CN103059117A - 日本血吸虫重要抗原的高通量筛选及其在血吸虫病诊断中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了日本血吸虫重要抗原的高通量筛选及其在血吸虫病诊断中的应用。具体的，本发明提供了一类重要的血吸虫抗原及其在血吸虫病诊断以及疫苗制备方面的用途。本发明人基于GST融合表达的高通量功能蛋白筛选技术，获得24个能被血吸虫病病人血清识别的阳性抗原，其中8个抗原呈现较强的阳性反应。血吸虫病血清学检测表明，用这些阳性抗原检测血吸虫具有高敏感性和特异性。本发明还提供了相应的诊断和监测血吸虫病的方法和试剂盒。

Description

日本血吸虫重要抗原的高通量筛选及其在血吸虫病诊断中的应用

技术领域

本发明属于生物技术领域；更具体地，本发明公开了日本血吸虫重要抗原的高通量筛选及其在血吸虫病诊断中的应用，本发明还涉及一类血吸虫阳性抗原，并提供这些抗原在血吸虫病诊断和疫苗制备中的应用。

背景技术

血吸虫病是一种严重威胁人类健康的人畜共患病，全球每年因血吸虫病死亡人数约28万。经过几十年的努力，我国血吸虫病防治工作取得了举世瞩目的成就，然而目前我国仍有现症感染人群约50万，尤其是目前大量人口流动，加之人们对血吸虫病防范意识松懈，导致我国血吸虫病防治形势不容乐观，防治任务依然艰巨。

血吸虫的诊断是防治血吸虫的重要前提和手段之一。精确的诊断技术不仅可以用于患者确诊，还可用于划分流行区等级、评估流行态势和考核防控效果等。

目前血吸虫病诊断方法主要有三种，一是病原学检测方法，二是免疫学检测方法，三是分子生物学检测方法。病原学检测方法主要包括虫卵检测法(Kato-Katz Technique)和毛蚴孵化法(Hatching Test)。免疫学检测方法主要有间接红血球凝集试验(Indirect Hemagglutination Assay，IHA)、酶联免疫吸附试验(Enzyme-Linked Immunosorbent Assay，ELISA)、环卵沉淀试验(Circum OvalPrecipitating Test，COPT)以及斑点免疫金渗滤试验(DotimmunogoldfiltrationAssay，DIGFA)。分子生物学方法是通过血吸虫特异的核酸扩增技术来进行诊断。

以上三种方法各有优缺点：病原学检测结果虽然目前仍然是血吸虫病确诊的金标准，但是病原学检测敏感度低，费时费力，同时还有污染环境的危险。免疫学方法中的环卵沉淀试验(COPT)和间接红血球凝集试验(IHA)特异性高，但敏感性低，不能广泛使用。分子生物学的检测方法敏感性高，但易出现假阳性，同时该方法对实验条件要求较高，目前仅停留在实验室研究阶段，无法广泛应用。

相比而言，ELISA技术具有操作简单、敏感度高、易标准化等优点，并且广泛应用在多种疾病诊断中，因此是血吸虫病诊断优先发展的方向。ELISA技术的关键是抗原的选择。目前市场上血吸虫抗体诊断ELISA使用的抗原是虫卵可溶性抗原(SEA)，但SEA是粗抗原，成分比较复杂，受个体生理和环境情况影响很大，使得SEA-ELISA的特异性较差，容易出现交叉反应，无法区分现症感染和既往感染。此外，虫卵可溶性抗原SEA通常要从动物肝脏中的虫卵提取，检测条件难以精确控制，且SEA-ELISA的方法成本较高，因此导致批次间的结果不稳定，无法产业应用。

利用基因工程技术生产重组蛋白是替代SEA的潜在新型抗原。重组抗原具有产量高、价格低、交叉反应少等优点，但抗原的选择依然是制约产业应用的瓶颈。关键目前本领域内还没有有效的、高敏感性、高特异性的抗原分子用作ELISA反应检测血吸虫。因此本领域迫切需要开发用于血吸虫病诊断和防治的新靶标抗原分子。

发明内容

本发明的目的在于提供一类用于日本血吸虫的阳性抗原及其用途。

本发明的另一目的在于提供一种高通量血吸虫抗原的筛选方法。

本发明的另一目的在于提供一种血吸虫病诊断试剂和试剂盒。

在本发明的第一方面，提供了一种血吸虫阳性抗原，所述抗原选自：

(a)氨基酸序列如SEQ ID NO：1-24所示的多肽：

(b)将SEQ ID NO：1-24氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基取代、缺失或添加而形成的具有免疫原性的衍生多肽；

(c)与SEQ ID NO：1-24所示氨基酸序列的同源性≥90％的、具有免疫原性的多肽；或

(d)具有免疫原性的多肽(a)-(c)的片段。

在另一优选例中，所述抗原的氨基酸序列如SEQ ID NO：1-8所示。

在另一优选例中，所述抗原用于制备检测血吸虫的试剂或试剂盒。

在本发明的第二方面，提供了一种分离的多核苷酸，包括一核苷酸序列，所述核苷酸序列选自下组：

(a)编码如本发明第一方面所述阳性抗原的多核苷酸；

(b)与多核苷酸(a)互补的多核苷酸。

在另一优选例中，所述多核苷酸编码具有SEQ ID NO：1所示氨基酸序列的抗原。

在本发明的第三方面，提供了一种载体，所述载体含有本发明的第二方面所述的多核苷酸。

在本发明的第四方面，提供了一种遗传工程化的宿主细胞，所述宿主细胞含有本发明的第三方面所述的载体或染色体整合有本发明的第二方面所述的多核苷酸。

在本发明的第五方面，提供了一种血吸虫阳性抗原的制备方法，所述方法包括步骤：

(a)在适合表达的条件下，培养本发明第四方面所述的宿主细胞；

(b)从培养物中分离出血吸虫阳性蛋白抗原。

在本发明的第六方面，提供了一种检测血吸虫的试剂盒，所述试剂盒包括：容器或载体；以及位于所述容器内或载体上的如本发明第一方面所述的阳性抗原。

在另一优选例中，所述试剂盒还包括酶结合液、反应底物和任选的说明书，较佳地，所述的试剂盒还可包括选自下组的组分：反应终止液、样本稀释液、和洗涤液。

在本发明的第七方面，提供了一种检测血吸虫的试剂，所述试剂包括：固相载体以及包被于所述固相载体上的本发明第一方面所述的阳性抗原。

在另一优选例中，所述的固相载体上包被有SjGP1(序列如SEQ ID NO：1所示)以及任选的选自序列如SEQ ID NO：2-24所示的一种或多种阳性抗原。

在另一优选例中，所述的试剂盒或试剂用于用于检测待测样本是否感染血吸虫。

在另一优选例中，所述待测样本来自血吸虫病流行区人群。

在另一优选例中，所述待测样本来自牛或其他哺乳动物。

在本发明的第八方面，提供了一种能与本发明第一方面所述的血吸虫阳性抗原特异性结合的抗体。

在另一优选例中，所述抗体是与氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示的阳性抗原结合的抗体。

在本发明的第九方面，提供了一种抗原-抗体复合物，所述的复合物包括：

(i)氨基酸序列如SEQ ID NO：1-8所示的阳性抗原；

(ii)与(i)阳性抗原特异性结合的抗体；

并且所述的抗原和抗体结合在一起。

在另一优选例中，所述复合物由氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示的阳性抗原及其特异性结合的抗体所构成。

在本发明的第十方面，提供了本发明第九方面所述的抗原-抗体复合物的用途，所述复合物用于：

(a)制备检测血吸虫的试剂或试剂盒；和

(b)用作检测血吸虫的阳性对照。

在另一优选例中，所述的检测是血清学检测。

在本发明的第十一方面，提供了一种高通量筛选血吸虫抗原的方法，包括步骤：

(1)将含有信号肽的候选蛋白抗原与标志蛋白GST进行融合表达；

(2)将步骤(1)得到的融合蛋白置于螯合了GSH的多孔板的孔中，从而捕获GST融合蛋白；

(3)将含有血吸虫抗体的血清置于步骤(2)的多孔板的孔中；

(4)筛选形成特异性抗原-抗体复合物的孔，所对应的候选蛋白即为血吸虫阳性抗原。

在另一优选例中，在步骤(2)中将5-100种(较佳地10-80种)GST融合蛋白置于多孔板的孔中。

在另一优选例中，步骤(3)所述待测样本为人或除人外的哺乳动物的血清。

在另一优选例中，步骤(3)所述的筛选方法是ELISA。

在本发明的第十二方面，提供了一种检测样本中是否感染血吸虫的方法，包括步骤：

(1)制备本发明第一方面所述的血吸虫阳性抗原；

(2)将步骤(1)得到的抗原与待检测的样本接触；

(3)检测样本中是否含有与本发明第一方面任一所述抗原结合的特异性抗体。

在另一优选例中，所述阳性抗原的氨基酸序列如SEQ ID NO：1-8所示。

应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。

附图说明

图1显示日本血吸虫重要抗原高通量筛选结果，共有24个阳性克隆(R≥2)。

图2显示SjGP1的表达与纯化结果：泳道1为破碎的菌体电泳结果；泳道2为破碎菌体上清电泳结果；泳道3为破碎菌体沉淀电泳结果；泳道4为纯化的蛋白电泳结果。

具体实施方式

本发明人经过长期而深入的研究，基于GST融合表达的高通量功能蛋白筛选技术，首次筛选到24个能被血吸虫病病人血清识别的阳性抗原，其中8个抗原呈现较强的阳性反应，将其中1个最强的阳性抗原SjGP1用作血吸虫病血清学检测，结果表明用此抗原检测血吸虫具有高敏感性和特异性。基于本发明，可用于制备诊断和监测血吸虫病的试剂或试剂盒。在此基础上完成了本发明。

血吸虫及其组学研究

血吸虫严重危害人类及其他哺乳动物的健康，其中日本血吸虫是最重要的血吸虫种类，因其在日本首次发现，故得名。目前日本、菲律宾、印度尼西亚和我国南方是日本血吸虫的高发区。急性血吸虫病的发病机制尚不清楚，对于血吸虫的治疗也因受地域和人群的不同而不能取得良好的防治效果。

为了筛选新的诊断和治疗靶点，1994年世界卫生组织(WHO)启动了血吸虫基因组计划，并且在近几年，血吸虫研究取得了巨大进展，日本血吸虫的基因组草图已经绘制完成，并注释了超过一万条基因，同时EST数据库、蛋白质组数据库也已建立。这些重要的数据库不仅可以用于在分子水平研究血吸虫的生长发育机制，探讨血吸虫-宿主相互作用机理，更重要的是可以服务于血吸虫病防治新方法的研究、筛选新型诊断分子、候选疫苗分子和药物新靶点等。但是，目前还没有办法能直接从血吸虫基因组、蛋白质组或转录组中明确哪些分子是我们所需要的靶标。因此迫切需要一些新的技术能将组学数据与具体的研究领域结合。免疫组学(immunomics)就是衔接免疫学和基因组学的交叉学科，它利用免疫学的技术手段从基因组、蛋白质组和转录组中筛选出与宿主免疫系统相互作用的一组分子，即免疫组(immunome)。免疫组中的分子具有用于疾病免疫学诊断巨大潜在价值，是血吸虫后基因组时代研究的重要内容。如何从免疫组中筛选出可用于血吸虫病诊断和防治的新靶标，已成为本领域研究人员迫切需要解决的问题。

阳性抗原

在本发明中，术语“抗原”或“阳性抗原”可互换使用，都指能够与血吸虫抗体特异结合的蛋白或多肽。抗原是指能够刺激机体产生(特异性)免疫应答，并能与免疫应答产物抗体和致敏淋巴细胞在体外结合，发生免疫效应(特异性反应)的物质。抗原的基本特性有两种，一是诱导免疫应答的能力，也就是免疫原性，二是与免疫应答的产物发生反应，也就是抗原性。

如本文所用，“分离的”是指物质从其原始环境中分离出来(如果是天然的物质，原始环境即是天然环境)。如活体细胞内的天然状态下的多聚核苷酸和蛋白是没有分离纯化的，但同样的多聚核苷酸或蛋白如从天然状态中同存在的其他物质中分开，则为分离纯化的。“分离的阳性抗原”是指所述抗原基本上不含天然与其相关的其它蛋白、脂类、糖类或其它物质。本领域的技术人员能用标准的蛋白质纯化技术纯化阳性抗原。基本上纯的蛋白抗原在非还原聚丙烯酰胺凝胶上能产生单一的主带。抗原的纯度能用氨基酸序列分析。

本发明的抗原可以是天然纯化的产物，或是化学合成的产物，或使用重组技术从原核或真核宿主(例如，细菌、酵母、高等植物、昆虫和哺乳动物细胞)中产生。根据重组生产方案所用的宿主，本发明的抗原可以是糖基化的和非糖基化的。本发明的抗原还可包括或不包括起始的甲硫氨酸残基。

本发明还包括抗原的片段、衍生物和类似物。如本文所用，术语“片段”、“衍生物”和“类似物”是指基本上保持本发明的天然抗原相同的生物学功能或活性的抗原。本发明的抗原片段、衍生物或类似物可以是(i)有一个或多个保守或非保守性氨基酸残基(优选保守性氨基酸残基)被取代的抗原，而这样的取代的氨基酸残基可以是也可以不是由遗传密码编码的，或(ii)在一个或多个氨基酸残基中具有取代基团的抗原，或(iii)抗原与另一个化合物(比如延长抗原半衰期的化合物，例如聚乙二醇)融合所形成的抗原，或(iv)附加的氨基酸序列融合到此抗原序列而形成。这些片段、衍生物和类似物属于本领域熟练技术人员公知的范围。

在本发明中，术语“抗原”还包括具有相同功能的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)：一个或多个(通常为1-50个，较佳地1-30个，更佳地1-20个，最佳地1-10个)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一个或数个(通常为20个以内，较佳地为10个以内，更佳地为5个以内)氨基酸。例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的功能。

修饰(通常不改变一级结构)形式包括：体内或体外的抗原的化学衍生形式如乙酰化、羧基化、糖基化。修饰形式还包括具有磷酸化氨基酸残基(如磷酸酪氨酸，磷酸丝氨酸，磷酸苏氨酸)的序列。

抗原编码序列

编码本发明抗原的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因组DNA或人工合成的DNA。DNA可以是单链的或是双链的。DNA可以是编码链或非编码链。术语“编码本发明抗原的多核苷酸”可以是包括编码此抗原的多核苷酸，也可以是还包括附加编码和/或非编码序列的多核苷酸。

本发明还涉及上述多核苷酸的变异体。此多核苷酸的变异体可以是天然发生的等位变异体或非天然发生的变异体。这些核苷酸变异体包括取代变异体、缺失变异体和插入变异体。本发明还涉及与上述的序列杂交且两个序列之间具有至少50％，较佳地至少70％，更佳地至少80％相同性的多核苷酸。本发明特别涉及在严格条件下与本发明所述多核苷酸可杂交的多核苷酸。

本发明的核苷酸序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。对于PCR扩增法，可根据本发明所公开的有关核苷酸序列，尤其是开放阅读框序列来设计引物，并用市售的cDNA库或按本领域技术人员已知的常规方法所制备的cDNA库作为模板，扩增而得有关序列。一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。此外，还可用人工合成的方法来合成有关序列，尤其是片段长度较短时。通常，通过先合成多个小片段，然后再进行连接可获得序列很长的片段。可以完全通过化学合成来得到编码本发明抗原(或其片段，或其衍生物)的DNA序列。然后可将该DNA序列引入本领域中已知的各种现有的DNA分子(或如载体)和细胞中。此外，还可通过化学合成将突变引入本发明抗原序列中。

应用PCR技术扩增DNA/RNA的方法(Saiki，et al.Science 1985；230：1350-1354)被优选用于获得本发明的基因。用于PCR的引物可根据本文所公开的本发明的序列信息适当地选择，并可用常规方法合成。

抗原制备方法

本发明抗原的制备方法有以下步骤：

(1).用编码本发明阳性抗原的多核苷酸(或变异体)，或用含有该多核苷酸的重组表达载体转化或转导合适的宿主细胞；

(2).在合适的培养基中培养的宿主细胞；

(3).从培养基或细胞中分离、纯化本发明抗原。

本发明中，多核苷酸序列可插入到重组表达载体中。本领域的技术人员熟知的方法能用于构建含抗原编码DNA序列和合适的转录/翻译控制信号的表达载体。包含上述适当DNA序列以及适当启动子或者控制序列的载体，可以用于转化适当的宿主细胞，以使其能够表达蛋白质。

宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞，如哺乳动物细胞。代表性例子有：大肠杆菌，链霉菌属；鼠伤寒沙门氏菌的细菌细胞；真菌细胞如酵母；植物细胞；果蝇S2或Sf9的昆虫细胞；CHO、COS、293细胞、或Bowes黑素瘤细胞的动物细胞等。用重组DNA转化宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。当宿主为原核生物如大肠杆菌时，能吸收DNA的感受态细胞可在指数生长期后收获，用CaCl₂法处理，所用的步骤在本领域众所周知。另一种方法是使用MgCl₂。如果需要，转化也可用电穿孔的方法进行。当宿主是真核生物，可选用如下的DNA转染方法：磷酸钙共沉淀法，常规机械方法如显微注射、电穿孔、脂质体包装等。

获得的转化子可以用常规方法培养，表达本发明抗原蛋白。根据所用的宿主细胞，培养中所用的培养基可选自各种常规培养基。在适于宿主细胞生长的条件下进行培养。当宿主细胞生长到适当的细胞密度后，用合适的方法(如温度转换或化学诱导)诱导选择的启动子，将细胞再培养一段时间。

抗原蛋白可在细胞内、或在细胞膜上表达、或分泌到细胞外。如果需要，可利用其物理的、化学的和其它特性通过各种分离方法分离和纯化抗原蛋白。这些方法是本领域技术人员所熟知的。这些方法的例子包括但并不限于：常规的复性处理、用蛋白沉淀剂处理(盐析方法)、离心、渗透破菌、超处理、超离心、分子筛层析(凝胶过滤)、吸附层析、离子交换层析、高效液相层析(HPLC)和其它各种液相层析技术及这些方法的结合。

抗原筛选方法

本发明基于谷胱甘肽-S-转移酶(GST)融合蛋白表达的方法进行高通量蛋白抗原筛选，包括步骤：(1)利用生物信息学的方法预测日本血吸虫表达序列标签(EST)数据库中含有信号肽的蛋白，在本发明的一个优选例中，数据库优选NCBI的蛋白质序列，预测软件优选SignalP 3.0(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)；(2)扩增各信号肽蛋白对应的目的基因，将目的基因克隆至表达载体，较佳地表达载体为GST表达载体，转化大肠杆菌后诱导菌体表达抗体-GST融合蛋白；(3)将融合蛋白置于螯合了GSH的多孔板的孔中，捕获GST融合蛋白；(4)将含有血吸虫抗体的血清置于多孔板的中，进行抗原抗体检测，筛选形成特异性抗原-抗体复合物的孔，所对应的候选蛋白即为血吸虫阳性抗原。在另一优选例中，可以同时将5-100种(较佳地10-80种)GST融合蛋白置于多孔板的孔中，从而实现高通量筛选。

试剂盒

本发明还提供了一种检测血吸虫的试剂盒。一般地，本发明的试剂盒包括以下组分：容器或载体；以及位于所述容器内或载体上的本发明第一方面所述的阳性抗原。在另一优选例中，所述试剂盒还包括酶结合液、反应底物和任选的说明书。较佳地，所述的试剂盒还可包括选自下组的组分：反应终止液、样本稀释液、和洗涤液。一种优选的可用于检测日本血吸虫的试剂盒包括：容器以及位于容器内的包被液、辣根过氧化物酶标记的鼠抗人IgG(H+L)抗体、底物液TMB、稀浓硫酸反应终止液和样本稀释液。更佳地，还含有空白对照、阳性和阴性对照和作以监控检测过程是否符合标准。

疫苗及药物组合物

本发明还提供了一种疫苗和抗原药物组合物。本发明的疫苗和抗原药物组合物包括至少一种有效量的本发明的蛋白抗原以及药学上可接受的佐剂和/或载体。常用的疫苗佐剂可分为4类：无机佐剂，如氢氧化铝，明矾等；有机佐剂，微生物及其产物如分枝杆菌(结核杆菌、卡介苗)、短小杆菌、百日咳杆菌、内毒素、细菌提取物(胞壁酰二肽)等；合成佐剂，如人工合成的双链多聚核苷酸(双链多聚腺苷酸、尿苷酸)、左旋咪唑、异丙肌苷等；油剂，如费氏佐剂、花生油乳化佐剂、矿物油、植物油等。常用的载体包括(但并不限于)：盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其组合。通常药物制剂应与给药方式相匹配，本发明的药物组合物可以被制成针剂形式，例如用生理盐水或含有葡萄糖和其他辅剂的水溶液通过常规方法进行制备。所述的药物组合物宜在无菌条件下制造。本发明抗原的有效量可以由本领域普通技术人员根据各种因素来确定(例如通过临床试验)。通常每天以约0.00001mg-50mg/kg动物体重(较佳的0.0001mg-10mg/kg动物体重)的剂量给予，能得到令人满意的防治效果。配制好的抗原药物组合物可以通过常规途径进行给药，其中包括(但并不限于)：口服、肌内、腹腔内、静脉内、皮下、皮内。

本发明的主要优点在于：

1.抗原灵敏度高，如SjGP1抗原蛋白检测血吸虫不受检测样本感染度的影响，在EPG＜10的情况下依然能够检出，敏感度达到90％。

2.高特异性，本发明的抗原检测待测样本，其假阳率仅有1.1％，远远低于市售的SEA法的7.5％。

3.操作简便，抗原可以使用通用的ELISA法读取荧光强度值。

4.结果稳定，重复性高。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室指南(New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和分数按重量计算。

实施例1  日本血吸虫重要抗原的高通量筛选

1.预测日本血吸虫的分泌蛋白：从国家人类基因组南方研究中心和NCBI下载日本血吸虫EST数据库，以及对应的蛋白质序列；将蛋白质序列导入信号肽在线预测软件SignalP 3.0(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)进行预测；根据预测结果，按照p值大于0.1，选定预测为信号肽蛋白的序列。

2.基因克隆：抽提血吸虫的总RNA；通过RT-PCR扩增目的基因，回收目的片段，酶切，将目的片段克隆到市售的表达载体pGEX-4T-1；转化市售大肠杆菌Top10，阳性克隆经测序确认序列正确。

3.重组蛋白诱导表达：抽提质粒，将pGEX-4T-1重组质粒转化市售的大肠杆菌Bl21；挑取单克隆，接种96孔细菌深孔培养板，37℃，250rpm培养过夜后按1％比例接种96孔细菌深孔培养板，每孔含有1ml 2×YT(含100μg/mlAmp)液体培养基，37℃ 250rpm培养约三小时，至OD₆₀₀＝0.4-1.0；加入IPTG至终浓度1mmol/L，37℃，250rpm诱导目的蛋白表达；诱导表达6h，停止培养；收集菌体，-80℃冻存备用。

4.包涵体的溶解：反复冻融菌体2次；加入300μl B-PER(另加入DNase、RNase、PMSF)裂解菌体，吹打混匀，转至EP管中；13,000rpm室温离心5min；移出上清至新的Ep管中，冷冻保存备用，沉淀即为包涵体；用含1％ Triton-X100的PBS作为洗涤液，洗涤包涵体并混匀，13,000rpm室温离心，5min，弃上清；重复洗涤步骤，再一次离心弃上清；用包涵体溶解液溶解包涵体，1ml诱导菌液大约能得到0.1g包涵体沉淀，加入1ml溶解液，吹打混匀，室温摇过夜，充分溶解包涵体。

5.包涵体复性：将溶解后的溶液以13,000rpm室温离心5min，取上清；在96孔深孔培养板中，每孔加入50μl变性所得溶液和1ml复性液；混匀，室温摇过夜；离心收集上清。

6.血清吸附：将pGEX-4T-1质粒转化大肠杆菌Bl21(DE3)，按照前面的表达方法制备GST表达菌液以及Bl21菌液各100ml，离心收集菌体，用10ml PBS重悬，超声破碎后收集上清备用；将1ml柱体积GSH填料、3ml GST表达上清和9ml PBS混合，室温混1h，1000rpm离心收集沉淀，再用10ml PBS洗涤五次，此时填料上结合了GST蛋白；用10ml PBS重悬GST/填料，分装1.9ml每管；加100μl病人血清到分装管中，室温混匀5h，此步骤是吸附血清中抗GST的抗体；1000rpm离心5min，去除填料，收集上清，此时血清稀释度是1∶20；将3mlBl21(DE3)裂解上清加入2ml的GST吸附过的血清中，室温混匀5h，此步骤是吸附抗细菌蛋白的抗体，此时血清稀释度是1∶50；13000rpm离心10min，每管分装500μl，冻存备用。

7.血清阳性克隆的筛选：在GSH-微孔板中，每孔加20μl复性蛋白液和80μlPBS，4℃过夜孵育；同时设GST表达菌液作为阴性对照，PBS作为空白对照，在筛选到阳性蛋白后，以此克隆作为阳性对照，微孔板排布如表1。

表1

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B

B

-

-

+

+

其中“B”表示空白对照，“-”表示阴性对照，“+”表示阳性对照。

PBST(PBS+吐温)洗涤五次；200μl 5％奶粉/PBST，室温封闭2h；PBST洗涤五次；吸附过的血清按照1∶20用5％奶粉稀释，最终血清的稀释度是1∶1000；100μl/孔，37℃结合1h；PBST洗涤五次；按照1∶20,000，稀释HRP酶标记的鼠抗人IgG(H+L)抗体，100μl/孔，37℃结合1h；PBST洗涤5次；加100μl市售商品SuperSignal ELISA Femto进行检测，在425nm处读取荧光强度值；计算样本和阴性对照荧光强度的比值R，根据R大小判断是否为阳性蛋白，若R≥2，则判定为阳性，R的计算公式如下：

结果如图1所示，从218个日本血吸虫分泌蛋白中，筛选了24个阳性克隆，其氨基酸序列分别如SEQ ID NO：1-24所示，其中有8个强阳性克隆(R≥10)其序列分别如SEQ ID NO：1-8所示。

实施例2  强阳性克隆诊断敏感性的比较

选择R≥10的8个强阳性抗原(序列的分别为SEQ ID NO：1-8)，分别吸附到GSH-微孔板上，同时设GST(谷胱甘肽-S-转移酶)表达菌液作为阴性对照，PBS作为空白对照；PBST洗涤五次；200μl 5％奶粉/PBST，室温封闭2h；PBST洗涤五次；吸附过的血清按照1∶20用5％奶粉稀释，最终血清的稀释度是1∶1000；100μl/孔，37℃结合1h；PBST洗涤五次；按照1∶20,000，稀释HRP酶标记的鼠抗人IgG(H+L)抗体，100μl/孔，37℃结合1h；PBST洗涤5次；加100μl市售商品Super Signal ELISA Femto进行检测，在425nm处读取荧光强度值；计算R值。并与样本每克肝卵数目(EPG)比较，检测抗原的敏感性。比较结果见表2。

表2

结果表明，1号蛋白(SjGP1)诊断敏感性最高，为100％，在14个病人血清样本中均有阳性反应，3、5、6和8号蛋白敏感性在50％以上，2、4号敏感性为42.80％，7号敏感性只有28.5％。

分析血清诊断阴性的个体发现，EPG的数目与敏感性有关，对中度感染者(EPG＝101-400)，8个克隆的敏感性均较高；但对于轻度感染者(EPG＝1-100)，除了1、6号蛋白外，其余克隆的敏感性较低。

当前我国疫区疫情呈现低感染率和低感染度的趋势，因此1号蛋白表现出来的不受感染度影响的优势，显得尤为重要。本发明人在以下实施例中对此蛋白将进一步研究。

实施例3  一号蛋白SjGP1的表达和纯化

1.pET28(a)表达载体的构建：从重组pGEX-4T-1上酶切下SjGP1基因，将其连接到pET28(a)载体上，通过Kan⁺平板筛选阳性克隆。

2.SjGP1蛋白的表达：将重组pET28(a)载体转化Bl21(DE3)表达菌株，挑取阳性克隆制备种子液，按照1％接种到三角烧瓶中，37℃ 250rpm摇瓶培养3h；加IPTG诱导表达，IPTG终浓度为1mM，继续37℃ 250rpm培养5h。

3.细菌细胞裂解：收集细菌，将细菌冻融两次；将冻融两次后的细菌用10ml细菌蛋白提取试剂B-PER(另加入DNase、RNase、PMSF等)裂解菌体，转移到烧杯中，缓慢搅拌30min，超声处理10min。

4.包涵体的处理：洗涤包涵体：15000rpm离心10min，收集沉淀；将沉淀用100ml包涵体洗涤液重悬：先打散沉淀，转移到烧杯中，然后超声1-2min，彻底冲散沉淀，缓慢搅拌30min(洗涤液配方：0.5M尿素，0.1M NaH₂PO₄，0.01MTris-HCl，0.5％ Triton-X100，pH＝8.0)。

溶解包涵体：将沉淀用100ml包涵体溶解液溶解：超声1-2min，彻底冲散沉淀，缓慢搅拌30min；15000rpm离心10min，收集上清(溶解液配方：8M尿素，0.1M NaH₂PO₄，0.01M Tris-HCl，pH＝8.0)。

5.Ni柱纯化：Ni柱用溶解液平衡；按照1ml柱体积对应10ml蛋白液，将二者混合，200rpm，室温孵育30min；将混合液上柱，收集柱后液体；用10倍柱体积洗涤液洗涤，收集洗涤液(Ni柱洗涤液配方：8M尿素，0.1M NaH₂PO₄，0.01M Tris-HCl，10mM咪唑，pH＝8.0)；用10倍柱体积洗脱液洗脱：收集洗脱液，1ml/管(Ni柱洗脱液配方：8M尿素，0.1M NaH₂PO₄，0.01M Tris-HCl，500mM咪唑，pH＝8.0)；SDS-PAGE检测每个收集管中的蛋白纯度。

6.蛋白复性：将纯化的蛋白溶液按照体积比1∶10，在复性液中透析复性，4℃，每隔5小时换新鲜的复性液，换3次；将经过复性的蛋白按照体积比1∶10，在含10％甘油的PBS中透析，4℃，每隔5小时换新鲜的透析液，换3次；SDS-PAGE检测；浓缩管浓缩蛋白溶液至1ml左右，测定蛋白浓度。

结果如图2所示，泳道1为破碎的菌体；泳道2为破碎菌体上清；泳道3为破碎菌体沉淀；泳道4为纯化的蛋白。由此看出，SjGP1以包涵体形式表达，通过蛋白纯化和复性获得了高纯度的可溶性重组蛋白。

实施例4  制备日本血吸虫病酶联免疫诊断试剂盒

1.包被抗原的固相载体：将蛋白抗原SjGP1包被在聚苯乙烯反应孔中，包被液配方：1.5g Na₂CO₃和NaHCO₃溶解在1000ml蒸馏水中。

2.制备酶结合液采用HRP酶标记的鼠抗人IgG(H+L)抗体(Promega)。

3.制备酶的底物液：TMB A液(每ml 0.005％醋酸钠-柠檬酸缓冲液中含有3.2μl 1.5％H₂O₂，4℃避光保存)；TMB B液(TMB 0.08g，加入40ml DMSO溶解后，加60ml甲醇，混匀后加100ml 0.005％醋酸钠-柠檬酸缓冲液，避光振荡1小时，室温放置3小时，4℃避光保存)；用前，A液和B液等体积混合。

4.制备酶反应终止液：于600ml ddH₂O中缓慢滴加100ml浓硫酸，不断搅拌，定容至900ml。

5.制备样本稀释液：5％奶粉/PBST。

6.制备洗涤液：PBST。

实施例5  检测方法及操作程序

1.样本稀释：用样本稀释液按照1∶100稀释待检血清。

2.加样反应：样本检测孔每孔加100μl稀释后的血清样本，每个样本平行检测2个复孔。同时设阳性、阴性和空白对照个2复孔，取阳性和阴性对照品各100μl加入孔内，空白对照仅加样本稀释液。37℃，避光孵育60分钟。

3.洗涤：甩干孔内液体，每孔用洗涤液注满，静置2分钟，甩干，重复洗涤4次，最后一次拍干。

4.加酶：每孔加100μl辣根过氧化物酶(HRP酶)标记的鼠抗人IgG(H+L)抗体，37℃避光孵育1小时，如上洗涤，拍干。

5.显色：每孔加100μl酶底物显色液，37℃避光孵育10分钟；加终止液50μl，立即用酶标仪检测。

6.读数及数据处理：用空白对照调零，于波长450nm处读取OD值；待测孔OD值大于或等于阴性对照2.1倍者为阳性，当阴性对照OD值低于0.05时按0.05计算。

实施例6  试剂盒特异性

收集上海地区正常人血清样本174份，评价在正常人群中本试剂盒(SjGP1-ELISA)的假阳性率，并与常用的市售试剂盒SEA-ELISA进行比较。正常人群中SEA-ELISA和38-ELISA假阳性率比较结果见表3

表3

*：p＝0.006

如表3所示，在174份正常人血清样本中，用SEA-ELISA方法检测到13例假阳性样本，假阳性率达到7.5％；而用SjGP1-ELISA方法只检测到2例假阳性，假阳性率仅有1.1％。Fisher’s精确检验，p＝0.006，具有显著差异。以上结果说明，SjGP1-ELISA比SEA-ELISA具有更好的特异性。

实施例7  试剂盒敏感性

样品采集：从湖南、江西两省疫区分四次收集到302份虫卵阳性病人血清，其中湖南省两次分别收集了110份和34份血清，江西省两次分别收集了84份和74份血清。采用粪检阳性血吸虫病病人的血清样本，评价市售试剂盒SEA-ELISA和SjGP1-ELISA法的敏感性。检测结果如表4所示。

表4

*：p＜0.05

湖南2010年110份样本中，SEA-ELISA阳性数为78份，敏感度为70.9％，SjGP1-ELISA阳性数是96份，敏感度为87.3％；湖南2009年34份样本中，SEA-ELISA阳性数是33份，敏感度为97.1％，SjGP1-ELISA阳性数是34份，敏感度为100％；江西2010年74份样本中，SEA-ELISA阳性数是71份，敏感度为95.9％，SjGP1-ELISA阳性数是71份，敏感度为95.9％；江西2009年84份样本中，SEA-ELISA阳性数是61份，敏感度为72.6％，SjGP1-ELISA阳性数是72份，敏感度为85.7％。除了江西74份血清组，SEA-ELISA和SjGP1-ELISA敏感度相同外，其余3组血清中，SjGP1-ELISA敏感度均高于SEA-ELISA，其中湖南110份血清组和江西84份血清组敏感度具有显著差异(χ² ₁₁₀＝8.906，p＝0.003；χ² ₈₄＝4.307，p＝0.037)。合并四组共计302份血清中，SEA-ELISA敏感度为80.5％，SjGP1-ELISA敏感度为90.4％，两者之间的差异显著(χ²＝11.971，p＝0.001)。

以往的大量研究表明，SEA-ELISA的敏感度在80-95％左右，本研究结论与此前研究结论基本一致。SjGP1-ELISA敏感度达到90％，比SEA-ELISA高出约10个百分点，显示了较好的敏感性。此外，由于SEA是混合抗原，难以做到精确的质量控制，因此不同批次间往往会有一定的误差，而SjGP1蛋白是重组抗原，可以做到精确的质量控制，减少批次间的差异。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims (15)

1.一种血吸虫阳性抗原，其特征在于，所述抗原选自：

(a)氨基酸序列如SEQ ID NO：1-24所示的多肽：

(b)将SEQ ID NO：1-24氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基取代、缺失或添加而形成的具有免疫原性的衍生多肽；

(c)与SEQ ID NO：1-24所示氨基酸序列的同源性≥90％的、具有免疫原性的多肽；或

(d)具有免疫原性的多肽(a)-(c)的片段。

2.如权利要求1所述的阳性抗原，其特征在于，所述抗原的氨基酸序列如SEQ ID NO：1-8所示。

3.权利要求1所述阳性抗原的用途，其特征在于，所述抗原用于制备检测血吸虫的试剂或试剂盒。

4.一种分离的多核苷酸，其特征在于，包括一核苷酸序列，所述核苷酸序列选自下组：

(a)编码如权利要求1所述阳性抗原的多核苷酸；

(b)与多核苷酸(a)互补的多核苷酸。

5.如权利要求4所述的多核苷酸，其特征在于，所述多核苷酸编码具有SEQID NO：1所示氨基酸序列的抗原。

6.一种载体，其特征在于，该载体含有权利要求4所述的多核苷酸。

7.一种遗传工程化的宿主细胞，其特征在于，它含有权利要求6所述的载体或染色体整合有权利要求4所述的多核苷酸。

8.一种血吸虫阳性抗原的制备方法，其特征在于，所述方法包括步骤：

(a)在适合表达的条件下，培养权利要求7所述的宿主细胞；

(b)从培养物中分离出血吸虫阳性蛋白抗原。

9.一种检测血吸虫的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括：容器或载体；以及位于所述容器内或载体上的如权利要求1所述的阳性抗原。

10.一种检测血吸虫的试剂，其特征在于，所述试剂包括：固相载体以及包被于所述固相载体上的权利要求1所述阳性抗原。

11.一种能与权利要求1所述的血吸虫阳性抗原特异性结合的抗体。

12.一种抗原-抗体复合物，其特征在于，所述的复合物包括：

(i)氨基酸序列如SEQ ID NO：1-8所示的阳性抗原；

(ii)与(i)阳性抗原特异性结合的抗体；

并且所述的抗原和抗体结合在一起。

13.如权利要求12所述的复合物，其特征在于，所述复合物由氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示的阳性抗原及其特异性结合的抗体所构成。

14.权利要求12所述的抗原-抗体复合物的用途，其特征在于，所述复合物用于：

(a)制备检测血吸虫的试剂或试剂盒；和

(b)用作检测血吸虫的阳性对照。

15.一种高通量筛选血吸虫抗原的方法，其特征在于，包括步骤：

(1)将含有信号肽的候选蛋白抗原与标志蛋白GST进行融合表达；

(2)将步骤(1)得到的融合蛋白置于螯合了GSH的多孔板的孔中，从而捕获GST融合蛋白；

(3)将含有血吸虫抗体的血清置于步骤(2)的多孔板的孔中；

(4)筛选形成特异性抗原-抗体复合物的孔，所对应的候选蛋白即为血吸虫阳性抗原。

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