CN105483117B

CN105483117B - 一种提高聚合酶链式反应特异性的方法

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Publication number: CN105483117B
Application number: CN201510926040.3A
Authority: CN
Inventors: 罗凯; 贺智敏; 王倩; 张志杰; 郑国沛
Original assignee: Cancer Center of Guangzhou Medical University
Current assignee: Cancer Center of Guangzhou Medical University
Priority date: 2015-12-11
Filing date: 2015-12-11
Publication date: 2019-04-30
Anticipated expiration: 2035-12-11
Also published as: CN105483117A

Abstract

本发明公开了一种提高聚合酶链式反应特异性的方法，是在引物对的5’端添加一段与模板非同源且不形成稳定二级结构的序列。其次，还可将5’端加尾引物与复合PCR反应条件结合使用进一步提高反应特异性；所述复合PCR反应条件为：（1）5～10循环的常规PCR反应条件，（2）高温的退火和延伸步骤合并的两步法PCR条件。与普通PCR引物相比，上述加尾引物可有效提高PCR反应特异性但不影响灵敏度，同时引物工作浓度与常规引物一致甚至更低，在使用常规PCR反应条件时即可显著提高PCR特异性，与复合PCR反应条件的组合模式可进一步提高反应特异性。本发明适用于常规PCR、巢式PCR等各类PCR，具有广泛的应用价值。

Description

一种提高聚合酶链式反应特异性的方法

技术领域

本发明属于分子生物技术领域。更具体地，涉及一种提高聚合酶链式反应特异性的方法。

背景技术

聚合酶链式反应(PCR)是一种在生物技术领域广为使用的有效扩增脱氧核糖核酸(DNA)片段的方法。常规PCR基本原理为：依据已知的待扩增目的DNA序列设计一对与目的DNA序列两条单链完全互补的相向的特异性引物，然后将模板DNA、引物、DNA聚合酶、4种脱氧核苷酸(dNTPs)放入反应缓冲液中，然后通过高温变性、低温复性、中温延伸的过程使目的DNA片段得到扩增。在高温变性阶段，模板双链DNA变性变为单链；在低温复性阶段，序列互补的单链将重新结合为双链，此时分别与模板DNA两条单链完全互补的引物片段因在体系内的浓度优势将优先与对应的模板DNA单链重新结合为局部双链，两条引物在模板DNA上的结合位置决定了扩增片段的长度。在中温延伸阶段，DNA聚合酶结合于引物的3’端并依据模板DNA序列利用dNTPs特异的合成新的互补链。这三个步骤每重复一次，目的DNA片段理论上会扩增1倍，通过对这三个步骤的重复进行，就可大量而特异性的扩增目的DNA片段。

PCR的基本组分包括模板DNA、引物、DNA聚合酶、dNTPs和含有镁离子的缓冲液，其中引物是决定PCR反应特异性的关键因素，只有当引物与目的扩增片段完全匹配时才能特异性扩增目的片段。目前普遍认为常规PCR适宜采用的引物长度约为15bp～25bp，且整个引物序列应与目的扩增片段完全互补，但在实践过程中发现仅当引物的3’扩增起始端部分序列与模板DNA互补时也可以成功进行PCR扩增。如引物3’端在模板DNA上结合的位置正确且与模板完全互补的部分序列足够长，则也可以成功而特异的扩增目的片段，因此引物足够长时其5’端局部序列与模板DNA不完全匹配可不影响PCR的成功进行。但当拟扩增的目的DNA序列本身特异性不高且在模板DNA中存在较多的相似序列时，引物的3’端就可能在模板DNA上存在多个结合位点，在此情况下PCR就出现了非特异性扩增，当非特异性扩增现象严重时甚至会导致目的片段不能扩增，此时PCR反应失败。

目前，普遍应用的提高PCR反应特异性的方法主要包括：(1)设计多条引物以筛选高特异性引物，但当目的序列特异性较差时此方案效果欠佳；(2)提高PCR反应的退火温度：当引物在模板上存在多个非特异性结合位点时，与特异性结合位点相比，大部分非特异性结合位点仅为引物与模板的部分互补结合，其结合力弱、稳定性差，因此当退火温度升高时，引物的非特异性结合位点减少，PCR反应特异性增高；但是此种方法也存在局限性，当目标序列或引物特异性较差时，模板上多个引物结合位点的结合稳定性差异往往不大，提高退火温度也不能有效提高PCR反应特异性；(3)应用高保真的Taq酶：此方法是在引物特异性尚可的情况下进一步提高PCR反应特异性的方法，因此有很多非特异性扩增用该办法也无法解决。

综上所述，寻找更好更多的提高PCR反应特异性的方法，对于PCR检测的应用十分必要。

发明内容

本发明要解决的技术问题是克服现有提高PCR反应特异性的方法的缺陷和不足，提供一种提高聚合酶链式反应(PCR)特异性的方法，即在常规PCR所使用的特异性引物的5’端添加一段与模板非同源且不形成稳定二级结构的序列，其长度可为几个至几十个碱基(一般采用9～20个碱基)。另外进一步地，还可采用复合PCR反应条件进一步提高PCR反应特异性(复合反应条件：第一个循环阶段采取5～10循环的常规PCR反应条件，第二个循环阶段采用高温的退火和延伸步骤合并的两步法PCR条件)。

本发明的目的是提供一种提高聚合酶链式反应特异性的方法。

本发明另一目的是提供一种提高EGFR基因18、19、20、21外显子的PCR反应特异性的方法。

本发明再一目的是提供EGFR基因18、19、20、21外显子的高特异性扩增引物。

本发明上述目的通过以下技术方案实现：

一种提高聚合酶链式反应特异性的方法，是在所述聚合酶链式反应的引物对的5’端加尾；所述加尾是指在引物对的5’端添加一段与模板非同源且不形成稳定二级结构的序列。

引物5’端所加的尾其长度可为几个到几十个碱基，优选为9～20个碱基。具体加尾的长度取决于拟采用的目标退火温度。

同时尾序列可为非固定序列，只要其不与待扩增的样品高度同源且不会形成引物内或间稳定的二级结构影响PCR扩增即可。

另外，所述加尾是指在引物对中的两条引物的5’端均加尾，两条引物加尾的碱基数相同，所述加尾为9～20个碱基。

上述5’端加尾后引物的工作浓度与常规引物一致甚至更低。

根据上述要求所设计出的5’加尾引物使用常规三步法PCR反应条件时即可在提高反应特异性的情况下有效扩增，显著提高PCR反应的特异性。

具体地，作为一种可实施的优选方案，上述加尾是指在上游引物的5’端添加10bp上游加尾序列、15bp上游加尾序列或20bp上游加尾序列，对应地在下游引物的5’端添加10bp下游加尾序列、15bp下游加尾序列或20bp下游加尾序列；

所述10bp上游加尾序列为CTCGGGATTA、GTCGGCATTA、AGCGGAATTA或AGCGGGATTA；

所述15bp上游加尾序列为TGTTACTCGGGATTA、GGTCAGTCGGCATTA、AGTCAAGCGGAATTA或GCTCAAGCGGGATTA；

所述20bp上游加尾序列为CGCTATGTTACTCGGGATTA、CCCCAGGTCAGTCGGCATTA、CCCCAAGTCAAGCGGAATTA或CACGAGCTCAAGCGGGATTA；

所述10bp下游加尾序列为CTGAGAGCAC、CGGTCAGCAC、CTCTCAGCAC或CTCAAATCAC；

所述15bp下游加尾序列为CACGACTGAGAGCAC、CACGACGGTCAGCAC、CACCACTCTCAGCAC或CACGACTCAAATCAC；

所述20bp下游加尾序列为AGCGGCACGACTGAGAGCAC、TTCGGCACGACGGTCAGCAC、TTCTGCACCACTCTCAGCAC或TTCTGCACGACTCAAATCAC。

更进一步地，作为一种可实施的优选方案，优选地，所述加尾是指在上游引物的5’端添加10bp上游加尾序列CTCGGGATTA，在下游引物的5’端添加10bp下游加尾序列CTGAGAGCAC；

或在上游引物的5’端添加10bp上游加尾序列GTCGGCATTA，在下游引物的5’端添加10bp下游加尾序列CGGTCAGCAC；

或在上游引物的5’端添加10bp上游加尾序列AGCGGAATTA，在下游引物的5’端添加10bp下游加尾序列CTCTCAGCAC；

或在上游引物的5’端添加10bp上游加尾序列AGCGGGATTA，在下游引物的5’端添加10bp下游加尾序列CTCAAATCAC；

或在上游引物的5’端添加15bp上游加尾序列TGTTACTCGGGATTA，在下游引物的5’端添加15bp下游加尾序列CACGACTGAGAGCAC；

或在上游引物的5’端添加15bp上游加尾序列GGTCAGTCGGCATTA，在下游引物的5’端添加15bp下游加尾序列CACGACGGTCAGCAC；

或在上游引物的5’端添加15bp上游加尾序列AGTCAAGCGGAATTA，在下游引物的5’端添加15bp下游加尾序列CACCACTCTCAGCAC；

或在上游引物的5’端添加15bp上游加尾序列GCTCAAGCGGGATTA，在下游引物的5’端添加15bp下游加尾序列CACGACTCAAATCAC；

或在上游引物的5’端添加20bp上游加尾序列CGCTATGTTACTCGGGATTA，在下游引物的5’端添加20bp下游加尾序列AGCGGCACGACTGAGAGCAC；

或在上游引物的5’端添加20bp上游加尾序列CCCCAGGTCAGTCGGCATTA，在下游引物的5’端添加20bp下游加尾序列TTCGGCACGACGGTCAGCAC；

或在上游引物的5’端添加20bp上游加尾序列CCCCAAGTCAAGCGGAATTA，在下游引物的5’端添加20bp下游加尾序列TTCTGCACCACTCTCAGCAC；

或在上游引物的5’端添加20bp上游加尾序列CACGAGCTCAAGCGGGATTA，在下游引物的5’端添加20bp下游加尾序列TTCTGCACGACTCAAATCAC。

作为另一种可实施的优选方案，优选地，所述加尾是指在上游引物的5’端添加9bp上游加尾序列CCACTCCGA，在下游引物的5’端添加9bp下游加尾序列ACCTGTCGA；

或在上游引物的5’端添加13bp上游加尾序列CCGCCCACTCCGA，在下游引物的5’端添加13bp下游加尾序列CTTGACCTGTCGA；

或在上游引物的5’端添加17bp上游加尾序列CCGCCCGCCCACTCCGA，在下游引物的5’端添加17bp下游加尾序列ACCGCTTGACCTGTCGA。

另外，将本发明上述的5’加尾引物与复合PCR反应条件结合使用，可进一步提高PCR反应的特异性。与普通PCR引物相比，本发明所述的加尾引物可有效提高PCR反应的特异性但不影响灵敏度，同时引物工作浓度与常规引物一致甚至更低，在使用常规PCR反应条件时即可显著提高PCR特异性。如果部分反应特异性仍不理想，则可使用加尾引物结合复合PCR反应条件的组合模式来进一步提高反应特异性。

所述复合PCR反应条件必须由一个常规PCR反应条件加高温的退火和延伸步骤合并的两步法PCR条件；第一个循环阶段采取5～10循环的常规PCR反应条件(必须具备该步骤，否则会导致两步法扩增失败或扩增效率低下)，第二个循环阶段采用高温的退火和延伸步骤合并的两步法PCR条件；所述退火和延伸的温度相同，均为64～79℃。退火合并延伸阶段的反应温度明显较常规PCR反应条件中的退火温度高而与延伸温度接近，具体适宜反应温度的选择需通过筛选实验确定。

另外，作为本发明方法的举例验证，本发明以EGFR基因18外显子、19外显子、20外显子或21外显子为例，设计了其特异性扩增引物，并对这些引物进行不同的加尾，很好地验证了本发明上述方法对PCR反应特异性的提高作用。

因此，利用本发明上述方法获得的提高EGFR基因18外显子、19外显子、20外显子或21外显子的PCR反应特异性的方法，也应在本发明的保护范围之内。

所述提高EGFR基因18外显子、19外显子、20外显子或21外显子的PCR反应特异性的方法，是在EGFR基因18外显子、19外显子、20外显子或21外显子的特异性扩增引物对中的两条引物的5’端均加尾；具体加尾方法是：

在上游引物的5’端添加10bp上游加尾序列CTCGGGATTA，在下游引物的5’端添加10bp下游加尾序列CTGAGAGCAC；

进一步地，上述提高EGFR基因18外显子、19外显子、20外显子或21外显子的PCR反应特异性的方法，还包括将PCR反应条件由常规的三步法PCR反应条件修改为复合PCR反应条件；所述复合PCR反应条件为：第一个循环阶段采取5～10循环的常规PCR反应条件，第二个循环阶段采用高温的退火和延伸步骤合并的两步法PCR条件；所述退火和延伸的温度相同，均为64～79℃。

另外，加尾后的对EGFR基因18外显子、19外显子、20外显子或21外显子具有高特异性的引物对也在本发明的保护范围之内。

一组EGFR基因18外显子的高特异性扩增引物对，所述引物对为18F-10T/18R-10T、18F-15T/18R-15T或18F-20T/18R-20T，其序列分别如SEQ ID NO.25～26、SEQ ID NO.17～18、SEQ ID NO.9～10所示。

一组EGFR基因19外显子的高特异性扩增引物对，所述引物对为19F-10T/19R-10T、19F-15T/19R-15T或19F-20T/19R-20T，其序列分别如SEQ ID NO.27～28、SEQ ID NO.19～20、SEQ ID NO.11～12所示。

一组EGFR基因20外显子的高特异性扩增引物对，所述引物对为20F-10T/20R-10T、20F-15T/20R-15T或20F-20T/20R-20T，其序列分别如SEQ ID NO.29～30、SEQ ID NO.21～22、SEQ ID NO.13～14所示。

一组EGFR基因21外显子的高特异性扩增引物对，所述引物对为21F-10T/21R-10T、21F-15T/21R-15T或21F-20T/21R-20T，其序列分别如SEQ ID NO.31～32、SEQ ID NO.23～24、SEQ ID NO.15～16所示。

另外，作为另一个本发明方法的举例验证，本发明还对TCRP1基因2号外显子扩增引物进行了加尾研究，设计了其特异性扩增引物，并对这些引物进行不同的加尾，很好地验证了本发明上述方法对PCR反应特异性的提高作用。

因此，利用本发明上述方法获得的提高TCRP1基因2号外显子的PCR反应特异性的方法，也应在本发明的保护范围之内。

所述提高TCRP1基因2号外显子的PCR反应特异性的方法，是在TCRP1基因2号外显子的特异性扩增引物对中的两条引物的5’端均加尾；具体加尾方法是：

在上游引物的5’端添加9bp上游加尾序列CCACTCCGA，在下游引物的5’端添加9bp下游加尾序列ACCTGTCGA；

进一步地，上述提高TCRP1基因2号外显子的PCR反应特异性的方法，还包括将PCR反应条件由常规的三步法PCR反应条件修改为复合PCR反应条件；所述复合PCR反应条件为：第一个循环阶段采取5～10循环的常规PCR反应条件，第二个循环阶段采用高温的退火和延伸步骤合并的两步法PCR条件；所述退火和延伸的温度相同，均为64～79℃。

另外，加尾后的对TCRP1基因2号外显子具有高特异性的引物对也在本发明的保护范围之内。

一组TCRP1基因2号外显子的高特异性扩增引物对，所述引物对为2F-9T/2R-9T、2F-13T/2R-13T或2F-17T/2R-17T，其序列分别如SEQ ID NO.33～34、SEQ ID NO.35～35、SEQ ID NO.37～38所示。

本发明经过大量的摸索和研究，探索出了一种提高PCR反应特异性的方法，主要包括两方面的特征：其一为5’加尾的PCR引物，其二为可采用复合PCR反应条件。

首先，本发明的5’加尾PCR引物其5’端加尾长度可为几个到几十个碱基(一般为9～20个碱基，具体加尾的长度取决于拟采用的目标退火温度)；在一对PCR引物中的两条引物上均加尾；所采用的加尾序列为非固定加尾序列，序列选择原则为不与待扩增样品基因组DNA高度同源且加尾序列与扩增特异性引物序列连接后不会形成引物内或间稳定的二级结构而影响PCR扩增。与普通PCR引物相比，本发明所述的加尾引物可有效提高PCR反应的特异性但不影响灵敏度，同时引物工作浓度与常规引物一致甚至更低，在使用常规PCR反应条件时即可显著提高PCR特异性。如部分反应特异性仍不理想则可使用加尾引物加复合PCR反应条件的组合模式来进一步提高反应特异性。本发明适用于常规PCR、巢式PCR等各类PCR提高其反应特异性，具有广泛的应用价值。

其次，本发明的可采用的复合PCR反应条件由两个主要的PCR扩增阶段组成：第一个主要扩增阶段为常规三步法PCR反应条件，其退火温度的选择为引物的特异性扩增部分的Tm值减5～8℃，共5～10个循环(该步骤为必需步骤，如缺失该步骤将导致整个扩增反应失败)；第二个主要扩增阶段为两步法PCR反应条件，其退火和延伸步骤合并，PCR循环步骤简化为高温变性和低温退火延伸两步，低温退火延伸步骤的温度选择为整条加尾引物的Tm值减5～8℃左右，其相比常规三步法PCR反应条件的退火温度显著提高，共30～35个循环。

本发明也针对不同的基因、不同的引物做了大量的实验验证，证明了上述方法的可行性和稳定性，实施例部分以EGFR基因的18外显子、19外显子、20外显子和21外显子为例进行了结果的呈现。

本发明具有以下有益效果：

本发明提供了一种能有效提高PCR反应特异性的方法，即在常规PCR所使用的特异性引物的5’端添加一段与模板非同源且不形成稳定二级结构的序列，其长度可为几个至几十个碱基(一般采用9～20个碱基)。另外进一步地，还可采用复合PCR反应条件(复合反应条件：第一个循环阶段采取5～10循环的常规PCR反应条件，第二个循环阶段采用高温的退火和延伸步骤合并的两步法PCR条件)进一步提高PCR反应特异性。

通过本发明的5’加尾PCR引物与常规PCR反应条件或复合PCR反应条件的结合应用可使PCR反应特异性提高并同时具有以下特点：

1、更宽的适宜退火温度范围：5’加尾PCR引物利用常规三步法反应条件进行PCR扩增时，与普通引物相比可在更广的退火温度范围获得特异性扩增条带，因此其特异性扩增效果更好且具更宽的适用退火温度范围，对于多PCR体系优化通用反应条件具有很大帮助。

2、相似或更宽的引物应用浓度范围：5’加尾PCR引物可在相似或更宽的引物应用浓度范围获得高特异性的PCR扩增产物。

3、5’加尾PCR引物与常规PCR引物扩增灵敏度相似。

4、复合PCR反应条件：5’加尾PCR引物与复合PCR反应条件联合应用时可进一步提高PCR反应的特异性。

附图说明

图1为不同退火温度下EGFR特异性引物及5’加尾20bp后引物的PCR结果；图中DNAMarker为NEW England公司的100bp DNA Ladder，由左至右各样品泳道分别为61℃、58℃、55℃、52℃、49℃、46℃、阴性对照。

图2为不同引物浓度下EGFR特异性引物及5’加尾20bp后引物的PCR结果；图中，DNAMarker为天根公司的DNA MarkerⅠ，由左至右各样品泳道分别为引物浓度0.3125μmoL/L、0.625μmoL/L、1.25μmoL/L、2.5μmoL/L、5μmoL/L、10μmoL/L、20μmoL/L、30μmoL/L、40μmoL/L、阴性对照。

图3为不同退火温度下EGFR特异性引物及5’加尾15bp后引物的PCR结果，图中，DNAMarker为天根公司的DNA MarkerⅠ，由左至右各样品泳道分别为61℃、58℃、55℃、52℃、49℃、46℃、阴性对照。

图4为不同退火温度下EGFR特异性引物及5’加尾10bp后引物的PCR结果，图中，DNAMarker为天根公司的DNA MarkerⅠ，由左至右各样品泳道分别为61℃、58℃、55℃、52℃、49℃、46℃、阴性对照。

图5为EGFR特异性引物加尾前后对PCR反应扩增灵敏度的影响，图中DNA Marker为天根公司的DNA MarkerⅠ，由左至右各样品泳道分别为样品浓度0.8875ng/μl、1.775ng/μl、3.55ng/μl、7.1ng/μl、14.2ng/μl、28.4ng/μl、阴性对照。

图6为EGFR基因18外显子5’加尾特异性PCR引物与复合反应条件对反应特异性的提高作用，图中DNA Marker均为天根DNA MarkerⅠ，由左至右各样品泳道分别为样品浓度0.8875ng/μl、1.775ng/μl、3.55ng/μl、7.1ng/μl、14.2ng/μl、28.4ng/μl、阴性对照。

图7为EGFR基因19外显子5’加尾特异性PCR引物与复合反应条件对反应特异性的提高作用，图中DNA Marker均为天根DNA MarkerⅠ，由左至右各样品泳道分别为样品浓度0.8875ng/μl、1.775ng/μl、3.55ng/μl、7.1ng/μl、14.2ng/μl、28.4ng/μl、阴性对照。

图8为EGFR基因20外显子5’加尾特异性PCR引物与复合反应条件对反应特异性的提高作用，图中DNA Marker均为天根DNA MarkerⅠ，由左至右各样品泳道分别为样品浓度0.8875ng/μl、1.775ng/μl、3.55ng/μl、7.1ng/μl、14.2ng/μl、28.4ng/μl、阴性对照。

图9为EGFR基因21外显子5’加尾特异性PCR引物与复合反应条件对反应特异性的提高作用，图中DNA Marker均为天根DNA MarkerⅠ，由左至右各样品泳道分别为样品浓度0.8875ng/μl、1.775ng/μl、3.55ng/μl、7.1ng/μl、14.2ng/μl、28.4ng/μl、阴性对照。

图10为EGFR基因外显子PCR扩增产物的测序鉴定结果。

图11为TCRP1基因2号外显子PCR扩增产物电泳图，图中：由左至右各泳道分别为DNA Marker(DNA MarkerⅠ，天根)、2号外显子PCR引物(50℃、53℃、56℃、59℃、62℃、65℃)、2号外显子5’加短尾PCR引物(9bp)(50℃、53℃、56℃、59℃、62℃、65℃)、2号外显子5’加中尾PCR引物(13bp)(50℃、53℃、56℃、59℃、62℃、65℃)、2号外显子5’加长尾PCR引物(17bp)(50℃、53℃、56℃、59℃、62℃、65℃)、阴性对照。

图12为TCRP1基因2号外显子测序图。

具体实施方式

为帮助理解本发明的优点与实质，以下选择具体的基因及其检测引物为例，结合说明书附图进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。

除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。

以下实施例中所举例的EGFR基因特异性引物和加尾引物如下表：

TCRP1基因2外显子特异性、5’加尾特异性PCR扩增引物如下表：

实施例1 表皮生长因子受体(EGFR)18、19、20、21外显子的PCR检测——20bp加尾

本实施例选择EGFR基因的18、19、20、21外显子为靶序列进行测试分析。采用常规三步法反应条件。

1、特异性引物设计

针对EGFR基因18～21外显子设计特异性的PCR引物，18F/18R(扩增片段长271bp)，19F/19R(扩增片段长304bp)，20F/20R(扩增片段长242bp)，21F/21R(扩增片段长262bp)，具体引物序列如下(如表1所示)：

18F(SEQ ID NO.1所示)：5’-GGCTGAGGTGACCCTT-3’；

18R(SEQ ID NO.2所示)：5’-GAGTAAAGTAGATGATGGAAATA-3’。

19F(SEQ ID NO.3所示)：5’-AGCATGTGGCACCATC-3’；

19R(SEQ ID NO.4所示)：5’-CTAGAGCTAGAAAGGGAAAG-3’。

20F(SEQ ID NO.5所示)：5’-CCATGCGAAGCCACA-3’；

20R(SEQ ID NO.6所示)：5’-TCCCTTCCCTGATTACCT-3’。

21F(SEQ ID NO.7所示)：5’-GCATGAACATGACCCTGAA-3’；

21R(SEQ ID NO.8所示)：5’-GCTGACCTAAAGCCACCT-3’。

2、特异性引物加尾

针对上述引物，分别依据各对特异性的PCR引物序列设计20bp长的5’端加尾序列，然后将设计好的5’端加尾序列连接在相应特异性引物的5’端作为5’加尾特异性PCR引物，具体加尾后的特异性引物序列如下所示：

18F-20T(SEQ ID NO.9所示)：5’-CGCTATGTTACTCGGGATTAGGCTGAGGTGACCCTT-3’；

18R-20T(SEQ ID NO.10所示)：5’-AGCGGCACGACTGAGAGCACGAGTAAAGTAGATGATGGAAATA-3’。

19F-20T(SEQ ID NO.11所示)：5’-CCCCAGGTCAGTCGGCATTAAGCATGTGGCACCATC-3’；

19R-20T(SEQ ID NO.12所示)：5’-TTCGGCACGACGGTCAGCACCTAGAGCTAGAAAGGGAAAG-3’。

20F-20T(SEQ ID NO.13所示)：5’-CCCCAAGTCAAGCGGAATTACCATGCGAAGCCACA-3’；

20R-20T(SEQ ID NO.14所示)：5’-TTCTGCACCACTCTCAGCACTCCCTTCCCTGATTACCT-3’。

21F-20T(SEQ ID NO.15所示)：5’-CACGAGCTCAAGCGGGATTAGCATGAACATGACCCTGAA-3’；

21R-20T(SEQ ID NO.16所示)：5’-TTCTGCACGACTCAAATCACGCTGACCTAAAGCCACCT-3’。

3、样本基因组DNA提取

使用美国Promega公司基因组DNA提取试剂盒(Genomic DNA Purification Kit)依说明书提取肺癌H1299细胞基因组DNA，美国Thermo NANODR 2000超微量分光光度计测定样本DNA含量，然后稀释至20ng/μl备用。

4、常规三步法PCR检测

(1)PCR反应体系：Taq Green mix 10μL、上游引物(10μmoL/L)1μL、下游引物(10μmoL/L)1μL、纯水6μL、样本DNA 2μL，总体积20μL。

(2)PCR反应条件：94℃3min；94℃30s、X℃(46℃、49℃、52℃、55℃、58℃、61℃)30s、72℃45s，40个循环；72℃7min。

(3)PCR产物鉴定：2％琼脂糖电泳鉴定PCR扩增产物。

(4)结果如图1所示，特异性PCR检测引物的5’端加尾之后，检测特异性明显提高。

同时，图1中的各泳道为不同的退火温度下的PCR结果，可见18、20、21外显子加尾引物在退火温度46～61℃范围内均仅见一特异性目的扩增条带，而18外显子无尾引物在46～61℃范围内均存在明显非特异性扩增条带、20外显子无尾引物仅在55～61℃见一特异性目的扩增条带、21外显子仅在61℃见一特异性目的扩增条带。故5’加尾PCR引物具有更宽的适宜退火温度范围。同时，19外显子加尾引物扩增条带明显较无尾引物扩增条带强，提示其存在一定的提高目的片段扩增效率的功能。

以上结果表明，未加尾时，随着退火温度的变化，退火温度持续升高过高或持续降低，检测效果都会逐渐变差。而加尾之后检测结果的特异性没有随着退火温度的改变而出现明显的变化，即上述在EGFR基因的18、19、20、21外显子特异性引物的5’端加尾之后，具有了更宽的适宜退火温度范围。

实施例2 表皮生长因子受体(EGFR)18、19、20、21外显子的PCR检测——20bp加尾

1、引物、加尾引物、样本基因组DNA提取同实施例1。

2、常规三步法PCR检测

(1)PCR反应体系：Taq Green mix 10μL、上游引物与下游引物各1μL(引物浓度分别采取：40μmoL/L、30μmoL/L、20μmoL/L、10μmoL/L、5μmoL/L、2.5μmoL/L、1.25μmoL/L、0.625μmoL/L、0.3125μmoL/L)、纯水6μL、样本DNA2μL，总体积20μL。

PCR反应条件：94℃3min；94℃30s、56℃30s、72℃45s，40个循环；72℃7min。

PCR产物鉴定：2％琼脂糖电泳鉴定PCR扩增产物。

(2)结果如图2所示，特异性PCR检测引物的5’端加尾之后，检测特异性明显提高。

同时，图2中的各泳道为不同引物浓度下的PCR结果，可见18、19、20、21外显子加尾引物分别在引物浓度范围0.3125-40μmoL/L、1.25-40μmoL/L、1.25-40μmoL/L、0.3125-40μmoL/L内均可见单一目的扩增条带；相较各无尾引物的适宜引物浓度范围1.25-5μmoL/L、0.625-40μmoL/L、5-40μmoL/L、0.3125-20μmoL/L来说，5’加尾PCR引物具有相似或更宽的引物应用浓度范围。

以上结果表明，未加尾时，随着引物浓度的变化，引物浓度持续降低或者持续升高，检测效果都会逐渐变差，而加尾之后检测结果的特异性没有随着引物浓度的改变而出现明显的变化，即上述在EGFR基因的18、19、20、21外显子特异性引物的5’端加尾之后，具有了相似或更宽的引物应用浓度范围。

实施例3 表皮生长因子受体(EGFR)18、19、20、21外显子的PCR检测——15bp加尾

1、在实施例1所设计的EGFR基因18～21外显子的特异性PCR引物18F/18R、19F/19R、20F/20R和21F/21R，以及5’加尾特异性PCR引物(尾长20bp)的基础上，分别设计合成5’加尾长度为15bp的5’加尾特异性PCR引物，具体加尾后的特异性引物序列如下所示：

18F-15T(SEQ ID NO.17所示)：5’-TGTTACTCGGGATTAGGCTGAGGTGACCCTT-3’；

18R-15T(SEQ ID NO.18所示)：5’-CACGACTGAGAGCACGAGTAAAGTAGATGATGGAAATA-3’。

19F-15T(SEQ ID NO.19所示)：5’-GGTCAGTCGGCATTAAGCATGTGGCACCATC-3’；

19R-15T(SEQ ID NO.20所示)：5’-CACGACGGTCAGCACCTAGAGCTAGAAAGGGAAAG-3’。

20F-15T(SEQ ID NO.21所示)：5’-AGTCAAGCGGAATTACCATGCGAAGCCACA-3’；

20R-15T(SEQ ID NO.22所示)：5’-CACCACTCTCAGCACTCCCTTCCCTGATTACCT-3’。

21F-15T(SEQ ID NO.23所示)：5’-GCTCAAGCGGGATTAGCATGAACATGACCCTGAA-3’；

21R-15T(SEQ ID NO.24所示)：5’-CACGACTCAAATCACGCTGACCTAAAGCCACCT-3’。

2、样本基因组DNA提取、PCR反应体系、PCR反应条件、PCR产物鉴定同实施例1。

3、结果如附图3所示，特异性PCR检测引物的5’端加尾之后，检测特异性明显提高。

同时，图3中的各泳道为不同的退火温度下的PCR结果，加尾之后检测结果的特异性没有随着退火温度的改变而出现明显的变化，即上述在EGFR基因的18、19、20、21外显子特异性引物的5’端加尾之后，具有了更宽的适宜退火温度范围，结果与实施例1相同。

实施例4 表皮生长因子受体(EGFR)18、19、20、21外显子的PCR检测——10bp加尾

1、在实施例1所设计的EGFR基因18～21外显子的特异性PCR引物18F/18R、19F/19R、20F/20R和21F/21R，以及5’加尾特异性PCR引物(尾长20bp)的基础上，分别设计合成5’加尾长度为10bp的5’加尾特异性PCR引物，具体加尾后的特异性引物序列如下所示：

18F-10T(SEQ ID NO.25所示)：5’-CTCGGGATTAGGCTGAGGTGACCCTT-3’；

18R-10T(SEQ ID NO.26所示)：5’-CTGAGAGCACGAGTAAAGTAGATGATGGAAATA-3’。

19F-10T(SEQ ID NO.27所示)：5’-GTCGGCATTAAGCATGTGGCACCATC-3’；

19R-10T(SEQ ID NO.28所示)：5’-CGGTCAGCACCTAGAGCTAGAAAGGGAAAG-3’。

20F-10T(SEQ ID NO.29所示)：5’-AGCGGAATTACCATGCGAAGCCACA-3’；

20R-10T(SEQ ID NO.30所示)：5’-CTCTCAGCACTCCCTTCCCTGATTACCT-3’。

21F-10T(SEQ ID NO.31所示)：5’-AGCGGGATTAGCATGAACATGACCCTGAA-3’；

21R-10T(SEQ ID NO.32所示)：5’-CTCAAATCACGCTGACCTAAAGCCACCT-3’。

3、结果如附图4所示，特异性PCR检测引物的5’端加尾之后，检测特异性明显提高。

同时，图4中的各泳道为不同的退火温度下的PCR结果，加尾之后检测结果的特异性没有随着退火温度的改变而出现明显的变化，即上述在EGFR基因的18、19、20、21外显子特异性引物的5’端加尾之后，具有了更宽的适宜退火温度范围，结果与实施例1相同。

综上所述，以上结果显示，不同加尾长度的引物均可提高PCR反应的特异性，且具有更宽的适宜退火温度范围，具有更宽的引物应用浓度范围。

实施例5 PCR引物5’加尾前后灵敏度的变化

1、引物为上述实施例1、3、4所述的引物18F/18R，19F/19R，20F/20R，21F/21R，以及各自加尾20bp、15bp、10bp的加尾引物。

2、样本基因组DNA提取同实施例1。

提取后的样本基因组DNA经50倍稀释后重新测定浓度为28.4ng/ul，以该稀释样本为最高浓度样品再按2倍倍比稀释5个浓度梯度样本，最终共获得6个浓度梯度样品(28.4ng/μl、14.2ng/μl、7.1ng/μl、3.55ng/μl、1.775ng/μl、0.8875ng/μl)用于测试反应体系的扩增灵敏度。

3、PCR反应体系同实施例1，PCR反应条件、PCR产物鉴定同实施例2。

4、结果如图5所示，18外显子未加尾与加尾引物均可检出0.8875～28.4ng/μl浓度梯度范围的样品，且未加尾引物的扩增产物中存在一定的非特异性扩增，故两种引物具有相似的扩增灵敏度且加尾引物的特异性更佳。19外显子未加尾引物可检出1.775～28.4ng/μl浓度梯度范围的样品，而加尾10bp、15bp、20bp的引物则分别可检出1.775～28.4ng/μl、3.55～28.4ng/μl、7.1～28.4ng/μl浓度梯度范围的样品，显示加尾10bp的引物与未加尾引物具相似的扩增灵敏度，此引物随加尾长度增加，扩增灵敏度略有下降。20外显子未加尾与加尾引物均可检出1.775～28.4ng/μl浓度梯度范围的样品，具有相似的扩增灵敏度。21外显子未加尾引物可检出0.8875～28.4ng/μl浓度梯度范围的样品，而加尾10bp、15bp、20bp的引物则分别可检出7.1～28.4ng/μl、3.55～28.4ng/μl、1.775～28.4ng/μl浓度梯度范围的样品，加尾20bp的引物与未加尾引物具相似的扩增灵敏度。

综上所述，5’加尾引物的加尾长短会对引物的扩增灵敏度有轻微影响，但通过调整合适的加尾长度均可获得相似的扩增灵敏度，故5’加尾与不加尾PCR引物具有相似的扩增灵敏度。

实施例6 加尾引物结合PCR复合反应条件对反应特异性的提高作用

2、样本基因组DNA提取以及由此获得的6个浓度梯度样品同实施例5；PCR反应体系同实施例1。

3、PCR反应条件如表1

表1

3、PCR产物鉴定同实施例2。

4、结果如图6～9所示，使用18～21外显子未加尾引物结合复合反应条件不能对目标片段实现有效扩增。使用18～21外显子各种加尾引物结合两步法反应条件仅在加短尾引物中可见低效率的目标片段扩增，而在加长尾引物中则未见目标片段扩增。使用18～21外显子各种加尾引物结合两种复合反应条件均可对目标片段实现有效扩增，且其扩增效果以及灵敏度与相同引物结合常规PCR反应条件一致甚至更高。

综上所述，5’加尾特异性PCR引物与复合反应条件结合使用可进一步提高反应特异性。

实施例7 扩增产物的测序鉴定

1、依据EGFR基因序列以及上述的EGFR基因18～21外显子特异性PCR引物设计测序引物如下：

18外显子测序引物：5’-GGCTGAGGTGACCCTTGTCT-3’

19外显子测序引物：5’-CATCTCACAATTGCCAGTT-3’

20外显子测序引物：5’-TCACCTGGAAGGGGTCC-3’

21外显子测序引物：5’-GCAGAGCTTCTTCCCATGA-3’

2、利用上述引物测序鉴定以上实施例的PCR扩增产物

(1)PCR产物纯化：取PCR产物5μl加入2μl北京鑫诺SAP酶混合物混匀，37℃1h，80℃15min。

(2)测序反应体系：纯化PCR产物3ul、Bigdye3.1 1μl、测序引物(10μm oL/L)1μl、超纯水1μl。

(3)反应条件：96℃1min；96℃10s、50℃5s、60℃4min，25个循环；12℃恒温。醋酸钠乙醇纯化测序反应产物，上美国ABI3130xl测序仪测序。

3、结果如图10所示，18～21外显子未加尾引物与各加尾引物扩增的目的片段经测序验证均为设计时所选择目的片段。

表明上述各实施例中的EGFR18、19、20、21外显子特异性PCR扩增引物以及各加尾特异性PCR扩增引物扩增的目的条带确为引物设计所拟扩增的18、19、20、21外显子目的扩增条带，引物设计有效。

以上实施例为以EGFR基因18、19、20、21外显子为例进行的验证实验。以下实施例以另一种基因为例进行验证。

实施例8 TCRP1基因2号外显子加尾引物研究

1、针对TCRP1基因2号外显子设计特异性的PCR引物(扩增片段长度347bp)。

TCRP1基因2外显子特异性引物上游引物：5’-CCACTACACCCTGATGC-3’；

TCRP1基因2外显子特异性引物下游引物：5’-TTCCGCTGGACCTCA-3’。

2、然后依据特异性PCR引物序列设计9～17bp长的5’端加尾序列，然后将设计好的5’端加尾序列连接在相应特异性引物的5’端作为5’加尾特异性PCR引物，分别为引物对2F-9T和2R-9T、2F-13T和2R-13T、2F-17T和2R-17T，具体如下：

2F-9T(SEQ ID NO.33所示)：5’-CCACTCCGACCACTACACCCTGATGC-3’；

2R-9T(SEQ ID NO.34所示)：5’-ACCTGTCGATTCCGCTGGACCTCA-3’。

2F-13T(SEQ ID NO.35所示)：5’-CCGCCCACTCCGACCACTACACCCTGATGC-3’；

2R-13T(SEQ ID NO.36所示)：5’-CTTGACCTGTCGATTCCGCTGGACCTCA-3’。

2F-17T(SEQ ID NO.37所示)：5’-CCGCCCGCCCACTCCGACCACTACACCCTGATGC-3’；

2R-17T(SEQ ID NO.38所示)：5’-ACCGCTTGACCTGTCGATTCCGCTGGACCTCA-3’。

3、样本基因组DNA提取：使用美国Promega公司基因组DNA提取试剂盒(GenomicDNA Purification Kit)依说明书提取肺癌A549细胞基因组DNA，美国Thermo NANODR 2000超微量分光光度计测定样本DNA含量，然后稀释至25ng/ul备用。

4、PCR扩增

(2)PCR反应条件：95℃3min；95℃30s、X℃(50℃、53℃、56℃、59℃、62℃、65℃)25s、72℃50s，35个循环；72℃7min。

(3)PCR产物鉴定：2％琼脂糖电泳鉴定PCR扩增产物。

5、电泳鉴定结果如图11所示，TCRP1基因2号外显子未加尾引物在59～62℃可见特异性扩增条带且无非特异性扩增，而加短尾、中尾、长尾引物则分别在59～65℃、59～65℃、56～65℃见特异性扩增条带且无非特异性扩增，同时加尾引物的电泳鉴定特异性目的条带亮度均较未加尾引物强。因此，TCRP1基因2号外显子加尾引物较未加尾引物具有更宽的适宜退火温度范围以及更高的扩增效率。

6、测序鉴定本实施例的PCR扩增产物

(1)利用TCRP1基因2号外显子特异性PCR上游引物(5’-CCACTACACCCTGA TGC-3’)作为测序引物对各未加尾与加尾引物PCR扩增产物进行测序鉴定。具体步骤同实施例7。

(2)测序鉴定结果如图12所示，本实施例中的TCRP1基因2号外显子特异性PCR扩增引物以及各加尾特异性PCR扩增引物扩增的目的条带确为引物设计所拟扩增的的扩增条带，引物设计有效。

Claims

1.一种提高聚合酶链式反应特异性的方法，其特征在于，在所述聚合酶链式反应的引物对的5’端加尾；所述加尾是指在引物对的5’端添加一段与模板非同源且不形成稳定二级结构的序列，只要其不与待扩增的样品高度同源且不会形成引物内或间稳定的二级结构影响PCR扩增即可；所述加尾是指在引物对中的两条引物的5’端均加尾，两条引物加尾的碱基数相同，所述加尾序列的长度为9～20个碱基；

所述方法还包括将PCR反应条件由常规的三步法PCR反应条件修改为复合PCR反应条件；所述复合PCR反应条件为：第一个循环阶段采取5～10循环的常规PCR反应条件，第二个循环阶段采用高温的退火和延伸步骤合并的两步法PCR条件；所述退火和延伸的温度相同，均为64～79℃。

2.一种提高EGFR基因18外显子、19外显子、20外显子或21外显子的PCR反应特异性的方法，其特征在于，是在EGFR基因18外显子、19外显子、20外显子或21外显子的特异性扩增引物对中的两条引物的5’端均加尾；所述加尾序列是指一段不与待扩增的样品高度同源且不会形成引物内或间稳定的二级结构的序列；具体加尾方法是：

3.一组EGFR基因18外显子的高特异性扩增引物对，其特征在于，所述引物对为18F-10T/18R-10T、18F-15T/18R-15T或18F-20T/18R-20T，其序列分别如SEQ ID NO.25～26、SEQID NO.17～18、SEQ ID NO.9～10所示。

4.一组EGFR基因19外显子的高特异性扩增引物对，其特征在于，所述引物对为19F-10T/19R-10T、19F-15T/19R-15T或19F-20T/19R-20T，其序列分别如SEQ ID NO.27～28、SEQID NO.19～20、SEQ ID NO.11～12所示。

5.一组EGFR基因20外显子的高特异性扩增引物对，其特征在于，所述引物对为20F-10T/20R-10T、20F-15T/20R-15T或20F-20T/20R-20T，其序列分别如SEQ ID NO.29～30、SEQID NO.21～22、SEQ ID NO.13～14所示。

6.一组EGFR基因21外显子的高特异性扩增引物对，其特征在于，所述引物对为21F-10T/21R-10T、21F-15T/21R-15Thuo 21F-20T/21R-20T，其序列分别如SEQ ID NO.31～32、SEQ ID NO.23～24、SEQ ID NO.15～16所示。

7.一种提高TCRP1基因2号外显子的PCR反应特异性的方法，其特征在于，是在TCRP1基因2号外显子的特异性扩增引物对中的两条引物的5’端均加尾；所述加尾序列是指一段不与待扩增的样品高度同源且不会形成引物内或间稳定的二级结构的序列；具体加尾方法是：

8.一组TCRP1基因2号外显子的高特异性扩增引物对，其特征在于，所述引物对为2F-9T/2R-9T、2F-13T/2R-13T或2F-17T/2R-17T，其序列分别如SEQ ID NO.33～34、SEQ IDNO.35～36、SEQ ID NO.37～38所示。