CN105219863A - 错配修复基因hMLH1异常剪接体的定性及定量检测试剂盒及其用途 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及错配修复基因hMLH1异常剪接体的定性及定量检测试剂盒及其用途。试剂盒的主要成分包括：(1)hMLH1基因cDNA？PCR定性扩增与测序引物2对；(2)hMLH1基因cDNA实时定量PCR扩增引物8对；(3)RT-PCR试剂；(4)PCR扩增用试剂。通过本试剂盒得到的PCR扩增产物，可通过琼脂糖凝胶电泳结合DNA序列分析确认mRNA表达产物，并采用实时定量PCR方法定量分析mRNA表达水平。本试剂盒具有高效的mRNA检出作用。用于hMLH1基因异常剪接体的检测。
Description
技术领域
本发明涉及一种hMLH1基因异常剪接体检测试剂盒，特别涉及其在东亚胃癌高发人群的mRNA表达分析与后果评估。
背景技术
胃癌(Gastriccancer，GC)是严重危害人类健康的常见恶性肿瘤之一，其发病是一个多因素、多步骤、多基因参与的复杂病理过程。人类错配修复基因hMLH1胚系突变是遗传性非息肉性结直肠癌的重要病因，而在胃癌高发的东亚人群，部分家族性胃癌的发病亦与hMLH1基因功能异常相关。pre-mRNA选择性剪接是真核生物基因转录后表达调控的关键环节之一，构成蛋白质多样性的一个主要来源，也是生物细胞功能平衡系统调控的重要组成部分。选择性剪接产物的自然平衡维持细胞的正常功能，剪接过程的异常可导致这种功能平衡的破坏，使得细胞某些关键基因的功能性蛋白表达模式改变，与肿瘤等多种人类疾病的发病风险增高相关联。但是目前尚缺乏系统检测hMLH1基因剪接体异常的方法。因此有必要开发一种方便快捷的hMLH1基因异常剪接体检测方法，以用于胃癌的病因学分析。
发明内容
本发明的目的是提供一种hMLH1基因异常剪接体的定性及定量检测试剂盒及其应用。
本检测试剂盒主要包括以下成分：
(1)hMLH1基因cDNAPCR定性扩增与测序引物2对，各对引物序列见表1；
(2)hMLH1基因cDNASYBRGreen法实时定量PCR扩增引物及探针8对，各对引物序列见表2；
(3)RNA提取试剂、逆转录酶，PCR扩增试剂，如dNTP、ExTaqHotStart聚合酶及SYBRGreen试剂等。
表1hMLH1基因RT-PCR引物序列
表2hMLH1基因SYBRGreen法实时定量PCR引物序列
本试剂盒扩增出的RT-PCR产物可以采用以下方式进行mRNA表达定性检测：将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，根据电泳条带位置进行分析，并对于电泳条带纯化后测序分析。
本试剂盒RNA逆转录产物还可以在ABIStepOnePlusReal-TimePCRSystem仪器上开展实时定量PCR反应，进行mRNA表达定量检测。
试剂盒中，还可以有琼脂糖凝胶、RNA提取试剂、DNA纯化试剂及SYBRGreen试剂等。
本发明所说的试剂盒用于检测hMLH1基因异常剪接体。
本试剂盒的检测hMLH1基因异常剪接体的步骤包括：
(1)提取组织或细胞RNA。
(2)RNA逆转录。
(3)hMLH1基因cDNAPCR扩增。
分别扩增hMLH1基因外显子10-11及外显子16–18区域。引物如表1所示。反应体系为20μl：TaKaRaExTaqHS聚合酶0.15μl、10×EXTaqbuffer2.5μl、dNTPMixture(2.5mMeach)2.5μl、上游引物(10μM)1μl、下游引物(10μM)1μl、cDNA1μl、ddH2O11.85μl。反应条件：95℃预变性5min；95℃变性30sec，58℃复性30sec，72℃延伸30sec，40个循环；再72℃延伸10min。
将PCR产物进行1.5％琼脂糖凝胶电泳，EB分辨条带，通过条带差异区分野生型或外显子跳跃型。条带经切胶纯化测序鉴定。
(4)hMLH1基因cDNAqPCR扩增。
SYBRGreen法实时定量PCR分析hMLH1基因外显子10-11区域和外显子16-17区域不同转录产物。引物如表2所示。反应体系为10μl：SYBR5μl、ROXReferenceDye0.2μl、上游引物(10μM)0.2μl、下游引物(10μM)0.2μl、cDNA1μl、ddH2O3.4μl。反应条件：95℃30sec；95℃15sec，60℃30sec，共40个循环。
本试剂盒具有高效的异常剪接体检测作用。实施实例中报道，对于胃癌患者，针对hMLH1基因外显子10-11区域，采用试剂盒的功能评估方法提出，除了正常剪接的mRNA产物，还存在hMLH1外显子10跳跃、11跳跃及10-11跳跃等异常剪接产物，对于胃癌形成可能具有病因学意义。本试剂盒在胃癌患者hMLH1异常剪接体检测及病因学意义分析上具有重要作用。
附图说明
图1A是胃癌患者瘤组织RNA的RT-PCR图。图示hMLH1基因外显子10-11区域的扩增条带。M为分子量标记。
图1B是图1A中截短条带的测序图及示意图：图示hMLH1基因外显子10、11及10-11跳跃的序列。
图2是胃癌患者瘤组织及同源正常组织RNA的SYBRGreen法RT-qPCR图。图示hMLH1基因正常转录产物及delEx10、delEx10-11转录产物表达水平。
图3是胃粘膜上皮细胞系GES-1、胃癌细胞系SGC-7901、BGC-823及MGC80-3中，RNA的SYBRGreen法RT-qPCR图。图示hMLH1基因正常转录产物及delEx10、delEx11及delEx10-11转录产物表达水平。
具体实施方式
实施例1：中国胃癌患者hMLH1外显子10-11区域mRNA异常剪接体的定性及定量分析
针对hMLH1外显子10-11区域，RT-PCR分析mRNA异常剪接体：提取患者瘤组织RNA，逆转录为cDNA，选择‘hMLH1基因cDNAPCR定性扩增与测序引物’第1对引物(F:5'-TGGAAATGCTGTTAGTCGAGAA-3'，R:5'-AGACGAGGTCAGACTTGTTGTG-3')，扩增hMLH1基因外显子10-11区域。反应体系为20μl：TaKaRaExTaqHS聚合酶0.15μl、10×EXTaqbuffer2.5μl、dNTPMixture(2.5mMeach)2.5μl、上游引物(10μM)1μl、下游引物(10μM)1μl、cDNA1μl、ddH2O11.85μl。反应条件：95℃预变性5min；95℃变性30sec，58℃复性30sec，72℃延伸30sec，40个循环；再72℃延伸10min。将PCR产物进行1.5％琼脂糖凝胶电泳，EB分辨条带，通过条带差异区分野生型或外显子跳跃型。条带经切胶纯化测序鉴定。图1为hMLH1基因外显子10-11的PCR扩增图，由图1可见，hMLH1基因外显子10-11区域除了存在hMLH1基因正常转录产物(448bp)，还扩增出不同长度的截短转录产物。条带经切胶纯化，采用BigDyeTerminatorV3.1试剂盒，在ABI3130基因分析仪(美国ABI公司)上测序，确认截短条带354bp、294bp和200bp分别是hMLH1基因外显子10缺失(delEx10)、外显子11缺失(delEx11)和外显子10-11缺失(delEx10-11)。将分别形成编码265、315和292个氨基酸的截短蛋白(图1)。
在30例胃癌患者瘤组织及同源正常组织cDNA中，开展转录特异的定量PCR分析：提取患者瘤组织RNA，逆转录为cDNA，选择表2中‘hMLH1基因cDNA实时定量PCR扩增引物’第1-4对引物(即SEQIDNo.5-12)，SYBRGreen法实时定量PCR分析hMLH1基因外显子10-11区域不同转录产物。反应体系为10μl：SYBR5μl、ROXReferenceDye0.2μl、上游引物(10μM)0.2μl、下游引物(10μM)0.2μl、cDNA1μl、ddH2O3.4μl。反应条件：95℃30sec；95℃15sec，60℃30sec，共40个循环。结果显示除了正常RNA表达产物，多数均存在hMLH1delEx10及delEx10-11异常转录产物(图2)。采用上述同样的转录特异的定量PCR分析，经体外实验揭示，胃粘膜上皮细胞系GES-1、胃癌细胞系SGC-7901、BGC-823及MGC80-3中均存在hMLH1delEx10、delEx11及delEx10-11异常转录产物。总体上胃癌细胞系中hMLH1基因外显子10-11区域的异常转录产物显著高于人胃粘膜细胞系，但不同胃癌细胞系在hMLH1基因外显子10-11区域的异常转录产物的比例不尽相同(图3)。
Claims (3)
1.一种错配修复基因hMLH1异常剪接体的定性及定量检测试剂盒，其特征在于包括以下成分：
(1)hMLH1基因cDNAPCR定性扩增与测序引物2对；(2)hMLH1基因cDNA实时定量PCR扩增引物及探针8对；(3)RT-PCR试剂；(4)PCR扩增用试剂；
所说的2对hMLH1基因cDNAPCR定性扩增与测序引物序列如下：
第1对：
F:5'-TGGAAATGCTGTTAGTCGAGAA-3'
R:5'-AGACGAGGTCAGACTTGTTGTG-3'
第2对：
F:5'-CACCAAGCTTAGTGAAGAACTG-3'
R:5'-GAAAGAAGAACACATCCCAC-3'
所说的8对hMLH1基因cDNA实时定量PCR扩增引物序列如下：
第1对：
F:5'-CTTCTTACTCTTCATCAACCATCGT-3'
R:5'-CTGATTTCTAAACTGAGGTACAGG-3'
第2对：
F:5'-TTCATCAACCTTTAGAAATCAGTCC-3'
R:5'-TAGCAAAGTCTGGGTGAAGTACATC-3'
第3对：
F:5'-CATTCCTGTACCTCAGACTTTG-3'
R:5'-CATAGACCTTATCACTACTTCC-3'
第4对：
F:5'-TCTTCATCAACCACTTTGCTAC-3'
R:5’-CATAGACCTTATCACTACTTCC-3’
第5对：
F:5'-GAAATTGATGAGGAAGGGAACCTG-3'
R:5'-CAGGCACTTCACTCTGCTGGCCTG-3'
第6对：
F:5'-CAGGTTATCGGAAGGGAACCTG-3'
R:5'-CAGGCACTTCACTCTGCTGGCCTG-3'
第7对：
F:5'-GAAATTGATGAGGTGAATTGGGAC-3'
R:5’-CAGGCACTTCACTCTGCTGGCCTG-3’
第8对：
F:5'-CAGGTTATCGAGTGAAGTGCCTG-3'
R:5'-GAAAGAAGAACACATCCCAC-3'。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，还包括琼脂糖凝胶，SYBRGreen试剂。
3.权利要求1所说的试剂盒用于检测hMLH1基因异常剪接体。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |
Application publication date: 20160106 |
|
| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |