CN109536458A

CN109536458A - 用于治疗和控制植物病害的方法和组合物

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Publication number: CN109536458A
Application number: CN201811190160.1A
Authority: CN
Inventors: 卡洛斯·F·冈萨雷斯; 斯蒂芬·J·埃亨; 马尤克·达斯; 赖兰·F·Iii·扬; 图沙尔·苏沃拉·鲍米克
Original assignee: Texas A&M University System
Current assignee: Texas A&M University System
Priority date: 2012-10-19
Filing date: 2013-10-18
Publication date: 2019-03-29
Also published as: EP2909317A2; JP2015534983A; PT2909317T; AU2013331060A1; GT201500091A; CN104994740B; CL2015000986A1; EA201590766A1; IN2015DN04230A; US9357785B2; EP2909317A4; HUE047411T2; US20160302426A1; BR112015008517A2; ES2774291T3; US10212941B2; MX2015004951A; JP6391579B2; WO2014063070A2; EP2909317B1

Abstract

本发明提供开发用于控制由苛养木杆菌(Xylella fastidiosa)引起的植物病害的基于有毒噬菌体的治疗的方法。本发明还提供分离和繁殖在黄单胞菌属(Xanthomonas)细菌宿主中对苛养木杆菌(X.fastidiosain)有毒的噬菌体和用于治疗或减少植物中苛养木杆菌感染症状的方法。本发明还提供分离和繁殖对地毯草黄单胞菌柑橘致病变种(Xanthomonas axonopodis pv.citri)有毒的噬菌体和用于治疗或减少植物中地毯草黄单胞菌柑橘致病变种感染症状的方法。

Description

用于治疗和控制植物病害的方法和组合物

本申请是2013年10月18日提交的发明专利申请201380054534.6的分案申请。

相关申请的交叉引用

本申请要求于2012年10月19日提交的美国临时申请号61/716,245和于2013年3月14日提交的美国临时申请号61/785,535的权益，二者通过引用完全结合于此。

关于联邦政府资助的研究的声明

依照下述，美国政府享有本发明的某些权利：动植物卫生检验局(APHIS)关于德克萨斯皮尔斯疾病研究与教育项目(Texas Pierce’s Disease Research&EducationProgram)的合作协议奖，协议号为11-8500-0955-CA，授予AgriLife研究；和Otsuka制药有限公司(Otsuka Pharmaceutical Co.，LTD)，协议号为406039，授予AgriLife研究。

序列表的并入

命名为“TAMC019WO_ST25.txt”的文件中所包含的序列表以电子形式提交并且通过引用结合在本文中，该文件在Microsoft Windows操作系统中测量为907kb，并且是在2013年10月17日生成的。

发明领域

本发明涉及植物病理学领域。更具体地，本发明涉及用于分离噬菌体和用于治疗由苛养木杆菌(Xylella fastidiosa)和地毯草黄单胞菌(Xanthomonas axonopodis)引起的植物病害的方法和组合物，包括作为细菌病毒的噬菌体的应用。

发明背景

在植物中，细菌可能引起多种病害，包括葡萄藤的皮尔斯病(Pierce’s Disease)和柑橘属植物的柑橘溃疡(Citrus Canker)。细菌感染植物组织，并且可能引起萎蔫、生长差、损害果实，甚至是植物死亡。感染可能通过风、雨、被污染的设备或媒介昆虫传播而发生，其迅速地传播到其他植物上，并且导致对所述植物的有害的作用和大量的农作物损失。这些病害的有效治疗需要一种治疗植物消除细菌的方法。

发明概述

在一方面，本发明提供繁殖其宿主范围包括苛养木杆菌(X.fastidiosain)的有毒噬菌体(bacteriophage或phage)的方法，所述方法包括用所述噬菌体感染黄单胞菌属(Xanthomonas)细菌的培养物，允许所述噬菌体繁殖，并且从所述培养物中分离噬菌体颗粒。在另一个实施方案中，所述黄单胞菌属细菌包括物种菌株EC-12。在另一个实施方案中，所述噬菌体通过结合细胞表面特征而感染细胞。在另一个实施方案中，所述细胞表面特征是IV型菌毛。在另一个实施方案中，所述噬菌体包括来自由podophage、siphophage和myophage组成的组的有尾噬菌体。在其他实施方案中，所述噬菌体是从环境、污水处理厂或流出物、植物或其表面或从环境土壤中分离的。在本发明的其他实施方案中，利用替代宿主(surrogate host)来富集有毒噬菌体。在另一个实施方案中，所述噬菌体对苛养木杆菌有毒。在其他实施方案中，利用琼脂覆盖(agar overlaying)来生长所述噬菌体。

在另一方面，本发明提供获得用于皮尔斯病的候选生物控制剂的方法，所述方法包括使苛养木杆菌和黄单胞菌属细菌与包含有毒噬菌体群体的样品接触，并且从所述群体分离至少第一种能够裂解所述苛养木杆菌和黄单胞菌属细菌的噬菌体。在一个实施方案中，所述噬菌体通过与细胞表面特征结合而感染细胞。在另一个实施方案中，所述细胞表面特征是IV型菌毛。在另一个实施方案中，所述细胞表面特征是细菌宿主的发病机制/毒力所需要的。其他实施方案包括使苛养木杆菌和黄单胞菌属中的至少一种的菌苔与样品接触，使苛养木杆菌和黄单胞菌属同时与样品接触，和使苛养木杆菌和黄单胞菌属先后与样品接触。在其他实施方案中，所述噬菌体是从环境、污水处理厂或流出物、植物或其表面或从环境土壤中分离的。在另一个实施方案中，所用的噬菌体是对苛养木杆菌(Xylellafastidiosa)有毒的。所述方法还包括在使宿主细菌与有毒噬菌体接触后，检测裂解的细菌宿主细胞或噬菌斑的形成。在具体的实施方案中，所述方法包括其上已经引入了噬菌体样品的平板琼脂覆盖物或细菌宿主细胞的平板。

在其他实施方案中，使用含有苛养木杆菌和黄单胞菌属的软琼脂覆盖物来制备噬菌体，并且在其他实施方案中，通过收集一种或多种包含表现出融合裂解的苛养木杆菌菌株或黄单胞菌属菌株(如EC-12)的覆盖平板，然后浸离并通过离心来澄清，来制备高滴度的噬菌体平板裂解物。滤器除菌后，可以保存得到的裂解物，例如，在4℃保存。随后，纯化高滴度噬菌体裂解物，例如，通过等密度CsCl离心进行，并且将提取的噬菌体溶液进行透析。得到的CsCl-纯化的噬菌体典型地展现出约1X10¹¹PFU/ml的滴度。

在一些实施方案中，植物组织滤出液(PTFs)中的噬菌体比率约为1ml PTF：20ml替代宿主(所选的宿主的活性生长培养物)，对于苛养木杆菌菌株Temecula生长4天或对于黄单胞菌属菌株EC-12生长4小时。

本发明的另一方面提供预防或减少植物中与苛养木杆菌相关的症状或病害的方法，所述方法包括使植物与其宿主范围包括苛养木杆菌的噬菌体接触，其中所述与苛养木杆菌相关的症状或病害包括典型的皮尔斯病(PD)症状，其中叶片沿着边缘表现出黄色或红色的现象，最终叶片边缘坏死。在一个实施方案中，可以将噬菌体颗粒引入到植物中。在另一个实施方案中，所述植物选自由下述组成的组：葡萄藤植物，柑橘属植物，杏树属(almond)，咖啡树，苜蓿(alfalfa)，夹竹桃(oleander)，栎属树(oak)，香枫(sweetgum)，紫荆属(redbud)，榆树(elm)，桃树，杏树(apricot)，李属(plum)，黑莓，桑树(mulberry)和梓柳(Chitalpa tashkentensis)。在另一个实施方案中，噬菌体通过注射、昆虫媒介(insectvector)引入到植物中或通过注射经由根系统引入到植物中。在其他实施方案中，注射包括针头或无针头系统、充气空气(pneumatic air)或压力注射系统。在其他实施方案中，注射是手工进行的，或者一次，或者多于一次。在另一个实施方案中，所述昆虫媒介是玻璃翅叶蝉(glassy winged sharpshooter)。在另一个实施方案中，要引入到植物中的噬菌体为1至10¹²PFU/ml(噬菌斑形成单位/ml)、10⁴至10¹¹PFU/ml和10⁷至10¹⁰PFU/ml。在另一个实施方案中，所述噬菌体颗粒通过下述方法获得：所述方法包括用所述噬菌体感染黄单胞菌属细菌的培养物，允许所述噬菌体繁殖，并且从所述培养物分离噬菌体颗粒。在另一个实施方案中，所述方法包括使植物群体与所述噬菌体颗粒接触，以预防或减少与苛养木杆菌相关的症状。在另一个实施方案中，所述噬菌体包括选自下述Xfas100噬菌体类型或Xfas300噬菌体类型的菌株中的至少一种噬菌体(bacteriophage或phage)。

在另一方面，本发明提供一种配制递送至植物的植物病害生物控制组合物，所述组合物包含至少一种稀释剂、辅药或表面活性剂，和至少一种来自下述Xfas100噬菌体类型或Xfas300噬菌体类型的噬菌体。在一个实施方案中，所述组合物进一步定义为配制用于通过注射、喷洒(spraying)、薄雾(misting)或粉末(dusting)引入到植物中。在另一个实施方案中，所述组合物进一步被定义为配制用于局部施用至植物。

在另一方面，本发明提供获得用于柑橘属溃疡的候选生物控制剂的方法，所述方法包括使地毯草黄单胞菌柑橘致病变种(Xanthomonas axonopodis pv.citri)细菌与包含有毒噬菌体群体的样品接触，并且从所述群体分离至少第一种能够裂解所述地毯草黄单胞菌(Xanthomonas axonopodis)细菌的噬菌体。在一个实施方案中，所述噬菌体通过结合细胞表面特征而感染细胞。在一个实施方案中，所述细胞表面特征是IV型菌毛。在另一个实施方案中，所述细胞表面特征是细菌宿主的发病机制/毒力所需要的。其他实施方案包括使黄单胞菌属的菌苔与样品接触。在另一个实施方案中，所用的噬菌体对地毯草黄单胞菌有毒。

本发明的另一方面提供预防或减少植物中与地毯草黄单胞菌相关的病害的方法，所述方法包括使植物与其宿主范围包括地毯草黄单胞菌的噬菌体接触。在一个实施方案中，可以将噬菌体颗粒引入到植物中。在一些实施方案中，所述植物是选自由柑橘属(Citrus)物种、金桔属(Fortunella)物种、枳属(Poncirus)物种、酸橙(lime)、柠檬(lemon)、橙子(orange)、葡萄柚(grapefruit)、柚子(pomelo)和用作砧木的枸橘(trifoliate orange)的杂交体组成的组柑橘属植物。在另一个实施方案中，噬菌体通过注射、昆虫媒介引入到植物中或通过注射经由根系统引入到植物中。在一些实施方案中，注射包括针头或无针头系统、充气空气或压力注射系统。在其他实施方案中，注射是手工进行的，或者一次，或者多于一次。在另一个实施方案中，所述昆虫媒介是玻璃翅叶蝉。在另一个实施方案中，要引入到植物中的噬菌体为1至10¹²PFU/ml(噬菌斑形成单位/ml)、10⁴至10¹¹PFU/ml和10⁷至10¹⁰PFU/ml的浓度。在另一个实施方案中，所述方法包括使植物群体与所述噬菌体颗粒接触，以预防或减少所述群体中与地毯草黄单胞菌及其致病变型相关的症状。在另一个实施方案中，所述噬菌体包括选自下述Xfas100噬菌体类型或Xfas300噬菌体类型的菌株中的至少一种噬菌体。

在另一方面，本发明提供对地毯草黄单胞菌Xfas303噬菌体有毒的分离的噬菌体，其中所述噬菌体的代表性样品已经保藏，保藏号为ATCC登记号PTA-13099。在另一方面，本发明提供对地毯草黄单胞菌和/或苛养木杆菌有毒的分离的噬菌体，如选自由下述组成的组的一种噬菌体：Xfas 101，Xfas102，Xfas103，Xfas104，Xfas105，Xfas106，Xfas107，Xfas108，Xfas109，Xfas110，Xfas301，Xfas302，Xfas304，Xfas305和Xfas306，其中所述噬菌体Xfas103、Xfas106、Xfas302、Xfas303、Xfas304和Xfas306的代表性的样品已经保藏，保藏号为ATCC登记号PTA-13095，PTA-13096，PTA-13097，PTA-13098，PTA-13099和PTA-13100。

在特定的实施方案中，本发明提供预防或减少植物中与苛养木杆菌或地毯草黄单胞菌柑橘致病变种(Xanthomonas axoxonopodis pv.Citri)相关的症状或病害或由苛养木杆菌或地毯草黄单胞菌柑橘致病变种(Xanthomonas axoxonopodis pv.Citri)引起的症状或病害的方法，所述方法包括使所述植物与有毒噬菌体接触的步骤，所述噬菌体在其宿主范围内包括苛养木杆菌和/或地毯草黄单胞菌柑橘致病变种，进一步地，其中所述噬菌体是选自由Xfas100噬菌体类型和Xfas300噬菌体类型组成的组的至少一种噬菌体，其中所述Xfas100型噬菌体具有选自由下述组成的组的至少一个特征：(a)所述噬菌体能够裂解所述苛养木杆菌和/或黄单胞菌属细菌；(b)所述噬菌体通过结合IV型菌毛感染细胞；(c)所述噬菌体属于一组这样的有尾噬菌体，所述噬菌体展现出长的非收缩性的尾部，具有直径在55-77mm范围内的衣壳，典型是管状病毒科(Siphoviridae)的形态；(d)所述噬菌体的基因组大小为约55500bp至56200bp；和(e)所述噬菌体预防或减少一种植物或多种植物中与皮尔斯病相关的症状；并且其中所述Xfas300型噬菌体具有选自由下述组成的组的至少一种特征：(a)所述噬菌体能够裂解所述苛养木杆菌和/或黄单胞菌属细菌；(b)所述噬菌体通过结合IV型菌毛感染细胞；(c)所述噬菌体属于一组这样的有尾噬菌体，所述噬菌体展现出短的非收缩性的尾部，具有直径在58-68mm范围内的衣壳，典型是短尾病毒科(Podoviridae)的形态；(d)噬菌体的基因组大小为约43300bp至44600bp；和(e)所述噬菌体具有预防或减少一种植物或多种植物中与皮尔斯病相关的症状的活性。在特定的实施方案中，向植物中引入单一类型的有毒噬菌体。在其他实施方案中，向植物中引入2、3、4、5、6或更多种有毒噬菌体分离株或类型的组合，同时引入或先后引入。在特定的实施方案中，所述噬菌体包含这样的基因组，所述基因组具有选自由SEQ ID NO:11-24组成的组的DNA序列，或与其至少90％、95％、98％或99％相同的DNA序列。因此，在特定的实施方案中，要引入到植物中的噬菌体选自由下述组成的组：Xfas101，Xfas102，Xfas103，Xfas104，Xfas105，Xfas106，Xfas107，Xfas110，Xfas301，Xfas302，Xfas303，Xfas304，Xfas305和Xfas306。还包括配置用于递送到植物中且包含所述Xfas100和/或Xfas300型噬菌体的植物病害生物控制组合物。所述生物控制组合物可以进一步包含载体。在一些实施方案中，所述载体可以包含稀释剂、表面活性剂和/或缓冲剂。

附图简述

为了更完整地理解本发明的特征和优点，现在结合附图参考本发明的详细描述，在附图中：

图1:显示噬菌体Xfas302、Xfas303、Xfas304和Xfas305的TEM图像，所述噬菌体具有短尾病毒科特有的形态和大小。

图2:显示噬菌体Xfas101、Xfas102、Xfas103和Xfas104的TEM图像，所述噬菌体具有管状病毒科特有的形态和大小。

图3:显示分离自废水的能够在XF15和EC-12上形成噬菌斑的苛养木杆菌的短尾病毒科和管状病毒科噬菌体。

图4:显示管状病毒科Xfas103和Xfas106的基因组图谱。

图5:显示短尾病毒科Xfas302、Xfas303、Xfas304和Xfas306的基因组图谱。

图6:显示用菌株XF54接种后8周并且不用噬菌体攻击的表现出皮尔斯病症状的葡萄藤植物。

图7:显示葡萄藤噬菌体治疗和预防性攻击研究的总结。

图8:显示在噬菌体接种后8周(上图)和12周(下图)在接种的葡萄藤中个体噬菌体的移动和存留。左图：在根组织中存在的噬菌体。中间图：在葡萄藤的防疫线(cordon)1存在的噬菌体。右图：在葡萄藤的防疫线2存在的噬菌体。

图9:显示3周后在用噬菌体混合物(cocktail)攻击的接种的葡萄藤中XF15的水平。在噬菌体混合物攻击后9周(细菌接种后12周)收集样品。左图：在根组织中存在的噬菌体。中间图：在葡萄藤的防疫线1存在的噬菌体。右图：在葡萄藤的防疫线2存在的噬菌体。灰色柱显示在XF15接种的葡萄树中的XF15水平。黑色柱显示在病原体接种后第3周用噬菌体混合物攻击的XF15接种的葡萄树中的XF15水平。箭头显示具有接种点的节段。每个柱表示3棵葡萄树的根和2个防疫线的平均CFU/gpt(克植物组织)。

图10:显示在初始用XF15接种并且3周后用噬菌体混合物攻击的葡萄藤中混合噬菌体的水平。在噬菌体混合物攻击后5、7和9周(初始细菌接种后8、10和12周)收集样品。左图：在根组织中存在的噬菌体。中间图：在葡萄藤的防疫线1存在的噬菌体。右图：在葡萄藤的防疫线2存在的噬菌体。黑色柱显示在混合物接种的植物中的噬菌体水平。灰色柱显示在病原体接种后第3周用噬菌体混合物攻击的XF15接种的葡萄树中的噬菌体水平。箭头表示具有接种点的节段。每个柱表示由3棵葡萄树的根和2个防疫线决定的混合物中4种噬菌体的平均CFU/gpt(克植物组织)。

图11:显示在初始用噬菌体混合物接种并且3周后用XF15攻击的葡萄藤中的噬菌体水平。在XF15攻击后5、7和9周(初始噬菌体接种后8、10和12周)收集样品。左图：在根组织中存在的噬菌体。中间图：在葡萄藤的防疫线1存在的噬菌体。右图：在葡萄藤的防疫线2存在的噬菌体。黑色柱显示在混合物接种的葡萄树中的噬菌体水平。灰色柱显示在噬菌体接种后第3周用XF15攻击的混合物接种的葡萄树中的噬菌体水平。箭头表示具有接种点的节段。每个柱表示由3棵葡萄树的根和2个防疫线决定的混合物中4种噬菌体的平均CFU/gpt(克植物组织)。

图12:显示噬菌体Xfas303在地毯草黄单胞菌柑橘致病变种菌株上的斑点滴定结果。

序列表简述

SEQ ID NO:1–设计用于苛养木杆菌gyrB的苛养木杆菌-特异性寡核苷酸正向引物。

SEQ ID NO:2–设计用于苛养木杆菌gyrB的苛养木杆菌-特异性寡核苷酸反向引物。

SEQ ID NO:3–设计用于噬菌体DNA引发酶基因的噬菌体Xfas304-特异性寡核苷酸正向引物。

SEQ ID NO:4–设计用于噬菌体DNA引发酶基因的噬菌体Xfas304-特异性寡核苷酸反向引物。

SEQ ID NO:5–设计用于噬菌体DNA引发酶基因的噬菌体Xfas303-特异性寡核苷酸正向引物。

SEQ ID NO:6–设计用于噬菌体DNA引发酶基因的噬菌体Xfas303-特异性寡核苷酸反向引物。

SEQ ID NO:7–设计用于噬菌体DNA解旋酶基因的噬菌体Xfas103-特异性寡核苷酸正向引物。

SEQ ID NO:8–设计用于噬菌体DNA解旋酶基因的噬菌体Xfas103-特异性寡核苷酸反向引物。

SEQ ID NO:9–设计用于噬菌体DNA解旋酶基因的噬菌体Xfas106-特异性寡核苷酸正向引物。

SEQ ID NO:10–设计用于噬菌体DNA解旋酶基因的噬菌体Xfas106-特异性寡核苷酸反向引物。

SEQ ID NO:11–噬菌体Xfas101的基因组序列。

SEQ ID NO:12–噬菌体Xfas102的基因组序列。

SEQ ID NO:13–噬菌体Xfas103的基因组序列。

SEQ ID NO:14–噬菌体Xfas104的基因组序列。

SEQ ID NO:15–噬菌体Xfas105的基因组序列。

SEQ ID NO:16–噬菌体Xfas106的基因组序列。

SEQ ID NO:17–噬菌体Xfas107的基因组序列。

SEQ ID NO:18–噬菌体Xfas110的基因组序列。

SEQ ID NO:19–噬菌体Xfas301的基因组序列。

SEQ ID NO:20–噬菌体Xfas302的基因组序列。

SEQ ID NO:21–噬菌体Xfas303的基因组序列。

SEQ ID NO:22–噬菌体Xfas304的基因组序列。

SEQ ID NO:23–噬菌体Xfas305的基因组序列。

SEQ ID NO:24–噬菌体Xfas306的基因组序列。

发明详述

提供下述定义和方法以更好地定义本发明，并指导本领域普通技术人员实施本发明。除非另外注释，术语应该按照相关领域普通技术人员的常规应用来理解。

本发明首次提供了允许有效繁殖和分离能够感染、在其中复制并且裂解苛养木杆菌和/或地毯草黄单胞菌(Xa)及其致病变型的噬菌体(bacteriophage或phage)的方法。本发明还提供了用于控制植物中的细菌病害的方法。可以按照本发明得到控制的植物病害可以包括，但不限于，皮尔斯病和柑橘溃疡。按照本发明可用的细菌种类可以包括，但不限于，木杆菌属(Xylella)物种，如苛养木杆菌，或黄单胞菌属物种，如地毯草黄单胞菌及其致病变型，如地毯草黄单胞菌柑橘致病变种(Xanthomonas axonopodis pv.Citri)(Xac)。

当用于本文时，“噬菌体(bacteriophage或phage)”是指细菌的病毒。用于本文时，“地毯草黄单胞菌”或“Xa”是指地毯草黄单胞菌细菌物种或其致病变型，其可以包括地毯草黄单胞菌柑橘致病变种(Xac)或地毯草黄单胞菌的任意其他的致病变型。目前，能够裂解苛养木杆菌的噬菌体的繁殖在实验室中是劳动量大的，使用苛养木杆菌宿主细胞和复杂、昂贵的固体形式的培养基。这可能需要7-10天才能产生少量的噬菌体。因此，本发明代表显著的进步，提供了能够感染苛养木杆菌的噬菌体的繁殖，其通过使所述噬菌体在快速生长的宿主细菌(如黄单胞菌属物种EC-12)中生长以快速产生噬菌体而进行；这命名为“替代宿主”方法。该技术快速且成本有效，能够使用本领域可获得的常规的培养基成分进行。该技术也容易按比例放大。在替代宿主中产生裂解(杀死)苛养木杆菌和/或Xa的有毒噬菌体的能力首次使得包括使用有毒噬菌体的苛养木杆菌-和/或地毯草黄单胞菌-街道的病害控制和治疗方法的产生和实施成为可行的，所述替代宿主在标准条件下能够每小时复制，而不是使用最多在非常复杂的培养基中每天复制的宿主那样需要数天。Xa的培养可以在营养肉汤中进行，一代的时间大约2-3小时。然而，Xa是接受的病原体，因此需要相对培养物的生物安全水平为2(BL2)。因此，与苛养木杆菌类似，Xa用于大规模生产可能是不可行的。

噬菌体可以通过软琼脂覆盖法分离，该方法允许从苛养木杆菌和/或黄单胞菌属细胞中分离噬菌体，并且在其他实施方案中，通过收集一个或多个覆盖平板的表现出融合裂解的苛养木杆菌菌株或黄单胞菌属菌株(如菌株EC-12)，然后浸渍，通过离心澄清，并且过滤除菌而制备高滴度噬菌体平板裂解物。得到的裂解物可以保存在4℃。然后，例如，可以通过等密度CsCl离心纯化高滴度噬菌体裂解物，并且可以将提取的噬菌体溶液进行透析。由此，可以获得产生的滴度约为1X10¹¹PFU/ml的CsCl-纯化的噬菌体。在其他实施方案中，植物组织滤出液(PTFs)中的噬菌体可以进行过滤。对于滤出液，优选的比率为1ml PTF比20ml替代宿主培养物(所选宿主的活性生长培养物)，例如，对于苛养木杆菌菌株Temecula生长4天的培养物或对黄单胞菌属菌株EC-12生长4小时的培养物。

利用检测和繁殖对苛养木杆菌和/或地毯草黄单胞菌("Xa")致病变型有毒的噬菌体的方法，可以从需要的资源，如从环境，包括植物、废水和/或土壤水，选择能够引起苛养木杆菌和/或Xa裂解的有毒噬菌体，并且按照本发明进行繁殖。可以按照本发明鉴定的噬菌体可以通过由Casjens等.(Research in Microbiology(微生物学研究)，159:340-348，2008)所述的具体特征进行定义，如衣壳形状和大小，基因组大小，基因和/或基因模块排列、形态和生命周期。在一个实施方案中，本发明的噬菌体可以是有毒的、等大的(isometric)，具有T＝7的三角划分数，基因组大小约为60kb或在60kb的大约15％内，在基因组中可以包括直接的末端重复。例如，可以使用有毒噬菌体来控制和预防由木杆菌属物种和亚种和/或黄单胞菌属物种如地毯草黄单胞菌及其致病变型(如地毯草黄单胞菌柑橘致病变种)引起的病害。

目前，已经认为五个木杆菌属亚种引起植物病害。例如，能够被木杆菌属感染的植物物种在www.cnr.berkeley.edu/xylella/control/hosts.htm列出，在Hernandez-Martinez等，(American Phytopathological Society(美国植物病理学学会)，97(7):857-864，2007)和Nunney等，(PLoS ONE,5(11):e15488，2010)中描述，并且可以包括商业农作物，如，但不限于，葡萄藤，柑橘属，咖啡树，杏树属，桃树，苜蓿，杏树，李属，黑莓，桑树和园艺植物，如夹竹桃，栎属树，香枫，紫荆属，榆树和梓柳。在本发明的一个实施方案中，噬菌体可以从由于苛养木杆菌特有的生长需要而不能在其中生长的环境中分离。此外，按照本发明，能够被地毯草黄单胞菌致病变型感染的植物物种可以包括，但不限于，柑橘属物种，金桔属物种，枳属物种，酸橙，柠檬，橙子，葡萄柚，柚子和用作砧木的枸橘的杂交体。

因此，本发明提供用于开发控制由苛养木杆菌引起的植物病害的基于噬菌体的治疗的方法，所述苛养木杆菌是在多种植物中引起病害的木质部限制性的、昆虫传播的、革兰氏阴性细菌。最显著地，苛养木杆菌是葡萄的皮尔斯病(PD)的原因物质，其目前是美国多个区域(包括德克萨斯和加利福尼亚)中培育高质量的酒料葡萄的限制性因素。由苛养木杆菌引起的一种重要的植物病害是葡萄的皮尔斯病("PD")，其引起可见的症状，包括变黄的叶片，或者边缘变红的叶片。最终可能发生叶片边缘和叶片的死亡和坏死。昆虫媒介，如叶蝉玻璃翅叶蝉("GWSS")可以传播该疾病，以及感染该引起疾病的细菌并且可以用于生物控制功效的噬菌体。

目前，没有有效的用于PD的控制措施，缺少感染的葡萄树的攻击性的选择。本发明允许通过首次提供以成本有效方式产生充足的噬菌体量足以允许植物治疗的可用系统来治疗所述病害。本发明还提供用于开发控制由作为柑橘溃疡病的原因物质的Xa(包括Xac)引起的植物病害的基于噬菌体的治疗的方法。在具体的实施方案中，本发明提供用于控制植物中的Xa病害的方法。

用于本文时，术语“有毒的”是指病毒，特别是噬菌体，其能够感染、在其中复制并且裂解(杀死)宿主细胞。术语“温和的(temperate)”是指这样的噬菌体，其能够整合到宿主基因组(溶原化)或者裂解宿主细胞。在本发明的一个实施方案中，噬菌体在合适的宿主中繁殖，如本文所述。术语“宿主”是指可以用来产生大量的噬菌体的细菌细胞。开发本文提供的基于噬菌体的控制策略中的一个步骤是鉴定并且繁殖识别特定细菌受体位点的有毒噬菌体。对引起病害的细菌有毒的噬菌体的产生和递送必须是经济的，以代表一种可行的生物控制选择。

噬菌体通过受体识别来感染宿主细胞，所述受体可以包括，但不限于，表面蛋白，如Omp A和OmpF，革兰氏阴性细菌中细菌LPS的核心和O-链，性菌毛和IV型菌毛(例如，Roine等，Mol.Plant Microbe Interact.(分子植物微生物相互作用)，11:1048-1056(1998))，和鞭毛。不希望受限于任何给定的理论，相信噬菌体可以通过IV型菌毛感染苛养木杆菌和Xa细胞。因此，在一个实施方案中，本公开内容所述的宿主可以是任意类型的细菌，并且特别是毒性温和的噬菌体或其衍生物(如传代的噬菌体)能够吸附并且通过毒力和/或致病性所需要的表面受体(如IV型菌毛或TonB-样蛋白)进行感染的任意细菌物种。“传代的噬菌体”意指已经通过在培养的宿主细胞中的一个或多个生长期繁殖的噬菌体群体。本发明所用的典型的宿主可以是细菌细胞，特别是黄单胞菌科(Xanthomonadaceae)的细菌物种，其包括木杆菌属和黄单胞菌属。在一些实施方案中，可以用于实施本发明的苛养木杆菌的菌株可以包括Temecula1(ATCC 700964)；Ann-1(ATCC 700598)；Dixon(ATCC 700965)；XF53，XF54和XF95(Whitehorn等，Science(科学)，336:351-352(2012))；XF134，XF136，XF140，XF141，XF15-1，XF15-1-1，TM1(Jones，等，Ann.Rev Phytopathol.(植物病理学年度综述)，45:245-262(2007))；和tonB1(Summer等，J.Bacteriol.(细菌学杂志)192:179-190(2010))。对所公开的噬菌体分离株的一种或多种敏感并且可用于本发明的示例性的黄单胞菌属菌株特别包括EC12，Pres-4和Jal-4(由佛罗里达Gainesville的佛罗里达大学(Univ.of Florida，Gainesville，FL)的Dr.N.Wang提供)，Noth 40，Ft.Basinger和Block22。根据其对Xfas100和/或Xfas300噬菌体的敏感性，也可以使用其他黄单胞菌属细菌。

用于本文时，术语“分离”定义为从包含混合的生物体培养物的溶液中分离并鉴定一种生物体。能够分离的生物体可以包括病毒、细菌、植物细胞等。噬菌体可以如本文所述和本领域已知那样分离。在一个实施方案中，用于分离噬菌体的一般实验室方法特别可以包括，但不限于，在培养的细胞中生长，噬菌体测定，双琼脂法和噬菌斑测定。本发明提供已知分离噬菌体的方法，其通过包括覆盖包含在一起的不同的细菌宿主细胞菌株的至少第一样品，以分离能够感染并且在两种宿主细胞类型中繁殖的噬菌体的方法进行。

本发明还提供繁殖对苛养木杆菌和/或Xa有毒的病毒(噬菌体)的方法。繁殖噬菌体的方法在本领域中是已知的，并且可以包括能够产生足以用于治疗植物病害的噬菌体的量的任何方法。在一个实施方案中，繁殖对苛养木杆菌和/或Xac有毒的噬菌体可以包括在黄单胞菌属细菌中生长噬菌体，允许所述噬菌体繁殖，并且从培养物分离噬菌体颗粒。

对苛养木杆菌有毒的噬菌体可以使用软琼脂覆盖法制备。可以自备高滴度的平板裂解物，例如，通过收集展现出融合裂解的苛养木杆菌菌株Temeculaor或黄单胞菌属菌株EC-12的覆盖平板，然后浸渍，并通过离心澄清。过滤除菌后，可以将得到的裂解物保存在4℃。随后，可以通过等密度CsCl离心纯化高滴度噬菌体裂解物，并将提取的噬菌体溶液透析。例如，可以得到具有1X10¹¹PFU/ml的滴度的CsCl-纯化的噬菌体。

例如，用于过滤的植物组织滤出液(PTFs)中的噬菌体的优选比率为1ml PTF：20ml替代宿主培养物(所选宿主的活性生长的培养物)，所述培养物是苛养木杆菌菌株Temecula生长4天或黄单胞菌属菌株EC-12生长4小时的培养物。

本发明还提供治疗或减少一种植物或多种植物中与苛养木杆菌和/或Xa致病变型相关的症状的方法。典型的皮尔斯病(PD)症状包括沿着边缘分别略微变黄或变红的叶片；最终叶片边缘可以在该区域内变干或死亡。

所包括的方法的一个实施方案包括给感染了苛养木杆菌和/或Xa的植物以导致对所述植物的治疗的方式施用对苛养木杆菌和/或Xa有毒的噬菌体。注射治疗植物可以通过喷洒、薄雾、粉末、注射或本领域已知的任意其他方法进行。配制用于所述应用的组合物的方法在本领域中也是公知的。例如，苛养木杆菌感染植物的维管组织，因此，本文所述的本发明可以包括通过注射向感染了苛养木杆菌的植物中引入对苛养木杆菌有毒的纯化的噬菌体颗粒的群体，以使所述噬菌体能够感染并且裂解所述苛养木杆菌细胞，由此治疗植物感染。然而，本领域的技术人员应该认识到也可以成功使用其他方法。Xa是叶病原体，并且通过直接流经叶片气孔的雨水自然地感染植物叶片、茎和果实，或者通过在强风过程中产生的伤口或通过昆虫感染。因此，在一个实施方案中，本发明可以包括通过喷洒包含对Xa有毒的纯化的噬菌体颗粒群体的组合物而向感染了Xa的植物中引入该组合物。

用于本文时，术语“治疗(treatment，treating和treat)”定义为用试剂作用在疾病、病症或病况上以减少或减轻所述疾病、病症或病况的生理学作用和/或其症状。用于本文时，“治疗”覆盖对宿主(例如，植物物种，包括农业目的的那些，如食用植物或用于产生食用产品的那些，以及观赏植物物种)中疾病的任何治疗，并且包括：(a)减少在植物中发生所述疾病的危险，(b)阻止所述疾病的进展，和(c)减轻所述疾病，即，引起所述疾病的消退和/或减轻一种或多种疾病症状。“治疗”还意指包括递送抑制剂以提供作用，甚至在不存在疾病或病症时。例如，“治疗”包括递送在植物中提供增强的或需要的作用(例如，减少病原体负荷，减少疾病症状等)的疾病或病原体抑制剂。

本发明还提供一种配制用于递送至植物中的植物病害生物控制组合物，所述组合物包含至少一种载体和至少一种对苛养木杆菌和黄单胞菌属物种如Xa有毒的噬菌体。

作为本发明的组合物的活性成分的对苛养木杆菌和/或黄单胞菌属物种如Xa有毒的噬菌体还作为选自由下述组成的组的至少一种噬菌体提供：Xfas100噬菌体类型，如Xfas101，Xfas102，Xfas103，Xfas104，Xfas105，Xfas106，Xfas107，Xfas108，Xfas109和Xfas110,和/或Xfas300噬菌体类型，如Xfas301，Xfas302，Xfas303，Xfas304，Xfas305和Xfas306，其中Xfas103，Xfas106，Xfas302，Xfas303，Xfas304和Xfas306所述的噬菌体类型已经分别以ATCC登记号PTA-13096，PTA-13095，PTA-13098，PTA-13099，PTA-13100和PTA-13097保藏。

作为本发明的活性成分的Xfas100噬菌体类型的有毒噬菌体展示出下述特征中的至少一种：(a)所述噬菌体具有能够裂解所述苛养木杆菌和黄单胞菌属细菌的活性，(b)所述噬菌体通过结合IV型菌毛感染细胞；(c)有尾噬菌体展现出长的非收缩性的尾部，具有直径在55-77mm范围内的衣壳，典型是管状病毒科的形态；(d)噬菌体的基因组大小为约55500bp至56200bp；和(e)所述噬菌体具有预防或减少一种植物或多种植物中与皮尔斯病相关的症状的活性。

作为本发明的活性成分的Xfas300噬菌体类型的有毒噬菌体展示出至少一种这样的特征，其中所述特征为：(a)所述噬菌体具有能够裂解所述苛养木杆菌和黄单胞菌属细菌的活性；(b)所述噬菌体通过结合IV型菌毛感染细胞；(c)所述噬菌体展现出短的非收缩性的尾部，具有直径在58-68mm范围内的衣壳，典型是短尾病毒科的形态；(d)噬菌体的基因组大小为约43300bp至44600bp；和(e)所述噬菌体具有预防或减少一种植物或多种植物中与皮尔斯病相关的症状的活性。作为本发明的组合物的活性成分的有毒噬菌体还包括选自Xfas100噬菌体类型和/或Xfas300噬菌体类型的至少一种噬菌体，其中所述Xfas100噬菌体类型是Xfas103和Xfas106，和/或所述Xfas300噬菌体类型是Xfas302，Xfas303，Xfas304和Xfas306。

用作本发明的组合物的活性成分的对苛养木杆菌和黄单胞菌属物种(如Xa)有毒的噬菌体还通过噬菌体组合提供，如两种、三种、四种、五种、六种或更多种有毒噬菌体分离株或类型的混合物，其可以同时或先后提供，包括与载体一起。术语“载体”是指噬菌体与其一起施用的稀释剂、辅药、表面活性剂、赋形剂或媒介物(vehicle)。所述载体可以是无菌液体，如水和油，包括石油、动物、植物和合成来源的那些，如花生油、大豆油、矿物油、芝麻油等。盐溶液，包括磷酸盐溶液，如磷酸氢二钠、磷酸二氢钾和葡萄糖水溶液和甘油溶液也可以用作液体载体，特别是用于注射液。适当的赋形剂可以包括淀粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明胶、麦芽、大米、面粉、白垩(chalk)、硅胶、硬脂酸钠、单硬脂酸甘油酯、滑石、氯化钠、脱脂奶粉、甘油、丙二醇、水、乙醇等。

如果需要，植物病害生物控制组合物还可以包含少量的湿润剂或乳化剂，或pH缓冲剂。

可以向植物病害生物控制组合物中加入保护剂，如，但不限于，基于酪蛋白的制剂，基于面粉的制剂，蔗糖，刚果红，正丙基gallete(N-propyl-gallete)，和基于木质素的制剂。

有效的病害控制所需要的噬菌体浓度没有限制，但是，例如，可以是1X10-1X10¹²PFU/ml，1X10⁴-1X10¹¹PFU/ml或1X10⁷-1X10¹⁰PFU/ml。

取决于树的生长年数，茎的厚度，根的大小，适当地调节剂量。植物病害生物控制组合物可以是干燥的产品，基本上干燥的产品，液体产品，或基本上液体的产品。在一些实施方案中，干燥或基本上干燥的产品可以在液体(例如，水等)中重建，然后应用到植物中。在其他实施方案中，所述组合物可以以干燥或基本上干燥的形式应用，其中已经存在于植物中的液体同时应用到植物中，或者随后出现在植物上(例如，通过涂抹，表面结露(condensation)等)，促使所述噬菌体暴露于靶标细菌。在另一个实施方案中，所述组合物可以通过喷洒、薄雾、或尘化应用到植物上。

植物病害生物控制组合物可以采取溶液、混悬液、乳液、粉末、片剂等的形式。

应用植物病害生物控制组合物的时间没有限制，但是，例如，可以是每天一次、每周一次、或每周两次、每月一次、每两月一次或每季度一次。

本发明还提供一种分离的噬菌体，所述噬菌体对苛养木杆菌和黄单胞菌属物种(如Xa)及其致病变型有毒。

本发明还提供作为选自由下述组成的组的一种噬菌体的分离的噬菌体：Xfas100噬菌体类型，如Xfas101-Xfas110，和/或Xfas300噬菌体类型，如Xfas301-Xfas306，并且其中Xfas103，Xfas106，Xfas302，Xfas303，Xfas304和Xfas306，其已经分别以ATCC登记号PTA-13096，PTA-13095，PTA-13098，PTA-13099，PTA-13100和PTA-13097进行了保藏。

所述噬菌体可以通过验证在苛养木杆菌和/或黄单胞菌属物种上形成噬菌斑的能力进行检测。

保藏信息

在本文上文中公开的和在权利要求书中引用的每个菌株Xfas103，Xfas106，Xfas302，Xfas303，Xfas304和Xfas306的代表性噬菌体的保藏，和地毯草黄单胞菌EC-12的代表性细菌的保藏，在位于P.O.Box 1549，Manassas，VA 20108，USA的ATCC进行。登记的保藏日期为2012年7月24日，并且保藏的菌株的登记号分别为PTA-13096，PTA-13095，PTA-13098，PTA-13099，PTA13100，PTA13097和PTA-13101。当专利授权时，将解除对保藏的所有限制，并且保藏意欲满足37C.F.R.§1.801-1.809的所有要求。保藏将在保藏机构保持30年的时期，或在最后一次请求后5年，或者是专利的有效期，选其中较长的时期，并且在该期间内如果需要将进行替换。

实施例

包括下述实施例来证明本发明的优选的实施方案。本领域技术人员应该理解，在下述实施例中公开的技术代表由本发明人发现的技术在本发明的实施中很好地行使作用，由此可以认为组成其实施的优选方式。然而，根据本公开内容，本领域技术人员应该理解，在所公开的具体的实施方案中可以进行多种改变并且仍然获得相似的或类似的结果，而没有背离本发明的精神和范围。

实施例1

培养基、培养条件和细菌菌株

该实施例描述对苛养木杆菌和黄单胞菌属物种有毒的噬菌体的分离、繁殖以及形态和基因组特征。在本研究中所用的培养基不同于用于生长苛养木杆菌的标准培养基，该培养基允许快速生长但是影响噬菌体的感染能力。Sherald等(Plant Disease(植物病害)67:849-852，1983)改良的称为PW-M的PW肉汤培养基用于生长苛养木杆菌分离株，不同之处在于最终的牛血清白蛋白含量为0.3％，如由Hill和Purcell(Phytopathology(植物病理学)85(12):1368-1372，1995)所改良的。对于固体培养基(PW-MA)和软琼脂，分别用15g/l和7.5g/l的植物细胞培养物检测的琼脂(Plant Cell Culture Tested agar，Sigma)改良所述PW-M肉汤。复杂的培养基TN肉汤(TNB)用于非-苛养木杆菌培养物的常规保持。固体培养基(TNA)是相同的，不同之处在于其缺少KNO₃，并且补充有20g/L琼脂。对于软琼脂覆盖，用7.5g/L琼脂改良TN培养基(TNSA)。为了涂布植物提取物以获得总的细菌计数，用环己酰亚胺(40μg/ml；TNAC)改良TNA培养基。所有的培养物在28℃生长，并且使用Nephelo烧瓶在λ＝600nm监测液体培养物。本研究中所包括的加利福尼亚苛养木杆菌分离株为Temecula(XF15)，其代表苛养木杆菌亚种fastidiosa，Ann1(XF108)，其代表苛养木杆菌亚种sandyi，和Dixon(XF102)，其代表苛养木杆菌亚种multiplex(Hendson等，Applied andEnvironmental Microbiology(应用和环境微生物学)67(2):895-903，2001)。所包括的德克萨斯苛养木杆菌分离株分别来自一球悬铃木(Platanus occidentalis)(XF1)，向日葵(Helianthus annuus)(XF5)，假苍耳(Iva annua)(XF18)，多年生豚草(Ambrosiapsilostachya)(XF23)，草原松果菊(Ratibida columnifera)(XF37)，夏葡萄(Vitisaestivalis)(XF39)，白亮葡萄(Vitis mustangensis)(XF41)，来自三裂叶猪草(Ambrosiatrifida var.texana)的三个分离株(XF16，40和43)，来自橙花(Nerium oleander)的两个分离株(XF93和95)，和来自欧洲葡萄(Vitis vinifera)的15个分离株(XF48，50，52，53,54，56，58，59，60，66，67，70，71，76和78)。所有的分离株都是通过划线分离法纯化的单克隆，并且在修正PW-M肉汤培养物至20％甘油的终浓度(v/v)后保存在-80℃。如之前所述(Hernandez-Martinez等，Plant Disease(植物病害)90(11):1382-1388，2006)，利用聚合酶链式反应(PCR)分析在物种和亚种水平上验证苛养木杆菌分离株。利用通过气相色谱(GC-FAME)分析脂肪酸甲基酯的MIDI微生物鉴定系统(MIDIMicrobial Identification System)来鉴定黄单胞菌属物种。

实施例2

处理植物样品和分离细菌

欧洲葡萄、白亮葡萄(V.mustangensis)和杂草的植物样品获自德克萨斯Brazos县和Washington县的葡萄园。来自稻田的水稻(Oryza sativa)植物组织和杂草获自德克萨斯的Jefferson县和Wharton县。水稻种子样品获自位于德克萨斯Beaumont的德克萨斯AgriLife研究中心(Texas AgriLife Research Center，Beaumont，Texas)。玫瑰植物(蔷薇属物种(Rosa spp.)；敲除)和(TAM-mild；辣椒(Capsicum annuum))的样品从德克萨斯的Brazos县获得。为了获得植物提取物，在50ml噬菌体缓冲液(P-缓冲液；50mM Tris-HCl pH 7.5，100mM NaCl，8mM MgSO₄)中，使用研钵和研棒碾碎10g植物组织，涡旋，并且通过双层粗棉布过滤，以去除大的颗粒。然后，将提取物分别稀释涂布到PW-M和TNAC二者上，用于分离苛养木杆菌和非-苛养木杆菌细菌，并且在28℃温育。每天评价平板的生长直至10天。

实施例3

从植物样品分离、纯化和滴定噬菌体

为了获得植物组织滤出液(PTFs)，将澄清的植物组织离心(10,000x g，在4℃10min)两次，并且组织提取物通过0.22μm的滤器(Supor，Pall Life Sciences)进行过滤。通过将10μl 10倍连续稀释液点样到一组苛养木杆菌和黄单胞菌属物种宿主的覆盖物上，并且在菌苔形成后(对于苛养木杆菌分离株，6-7天，对于黄单胞菌属物种分离株，18小时)观察带或噬菌斑的形式，而直接确定PTFs中噬菌体的存在。备选地，通过向20ml苛养木杆菌分离株的活性生长培养物(4天培养物；A₆₀₀＝0.30)或A₆₀₀＝0.25(4h)的黄单胞菌属物种宿主的培养物中加入1ml的每种滤出液而从PTFs富集噬菌体。分别在生长苛养木杆菌或黄单胞菌属物种富集物72小时或24小时后，将培养物离心(10,000x g，在4℃10min)并且过滤除菌(0.22-μm滤器)。为了确定噬菌体在富集的上清中的存在，将10μl 10倍连续稀释液点样到一组苛养木杆菌和黄单胞菌属物种宿主的覆盖物上，并且观察带或噬菌斑的形式。使用在PW-MA上生长了五天的苛养木杆菌培养物来制备在PW-M肉汤中的宿主混悬液(A₆₀₀＝0.5)，而使用在TNA培养基上生长18小时的黄单胞菌属物种分离株的培养物来制备在TN肉汤中的混悬液(A₆₀₀＝0.5)，并且用于制备覆盖物。用于测量细菌上清的噬菌体活性的软琼脂覆盖物通过下述制备：将100μl所述细菌上清与7ml熔融的PW-M或TN软琼脂混合，将所述混合物倒入PW-MA或TNA平板中，并且允许其凝固和变干。显示出噬菌斑或透明区带形成的点样覆盖物进一步通过上述涂布进行研究，不同之处在于，在覆盖之前，将PTF稀释液直接与个体宿主指示剂混悬液混合。将在苛养木杆菌或黄单胞菌属物种宿主覆盖物上形成的单个噬菌斑切下，混悬在P缓冲液中并且滴定。重复该步骤三次，以获得单噬菌斑分离物。高滴度裂解物(1x10¹⁰PFU/ml)通过下述制备：用5ml P-缓冲液收集表现出融合裂解的覆盖物，浸泡软琼脂覆盖物，通过离心(10,000x g，在4℃15min)使裂解物澄清并通过0.22-μm滤器过滤除菌。裂解物保存在4℃。

将植物提取物分别涂布在PW-M和TNAC上，用于选择苛养木杆菌和获得总细菌计数。来自所有测定植物的植物提取物没有产生任何关于苛养木杆菌分离株的迹象。然而，非选择性涂布确实产生很多种细菌菌落类型。从平板中挑取生成黄色色素的细菌的代表性的单菌落，并划线纯化以获得原种(stocks)。将所述原种用来制备覆盖物，在覆盖物上点样PTFs，以观察带或噬菌斑形成。分别从水稻种子、叶片和水稻组织的提取物获得的细菌分离株Presidio-4、Jal-4和EC-12，利用通过气相色谱(GC-FAME)的脂肪酸甲基酯分析全部鉴定为黄单胞菌属物种，并且用作宿主来评价PTFs。考虑到一种或多种所公开的噬菌体对所述菌株的毒力，也可以使用其他的Xa菌株。

培养5-6天后，一些PTFs的稀释液在分离株XF15，XF53，XF54，XF95上产生噬菌斑，这表明在植物组织中存在能够在这些宿主上形成噬菌斑的噬菌体。由提取物观察到的初始滴度在5X10¹至7X10⁵PFU/克组织的范围内。由于所有的PTFs对XF15、XF53、XF54和XF95都表现出相同的产生模式，因此，将菌株XF15用作宿主来进行噬菌斑纯化和产生。在这些非富集的PTF中发现的高滴度表明与植物组织相关的天然细菌宿主可以作为噬菌体的宿主，所述噬菌体可以在苛养木杆菌的覆盖物上产生噬菌斑。PTF的连续涂布产生大小均一的单个噬菌斑。将单个噬菌斑切下，并用XF15作为宿主纯化噬菌斑三次，以获得克隆分离株。一培养皿噬菌体Xfas302用苛养木杆菌宿主菌株Temecula(1x10⁹PFU(噬菌斑形成单位/ml))纯化并且增加，并在黄单胞菌属物种分离株Pres-4和EC-12(二者均为5x10⁷CFU(菌落形成单位)/ml)上滴定，这表明在苛养木杆菌菌株XF15(Jones等，2007)或苛养木杆菌Temecula菌株(ATCC 700964)上繁殖的噬菌体Xfas302能够在黄单胞菌属物种菌株Pres-4和EC12(EC12以ATCC登记号PTA-13101保藏)上形成噬菌斑，这提供了在苛养木杆菌上繁殖的噬菌体能够吸附在黄单胞菌属菌株上、复制和形成噬菌斑的证据。下述宿主范围研究进一步证实了这些结果。

噬菌体Xfas101-Xfas105都在XF15菌苔上产生小的透明的噬菌斑，而噬菌体Xfas301-Xfas305在同一宿主上产生大的透明的噬菌斑。Xfas302-Xfas305和Xfas101-Xfas104的TEM图像分别显示在图1和图2中。将使用XF15产生的高滴度裂解物用来获得CsCl-纯化的每种噬菌体的制剂，所述制剂用来进行透射电子显微镜检查(TEM)研究。噬菌体Xfas101-Xfas105都表现出长的非收缩性的尾部，具有直径在55-64nm范围内的衣壳，并且因此确定属于管状病毒科。Xfas301-Xfas305都表现出短的非收缩性的尾部，具有直径在58-65nm范围内的衣壳，典型的短尾病毒科的形态。

实施例4

从废水中富集噬菌体

从德克萨斯地区Bryan的处理厂获得澄清处理的废水样品。样品从Still Creek，Carter Creek，Turkey Creek和Burton Creek厂获得。将样品离心(10,000x g，在4℃10min)两次，并且将组织提取物通过0.22-μm滤器过滤。如上文所述，通过向20ml所选的宿主的活性生长培养物中加入1ml的每种滤出液而富集噬菌体。对于苛养木杆菌或黄单胞菌属物种富集分别生长72和24小时后，将培养物离心，并且过滤除菌。将富集的滤出液点样在覆盖物上进行滴定，如上文所述。

使用宿主EC-12作为宿主，从单个富集的样品中分离噬菌体Xfas106-109和Xfas306，所述单个富集的样品获自四个废水处理厂。纯化的噬菌体浓缩物的TEM研究在形态上将噬菌体Xfas306鉴定为短尾病毒科，其具有短的非收缩性的尾部，直径为68nm的衣壳(图3)，而分离的噬菌体Xfas106-109表现出管状病毒科特有的长的非收缩性的尾部，具有直径～77nm的衣壳(图3)。噬菌体Xfas306在两种宿主EC-12和XF15上都产生大的透明的噬菌斑，而噬菌体Xfas106-109在相同宿主上产生小的透明的噬菌斑(图3)。因此，该实验所用的方法能够从环境样品中分离苛养木杆菌噬菌体。

实施例5

CsCl-纯化

过滤除菌的噬菌体混悬液通过在Beckman L8-70M超离心机中用60Ti型转子离心(90,000x g，在5℃2.5h)进行浓缩。将沉淀物重悬在P-缓冲液中并用终浓度为1μg/ml的DNA酶I和RNA酶A(Sigma)在25℃处理2小时。向噬菌体混悬液中加入CsCl至终浓度为0.75g/ml，并且在VTi 65.2转子中离心(300,000x g，在5℃18h)。使用18号注射针头提取可见的噬菌体条带，并且在4℃针对改良为1M NaCl的P-缓冲液透析过夜，在25℃针对P-缓冲液透析透析2次每次4小时，以获得1X10¹¹PFU/ml的混悬液。将CsCl-纯化的噬菌体保存在4℃。

实施例6

透射电子显微镜检查

通过用P-缓冲液稀释并且将5μl应用到刚刚辉光放电的聚乙烯醇缩甲醛-碳包被的栅极上1分钟进行CsCl-纯化的噬菌体(1x10¹¹PFU/ml)的电子显微镜检查。然后，将栅极用去离子水滴简单清洗，并用2％(w/v)水性醋酸双氧铀染色。在以100KV加速电压操作的JEOL1200EX透射电子显微镜下观察样本。

实施例7

涂布效率和宿主范围

通过计算用异源(非繁殖的)宿主获得的噬菌体噬菌斑滴度与在同源(繁殖的)宿主上获得的噬菌体噬菌斑的比率而获得涂布效率(EOP)。在覆盖到固体培养基上之前，通过将100μl噬菌体原种稀释液与软琼脂(7ml)中的单个宿主指示剂混悬液(A₆₀₀＝0.5)混合，使用适当的培养基在苛养木杆菌或黄单胞菌属物种宿主上滴定噬菌体原种。

比较Xfas噬菌体的EOP的研究显示在表1中。从植物样品中分离用黄单胞菌属物种菌株EC-12繁殖然后用苛养木杆菌菌株XF15作为宿主滴定的噬菌体的EOP在1X10^-1至1X10^-3的范围内，当使用菌株XF15繁殖的噬菌体接着用EC-12作为宿主滴定时，观察到相似的结果。使用从废水滤出液分离并且在菌株EC-12上繁殖的噬菌体的类似的研究表现出范围在1X10^-1至5X10^-1的EOPs。当噬菌体Xfas106-109在菌株XF15上繁殖并且在宿主EC-12上涂布时获得1X10^-1至3X10^-1的EOPs，这表明尽管可能存在DNA限制和修饰屏障，但是在快速生长的菌株EC-12上在一天内繁殖的噬菌体能够在苛养木杆菌上吸附、复制并形成噬菌斑，该过程在单独的苛养木杆菌上可能需要多至10天。

表1.在苛养木杆菌或黄单胞菌属物种宿主上繁殖的Xfas噬菌体的涂布效率

通过用接种了单个宿主的同源软琼脂覆盖适当的培养基，即PW-M(用于XF15)或TNA(用于EC-12)，而制备宿主的菌苔。然后，通过将10μl 10-倍稀释系列点样到苛养木杆菌或黄单胞菌属物种宿主的覆盖物上，在所述单个菌苔智能光点样滴定单个噬菌体制剂的高滴度裂解物(1x10⁹PFU/ml)。将平板在28℃温育适当的时间后(EC-12：24小时，或XF15：5-7天)，评价平板的带和噬菌斑形成。

表2所示的初始宿主范围研究表明，所有能够在苛养木杆菌宿主XF15上形成噬菌斑的噬菌体也在宿主EC-12上形成噬菌斑，而宿主Jal-4和Pres4表现出对大部分siphophages的不敏感性。对于抗性的原因在下述范围内：缺少吸附或其他吸附后机制，如噬菌体-基因组吸收障碍，重复感染免疫性，限制性修饰，和成簇的、规律间隔的短回文重复(clustered regularly interspaced short palindromic repeats，CRISPRs)。

表2.Xfas噬菌体的宿主范围*

*EC-12宿主用于测试中所用的噬菌体的繁殖。

S＝在所示的宿主上形成透明的噬菌斑的能力；R＝不能在所示的宿主上形成噬菌斑。

实施例8

Xfas吸附位点的初步鉴定

基于从植物组织或废水样品中获得或富集的苛养木杆菌噬菌体在苛养木杆菌上形成噬菌斑的观察，有兴趣确定细胞表面成分能否作为吸附位点。已知的噬菌体吸附位点包括表面蛋白，如OmpA和OmpF，革兰氏阴性细菌中细菌LPS的核心和O-链，性菌毛和IV型菌毛，和鞭毛。野生型和缺失pilA导致缺少IV性菌毛的衍生物的衍生突变体评价为Xfas噬菌体的宿主。所检测的所有噬菌体都在XF15野生型菌株上形成噬菌斑，但是不在XF15ΔpilA突变体上形成噬菌斑。结果表明IV型菌毛可以是Xfas噬菌体附着的基本位点。

基于用XF15-ΔpilA获得的结果，有兴趣确定黄单胞菌属物种菌株EC-12的pilA缺失突变体是否变得对Xfas噬菌体Xfas103，Xfas106Xfas302，Xfas303 Xfas304和Xfas306不敏感。在平板滴度测定中，菌株EC-12ΔpilA对所述噬菌体不敏感，并且在使用噬菌体Xfas303的吸附实验中，没有观察到对宿主的吸附。与pilA反向互补的EC-12ΔpilA对所有测试的噬菌体敏感。这进一步证明IV型菌毛是所观察的噬菌体附着苛养木杆菌的基本位点。

实施例9

噬菌体DNA分离和基因组测序

使用改良形式的Promega Wizard DNA提取试剂盒(Promega)从10-20ml过滤除菌的、高滴度(>1x10⁹PFU/ml)CsCl-纯化的噬菌体裂解物中制备噬菌体基因组DNA。简言之，将10-20ml噬菌体裂解物用10μg/ml的每种DNA酶I和RNA酶A(Sigma)在37℃消化30分钟，并且在10％(w/v)聚乙二醇8000和1M NaCl的存在下在4℃沉淀16-20h。沉淀物在4℃以10,000xg离心10min，并且将沉淀物重悬在0.5ml P-缓冲液中。将由Wizard试剂盒提供的1ml DNA纯化树脂添加到重悬的噬菌体中，上样到迷你柱上并用2ml 80％(v/v)异丙醇洗涤。通过加入100μl预热到80℃的水，然后立即将所述迷你柱离心而从所述树脂洗脱DNA。通过在0.8％琼脂糖凝胶上运行并用溴乙啶然而而验证DNA的完整性，并且通过条带光密度测定法定量DNA。通过在1％琼脂糖凝胶(脉冲电场琼脂糖，BioRad)上进行基因组DNA的脉冲电场凝胶电泳(PFGE)分析并与大小标记物(中等范围标记物I，NEB)比较而估测噬菌体基因组大小。

噬菌体使用"454"焦磷酸测序(Roche/454 Life Sciences，Branford，CT，USA，在Emory GRA Genomics Core:Emory Univ.，Atlanta，GA)进行测序。噬菌体基因组DNA由上文所述的噬菌体分离株制备，并且以等摩尔量混合至约100ng/μl的终浓度。将汇集的DNA剪切，与对四个汇集库的每一种特异性的多路标识符(multiplex identifier，MID)标记连接，并且在Roche FLX Titanium测序仪上按照供应商的流程使用全平板反应(full-platereaction)通过焦磷酸测序法进行测序。汇集的噬菌体DNA存在于两个测序反应中。反应包含表示39个基因组元件的、总计约3,331kb基因组序列的基因组DNA，并且测序允许产生987,815个读出，平均长度为405bp，这提供了对整个汇集库的总计120-倍的覆盖。与四个汇集库的每一个相对应的平衡的FLX钛flowgram输出结果(trimmed FLX Titanium flowgramoutputs)分别用Newbler汇编程序版本2.5.3(454 Life Sciences)通过调整设置仅包括含有单个MID标识符/次组装进行组装。单个毗连序列群的性质使用针对毗连序列群序列产生的引物和单个噬菌体基因组DNA制剂作为模板通过PCR进行确定；从噬菌体DNA模板产生预计大小的产物用来使单个噬菌体与其毗连序列群相匹配。测序仪(Gene CodesCorporation)用于序列组装和编辑。利用Genemark(opal.biology.gatech.edu/GeneMark/gmhmm2_prok.cgi)预测蛋白编码区，并且在Artemis(www.sanger.ac.uk/Software/Artemis/)人工编辑(Lukashin等，Nucleic Acids Research(核酸研究)26(4):1107-1115，1998；Rutherford等，Bioinformatics(生物信息学)16(10):944-945，2000)。使用DOTTER产生DotPlots(Brodie等，Bioinformatics(生物信息学)20(2):279-281，2004)。使用BLAST(www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/Blast.cgi)比较预测的蛋白和GenBank数据库中的蛋白。利用InterProScan(www.ebi.ac.uk/Tools/webservices/services/interproscan)、LipoP(www.cbs.dtu.dk/services/LipoP/)和TMHMM(www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)分别鉴定保守结构域、脂蛋白加工信号和跨膜结构域(TMDs)。

表3.Xfas噬菌体的基因组大小。

表3

Dice评分＝((2x同一性)/(两种噬菌体的序列长度))x 100

实施例10

Xfas噬菌体的基因组分析和Xfas100与Xfas300噬菌体类型的描述

由于从感染中不能分离溶菌性菌落，并且在基因组序列中没有发现与温和的生活方式相关的基因(阻抑蛋白，整合酶)，因此，针对其攻击黄单胞菌属EC-12和苛养木杆菌以及亚种的能力分离噬菌体，所述噬菌体都需要IV型菌毛进行感染，并且都是有毒的。所述噬菌体可以进一步分成两种噬菌体类型，如由Casjens等定义的(Research in Microbiology(微生物学研究)，159:340-348，2008)。

(1)Xfas100噬菌体类型：Xfas100噬菌体类型由黄单胞菌属和木杆菌属的有毒的Siphophages(ICTV管状病毒科)组成，其典型为噬菌体Xfas101，Xfas102，Xfas103，Xfas104，Xfas105，Xfas106，Xfas107，Xfas108，Xfas109和Xfas110(表12)，并且其他的实例在表3中作为命名为“Xfas1nn”的任意噬菌体列出，其中n是任意数字(称为Xfas 100系列)。由于预计将要分离Xfas1nn噬菌体类型的其他变体，所以，这种灵活的命名系统是有必要的。Xfas100-型噬菌体是siphophages，在生活方式中是有毒的，并且需要IV型菌毛来感染木杆菌属和黄单胞菌属物种。Xfas100-型噬菌体具有直径测量约为55-77nm的二十面体衣壳头部和长约200-262nm的灵活的尾部；两个尺度值都是在负染色电子显微镜的标准精确度内确定的(见图2和3)。Xfas100系列病毒DNA具有单链DNA突出端特有的粘(cos)末端(Casjens，等，Methods Mol Biol 502:91-111，2009)，由于cos DNA包装避免产生加强发病机制决定因素转移的一般转导颗粒(generalized transducing particles)，因此，其对于要用于抗菌应用的噬菌体是重要的。Xfas100基因组具有特有的整体组织(见图4)，基因排列成两个分开的基因簇，A_L和A_R和B_L和B_R。Xfas100噬菌体类型进一步通过下述事实区分：噬菌体的基本结构和裂解基因聚在右边的基因簇B_L中。Xfas100系列噬菌体类型还通过编码其自身的单分子DNA聚合酶(Xfas103gp71和Xfas106gp66)、引发酶(Xfas103gp76和Xfas106gp71)和解旋酶(Xfas103gp69和Xfas106gp64)进行区分。

(2)Xfas300噬菌体类型：Xfas300噬菌体类型由黄单胞菌属和木杆菌属的有毒podophages(ICTV短尾病毒科)组成，其典型为噬菌体Xfas301，Xfas302，Xfas303，Xfas304，Xfas305和Xfas306，并且其他的实例在表3中作为命名为“Xfas3nn”的任意噬菌体列出，其中n是任意数字(称为Xfas300系列)。由于预计将要分离Xfas3nn噬菌体类型的其他变体，所以，这种灵活的命名系统是有必要的。Xfas300-型噬菌体具有直径测量约为58-68nm的二十面体衣壳头部；该尺度值都是在负染色电子显微镜的标准精确度内确定的(见图1和3)。Xfas302-306基因组编码位于结构蛋白区附近的单亚基RNA聚合酶。Xfas300系列基因组具有特有的整体组织(见图5)，基因排列在一条链上，包括噬菌体的复制、结构和裂解基因。Xfas300噬菌体类型还通过编码其自身单分子DNA聚合酶(Xfas302gp18，Xfas303gp17，Xfas304gp17和Xfas306gp17)，单亚基RNA聚合酶(分别为Xfas302gp31，Xfas303gp28，Xfas304gp27和Xfas306gp30)和解旋酶(Xfas302gp15，Xfas303gp14，Xfas304gp15和Xfas306gp14)进行区分(见图5，噬菌体基因组的示意图)。

实施例11

使用噬菌体Xfas304在葡萄藤中进行运动、攻击和保护研究

噬菌体Xfas304是短尾病毒科的一员，从环境样品中分离，具有包括苛养木杆菌和黄单胞菌属物种的宿主范围。在此处所述的研究中，在存在敏感宿主的条件下，在葡萄藤中确定Xfas304的运动和持续性，以确定用噬菌体治疗植物是否可以预防后续的苛养木杆菌感染。另外，先接种苛养木杆菌的葡萄藤在病原体接种后4周再用噬菌体Xfas304进行攻击，以确定所述噬菌体能否治疗性地控制皮尔斯病的发展。

对于预防性研究，葡萄藤接种40μl的噬菌体Xfas304混悬液(1x10¹⁰PFU/ml)，然后在噬菌体接种后4周用苛养木杆菌攻击。分光光度测量调节用于接种的细菌苛养木杆菌混悬液(A₆₀₀＝0.4；1X10⁹CFU/ml)。在第二和第三节之间在相对位点上接种单个的防疫线(两点/防疫线)，使用针头接种技术接种40μl细菌混悬液，如Hopkins(Plant Dis.(植物病害)89:1348-1352，2005)所述。对照葡萄树在上述相同的接种点模拟接种磷酸缓冲液。

结果表明，噬菌体Xfas304可以用于治疗或预防葡萄藤中由苛养木杆菌亚种fastidiosa引起皮尔斯病。因此，在这些研究中鉴定的噬菌体Xfas304和其他有毒木杆菌属-黄单胞菌属噬菌体在针对由其他苛养木杆菌亚种和黄单胞菌属物种引起的病害的植物保护和治疗中具有潜在的应用。

本研究中所用的细菌包括苛养木杆菌菌株Temecula(XF15)和XF54，它们分别与加利福尼亚和德克萨斯的葡萄藤皮尔斯病相关。将苛养木杆菌的培养物在PW-M琼脂培养基(Summer等，J Bacteriol 192(1):179-190，2010)上在28℃维持5-7天。将在PW-MA上生长五天的苛养木杆菌分离株的培养物用于在磷酸缓冲液(0.125M，pH 7.1)中制备细菌混悬液，用于葡萄树接种。

在1103P砧木上的休眠的赤霞珠葡萄(V.vinifera cv.Cabernet Sauvignon)克隆08购自Vintage Nurseries(Wasco，California，USA)。葡萄树使用101Sunshine Mix 1(SunGro Horticulture，Vancouver，British Columbia，加拿大)种植在7加仑的盆中。植物在温室中以16小时光(26℃，300-400μE/m²·s)/8小时黑暗(18℃)周期生长，补充有来自钠气灯的照明。植物每隔一天用自来水浇灌。每15天，对葡萄树施以Peter's通用20-20-20肥料和微量营养素。植物逐渐进行修剪，以如下述提供均一的植物：当产生两个100-150cm的不分叉的独茎(solitary shoots)时，将两个茎修剪为80cm。去除侧茎和芽。划上两个防疫线，并且允许生长至在葡萄树用于上述实验之前，每个防疫线长为～2.5-2.75m。

对于所有的苛养木杆菌菌株XF15和XF54，以及对于噬菌体Xfas304，获得标准qRT-PCR线状图表，所有这些具有大于0.9的R²值和分别为157％、130％和123％的效率。来自一式三份XF15和XF54样品的两个防疫线的定量评估表明病原体在整个所有测定的节段上的分布，分别可见典型的皮尔斯病(PD)症状，如叶片沿着边缘变得略黄或红，并且最终到接种后第8周叶片边缘变干或在其区带上死亡(图6)。在接种了噬菌体Xfas304的葡萄树中，在不存在容许宿主的条件下，在接种后2、4和6周观察到噬菌体分布的进展，在8-12周减少，并且没有葡萄树症状。

实施例12

葡萄藤接种细菌和噬菌体

为了治疗性评价噬菌体治疗，将15棵葡萄树(每棵两个防疫线)接种苛养木杆菌菌株XF15或XF54。分光光度测量调整用于接种的细菌混悬液(A₆₀₀＝0.4；1X10⁹CFU/ml)。来自三棵葡萄树的三个具有相似的区域的节段(例如，1/1a，1/1b，1/1c)的qRT-PCR结果的平均值用来确定CFU/克植物组织(gpt)和PFU/gpt。在第二和第三节之间在相对位点上接种单个的防疫线(两点/防疫线)，使用针头接种技术接种40μl细菌混悬液，如Hopkins(Plant Dis.(植物病害)89:1348-1352，2005)所述。对照葡萄树按照相同的流程模拟接种磷酸缓冲液。用病原体接种后四周，来自每种治疗的15棵葡萄树使用相同的接种流程和技术用40μl噬菌体Xfas304混悬液(1X10¹⁰PFU/ml)攻击。葡萄树每周两次针对症状发展进行评分，持续12周，并且在接种时，在8、10和12周，对苛养木杆菌和噬菌体进行一式三份的测定，如下文所述。为了确定噬菌体能否以预防方式作用，利用与上述相同的接种流程和接种技术对九棵葡萄树(每棵两个防疫线)接种40μl噬菌体Xfas304。在噬菌体接种后四周，用40μl(A₆₀₀＝0.4；1X10⁹CFU/ml)菌株XF15利用与上述相同的接种流程攻击葡萄树。

为了评价葡萄藤中细菌和噬菌体的运动，使用与上述相同的接种流程，将15棵葡萄树分别接种XF15或XF54，将24棵葡萄树仅接种噬菌体Xfas304。接种了XF15或XF54的葡萄树在接种后立即和在接种后8、10和12周一式三份进行测定。接种了噬菌体的葡萄树在接种后立即和每两周一式三份进行测定，持续12周。测定的方法如下所述。

为了确定噬菌体将如何影响葡萄树中的病原体群体和疾病发展，在病原体接种后四周用噬菌体Xfas304攻击苛养木杆菌接种的葡萄树。在用XF15接种后8周，在第4周用Xfas304攻击的葡萄树没有表现出PD症状，并且，与未攻击的葡萄树相比，在噬菌体攻击的葡萄树中的细菌群体低1至3个对数。未噬菌体攻击的植物表现出PD症状(图7，第2列)，而噬菌体攻击的葡萄树在第5周后没有表现出PD症状(图7，第6列)。在XF15接种后8-12周(Xfas304攻击后4-8周)，在噬菌体攻击的葡萄树中没有观察到PD症状，并且，与未噬菌体攻击的葡萄树相比，XF15群体持续减少至几乎不可检测的水平。

在存在和不存在引入的宿主(XF15)的条件下，噬菌体群体的定量评价表明所述噬菌体能够在葡萄树中生长的敏感宿主中复制，并且在不存在敏感宿主的条件下减少。在病原体接种后4周用Xfas304攻击的菌株XF54进行的实验表现出与对于XF15攻击的葡萄树观察到的结果相似的结果。与在未进行噬菌体攻击的葡萄树中观察到的相比，在噬菌体攻击的葡萄树中，通过提取物的CFU/ml测量的葡萄树提取物中的XF54群体在8-12周减少。在XF54接种后8-12周(Xfas304攻击后4-8周)，在噬菌体攻击的葡萄树中没有观察到PD症状(图7，第7列)。在XF54的存在下，噬菌体群体随着攻击后时间期间增加，并且在不存在宿主的条件下减少，这又表明，当葡萄树中存在敏感的宿主时，所述噬菌体能够在敏感的宿主中复制。攻击研究的总结显示在图7中，表明在用噬菌体Xfas304攻击的(病原体接种后第4周)XF15或XF54接种的葡萄树中，在第5周后没有观察到PD症状(图7，第6和7列)，而在用XF15或XF54接种的、未进行噬菌体攻击的葡萄树中，分别在第9和10周发展症状(图7，第2和3列)。

使用接种了噬菌体Xfas304、然后在噬菌体接种后第4周用XF15攻击的葡萄树进行另外的研究，以确定噬菌体治疗的保护性(预防性)潜力。在用XF15攻击后4和8周，葡萄树没有表现出PD症状(图7，第8列)，而未进行噬菌体处理的葡萄树发展了症状(图7，第2列)。在存在XF15的条件下，在攻击期间后8-12周，噬菌体群体增加，并且在不存在宿主的条件下，噬菌体群体减少。

这些结果证实噬菌体治疗预防或减少植物中苛养木杆菌引起的症状，并且所述噬菌体治疗没有给植物带来不利的作用。

实施例13

样品收集和处理

将来自每棵葡萄树的两个防疫线分成5-6段，并且将各个段从底部到顶部编号。每段用带有20X115mm发生器的PRO250匀浆器20X115mm在15ml P-缓冲液(50mM Tris-HCl，pH7.5，100mM NaCl，8mM MgSO₄)中匀浆，通过无菌粗棉布(Fisher Scientific，USA)过滤，以去除植物组织残渣。为了测定噬菌体，将滤出液浓缩(10,000xg，15min)，并且过滤除菌。利用滤出液进行噬菌体DNA提取。相同的流程用于细菌测定，不同之处在于将沉淀重悬在1mlMilli-Q水中进行细菌DNA提取。

实施例14

样品的单叠氮化丙啶(Propidium Monoazide，PMA)处理

利用Nocker(J Microbiol Meth(微生物学方法杂志)67:310-20，2006)所述的PMA流程来从用于提供测定标准曲线和用于测定葡萄树组织提取物的测定中排除苛养木杆菌的死细胞。简言之，将PMA(Biotium Inc.，Hayward，CA)溶解在20％二甲亚砜(Sigma-Aldrich，德国)中，产生20mM的储液并且在-20℃保存在暗处。将体积为1.25μl的PMA储液加入到500μl苛养木杆菌细胞混悬液(A₆₀₀＝0.4；1X10⁹CFU/ml)中或来自对照和接种的葡萄树的提取物中。在反复倒转的条件下，将制备物在干净的微量离心管中在暗处温育5分钟。温育后，将所述微量离心管放置在冰上，并且以20cm的距离暴露于650-W卤素光源(Ushio，USA)1分钟。将管用手每15秒短时旋动，并且照射30秒后倒转，以确保可得到的DNA的完全交联和游离PMA转化为羟基氨基丙啶。在光诱导的交联后，通过离心收集存活的细胞(12000xg，在25℃2分钟)，并且用500μl无菌蒸馏水洗涤，并重悬在Mili-Q水中用于DNA提取。

使用ZR真菌/细菌DNA Miniprep(Zymo Research，USA)，按照供应商的使用说明，从PMA处理的细胞制备物和葡萄树提取物中提取细菌DNA。

使用带有Summer(Methods Mol.Biol.(分子生物学方法)502:27–46，2009)所述的改进的Wizard DNA提取系统(Promega，WI，USA)，提取来自对照制备物和来自植物提取物的噬菌体DNA。

实施例15

利用实时-PCR检测苛养木杆菌和噬菌体Xfas304

使用下述引物在7500实时PCR系统(Applied Biosystems，CA，USA)上进行基于SYBR-绿的实时PCR(RTPCR)：设计针对gyr B的苛养木杆菌-特异性引物INF2 5'-GTTTGATTGATGAACGTGGTGAG-3’(SEQ ID NO:1)和INR1 5'-CATTGTTTCTTGGTAGGCATCAG-3’(SEQ ID NO:2)(Bextine和Child，FEMS Microbiology Letters276:48-54，2007)，设计针对DNA引发酶基因的噬菌体Xfas304-特异性引物304-PrimF 5'-AAGAAGCGTGGTTTGTTTGC-3’(SEQ ID NO:3)和304-PrimR 5'-CTACCGGCTTCCCTAACTCC-3’(SEQ ID NO:4)。每次反应使用10μl Express SYBR绿ER SuperMix(Invitrogen)，0.4μl两种引物(浓度为10μM)，8.56μl无菌分子级水，0.04μl ROX参比染料(Invitrogen)和1μl DNA模板制备主混合物。标准化的条件用于所有的反应：在95℃3分钟的初始变性步骤，接着是40个循环的下述参数：95℃30s，55℃30s，和72℃30s。在PCR结束时，温度以0.5℃/10s的速度从72℃升高至99℃，并且每10s测量荧光。每份DNA样品一式三份进行分析。使用上文所述的方法从苛养木杆菌细胞和从噬菌体Xfas304裂解物提取的DNA作为阳性对照。使用由Applied Biosystems提供的软件包确定循环阈值(Ct)的值，该阈值描述荧光升高高于基线的PCR循环数。

为了确定用于绝对定量的标准曲线，将体积为1-ml的1X10⁸CFU/ml的XF15和XF54细胞混悬液用PMA流程进行处理。如上文所述提取细菌DNA，从1X10^-1连续稀释至1X10^-5并且进行上文所述的实时PCR测定。类似地，如上文所述，噬菌体DNA从体积为1ml的1X10⁹PFU/ml的噬菌体Xfas304提取，从1X10^-1稀释至1X10^-6并且进行实时PCR测定。将关于苛养木杆菌和噬菌体Xfas304的每份样品的三份重复用于产生标准曲线。通过将由实时PCR产生的Ct值针对苛养木杆菌DNA浓度(Log DNA conc./μl，通过A₂₆₀确定)绘图而构建标准曲线。效率(E)计算如下：E＝10^(-1/斜率)-1(Klein等，Electrophoresis(电泳)20:291–299，1999)。

实施例16

溶素原形成测定研究

为了测定噬菌体溶素原形成，检测噬菌体感染的存活者的原噬菌体的存在。对于每种噬菌体，以输入MOI为～3感染细菌，并且涂布在软琼脂覆盖物上。监测平板的菌落生长(对于苛养木杆菌菌株Temecula，监测10-15天，对于黄单胞菌属菌株EC-12，监测2-3天)。挑取出现的单个菌落，纯化(三次)并且通过将同一噬菌体的稀释液点样到软琼脂覆盖物上而重新检测噬菌体敏感性。然后，使用对Xfas 103和Xfas 106解旋酶基因或对Xfas 303和Xfas 304引发酶基因特异的引物对(表5)来检测在噬菌体-不敏感的分离株中原噬菌体序列的存在。野生型细菌DNA用作阴性对照，并且掺有噬菌体DNA的野生型细菌DNA作为阳性对照。

为了检测能否发现流产溶源性(abortive lysogeny)(即，建立抑制)的迹象，我们按照Gill等(Gill J.J.，等，J.Bacteriol.(细菌学杂志)，193:5300-5313(2011))的方法，不同之处在于通过三次连续的洗涤去除可逆结合的噬菌体。将对数生长的黄单胞菌属菌株EC-12的液体培养物培养至OD600为～0.3-0.5。将1ml的整分试样通过离心沉淀，并且重悬在0.20ml噬菌体裂解物(在TNB中收集)或无菌TNB中。在25℃温育30分钟后，将细菌-噬菌体混合物离心，取出上清并且滴定来确定吸附的噬菌体。在初步实验中，确定噬菌体是可逆结合的，这影响MIO_实际值的计算(Kasman，L.M.，等，J.Virol.(病毒学杂志)，76:5557-5564(2002))。为了防止这一问题并且获得准确的MIO实际值，将细胞重悬在无菌TNB中，允许在25℃温育5分钟，离心并且取出上清。将这一步骤重复三次，以去除未结合的噬菌体。滴定每份上清以确定PFU。将细胞沉淀重悬在0.20ml无菌TNB中，连续稀释并且涂布以计数在噬菌体暴露后残留的细菌存活者。从这些数据计算MOI_实际值，即，吸附的噬菌体的数目与不含噬菌体的对照中的CFU的数目的比率。使用Poisson分布，利用这些MOI_实际值来计算预测的未感染的细胞的比例。使用Xfas 103和Xfas 303重复该实验三次。

溶源性

为了确定溶源性的潜力，将苛养木杆菌菌株Temecula和黄单胞菌属菌株EC-12的40个噬菌体不敏感的分离株分别在噬菌体Xfas 103，Xfas 106，Xfas 303或Xfas 304攻击后回收。在抗性分离株中，使用噬菌体特异性的引物进行的PCR没有检测到噬菌体溶菌原的存在，这表明抗性不是由于溶源性导致的。另外，使用以高MOI的感染并测量存活(Gill等，(2011))检验流产溶源性的潜力。如表4所示，感染后，在预测的和实际的存活者之间没有显著差异，这表明以高MOI的噬菌体感染没有导致抑制的建立。总之，这些结果表明没有关于溶源性或抑制的迹象，这支持所述四种噬菌体是有毒的结论。

表4在暴露于噬菌体Xfas 103或Xfas 303a后，与黄单胞菌属菌株EC-12的测量的细菌存活者相比，基于MOI_实际值预测的细菌存活者。

预测的存活者由关于测量的MOI_实际值的Poisson分布计算。所示的数据来自三次独立的重复实验。

实施例17

噬菌体混合物保护和预防性研究

细菌菌株、噬菌体和接种物制备：用于本研究的细菌分离株为苛养木杆菌菌株Temecula(XF15)和XF54(见实施例3)。如实施例1所述，苛养木杆菌的培养物保持在PW-M上。如实施例11所述，制备XF15和XF54接种物。如实施例3所述，制备Xfas303，Xfas304，Xfas103和Xfas106的高滴度噬菌体裂解物(1x10¹⁰PFU/ml)，并进行滴定。通过混合四种噬菌体中的每一种而制备噬菌体混合物，获得每种噬菌体在所述混合物中的终浓度为1X10¹⁰PFU/ml。

用细菌和噬菌体混合物接种葡萄藤：将葡萄藤用苛养木杆菌菌株XF15或XF54接种，以评价细菌在葡萄藤中的运动。在接种后立即(0min)和在接种后8和12周一式三份测定葡萄藤。另外，将接种了XF15或XF54的葡萄藤在接种后3周用噬菌体混合物攻击，以评价治疗功效。在噬菌体接种后3周，将接种了噬菌体混合物的葡萄藤用XF15或XF54攻击，以评价所述混合物的预防功效。将来自每种治疗的葡萄藤每周两次针对症状发张进行评分。为了确定所述混合物所包含的单个噬菌体的分布，如下文所述，在接种后0，2，4，6，8，10和12周测定葡萄藤。如下文所述，在0，6，8，10和12周，测定在噬菌体或病原体攻击研究中接种的葡萄藤的噬菌体和/或苛养木杆菌感染。在接种后0，8和12周，测定对照葡萄藤，以监测病原体分布和疾病发展。所有的葡萄藤测定使用含有两个防疫线的葡萄树一式三份进行。将每个防疫线(例如，防疫线1＝S1，或防疫线2＝S2)分成5-6(5英寸)段。葡萄树节段从接种点(0)开始编号，并且在接种点之下(-)或之上(+)以5英寸的节段编号。根部分分成三段：R1，R2或R3。

样品收集和处理：为了定量混合物噬菌体和病原体，如实施例13所述获得样品。为了测定噬菌体，将滤出液离心(10,000X g，在4℃15分钟)，并且过滤除菌。将滤出液用于噬菌体DNA提取，以完成定量实时PCR(qRTPCR)(见下文)。相同的流程用于细菌测定，不同之处在于将沉淀重悬在1ml Milli-Q水中，用于分离用于qRTPCR的细菌DNA。将来自三棵葡萄树的具有相似的位置的三个节段(例如，0a,0b,0c)所产生的qRTPCR结果的平均值用于确定CFU和PFU。为了确定由于噬菌体攻击实验是否将发展出噬菌体-抗性的苛养木杆菌，如实施例13所述，处理在病原体接种后地12周从葡萄藤收集的样品。简言之，将100μl沉淀在1mlMilli-Q中的混悬液涂布在补充有40μg/ml环己酰亚胺的PW-MA(实施例1)(PW-MAC)上，并且在28℃温育。10-12天后，挑取单个菌落，并且在PW-MAC上划线纯化3次。如Hernandez-Martinez等(实施例1)所述，利用PCR分析在物种和亚种水平上验证来自每份葡萄藤样品的代表性的单个菌落(总共20个菌落)。如实施例3所述，通过在覆盖物上的连续稀释点测定和软琼脂覆盖物方法确定验证的分离株的噬菌体敏感性。

PMA处理和qRTPCR：如实施例15所述，PMA处理和基于SYBR-绿的qRTPCR流程，其使用表5列出的苛养木杆菌-特异性引物INF2(SEQ ID NO:1)与INR1(SEQ ID NO:2)和噬菌体-Xfas303特异性引物303-PrimF(SEQ ID NO:5)与303-PrimR(SEQ ID NO:6)，Xfas304特异性引物304-PrimF(SEQ ID NO:3)与304-PrimR(SEQ ID NO:4)，Xfas103-特异性引物103-HelF(SEQ ID NO:7)与103-HelR(SEQ ID NO:8)；以及Xfas106-特异性引物106-HelF(SEQ IDNO:9)与106-HelR(SEQ ID NO:10)进行。

表5.用于qRT_PCR的引物(SEQ ID NOs.1-10)。

*所有的PCR反应都进行40个循环：95℃变性30秒，55℃退火30秒，和在72℃延伸30秒。

葡萄藤中苛养木杆菌的运动和疾病发展：来自XF15或XF54接种的葡萄藤的三份样品的两个防疫线的定量测定显示病原体在所测定的葡萄藤节段中的运动。qRTPCR分别检测节段(Seg)S1/1(防疫线1，在接种点上方5英寸的节段1)和S2/1中平均为1X10⁴和1X10⁵CFU/gm植物组织(gpt)的XF15的存在，和在接种后第8周，平均值为1X10⁴CFU/gpt的XF54在S1/2和S2/2中的存在。典型的皮尔斯病症状是可见的，如叶片沿着边缘变得略黄或红，并且在未进行混合物攻击的葡萄藤中在桀纣后第8周叶片边缘变干或坏死。在接种后第12周，分别在S1/3和S2/2中检测平均值为1X10⁴和1X10⁶CFU/gpt的XF15。以同样的测定时间间隔，在接种后第12周，用表现出PD症状的葡萄藤分别检测在S1/3和S2/1中的平均值为1X10⁵和1X10⁴CFU/gpt的XF54。在病原体接种后第8和12周，以1X10¹-1X10²CFU/gpt的平均值检测葡萄树根系统中的两种病原体(XF15和XF54)。

噬菌体在葡萄藤中的运动和持久性：对噬菌体Xfas303，Xfas304，Xfas103，和Xfas106获得标准qRTPCR线图，所述线图具有大于0.9的R2值和分别为127％、123％、129％与120％的效率。来自用噬菌体混合物(Xfas303，Xfas304，Xfas103和Xfas106)接种的葡萄藤的三份样品的两个防疫线的定量评估显示所有噬菌体分别在混合物接种后第2-8周测定的葡萄藤节段中分布(图8)。到第8和12周，在根中不再能检测到个体噬菌体，并且到第12周，在测定的节段中减少到平均值为1X10¹-1X10²PFU/gpt，没有观察到葡萄藤症状(图8)。

噬菌体针对葡萄藤中的苛养木杆菌的治疗功效：接种了XF15的葡萄藤在病原体接种后三周用噬菌体混合物攻击。在8周(混合物刺激后5周)，与攻击的葡萄藤相比，在未攻击的葡萄藤中，XF15群体平均高2-3个对数。未治疗性治疗的葡萄藤表现出典型的PD症状，而攻击的葡萄藤不表现出该症状。在XF15接种后第12周(混合物攻击后9周)，当与噬菌体混合物攻击的葡萄藤相比时，在未攻击的葡萄藤中，细菌群体平均高2-3个对数(图9)。在整个试验过程中(12周)，在噬菌体攻击的葡萄藤中没有观察到PD症状，而未进行混合物治疗的葡萄藤早在4周时就表现出症状，该症状到第12周一直发展。类似地，与未攻击的葡萄藤相比，在用XF54-接种的混合物攻击的葡萄藤中，细菌群体从第8周到第12周显著减少，在混合物攻击的葡萄藤中没有观察到症状。涂布来自12周混合物攻击的葡萄藤的植物提取物产生1X10²CFU/gpt的平均值。证实为来自三棵葡萄藤的每一棵的每条防疫线的苛养木杆菌的代表性的分离株(20ea)都对组成所述混合物的四种噬菌体敏感。

用于预防葡萄藤中的PD的混合物治疗的预防功效：通过先用混合物接种葡萄藤然后在混合物接种后第3周用苛养木杆菌菌株XF15或XF54攻击来评价噬菌体混合物的预防功效。预防性治疗的葡萄藤在混合物后接种后8和12周没有表现出PD症状。在用XF15攻击的混合物接种的葡萄藤中，在第8和12周检验的葡萄藤节段中，病原体群体达到最大平均值1X10³CFU/gpt，并且在未预防性治疗的葡萄藤中高至平均值为1X10⁶CFU/gpt。在用混合物预防性治疗任何在噬菌体混合物接种后第3周用XF54攻击的葡萄藤中观察到相似的结果。涂布来自12周混合物攻击的葡萄藤的植物提取物产生3X10²CFU/gpt的平均值。证实为来自三棵葡萄藤的每一棵的每条防疫线的苛养木杆菌的代表性分离株(20ea)都对组成所述混合物的四种噬菌体敏感。

噬菌体在葡萄藤中的持久性和复制：有兴趣确定在存在或不存在引入的宿主(XF15和XF54)的条件下葡萄藤中的噬菌体群体。在存在或不存在宿主的条件下噬菌体群体的定量证实，在治疗和预防性研究中，如果在葡萄藤中存在敏感宿主，所述混合物噬菌体能够复制并且保持较高的群体，并且当不存在敏感宿主时，则减少(图10和11)。在8-12周，在不包含宿主的葡萄藤中的噬菌体群体减少，而在相同的时间期间内在接种了XF15或XF54并且用噬菌体混合物攻击(治疗性治疗)的葡萄藤中，噬菌体群体平均增加1-2个对数(图10)。在治疗性研究中获得相似的结果，与在不包含宿主的葡萄藤中观察到的群体相比，噬菌体群体平均增加1-2个对数(图11)。这些结果证实噬菌体治疗预防或减少植物中由苛养木杆菌引起的PD症状，并且证明对所治疗的植物没有不利的作用。

实施例18

通过玻璃翅叶蝉传播苛养木杆菌

玻璃翅叶蝉(GWSS)，即，琉璃叶蝉(Homalodisca vitripennis)，是一种传播苛养木杆菌的咬噬木质部的叶蝉。GWSS在南加利福尼亚和德克萨斯的整个葡萄种植地区盛行。在三个试验中，将实验室培养的不含苛养木杆菌的GWSSs在携带苛养木杆菌或有毒噬菌体Xfas304的豇豆(cowpea)(豇豆(Vigna unguiculata)亚种unguiculata)植物上喂饲48小时，以检验GWSS对苛养木杆菌或噬菌体的吸收。为了确定GWSSs向植物传播细菌后噬菌体的能力，将携带细菌或噬菌体的GWSSs在不含细菌和噬菌体的植物上喂饲。通过将携带细菌的GWSSs子集在携带噬菌体的植物上喂饲48或96小时而攻击所述GWSSs。在所有实验中用qRTPCR分别测定GWSSs和植物，以评价细菌和/或噬菌体的吸收、传播或持久性。GWSSs能够吸收并转移苛养木杆菌和/或噬菌体。在携带苛养木杆菌并用噬菌体攻击的GWSSs中，与在不含苛养木杆菌的GWSSs中观察到的滴度相比，噬菌体Xfas304的滴度增加两倍。与未攻击的相比，当用噬菌体Xfas304攻击时，在GWSSs中观察到细菌群体减少两倍。GWSSs向植物传播苛养木杆菌和/或噬菌体。据信这是GWSSs作为噬菌体传播者的首次报道。

细菌菌株、噬菌体和接种物制备：本研究中使用苛养木杆菌菌株XF54(见实施例1)和噬菌体Xfas304(见实施例3)。如实施例1所述，XF54培养物在PW-M上生长。将在PW-MA上生长5天的XF54培养物用于制备在磷酸缓冲液(0.125M，pH 7.1)中的细菌混悬液。制备高滴度的Xfas304噬菌体裂解物(1x10¹⁰PFU/ml)，并且如实施例3所述在无菌去离子水(SDW)中滴定。

植物生长条件和制备：在3英寸的盆中用Metro-Mix种植豇豆(豇豆亚种unguiculata)植物并且维持在24℃-29℃(分别为16和8小时的光照和黑暗)并且按需要浇水。

玻璃翅叶蝉：将实验室培养的GWSSs在下述两个地点的任一个的温室中初始培养多代：(i)Arvin的加利福尼亚食品和农业部(CDFA)，或(ii)加利福尼亚州San Marcos的加利福尼亚合作推广大学。本研究中所用的所有GWSSs都是成年雄虫和雌虫，并且从上述两个地点转运而来。接收后，在用于实验之前，将昆虫在保持在24℃-29℃的豇豆植物(分别为16和8小时光照和黑暗)上喂饲两天，以适应新的气候。

实验设计：每个实验单位(即，笼子)包含3-4片叶阶段的15-cm-长的豇豆茎和50ml平底管，所述平底管适当地具有50-ml在SDW中的噬菌体或细菌混悬液。在3-4片叶阶段的带有叶子的豇豆茎(截下的茎)是从插入到孔中的两周龄或三周龄的植物上收集的，所述孔具有帽(cap)并且用石蜡固定在原地(固定的截下的茎)。GWSSs(3只GWSS/截下的茎/笼)放置在笼中，并且允许适当地喂饲。

GWSSs对苛养木杆菌和噬菌体的吸收：为了确定GWSSs对苛养木杆菌和/或噬菌体的吸收，将带有叶子的豇豆截下的茎固定在充满苛养木杆菌(1x10⁹CFU/ml)或噬菌体Xfas304(1x10¹⁰PFU/ml)混悬液的管中4小时，以允许对苛养木杆菌或噬菌体的毛细吸收。对照截下的茎放置在SDW中。允许截下的茎吸收适当的混悬液4小时后，测定子集(3个截下的茎)以定量苛养木杆菌或Xfas304。在4小时的吸收期后，允许GWSSs(3只GWSSs/截下的茎/笼)在截下的茎上喂饲。每个实验组进行三次(1个截下的茎X 3只GWSSs X 3个笼)。48小时后，测定所有豇豆截下的茎和GWSSs，以通过qRTPCR定量苛养木杆菌和/或噬菌体的存在。对于所有的实验在相同条件下进行水吸收对照，并且测定苛养木杆菌和噬菌体。

设计初始实验来确定GWSSs能否从携带病原体或噬菌体的截下的茎中获得苛养木杆菌或噬菌体，并且如果能够获得，确定它们能否将所述苛养木杆菌或噬菌体转移到其他截下的茎上。48小时后，截下的茎和GWSSs分别携带平均2X10⁸±1X10⁸CFU/g植物组织(gpt)和1X10⁶±0.7X10⁶CFU/GWSS，，这证实GWSSs能够获得苛养木杆菌，如之前所报道的那样(Bextine等，Biotechniques(生物技术)38:184，186，2005)。在确定噬菌体能否被GWSSs通过在截下的茎上喂饲而获得的平行实验中，48小时后测定的GWSSs携带平均2X10⁶±0.9X10⁶PFU/GWSS，其实从含有2X10⁸±1X10⁸PFU/gpt的截下的茎中获得的。结果表明GWSSs能够通过在截下的茎上喂饲而获得噬菌体。

GWSSs对噬菌体的吸收和转移：为了确定GWSSs对噬菌体的吸收和转移，将豇豆截下的茎(9个)固定在充满噬菌体Xfas304混悬液(1x10¹⁰PFU/ml)的50-ml管中。对照(3个截下的茎)放置在SDW中。允许两组截下的茎吸收各自的培养基。4小时后，测定允许吸收噬菌体的截下的茎中的三个来确定噬菌体浓度。余下的6个截下的茎分别放置在单个具有GWSSs的笼中(3只GWSSs/截下的茎/笼)。48小时后，测定9只GWSSs及其各自的3个截下的茎的噬菌体含量，并将其余的9只GWSSs转移到固定在SDW中的新鲜的豇豆截下的茎中(3只GWSSs/截下的茎X 3笼)，并且允许再喂饲48小时，以确定噬菌体向截下的茎中的转移。在指定的期间后，测定截下的茎(3个)和GWSSs(9只)的噬菌体。对于所有实验在相同条件下进行水吸收对照，并且测定噬菌体。

已经确定GWSSs能够获得噬菌体和细菌二者，有兴趣确定从截下的茎获得噬菌体的GWSSs能否将噬菌体和/或细菌转移到另一个截下的茎中。将携带噬菌体的GWSSs子集转移至在SDW中的新鲜的豇豆截下的茎中，并且允许喂饲。48小时后，所述截下的茎和GWSSs分别携带平均3X10²±2.5X10²PFU/gpt和3X10³±1.6X10³PFU/GWSSs，这表明GWSSs能够转移噬菌体。

携带苛养木杆菌的GWSSs的噬菌体攻击：为了确定噬菌体能否影响GWSSs中的苛养木杆菌群体，将携带苛养木杆菌的GWSSs用噬菌体攻击。简言之，使用上文所述的方法，三次重复，将在含有苛养木杆菌的截下的茎上喂饲的GWSSs(证实包含苛养木杆菌)转移至吸收噬菌体Xfas304的豇豆截下的茎，并且允许喂饲。喂饲48小时或96小时后，测定所述截下的茎和GWSSs的噬菌体和/或苛养木杆菌。对于苛养木杆菌的吸收，在引入GWSSs之前，将豇豆截下的茎(15个)放置在XF54混悬液(1x10⁹CFU/ml)中4小时。4小时时，测定3个截下的茎的苛养木杆菌。将其余12个截下的茎中的每一个放置在笼中，3只GWSSs/截下的茎，并且允许GWSSs在含有苛养木杆菌的截下的茎上喂饲48小时。48小时后，将苛养木杆菌喂饲的苛养木杆菌和宿主截下的茎再分成3组：第1组测定苛养木杆菌(3个截下的茎和9只GWSSs)；第2组(9只GWSSs)转移到放置在SDW中的新鲜的豇豆截下的茎(3个)，并且允许喂饲48小时，然后测定GWSSs和截下的茎的苛养木杆菌；第3组(18只GWSSs)转移至放置在XFas304混悬液(1x10¹⁰PFU/ml)中的豇豆截下的茎(3个)中，并且允许喂饲48或96小时，然后测定GWSSs和截下的茎的苛养木杆菌和噬菌体。对于所有实验在相同条件下进行水吸收对照，并且测定噬菌体和噬菌体二者。

允许36只GWSSs在苛养木杆菌混悬液中的豇豆截下的茎上喂饲，然后进行测定来确定GWSSs中的苛养木杆菌吸收，苛养木杆菌和/或噬菌体转移，和对噬菌体和/或苛养木杆菌的影响。确定允许在已经放置在苛养木杆菌菌株XF54(3X10⁹CFU/ml)中的截下的茎上喂饲48小时的GWSSs(第1组)携带平均1X10⁶±0.7X10⁶CFU/GWSSs，并且确定宿主喂饲的截下的茎携带平均2X10⁸±1X10⁸CFU/gpt。在允许携带苛养木杆菌的GWSSs(第2组；1X10⁶±0.7X10⁶CFU/GWSS)在SDW中的新鲜的截下的茎上喂饲48小时后，所述截下的茎表现出平均1X10³±1.3X10³CFU/gpt，并且所述GWSSs表现出平均2X10³±1X10³CFU/GWSSs残留的苛养木杆菌；这再次证实之前的结果：GWSSs转移苛养木杆菌。第3组携带苛养木杆菌的GWSSs转移到在Xfas304混悬液(2X10¹⁰PFU/ml)中的截下的茎上，并且允许喂饲48小时，显示出噬菌体的吸收和苛养木杆菌的持久性。在喂饲48小时测定的GWSSs携带平均3X10⁴±1.8X10⁴PFU/GWSS Xfas304，并且保留2X10³±1.1X10³CFU/GWSSs XF54。在相同时间间隔测定的截下的茎包含平均3X10⁸±2X10⁸PFU/gpt和2X10³±0.6X10³CFU/gpt。允许喂饲96小时的所述GWSSs携带平均2X10⁵±1.2X10⁵PFU/GWSS Xfas304和1X10²±0.9X10²CFU/GWSS XF54，这表明XF54的减少和Xfas304的平均6倍的增加。

豇豆截下的茎和GWSSs的校正和测定：通过在-20℃冷冻5分钟处死GWSSs，并且通过用无菌剃刀在管盖连接处切割而收集豇豆截下的茎。将每三份的每只GWSS放置在具有0.5ml P-缓冲剂(50mM Tris-HCl，pH7.5，100mM NaCl，8mM MgSO₄)的1.5-ml微量离心管仲，用无菌塑料微研棒(Fisher)匀浆，并且通过无菌粗棉布(Fisher Scientific，USA)过滤，以去除组织残渣。三份中每一份的每个截下的茎称重，并用无菌刀片切小(commuted)，在1mlP-缓冲液中用研钵和研棒匀浆，通过无菌粗棉布(Fisher Scientific，USA)过滤，以去除组织残渣。为了测定噬菌体，将滤出液离心(10,000x g，15min)并且过滤除菌。一部分滤出液用于噬菌体DNA提取，如实施例9所述，然后如下文所述进行qRTPCR。其余部分的滤出液用于滴定噬菌体，如实施例3所述。相同的流程用于细菌测定(CFUs)，不同之处在于将沉淀重悬在0.5ml无菌Milli-Q水中用于PMA处理，细菌DNA提取和qRTPCR，如下文所述。

PMA处理和qRTPCR：PMA处理和基于SYBR-绿的qRTPCR流程如实施例17所述进行，qRTPCR流程用苛养木杆菌-和噬菌体-特异性的引物进行。

实施例19

针对地毯草黄单胞菌柑橘致病变种的噬菌体活性

尽管之前的研究已经评价了噬菌体用于控制柑橘溃疡病的应用，但是没有决定性的数据证实所述噬菌体的有毒性质(Balogh等，Plant Disease(植物病害)，92:1048-1052，2008)。仅有有毒的、非转导性的噬菌体应该用于评价和实施可持续的噬菌体生物控制系统。分别检测从佛罗里达获得的三种Xac田野菌株(North 40，Block 22，Fort Basinger)对短尾病毒科(Xfas303)和管状病毒科(Xfas103)的两种充分表征的有毒噬菌体的敏感性。结果表明所检测的三种Xac菌株仅对噬菌体Xfas303敏感(图12)。噬菌体Xfas303在所检测的三种Xac菌株上能够形成透明的噬菌斑。对Xfas303基因组进行454次焦磷酸测序，并且完全注解预测的基因。发现存在单亚基RNA聚合酶(SSRNAP)，其指示有毒噬菌体，如T7和KMV(Dunn等，J.Mol.Biol.(分子生物学杂志)166:477-53521，1983；Lavigne等，Virology(病毒学)312:49-59，2003)。另外，通过在细菌中制备pilA的符合阅读框的缺失突变体而确定黄单胞菌属物种菌株EC-12的IV型菌毛是噬菌体Xfas303的主要受体位点。噬菌体Xfas303和Xfas103都吸附菌株EC-12并且在其上形成透明的噬菌斑，但是在ΔpilA衍生物上没有形成噬菌斑，这显示仅关于将噬菌体Xfas303涂布在EC-12或EC-12ΔpilA上的结果。还确定IV型菌毛是噬菌体Xfas303的主要受体位点；由此，对于感染，该噬菌体可能具有不同的次要受体位点需要，或者噬菌体DNA是受限的。结果表明开发的非Xac依赖性方法可以用来分离针对Xac的有毒的噬菌体，而不具有涂布效率的损失(EOP为0.75)。

实施例20

Xac中的IV型菌毛表达的证据

文献中的报道与IV型菌毛在Xac的感染过程和发病机制中的表达和作用相抵触(Brunings等，Mol.Plant.Pathol.(分子植物病理学)4:141-57，2003；Li等，PLoS ONE 6:e21804，2011；Yang等，Curr.Microbiol.(现代微生物学)48:251-61，2004)。上述结果表明所检测的所有三个Xac菌株都表达功能性IV型菌毛，原因在于菌毛必须收缩以促进噬菌体的吸附和感染。利用光学显微镜研究，评价三个Xac菌株的蹭行运动，其是功能性IV型菌毛的指示。铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)菌株PAO1和黄单胞菌属物种菌株EC-12用作阳性对照，并且EC-12ΔpilA用作阴性对照。评价三个Xac菌株(North 40，Block 22和Fort Basinger)的蹭行运动。PAO1，EC-12和三个Xac菌株表现出蹭行运动，而EC-12ΔpilA没有表现出蹭行运动。显微镜研究印证了噬菌体敏感性检测获得的结果，并且表明三个Xac菌株具有作用为噬菌体Xfas303的吸附位点的功能性IV型菌毛。结果印证了其他人的观察(Brunings等，Mol.Plant.Pathol.(分子植物病理学)4:141-57，2003；Li等，PLoS ONE 6:e21804，2011；Yang等，Curr.Microbiol.(现代微生物学)48:251-61，2004)，即，Xac表达IV型菌毛。

Claims

1.一种预防或减少植物中由苛养木杆菌(Xylella fastidiosa)或黄单胞菌属(Xanthomonas)引起的症状或病害的方法，所述方法包括：使所述植物与在其宿主范围中包括苛养木杆菌(X.fastidiosa)和/或黄单胞菌属的有毒噬菌体接触。

2.根据权利要求1所述的方法，其中所述噬菌体为选自由Xfas100噬菌体，Xfas300噬菌体组成的组的至少一种Xfas100-型或Xfas300-型噬菌体，其中Xfas100噬菌体类型表现出至少一种下述特征：

(a)所述噬菌体能够裂解所述苛养木杆菌和/或黄单胞菌属细菌；

(b)所述噬菌体通过结合IV型菌毛感染细胞；

(c)所述噬菌体包含非收缩性的尾部和直径在55-77mm范围内的衣壳大小，具有典型管状病毒科(Siphoviridae family)的形态；

(d)所述噬菌体的基因组大小为约55500bp至56200bp；和

(e)所述噬菌体预防或减少一种植物或多种植物中与皮尔斯病相关的症状；

进一步地，其中Xfas300噬菌体类型表现出至少一种下述特征：

(f)所述噬菌体能够裂解所述苛养木杆菌和/或黄单胞菌属细菌；

(g)所述噬菌体通过结合IV型菌毛感染细胞；

(h)所述噬菌体包括短尾病毒科(Podoviridae family)的典型的形态，其特征在于非收缩性的尾部，具有直径在58-68mm范围内的衣壳大小；

(i)所述噬菌体的基因组大小为约43300bp至44600bp；和

(j)所述噬菌体预防或减少一种植物或多种植物中与皮尔斯病相关的症状。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其中接触包括向所述植物中引入噬菌体颗粒。

4.根据权利要求3所述的方法，其中所述植物是葡萄藤，柑橘属，杏树属，咖啡树，苜蓿，夹竹桃，栎属树，香枫，紫荆属，榆树，桃树，杏树，李属，黑莓，桑树，或梓柳(Chitalpatashkentensis)植物。

5.根据权利要求4所述的方法，其中所述接触包括通过注射，通过昆虫媒介，经由根系统，通过注射，通过喷洒，通过薄雾或通过粉末接触所述植物而将噬菌体引入到所述植物中。

6.根据权利要求5所述的方法，其中所述昆虫媒介是玻璃翅叶蝉。

7.根据权利要求5所述的方法，其中引入到所述植物中的所述噬菌体的数目为1至1X10¹²PFU/ml。

8.根据权利要求1或2所述的方法，其中向所述植物中同时或先后引入两个、三个、四个、五个或六个对苛养木杆菌和/或黄单胞菌属物种有毒的噬菌体株。

9.根据权利要求1或2所述的方法，其定义为包括使植物群体与所述噬菌体接触，以预防或减少所述群体中由苛养木杆菌(X fastidiosa)引起的症状。

10.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述Xfas100噬菌体类型包含具有选自由下述组成的组的DNA序列的基因组：SEQ ID NO:11，SEQ ID NO:12，SEQ ID NO:13，SEQ ID NO:14，SEQ ID NO:15，SEQ ID NO:16，SEQ ID NO:17和SEQ ID NO:18；或所述Xfas300噬菌体类型包含具有选自由下述组成的组的DNA序列的基因组：SEQ ID NO:19，SEQ ID NO:20，SEQID NO:21，SEQ.ID 22，SEQ ID NO:23，和SEQ ID NO:24。

11.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述有毒噬菌体是选自Xfas100噬菌体类型和/或Xfas300噬菌体类型的至少一种噬菌体，其中所述Xfas100噬菌体类型是选自由下述组成的组的至少一种噬菌体：Xfasl03和Xfasl06；并且所述Xfas300噬菌体类型是选自由下述组成的组的至少一种噬菌体：Xfas302，Xfas303，Xfas304和Xfas306；其中所述噬菌体类型已经以分别针对噬菌体Xfas103，Xfas106，Xfas302，Xfas303，Xfas304和Xfas306的ATCC登记号PTA-13096，PTA-13095，PTA-13098，PTA-13099，PTA-13100和PTA-13097进行了保藏。

12.配制用于递送至植物的植物病害生物控制组合物，所述组合物包含至少一种载体和至少一种选自由下述组成的组的噬菌体：Xfasl00噬菌体类型，Xfas300噬菌体类型，其中所述噬菌体对苛养木杆菌和黄单胞菌属物种是有毒的。

13.权利要求12的植物病害生物控制组合物，其中所述噬菌体是选自由Xfasl00噬菌体类型和Xfas300噬菌体类型组成的组的至少一种噬菌体，其中所述Xfas100噬菌体类型表现出至少一种下述特征：

(b)所述噬菌体通过结合IV型菌毛感染细胞；

(c)所述噬菌体包含非收缩性的尾部和直径在55-77mm范围内的衣壳大小，具有典型管状病毒科的形态；

(d)所述噬菌体的基因组大小为约55500bp至56200bp；和

进一步地，其中所述Xfas300噬菌体类型表现出至少一种下述特征：

(g)所述噬菌体通过结合IV型菌毛感染细胞；

(h)所述噬菌体包括短尾病毒科的典型的形态，其特征在于非收缩性的尾部，具有直径在58-68mm范围内的衣壳大小；

(i)所述噬菌体的基因组大小为约43300bp至44600bp；和

14.权利要求12的植物病害生物控制组合物，其中所述Xfasl00噬菌体类型是选自由Xfasl03和Xfasl06噬菌体组成的组的至少一种噬菌体，并且所述Xfas300噬菌体类型是选自由Xfas302，Xfas303，Xfas304和Xfas306噬菌体组成的组的至少一种噬菌体；其中所述噬菌体类型的代表性样品已经针对噬菌体Xfas103，Xfas106，Xfas302，Xfas303，Xfas304和Xfas306分别以ATCC登记号PTA-13096，PTA-13095，PTA-13098，PTA-13099，PTA-13100和PTA-13097进行了保藏。

15.权利要求12的植物病害生物控制组合物，其中所述Xfas100噬菌体类型包含具有选自由下述组成的组的DNA序列的基因组：SEQ ID NO:11，SEQ ID NO:12，SEQ ID NO:13，SEQID NO:14，SEQ ID NO:15，SEQ ID NO:16，SEQ ID NO:17和SEQ ID NO:18；和所述Xfas300噬菌体类型包含具有选自由下述组成的组的DNA序列的基因组：SEQ ID NO:19，SEQ ID NO:20，SEQ ID NO:21，SEQ.ID 22，SEQ ID NO:23，和SEQ ID NO:24。

16.权利要求12至15中的组合物，其还定义为配制用于通过注射、喷洒、薄雾或粉末引入到植物中。

17.分离的噬菌体，所述噬菌体对苛养木杆菌和黄单胞菌属物种有毒，其中所述噬菌体是选自由Xfas100噬菌体类型和Xfas300噬菌体类型组成的组的至少一种噬菌体。

18.根据权利要求17所述的分离的噬菌体，其中所述噬菌体对苛养木杆菌和黄单胞菌属物种有毒，其中所述噬菌体是选自由Xfas100噬菌体类型和Xfas300噬菌体类型组成的组的至少一种噬菌体，其中所述Xfas100噬菌体类型表现出至少一种下述特征：

(b)所述噬菌体通过结合IV型菌毛感染细胞；

(d)所述噬菌体的基因组大小为约55500bp至56200bp；和

(g)所述噬菌体通过结合IV型菌毛感染细胞；

(i)所述噬菌体的基因组大小为约43300bp至44600bp；和

19.根据权利要求17所述的分离的噬菌体，其中所述Xfasl00噬菌体类型包括选自由Xfasl03和Xfasl06组成的组的至少一种噬菌体，并且所述Xfas300噬菌体类型包括选自由Xfas302，Xfas303，Xfas304和Xfas306组成的组的至少一种噬菌体；其中所述噬菌体类型已经针对噬菌体Xfas103，Xfas106，Xfas302，Xfas303，Xfas304和Xfas306分别以ATCC登记号PTA-13096，PTA-13095，PTA-13098，PTA-13099，PTA-13100和PTA-13097进行了保藏。

20.根据权利要求17所述的分离的噬菌体，其中所述Xfas100噬菌体类型包含具有选自由下述组成的组的DNA序列的基因组：SEQ ID NO:11，SEQ ID NO:12，SEQ ID NO:13，SEQ IDNO:14，SEQ ID NO:15，SEQ ID NO:16，SEQ ID NO:17和SEQ ID NO:18；和所述Xfas300噬菌体类型包含具有选自由下述组成的组的DNA序列的基因组：SEQ ID NO:19，SEQ ID NO:20，SEQ ID NO:21，SEQ.ID 22，SEQ ID NO:23，和SEQ ID NO:24。

21.一种预防或减少植物中由地毯草黄单胞菌柑橘致病变种(Xanthomonasaxonopodis pv.citri)引起的症状或病害的方法，所述方法包括使所述植物与对地毯草黄单胞菌柑橘致病变种有毒的噬菌体接触，其中所述噬菌体是Xfas300噬菌体类型。

22.权利要求21的方法，其中所述Xfas300噬菌体类型的有毒的噬菌体表现出至少一种下述特征：

(b)所述噬菌体通过结合IV型菌毛感染细胞；

(c)所述噬菌体包含非收缩性的尾部和直径在58-68mm范围内的衣壳大小，具有典型短尾病毒科的形态；

(d)所述噬菌体的基因组大小为约43300bp至44600bp；和

(e)所述噬菌体预防或减少一种植物或多种植物中与皮尔斯病相关的症状。

23.权利要求21或22的方法，其中接触包括向所述植物中引入所述噬菌体。

24.权利要求23的方法，其中所述植物是柑橘属(Citrus)物种、金桔属(Fortunella)物种、枳属(Poncirus)物种、酸橙、柠檬、橙子、葡萄柚、柚子或用作砧木的枸橘的杂交体。

25.权利要求23的方法，其中所述噬菌体通过注射、通过昆虫媒介引入到所述植物中，或者经由根系统通过注射、通过喷洒、通过薄雾或通过向所述植物撒粉末进行递送。

26.权利要求23的方法，其中所述昆虫媒介是玻璃翅叶蝉。

27.权利要求24的方法，其中要引入到所述植物中的所述噬菌体的数目为1至1X10¹²PFU/ml。

28.权利要求24的方法，其定义为包括使植物群体与噬菌体颗粒接触，以预防或减少所述群体中与地毯草黄单胞菌(Xanthomonas axonopodis)及其致病变型相关的症状。

29.权利要求24的方法，其中所述Xfas300噬菌体类型包含含有选自由下述组成的组的DNA序列的基因组：SEQ ID NO:19，SEQ ID NO:20，SEQ ID NO:21，SEQ ID NO:22，SEQ IDNO:23和SEQ ID NO:24。

30.权利要求24的方法，其中所述Xfas300噬菌体类型的基因组包含SEQ ID NO:21。

31.权利要求24的方法，其中所述噬菌体是选自由Xfas302，Xfas303，Xfas304和Xfas306组成的组的至少一种噬菌体，其中所述噬菌体的Xfas302，Xfas303，Xfas304和Xfas306的代表性样品已经以ATCC登记号PTA-13098，PTA13099，PTA-13100和PTA-13097进行了保藏。

32.权利要求24的方法，其中所述有毒的噬菌体是Xfas303，其样品以ATCC登记号PTA-13099保藏。

33.一种繁殖在其宿主范围中包括苛养木杆菌的有毒噬菌体的方法，所述方法包括下述步骤：(a)用所述有毒噬菌体感染黄单胞菌属细菌的培养物；(b)允许所述噬菌体繁殖；和(c)从所述培养物分离有毒噬菌体颗粒。

34.权利要求33的方法，其中所述噬菌体从植物、废水和/或土壤水分离。

35.权利要求33的方法，其中所述黄单胞菌属细菌的培养物包括黄单胞菌属菌株EC-12，所述菌株以ATCC登记号PTA-13101保藏。

36.权利要求33的方法，其还包括使用琼脂覆盖物来生长所述噬菌体。

37.一种获得用于皮尔斯病的候选生物控制剂的方法，所述方法包括使苛养木杆菌和/或黄单胞菌属细菌与包含有毒噬菌体群体的样品接触，并且从所述群体分离能够裂解所述苛养木杆菌和/或黄单胞菌属细菌的至少第一噬菌体。

38.根据权利要求37所述的方法，其中所述样品从植物、废水和/或土壤水分离。

39.根据权利要求37所述的方法，其还包括：检测有毒噬菌体在苛养木杆菌和/或黄单胞菌属细菌宿主的培养物覆盖物上的区带或噬菌斑形成。