚磷酰胺固体支持体方法或者其他众所周知的方法来化学合成。这种核酸序列还可以通过利用本领域公知的各种手段进行修饰。这种修饰的非限制性例包括甲基化、“加帽”、天然核苷酸的至少一个同源物的取代以及核苷酸之间的修饰，例如，对非电荷连接体(例如：膦酸甲酯、磷酸酯、氨基磷酸酯、氨基甲酸酯等)或者电荷连接体((例如：硫逐磷酸酯、二硫代磷酸酯等)的修饰。
微小核糖核酸的表达水平可通过生物试剂盒领域中常用的方法来进行测定，例如包括但不限于，反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)、竞争性反转录聚合酶链式反应(Competitive RT-PCR)、实时反转录聚合酶链式反应(Real-time RT-PCR)、核糖核酸酶保护测定(RPA；RNase protection assay)、核糖核酸印迹法(Northern blotting)或者基因芯片等。
本发明的另一方面涉及用于诊断癌症的试剂盒，其包含用于诊断上述癌症的组合物。
上述试剂盒不仅包含用于测定上述微小核糖核酸的表达水平的制剂，还可以包含适合用作癌症诊断试剂盒的本领域中常用的工具、试剂等。
上述工具或者试剂的一例包括但不限于，合适的载体、能够产生可检测信号的标记物、生色团(chromophores)、溶解剂、清洁剂、缓冲剂及稳定剂等。当标记物为酶时，可包括能够测定酶活性的底物及反应终止剂。载体包括可溶性载体和不溶性载体，可溶性载体的一例包括本领域公知的生物学上可接受的缓冲液，例如磷酸缓冲盐溶液(PBS)，不溶性载体的一例可以是聚苯乙烯、聚乙烯、聚丙烯、聚酯纤维、聚丙烯腈、氟树脂、交联葡聚糖、多糖、诸如在乳胶上涂有金属的磁性微粒子之类的高分子、其他纸张、玻璃、金属、琼脂糖及它们的组合。
例如，本发明的诊断试剂盒可以是包含进行反转录聚合酶链式反应所需的必要元件的试剂盒。反转录聚合酶链式反应试剂盒不仅包括对标志物微小核糖核酸特异的各个引物对，还可以包括试管或者其他合适的容器、反应缓冲液(pH及镁浓度多样)、脱氧核苷酸(dNTPs)、诸如Taq-聚合酶及反转录酶之类的酶、脱氧核糖核酸酶、核糖核酸酶抑制剂、DEPC-水(DEPC-water)及无菌水等。
本发明的试剂盒包含上述组合物，因此将省略对重复内容的描述，以免本说明书变得过度复杂。
本发明的还有一方面涉及用于诊断癌症的组合物，其包含用于测定选自由末端尿苷酰基转移酶4(基因库SEQ ID NO：：23318)及末端尿苷酰基转移酶7(基因库SEQ ID NO：：79670)组成的组中的至少一种基因信使核糖核酸或者其蛋白质的水平的制剂。
上述末端尿苷酰基转移酶4基因的碱基序列由SEQ ID NO：21表示，上述末端尿苷酰基转移酶7基因的碱基序列由SEQ ID NO：22表示。
在本说明书中，“诊断”包括判断个体对某种疾病或者疾病的易感性，判断个体是否患有某种疾病或者疾病，判断患有某种疾病或者疾病的个体的预后,或者度量疗法(例如，监测个体的状态以提供关于治疗功效的信息)。
在在本说明书中，“个体”、“对象”或者“患者”是指需要治疗的任何单一个体，包括人、牛、狗、豚鼠、兔子、鸡及昆虫等，并且，上述对象包括参与临床研究试验且未表现出任何疾病临床表现的任何对象或者参与流行病学研究的对象或者用作对照组的对象。
除非在本说明书中另有说明，否则在本说明书中所使用的表达“测定基因信使核糖核酸或者其蛋白质的水平”指在相应试样内检测待检测的对象。
本发明中的待检测的对象为试样内相应基因信使核糖核酸或者其蛋白质。即，可通过检测信使核糖核酸或者其蛋白质来确定上述癌症是否发作。
例如，上述信使核糖核酸或者其蛋白质的水平可从怀疑患有癌症的患者的生物试样中测定。
在本发明中，确认到与未患有癌症的情况相比，在患有癌症的情况下，生物体内末端尿苷酰基转移酶4及末端尿苷酰基转移酶7的表达水平显著增加，基于这一点，将末端尿苷酰基转移酶4及末端尿苷酰基转移酶7用作判断癌症是否发作的诊断标志物。
在本说明书中，“基因”是指在编码或者转录蛋白质或者调控其他基因表达时，具有功能性作用的任何核酸序列或者其一部分。基因可以由编码功能性蛋白质的所有核酸或者仅由编码或表达蛋白质的部分核酸组成。核酸序列可包括外显子、内含子、起始区或终止区、启动子序列、其他调控序列或者与基因相邻的独特序列中的基因异常。
本发明的用于测定基因信使核糖核酸的表达水平的制剂是指如下可用于检测标志物的分子，其通过在癌症发作的情况下，在对象的生物试样的临床标本中确认表达水平降低的标志物-信使核糖核酸，来检测标志物。
具体地，用于测定上述信使核糖核酸的表达水平的制剂可以是与上述信使核糖核酸特异性结合的引物或者探针。
将省略与上述“用于诊断癌症的组合物，其包含用于测定miR-324-5p及miR-324-3p.1的微小核糖核酸的表达水平的制剂”重复的内容的描述，以免本说明书变得过度复杂。
在本说明书中，“蛋白质”包括还保留与参考蛋白质本质上相同的生物活性或者功能的蛋白质的片段、类似物及衍生物。
本发明的用于测定蛋白质水平的制剂是指如下可用于检测标志物的分子，其通过在癌症发作的情况下，在对象的生物试样的临床标本中确认水平增加的标志物-蛋白质，来检测标志物。
具体地，用于测定上述蛋白质的水平的制剂可以是与上述蛋白质特异性结合的抗体。
在本发明中，“抗体”以最广义来使用，具体包括完整单克隆抗体、多克隆抗体、由至少2个完整抗体形成的多特异性抗体(例如双特异性抗体)及表现出所需生物活性的抗体片段。
本发明的又一方面涉及用于诊断癌症的试剂盒，其包含用于诊断上述癌症的组合物。
上述试剂盒不仅包含用于测定上述基因信使核糖核酸或者其蛋白质的水平的制剂，还可以包含适合用作癌症诊断试剂盒的本领域中常用的工具、试剂等。
将省略与上述“用于诊断癌症的试剂盒，其包含用于诊断癌症的组合物，上述用于诊断癌症的组合物包含用于测定miR-324-5p及miR-324-3p.1的微小核糖核酸的表达水平的制剂”重复的内容的描述，以免本说明书变得过度复杂。
发明的效果
本发明涉及包含末端尿苷酰基转移酶4/7表达调控因子的用于预防或治疗癌症的药学组合物，本发明的药学组合物可通过抑制末端尿苷酰基转移酶4/7的功能来防止细胞分裂并抑制癌症的发展，可以增加miR-324-5p的量且抑制miR-324-3p.1的功能，因此可有效地用于癌症的预防、治疗或者诊断。
附图说明
图1为mir-324臂切换结果，图1a示出微小核糖核酸的5p比率的中位数绝对偏差的散点图(分析中包括了丰富且普遍存在的微小核糖核酸(在两个数据集中＞100medianRPM，在所有样本中＞0RPM))，图1b示出在通过AQ-seq测定的HEK293T中的miR-324的IsomiR图谱(左侧表示RPM标准化读取次数，灰色阴影表示5p及3p的参照序列)，图1c示出mir-324与通过AQ-seq测定的小鼠组织的指示面板的链比(5p/3p.1),及图1d示出miR-324的5’-isomiR在哺乳动物中的保守性。
图2为通过末端尿苷酰基转移酶4/7调控的mir-324臂切换结果，图2a示出9个人体细胞株及15个小鼠组织中miR-324-3p的尿苷化频率与mir-324的5p/3p.1比(ratio)之间的阴性关联性(虚线表示线性回归。rs：斯皮尔曼相关系数(Spearman correlationcoefficient))，图2b示出小鼠组织的指示面板中的相对末端尿苷酰基转移酶4/7水平及mir-324的5p/3p.1比(末端尿苷酰基转移酶4/7信使核糖核酸水平及5p/3p.1比分别由实时定量聚合酶链式反应及AQ-seq定量化。rs：斯皮尔曼相关系数)，图2c示出在HEK293T中敲落末端尿苷酰基转移酶4/7后的AQ-seq结果(左侧及中间：尿苷化产生频率及微小核糖核酸的5p比率散布图。siNC-分析中包括转染样本中的丰富的微小核糖核酸(＞100RPM)。右侧：3个5’-isomiR的相对丰富性及mir-324的log2-修饰的5p/3p.1比)，图2d示出HEK293T中的miR-324-5p及miR-324-3p的诺瑟杂交(使用合成mir-324双联体作为大小基准),及图2e示出在小鼠中二次敲除末端尿苷酰基转移酶4/7后的小核糖核酸(small RNA)测序结果(左侧：由于骨髓中末端尿苷酰基转移酶4/7的耗尽(depletion)导致的5’-isomiR的丰富性变化。分析中包括了对照组样本中具有超过10RPM的5’-isomiR。双面学生t检验(two-sidedStudent's t test)的假定值(P-VALUE)。右侧：mir-324的og2-修饰的5p/3p.1比。条形为平均值±标准差(Standard Deviation)。骨髓n＝2；胚胎成纤维细胞n＝2；胚胎干细胞n＝3；肝中的对照组及末端尿苷酰基转移酶4/7双敲除(dKO)分别为n＝4及3。通过双面学生t检验的*p＜0.05，***p＜0.001RPM。RPM：reads per million)。
图3为由尿苷化(Uridylation)诱导的pre-mir-324的替代Dicer切割结果，图3a示出通过免疫纯化的Dicer的pre-mir-324进行的未修饰且单一或者双-尿苷化形式的试管内(in vitro)切割(processing)(使用由蓝色表示的合成mir-324-5p(23nt)作为大小基准。主要切割产物及相应切割位点用箭头表示。*：放射性标志的5’磷酸)，图3b示出HEK293T中的miR-324-3p的5’-isomiR组合物,及图3c示出小鼠中的miR-324-3p地5’-isomiR组合物(条形为平均值。骨髓n＝2；胚胎成纤维细胞n＝2；胚胎干细胞n＝3；肝中的对照组及末端尿苷酰基转移酶4/7双敲除分别为n＝4及3)。
图4为通过双链核糖核酸结合域(double stranded RNA-binding domain；dsRBD)促进的替代Dicer切割的结果，图4a示出通过免疫纯化的Dicer进行的野生型或者无凸起(no-bulge)突变体pre-mir-324的未修饰且单一或者双-尿苷化形式的试管内切割，图4b及4c示出通过免疫纯化的口袋Dicer突变体(4b)或者dsRBD-无效突变体(4c)的pre-mir-324的未修饰且单一或者双-尿苷化形式的试管内切割(主要切割产物及相应切割位点用箭头表示。*：放射性标志的5’磷酸。
Figure BDA0003228153390000071
3p位点刻痕产物),图4d示出用于pre-mir-324的尿苷化-介导的替代Dicer切割而提出的模型。
图5为由替代Dicer切割诱导的臂切换结果，图5a示出由未修饰及尿苷化的pre-mir-324制备的mir-324双联体的链选择的简图(虚线四边形表示用于指示各双联体的链选择的末端)，图5b示出利用2个mir-324双联体的荧光素酶报道分子分析(左侧：具有miR-324-5p或者3p.1的3个8mer靶位点的萤火虫(firefly)报道分子信使核糖核酸的图片。右侧：与HEK293T中的2个mir-324双联体相关的萤火虫荧光素酶的相对报道分子活性。使用海肾(renilla)荧光素酶的报道分子活性作为对照组。条形为平均值±标准差。(n＝2，生物学重复)。基于双面学生t检验的**p＜0.01)。
图6为由mir-324臂切换调控的细胞周期进行结果，图6a示出成胶质细胞瘤(glioblastoma)及正常脑组织中的miR-324-3p的5’-isomiR组合物的比率(正常脑n＝3；成胶质细胞瘤n＝6)，图6b示出Oncopression数据库的正常、低级神经胶质瘤(glioma)及成胶质细胞瘤组织中末端尿苷酰基转移酶4/7的表达水平(正常n＝723；1级n＝74；2级n＝133；3级n＝132；成胶质细胞瘤n＝865。通过用于多重比较的两两比较检验和图基事后检验的***p＜0.001)，图6c示出在与成胶质细胞瘤(黑色)一致的正常脑组织(白色)中，末端尿苷酰基转移酶4/7表达水平与miR-324-5p/3p比之间的负相关关系(线性回归用虚线表示。rs：斯皮尔曼相关系数)，图6d示出在A172细胞中过表达mir-324的合成5p双联体(长双联体)或者3p.1双联体(短双联体)后表示的细胞周期蛋白的蛋白质的蛋白质印迹及细胞周期图谱，图6e示出在A172细胞中，通过锁核酸反义寡核苷酸抑制miR-324后指示的细胞周期蛋白的蛋白质的蛋白质印迹及细胞周期图谱，图6f示出在A172细胞中敲落末端尿苷酰基转移酶4/7后指示的蛋白质的蛋白质印迹及细胞周期图谱(*：交叉反应条带。PI：碘化丙啶。BrdU：溴脱氧尿苷)。
图7为mir-324臂切换机制模型的示意图。
具体实施方式
下面，根据以下实施例更详细的说明本发明。但是这些实施例仅用于例示本发明，本发明的范围并不限于这些实施例。
在整个本说明书中，除非另有说明，否则用于表示特定物质的浓度的“％”，对于固体/固体而言是(重量/重量)％，对于固体/液体而言是(重量/体积)％，对于液体/液体而言是(体积/体积)％。
准备例
1.AQ-seq文库
如先前研究(kim等，2019)所述，AQ-seq(最小偏倚的sRNA-seq)文库利用15个小鼠组织的总核糖核酸来构成。
具体地，将总5μg的核糖核酸与30个10fmole的等摩尔spike-in核糖核酸(用于偏倚评估的微小核糖核酸类似非人类/小鼠/青蛙/鱼核糖核酸)进行混合。小核糖核酸(SmallRNA)利用15％尿素-聚丙烯酰胺凝胶电泳通过大小分级被浓缩，并且依次连接到3’及5’末端的随机衔接子。连接的核糖核酸利用SuperScript III反转录酶(Invitrogen)来反转录，利用Phusion高保真脱氧核糖核酸聚合酶(Thermo Scientific)来扩增，在MiSeq平台(Illumina)进行高通量测序(high-throughput sequencing；HTS)。
2.微小核糖核酸的高通量测序(high-throughput sequencing)分析
除了将小鼠中sRNA-seq结果的读数映射到小鼠基因组(mm10)外，按照先前研究K(kim等，2019)所说明的方法处理数据。
具体地，利用cutadapt(Martin，2011)从读数(reads)中剪切3’衔接子。AQ-seq数据利用FNTX-Toolkit(http：//hannonlab.cshl.edu/fastx toolkit/)来进一步去除4-nt变性序列。使用FASTX-Toolkit过滤简短的低质量的人工读数后，先将AQ-seq数据排列在spike-in序列上，未排列的读数映射到下一个基因组，其他sRNA-seq数据利用BWA映射到基因组(Li and Durbin，2010)。然后，选择具有仅允许3’末端错配的最佳排列分数的排列结果。微小核糖核酸注释作为BEDTools(Cozomara和Griffiths-Jones，2014；Quinlan和Hall，2010)的交叉工具，利用miRBase release 21来检索。
为了定量分析微小核糖核酸链比率(strand ratio)，首先对表达最丰富的细胞株或者组织中给定的成熟微小核糖核酸，确认最丰富的5’-isomiR。然后，对所有细胞株或者组织，计算从5p及3p到最高5’-isomiR之间的比率。此分析中包含在miRBase release 21中两侧链被注释处理的非重复微小核糖核酸基因。
3.靶基因(Targetome)分析
通过分析修改版的AGO CLIP-seq(CLEAR-CLIP及CLASH)的结果，来识别miR-324靶(target)(Helwak等，2013；Moore等，2015)。
首先为了CLEAR-CLIP的分析，利用cutadapt来剪切3’及5’衔接子后提取包含miR-324序列的读数。然后，将靶核糖核酸序列映射到小鼠基因组(mm10)。注释作为BEDTools的交叉工具，利用GENCODE release M19来检索。
之后为了CLASH的分析，使用由协议E4生成的CLASH数据的补充文档。根据miR-324-3p序列的5’末端细分miR-324-3p的靶基因。
4.构建质粒
为了构建用于表达野生型(wild type)、5’口袋Dicer突变体及3’口袋Dicer突变体的表达的质粒，使人Dicer参考(RefSeq NM_030621)的编码序列在存在或者不存在从先前研究引入的突变的情况下进行扩增(Park等，2011)。利用In-Fusion HD Cloning Kit(Clontech)，将扩增的脱氧核糖核酸在BamHI及XhoI位点亚克隆到pCK-FLAG载体(CMV启动子驱动的载体)。
双链核糖核酸结合域(double stranded RNA-binding domain；dsRBD)无效Dicer，扩增除与V1849-S1922氨基酸相应的序列外的编码区域，利用相同的方法亚克隆到pCK-FLAG载体内。
TRBP，扩增人TRBP参考(RefSeq NM_134323)的编码序列，从BamHI及XhoI位点亚克隆到pcDNA3-cMyc载体(Invitrogen)。
最后，为了构建用于荧光素酶(luciferase)分析的质粒，扩增包含miR-1-3p、miR-324-5p或者miR-324-3p.1的3个8mer靶位点的合成寡聚脱氧核糖核酸，在XhoI及XbaI位点插入到pmirGLO(Promega)。合成寡聚脱氧核糖核酸及聚合酶链式反应引物的序列示于下表1。
表1
Figure BDA0003228153390000091
5.细胞培养及转染(transfection)
A172及U87MG从韩国细胞株银行收获。HEK293T，A172及U87MG维持在补充有10％胎牛血清(WELGENE)的DMEM(WELGENE)中。如韩国延世大学医科大学(4-2012-0212，4-2014-0649)的机构审查委员会批准，来源于成胶质细胞瘤(glioblastoma)患者(TS13-64)第一肿瘤细胞通过新鲜的成胶质细胞瘤组织标本建立。
为了培养肿瘤球(tumorsphere)，使TS13-64细胞在补充有1X B-27(ThermoScientific)、20ng/mL的bFGF(R&D Systems)及20ng/mL的EGF(Sigma-Aldrich)的DMEM(WELGENE)中进行生长(Sigma-Aldrich)(Kong等，2013)。
为了敲落末端尿苷酰基转移酶4/7，利用脂质体(Lipofectamine)3000(ThermoScientific)，用20～22nM小干扰核糖核酸经两次转染细胞，在第一次转染4天后收获。
为了Dicer的过表达，利用脂质体3000将pCK-FLAG-DICER转染至HEK293T细胞，在转染2天后收获。
为了传递合成微小核糖核酸或者抑制剂，利用脂质体3000将20nM的合成微小核糖核酸双联体或者80nM的LNA微小核糖核酸抑制剂转染至细胞，在转染2天后收获。
对照组小干扰核糖核酸(AccuTarget阴性对照组小干扰核糖核酸)、小干扰核糖核酸、对照组微小核糖核酸及合成mir-324双链体从Bioner收获。对照组微小核糖核酸抑制剂(miRCURY LNA微小核糖核酸抑制剂阴性对照组A)及miR-324抑制剂(hsa-miR-324-5p及hsa-miR-324-3p miRCURY LNA微小核糖核酸抑制剂)从QIAGEN收获。合成小干扰核糖核酸及微小核糖核酸的序列示于下表2。
表2
Figure BDA0003228153390000092
Figure BDA0003228153390000101
6.诺瑟杂交(Northern blot)
利用TRIzol(Invitrogen)分离总核糖核酸，用mirVana微小核糖核酸IsolationKit(Ambion)浓缩小核糖核酸(＜200nt)。然后，在15％尿素-聚丙烯酰胺凝胶上分析核糖核酸。合成mir-324双联体及Decade Markers System(Ambion)用作大小标志物。将核糖核酸转移到Hybond-NX膜(Amersham)，用1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳化二亚胺交联到膜。利用[γ-32P]ATP，通过T4多核苷酸(Takara)，对反义探针5’末端进行放射性标记，利用Performa Spin柱(Edge BioSystems)来进行纯化。膜与在PerfectHyb Plus杂交缓冲液中改性的UltraPure Salmon Sperm脱氧核糖核酸溶液(Thermo Scientific)一起培养，且与反义探针杂交后，利用mild洗涤缓冲液(0.05％SDS及2X SSC)进行洗涤，利用stringent洗涤缓冲液(0.1％SDS及0.1X SSC)进行洗涤。放射性信号由Typhoon FLA 7000(GEHealthcare)检测，并且利用Multi Gauge软件(FujiFilm)进行分析。
首先检测出miR-324-3p，剥下探针后检测出miR-324-5p。为了从印迹中去除探针，将膜浸入预煮的0.5％SDS中15分钟。合成mir-324双联体(AccuTarget)从Bioneer获得。探针的序列示于下表3。
表3
名称 序列(5’->3’)
miR-324-5p探针 ACCAATGCCCTAGGGGATGCG(SEQ ID NO：34)
miR-324-3p探针 CAGCAGCACCTGGGGCAGT(SEQ ID NO：35)
7.实时定量聚合酶链式反应(RT-qPCR)
为了在小鼠组织测定信使核糖核酸水平，利用RevertAid First Strand cDNA合成试剂盒(Thermo Scientific)反转录Mouse Total RNA Master Panel(Takara)的核糖核酸，利用Power SYBR Green PCR Master Mix(Thermo Scientific)在StepOnePlus Real-Time聚合酶链式反应系统(Thermo Scientific)进行实时定量聚合酶链式反应。GAPDH用于内部对照组，q聚合酶链式反应引物的序列示于下表4。
表4
名称 序列(5’->3’)
TUT4正向引物 GCCTAAAAGGCGGATAGCCATTG(SEQ ID NO：36)
TUT4反向引物 GCTGCTCTGAATCTTTCCACAAC(SEQ ID NO：37)
TUT7正向引物 CAGCTCAGCAAAAGAGGAGGCA(SEQ ID NO：38)
TUT7反向引物 CATAGAACCGCAGCAATTCCACC(SEQ ID NO：39)
GAPDH正向引物 ACCACAGTCCATGCCATCAC(SEQ ID NO：40)
GAPDH反向引物 TCCACCACCCTGTTGCTGTA(SEQ ID NO：41)
为了定量miR-324-5p/3p链比，利用TRIzol分离总核糖核酸。然后，利用TaqMan微小核糖核酸反转录试剂盒(Applied Biosystems)合成互补脱氧核糖核酸(cDNA)，利用TaqMan基因表达分析试剂盒(Applied Biosystems)在StepOnePlus Real-Time聚合酶链式反应系统进行实时定量聚合酶链式反应。U6核小核糖核酸(snRNA)用于内部对照组。
8.试管内Dicer切割分析
用[γ-32P]ATP，通过T4多核苷酸，放射性标记pre-mir-324及其变异体，根据制造商的指示利用Oligo Clean&Concentrator(Zymo Research)进行纯化。
为了FLAG-DICER的免疫沉淀，利用裂解缓冲液(500mM NaCl，20mM Tris(pH 8.0)，1mM EDTA，1％Triton X-100)裂解过表达Dicer蛋白质的HEK293T细胞，利用BioruptorStandard(Diagenode)进行超声处理。离心分离后，上清液与10μL的ANTI-FLAG M2AffinityGel(Sigma-Aldrich)一起培养。珠子(beads)用裂解缓冲液洗涤2次，用高盐缓冲液(800mMNaCl及50mM Tris(pH 8.0))洗涤4次，用缓冲液D(200mM KCl，20mM Tris(pH 8.0)，0.2mMEDTA)洗涤4次。
免疫纯化的Dicer在总体积为30μL(包含2mM MgCl2、1mM DTT、SUPERase In核糖核酸酶抑制剂(Thermo Scientific)60unit及5’-放射性标记的pre-mir-324)的条件下进行试管内反应。用酚提取物或者Oligo Clean&Concentrator纯化核糖核酸，在15％尿素-聚丙烯酰胺凝胶上进行分析。合成mir-324-5p及Decade Markers System用作大小标志物。合成pre-mir-324片段从IDT中获得。合成mir-324-5p从Bioneer中获得。合成pre-mir-324片段及miR-324-5p的序列示于下表5。
表5
Figure BDA0003228153390000111
9.双荧光素酶报道分子分析
包含miR-1-3p、miR-324-5p或者miR-324-3p.1额3个8mer靶位点的pmirGLO与对照微小核糖核酸或者mir-324双联体一起，通过使用脂质体3000共转染(co-transfected)到HEK293T细胞中。转染2天后，收获细胞并进行报道分子分析。报道分子活性根据制造商的指示(Promega)在Spark microplate reader(TECAN)中利用Dual-Luciferase ReporterAssay System来测定。鉴于miR-1-3p在HEK293T中几乎不表达(在AQ-seq约为8RPM)，具有miR-1-3p的3个8mer靶位点的pmirGLO用作质粒对照组。为了进一步标准化，利用对照组微小核糖核酸。
10.成胶质细胞瘤(glioblastoma)患者数据的基因表达分析
利用微阵列在Oncopression(http：//oncopression。com)上检索预处理的基因表达数据(Lee和Choi，2017)。从ArrayExpress(Madhavan等，2009)获得REMBRANDT基因表达数据集(E-MTAB-3073)。
为了信使核糖核酸及微小核糖核酸的同时分析(Gulluoglu等，2018)，利用R语言limma包，将处理前的微阵列数据标准化为RMA(robust multi-array average)后用于基因表达分析。
11.生存分析(Survival analysis)
与TCGA成胶质细胞瘤患者相关的3级微小核糖核酸基因定量数据及临床数据分别从GDC legacy archive及GDC数据门户获得。患者根据miR-324-5p/3p比被分层，前40％及后40％包括在分析中。患者的生存通过Kaplan-Meier方法来推定，利用R语言生存包通过双面对数秩检验进行测试。
12.蛋白质印迹(Western blot)
用PBS洗涤细胞，并且在补充有蛋白酶抑制剂混合物组III(Merck Millipore)及磷酸酶抑制剂混合物II(AG Scientific)的RIPA缓冲液(Thermo Scientific)中裂解。用BCA蛋白质分析试剂盒(Pierce Biotechnology)测定蛋白质浓度，从4-12％Tris-甘氨酸凝胶(Thermo Scientific)中分离出相同量的蛋白质并转移到Immobilon-PPVDF膜(MerckMillipore)。将膜与包含5％脱脂奶的PBS-T(PBS(Amresco)+0.1％twin 20(Anatrace))一起培养后用第一抗体进行处理。用PBS-T洗涤3次后，将膜与HRP-接合第二抗体一起培养。由SuperSignal West Pico PLUS Chemiluminescent Substrate(Thermo Scientific)检测蛋白条带，由ChemiDoc XRS+系统(Bio-Rad)扫描蛋白条带。
针对末端尿苷酰基转移酶4(18980-1-AP，RRID：AB_10598327，1：500)及末端尿苷酰基转移酶7(25196-1-AP，1：500)的兔多克隆抗体从Proteintech获得。针对Cyclin E(sc-247，RRID：AB_627357，1：1,000)的小鼠单克隆抗体及针对Cyclin A(sc-751，RRID：AB_631329，1：1,000)、Cyclin B1(sc-752，RRID：AB_2072134，1：1,000)及Cyclin D1(sc-753，RRID：AB_2070433，1：1,000)的兔多克隆抗体从Santa Cruz Biotechnology获得。与HSP90(4874，RRID：AB_2121214，1：1,000)相关的兔多克隆抗体从Cell Signaling获得。针对兔IgG(111-035-144，RRID：AB_2307391，1：10,000)及小鼠IgG(115-035-146，RRID：AB_2307392，1：10,000)的HRP-接合山羊多克隆抗体从Jackson ImmunoResearch获得。
13.流式细胞分析(Flow cytometry)
将细胞与10μM的BrdU一起培养3～8小时之后，用冰冷(ice-cold)的70％乙醇固定。将固定的细胞与FITC-接合抗-BrdU抗体(11-5071-42，RRID：AB_11042627，Invitrogen)一起培养，在存在10μg/mL的核糖核酸酶A(Thermo Scientific)的情况下，用20μg/mL的碘化丙啶(Sigma-Aldrich)进行进一步染色。然后，利用BD Accuri C6 Plus流式细胞分析仪进行检测。细胞周期由BD Accuri C6系统软件来分析。
实施例
1.mir-324的替代链选择(或者臂切换(Arm switching))
首先，检索对链比率(strand ratio)变化大的微小核糖核酸。为了准确定量链比率，使用AQ-seq文库协议。链选择(strand selection)的变异(variation)根据15个不同的小鼠组织/发育阶段来推定(图1ax轴)。并且，为了比较人类链的使用情况，使用了从9个人体细胞株获得的sRNA-seq数据集。
从图1a可以确认，在人类及小鼠数据集中大部分的微小核糖核酸的链比率(～79％，小于3％的中间分散)没有变化。但是，确认了明确表示变化的几个示例，如mir-324、mir-362、mir-193a及mir-140。
尤其，由于mir-324的臂切换可能对确定细胞命运有实际影响，因此关注mir-324的链变化。
从图1b至图1d可以确认，检测出在单一MIR324基因位点产生的5’-isomiRs(5p，3p.1及3p.2)这三种基团(图1b)。5p链在小鼠胚胎及神经组织上有优势，反之作为主要(major)3p异构体的3p.1在肝及胃上有优势(图1c)。并且，5’-isomiR基团在哺乳类中被发现，这表示进化性保守了替代链选择机制(图1d)。
2.mir-324臂切换由末端尿苷酰基转移酶4及末端尿苷酰基转移酶7调控。
确认3p的尿苷化频率(uridylation frequency)与5p/3p.1比具有负相关关系(图2a)。因此，假设尿苷化可能参与臂切换。
另一方面，末端尿苷酰基转移酶(Terminal uridylyl transferases)的末端尿苷酰基转移酶4(也称为ZCCHC11及TENT3A)及末端尿苷酰基转移酶7(也称为ZCCHC6及TENT3B)促进包含pre-微小核糖核酸的某种集(例如，let-7前体)的各种核糖核酸肿瘤的尿苷化。末端尿苷酰基转移酶4及末端尿苷酰基转移酶7(末端尿苷酰基转移酶4/7)在大部分的底物上重复工作。
基于如上述的事实，通过在小鼠组织中对末端尿苷酰基转移酶4/7水平进行定量(实时定量聚合酶链式反应)的结果，可知在末端尿苷酰基转移酶4及末端尿苷酰基转移酶7水平相对较低的细胞类型中5p/3p.1比率更高(图2b)。
为了确认末端尿苷酰基转移酶4/7参与mir-324成熟(maturation)，在HEK293T细胞中消耗(depleted)末端尿苷酰基转移酶4/7，并且进行sRNA-seq(AQ-seq)。
如图2c所示，末端尿苷酰基转移酶4/7敲落降低微小核糖核酸的尿苷化，包括miR-324-3p(左侧上部面板)。并且，末端尿苷酰基转移酶4/7敲落导致3p.1的减少,及5p及辅助(minor)异构体3p.2的增加等miR-324的异构体组成的变化，最终，主要异构体之间(5p/3p.1)的比增加(右侧上部及下部面板)。
这种测序数据与诺瑟杂交结果(图2d)一致，意味着在敲落末端尿苷酰基转移酶4/7时，miR-324异构体的量发生变化。
并且，如图2e所示，对从末端尿苷酰基转移酶4/7双敲除小鼠公开的sRNA-seq数据重新分析的结果，在敲除末端尿苷酰基转移酶4/7时，3p.1水平下降而5p水平增加(左侧面板)。最终，从检查的所有组织/细胞类型(骨髓，胚胎成纤维细胞，胚胎干细胞及肝)观察到由末端尿苷酰基转移酶4/7双敲除引起的链比率的变化(右侧面板)。
3.尿苷化诱导pre-mir-324的替代Dicer切割。
已知末端尿苷酰基转移酶4/7修饰pre-微小核糖核酸，而不是成熟微小核糖核酸。因此，为了确认末端尿苷酰基转移酶4/7如何调控mir-324链选择，用合成pre-mir-324进行试管内Dicer切割分析，从而确认尿苷化对pre-微小核糖核酸切割的影响。
从图3a可以确认，当pre-mir-324在3’末端具有一个或者2个额外尿苷残基时，Dicer切割位点移动3-nt(在图3a中从位置A移动到位置B)。未修饰的pre-mir-324主要产生包含5p及3p.2的较长双联体(黑色箭头)，而尿苷化的pre-mir-324以在代替位置(位置B)分裂的方式产生由较短的5p及3p.1组成的较短双联体(白色箭头)。由此可知，pre-mir-324的末端尿苷酰基转移酶4/7-介导尿苷化导致替代Dicer切割。
并且，如图3b及图3c所示，来自末端尿苷酰基转移酶4/7-消耗的人类及小鼠细胞的测序数据支持如下结论，即，3p isomiRs(3p.1vs.3p.2)的相对丰富性根据末端尿苷酰基转移酶4/7敲落(图3b)及敲除(图3c)而变化，由此尿苷化改变Dicer切割位点的选择。
4.替代Dicer切割被双链核糖核酸结合域(double stranded RNA-bindingdomain)得以促进。
首先，为了确认引起3-nt移动的决定因素，从pre-mir-324中去除U凸起(bulge)。
如图4a所示，在“无U凸起”突变体的情况下，Dicer的切割位点不再通过尿苷化而突然移动到位置B，而是根据尿苷数量逐渐移动(lane10～12)。因此，确认U凸起为在位置A与B之间的位点上切割的抗决定因子(anti-determinant)，从而用作充当负责Dicer的替代切割的顺式作用(cis-acting)因素。
然后，为了确认5’-及3’-计数规则与pre-mir-324切割有何关联，利用5’或者3’口袋中的Dicer突变体。
从图4b可以确认，5’口袋Dicer突变体未在位置A切割pre-mir-324，3’口袋突变体未影响切割位点选择的同时，稍微影响切割效率。这种结果表示，对在位置A进行的切割的5’口袋的重要性。
进而，观察了Dicer中的其他域的贡献度。为了确认试管内Dicer dsRBD的作用，产生dsRBD-缺失突变体。
从图4c可以确认，dsRBD缺失导致切割模式发生重大变化。即，如果没有dsRBD，则Dicer主要切割位置A，这表示dsRBD负责位置B中的切割。
综上所述，从图4d可以确认，可知未修饰的pre-mir-324依赖于Dicer的平台域中存在的5’口袋，在位置A被切割(左侧面板)。但是，由于尿苷化后，无法牢固地固定在平台/PAZ域，因此最终结构(3-4nt 3’突出端)在dsRBD的帮助下，pre-mir-324在Dicer上重新定位，从而能够在位置B进行替代切割(右侧面板)。
5.替代Dicer切割诱导臂切换。
根据上述多个实施例的结果，从图5a可以确认，可知pre-mir-324可产生2种替代形式的双联体，即长双联体(位置A；5p/3p.2)及短双联体(位置B；5p/3p.1)。
因此，为了确认细胞中的链选择，构成包含与miR-324-5p或者miR-324-3p.1互补的3’UTR的报道分子(图5b左侧面板)，将合成双联体((5p/3p.2)或者(5p/3p.1))与报道分子进行共同转染(co-transfected)。其结果，长双联体选择性抑制具有5p互补位点(complementary sites)的报道分子而不是具有3p.1位点的报道分子。相反，短双联体下调3p.1报道分子，但未下调5p报道分子(图5b右侧面板)。
这种结果表明，实际上5p及3p.1的生成分别不同于长双联体及短双联体。即，可知在长双联体的情况下，与3p.2的5’末端相比，5p的5’末端在热力学上不稳定，因此选择5p链(图5a，蓝色虚线四边形)，相反，在短双联体的情况下，3p.1起始于由AGO首选的5’腺苷(图5a，红色虚线四边形)。
综上所述，可知基于替代Dicer切割产生mir-324的臂切换。
6.mir-324臂切换调控细胞周期的进行。
已在人成胶质细胞瘤(GBM)中报道miR-324-3p的5’末端变化，从图6a可以确认，实际上肿瘤(GBM)中的3p.1的比率显著高于正常的脑组织(Normal brain)。
因此，为了观察在GBM中末端尿苷酰基转移酶4/7-介导mir-324成熟受到不同调控的可能性，利用Oncopression分析转录体数据集。
从图6b可以确认，在GBM中，末端尿苷酰基转移酶4及末端尿苷酰基转移酶7均显著上调。
另外，当使用对信使核糖核酸及微小核糖核酸均进行分析的独立数据集与正常样本进行比较时，确认在GBM中末端尿苷酰基转移酶4/7的量上调，而miR-324-5p/3p比减少。
从图6c可以确认，可知末端尿苷酰基转移酶4/7水平与5p/3p比率存在负相关关系。这种结果表明，在GBM中末端尿苷酰基转移酶4/7-介导mir-324调控可能在生理学上具有关联性。
基于上述结果，为了理解mir-324臂切换的功能，观察在GBM细胞株中由mir-324替代链选择来诱导的分子及细胞表现型。
从图6d及图6e可以确认，针对合成长双联体(“5p双联体”)或者3p的反义寡核苷酸(“3p抑制剂”)的转染导致细胞周期蛋白D及E的积累以及细胞周期蛋白A及B的减少(左侧面板)。并且，根据细胞周期分析，可知细胞停止在G1阶段(右侧面板)。
从图6f可以确认，末端尿苷酰基转移酶4/7敲落也同样导致了细胞周期蛋白调控异常及G1停止。
综上所述，可知miR-324isomiRs具有抗GBM细胞增殖的功能。
小结
从图7可以确认，作为末端尿苷化酶的末端尿苷酰基转移酶4/7通过尿苷化pre-mir-324，对mir-324替代链选择起到主要实施者的作用。即，末端尿苷酰基转移酶4/7尿苷化pre-mir-324，尿苷化现象调控pre-mir-324的Dicer切割位置，从而改变具有不同功能的3种微小核糖核酸(5p及2种3p异构体)之间的比率。因此，如果抑制基于尿苷化的miR-324调控，则可以抑制与细胞分裂有关的多个基因的表达，并且可以抑制成胶质细胞瘤的生长。
根据本发明，由于可以通过末端尿苷酰基转移酶4/7调控微小核糖核酸(miR-324)的替代链选择，因此可有效地用于癌症(脑瘤)的预防和治疗。
产业上的可利用性
本发明涉及包含末端尿苷酰基转移酶4/7表达调控因子的用于预防或治疗癌症的药学组合物，更详细地，涉及包含用于调控末端尿苷酰基转移酶4/7表达的核酸序列的用于预防或治疗癌症的药学组合物。
序列表
<110> Seoul National University R&DB Foundation
INSTITUTE FOR BASIC SCIENCE
<120> 包含末端尿苷酰基转移酶4/7表达调控因子的用于预防或治疗癌症的药学组合物
<130> PP200013
<150> KR 10-2019-0022551
<151> 2019-02-26
<160> 46
<170> KoPatentIn 3.0
<210> 1
<211> 23
<212> RNA
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<211> 4938
<212> RNA
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<223> 末端尿苷酰基转移酶4
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aacacaagaa ugcuagcuac uuaugcagcu auugauccua gagugcagua uuugggauau 3300
acuaugaaag uguuugcuaa gcgaugugac auuggggaug cuuccagggg aaguuuaucu 3360
ucauaugcau auauccuuau ggugcuguac uuucugcagc agagaaagcc accuguuauc 3420
ccaguucuac aagagaucuu ugauggaaaa cagauuccac agagaauggu ugauggaugg 3480
aaugcuuucu ucuuugauaa aacagaagaa cugaaaaagc guuuaccuuc acuuggaaag 3540
aacacagaau cauuagggga gcuuuggcug ggacugcuuc guuucuauac ugaagaguuu 3600
gauuucaagg aauauguaau uagcauucgg cagaaaaagc uguugacaac uuuugagaag 3660
caguggacuu ccaagugcau ugcaauugaa gacccuuuug acuugaauca uaaccuuggu 3720
gcuggaguuu ccagaaaaau gaccaauuuc aucaugaaag cauuuaucaa uggaaggaaa 3780
cuuuuuggua ccccuuuuua uccacucauu ggcagagaag cugaguacuu cuuugauucc 3840
agaguauuaa cagauggaga acuggcuccc aaugauagau guugccgugu guguggaaaa 3900
auaggccacu acaugaaaga cugcccuaaa aggaaaagca guuuacuguu uagacuaaag 3960
aagaaagaca gugaagaaga gaaggaaggg aaugaagaag agaaagauuc ccgagauguu 4020
cuugaccccc gagaccucca cgauacucga gacuuuagag acccgagaga ccucagaugu 4080
uuuauaugug gagaugcugg acauguacga agggagugcc cagaggucaa gcuggcccgu 4140
cagaggaaua gcaguguggc agcagcccag cugguccgca accuuguaaa ugcucaacag 4200
guggcugguu cagcucagca acagggugau caguccauaa ggacuagaca gucaucagaa 4260
uguucugaau caccaucuua uucuccucag ccucagccau uuccacagaa cucuucccag 4320
ucagcugcua uuacucagcc uucaucucag ccaggauccc aaccuaagcu uggcccaccu 4380
cagcagggag cccaaccucc ccaucagguc cagaugccac uguauaacuu uccccaguca 4440
ccaccagcuc aguauucucc caugcacaau augggauugu ugccaaugca cccucuccag 4500
aucccugccc cguccuggcc cauccauggc ccagugaucc acucugcacc aggcagugcc 4560
cccagcaaua uuggccuaaa ugaucccagc aucaucuuug cacagccugc ugccagaccu 4620
guggcaaucc cuaacacguc ucacgaugga cacuggcccc guacuguggc uccaaauucc 4680
cugguaaaca guggugcagu ggggaauuca gagccaggcu uucgaggacu gacuccucca 4740
auuccuuggg aacaugcacc gcguccccau uucccccuug ucccagcuuc guggccuuau 4800
gguuugcauc aaaacuucau gcaucaggga aaugcccgau uccagcccaa caaaccuuuc 4860
uauacucaag acagaugugc cacccgucgg uguagagagc guugucccca cccaccaaga 4920
ggaaacgugu cggaguaa 4938
<210> 22
<211> 4488
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 末端尿苷酰基转移酶7
<400> 22
augggagaua cagcaaaacc uuauuucgug aagcgcacua aagaccgggg gacuauggau 60
gaugaugacu ucagaagggg ucacccccaa caagauuauu uaauaauaga ugaccaugcu 120
aaaggccaug gcaguaaaau ggaaaagggc cuucaaaaaa agaagauaac accagggaac 180
uaugggaaua cccccagaaa aggaccaugu gcuguuucca gcaauccaua ugcauuuaaa 240
aacccaaucu acagucaacc cgcuuggaug aaugacagcc acaaagauca gaguaagaga 300
uggcugucug augaacauac ugguaauuca gacaacugga gagaauucaa accuggaccu 360
agaauuccug uuauaaaccg acaaagaaaa gacuccuuuc aagaaaauga agaugguuau 420
agguggcaag acacaagagg cugcagaacu guaagacgac uguuucauaa agaccuaaca 480
agccuagaaa ccacgucaga aauggaagca ggaaguccug aaaacaagaa gcagaggucc 540
agaccuagga agccacggaa gacuagaaau gaggaaaaug agcaggaugg agacuuggaa 600
ggcccuguga ucgaugaguc uguacuuuca acgaaggagc ugcuaggcuu acagcaggcu 660
gaggagagac ugaagagaga cugcauugac aggcuaaaaa ggcgaccacg aaacuacccu 720
acagcaaagu acaccugcag acucugugau guuuuaauug aauccauugc auuugcccau 780
aagcauauca aggaaaagag gcacaagaaa aacauuaagg agaagcaaga ggaagaguug 840
cucacuacgu uacccccacc aacacccucc cagauaaaug caguuggcau ugccauugac 900
aaagugguac aggaauuugg cuuacacaau gagaacuugg aacagaggcu ggaaauuaaa 960
cguaucaugg aaaauguguu ccaacacaag uuaccagauu guucccuaag auuauauggg 1020
ucauccugua gcagauuggg uuucaaaaau ucggauguaa acauugacau ccaguuucca 1080
gccauuaugu cucagccaga uguccucuua cuuguucaag aauguuuaaa gaacagugac 1140
uccuuuauug auguugaugc agacuuccau gcuagggugc cagugguggu gugcagagaa 1200
aagcaaagug gucuucugug uaaagugagc gcaggaaaug aaaaugcuug ucugacaaca 1260
aagcauuuaa cugcccuugg aaaacuagaa ccaaagcugg uuccuuuggu gauugcauuu 1320
agguacuggg caaagcuuug caguauagau cgcccugaag aaggaggucu gccaccuuau 1380
guguuugccc ugauggccau uuucuuucuu cagcagagga aagaaccccu uuugccugua 1440
uaucuaggau cauggauuga aggauucuca uuaagcaaac uagggaauuu caaccuucaa 1500
gacauugaaa aagauguugu gaucugggaa cauacugaca gugcugcagg ggacacaggc 1560
auaacaaaag aagaggcacc aagagaaacg ccgauuaaaa ggggacaggu gucauuaaua 1620
uuggauguga aacaccagcc uucaguacca guugggcagc ucugggugga auugcugcgg 1680
uucuaugcuu uagaauuuaa uuuggcugau uuagugauaa guauucgugu caaagaauug 1740
guaucucggg aauugaagga uuggcccaaa aagcgcauug ccauugaaga ucccuacucu 1800
guuaaaagaa auguggcaag aacccuaaau agucaaccug uguuugaaua uauacuucau 1860
uguuuaagga caacauacaa guauuuugcu cuuccacaca aaauuacaaa auccagccuu 1920
cuaaagccuc ugaaugcaau uacauguauu ucagaacauu cuaaagaagu aauaaaucau 1980
cauccagaug uacaaacaaa agaugauaag cucaaaaacu caguuuuggc ccaagguccu 2040
ggugcuacca guucagcugc aaauaccugu aagguacagc cacuuacucu uaaagagacu 2100
gcugaaaguu uuggaagccc accaaaagaa gaaaugggaa augaacacau caguguccac 2160
ccugaaaacu cagacuguau ccaagcagau guuaacucug augauuacaa gggugauaaa 2220
guauaccauc cagaaacagg aaggaaaaac gagaaagaga aaguuggaag gaagggcaag 2280
caucuguuga cuguugauca gaaacgugga gagcauguug ucuguggcag cacacguaau 2340
aaugagucag agagcacuuu ggauuuagaa ggcuuccaaa aucccacagc uaaagagugu 2400
gagggacuug ccacuuuaga uaacaaggcu gaucuugaug gagaaaguac agaagguacu 2460
gaggaacuag aagacucucu aaaccacuuu acccacucag uacagggcca gacaucagaa 2520
augauucccu cugaugaaga ggaggaggac gacgaagaag aggaggagga agaagaaccu 2580
aggcucacca uuaaccaaag ggaagaugaa gauggcaugg cuaaugaaga ugaguuagac 2640
aacaccuaca cugggucagg ggaugaggac gcccuaucug aagaggauga ugaguuaggc 2700
gaagcugcua aguaugaaga cgugaaagaa uguggaaaac auguagaaag agcucuccua 2760
guggaacuua auaaaauaag ucucaaggaa gaaaauguau gugaagaaaa aaauucaccu 2820
guggaucagu cugauuuuuu uuaugaauuc aguaaacuua ucuucaccaa aggcaagucu 2880
ccuacgguag ugugcagcuu augcaaacga gagggucauc uaaagaagga cuguccugaa 2940
gacuucaaaa gaauccagcu agaaccucug ccaccauuaa cacccaaguu uuuaaauauc 3000
uuagaucaag ucuguaucca guguuauaag gauuuuucuc caacaauuau agaagaucag 3060
gcucgugaac auauucggca aaaccuagaa aguuucauaa gacaggacuu uccaggaacu 3120
aaauugagcc uguuuggcuc cuccaaaaau ggauuugggu ucaaacagag ugaccuugac 3180
gucuguauga caauuaaugg acuugaaacu gcugagggau uggacugugu cagaacuauu 3240
gaagaauuag caagaguccu cagaaaacau ucaggucuga gaaacaucuu accuauuaca 3300
acagcaaagg ugccaauugu gaaguucuuc cauuugagaa guggucugga aguagauauc 3360
aguuuguaua acacauuggc ccuucauaac acaaggcuuu uaucugcuua uuccgccauu 3420
gaucccagag ugaaguauuu gugcuauacc augaaaguau uuacaaagau gugugauauu 3480
ggugaugcau cuagaggcag cuuaucaucg uaugcauaua cucuuauggu gcuauauuuu 3540
cuccagcaga ggaauccacc agucauuccu guccuucaag agauauacaa aggugaaaag 3600
aaaccugaaa uauuuguuga uggcuggaau auuuauuuuu uugaucaaau agaugaacug 3660
ccuaccuauu ggucagaaug uggaaaaaau acagaaucug uugggcaguu augguugggc 3720
cuucuucguu ucuacacaga ggaauuugau uuuaaagaac auguuauuag caucaggaga 3780
aaaagucugc uuacaacuuu uaagaaacag uggaccucaa aauacauugu uauugaagau 3840
cccuuugauu ugaaucauaa ucuuggagcu ggauuaucaa ggaaaaugac aaauuuuaua 3900
augaaggcuu uuaucaaugg uagaagagua uuugguauuc cugucaaggg auuuccaaag 3960
gacuaccccu caaaaaugga auacuuuuuu gauccagaug uguuaacuga aggagagcug 4020
gccccaaaug auagauguug ucgaauuugu ggaaaaaucg gacacuucau gaaggacugu 4080
ccuaugagga gaaaaguaag acggcggcga gaucaggaag augcccugaa ccaaagauac 4140
ccugagaaca aggaaaaaag aagcaaagag gacaaagaaa uucacaacaa guacacagaa 4200
agggaggugu caacaaaaga agauaagccc auacagugca caccucagaa agccaagcca 4260
augcgggcag cugcugaccu ggggagggag aagauccuca ggccaccagu agaaaaaugg 4320
aagagacagg augacaaaga cuuaagagaa aaacguuguu uuauuugugg aagagaaggg 4380
cacauuaaaa aggaaugccc acaguuuaaa ggcucuucag guagccuuuc caguaaauau 4440
augacucagg gaaaagccuc agcgaagagg acccagcagg aaucauga 4488
<210> 23
<211> 90
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 3X miR-1-3p
<400> 23
agttgtttca atctacttcc gaacattcca cgcgcaatct acttccgaac attccacgcg 60
caatctactt ccgaacattc caaaacgagc 90
<210> 24
<211> 90
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 3X miR-324-5p
<400> 24
agttgtttca atctacttcc gagggatgca cgcgcaatct acttccgagg gatgcacgcg 60
caatctactt ccgagggatg caaaacgagc 90
<210> 25
<211> 90
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 3X miR-324-3p.1
<400> 25
agttgtttca atctacttcc gaggggcaga cgcgcaatct acttccgagg ggcagacgcg 60
caatctactt ccgaggggca gaaaacgagc 90
<210> 26
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> miRNA_正向引物
<400> 26
ctcgctagcc tcgagagttg tttcaatcta cttcc 35
<210> 27
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> miR-1-3p_反向引物
<400> 27
caggtcgact ctagagctcg ttttggaatg ttcgg 35
<210> 28
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> miR-324-5p_反向引物
<400> 28
caggtcgact ctagagctcg ttttgcatcc ctcgg 35
<210> 29
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> miR-324-3p.1_反向引物
<400> 29
caggtcgact ctagagctcg ttttctgccc ctcgg 35
<210> 30
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> miNC 正义
<400> 30
ccuacgccac caauuucguu u 21
<210> 31
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> miNC 反义
<400> 31
acgaaauugg uggcguaggu u 21
<210> 32
<211> 20
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 3p.1双联体_5p
<400> 32
cgcauccccu agggcauugg 20
<210> 33
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 3p.1双联体_3p.1+U
<400> 33
acugccccag gugcugcugg u 21
<210> 34
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> miR-324-5p探针
<400> 34
accaatgccc taggggatgc g 21
<210> 35
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> miR-324-3p探针
<400> 35
cagcagcacc tggggcagt 19
<210> 36
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> TUT4 正向引物
<400> 36
gcctaaaagg cggatagcca ttg 23
<210> 37
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> TUT4 反向引物
<400> 37
gctgctctga atctttccac aac 23
<210> 38
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> TUT7 正向引物
<400> 38
cagctcagca aaagaggagg ca 22
<210> 39
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> TUT7 反向引物
<400> 39
catagaaccg cagcaattcc acc 23
<210> 40
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> GAPDH 正向引物
<400> 40
accacagtcc atgccatcac 20
<210> 41
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> GAPDH 反向引物
<400> 41
tccaccaccc tgttgctgta 20
<210> 42
<211> 30
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Pre-mir-324 5' half
<400> 42
cgcauccccu agggcauugg uguaaagcug 30
<210> 43
<211> 29
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> No-bulge pre-mir-324 5' half
<400> 43
cgcauccccu agggcauugg guaaagcug 29
<210> 44
<211> 27
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Pre-mir-324 3' half
<400> 44
gagacccacu gccccaggug cugcugg 27
<210> 45
<211> 28
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Pre-mir-324 3' half + U
<400> 45
gagacccacu gccccaggug cugcuggu 28
<210> 46
<211> 29
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Pre-mir-324 3' half + UU
<400> 46
gagacccacu gccccaggug cugcugguu 29

Claims (14)

1.一种用于预防或治疗癌症的药学组合物，其包含选自由如下组组成的组中的至少一种：
包含SEQ ID NO：1及SEQ ID NO：2的碱基序列的微小核糖核酸；
由SEQ ID NO：4的碱基序列组成的核酸；以及
包含选自由SEQ ID NO：5至SEQ ID NO：20组成的组中的至少一种碱基序列的小干扰核糖核酸。
2.根据权利要求1所述的用于预防或治疗癌症的药学组合物，其中所述微小核糖核酸为包含上述SEQ ID NO：1的碱基序列的微小核糖核酸与包含上述SEQ ID NO：2的碱基序列的微小核糖核酸相结合的双联体形式。
3.根据权利要求1所述的用于预防或治疗癌症的药学组合物，其中所述小干扰核糖核酸为如下复合体形式：
包含SEQ ID NO：5至SEQ ID NO：8中的一个碱基序列的小干扰核糖核酸与包含上述SEQID NO：9至SEQ ID NO：12中的一个碱基序列的小干扰核糖核酸相结合的复合体形式；或者
包含SEQ ID NO：13至SEQ ID NO：16中的一个碱基序列的小干扰核糖核酸与包含上述SEQ ID NO：17至SEQ ID NO：20中的一个碱基序列的小干扰核糖核酸相结合的复合体形式。
4.根据权利要求1所述的用于预防或治疗癌症的药学组合物，其中所述癌症选自由脑瘤、结肠癌、结肠直肠癌、肺癌、肝癌、胃癌、食道癌、胰腺癌、胆囊癌、肾癌、膀胱癌、前列腺癌、睾丸癌、宫颈癌、子宫内膜癌、绒毛膜癌、卵巢癌、乳腺癌、甲状腺癌、脑癌、头颈癌及恶性黑色素瘤组成的组中。
5.根据权利要求1所述的用于预防或治疗癌症的药学组合物，其中所述癌症为脑瘤。
6.一种用于诊断癌症的组合物，其包含用于测定选自由miR-324-5p及miR-324-3p.1组成的组中的至少一种微小核糖核酸的表达水平的制剂。
7.根据权利要求6所述的用于诊断癌症的组合物，其中所述制剂包含与上述至少一种微小核糖核酸特异性结合的引物或者探针。
8.一种用于诊断癌症的试剂盒，其包含权利要求6及权利要求7中任一项所述的组合物。
9.根据权利要求8所述的用于诊断癌症的试剂盒，其中所述试剂盒用于反转录聚合酶链式反应、实时反转录聚合酶链式反应、核糖核酸印迹法、核糖核酸保护分析法或者微阵列芯片。
10.一种用于诊断癌症的组合物，其包含用于测定选自由末端尿苷酰基转移酶4及末端尿苷酰基转移酶7组成的组中的至少一种基因信使核糖核酸或者其蛋白质的水平的制剂。
11.根据权利要求10所述的用于诊断癌症的组合物，其中用于测定上述基因信使核糖核酸水平的制剂包含，与上述末端尿苷酰基转移酶4及末端尿苷酰基转移酶7中的至少一种信使核糖核酸特异性结合的引物或者探针。
12.根据权利要求10所述的用于诊断癌症的组合物，其中用于测定上述蛋白质水平的制剂包含，与上述末端尿苷酰基转移酶4及末端尿苷酰基转移酶7中的至少一种蛋白质特异性结合的抗体。
13.一种用于诊断癌症的试剂盒，其包含权利要求10至权利要求12中任一项所述的组合物。
14.根据权利要求13所述的用于诊断癌症的试剂盒，其中所述试剂盒用于反转录聚合酶链式反应试剂盒，脱氧核糖核酸芯片试剂盒或者蛋白质芯片。
CN202080016505.0A 2019-02-26 2020-02-25 包含末端尿苷酰基转移酶4/7表达调控因子的用于预防或治疗癌症的药学组合物 Active CN113498437B (zh)

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