CN107828742B - 一种腐败希瓦氏菌噬菌体及其应用 - Google Patents
一种腐败希瓦氏菌噬菌体及其应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明属于生物工程领域,涉及一种腐败希瓦氏菌噬菌体分离株及其应用。所述腐败希瓦氏菌噬菌体分离株是腐败希瓦氏菌噬菌体(Shewanella putrefaciens phage)SppYZU05,其保藏编号:CCTCC NO:M 2016717。本发明还公开了腐败希瓦氏菌噬菌体SppYZU05作为抑菌剂的应用。
Description
技术领域
本发明涉及一种腐败希瓦氏菌噬菌体分离株,及其抑菌应用。属于生物工程领域。
背景技术
腐败希瓦氏菌(Shewanella putrefaciens)是水产品、肉制品等高水分蛋白食品冷链流通中的特定腐败菌,在低温贮藏(0-8℃)条件下生长快,腐败能力强,最终形成腐败过程中的优势菌群,并产生H2S、还原TMAO,导致肉质变粘,肉色改变等感官品质的劣变,给水产及肉品加工业造成严重的经济损失。有效抑制这类细菌的生长及加工与贮藏过程中的交叉污染,是维持低温水产品及肉制品鲜度,延长货架期的重要手段。目前用于控制食品中腐败细菌生长的常规保鲜剂主要有化学防腐剂,近年来出于对食品安全和绿色保鲜的需求,人们利用从动植物、微生物中提取的天然成分作为生物抑菌剂,如大蒜素、茶多酚、溶菌酶、乳酸链球菌素等。这些抑菌剂虽能抑制腐败希瓦氏菌生长,往往低温保鲜效果不佳、制备成本高。此外,腐败希瓦氏菌在生长过程中,极易在食品、加工器具的表面形成生物被膜,被膜内的细菌对常规保鲜剂、抑菌剂的抵抗能力可以提高数百倍,很难被清除,从而导致持续性污染,给水产品和肉制品加工和保鲜带来严重危害。因此亟需开发新型生物保鲜剂应用于水产和肉制品加工与贮藏。
噬菌体是一类细菌依赖性的病毒,又称细菌病毒。裂解性噬菌体感染细菌后,可在宿主菌内快速增殖,并使之裂解,故又称毒性噬菌体。噬菌体广泛存在于自然界中,并且对宿主菌具有专一性,制备成本低廉,安全性好。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种对腐败希瓦氏菌具有强裂解作用的噬菌体制剂,该制剂可以单独或复配使用,能够有效控制生物被膜形成、抑制腐败希瓦氏菌生长与代谢。
本发明所述的一种腐败希瓦氏菌噬菌体(Shewanella putrefaciens phage)SppYZU05,其保藏编号:CCTCC NO:M 2016717。
本发明进一步公开了腐败希瓦氏菌噬菌体(Shewanella putrefaciens phage)SppYZU05在制备抑菌剂中的应用。
本发明还提供了一种腐败希瓦氏菌抑菌剂,是以所述的噬菌体SppYZU05分离物或培养物作为抑菌成分。
本发明从农贸市场采集的污水样品中分离出一株腐败希瓦氏菌噬菌体SppYZU05(Shewanella putrefaciens phage SppYZU05),保藏在中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC),保藏地址:武汉武汉大学;保藏编号:CCTCC NO:M 2016717;保藏日期:2016年12月2日。
本发明中的腐败希瓦氏菌噬菌体SppYZU05具有以下生物学特征:
(1)形态学特征:通过透射电镜观察,头部对称,直径约为61nm,尾长约为166nm,无伸缩性尾鞘,噬菌体的形态学特征归于长尾噬菌体科。
(2)噬菌体核酸类型:噬菌体为dsDNA。
(3)噬菌体基因组特征:SppYZU05基因组全长为54319bp,其中编码基因总长度分别为48786bp,平均长度分别为707bp,占总长的89.81%,GC含量为50.63%,有69个开放阅读框(ORFs)。69个ORFs编码蛋白中有12个ORFs在数据库中搜不到同源性基因,57个ORFs编码的蛋白在数据库中找到同源性序列,其中44个ORFs编码的蛋白为假设蛋白,有13个蛋白序列功能明确,基因组数据显示SppYZU05为一种新的噬菌体。
(4)具有强烈的腐败希瓦氏菌裂解性能。
(5)能够抑制腐败希瓦氏菌生物被膜形成。
本发明将上述的腐败希瓦氏菌噬菌体SppYZU05制备成一种腐败希瓦氏菌噬菌体抑菌剂,制备方法特征在于:分别取100μL SppYZU05噬菌体液与相应对数期生长期的腐败希瓦氏菌液100μL混合,室温放置10min,然后加到10mL LB液体培养基中,25℃,150rpm恒温振荡过夜培养;将试管中的培养物转至灭菌离心管中,经5000×g,10min离心后收集上清液,通过0.22μm微孔滤膜过滤除菌,得到噬菌体增殖液。加0.93g PEG 8000,0.58g NaCl,摇匀至溶解,4℃过夜;10000×g 4℃离心20min,去上清液;加0.5mL SM(1L:NaCl 5.8g,MgSO4.7H2O 2.0g,1M Tris-HCl(pH7.4)50mL)溶液,室温作用1h;通过加入等体积的氯仿抽提30s;3000×g 4℃离心15min回收含有噬菌体颗粒的亲水相。将获得的纯化的SppYZU05噬菌体颗粒与SM缓冲液按1:10比例混合形成噬菌体抑菌剂母液。
由于本发明采用噬菌体SppYZU05特异性裂解腐败希瓦氏菌,可以在常温和冷藏条件下有效抑制腐败希瓦氏菌代谢和繁殖,减少腐败希瓦氏菌引起的腐败;本发明涉及的噬菌体SppYZU05通过传统的方法很容易配制成喷洒液或淋洗液。
附图说明
图1是不同噬菌体分离株的抑菌能力比较。
图2噬菌体SppYZU05单层平板抑菌结果。
图3噬菌体SppYZU05电镜照片。
图4噬菌体SppYZU05全基因组图谱。
图5噬菌体SppYZU05对菌膜形成的抑制效果,其中,Control表示未加噬菌体的对照组;Blank表示纯培养基空白对照组;A、B、C、D、E组表示加104PFU/mL、105PFU/mL、106PFU/mL、107PFU/mL、108PFU/mL浓度的SppYZU05处理组,每组5个平行,星号表示与对照组差异极显著(p<0.001)。
图6噬菌体SppYZU05在鱼汁保藏过程中的抑菌作用,其中,实心数据点表示未加噬菌体的对照组;空心数据点为添加噬菌体的实验组;圆形数据点为25℃贮藏测定结果;方形数据为4℃贮藏测定的结果。
图7噬菌体SppYZU05在鱼片保藏过程中的抑菌作用,其中,实心数据点表示未经噬菌体处理的鱼片(对照组);空心数据点为噬菌体组合处理的鱼片(实验组);圆形数据点为25℃贮藏测定结果;方形数据点为4℃贮藏测定的结果。
图8噬菌体SppYZU05在鱼片保藏过程中的保鲜效果,其中,黑色柱状图表示未经噬菌体处理的鱼片(对照组);白色柱状图为噬菌体组合处理的鱼片(实验组);图A为25℃贮藏鱼片测定结果;图B为4℃贮藏测定的结果。
本发明中腐败希瓦氏菌噬菌体SppYZU05(Shewanella putrefaciens phageSppYZU05),保藏在中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC),保藏地址:武汉武汉大学;保藏编号:CCTCC NO:M 2016717;保藏日期:2016年12月2日。
具体实施方式
以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明,但实施例并不对本发明做任何形式的限定。
本发明试验用噬菌体宿主菌腐败希瓦氏菌(Shewanella putrefaciens,菌株号:CICC22940),购自中国工业微生物菌种保藏管理中心;腐败希瓦氏菌菌株ATCC BAA-1097购自北京北纳创联生物技术研究院。
除非特别说明,本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。
除非特别说明,本发明实施例所用培养基和试验条件为本领域常规培养基和试验。除非特别说明,本发明实施例所用试剂均为市购。
实施例1、噬菌体分离及纯化制备
噬菌体分离
本发明样品采自江苏扬州农贸市场污水,取30mL污水样品放入50mL离心管中,5000×g离心10min,取5mL上清液加入到5mL LB液体培养基中,同时加入100μL对数生长期的腐败希瓦氏菌CICC 22940,放置25℃摇床过夜培养,次日,将试管中的培养物转至无菌离心管中,4℃,5000×g离心10min,取上清过0.22μm滤膜,得到噬菌体原液,放置4℃冰箱保存。
用无菌SM缓冲液对噬菌体原液进行倍比稀释,取合适稀释度的噬菌体液100μL与100μL对数生长期的腐败希瓦氏菌CICC 22940在室温下混合10min,再加入5mL LB半固体培养基,混匀,快速倾倒在事先制好的LB固体培养基上,制成双层平板,凝固后倒置放在25℃恒温培养箱中培养。
在上述出现噬菌斑的双层平板上挑取透明单个空斑至1mL SM缓冲液中,混匀,4℃放置24h;次日用无菌的SM缓冲液对噬菌体液进行倍比稀释,取合适稀释度的噬菌体液体100μL与100μL对数生长期的腐败希瓦氏菌CICC 22940在室温下混合10min,再加入5mL LB半固体培养基,混匀,快速倾倒在事先制好的LB固体培养基上,制成双层平板,凝固后倒置放在25℃恒温培养箱中培养。重复双层平板法的操作3次,得到的噬菌斑大小一致后,即认为分离到的是纯的噬菌体。分离获得的噬菌体,得到分离株SppYZU05、SppYZU05-1、SppYZU05-2、SppYZU05-3、SppYZU05-4。
分别取10μL腐败希瓦氏菌噬菌体分离株SppYZU05、SppYZU05-1、SppYZU05-2、SppYZU05-3、SppYZU05-4的悬液加入100μL对数期生长期的腐败希瓦氏菌悬液(菌株SYZU05、CICC 22940和ATCC BAA-1097等体积混合),以同体积的SM缓冲液为对照(Blank),室温放置10min,然后加到20mL LB液体培养基中,接种物放置在25℃培养箱中恒温培养,在0h、24h、48h取样1mL,用分光光度计测量波长在600nm处的吸光值,每组设置3个平行,取平均值用于比较不同噬菌体分离株的抑菌能力。结果如图1所示,SppYZU05在24h和48h的OD600nm值始终保持在较低的水平(OD600<0.2)显著小于其他的噬菌体分离株(P<0.01),表明SppYZU05具有最强的抑制能力。
噬菌体的纯化
分别取100μL分离得到的腐败希瓦氏菌噬菌体SppYZU05与对数期生长期的腐败希瓦氏菌液100μL混合,室温放置10min,然后加到10mL LB液体培养基中,25℃,150rpm恒温振荡过夜培养;将试管中的培养物转至灭菌离心管中,经5000×g,10min离心后收集上清液,通过0.22μm微孔滤膜过滤除菌,得到噬菌体增殖液。加0.93g PEG 8000,0.58g NaCl,摇匀至溶解,4℃过夜;10000×g 4℃离心20min,去上清液;加0.5mL SM(1L:NaCl 5.8g,MgSO4.7H2O 2.0g,1M Tris-HCl(pH7.4)50mL)溶液,室温作用1h;通过加入等体积的氯仿抽提30s;3000×g 4℃离心15min回收含有噬菌体颗粒的亲水相。获得纯化的噬菌体,用双层平板检测纯化噬菌体裂解效果。结果显示SppYZU05对腐败希瓦氏菌产生强烈的裂解效应(如图2所示)。
噬菌体形态特征
用透射电镜观察噬菌体形态特征。采用磷钨酸负染色法,将铜网有膜的一面朝上,取10μL噬菌体液滴于铜网上,吸附15min后用吸水纸吸干水分,取出铜网,在空气中自然干燥2-3min。然后在铜网上滴一滴2%的磷钨酸(PTA)水溶液进行染色,2min后取下,用吸水纸吸干水分,在空气中干燥5min,用透射电镜观察,选取清晰的噬菌体图像进行拍照分析。
结果如图3所示,噬菌体SppYZU05头部对称,直径约为61nm,尾长约为166nm,无伸缩性尾鞘,属于长尾噬菌体科。
噬菌体基因组特征
将纯化的噬菌体SppYZU05悬液加DNase I至终浓度5μg/mL,RNase A至1μg/mL,37℃温育1h;加入EDTA(pH 8.0)至终浓度20mmol/L;加蛋白酶K至终浓度50μg/mL,加SDS至终浓度0.5%,混匀,56℃×1h;加入等体积平衡酚(pH 8.0)振荡抽提,5000×g,离心10min,收集上层水相;用等体积氯仿再抽提一次,5000×g,离心10min,收集上层水相;加入1/10体积3mol/L NaAc(pH 5.2),再加入两倍体积的无水乙醇沉淀核酸,-20℃过夜,4℃,12000×g离心10min;沉淀用70%乙醇和无水乙醇各洗涤一次,去乙醇,空气中干燥沉淀;用适量TE(pH8.0)混悬沉淀,在GeneQuant核酸定量仪上粗略定量,暂按ds DNA设置参数,-20℃保存;提取的噬菌体DNA送至深圳恒创基因生物有限公司由Illumina Hiseq 2500PE150平台进行全基因组测序及分析。
结果如图4所示,SppYZU05基因组全长为54319bp,其中编码基因总长度分别为48786bp,平均长度分别为707bp,占总长的89.81%,GC含量为50.63%,有69个开放阅读框(ORFs);69个ORFs编码蛋白中有12个ORFs在数据库中搜不到同源性基因,57个ORFs编码的蛋白在数据库中找到同源性序列,其中44个ORFs编码的蛋白为假设蛋白,有13个蛋白序列功能明确,基因组数据显示SppYZU05为一种新的噬菌体;分析表明SppYZU05基因组中未检测到已知的毒力相关基因。
实施例2、噬菌体SppYZU05对腐败希瓦氏菌生物膜的抑制作用
取对数生长期的腐败希瓦氏菌(CICC 22940+ATCC BAA-1097,1:1混合)用营养肉汤培养基进行稀释,最终浓度为1×107CFU/mL,实验组:在无菌96孔板中每孔分别加入稀释菌液(107CFU/mL)和噬菌体SppYZU05悬液(104PFU/mL、105PFU/mL、106PFU/mL、107PFU/mL、108PFU/mL)各150μL;对照组:在无菌96孔板中每孔加入稀释菌液(107CFU/mL)和营养肉汤培养基各150μL;空白组:每孔加300μL营养肉汤培养基;37℃培养24h;取出96孔板,吸出悬浮菌液,用无菌PBS清洗96孔板3次,吹干,充分除去浮游菌体;每孔加入200μL浓度为0.2%的结晶紫染色液,染色30min;吸出染色液,用无菌PBS彻底清洗96孔板至洗出液呈无色,吹干;每孔加入200μL的33%醋酸脱色剂,振荡充分溶解,于酶标仪测定600nm处的OD值。每组平行测定5次。
结果如图5所示,加入105PFU/mL、106PFU/mL、107PFU/mL、108PFU/mL SppYZU05悬液的试验组(B、C、D、E组)测的的OD600nm显著低于对照组(p<0.001),表明105PFU/mL以上浓度的SppYZU05能够显著抑制腐败希瓦氏菌生物膜的形成。
实施例3、噬菌体SppYZU05在鱼汁贮藏过程中的抑菌作用
将新鲜草鱼宰杀后,取鱼背脊两侧肉,去皮,剪成细条,称重,按水的体积和鱼肉质量比例为2:1,加水煮沸5min后,用纱布过滤,重新添加水,恢复至第一次添加量,继续煮沸5min,用滤纸过滤,用NaOH将滤液pH调整为7,每升鱼汁中加入40mg L-半胱氨酸和40mg L-甲硫氨酸,分装至锥形瓶中,121℃灭菌15min。将腐败希瓦氏菌(CICC 22940+ATCC BAA-1097,1:1混合)按106CFU/mL浓度接种到30mL鱼汁中,实验组中加入30μL噬菌体SppYZU05悬液(108PFU/mL),对照组中加入30μL SM缓冲液,接种物分别放置在25℃培养箱以及4℃冰箱中恒温保藏,25℃培养的培养物每隔12h取样1mL,4℃培养的培养物每隔1天取样1mL,用分光光度计测量波长在600nm处的吸光值,每组设置3个平行,取平均值用于分析。
结果如图6所示,随着贮藏时间延长,对照组OD600nm快速增长,分别在第2天(25℃)和第7d(4℃)时达到1.02和1.01,而添加SppYZU05悬液的实验组OD600nm始终保持在较低的水平(OD600nm<0.2),表明本发明中的SppYZU05噬菌体在25℃和4℃条件下均能对腐败希瓦氏菌起到显著抑制作用(P<0.01)。
实施例4、噬菌体SppYZU05在鱼片贮藏过程中的抑菌作用
采集新鲜草鱼背部肌肉并分成60份,平均每份10g。用次氯酸钠浸泡15min,无菌水漂洗5遍,捞出沥干;用腐败希瓦氏菌(CICC 22940+ATCC BAA-1097,1:1混合)悬液浸泡10min,捞出沥干;对照组用SM缓冲液浸泡10min,实验组用噬菌体组合悬液浸泡10min,捞出沥干,装入聚乙烯薄膜袋中,置于4℃和25℃下恒温贮藏。4℃保藏0d、2d、4d、6d、8d、10d、12d以及25℃保藏0h、12h、24h、36h、48h取样测定菌落细菌总数(TAC),考察抑菌作用。
25℃和4℃贮藏条件下细菌总数(TAC)测定结果如图7。在两种贮藏温度下,贮藏初期对照组和实验组细菌总数分别为:3.28log CFU/g和3.09log CFU/g,随着贮藏时间的增加,噬菌体浸泡处理的鱼片细菌总数在整个贮藏期始终低于对照组,比对照组分别减少了3.2log CFU/g和3.66log CFU/g,表明本发明中的噬菌体SppYZU05抑菌剂在两种贮藏温度对鱼片中的腐败希瓦氏菌均起到显著的抑菌作用。
实施例5、噬菌体SppYZU05在鱼片冷藏过程中的保鲜效果
采集新鲜草鱼背部肌肉并分成60份,平均每份10g。用次氯酸钠浸泡15min,无菌水漂洗5遍,捞出沥干;用腐败希瓦氏菌株(CICC 22940+ATCC BAA-1097,1:1混合)悬液浸泡10min,捞出沥干;对照组用SM缓冲液浸泡10min,实验组用噬菌体SppYZU05悬液浸泡10min,捞出沥干,装入聚乙烯薄膜袋中,置于4℃和25℃下恒温贮藏。4℃保藏0d、4d、8d、12d以及25℃保藏0h、24h、48h取样测定测定挥发性盐基氮(TVB-N)值,考察鲜度变化。TVB-N值测定参照GB/T 5009.44-2003,采用半微量定氮法进行测定。
测定结果如图8。根据现有的研究结果,鱼制品TVB-N值在20mg N/100g为鲜度终点,而在35mg N/100g则为完全腐败。在常温(25℃)和低温(4℃)贮藏条件下,对照组分别在1d和4d时,TVB-N值超过20mg N/100g;在第2d和8d时TVB-N值达到35mg N/100g,接近完全腐败。而实验组(噬菌体浸泡处理的鱼片)分别在第1d和8d内TVB-N值始终保持在20mg N/100g以下,在两种温度贮藏终点,TVB-N值均未超过35mg N/100g。结果表明本发明中的噬菌SppYZU05合在两种贮藏温度下均显著抑制了腐败希瓦氏菌引起的TVB-N值上升,起到维持鲜度,延长保藏期作用。
Claims (3)
1.一种腐败希瓦氏菌噬菌体(Shewanella putrefaciens phage)SppYZU05,其保藏编号:CCTCC NO:M 2016717。
2.权利要求1所述的腐败希瓦氏菌噬菌体(Shewanella putrefaciens phage)SppYZU05在制备抑菌剂中的应用。
3.一种腐败希瓦氏菌抑菌剂,其特征在于:是以权利要求1所述的噬菌体SppYZU05作为抑菌成分。
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腐败希瓦氏菌噬菌体Spp001基因序列及其裂解活性研究;韩峰;《万方》;20150401;全文 * |
腐败希瓦氏菌噬菌体的性质和防腐应用研究;孔令红;《万方》;20121227;摘要 * |
Also Published As
Publication number | Publication date |
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CN107828742A (zh) | 2018-03-23 |
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