CN108707655A

CN108707655A - β-actin蛋白作为日本血吸虫病肝纤维化发生血清学诊断标志物的应用

Info

Publication number: CN108707655A
Application number: CN201810450282.3A
Authority: CN
Inventors: 张蓓蓓; 吴忠道; 吴晓瑛; 元冬娟; 刘嘉华; 宋秋月
Original assignee: National Sun Yat Sen University
Current assignee: Sun Yat Sen University; National Sun Yat Sen University
Priority date: 2018-05-11
Filing date: 2018-05-11
Publication date: 2018-10-26
Anticipated expiration: 2038-05-11
Also published as: CN108707655B

Abstract

本发明公开了人β‑actin作为日本血吸虫病肝纤维化发生血清学诊断标志物的应用，β‑actin蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。研究发现在日本血吸虫性肝纤维化小鼠肝脏和病人血清中，β‑actin的基因和蛋白水平都不稳定，肝脏中其含量随着纤维化的发生发展显著升高，血清中的含量随着纤维化的发生发展显著降低。因此，β‑actin的表达水平具有成为判断日本血吸虫病病人发生肝纤维化病变以及病变程度的重要诊断指标，通过检测病人外周血中β‑actin的表达水平，可以为现场调查和临床工作提供更为简单、易操作、经济、科学的日本血吸虫病肝纤维化发生的诊断技术。

Description

β-actin蛋白作为日本血吸虫病肝纤维化发生血清学诊断标志物的应用

技术领域

本发明涉及日本血吸虫病肝纤维化检测技术领域，更具体地，涉及β-actin蛋白作为日本血吸虫病肝纤维化发生血清学诊断标志物的应用。

背景技术

日本血吸虫（Schistosoma japonicum）感染引起的日本血吸虫病是一种流行广泛、严重危害人类健康和社会经济发展的人兽共患寄生虫病。全球患病人数超过2亿，造成了153万伤残调整寿命年的损失。我国是日本血吸虫病流行最严重的国家之一，开展了半个多世纪全面而有计划的防治工作，取得了显著成绩。据统计，至2013年底，我国仍有18.4 万血吸虫病患者，因此形式依然严峻。血吸虫尾蚴经皮肤感染人或动物后，在宿主门脉-肠系膜系统发育为成虫，成虫产卵后，一部分虫卵经门静脉系统流至肝门静脉，沉积在宿主肝脏组织内，造成大量炎症细胞募集，炎性细胞因子分泌，最终形成以虫卵为中心的肉芽肿并进展为肝纤维化。治疗不及时或治疗不当，延误最佳治疗时期，均可造成血吸虫病肝纤维化的持续发展，最终出现肝脾肿大、门脉高压、腹水等晚期血吸虫病体征。患者可因上消化道出血、肝昏迷等并发症死亡。

由于我国血吸虫病人主要存在贫穷落后的农村地方，经济发展较为落后，医疗条件较差，因此，我国晚期血吸虫病的病情评估主要依赖腹部B型超声检查来评估肝脏网格状条索的紧密及粗细程度，以及覆盖范围，进行病情诊断、分级。此方法判断病情存在一定的主观性，有待结合其它定量方法实现准确评判。尽管肝脏活检是评判肝纤维化程度的金标准，取材过程的有创性，使得病人的随访配合性差。近年来新兴的肝弹性测定技术逐步应用于临床，但是设备价格昂贵，难以应用于现场研究，因此，无创、简便、高效、精准的诊断手段的开发显得尤为迫切。而血清学临床指标的开发具有重要的现实应用价值。

发明内容

本发明的目的是为了克服现有技术的不足，提供β-actin作为日本血吸虫病肝纤维化发生血清学诊断标志物的应用及其诊断试剂盒。

本发明的第一个目的是提供人β-actin蛋白作为日本血吸虫病肝纤维化发生血清学诊断标志物的应用。

本发明的第二个目的是提供β-actin基因作为日本血吸虫病肝纤维化发生诊断标志物的应用。

本发明的第三个目的是提供β-actin基因、人β-actin蛋白、检测β-actin基因的引物或检测β-actin蛋白的抗体在制备日本血吸虫病肝纤维化诊断试剂盒中的应用。

本发明的第四个目的是提供一种在日本血吸虫病肝纤维化诊断的试剂盒。

为了实现上述目的，本发明是通过以下技术方案予以实现的：

β-actin是actin家族中的重要亚型，是重要的细胞骨架蛋白。通过日本血吸虫感染小鼠模型以及病人血清样本的分析，比较了肝纤维化发生后β-actin 的表达水平变化特征，评判其在日本血吸虫性肝纤维化诊断的潜在应用价值。研究发现，在日本血吸虫性肝纤维化小鼠肝脏和病人血清中，β-actin的基因和蛋白水平都不稳定，肝脏中的含量随着纤维化的发生发展显著升高。血清中的含量随着纤维化的发生发展显著降低。

因此本发明要求保护人β-actin蛋白作为日本血吸虫病肝纤维化发生血清学诊断标志物的应用，β-actin蛋白为Human（uc003sot.5 (ACTB) length=375），其的氨基酸序列如如SEQ ID NO：1所示。

同时，本发明要求保护人β-actin蛋白作为日本血吸虫病肝纤维化发生血清学诊断标志物的应用，β-actin基因为NM_007393.5 Mus musculus actin, beta (Actb),mRNA，其核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。

β-actin基因、人β-actin蛋白、检测β-actin基因的引物或检测β-actin蛋白的抗体在制备日本血吸虫病肝纤维化诊断试剂盒中的应用。

一种在日本血吸虫病肝纤维化诊断的试剂盒，含有检测β-actin基因或β-actin蛋白的表达量的组分。

优选地，含有以上所述的抗体。

优选地，含有以上所述的引物。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

研究发现在日本血吸虫性肝纤维化小鼠肝脏和病人血清中，β-actin的基因和蛋白水平都不稳定，肝脏中其含量随着纤维化的发生发展显著升高，血清中的含量随着纤维化的发生发展显著降低。因此，β-actin的表达水平具有成为判断日本血吸虫病病人发生肝纤维化病变以及病变程度的重要诊断指标，通过检测病人外周血中β-actin的表达水平，可以为现场调查和临床工作提供更为简单、易操作、经济、科学的日本血吸虫病肝纤维化发生的诊断技术。

附图说明

图1为日本血吸虫感染小鼠不同阶段肝纤维化病变，具体A：HE染色观察肝脏病变；B：Masson染色观察纤维沉积；C：IPP6软件分析胶原沉积情况。所有数据均用均数±标准误表示，采用one-way ANOVA进行统计学分析（*, P < 0.05; ***, P < 0.001）。

图2为日本血吸虫感染小鼠不同阶段肝脏纤维化相关基因mRNA表达谱；所有数据均用均数±标准误表示，采用one-way ANOVA进行统计学分析（***, P < 0.001）。

图3为日本血吸虫感染小鼠不同阶段肝脏β-actin蛋白表达水平；所有数据均用均数±标准误表示，采用非参数检验进行统计学分析（*, P < 0.05；***, P < 0.001）。

图4为日本血吸虫感染小鼠肝脏β-actin表达水平与肝纤维化程度的相关性分析；所有数据均用均数±标准误表示，采用one-way ANOVA进行统计学分析（***, P <0.001）。

图5为日本血吸虫感染小鼠不同阶段肝脏β-actin（绿色）、α-SMA（红色）的表达水平。

图6为日本血吸虫性肝纤维化病人血清β-actin含量的比较分析；所有数据均用均数±标准误表示，采用one-way ANOVA进行统计学分析（**, P < 0.01；***, P < 0.001）。

图7为日本血吸虫性肝纤维化病人血清β-actin含量的比较分析。

具体实施方式

下面结合说明书附图和具体实施例对本发明作进一步地详细阐述，所述实施例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。

实施例1 日本血吸虫感染及β-actin表达分析

一、日本血吸虫感染不同时期肝脏纤维化病变观察

1、操作

建立日本血吸虫感染小鼠模型：按常规方法，取阳性钉螺置于去氯水中、25℃～28℃光照条件下逸放尾蚴1～2h。用接种环蘸取水面尾蚴收集至盖玻片上。清洁级8周龄BALB/c小鼠经戊巴比妥麻醉，背部朝上固定于鼠板。腹部剔毛后清洁过夜去氯水湿润小鼠腹部，用接种环蘸取水面尾蚴15条至盖玻片上，贴附小鼠的腹部皮肤进行感染。根据感染时间的长短分为感染后4周组、6周组、8周组，并设同期正常小鼠为对照。

取各感染时间点小鼠肝左叶相同部位、约1cm×1cm×0.5cm大小组织。经固定、脱水、透明、石蜡包埋、连续切片等制成4μm厚的切片，已制备好的石蜡切片（4μm）自4℃取出后，在室温放置30min，后放置烘箱（65℃）1h后进行常规HE染色。采用Masson染色试剂盒染色观察肝脏组织胶原沉积情况，并用Image-Pro Plus 6（IPP6）进行定量分析。

同时，利用qPCR检测纤维化形成相关基因α-SMA、Collagen I、Collagen III的表达量，内参采用GAPDH。按照常规方法提取肝脏总RNA，并按Takara反转录试剂盒将RNA反转录成cDNA。以此为模板，设计特异性引物(见表1)进行通qPCR检测，采用 Roche 公司的LightCycler 480 System qRT-PCR 仪进行检测，设定反应条件如下：95℃ 30 s；95℃ 5s，60℃ 20 s，40 个循环；65℃ 15 s.

表1：绝对定量PCR检测引物序列

2、结果

通过建立日本血吸虫感染小鼠模型，HE、Masson染色结果显示，与正常小鼠相比，日本血吸虫感染4周小鼠肝脏出现轻微的炎症细胞浸润、纤维化反应。随着感染时间的延长，肝脏肉芽肿性病变加剧，尤其是第8周，大量胶原纤维沉积，纤维化面积增大（图1 B、C），通过IPP软件分析Masson染色阳性区域的累积光密度值（IOD），随着感染时间的延长，IOD值显著升高。

并且qPCR检测纤维化形成相关基因α-SMA、Collagen I、Collagen III的表达谱显示（图2），这些纤维化相关基因在感染6周小鼠肝脏中显著高表达。因此，日本血吸虫性肝纤维化小鼠模型建立成功。

二、肝脏β-actin表达分析

1、操作

Western blot检测β-actin蛋白表达（β-actin蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示，β-actin基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示）：提取肝脏组织蛋白后，BCA试剂盒测定蛋白浓度，用PBS将各样品稀释成统一浓度，向稀释后的蛋白液中加入1/4体积的5X蛋白上样缓冲液，混匀后置于100℃沸水煮5分钟。-80℃冷冻，待用。

Western blot 检测β-actin、GAPDH、Tubulin表达。具体步骤为：检测蛋白上样后，60V、30min后电压转换成120V，待溴酚蓝跑至分离胶底部时停止电泳。转膜后5%的脱脂奶粉室温封闭3h。按照β-actin（12262, Cell Signaling Technology）、GAPDH(G8795，Sigma)、Tubulin(T0198，Sigma)抗体说明书稀释一抗后4℃摇床过夜。PBST洗膜三次，每次5min。孵育二抗，室温1h。PBST洗膜后，ECL化学发光。

绝对定量PCR检测β-actin基因表达：按照常规方法提取肝脏总RNA，并按Takara反转录试剂盒将RNA反转录成cDNA。以此为模板，设计特异性引物(见表2)进行通PCR扩增，依次加入反应物，反应体系如下：Taq酶12.5 µl；Forward primer 1 µl；Reverse primer 1µl；ddH₂O 7.5 µl；cDNA 3 µl。总体积 25 µl。反应条件为：95℃预变性 5 min，94℃变性 1min，60℃退火 1 min，72℃延伸40 S，扩增40 35个循环。72℃延伸7min。4℃冷却体系后扩增结收集产物。

表2：绝对定量PCR检测引物序列

核酸电泳后，切胶回收，进一步纯化后的产物连接至T载上，将连接产物导入感受态细胞中，通过菌落培养，挑取白色单菌落进行小量液体培养经鉴定后4度保存待用。提取菌液中的质粒，对制备的重组质粒溶液，建立标准曲线。常规q-PCR检测肝脏中β-actin、GAPDH、Tubulin的cq值，根据标准曲线计算出绝对表达水平。

免疫荧光检测肝脏β-actin、α-SMA的表达定位：已制备好的石蜡切片（4μm）自4℃取出后，60℃烘烤30min后，经过梯度脱水，抗原修复、去除内源性酯酶、1%BSA封闭后，按照说明书加入一抗孵育过夜，洗涤后荧光二抗孵育1小时，DAPI常规染色，荧光显微镜下拍照分析。

2、结果

在生物学研究中，β-actin由于在各组织和细胞中的表达相对恒定，在检测蛋白的表达水平变化时常用它来做参照物。通过Western blot技术检测了肝脏中β-actin的蛋白表达水平，感染6周以后，肝脏中β-actin的蛋白表达水平显著升高，而2个常规的内参GAPDH和Tubulin的蛋白表达水平在正常鼠、感染不同时期的小鼠肝脏中的表达是稳定的（图3）。

通过绝对定量PCR方法进一步检测了β-actin的基因表达水平，得到同样的结果（图4 A）。相关性分析发现，肝脏中β-actin的表达与Masson染色的IOD值呈现正相关（r=0.8521，P=0.0004）（图4B）。因此，在血吸虫性肝纤维化模型中，随着纤维化程度的加剧，β-actin的表达水平升高。

为了进一步确证以上结论，我们通过免疫荧光技术，检测了肝脏组织中β-actin（绿色）、α-SMA（红色）的表达（图5），发现α-SMA的表达在4周轻微升高，6周以后显著升高，β-actin的表达呈现同样的趋势。并且，肝组织中β-actin、α-SMA染色双阳性区域在6周以后大面积升高。因此，肝纤维化的进展伴随着β-actin表达升高。

三、血清中β-actin ELISA检测

对江西省血吸虫病疫区的229例患者进行腹部B超检查，根据肝纤维化严重程度分成0级、1级、2级、3级（诊断标准参照：血吸虫病防治手册第三版）。利用ELISA检测血清中β-actin表达水平。其中，未出现纤维化的病人有27例，出现纤维化的病人有202例。

1、操作

按说明书，将100µl标准品及样本加入到包被好的酶标条中，37℃孵育2小时；弃去液体，加入100µl 生物素标记过的β-actin抗体，37℃孵育1小时。洗板：弃去生物素标记过的β-actin抗体，每孔加入250µl洗涤液，洗板3次，每次加入液体浸泡1min，垂直叩板去除残留液体。加检测酶：每孔加入100µl Avidin-HRP，37℃避光孵育1小时。洗板：用洗涤缓冲液洗板5～7次。TMB显色：每孔加TMB底物溶液90µl。37℃避光放置15min。每孔加50µl加终止液显色。读值：用酶标仪在450nm波长测OD值后分析数据。

2、结果

结果显示，未出现肝纤维化病人（0级）血清中的β-actin蛋白的水平显著高于肝纤维化1级、2级、3级病人（图6及图7）。

基于目前的病人样本量，当病人血清中β-actin蛋白的含量为17±9.5时，病人未出现肝纤维化，阴性检出准确率为66.7%；当含量为9.34±7.5时，病人出现肝纤维化，阳性检出准确率为81.7%。

结合小鼠模型的实验结果，分析β-actin作为重要的细胞骨架蛋白，在肝纤维化发生时，肝脏的成纤维细胞大量表达β-actin蛋白，β-actin蛋白水平在肝脏中的含量显著升高，其分泌至体液中的含量相应减少。因此，在日本血吸虫性肝纤维化中，血清β-actin含量可以作为病人肝纤维化发生的早期判断指标。

在日本血吸虫性肝纤维化小鼠肝脏和病人血清中，β-actin的基因和蛋白水平都不稳定，肝脏中的含量随着纤维化的发生发展显著升高，肝纤维1级病人外周血液中，β-actin的含量就已经显著减少。

因此，外周血β-actin蛋白的表达水平的降低具有成为判断日本血吸虫病病人发生肝纤维化病变以及病变程度的重要诊断指标，通过检测病人外周血中β-actin的表达水平，可以为现场调查和临床工作提供更为简单、易操作、经济、科学的日本血吸虫病肝纤维化发生的诊断技术。

序列表

<110> 中山大学

<120> β-actin蛋白作为日本血吸虫病肝纤维化发生血清学诊断标志物的应用

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 375

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 1

Met Asp Asp Asp Ile Ala Ala Leu Val Val Asp Asn Gly Ser Gly Met

1 5 10 15

Cys Lys Ala Gly Phe Ala Gly Asp Asp Ala Pro Arg Ala Val Phe Pro

20 25 30

Ser Ile Val Gly Arg Pro Arg His Gln Gly Val Met Val Gly Met Gly

35 40 45

Gln Lys Asp Ser Tyr Val Gly Asp Glu Ala Gln Ser Lys Arg Gly Ile

50 55 60

Leu Thr Leu Lys Tyr Pro Ile Glu His Gly Ile Val Thr Asn Trp Asp

65 70 75 80

Asp Met Glu Lys Ile Trp His His Thr Phe Tyr Asn Glu Leu Arg Val

85 90 95

Ala Pro Glu Glu His Pro Val Leu Leu Thr Glu Ala Pro Leu Asn Pro

100 105 110

Lys Ala Asn Arg Glu Lys Met Thr Gln Ile Met Phe Glu Thr Phe Asn

115 120 125

Thr Pro Ala Met Tyr Val Ala Ile Gln Ala Val Leu Ser Leu Tyr Ala

130 135 140

Ser Gly Arg Thr Thr Gly Ile Val Met Asp Ser Gly Asp Gly Val Thr

145 150 155 160

His Thr Val Pro Ile Tyr Glu Gly Tyr Ala Leu Pro His Ala Ile Leu

165 170 175

Arg Leu Asp Leu Ala Gly Arg Asp Leu Thr Asp Tyr Leu Met Lys Ile

180 185 190

Leu Thr Glu Arg Gly Tyr Ser Phe Thr Thr Thr Ala Glu Arg Glu Ile

195 200 205

Val Arg Asp Ile Lys Glu Lys Leu Cys Tyr Val Ala Leu Asp Phe Glu

210 215 220

Gln Glu Met Ala Thr Ala Ala Ser Ser Ser Ser Leu Glu Lys Ser Tyr

225 230 235 240

Glu Leu Pro Asp Gly Gln Val Ile Thr Ile Gly Asn Glu Arg Phe Arg

245 250 255

Cys Pro Glu Ala Leu Phe Gln Pro Ser Phe Leu Gly Met Glu Ser Cys

260 265 270

Gly Ile His Glu Thr Thr Phe Asn Ser Ile Met Lys Cys Asp Val Asp

275 280 285

Ile Arg Lys Asp Leu Tyr Ala Asn Thr Val Leu Ser Gly Gly Thr Thr

290 295 300

Met Tyr Pro Gly Ile Ala Asp Arg Met Gln Lys Glu Ile Thr Ala Leu

305 310 315 320

Ala Pro Ser Thr Met Lys Ile Lys Ile Ile Ala Pro Pro Glu Arg Lys

325 330 335

Tyr Ser Val Trp Ile Gly Gly Ser Ile Leu Ala Ser Leu Ser Thr Phe

340 345 350

Gln Gln Met Trp Ile Ser Lys Gln Glu Tyr Asp Glu Ser Gly Pro Ser

355 360 365

Ile Val His Arg Lys Cys Phe

370 375

<210> 2

<211> 1935

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 2

tataaaaccc ggcggcgcaa cgcgcagcca ctgtcgagtc gcgtccaccc gcgagcacag 60

cttctttgca gctccttcgt tgccggtcca cacccgccac cagttcgcca tggatgacga 120

tatcgctgcg ctggtcgtcg acaacggctc cggcatgtgc aaagccggct tcgcgggcga 180

cgatgctccc cgggctgtat tcccctccat cgtgggccgc cctaggcacc agggtgtgat 240

ggtgggaatg ggtcagaagg actcctatgt gggtgacgag gcccagagca agagaggtat 300

cctgaccctg aagtacccca ttgaacatgg cattgttacc aactgggacg acatggagaa 360

gatctggcac cacaccttct acaatgagct gcgtgtggcc cctgaggagc accctgtgct 420

gctcaccgag gcccccctga accctaaggc caaccgtgaa aagatgaccc agatcatgtt 480

tgagaccttc aacaccccag ccatgtacgt agccatccag gctgtgctgt ccctgtatgc 540

ctctggtcgt accacaggca ttgtgatgga ctccggagac ggggtcaccc acactgtgcc 600

catctacgag ggctatgctc tccctcacgc catcctgcgt ctggacctgg ctggccggga 660

cctgacagac tacctcatga agatcctgac cgagcgtggc tacagcttca ccaccacagc 720

tgagagggaa atcgtgcgtg acatcaaaga gaagctgtgc tatgttgctc tagacttcga 780

gcaggagatg gccactgccg catcctcttc ctccctggag aagagctatg agctgcctga 840

cggccaggtc atcactattg gcaacgagcg gttccgatgc cctgaggctc ttttccagcc 900

ttccttcttg ggtatggaat cctgtggcat ccatgaaact acattcaatt ccatcatgaa 960

gtgtgacgtt gacatccgta aagacctcta tgccaacaca gtgctgtctg gtggtaccac 1020

catgtaccca ggcattgctg acaggatgca gaaggagatt actgctctgg ctcctagcac 1080

catgaagatc aagatcattg ctcctcctga gcgcaagtac tctgtgtgga tcggtggctc 1140

catcctggcc tcactgtcca ccttccagca gatgtggatc agcaagcagg agtacgatga 1200

gtccggcccc tccatcgtgc accgcaagtg cttctaggcg gactgttact gagctgcgtt 1260

ttacaccctt tctttgacaa aacctaactt gcgcagaaaa aaaaaaaata agagacaaca 1320

ttggcatggc tttgtttttt taaatttttt ttaaagtttt tttttttttt tttttttttt 1380

tttttaagtt tttttgtttt gttttggcgc ttttgactca ggatttaaaa actggaacgg 1440

tgaaggcgac agcagttggt tggagcaaac atcccccaaa gttctacaaa tgtggctgag 1500

gactttgtac attgttttgt tttttttttt ttttggtttt gtcttttttt aatagtcatt 1560

ccaagtatcc atgaaataag tggttacagg aagtccctca ccctcccaaa agccaccccc 1620

actcctaaga ggaggatggt cgcgtccatg ccctgagtcc accccgggga aggtgacagc 1680

attgcttctg tgtaaattat gtactgcaaa aattttttta aatcttccgc cttaatactt 1740

catttttgtt tttaatttct gaatggccca ggtctgaggc ctcccttttt tttgtccccc 1800

caacttgatg tatgaaggct ttggtctccc tgggaggggg ttgaggtgtt gaggcagcca 1860

gggctggcct gtacactgac ttgagaccaa taaaagtgca caccttacct tacacaaaca 1920

aaaaaaaaaa aaaaa 1935

Claims

1.人β-actin蛋白作为日本血吸虫病肝纤维化发生血清学诊断标志物的应用，其特征在于，β-actin蛋白的氨基酸序列如如SEQ ID NO：1所示。

2.β-actin基因作为日本血吸虫病肝纤维化发生的诊断标志物的应用，其特征在于，β-actin基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。

3.β-actin基因、人β-actin蛋白、检测β-actin基因的引物或检测β-actin蛋白的抗体在制备日本血吸虫病肝纤维化诊断试剂盒中的应用。

4.一种日本血吸虫病肝纤维化的诊断试剂盒，其特征在于，含有检测β-actin基因或β-actin蛋白的表达量的组分。

5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，含有权利要求3中所述的抗体。

6.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，含有权利要求3中所述的引物。