JP5931050B2 - miR−155によるミスマッチ修復およびゲノム安定性の調節に関連する材料および方法 - Google Patents
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Description
[0001]本出願は、2010年3月26日出願の米国仮出願第61/318,042号の優先権を請求し、その全開示は、参照により本明細書に明確に援用される。
[0002]本発明は、米国衛生研究所により授与された助成金第GM080176号、第CA067007号、第CA124541号および第CA135030号のもとに、政府の援助で行われなかった。米国政府は、本発明に特定の権利を有する可能性がある。
[0003]本出願は、EFS−ウェブを通じて提出され、そしてその全体が参照により本明細書に援用される配列表を含有する。2011年3月21日に作成されたASCIIコピーは、604_51754_SEQ_LIST_OSU−10126.txtと名付けられ、そしてそのサイズは5,627バイトである。
[0004]本発明は、一般的に、分子生物学の分野に関する。より詳細には、本発明は癌関連技術に関する。本発明の特定の側面には、miR−155関連障害の診断学、治療学、および予後学における適用が含まれる。
[0009]MMR機能不全に関連する疾患にはかなりの研究が行われているにもかかわらず、これらは効率的に診断し、そして治療することが困難なままであり、そして患者において観察される死亡率は、これらの疾患の診断、治療および予防における改善が必要であることを示す。
[0012]本発明は、少なくとも1つのアンチセンスmiRNAおよび少なくとも1つのさらなる組成物を含む、組成物(composition of matter)であって、アンチセンスmiRNAが、少なくとも1つのコアMMRタンパク質を下方制御することが可能なmiRNAに対してアンチセンスであり、そして少なくとも1つのさらなる組成物がMMR関連疾患を治療するのに有用である、前記組成物を提供する。好ましくは、少なくとも1つのさらなる組成物は:化学療法薬剤;幹細胞;AG1478;ゲフィチニブ(Iressa(登録商標));エルロチニブ(Tarceva(登録商標));セツキシマブ;パニツマブ(panitumab);ザルツママブ(zalutumamab);ニモツザマブ(nimotuzamab);マツズマブ;およびラパチニブからなる群より選択される。好ましくは、アンチセンスmiRNAはmiRNA−155であり、そして/または少なくとも1つのコアMMRタンパク質は:hMSH1;hMSH6;およびhMLH1からなる群より選択される。
[0022]MMR機能不全細胞のアポトーシスを誘導するための方法であって、アンチセンスmiRNAのアポトーシス有効量を導入する工程を含み、アンチセンスmiRNAがmiRNA−155に対してアンチセンスである、前記方法もまた提供する。好ましいのは、細胞が、少なくとも1つの下方制御されたコアMMRタンパク質のために機能不全であり、該タンパク質が:hMSH2;hMSH6;およびhMLH1からなる群より選択される方法である。また好ましいのは、細胞がマイクロサテライト不安定性のために機能不全である方法である。また好ましいのは:化学療法薬剤;幹細胞;AG1478;ゲフィチニブ(Iressa(登録商標));エルロチニブ(Tarceva(登録商標));セツキシマブ;パニツマブ;ザルツママブ;ニモツザマブ;マツズマブ;およびラパチニブからなる群より選択される化合物からなる群より選択される化合物を導入する工程をさらに含む方法である。
[0058]DNA デオキシリボ核酸
[0059]mRNA メッセンジャーRNA
[0060]PCR ポリメラーゼ連鎖反応
[0061]プレmiRNA 前駆体マイクロRNA
[0062]qRT−PCR 定量的逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応
[0063]RNA リボ核酸
[0064]前述の一般的な説明および以下の詳細な説明のどちらも例示および説明のためのみであり、そして本解説の範囲を限定することは意図されないことが理解されるべきである。本出願において、単数形の使用には、別に言及しない限り、複数形が含まれる。
[0072]補助療法:一次治療の効果を改善するため、一次治療と組み合わせて用いる治療。
[0075]サイトカイン:他の細胞の挙動に影響を及ぼす、非常に多様な造血細胞および非造血細胞によって産生される、タンパク質。サイトカインは、自然および適応免疫反応の両方に重要である。
[0077]発現レベルの検出:例えば「miRまたはmiRNA発現レベルの検出」は、試料に存在するmiRまたはmiRNAの量を定量化することを指す。特異的miR、または任意のマイクロRNAの発現の検出は、当該技術分野において公知であるかまたは本明細書に記載する任意の方法を用いて、例えばqRT−PCRによって、達成可能である。miR発現の検出には、miRNAの成熟型またはmiRNA発現と相関する前駆体型のいずれかの発現を検出することが含まれる。典型的には、miRNA検出法は、配列特異的検出、例えばRT−PCRによるものを含む。当該技術分野において公知であり、そして配列番号にあるように本明細書において提供される前駆体および成熟miR核酸配列を用いて、miR特異的プライマーおよびプローブを設計することも可能である。
[0087]療法剤:被験体に適切に投与された際、所望の療法的または予防的効果を誘導することが可能な、化合物、小分子、または他の組成物、例えばアンチセンス化合物、抗体、プロテアーゼ阻害剤、ホルモン、ケモカインまたはサイトカイン。
[0094]本明細書のいくつかの方法において、試料中に存在するmiRNAを同定することが望ましい。
[00128]MMR機能不全から生じるミューテーター表現型は、癌進行を促進する、さらなる遺伝子突然変異の獲得を誘導する。生殖系列突然変異に加えて、コアMMRタンパク質発現の減少または非存在を生じる多くの病原性事象があり、それにはプロモーターメチル化、およびヒストンアセチル化減少、ならびに炎症および低酸素などの微小環境要因が含まれる。本発明者らの結果は、miR−155が、コアMMRヘテロ二量体タンパク質MSH2−MSH6およびMLH1−PMS2の下方調節を引き起こすことによって、この多要因制御において役割を果たすことを示す。miR−155によって、これらの必須のMMR構成要素を同時に阻害すると、突然変異誘発表現型が引き起こされる。
[00137]実施例1.
[00138]用いた材料および方法
[00139]細胞培養およびトランスフェクション
[00140]Colo−320DM、HCT−116およびDLD−1結腸直腸癌(CRC)細胞(American Type Culture Collection ATCC バージニア州マナサス)を、RPMI 1640(Gibco、カリフォルニア州カールスバッド)中で培養し、MV4−11 B骨髄単球性白血病細胞(ATCC バージニア州マナサス)およびパッケージング細胞293TN(System Biosciences、カリフォルニア州マウンテンビュー)をDMEM(Gibco、カリフォルニア州カールスバッド)中で増殖させた。すべての細胞に、抗生物質を加えた10%ウシ胎児血清(Sigma、ミズーリ州セントルイス)を補充した。マイコプラズマ混入に関して、細胞を定期的に、そして機能実験の前にチェックし、そして常に陰性であることが見出された。製造者のプロトコルにしたがってLipofectamine 2000(Invitrogen、カリフォルニア州カールスバッド)を用いることによって、細胞を6ウェルプレート中でトランスフェクションした。過剰発現研究のため、特異的miRNAまたは対照前駆体オリゴヌクレオチドをAmbion(テキサス州オースティン)から購入し、そして100nMで用いた。サイレンシング実験のため、miRCURY LNATMアンチmiR−155または対照miRCURYノックダウンプローブ(Exiqon、デンマーク・ベドベッグ)を100nMで用いた。以下に記載するように、定量的リアルタイムPCRによって、48時間後、miRNA発現を検証した。全長MLH1およびMSH6 cDNAをコードするプラスミドをOrigeneから購入した。QuikChange部位特異的突然変異誘発キット(Stratagene、カリフォルニア州サンディエゴ)を用いて、miR−155シード領域に関するMLH1およびMSH6突然変異体を調製した。0.3x106細胞を6ウェルプレートに植え付け、そして1μgのWTまたは突然変異cDNAコーディングプラスミドおよび1μgのmiR−155コーディングベクターまたは空ベクターを用いて、24時間後にトランスフェクションし、36時間後に細胞を採取して、そしてウェスタンブロッティングによって溶解物を分析した。
[00142]hMLH1、hMSH2およびhMSH6の3’−UTRおよび/またはCDS中の予測されるmiRNA結合部位を、以下のように、ホタル(firefly)・ルシフェラーゼ遺伝子の下流にクローニングした。特異的プライマー(以下の表2)を用いたPCRによって、SW−480細胞から、相補DNA(cDNA)を増幅した。
[00146]イムノブロッティング分析のため、プロテアーゼ阻害剤を加えた氷冷細胞溶解緩衝液(Cell Signaling Technology Inc. マサチューセッツ州ダンバース)で細胞を溶解した。等量のタンパク質を分離し、そして4X SDS−PAGE試料緩衝液と混合し、4%−20%および7.5%直線勾配Tris−HCL Criterion Precast Gels(Bio−Rad)中で電気泳動し、そしてニトロセルロースまたはPVDF膜(Bio−Rad)にトランスファーした。0.05%Tween20を含有するTris緩衝生理食塩水、pH7.4中の5%脱脂粉乳で膜をブロッキングし、そして製造者の指示にしたがって、一次および二次抗体とインキュベーションした。以下の一次抗体を用いた:マウス・モノクローナル抗MSH2(1:200、Invitrogen)、マウス・モノクローナル抗MSH6(1:500、BD Biosciences カリフォルニア州サンノゼ)、マウス・モノクローナル抗MLH1(1:200、Invitrogen)、ウサギ・ポリクローナル抗MLH1(マウス実験のために用いられる1:200 SantaCruz Biotechnology、カリフォルニア州サンタクルーズ)、マウス・モノクローナル抗アクチン(1:5000、Sigma)、マウス・モノクローナル抗GAPDH(1:1000、SantaCruz Biotechnology)。MLH1およびMSH6に対するN末端一次抗体(1/500 Sigma)。
[00148]Trizol(Invitrogen)で総RNAを単離した。一試験管TaqManマイクロRNAアッセイによって成熟miRNAを評価し、一方、目的のmRNAの発現を、以下のプローブを用いた遺伝子発現アッセイによって評価した:hMLH1=Hs00979923_m1、hMSH2=Hs00953523_m1、hMSH6=Hs00943001_m1(Applied Biosystems、カリフォルニア州フォスターシティ)。miRNA発現を、ヒトにおいてはRNU44およびRNU48、そしてマウス細胞においてはsnoR−135のものに対して標準化した。遺伝子発現をビンキュリンに対して標準化した。テンプレート不含対照およびRTを除いた対照を含めて、すべてのレトロトランスクリプターゼ(RT)反応をGeneAmp PCR 9700サーモサイクラー(Applied Biosystems)において行った。別に明記しない限り、各試料を3つ組で試験した。
[00150]成熟miRNA検出のため、先に記載されているようにアクリルアミド・ノーザンブロッティングを行った。
[00152]Colo−320DM細胞を、2つの異なるプロモーターの制御下で全長miR−155およびGFP遺伝子を含有するpCDH−CMV−MCS−EF1−miRNA発現プラスミドに安定感染させた(System Biosciences、カリフォルニア州マウンテンビュー)。空ベクターを対照として用いた。プレmiR−155発現および対照構築物を、293TNパッケージング細胞株中、pPACKH1レンチベクター・パッケージングプラスミド混合物(System Biosciences)でパッケージングした。PEG−itTMウイルス沈殿溶液を用いてウイルスを濃縮し、そしてUltraRapidレンチウイルス力価キット(System Biosciences)を用いて、力価を分析した。FACS分析によって、感染細胞を選択した(FACS Calibur、Becton Dickinson Immunocytometry Systems)。蛍光顕微法によって>90%の感染効率を検証し、そしてmiR−155発現に関するリアルタイムPCRによって、さらに確認した。
[00154]腫瘍タイプ(腺癌および粘液性腺癌)および分化等級をWHO基準にしたがって決定した。顕著な固形増殖パターンおよび穏やかなまたは中程度の核多形性を持つ癌を髄様腺癌3と分類した。
[00156]先に記載されている分析法にしたがって、MLH1およびPMS2発現の免疫組織化学分析を行った。核内MLH1またはMSH2発現の完全な喪失を示す腫瘍を、MLH1陰性またはMSH2陰性と分類した。正常上皮細胞、リンパ球、および間質細胞の核免疫染色は、各場合で、内部陽性対照として働いた。臨床データおよびMSI状態の知識を持たない2人の病理学者によって、すべての腫瘍を独立に評価した。
[00158]倫理委員会の認可後、Istituto Scientifico Romagnolo per lo Studio e la Cura dei Tumori、イタリア・メルドラで、CRCの83の連続症例由来の腫瘍および正常隣接組織から、新鮮凍結組織を収集した。タンパク質およびRNA抽出のための細胞溶解物を上述のように抽出した。
[00160]OSU Laser Capture Microdissection and Image Analysis Core Facilityで、LCMを行った。
[00162]CRC患者由来のDNAを増幅し、そして配列決定した。3730 DNA分析装置およびABI Prism BigDyeターミネーター・サイクル配列決定キット、バージョン3.1を配列決定分析に用いた。データ収集ソフトウェアv3.0および配列決定分析ソフトウェアv5.2を用いた。施設倫理委員会の認可後、患者情報および組織を収集した。
[00164]トランスフェクション
[00165]Lipofectamine 2000(Invitrogen、カリフォルニア州カールスバッド)を用いることによって、Colo−320DM、HCT−116、およびDLD1細胞をトランスフェクションし、一方、製造者の指示にしたがって、miR−155過剰発現のためのMV4−11レンチウイルスベクターおよび空ベクターをSystem Biosciences(カリフォルニア州マウンテンビュー)によって生成した。診断プライマーを用いた遺伝子型決定分析によって、マイクロサテライト不安定性を評価した。MSI患者由来のゲノムDNAを配列決定した。統計分析:別に示さない限り、結果を平均±標準誤差(S.E.M.)として表す。両側スチューデントt検定を用いて、群間の比較を行った。pが0.05より小さい場合、有意と認めた。Pearson相関に関しては、Graphpad Prism v5.0(Graphpad Software Inc.)分析を用いた。
[00167]hMLH1、hMSH2およびhMSH6は、miR−155のターゲットである。
[00172]このプロセスの結果、マイクロRNAがターゲットタンパク質を調節することが不可能になる。MLH1およびMSH6はどちらもCDSシード領域を含有する(図1;図6)。
[00181]miR−155の過剰発現は、ミューテーター表現型を誘導する。
[00182]MMR制御に対するmiR−155の生物学的役割を評価するため、本発明者らは、miR−155を過剰発現するColo−320DM CRC細胞の作製済み安定クローンに対するレンチウイルスベクター系を用いた(図3)。本発明者らは、MLH1、MSH2およびMSH6タンパク質発現が、空ベクターを発現する細胞(Colo−空;図3B)に比較して、miR−155を過剰発現するColo−155DM細胞(Colo−155)において、それぞれ、72%、42%および69%減少することを見出した。本発明者らはまた、MSH6 mRNAの減少も観察した(図3C)。転写に対する直接の影響の可能性は低いため、これらの結果は、miR155がMSH6プロモーターからの転写に影響を及ぼす他の制御因子をターゲットとする可能性があることを示す。
[00185]miR−155発現は、CRC組織において、hMLH1およびhMSH2と逆相関する。
[00191]MSI腫瘍におけるMMR制御解除の原因としてのmiR−155発現
[00192]MSIは、コアMMR遺伝子の1つの両対立遺伝子の不活性化後に獲得される。LS/HNPCCキャリアーにおいて、突然変異の大部分が、hMSH2およびhMLH1遺伝子中に見られる。LS/HNPCC患者においてMSI腫瘍を導く「第二のヒット」は、大部分が、影響を受けない対立遺伝子のヘテロ接合性喪失(LOH)または体細胞突然変異の結果である。CRCにおいて、LS/HNPCCは、MSI腫瘍の2〜5%を占める。孤発性CRC腫瘍のおよそ10〜15%がMSIを示し、これは大部分(90%)が、hMLH1プロモーターの2対立遺伝子不活性化の結果である。任意抽出の一連の1066のCRC患者において、135(12.7%)がMSIを示すことが見出された。これらのうち23(5.9%)がコアMMR遺伝子の1つに生殖系列突然変異を有すると決定され、そして106(78.5%)がhMLH1プロモーターのメチル化を含有することが見出された。これらのMSI腫瘍のおよそ5%が、コアMMRタンパク質の少なくとも1つの発現喪失を示し、明らかな遺伝子またはエピジェネティック上の原因はなかった。
[00198]療法/予防法および組成物
[00199]本発明は、有効量の療法剤、すなわち本発明のモノクローナル(またはポリクローナル)抗体、ウイルスベクター、Tcl1模倣体またはTcl1アンタゴニストを被験体に投与することによる、治療法および予防法を提供する。好ましい側面において、療法剤は実質的に精製される。被験体は、好ましくは動物であり、限定されるわけではないが、ウシ、ブタ、ニワトリ等の動物が含まれ、そして好ましくは哺乳動物であり、そして最も好ましくはヒトである。
[00210]癌患者を治療する方法
[00211]本実施例は、本明細書の組成物での治療に好ましい反応を有する可能性が高い患者を選択し、そして治療する方法を記載する。
[00215]癌患者を診断する方法
[00216]1つの特定の側面において、本明細書において、被験体が、癌を有するかまたは癌を進展させるリスクを有するかどうかを診断する方法を提供する。該方法には、一般的に、対照に比較してmiR−155の示差的miR発現パターンを測定する工程が含まれる。示差的miR発現パターンが確認された場合、結果は、被験体が癌を有するかまたは癌を進展させるリスクを有することの指標となる。特定の態様において、ノーザンブロット分析を用いて、少なくとも1つの遺伝子産物のレベルを測定する。また、特定の態様において、試験試料中の少なくとも1つの遺伝子産物のレベルは、対照試料中の対応するmiR遺伝子産物のレベルより低く、そして/または試験試料中の少なくとも1つのmiR遺伝子産物のレベルは、対照試料中の対応するmiR遺伝子産物のレベルより高い。
[00218]miR遺伝子産物の測定
[00219]被験体から得られた試験試料由来のRNAを逆転写して、1組のターゲット・オリゴデオキシヌクレオチドを提供し;miRNA特異的プローブ・オリゴヌクレオチドを含むマイクロアレイにターゲット・オリゴデオキシヌクレオチドをハイブリダイズさせて、試験試料に関するハイブリダイゼーション・プロファイルを提供し;そして対照試料から作成されたハイブリダイゼーション・プロファイルに、試験試料ハイブリダイゼーション・プロファイルを比較することによって、少なくとも1つのmiR遺伝子産物のレベルを測定してもよい。少なくとも1つのmiRNAのシグナルの変化は、被験体が、肺癌、特にEGFR突然変異肺癌を有するか、または該癌を進展させるリスクを有するかいずれかであることの指標となる。
[00221]診断および療法適用
[00222]別の側面において、本明細書において、少なくとも1つのmiRNAのシグナルが、対照試料から生成されるシグナルに比較して、制御解除されている(例えば下方制御されているおよび/または上方制御されている)場合、被験体において癌を治療する方法を提供する。
[00225]キット
[00226]本明細書に記載する組成物はいずれも、キット中に含まれてもよい。限定されない例において、miRNAを単離し、miRNAを標識し、そして/またはアレイを用いてmiRNA集団を評価するための試薬がキット中に含まれる。該キットにはさらに、miRNAプローブを生成するかまたは合成するための試薬も含まれてもよい。したがって、キットは、適切な容器手段中に、標識ヌクレオチドまたは続いて標識される非標識ヌクレオチドを取り込むことによってmiRNAを標識するための酵素を含むであろう。キットにはまた、1またはそれより多い緩衝剤、例えば反応緩衝剤、標識緩衝剤、洗浄緩衝剤、またはハイブリダイゼーション緩衝剤、miRNAプローブを調製するための化合物、およびmiRNAを単離するための構成要素も含まれてもよい。他のキットには、miRNAに相補的なオリゴヌクレオチドを含む核酸アレイを作製するための構成要素が含まれてもよく、そしてしたがって、例えば固体支持体が含まれてもよい。
[00237]アレイ調製およびスクリーニング
[00238]本明細書においてはまた、miRNAアレイの調製および使用も提供され、該miRNAアレイは、複数のmiRNA分子または前駆体miRNA分子に完全にまたはほぼ相補的であるかまたは同一であり、そして空間的に分離された構成で、支持体物質上に配置された、核酸分子(プローブ)の秩序だったマクロアレイまたは該核酸分子のマイクロアレイである。マクロアレイは、典型的には、プローブがスポットされているニトロセルロースまたはナイロンのシートである。マイクロアレイは、最大10,000の核酸分子が、典型的には1〜4平方センチメートルの領域内に適合可能であるように、核酸プローブをより密に配置する。
Claims (37)
- 少なくとも1つのアンチセンスmiR−155および少なくとも1つのさらなる組成物を含む組成物であって、アンチセンスmiR−155は少なくとも1つのコアMMRタンパク質を下方制御することが可能なmiR−155に対してアンチセンスであり、
ここで当該少なくとも1つのコアMMRタンパク質は:hMSH2;hMSH6;およびhMLH1からなる群より選択され、そして、
アンチセンスmiR−155と少なくとも1つのさらなる組成物の組合せが、結腸直腸癌、子宮内膜癌、卵巣癌、胃癌、および/または尿道上皮癌を治療するのに有用である、前記組成物。 - 少なくとも1つのさらなる組成物が:化学療法薬剤;幹細胞;AG1478;ゲフィチニブ;エルロチニブ;セツキシマブ;パニツマブ(panitumab);ザルツママブ(zalutumamab);ニモツザマブ(nimotuzamab);マツズマブ;およびラパチニブからなる群より選択される、請求項1に記載の組成物。
- アンチセンスmiR−155が、miR−155を標的とするロックト核酸修飾オリゴヌクレオチドを含む、請求項1に記載の組成物。
- 試験試料中のMMR機能不全細胞を同定する方法であって、試験試料中のmiRNA−155のレベルを対照のmiRNA−155のレベルと比較する工程を含み、
ここで、試験試料中のmiRNA−155のレベルが対照と比較して2〜4倍高く示差的に発現されたmiRNA−155のレベルが、試験試料をMMR機能不全細胞を含有するものとして同定する、
ここでMMR機能不全細胞はhMSH2遺伝子中に変異を有さず、hMSH6遺伝子に変異を有さず、そしてここでMMR機能不全細胞のhMLH1プロモーターはメチル化により不活化されていない、前記方法。 - 被験体がMMR機能不全細胞を有すること、または発展させるリスクがあることの指標となるmiRNA−155のレベルを測定する方法であって、試験試料中のmiRNA−155のレベルを対照のmiRNA−155のレベルと比較する工程、および試験試料中のmiRNA−155のレベルが対照と比較して2〜4倍高く示差的に発現されたmiRNA−155のレベルを被験体がMMR機能不全細胞を有すること、または発展させるリスクがあることとの相関において試験試料中のmiRNA−155のレベルを評価する工程を含む、
ここで、MMR機能不全細胞はhMSH2遺伝子中に変異を有さず、hMSH6遺伝子に変異を有さず、そしてここでMMR機能不全細胞のhMLH1プロモーターはメチル化により不活化されていない、前記方法。 - 被験体がリンチ症候群を有すること、または進展させるリスクがあることの指標となるmiRNA−155のレベルを測定する方法であって、試験試料中のmiRNA−155のレベルを対照のmiRNA−155のレベルと比較する工程、および試験試料中のmiRNA−155のレベルが対照と比較して2〜4倍高く示差的に発現されたmiRNA−155のレベルと被験体がリンチ症候群を有すること、または進展させるリスクがあることとの相関において試験試料中のmiRNA−155のレベルを評価する工程を含む、前記方法。
- 被験体が遺伝性非ポリポーシス結腸直腸癌を有すること、または進展させるリスクがあることの指標となるmiRNA−155のレベルを測定する方法であって、試験試料中のmiRNA−155のレベルを対照のmiRNA−155のレベルと比較する工程、および試験試料中のmiRNA−155のレベルが対照と比較して2〜4倍高く示差的に発現されたmiRNA−155のレベルと被験体が遺伝性非ポリポーシス結腸直腸癌を有すること、または進展させるリスクがあることとの相関において試験試料中のmiRNA−155のレベルを評価する工程を含む、前記方法。
- 被験体が結腸直腸癌および/またはMSI腫瘍を有すること、または進展させるリスクがあることの指標となるmiRNA−155のレベルを測定する方法であって、試験試料中のmiRNA−155のレベルを対照のmiRNA−155のレベルと比較する工程、および試験試料中のmiRNA−155のレベルが対照と比較して2〜4倍高く示差的に発現されたmiRNA−155のレベルと被験体が結腸直腸癌および/またはMSI腫瘍を有すること、または進展させるリスクがあることとの相関において試験試料中のmiRNA−155のレベルを評価する工程を含む、前記方法。
- MMR機能不全細胞の治療が必要な患者においてMMR機能不全細胞を治療するための医薬組成物であって、少なくとも1つのアンチセンスmiR−155および少なくとも1つのさらなる組成物を含み、ここで当該アンチセンスmiR−155は少なくとも1つのコアMMRタンパク質を下方制御することが可能なmiR−155に対してアンチセンスであり、ここで少なくとも1つのコアMMRタンパク質は:hMSH2;hMSH6;およびhMLH1からなる群より選択され;そしてここで少なくとも1つの医薬組成物はMMR機能不全細胞を治療するのに有用であり、
ここでMMR機能不全細胞はhMSH2遺伝子中に変異を有さず、hMSH6遺伝子に変異を有さず、そしてここでMMR機能不全細胞のhMLH1プロモーターはメチル化により不活化されていない、前記組成物。 - MMR機能不全細胞が:神経芽細胞腫;肺癌;胆管癌;非小細胞肺癌;肝細胞癌;リンパ腫;上咽頭癌;卵巣癌;頭頸部扁平上皮癌;扁平細胞子宮頸癌;胃癌;結腸癌;子宮頸癌;胆嚢癌;前立腺癌;乳癌;精巣胚細胞腫瘍;大細胞リンパ腫;濾胞性リンパ腫;結腸直腸癌;悪性胸膜中皮腫;神経膠腫;甲状腺癌;基底細胞癌;T細胞リンパ腫;t(8;17)前リンパ球性(prolyphocytic)白血病;骨髄異形成症候群;膵臓癌;t(5;14)(q35.1;q32.2)白血病;悪性線維性組織球腫;胃腸間質腫瘍;および肝芽腫;に由来する細胞からなる群より選択される、請求項9に記載の組成物。
- MMR機能不全細胞が:結腸直腸癌;子宮内膜癌;卵巣癌;胃癌;および尿路上皮癌;に由来する細胞からなる群より選択される、請求項9に記載の組成物。
- 少なくとも1つのさらなる組成物が、化学療法薬剤;幹細胞;AG1478;ゲフィチニブ;エルロチニブ;セツキシマブ;パニツマブ;ザルツママブ;ニモツザマブ;マツズマブ;およびラパチニブからなる群より選択される化合物を含む、請求項9に記載の組成物。
- MMR機能不全細胞のアポトーシスを誘導するための医薬組成物であって、請求項1に記載の組成物を含む、ここで当該MMR機能不全細胞はhMSH2遺伝子中に変異を有さず、hMSH6遺伝子に変異を有さず、そしてここでMMR機能不全細胞のhMLH1プロモーターはメチル化により不活化されていない、前記医薬組成物。
- MMR機能不全細胞のアポトーシスを誘導するため医薬組成物であって、アンチセンスmiRNAを含み、アンチセンスmiRNAがmiRNA−155に対してアンチセンスである、ここで当該MMR機能不全細胞はhMSH2遺伝子中に変異を有さず、hMSH6遺伝子に変異を有さず、そしてここでMMR機能不全細胞のhMLH1プロモーターはメチル化により不活化されていない、前記医薬組成物。
- 細胞が、少なくとも1つの下方制御されたコアMMRタンパク質のために機能不全であり、該タンパク質が:hMSH2;hMSH6;およびhMLH1からなる群より選択される、請求項14に記載の医薬組成物。
- 細胞がマイクロサテライト不安定性のために機能不全である、請求項14に記載の医薬組成物。
- 化学療法薬剤;幹細胞;AG1478;ゲフィチニブ;エルロチニブ;セツキシマブ;パニツマブ;ザルツママブ;ニモツザマブ;マツズマブ;およびラパチニブからなる群より選択される化合物をさらに含む、請求項15に記載の医薬組成物。
- 少なくとも1つのコアミスマッチ修復(MMR)タンパク質の発現を回復することを必要とする細胞における少なくとも1つのコアMMRタンパク質の望まれる発現を回復するための医薬組成物であって、ヒトMutSホモログ2(MSH2)、ヒトMutSホモログ6(MSH6)およびヒトMutLホモログ1(MLH1)から選択される1またはそれより多くのコアMMRタンパク質の発現を増加させるのに十分な量で、少なくともアンチmiR−155を含む、前記医薬組成物。
- 細胞が癌細胞である、請求項18に記載の医薬組成物。
- 癌が、結腸直腸癌である、請求項19に記載の医薬組成物。
- アンチmiR−155が、miR−155を標的とするロックト核酸修飾オリゴヌクレオチドを含む、請求項18に記載の医薬組成物。
- 少なくとも1つのミスマッチ修復MMR遺伝子の再発現が必要な細胞において、少なくとも1つのミスマッチ修飾MMR遺伝子の再発現を誘導するための医薬組成物であって、ヒトMutSホモログ2(MSH2)、ヒトMutSホモログ6(MSH6)およびヒトMutLホモログ1(MLH1)の1またはそれより多くから選択されるMMR遺伝子発現を誘導するのに十分な量でアンチmiR−155を含む、前記医薬組成物。
- 細胞が癌細胞である、請求項22に記載の医薬組成物。
- 癌が結腸直腸癌である、請求項23に記載の医薬組成物。
- アンチmiR−155が、miR−155を標的とするロックト核酸修飾オリゴヌクレオチドを含む、請求項22に記載の医薬組成物。
- ミスマッチ修復(MMR)タンパク質の発現を増加させることが必要な細胞において、MMRタンパク質の発現を増加させるための方法であって、ここで当該方法はヒト細胞において行われるものではなく、そして当該方法は、細胞をヒトアンチmiR−155核酸構築物で、ヒトMutSホモログ2(MSH2)、ヒトMutSホモログ6(MSH6)およびヒトMutLホモログ1(MLH1)から選択される1またはそれより多くのMMRタンパク質の発現を増加させるのに有効な量で、トランスフェクトすることを含む、前記方法。
- 細胞が癌細胞である、請求項26に記載の方法。
- 癌が結腸直腸癌である、請求項27に記載の方法。
- アンチmiR−155核酸構築物が、miR−155を標的とするロックト核酸修飾オリゴヌクレオチドを含む、請求項26に記載の方法。
- 細胞において少なくとも1つのミスマッチ修復(MMR)遺伝子を上方制御する方法であって、ここで当該方法はヒト細胞において行われるものではなく、そして当該細胞に少なくともmiR−155に対するmiR特異的阻害剤をMMR遺伝子によってコードされる1またはそれより多くのタンパク質の発現パターンを変更するのに十分な有効量で導入することを含む、当該ミスマッチ修復(MMR)タンパク質は、ヒトMutSホモログ2(MSH2)、ヒトMutSホモログ6(MSH6)およびヒトMutLホモログ1(MLH1)から選択される、前記方法。
- 細胞が癌細胞である、請求項30に記載の方法。
- 癌が結腸直腸癌である、請求項31に記載の方法。
- miR特異的阻害剤がアンチセンスmiR−155である、請求項30に記載の方法。
- アンチセンスmiR−155が、miR−155を標的とするロックト核酸修飾オリゴヌクレオチドを含む、請求項33に記載の方法。
- 試験試料中のミスマッチ修復(MMR)機能不全細胞を同定する方法であって、ここでMMR機能不全細胞はhMSH2遺伝子中に変異を有さず、hMSH6遺伝子に変異を有さず、そしてここでMMR機能不全細胞のhMLH1プロモーターはメチル化により不活化されておらず、そして当該方法は、
細胞から核酸含有試験試料を得る、ここで当該細胞はhMSH2遺伝子中に変異を有さず、hMSH6遺伝子に変異を有さず、そしてここで当該細胞のhMLH1プロモーターはメチル化により不活化されていない、
実験室的なアッセイにより、試験試料中のmiR−155のレベルを測定する、
試験試料中のmiR−155のレベルと対照のmiR−155のレベルを比較する、
試験試料中のmiR−155のレベルが対照における対応するmiR−155のレベルと比較して2〜4倍高く示差的に発現されたmiRNA−155のレベルを試験試料が有する場合、当該試料をMMR機能不全細胞を有するものとして同定する、
ことを含む、前記方法。 - MMR機能不全細胞は、hMSH2、hMSH6およびhMLH1からなる群より選択される少なくとも1つの機能不全コアMMRタンパク質を発現する、請求項35に記載の方法。
- 細胞が結腸直腸組織に由来する、請求項35に記載の方法。
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