CN112760295A - 一株肠炎沙门氏菌噬菌体及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一株肠炎沙门氏菌噬菌体及其应用，属于生物技术领域；一种强裂解性噬菌体，其特征在于：该噬菌体保藏号为GDMCC N0：61171‑B1，在2020年8月25日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，分类学名称为肠炎沙门氏菌噬菌体亚种，即Salmonella enterica subsp.enterica bacteriophage，对肠炎沙门氏菌具有高效杀菌能力。
Description
技术领域
本发明具体涉及生物技术领域，具体涉及一株肠炎沙门氏菌的强裂解性噬菌体PSM6防治沙门氏菌污染方面的应用。
背景技术
沙门氏菌(Salmonella)居食源性致病菌之首，常引起严重的食品安全事故和人畜患性疾病，是全球重点关注公共卫生问题之一。其中，肠炎沙门氏菌是最常见的沙门氏菌的污染可发生在食物链的任何一个环节，包括收获、生产、加工、保存等多个从农场到消费者的阶段。例如，沙门氏菌可隐藏在灌溉水中进而污染果蔬和农作物，也能以生物膜的形式覆盖在食品生产加工过程中的机器设备和保存用具的表面。目前，控制沙门氏菌污染的主要手段是使用抗生素。然而，细菌在抗生素的选择压力下会通过突变产生多重耐药性，甚至这种多重耐药性可以在肠道病原体迅速转移增加。在这场抗生素耐药(antimicrobialresistance，AMR)的全球性健康危机中，如果还不采取有效措施，到2050年，每年因细菌耐药造成死亡病例将可能攀升至1000万/年，与目前每年死于癌症的人数相当。
噬菌体，在自然界中广泛存在的细菌“天敌”，不受抗生素耐药性的制约被视为对付多重耐药菌新的希望，因此也成为了当前的研究热点。现阶段已有多株沙门氏菌噬菌体在畜禽养殖和食品工业等方面去除病原菌取得了较好的成果，但是满足于不同生产加工条件的噬菌体的种类数量是限制噬菌体治疗进一步发展应用的重要原因。因此，分离和鉴定噬菌体并展开相关研究来丰富噬菌体种库尤为重要。
发明内容
有鉴于此，本发明提供了一株沙门氏菌噬菌体PSM6及其应用。
为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一株沙门氏菌噬菌体PSM6，保藏编号为GDMCC N0：61171-B1，已保藏于广东省微生物菌种保藏中心，简称GDMCC，地址广东省广州市先烈中路100号大院59号5楼广东省微生物研究所，保藏日期为2020年8月 25日，分类命名为Salmonella enterica subsp.entericabacteriophage，属于肌尾噬菌体。
进一步，肠炎沙门氏菌噬菌体PSM6在裂解沙门氏菌中的应用。
进一步，肠炎沙门氏菌噬菌体PSM6去除沙门氏菌生物膜中的应用。经由上述的技术方案可知，与现有技术相比，本发明公开提供了一株沙门氏菌噬菌体PSM6及其应用，为病原菌的防控提供一种候选基础材料，丰富噬菌体种库，扩宽相关噬菌体鸡尾酒的裂解范围和应用范围；噬菌体 PSM6可快速高效裂解沙门氏菌，可用于生物膜条件下沙门氏菌的污染的去除及防治其耐药宿主菌。
附图说明
图1为本发明噬菌体PSM6的噬菌斑形态；
图2为本发明噬菌体PSM6的透射电镜形态；
图3为本发明噬菌体PSM6的温度稳定性测定结果图；
图4为本发明噬菌体PSM6的pH稳定性测定结果图；
图5为本发明噬菌体PSM6对生物膜状态下的沙门氏菌的消减效果图；
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本保护的范围。
实施例1、噬菌体的分离纯化
本实验使用经高压蒸汽灭菌后的塑料瓶，采集的东莞东江河水为样品，以8000r/min离心水样15min，用0.22um过滤注射器过滤上清。提前将冻存的肠炎沙门氏菌(GIM1.1105)菌液三区划线，接种于显色培养基，置于37℃培养箱约12h，取单菌落接种到LB液体培养基中，37℃、 180r/min振荡培养至对数期，得到新鲜菌液。取5mL过滤上清于20mLLB 液体培养基中，再加入500μL菌液和2mLSM缓冲液，混匀后再置于 37℃、220r/min摇床培养12小时获得富集液。富集液重复离心过滤取噬菌体上清，按上述步骤再处理2次，形成噬菌体原液。用SM缓冲液对噬菌体原液进行10倍稀释。取100μL不同倍数的稀释液与100μL菌液于灭菌好的96孔细胞培养板中，混匀静置反应15-20分钟后，吸入到45℃保温的10mlLB半固体培养基，混匀后迅速倒入LB固体培养基平板上层，待其凝固，置于37℃温箱培养8小时后观察，获得形成噬菌斑的双层平板。在15小时内，挑取双层平板上1个透亮、圆润的噬菌斑，置于含 100μL菌液和8mLSM缓冲液的8mL2倍LB液体培养基的试管中，将其倾斜在37℃、220r/min摇床中培养12小时摇床完毕后，重复上述方法，进行3-5次纯化，直到平板上所出现的噬菌斑的大小形态均匀一致为止，详见图1。
实施例2、噬菌体的电镜观察
取10μL扩增培养后的噬菌体滤液滴于铜网上，自然沉淀10min，用滤纸从侧面吸干多余的液体后加1滴2％磷钨酸到铜网上，染色10 min，待铜网干燥后用透射式电镜观察PSM6的形态。
电镜观察结果显示，噬菌体PSM6由正二十面体的头部和可收缩的尾部，属于肌尾噬菌体，电镜照片显示，PSM6头部直径约为69±5nm，尾部长度约为115±6nm，详见图2。
实施例3、噬菌体热稳定性的测定
取1000μL噬菌体滤液(约108PFU/mL)于1.5mlEP管中，分别于 40℃、50℃、60℃、70℃、80℃的水浴中作用2h，每隔20min取样，并立即将样品置于冰上冷却，经过10倍梯度稀释后测定噬菌体的效价、分析噬菌体的存活情况、并使用GraphPad Prism 8处理数据。
热稳定性测定结果显示，随着温度的升高，PSM6效价下降的速度越快。在40℃作用2h，噬菌体PSM6维持原有活性，效价基本不变。在 60℃作用2h后，效价仍有107.4PFU/mL，存活率约25％；在80℃作用2h，PSM6的效价最低，下降到106.2PFU/mL。总体上分析，PSM6的热稳定性较强，详见图3。
实施例4、噬菌体的pH稳定性
取100μL噬菌体滤液(约108PFU/mL)于1.5mlEP管中，分别加入 900μL不同pH值(即pH为2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、 13)的tris-HCl缓冲液，37℃、200r/min摇床培养2小时后，取100μ L进行10倍梯度稀释，用双层平板法测定噬菌体效价，重复3次。通过计算效价，得出该噬菌体最适pH值。
pH稳定性测定结果显示，PSM6在pH为5-10的范围内效价稳定，活性较高，存活率大于80％；pH＝4时，效价下降明显，存活率约11.3％；在 pH＝2、3、11、12、13的极端环境中，噬菌体效价降低到低于检出限(即存活率低于0.1％)，详见图4。
实施例5、噬菌体对生物膜条件下沙门氏菌的削减效果
将宿主菌过夜培养后调整浓度为1x109 CFU/mL,用稀释10倍后的LB 培养基稀释100倍，转移至96孔聚苯乙稀细胞培养板，200μL/孔,不加宿主菌(LB培养基)为阴性对照组，在37℃静置培养24h，吸弃重新加入 200μLLB培养基培养12h；倾去培养物，PBS轻柔洗涤3次，去除生物膜表面的浮游细菌；每孔加入200μL不同混合噬菌体滤液后，以PBS代替噬菌体滤液为阳性对照，37℃孵育4h,倒弃液体，加入甲醇固定3min,PBS 轻柔洗涤；结晶紫进行染色30min，PBS轻柔洗涤2次后，33％的乙酸溶解结晶紫，测OD562nm。
结果如图5所示，在使用噬菌体滤液处理生物膜,噬菌体效价越高，对生物膜条件下的宿主菌的削减效果越强。当使用效价为1010的噬菌体滤液处理肠炎沙门氏菌生物膜4h，生物膜去除率约为94.4％；当使用效价为 108的噬菌体滤液处理，生物膜去除率约为88.6％；当使用效价为106的噬菌体滤液处理，生物膜去除率约为75.6％。
实施例6、噬菌体对不同血清型沙门氏菌裂解能力
将所存的沙门氏菌分别培养至生长对数期，取200μL菌液于1.5mL 的离心管,用高压灭菌好的棉拭子吸走所有菌液，涂抹于提前倒好的下层培养基，取3μL噬菌体滤液滴于双层平板上，正置30min后，倒置放入培养箱中培养8h，观察有无裂解斑。
如表1所示，噬菌体除了可裂解肠炎沙门氏菌外，还可以裂解鼠伤寒、德尔卑、科瓦利斯、伦敦、彻斯特等血清型。
表1噬菌体PSM6的裂解范围和活性
注：++：裂解清透；+：裂解浑浊；-：不裂解
对所公开的实施例的见上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下,在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例,而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。
Claims (5)
1.一株噬菌体，其特征在于:该噬菌体PSM6保藏号为GDMCC N0：61171-B1，于2020年8月25日保藏在广东省微生物菌种保藏中心，分类命名为肠炎沙门氏菌噬菌体，Salmonellaenterica subsp.enterica bacteriophage，为肌尾噬菌体。
2.根据权利要求1所述的一株噬菌体，其特征在于：在40℃水浴处理2h，噬菌体PSM6维持原有活性，效价基本不变。随着温度的升高，PSM6效价下降的速度越快。在80℃作用2h，PSM6的效价下降最快，从108PFU/mL下降到106.2PFU/mL。总体上分析，PSM6的热稳定性较强。
3.根据权利要求2所述的一株噬菌体，其特征在于：PSM6在pH为5-10的范围内效价稳定，活性较高，存活率大于80％。
4.根据权利要求1或2所述噬菌体的应用，其特征在于：将沙门氏菌噬菌体纯化后，用于杀灭其裂解谱内的沙门氏菌。
5.根据权利要求1所述的一株噬菌体在生物膜条件下沙门氏菌的污染的去除及防治其耐药宿主菌的应用。
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