CN110352880B - 一种紫菜黄斑病的治疗方法 - Google Patents
一种紫菜黄斑病的治疗方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN110352880B CN110352880B CN201910745546.2A CN201910745546A CN110352880B CN 110352880 B CN110352880 B CN 110352880B CN 201910745546 A CN201910745546 A CN 201910745546A CN 110352880 B CN110352880 B CN 110352880B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- phage
- laver
- yong
- filament
- culture
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 13
- 241000206609 Porphyra Species 0.000 title description 7
- 241000206607 Porphyra umbilicalis Species 0.000 claims abstract description 36
- 238000004321 preservation Methods 0.000 claims abstract description 4
- 201000010099 disease Diseases 0.000 claims description 8
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 claims description 8
- 241001515965 unidentified phage Species 0.000 abstract description 17
- 208000035719 Maculopathy Diseases 0.000 abstract description 9
- 208000002780 macular degeneration Diseases 0.000 abstract description 9
- 230000008901 benefit Effects 0.000 abstract description 3
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 abstract description 3
- 239000013535 sea water Substances 0.000 description 27
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 24
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 20
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 19
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 18
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 17
- 241000195493 Cryptophyta Species 0.000 description 13
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 10
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 8
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 8
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 7
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 6
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 6
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 6
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 6
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 6
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 5
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 5
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 5
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 4
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- FJWGYAHXMCUOOM-QHOUIDNNSA-N [(2s,3r,4s,5r,6r)-2-[(2r,3r,4s,5r,6s)-4,5-dinitrooxy-2-(nitrooxymethyl)-6-[(2r,3r,4s,5r,6s)-4,5,6-trinitrooxy-2-(nitrooxymethyl)oxan-3-yl]oxyoxan-3-yl]oxy-3,5-dinitrooxy-6-(nitrooxymethyl)oxan-4-yl] nitrate Chemical compound O([C@@H]1O[C@@H]([C@H]([C@H](O[N+]([O-])=O)[C@H]1O[N+]([O-])=O)O[C@H]1[C@@H]([C@@H](O[N+]([O-])=O)[C@H](O[N+]([O-])=O)[C@@H](CO[N+]([O-])=O)O1)O[N+]([O-])=O)CO[N+](=O)[O-])[C@@H]1[C@@H](CO[N+]([O-])=O)O[C@@H](O[N+]([O-])=O)[C@H](O[N+]([O-])=O)[C@H]1O[N+]([O-])=O FJWGYAHXMCUOOM-QHOUIDNNSA-N 0.000 description 4
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 4
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 4
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 4
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 4
- 239000011550 stock solution Substances 0.000 description 4
- 241000607598 Vibrio Species 0.000 description 3
- 241000607334 Vibrio mediterranei Species 0.000 description 3
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 3
- 230000001186 cumulative effect Effects 0.000 description 3
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 3
- 239000010410 layer Substances 0.000 description 3
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 3
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 3
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 3
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 3
- COXVTLYNGOIATD-HVMBLDELSA-N CC1=C(C=CC(=C1)C1=CC(C)=C(C=C1)\N=N\C1=C(O)C2=C(N)C(=CC(=C2C=C1)S(O)(=O)=O)S(O)(=O)=O)\N=N\C1=CC=C2C(=CC(=C(N)C2=C1O)S(O)(=O)=O)S(O)(=O)=O Chemical compound CC1=C(C=CC(=C1)C1=CC(C)=C(C=C1)\N=N\C1=C(O)C2=C(N)C(=CC(=C2C=C1)S(O)(=O)=O)S(O)(=O)=O)\N=N\C1=CC=C2C(=CC(=C(N)C2=C1O)S(O)(=O)=O)S(O)(=O)=O COXVTLYNGOIATD-HVMBLDELSA-N 0.000 description 2
- 241000131448 Mycosphaerella Species 0.000 description 2
- 239000001888 Peptone Substances 0.000 description 2
- 108010080698 Peptones Proteins 0.000 description 2
- 241000589516 Pseudomonas Species 0.000 description 2
- 241001480978 Pyropia haitanensis Species 0.000 description 2
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 2
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 2
- 235000015278 beef Nutrition 0.000 description 2
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 2
- 238000007865 diluting Methods 0.000 description 2
- 238000004043 dyeing Methods 0.000 description 2
- 229960003699 evans blue Drugs 0.000 description 2
- 230000003203 everyday effect Effects 0.000 description 2
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 description 2
- 238000009630 liquid culture Methods 0.000 description 2
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 2
- 238000009629 microbiological culture Methods 0.000 description 2
- 235000019319 peptone Nutrition 0.000 description 2
- 239000008177 pharmaceutical agent Substances 0.000 description 2
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 2
- 239000008213 purified water Substances 0.000 description 2
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 2
- 239000002356 single layer Substances 0.000 description 2
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 2
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 description 2
- 239000002352 surface water Substances 0.000 description 2
- 102000002659 Amyloid Precursor Protein Secretases Human genes 0.000 description 1
- 108010043324 Amyloid Precursor Protein Secretases Proteins 0.000 description 1
- 241001474374 Blennius Species 0.000 description 1
- 240000001624 Espostoa lanata Species 0.000 description 1
- 235000009161 Espostoa lanata Nutrition 0.000 description 1
- 229930182566 Gentamicin Natural products 0.000 description 1
- CEAZRRDELHUEMR-URQXQFDESA-N Gentamicin Chemical compound O1[C@H](C(C)NC)CC[C@@H](N)[C@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](NC)[C@@](C)(O)CO2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N CEAZRRDELHUEMR-URQXQFDESA-N 0.000 description 1
- 206010025421 Macule Diseases 0.000 description 1
- 241000353097 Molva molva Species 0.000 description 1
- 241001646398 Pseudomonas chlororaphis Species 0.000 description 1
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 1
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 1
- 230000000996 additive effect Effects 0.000 description 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 1
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 1
- 230000000443 biocontrol Effects 0.000 description 1
- 238000010170 biological method Methods 0.000 description 1
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 description 1
- 230000001332 colony forming effect Effects 0.000 description 1
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 1
- 230000034994 death Effects 0.000 description 1
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 1
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- 238000004388 gamma ray sterilization Methods 0.000 description 1
- 229960002518 gentamicin Drugs 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 238000005286 illumination Methods 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 230000001678 irradiating effect Effects 0.000 description 1
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 description 1
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 description 1
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 1
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 description 1
- 238000002844 melting Methods 0.000 description 1
- 230000008018 melting Effects 0.000 description 1
- 230000000050 nutritive effect Effects 0.000 description 1
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 description 1
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 238000005070 sampling Methods 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 238000005201 scrubbing Methods 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 238000004659 sterilization and disinfection Methods 0.000 description 1
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 1
- 238000012795 verification Methods 0.000 description 1
- 230000000007 visual effect Effects 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K61/00—Culture of aquatic animals
- A01K61/10—Culture of aquatic animals of fish
- A01K61/13—Prevention or treatment of fish diseases
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
- A01N63/00—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing microorganisms, viruses, microbial fungi, animals or substances produced by, or obtained from, microorganisms, viruses, microbial fungi or animals, e.g. enzymes or fermentates
- A01N63/10—Animals; Substances produced thereby or obtained therefrom
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A40/00—Adaptation technologies in agriculture, forestry, livestock or agroalimentary production
- Y02A40/80—Adaptation technologies in agriculture, forestry, livestock or agroalimentary production in fisheries management
- Y02A40/81—Aquaculture, e.g. of fish
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Environmental Sciences (AREA)
- Zoology (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Pest Control & Pesticides (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Virology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Dentistry (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Agronomy & Crop Science (AREA)
- Marine Sciences & Fisheries (AREA)
- Animal Husbandry (AREA)
- Biodiversity & Conservation Biology (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
本发明提供一种紫菜黄斑病的治疗方法，是使用噬菌体来预防治疗发生黄斑病的不同生长阶段的紫菜丝状体；所述的噬菌体，为vB_VmeM‑Yong噬菌体，其保藏编号为CGMCC No.17098。所述的不同生长阶段，为贝壳丝状体阶段或自由丝状体阶段。本发明采用噬菌体Yong控制紫菜养殖中的黄斑病，可以在短期内并且安全有效的预防紫菜黄斑病的发生，进而提高紫菜的生产效益。
Description
技术领域
本发明属于养殖海藻病害防治技术领域，具体涉及一种紫菜黄斑病的治疗方法。
背景技术
紫菜黄斑病(yellow-spot disease)是一种紫菜丝状体育苗阶段常见的严重病害。一般认为该病是由嗜盐性细菌引起的。由于该病发生在育苗阶段，往往对紫菜栽培生产造成根本性损失。紫菜丝状体黄斑病屡见报道，有研究认为黄斑病是假单胞菌属(Pseudomonas)和弧菌属(Vibrio)细菌侵入藻体受伤部位并增殖，菌体分泌酶破坏叶状体组织引起的；也有人认为水温偏高、突降大雨，河道中有机物进入养殖海区等原因是造成紫菜黄斑病的原因。目前紫菜黄斑病已成为紫菜养殖中急需攻克的难题。
发明内容
本发明的目的是提供一种紫菜黄斑病的治疗方法，从而弥补现有技术的不足。
本发明所提供的紫菜黄斑病的防治方法，是使用噬菌体来预防治疗发生黄斑病的不同生长阶段的紫菜丝状体；
所述的噬菌体，为地中海弧菌噬菌体vB_VmeM-Yong，于2019年01月22日保藏在北京市朝阳区北辰西路1号院2号的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.17098。
所述的不同生长阶段，为贝壳丝状体阶段或自由丝状体阶段。
本发明的方法具有如下的优点：
(1)采用噬菌体Yong控制紫菜养殖中的黄斑病，可以在短期内并且安全有效的预防紫菜黄斑病的发生，进而提高紫菜的生产效益。
(2)噬菌体Yong是一种可靠、无品质破坏的生物防治剂。
(3)噬菌体Yong对V.mediterranei 117-T6感染的紫菜自由丝状体有很好的保护作用，使其存活率高达85％。
附图说明
图1：噬菌体Yong对V.mediterranei 117-T6感染的贝壳丝状体黄斑病的生物防治效果图；
图2：噬菌体Yong对V.mediterranei 117-T6感染的自由丝状体存活率的影响，其中F1：V.mediterranei 117-T6浓度为108CFU/mL，噬菌体Yong MOI＝0。F2：V.mediterranei117-T6浓度为108CFU/mL，噬菌体Yong MOI＝1。F3：V.mediterranei 117-T6浓度为108CFU/mL，噬菌体Yong MOI＝0.1。F4：V.mediterranei 117-T6浓度为106CFU/mL，噬菌体Yong MOI＝0。F5：V.mediterranei 117-T6菌浓度为106CFU/mL，噬菌体Yong MOI＝0.1。F6：V.mediterranei 117-T6菌浓度为106CFU/mL，噬菌体Yong MOI＝0.01。F7：V.mediterranei117-T6菌浓度为106CFU/mL，噬菌体Yong MOI＝0.001。
图3：噬菌体Yong对V.mediterranei 117-T6感染的自由丝状体的保护图。
具体实施方式
本发明使用从宁波市北仑区梅山湾海水中分离的噬菌体Yong，可以高效的防治种紫菜黄斑病，从而促成了本发明的建立。
对于本发明所涉及的术语，申请人记载如下：
1、紫菜贝壳丝状体：接种到贝壳上，并转入贝壳内生长的紫菜丝状体。
2、紫菜自由丝状体：在培养体系中自由生长的游离的紫菜丝状体，呈藻丝或藻丝团状态。
3、菌浓度：以每毫升中细菌菌落形成单位(CFU，Colony-Forming Units)CFU/mL表示，指单位体积中的细菌、霉菌、酵母等微生物的群落总数。本例中特指V.mediterranei117-T6的浓度。
4、噬菌体MOI(multiplicity of infection)：噬菌体感染复数，指感染时噬菌体与细菌的数量比值，也就是平均每个细菌感染噬菌体的数量。
5、噬菌体浓度：也指噬菌体的效价，即每毫升样品含噬菌体的个数。通常是在含敏感菌的平板上形成噬菌斑进行噬菌体的计数，以每毫升中含有噬菌斑形成单位(plaqueforming unit)，即PFU/mL表示。
对于本发明中所使用的药品试剂，以及生物学方法，本领域技术人员可在本发明构思的基础上选择其它常规的药品试剂及方法进行替换。
下面结合实施例对本发明进行详细的描述。
实施例1噬菌体的筛选及理化指标
本发明所提供的vB_VmeM-Yong噬菌体分离自浙江省宁波市北仑区梅山岛表层海水，水样采集的具体位置为North latitude:29.7831421；East longitude:121.9586032；具体的分离步骤如下：
1)地中海弧菌117-T6的活化、培养
取117-T6菌种划线接种于含1.5％琼脂的海水营养固体培养基平板上，26℃倒置培养过夜；从平板上挑取单菌落，接种到装有5mL海水营养培养基的试管内，摇床上26℃、180rpm培养12小时；从试管中取1mL液体培养液稀释至装有100mL海水营养培养基的锥形瓶中，放置于摇床上26℃、180rpm扩大培养至菌液OD600≈0.6，即得到对数期菌液；
其中海水营养培养基配方：蛋白胨10g，牛肉膏3g,加入过滤海水定容至1L，pH7.2,高压灭菌；
2)噬菌体的富集
从浙江省宁波市北仑区梅山岛海边采集表层水样，置冰盒内，并立即带回实验室，充分颠倒混匀后，10000g离心10min,取上清80mL到250mL锥形瓶中，在锥形瓶中加入40ml 3×海水营养培养基和2mL新鲜培养的对数期117-T6菌液，混匀后放置于摇床上26℃、180rpm培养3-4小时进行噬菌体富集；将富集培养液离心4℃、10000g、10min，取上清液依次经过0.45μm、0.22μm孔径硝酸纤维素滤膜过滤，滤液即为的噬菌体富集液；
点板验证：取融化状态下于42-45℃保温超过半小时的含0.7％琼脂的海水营养培养基与500μL对数期117-T6菌液迅速混匀，立即倾倒于含1.5％琼脂的海水营养培养基单层平板上，铺平，冷却凝固后，点2μL噬菌体原液于平板上，28℃过夜培养，翌日双层平板上点噬菌体富集液出出现明显透明噬菌斑；
噬菌体的进一步富集：取两根试管，其中一根用作实验组，添加如下组分：6mL上述噬菌体富集液、2mL 3×海水营养培养基、100μL新鲜的对数期117-T6菌液，对照组添加如下组分：8ml 1×海水营养培养基+100μL新鲜的对数期117-T6菌液；将试管置于26℃、180rpm摇床培养过夜；翌日，实验组培养液较对照组明显澄清，将培养液4℃、10000g离心10min，取上清液依次经过0.45μm、0.22μm孔径硝酸纤维素滤膜过滤，滤液即为的二次噬菌体富集液；
其中3×海水营养培养基配方：蛋白胨30g，牛肉膏9g,加入过滤海水定容至1L，pH7.2,121℃高压灭菌20min；
3)噬菌体的分离纯化
将步骤2)获得的二次噬菌体富集液用海水营养培养基做10倍系列梯度稀释，分别取10-4、10-5、10-6、10-7稀释度的稀释液各100μL与200μL新鲜的对数期117-T6菌液混合，在室温下，摇床上孵育10min，将该混合物加入至5ml的预先融化并在42-45℃保温超过半小时的含0.7％琼脂的半固体海水营养培养基中，立即充分混匀并倾倒于29℃预热的含1.5％琼脂的海水营养培养基单层平板上，均匀铺平，待上层胶冷却凝固后放于28℃培养箱内过夜培养，平板上有噬菌斑形成；选取噬菌斑密度合适的平板，挑取单个噬菌斑中心位置至5mL新鲜的对数期117-T6菌液中，摇床上28℃、180rpm过夜培养至宿主菌裂解澄清；将培养液离心10000g离心10min后，取上清液，依次经过0.45μm、0.22μm孔径硝酸纤维素滤膜过滤，过滤液即为新一代噬菌体原液；新噬菌体原液继续使用上述双层平板法重复进行三代噬菌体挖斑纯化实验，即得到纯化培养的噬菌体vB_VmeM-Yong原液；
4)噬菌体的扩大培养
将步骤3)纯化培养得到的vB_VmeM-Yong原液与新鲜的对数期117-T6菌液按体积200μL：20mL的比例混合作为实验组，设置20mL对数期117-T6菌液作为对照组，一起放置于摇床于26℃，180rpm培养，至实验组与对照组液体比出现肉眼可见明显差异时停止培养，将噬菌体vB_VmeM-Yong-菌培养裂解液置于4℃保存；
最终获得的地中海弧菌噬菌体vB_VmeM-Yong，于2019年01月22日保藏在北京市朝阳区北辰西路1号院2号的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.17098。
5)噬菌体悬液制备
取步骤4)制备的噬菌体vB_VmeM-Yong-菌培养裂解液在4℃、10000g离心10min，取上清液，依次经过0.45μm、0.22μm孔径硝酸纤维素滤膜过滤，即为噬菌体vB_VmeM-Yong悬液。
所筛选的噬菌体呈现二十面体近似球形的头部，直径109nm(±9nm)，具有可收缩的尾部，长度320nm±50nm；潜伏期约为40min，裂解期约为40min-150min。
实施例2：对贝壳丝状体黄斑病的治疗
1、贝壳丝状体预处理：
用灭菌海水和无菌棉球将所用的健康贝壳丝状体表面擦洗3～5次，擦洗完成后置于盐度为30的灭菌营养海水中，于20℃，光照30μmol·photons/(m2·s1)及光暗周期L:D＝12:12培养，培养1周后用于感染实验。
2、V.mediterranei 117-T6及培养条件
所用的V.mediterranei 117-T-6(地中海弧菌117-T6)分离自患病紫菜，-80℃保存于浙江省海洋生物工程重点实验室。保藏菌种室温下解冻后接种于灭菌的100mL TSB培养基(3gTSB培养基，0.5g氯化钠，纯水定容至100mL，pH＝7)，在28℃，110r/min的摇床中过夜培养。扩大培养条件与活化条件一致，培养过夜后，离心去除培养液，再用无菌海水重悬浮洗涤离心3次，最后用无菌营养海水将细胞浓度调整为1×108CFU/mL，备用。
3、噬菌体Yong对V.mediterranei117-T6感染的紫菜贝壳丝状体的防治
选择经过预处理生长良好的健康贝壳丝状体用于感染实验。每个贝壳丝状体添加20mL V.mediterranei117-T6菌悬液完全覆盖贝壳丝状体表面，随后将已添加V.mediterranei117-T6菌悬液的贝壳丝状体置于光照培养箱中培养；培养条件为：温度25℃，光照强度为30μmol·photons/(m2·s1)以及光暗周期L:D＝12:12。每天对贝壳丝状体的生长情况进行观察，拍照。
不同组的感染实验设置5个平行样本，具体分组如下：
CK组：以无菌营养海水代替菌溶液。
S1：V.mediterranei 117-T6浓度为108CFU/mL，噬菌体Yong MOI＝0
S2：V.mediterranei 117-T6浓度为108CFU/mL，噬菌体Yong MOI＝1。
如图1所示，加了V.mediterranei117-T6的贝壳丝状体(对照组)颜色变浅，出现黄斑；加了V.mediterranei117-T6和噬菌体Yong的贝壳丝状体(实验组)的颜色健康，仅次于对照组的健康程度，说明加了噬菌体Yong后，对V.mediterranei 117-T6感染的贝壳丝状体有明显的保护效果。
实施例3：噬菌体Yong对V.mediterranei117-T6感染的紫菜自由丝状体的生物防治
1、自由丝状体预处理：
将培养好的丝状体，取出鲜重为0.2g放入无菌海水中，用搅拌机打碎，然后采用氨苄青霉素(终浓度为300μg/mL)、卡那霉素(终浓度为100μg/mL)、庆大霉素(终浓度为100μg/mL)组合氨苄青霉素溶液(Ampicillin，100mg/mL，γ射线灭菌)，避光处理18h后，用无菌海水清洗紫菜丝状体3次，转入新鲜紫菜培养液培养12h后更换新鲜培养液，以彻底去除残留抗生素，再次转入新鲜培养液培养48h，备用。
2、V.mediterranei 117-T6及培养条件
所用的V.mediterranei117-T6分离自患病紫菜，-80℃保存于浙江省海洋生物工程重点实验室。保藏菌种室温下解冻后接种于灭菌的100mL TSB培养基(3gTSB培养基，0.5g氯化钠，纯水定容至100mL，pH＝7)，在28℃，110r/min的摇床中过夜培养。扩大培养条件与活化条件一致，培养过夜后，离心去除培养液，再用无菌海水重悬浮洗涤离心3次，最后用无菌营养海水将细胞浓度调整为1×108CFU/mL和1×106CFU/mL，备用。
3、生物防治
在15mL的离心管中分别加入适量的藻液和5mL V.mediterranei 117-T6菌液以及相应量的噬菌体Yong。每组3个平行，25℃培养。具体分组如下：
CK：以无菌营养海水代替菌溶液。
F1：V.mediterranei 117-T6菌浓度为108CFU/mL，噬菌体Yong MOI＝0。
F2：V.mediterranei 117-T6菌浓度为108CFU/mL，噬菌体Yong MOI＝1。
F3：V.mediterranei 117-T6菌浓度为108CFU/mL，噬菌体Yong MOI＝0.1。
F4：V.mediterranei 117-T6菌浓度为106CFU/mL，噬菌体Yong MOI＝0。
F5：V.mediterranei 117-T6菌浓度为106CFU/mL，噬菌体Yong MOI＝0.1。
F6：V.mediterranei 117-T6菌浓度为106CFU/mL，噬菌体Yong MOI＝0.01。
F7：V.mediterranei 117-T6菌浓度为106CFU/mL，噬菌体Yong MOI＝0.001。
分别在0h、6h、12h、24h、36h、48h、72h、96h、120h取样，用Evan’s blue避光染色8min，洗去染色液，400×光学显微镜下观察并拍照记录，被染成蓝色的紫菜丝状体为死亡细胞。通过计算同一视野下蓝色藻丝的比例确定藻体的死亡率。每次观察20个以上视野。以上每组实验重复3次。
由图2可以看出，噬菌体Yong对V.mediterranei 117-T6引起的紫菜自由丝状体黄斑病有较好保护效果的是F2、F7、F5，此时紫菜自由丝状体的存活率可以达到60％以上。其中V.mediterranei 117-T6菌浓度为108CFU/mL，噬菌体Yong MOI＝1的保护效果最好，藻体存活率可以达到85％；V.mediterranei 117-T6菌浓度108CFU/mL，噬菌体Yong MOI＝0.1的保护效果次之，藻体存活率达到70％；V.mediterranei 117-T6浓度106CFU/mL，噬菌体YongMOI＝0.1的藻体存活率达到60％。
实施例4：噬菌体Yong对坛紫菜自由丝状体的保护
以“浙东1号”坛紫菜自由丝状体作为实验对象，将紫菜丝状体分为三组，分别为实验组、对照组、和空白组。实验组和对照组添加最终浓度为1×108CFU/mL的V.mediterranei117-T6菌液，半小时内往水体内加原始浓度为1.1×109PFU/mL的噬菌体Yong，使其终浓度为1×108PFU/mL；对照组添加与噬菌体等体积的无菌营养海水，空白组水体不做任何处理。每天取样观察，用Evan’s Blue染色，然后显微观察拍照，记录藻丝生长状态。染成蓝色为死亡藻细胞，不变色的为健康藻丝。
结果表明，空白组藻丝如常，实验进行到第5天结束，对照组的累积死亡率为100％，实验组累积死亡率约为15％(图3)，实验组累计死亡率比对照组小85％，即噬菌体vB_VmeM-Yong对坛紫菜丝状体的相对保护率为85％。
Claims (3)
1.一种紫菜黄斑病的防治方法，其特征在于，所述的方法是使用噬菌体来预防治疗发生黄斑病的不同生长阶段的紫菜丝状体；所述的噬菌体的保藏编号为CGMCC No.17098。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的紫菜丝状体，为贝壳丝状体。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的紫菜丝状体，为自由阶段丝状体。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201910745546.2A CN110352880B (zh) | 2019-08-13 | 2019-08-13 | 一种紫菜黄斑病的治疗方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201910745546.2A CN110352880B (zh) | 2019-08-13 | 2019-08-13 | 一种紫菜黄斑病的治疗方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN110352880A CN110352880A (zh) | 2019-10-22 |
| CN110352880B true CN110352880B (zh) | 2021-04-20 |
Family
ID=68224569
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201910745546.2A Active CN110352880B (zh) | 2019-08-13 | 2019-08-13 | 一种紫菜黄斑病的治疗方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN110352880B (zh) |
Families Citing this family (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN113061552B (zh) * | 2021-04-06 | 2022-10-04 | 宁波大学 | 一种紫菜丝状体白化病致病菌 |
| CN114214250B (zh) * | 2021-12-27 | 2023-04-28 | 宁波大学 | 一种紫菜致病菌及其应用 |
Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP3984402B2 (ja) * | 1999-10-12 | 2007-10-03 | 株式会社マルイ物産 | フコイダン様多糖複合体の製造方法及びそれを主成分とする免疫賦活剤 |
| JP2009045000A (ja) * | 2007-08-20 | 2009-03-05 | Saga Univ | 抗スミノリ病バクテリオファージ及び養殖海苔のスミノリ病防止方法 |
| CN104994740A (zh) * | 2012-10-19 | 2015-10-21 | 德克萨斯A&M大学系统 | 用于治疗和控制植物病害的方法和组合物 |
| CN106688869A (zh) * | 2016-12-28 | 2017-05-24 | 江苏省海洋水产研究所 | 条斑紫菜贝壳丝状体黄斑病防治方法及培养装置 |
| CN109310722A (zh) * | 2016-04-01 | 2019-02-05 | 塔夫斯大学 | 用于预防弧菌感染的方法和组合物 |
-
2019
- 2019-08-13 CN CN201910745546.2A patent/CN110352880B/zh active Active
Patent Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP3984402B2 (ja) * | 1999-10-12 | 2007-10-03 | 株式会社マルイ物産 | フコイダン様多糖複合体の製造方法及びそれを主成分とする免疫賦活剤 |
| JP2009045000A (ja) * | 2007-08-20 | 2009-03-05 | Saga Univ | 抗スミノリ病バクテリオファージ及び養殖海苔のスミノリ病防止方法 |
| CN104994740A (zh) * | 2012-10-19 | 2015-10-21 | 德克萨斯A&M大学系统 | 用于治疗和控制植物病害的方法和组合物 |
| CN109310722A (zh) * | 2016-04-01 | 2019-02-05 | 塔夫斯大学 | 用于预防弧菌感染的方法和组合物 |
| CN106688869A (zh) * | 2016-12-28 | 2017-05-24 | 江苏省海洋水产研究所 | 条斑紫菜贝壳丝状体黄斑病防治方法及培养装置 |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| Sequence characterization and comparative analysis of three Plasmids isolated from environmental Vibfio spp.;Hazen, Tracy H等;《Applied and Environmental Microbiology》;20071231;第73卷(第23期);第7703页至第7710页 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN110352880A (zh) | 2019-10-22 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Tanaka et al. | Control of tobacco bacterial wilt by an avirulent strain of Pseudomonas solanacearum M4S and its bacteriophage | |
| CN110352880B (zh) | 一种紫菜黄斑病的治疗方法 | |
| CN110241049B (zh) | 一株具有溶藻能力的假交替单胞菌及其对米氏凯伦藻赤潮的应用 | |
| CN110791448B (zh) | 一株甘蔗内生芽孢杆菌及其应用 | |
| CN108949618B (zh) | 一种溶藻细菌及其应用 | |
| CN108651522A (zh) | 一种溶藻弧菌噬菌体制剂、制备方法及其应用 | |
| CN113061552B (zh) | 一种紫菜丝状体白化病致病菌 | |
| CN109022303B (zh) | 一种具有溶藻和破坏微藻气囊的功能的组合物及其应用 | |
| CN109706125B (zh) | 蜡样芽孢杆菌噬菌体组合物及其应用 | |
| CN114231499B (zh) | 噬菌体及其应用 | |
| CN114921420B (zh) | 一种鸭疫里氏杆菌噬菌体 | |
| CN111575219B (zh) | 一株广谱溶藻放线菌lw9、分离方法及应用 | |
| Tajima et al. | Seasonal fluctuations of Flexibacter sp. the causative bacterium of spotting disease of sea urchin Strongylocentrotus intermedius in the culturing facilities and coastal area | |
| CN113425858A (zh) | 一种珊瑚致病菌的益生菌筛选及防治方法 | |
| CN102876611A (zh) | 一种杀植物寄生线虫的坚强芽胞杆菌及其制备方法与应用 | |
| CN112760295A (zh) | 一株肠炎沙门氏菌噬菌体及其应用 | |
| CN115261338B (zh) | 一株具有防控烟草青枯病的裂解性噬菌体s5及应用 | |
| CN115321685B (zh) | 一株栅藻在抑制水华有害藻方面的应用 | |
| CN113637645B (zh) | 噬菌体VB_VpP_BT-1011、筛选方法和应用 | |
| CN114958778B (zh) | 一株副溶血弧菌裂解性噬菌体gvp-p20及其在中华绒螯蟹中副溶血弧菌的防治应用 | |
| JP5239069B2 (ja) | 抗スミノリ病バクテリオファージ及び養殖海苔のスミノリ病防止方法 | |
| CN114807056B (zh) | 一种烈性噬菌体PSA-Pe及其应用 | |
| CN116042439B (zh) | 一种根际放线菌asg及其在耐铝促茶树生长中的应用 | |
| CN118064379A (zh) | 一种粪产碱杆菌的烈性噬菌体casp2、噬菌体casp2的制剂及其应用 | |
| Miyamoto et al. | Isolation of a small rod with lytic activity against Vibrio parahaemolyticus from fresh sea water |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant |