CN104962630A - 莲草直胸跳甲actin基因转录水平荧光定量PCR检测试剂盒 - Google Patents

莲草直胸跳甲actin基因转录水平荧光定量PCR检测试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种检测莲草直胸跳甲肌动蛋白（actin）基因转录水平的试剂盒，该发明属于分子生物学检测技术中的荧光定量DNA体外扩增技术领域。本发明首先保护了一种检测引物，序列如SEQ. ID NO.1和SEQ. ID NO.2所示，其次提供了一种操作简便、快速，且能够定量检测莲草直胸跳甲actin基因转录水平的荧光定量PCR检测试剂盒，该试剂盒由SYBR Premix Ex Taq、引物混合物、标准actin基因模板和超纯水组成。本发明还保护了该试剂盒用于检测莲草直胸跳甲actin基因的表达量的用途。本发明可以准确的测定actin基因的转录水平，并具有高度的特异性，扩增曲线结果表明actin基因荧光信号值符合标准的“S”型曲线，熔解曲线表明该荧光定量具有高度的检测专一性。

Description

莲草直胸跳甲actin基因转录水平荧光定量PCR检测试剂盒
技术领域
本发明涉及一种检测莲草直胸跳甲肌动蛋白（actin）基因转录水平的试剂盒，该发明属于分子生物学检测技术中的荧光定量DNA体外扩增技术领域。
背景技术
聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction, PCR)，即DNA体外扩增技术，是1985年由美国Mullis首创的一种生物高技术，随着耐高温的Taq酶的出现，扩增自动化的完善，PCR近年得以迅速推广，它仅需要微微克水平的模板就能快速特异大量地复制任何所希望的基因或DNA片断。
荧光定量PCR是一种核酸定量技术，该技术在PCR反应系统中引入了特定的荧光标记物质，通过检测每个热循环后PCR反应体系中的荧光值的变化情况来实时监测DNA的扩增情况，并获得每个样本的荧光定量变化曲线，从而获得每个反应管的Ct值（荧光变化达到阈值时的循环数），以起始模板数的对数为横坐标，以Ct值为纵坐标制备标准曲线，据此标准曲线和各个标本的Ct值对每个反应的起始DNA模板数进行定量测定。
SYBR Green是一种结合于双链DNA小沟中的结合染料。利用荧光染料（SYBR Green）与双链DNA分子结合发光的特性来指示扩增产物的增加。在PCR反应体系中，加入过量SYBR Green I荧光染料，当该染料掺入DNA双链后，荧光信号增强；当DNA变性时SYBR Green I染料释放出来，荧光急剧减少；随后在聚合延伸过程中引物退火并形成PCR产物，SYBR Green I染料与双链产物结合，经检测获得荧光的净增量。荧光信号的增加与PCR产物的增加完全同步。这种高灵敏度、较低毒性的核酸染料在结合双链DNA分子后荧光增强800-1000倍。
SYBR Green在核酸的实时检测方面有很多优点，由于它与所有的双链DNA相结合，不必因为模板不同而特别定制，因此设计的程序通用性好，且价格相对较低。此外，由于一个PCR产物可以与多分子的染料结合，因此SYBR Green的灵敏度很高。但是，由于SYBR Green与所有的双链DNA结合，因此由引物二聚体、单链二级结构以及错误的扩增产物引起的假阳性会影响定量的精确性。通过测量升高温度后荧光的变化可以帮助降低非特异产物的影响。由解链曲线来分析产物的均一性有助于分析由SYBR Green得到定量结果的准确性。
在荧光定量PCR检测基因表达水平时，经常检测某个基因的相对表达量，其中内参基因常常选择actin。β-actin 即β 肌动蛋白，是actin 家族的一员，在维持细胞结构，细胞内运动，细胞分裂等细胞生理活动方面发挥着重要的作用。β-actin 基因是应用较为广泛的管家基因之一。管家基因(house-keeping genes) 是指所有细胞中均要表达的一类基因，其产物是对维持细胞基本生命活动所必需的。在进行定量PCR 时，可以通过计算目的基因和管家基因的比值，得到基因表达的相对浓度。通过大量的实验研究，我们优化出了一套能够有效检测莲草直胸跳甲actin基因表达量的引物和PCR反应体系，并组装成actin基因表达检测荧光定量聚合酶链式反应试剂盒，以满足生命科学、植物保护研究者的检测需要。
发明内容
本发明目的在于提供一种操作简便、快速，且能够定量检测莲草直胸跳甲actin基因转录水平的荧光定量PCR检测试剂盒。
本发明的技术方案如下：
本发明首先提供了一种莲草直胸跳甲actin基因转录水平荧光定量PCR检测引物混合物，所述引物混合物由引物1： 5＇-AAGCCCAAAGCAAAAGAGGTAT-3＇和引物2：5＇-TGTAGAAGGTGTGATGCCAGAT-3＇组成。
其次，本发明提供了一种利用所述引物混合物的莲草直胸跳甲actin基因转录水平荧光定量PCR检测试剂盒，该试剂盒由SYBR Premix Ex Taq、引物混合物、标准actin基因模板和超纯水组成。
所述引物混合物中：引物1为10 µmol/L、引物2为10 µmol/L。
所述标准actin基因模板：浓度为1.0 µmol/L，标准actin基因模板序列为：5＇-AAGCCCAAAGCAAAAGAGGTATCCTCACCTTGAAATACCCAATTGAACACGGTATCATCACCAACTGGGATGATATGGAGAAGATCTGGCATCACACCTTCTACA-3＇。
超纯水组成：纯度超过18.25 MΩ·CM。
本发明还保护了所述的莲草直胸跳甲actin基因转录水平荧光定量PCR检测试剂盒的用途，将该试剂盒用于检测莲草直胸跳甲actin基因的表达量。
所述检测包括建立PCR 反应体系：总体积为25 µL ，SYBR Premix Ex Taq 12.5 µL、模板cDNA或标准actin基因模板1.5 µL、引物混合物1.0 µL、超纯水10 mL。
本发明可以准确的测定actin的表达水平，并具有高度的特异性，扩增曲线结果表明actin基因荧光信号值符合标准的“S”型曲线（图1），熔解曲线表明该荧光定量具有高度的检测专一性（图2）。
附图说明
图1：莲草直胸跳甲actin基因扩增曲线；
图2：莲草直胸跳甲actin基因熔解曲线。
具体实施方式
以下结合具体实施例，对本发明进行详细说明。
本试剂盒由SYBR® Premix Ex TaqTM（购自Takara公司）、引物混合物、标准actin基因模板和超纯水组成，试剂盒组成：
表1
试剂盒中各组成成分如下：
SYBR® Premix Ex TaqTM：内含TaKaRa Ex Taq® HS，dNTP Mixture，Mg2+，Tli RNaseH，SYBR® Green I 等。
引物混合物：引物1为10 µmol/L、引物2为10 µmol/L，
引物1序列为5＇-AAGCCCAAAGCAAAAGAGGTAT-3＇、
引物2序列为5＇-TGTAGAAGGTGTGATGCCAGAT-3＇；
标准actin基因模板：浓度为1.0 µmol/L，actin基因模板序列为：5＇-AAGCCCAAAGCAAAAGAGGTATCCTCACCTTGAAATACCCAATTGAACACGGTATCATCACCAACTGGGATGATATGGAGAAGATCTGGCATCACACCTTCTACA-3＇；
超纯水组成：纯度超过18.25 MΩ·CM。
混合适量的SYBR® Premix Ex TaqTM、引物混合物、超纯水、标准actin基因模板或cDNA模板，在热循环仪上进行高温、低温、中温的反复热循环；并在中温时检测和记录荧光值。该actin荧光定量PCR可以有效扩增莲草直胸跳甲的actin基因，从而检测actin基因的表达量。
实例1
按比例配制actin荧光定量PCR反应液，25 µL反应体系如下表：
表2
在同一次定量反应中应同时设有阴性对照和阳性对照。
取SYBR® Premix Ex TaqTM1250 µL、引物混合物100 µL、超纯水1000 µL充分混匀，配制
2350 µL的FQ-PCR预混液。
充分混匀以上各种液体，将预混液按23.5 µL/管分装成100小管，加至荧光定量专用PCR反应管中。
配制以10E+8/ml、10E+7/ml、10E+6/ml、10E+5/ml、10E+4/ml等系列稀释度的标准actin基因模板5管，每管10 µL。
FQ-PCR扩增：每个装有23.5 µL PCR反应预混液的反应管中分别加入1.5 µL待测cDNA（此处用以上各浓度的标准品代替）、水或标准actin基因模板，震荡混匀，瞬时离心后上机到荧光定量PCR仪（Bio-Rad）中，95℃预变性30 s，然后按95℃变性3s，60℃退火30 s热循环40次，并在60℃时检测记录荧光信号。
PCR反应结束后，读取各个反应的Ct值，绘制标准曲线，用以定量分析；同时于3%琼脂糖凝胶电泳检测，凝胶成像系统下观察拍照。
结果：根据actin基因模板标准品绘制出的标准曲线，求出待测样品的actin基因浓度。根据标准曲线测出的已知浓度的标准品与其实际浓度相同（误差为1%-5%）。本发明可以准确的测定actin的表达水平，并具有高度的特异性，扩增曲线结果表明actin基因荧光信号值符合标准的“S”型曲线（图1），熔解曲线表明该荧光定量具有高度的检测专一性（图2）。
实例2
按比例配制actin荧光定量PCR反应液，25 µL反应体系如下表：
表3
在同一次定量反应中应同时设有阴性对照和阳性对照。
取SYBR® Premix Ex TaqTM1250 µL、引物混合物100 µL、超纯水1000 µL充分混匀，配制2350 µL的FQ-PCR预混液。
充分混匀以上各种液体，将预混液按23.5 µL/管分装成100小管，加至荧光定量专用PCR反应管中。
配制以10E+8/ml、10E+7/ml、10E+6/ml、10E+5/ml、10E+4/ml等系列稀释度的标准actin基因模板5管，每管10 µL。
FQ-PCR扩增：每个装有23.5 µL PCR反应预混液的反应管中分别加入1.5 µL标准actin基因模板（阴性对照管加超纯水），震荡混匀，瞬时离心后上机到荧光定量PCR仪（Bio-Rad）中，95℃预变性30 s，然后按95℃变性3s，60℃退火30 s热循环40次，并在60℃时检测记录荧光信号。
PCR反应结束后，读取各个反应的Ct值，绘制标准曲线，用以定量分析；同时于3%琼脂糖凝胶电泳检测，凝胶成像系统下观察拍照。
结果：实验对低浓度（10E+4/ml）标准actin基因模板的检出率为100%，根据标准曲线计算出的actin基因浓度之间的误差为±4%。
应当理解的是，对本领域普通技术人员来说，可以根据上述说明加以改进或变换，而所有的这些改进和变换都应属于本发明所附权利要求的保护范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 福建省农业科学院植物保护研究所
<120> 莲草直胸跳甲actin基因转录水平荧光定量PCR检测试剂盒
<160> 3
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
aagcccaaag caaaagaggt at 22
<210> 2
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
tgtagaaggt gtgatgccag at 22
<210> 3
<211> 105
<212> DNA
<213> 标准actin基因模板
<400> 3
aagcccaaag caaaagaggt atcctcacct tgaaataccc aattgaacac ggtatcatca 60
ccaactggga tgatatggag aagatctggc atcacacctt ctaca 105

Claims (6)

1.一种莲草直胸跳甲actin基因转录水平荧光定量PCR检测引物混合物，其特征在于：所述引物混合物由引物1：5＇-AAGCCCAAAGCAAAAGAGGTAT-3＇和引物2：5＇-TGTAGAAGGTGTGATGCCAGAT-3＇组成。
2.一种利用权利要求1所述引物混合物的莲草直胸跳甲actin基因转录水平荧光定量PCR检测试剂盒，其特征在于，该试剂盒由SYBR Premix Ex Taq、引物混合物、标准actin基因模板和超纯水组成。
3.根据权利要求2所述的莲草直胸跳甲actin基因转录水平荧光定量PCR检测试剂盒，其特征在于， 所述引物混合物中：引物1为10 µmol/L、引物2为10 µmol/L。
4.根据权利要求2所述的莲草直胸跳甲actin基因转录水平荧光定量PCR检测试剂盒，其特征在于，所述标准actin基因模板：浓度为1.0 µmol/L，标准actin基因模板序列为：5＇-AAGCCCAAAGCAAAAGAGGTATCCTCACCTTGAAATACCCAATTGAACACGGTATCATCACCAACTGGGATGATATGGAGAAGATCTGGCATCACACCTTCTACA-3＇。
5.如权利要求2-4中任一项所述的莲草直胸跳甲actin基因转录水平荧光定量PCR检测试剂盒的用途，其特征在于，该试剂盒用于检测莲草直胸跳甲actin基因的表达量。
6.根据权利要求5所述的用途，其特征在于，所述检测包括建立PCR 反应体系：总体积为25 µL ，SYBR Premix Ex Taq 12.5 µL、模板cDNA或标准actin基因模板1.5 µL、引物混合物1.0 µL、超纯水10 mL。
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