CN110305851A - 鸡白痢沙门氏菌噬菌体Pu20及其在液蛋中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种鸡白痢沙门氏菌噬菌体Pu20及其在液蛋中的应用，该噬菌体为宽谱型且能够裂解沙门氏菌及其耐药菌株，经鉴定，为有尾噬菌体目短尾噬菌体科，噬菌体Pu20在pH 3～12，温度30～40℃之间效价稳定。利用本发明提供的噬菌体可以有效控制液蛋样品中的耐药性肠炎沙门氏菌和鼠伤寒沙门氏菌，与抗生素和化学防腐剂相比较，具有特异性高、无残留和安全的特点。

Description

鸡白痢沙门氏菌噬菌体Pu20及其在液蛋中的应用
技术领域
本发明涉及食品安全领域，具体地指一种鸡白痢沙门氏菌噬菌体 Pu20及其在液蛋中的应用。
背景技术
沙门氏菌(Salmonella)是一类常见的人畜共患致病菌，呈全球性分布，易引起胃肠炎、败血症、伤寒等感染性疾病，给人类和动物健康造成巨大威胁。在全世界已发现2600多种沙门氏菌血清型，只有某些特定的沙门氏菌血清型会感染人和动物，其中鸡白痢沙门氏菌(S.Pullorum)是严重影响我国禽养殖业发展的宿主特异性病原菌，传播范围广，致病性强，主要感染雏鸡，可以引起白色下痢，且雏鸡感染后死亡率几乎100％；最常见的与人类疾病有重要关系的有鼠伤寒沙门氏菌(S.Typhimurium)和肠炎沙门氏菌(S.Enteritidis)等，欧洲食品安全局(EFSA)报道显示，2004～2011年欧洲地区，禽类及蛋类食品中肠炎沙门氏菌、婴儿沙门氏菌、鼠伤寒沙门氏菌是检出率最高的血清型，检出率分别为39.1％、22.0％和8.6％；猪肉、牛肉类食品中检出率最高的血清型均为鼠伤寒沙门氏菌(54.8％和43.5％)；2015～2016年，张濛等人在河南15家哨点医院搜集了 5720例食源性疾病患者的信息，从粪便中分离到221株沙门氏菌，其中肠炎沙门氏菌和鼠伤寒沙门氏菌为主导血清型。在我国70％～80％的细菌性食物中毒是因为食用了沙门氏菌污染的食品，这些食品中，超过90％是畜禽产品，在1998～2002年间发生了252例经证实的沙门氏菌食物中毒事件，其中90例因食用蛋及蛋类制品引起。
近几十年来，由于抗生素广泛用于动物饲料和其他生产过程中，沙门氏菌的耐药性逐渐增强，沙门氏菌对人类和动物健康的威胁也不断增加，美国每年至少有200万人感染抗生素耐药菌，23000人因此死亡，相比于直接感染抗生素耐药菌，其引起的并发症能造成更多的死亡病例。2018年在全国四个省份的养殖场采集动物和环境样本，从中分离到100株沙门氏菌株，对其进行药敏试验，发现这些沙门氏菌菌株对9种广泛使用抗生素的抗药率都高于50％且对多粘菌素B的抗药率高达98％，因此利用其他抗菌剂对沙门氏菌进行控制对食品安全具有重要意义。
噬菌体是专一裂解细菌的病毒，分布广泛于环境中，也是人体微生物组的重要组成部分，具有高效、高特异性、易大量制备等特点，并且无色无味，不会影响食品本身的风味，是一种较为安全的高效杀菌剂。
发明内容
本发明的目的是在于提供了一种鸡白痢沙门氏菌噬菌体Pu20，其为宽谱型且能够裂解沙门氏菌耐菌株。鸡白痢沙门氏菌噬菌体Pu20 作为一种对沙门氏菌具有强有效裂解作用的抑菌剂，它能够有效抑制肠炎沙门氏菌ATCC13076，SJTUF10978，SJTUF10984；鼠伤寒沙门氏菌ATCC14028，ST-8；鸡白痢沙门氏菌CVCC534，C79-3；都柏林沙门氏菌3710，3723；乙型副伤寒沙门氏菌CMCC50094；鸭沙门氏菌ATCC9270；猪霍乱沙门氏菌ATCC10708；19株沙门氏菌耐药菌株等31株细菌。
本发明还有一个目的是在于提供了一种鸡白痢沙门氏菌噬菌体 Pu20在液蛋样品中的应用，利用本发明提供的噬菌体可以有效控制液蛋样品中的耐药性肠炎沙门氏菌和耐药性鼠伤寒沙门氏菌，与抗生素和化学防腐剂相比较，具有特异性高、无残留和安全的特点。
为了实现上述技术目的，本发明采用以下技术措施：
本发明提供了一种鸡白痢沙门氏菌噬菌体Pu20，所述噬菌体具有广谱性、能够裂解沙门氏菌耐药菌株，经鉴定，该噬菌体为有尾噬菌体目短尾噬菌体科，其命名为鸡白痢沙门氏菌噬菌体(Salmonella pullorum bacteriophage)Pu20，于2019年5月16日将该噬菌体Pu20 保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址为湖北省武汉市武汉大学，保藏编号为：CCTCC NO：M 2019359，保藏日期为：2019年5 月16日。
噬菌体Pu20在pH为3-12之间，30-40℃效价稳定；噬菌体Pu20 可裂解的菌株包括肠炎沙门氏菌ATCC13076，SJTUF10978， SJTUF10984；鼠伤寒沙门氏菌ATCC14028，ST-8；鸡白痢沙门氏菌 CVCC534，C79-3；都柏林沙门氏菌3710，3723；乙型副伤寒沙门氏菌CMCC50094；鸭沙门氏菌ATCC9270；猪霍乱沙门氏菌 ATCC10708；19株沙门氏菌耐药菌株。
本发明还提供了一种上述鸡白痢沙门氏菌噬菌体Pu20在制备预防沙门氏菌的噬菌体制剂中的应用。所述沙门氏菌为肠炎沙门氏菌 11561或/和鼠伤寒沙门氏菌SJTUF13277。
本发明还提供了一种上述鸡白痢沙门氏菌噬菌体Pu20在液蛋保鲜中的应用。用于抑制液蛋样品中的耐药性肠炎沙门氏菌或/和鼠伤寒沙门氏菌。
上述应用的方法：向液蛋中添加鸡白痢沙门氏菌噬菌体Pu20培养液，其中，鸡白痢沙门氏菌噬菌体Pu20的添加量为1000～10000 PFU/mL。
作为优选方案，所述鸡白痢沙门氏菌噬菌体Pu20的添加量为 10000PFU/mL。
上述鸡白痢沙门氏菌噬菌体Pu20在液蛋样品中抑菌效果的实验，其步骤是：
(1)将培养至对数期的肠炎沙门氏菌11561和鼠伤寒沙门氏菌 SJTUF13277，用PBS缓冲液将其浓度调整为1×104CFU/mL。将实验分为十二组进行，分别取100μL菌液加入到9.8mL无菌的蛋黄、蛋清中，将六组蛋黄样品分别放置在25℃、4℃的培养箱中20min，让菌液充分适应该环境；将六组蛋清样品分别放置在25℃、4℃的培养箱中20min，让菌液充分适应该环境。
(2)在每个温度下的六组实验组中，四组为实验组：取100μL 纯化的噬菌体Pu20液(效价分别为1×108PFU/mL、1×107PFU/mL) 加入已加菌液的蛋黄、蛋清中，将其充分混匀；另两组为对照组：取 100μL PBS缓冲液(pH7.2～7.4)加入已加菌液的蛋黄、蛋清中，将其充分混匀。
(3)将步骤(2)经过两种处理的蛋黄、蛋清静置于4℃、25℃培养箱中，分别于0、1、3、6、12、24h取出，按照GB-4789.4-2010 (国标沙门氏菌检验方法)平板计数法检测蛋黄、蛋清中肠炎沙门氏菌的数量，进而计算噬菌体的抑菌效果。
本发明的有益效果在于：
(1)经固体富集后的噬菌体原液效价高，在本发明中，噬菌体 Pu20的效价≧1010PFU/mL。
(2)在不同的条件下，抑菌能力强。在本发明中，比较了噬菌体Pu20在MOI＝1000、MOI＝100、MOI＝10、MOI＝1、MOI＝0.1、 MOI＝0.01的条件下对肠炎沙门氏菌和鼠伤寒沙门氏菌的抑菌作用，并发现在不同的MOI条件下均具有很好的抑菌效果。
(3)pH范围更广。本发明提供的噬菌体Pu20的pH稳定性(3～ 12)优于专利201010508259.9中的肠炎沙门氏菌噬菌体No:M 2010226的pH稳定性(5～10)、专利201080042733.1中的肠炎沙门氏菌噬菌体KCCM1 1030P 2019.08.14的pH稳定性(3～11)。
(4)宿主谱宽。本发明提供的噬菌体Pu20对31株沙门氏菌(包括19株沙门氏菌耐药菌株)均具有较好的裂解效果。
(5)据统计，目前的专利在对耐药性沙门氏菌的应用较少，本发明旨在提供一种新型的抑菌剂能够抑制液蛋样品中耐药性肠炎沙门氏菌和耐药性鼠伤寒沙门氏菌的生长。
附图说明
图1为沙门氏菌噬菌体Pu20双层平板噬菌斑图；
图2为沙门氏菌噬菌体Pu20的电镜观察图；
图3为沙门氏菌噬菌体Pu20的结构蛋白的分析图；
图中，1：噬菌体Pu20结构蛋白；2：中分子量蛋白标准；
图4为沙门氏菌噬菌体Pu20的核酸的提取及鉴定的电泳图；
图中，M：15000bp DNA marker；1：噬菌体Pu20基因组经 Hind III酶切；2：噬菌体Pu20基因组经EcoRⅤ酶切；3：噬菌体 Pu20基因组；
图5A为沙门氏菌噬菌体Pu20在不同MOI值条件下对肠炎沙门氏菌11561裂菌能力结果图；
图5B为沙门氏菌噬菌体Pu20在不同MOI值条件下对肠炎沙门氏菌11561裂菌能力结果图；
图6为沙门氏菌噬菌体Pu20的一步生长曲线；
图7为沙门氏菌噬菌体Pu20的pH稳定性结果图；
图8为沙门氏菌噬菌体Pu20的热稳定性结果图；
图9为沙门氏菌噬菌体Pu20在低温4℃及室温25℃对蛋清中肠炎沙门氏菌11561的控制效果图；
图中，*显著；**极其显著，P-value＜0.05；
图10为沙门氏菌噬菌体Pu20在低温4℃及室温25℃对蛋黄中肠炎沙门氏菌11561的控制效果图；
图中，*显著；**极其显著，P-value＜0.05；
图11为沙门氏菌噬菌体Pu20在低温4℃及室温25℃对蛋清中鼠伤寒沙门氏菌SJTUF13277的控制效果图；
图中，*显著；**极其显著，P-value＜0.05；
图12为沙门氏菌噬菌体Pu20在低温4℃及室温25℃对蛋黄中鼠伤寒沙门氏菌SJTUF13277的控制效果图；
图中，*显著；**极其显著，P-value＜0.05。
具体实施方式
为了更好地解释本发明，以下结合具体实施例进一步阐明本发明的主要内容，但本发明的内容不仅仅局限于以下实施例。
实施例1：
鸡白痢沙门氏菌噬菌体Pu20的分离筛选方法，其步骤是：
(1)样品采集
污水样品分别来自湖北省武汉市某下水道。
(2)沙门氏菌噬菌体的筛选
取污水样品10mL，用0.22μm微孔滤器过滤。分别放入装有20 mL灭菌的LB肉汤培养基(该培养基的成分为：胰蛋白胨10.0g/L、酵母提取物5.0g/L、氯化钠10.0g/L、pH值7.3±0.2；该培养基的使用方法为：称取上述成分的LB肉汤培养基25.0g，加热搅拌溶解于1000mL蒸馏水中，分装于试管或其它合适的容器中，121℃高压灭菌20min备用)的50mL灭菌离心管中，另加入对数生长期(培养6 h～8h)的宿主菌菌液5mL。37℃振荡培养12h～18h，使噬菌体增殖，其中，宿主菌为鸡白痢沙门氏菌CVCC534。
将上述培养液于50mL离心管中，以4℃下，8000r/min离心10 min，取上清液用0.22μm的滤膜过滤。按照上述方法反复富集两次，即加入灭菌的LB肉汤培养基、加入对数生长期宿主菌菌液培养6h～ 8h。
利用双层平板法，将宿主菌菌液与上层培养基混合后到入已倒好的下层平板中，待凝固后，滴加10μL样品滤液，晾干后37℃倒置培养过夜，观察有无噬菌斑。
将有噬菌斑的样品滤液进行梯度稀释，利用双层平板法，将宿主菌、样品稀释液和上层培养基混合倒入下层平板，铺匀，凝固后37℃倒置培养6h。
(3)噬菌体的扩增培养和纯化
在培养噬菌体原液的双层平板中挑取相对独立、大而边缘光滑的噬菌斑，接种于1mL LB肉汤培养基中，37℃、200r/min振荡培养 12h～18h。4℃下，8000r/min离心10min，0.22μm滤膜过滤除菌，将噬菌体原液按从稀释倍数高向稀释倍数低的方向加入混有200μL菌液的上层培养基。重复上述步骤5次反复纯化噬菌体，直至得到大小较均一的噬菌斑，即为纯化的噬菌体，本发明人将该菌株编号为 Pu20。并利用双层平板法测定所分离噬菌体的效价。
经测定，该噬菌体Pu20的效价为1.3×1010PFU/mL。
(4)菌株鉴定
经纯化后的噬菌体Pu20头部呈正二十面体结构，头部直径长 42.23nm，尾长18.66nm，经鉴定该噬菌体为有尾噬菌体目，短尾噬菌体科。
(5)噬菌体的保藏
短期保存可将过滤得到的噬菌体悬液存放于4℃冰箱中；若长期保存将过滤得到的噬菌体悬液，加入灭菌甘油(终浓度为20％)，存放于-80℃冰箱。
该噬菌体Pu20命名为鸡白痢沙门氏菌噬菌体(Salmonella pullorumbacteriophage)Pu20，于2019年5月16日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址为湖北省武汉市武汉大学，保藏编号为 CCTCC NO：M 2019359CCTCC M 2019359
沙门氏菌噬菌体Pu20形成的噬菌斑呈圆形透明状，直径2mm左右(培养12h)，边界清楚无晕环，头部呈正二十面体结构，头部直径长42.23nm，尾长18.66nm，属短尾噬菌体科。
实施例2：鸡白痢沙门氏菌噬菌体Pu20宿主谱的测定
试验选择7种沙门氏菌标准菌株(肠炎沙门氏菌ATCC13076， SJTUF10978，SJTUF10984；鼠伤寒沙门氏菌ATCC14028， ATCC13311；鸡白痢沙门氏菌CVCC534；乙型副伤寒沙门氏菌 CMCC50094和42种其他种属菌株(鼠伤寒沙门氏菌ST-8；鸭沙门氏菌ATCC9270；猪霍乱沙门氏菌ATCC10708；鸡白痢沙门氏菌 C79-3；都柏林沙门氏菌3710、3720；大肠杆菌DH5α、BL21、T10、 83715、F18ac、NCTC12900CICC10662、CICC10664、CICC10669、 CICC10667；单核细胞增生李斯特氏菌ATCC19114；金黄色葡萄球菌 ATCC6538、ATCC29213和阿贡纳沙门氏菌耐药菌株17、19、21；鼠伤寒沙门氏菌耐药菌株30、36、114、172、206、10855、SJTUF13306、 SJTUF 13277、SJTUF13336、SJTUF13337、SJTUF13350；肠炎沙门氏菌耐药菌株38、39、42、201、211、10960、11561、13500、13520) 来做沙门氏菌噬菌体Pu20的宿主谱分析，具体步骤如下：
分别培养上述菌株(7种沙门氏菌标准菌株和42种其他种属菌株)至对数期。取100μL对数期上述菌液，待上层琼脂(向100mL 实施例1步骤(2)中的LB肉汤培养基中加入0.7g琼脂，121℃灭菌20min备用)温度降至38或39或40或41或42或43或44℃时，取3mL上层琼脂与上述菌液混匀，之后倒入15mL下层LB琼脂培养基(该培养基的成分为：胰蛋白胨10.0g/L、酵母提取物5.0g/L、氯化钠10.0g/L、琼脂10.0g/L、pH值7.3±0.2；该培养基的使用方法为：称取上述成分的LB琼脂培养基35.0g，加热搅拌溶解于1000 mL蒸馏水中，分装于试管或其它合适的容器中，121℃高压灭菌20 min备用)上；静置晾干约10min，待上层培养基凝固后，分别滴加 5μL噬菌体原液(噬菌体原液的制备方法为：取鸡白痢沙门氏菌 CVCC534接种于3mL新鲜LB肉汤培养基中，37℃培养6h左右，取100μL上述菌液于10mL新鲜LB肉汤培养基中，再分别加入100 μL，4℃保存的沙门氏菌噬菌体Pu20，混匀后37℃振荡培养箱中培养12h～18h使噬菌体增殖；取5mL增殖液于离心管中，8000r/min 离心15min去除细菌碎片，上清液用0.22μm滤膜过滤得噬菌体原液)，隔夜观察。
结果如表1所示，噬菌体可裂解多种不同血清型的沙门氏菌，表现出广谱性。
由于广谱抗生素的大量使用，导致沙门氏菌耐药菌株逐年增多，多重耐药沙门氏菌引起的食源性疾病严重危害人类健康和生命。沙门氏菌噬菌体Pu20能有效地裂解这些耐药菌株，不仅拓宽了噬菌体的宿主谱，还为杀灭耐药沙门氏菌提供了一种新杀菌剂。
表1沙门氏菌噬菌体Pu20宿主谱的测定
注：“+”表示噬菌体对细菌的裂解程度，“+”越多，表示裂解程度越高。“－”表示噬菌体对细菌无裂解能力。
实施例3：鸡白痢沙门氏菌噬菌体Pu20的电镜观察
采用磷钨酸负染色法(Clokie and Kropinski 2009)，噬菌体悬液于4℃、40000r/min超速离心1h沉淀噬菌体颗粒，沉淀用0.1 mol/L乙酸铵重悬，取噬菌体重悬液20μL和体积分数2％、pH＝7的磷钨酸20μL分别滴加在封口膜上。轻取铜网，先浸没于噬菌体液中10min之后用滤纸吸去多余液体。再将铜网置于磷钨酸染料中染色 10min后吸去多余液体，自然晾干至完全干燥，制备好的铜网在透射电子显微镜下观察噬菌体形态，并用软件Digital Micrograph Demo 3.9.1测量其大小。
结果如图2所示，沙门氏菌噬菌体Pu20头部呈正二十面体结构，头部直径长42.23nm，尾长18.66nm，属短尾噬菌体科。
实施例4：沙门氏菌噬菌体Pu20结构蛋白分析
1.噬菌体颗粒的浓缩
参照《分子克隆实验指南》第三版中λ噬菌体颗粒提取方法并加以改进(J.萨姆布鲁克1996)，简述如下：
(1)500mL的LB培养基按照1:100加入新鲜培养至对数期的宿主菌液，37℃摇床振荡培养3h直至浑浊。
(2)加入5mL噬菌体悬液，37℃摇床振荡培养4h～6h至培养液由浑浊变至澄清。
(3)加入氯仿5mL，37℃摇床振荡培养30min。
(4)加入DNaseⅠ和RNase A至终浓度为1μg/mL，37℃水浴30min，消化宿主菌的DNA和RNA。
(5)向溶液中加入固体NaCl 29.2g(终浓度为1mol/L)，边加边缓慢搅拌使之溶解，冰浴1h后4℃、11000r/min离心10min，收集上清液。
(6)在上清中加入固体PEG 8000(按w/v为10％加入)沉淀噬菌体颗粒，使用磁力搅拌器使之溶解，转移至离心管中，放在4℃冰箱过夜沉淀。
(7)于4℃，11000r/min离心10min，回收沉降的噬菌体，去上清，将离心管倒置5min，以便使液体流下。
(8)将沉淀轻轻重悬于8mL TE缓冲液中，充分柔和的冲洗离心管壁。
(9)加入等体积的氯仿抽提噬菌体悬液中的PEG和细胞碎片3 次，温和振荡30s，于4℃、3000r/min离心15min，分离有机相和亲水相，回收噬菌体颗粒的亲水相，用双层平板法检测浓缩好的噬菌体颗粒，4℃保存。
2.噬菌体结构蛋白的SDS-PAGE电泳
进行噬菌体结构蛋白的SDS-PAGE电泳(聚丙烯酰氨凝胶电泳)，具体实验步骤如下：
(1)安装好制胶玻璃板，检查是否漏水。
(2)在干净的小烧杯中制备12％分离胶，配方如下：
混匀，加入玻璃板中，并加入异丙醇压平液面，静置30min以上待其凝固后弃掉异丙醇。
(3)在干净的小烧杯中制备5％浓缩胶，配方如下：
混匀，加入到分离胶上层，插入梳子，静置20min以上待其凝固
(4)蛋白样品准备：浓缩好的噬菌体经4℃、40000r/min超速离心1h，使用新鲜配制的1倍上样缓冲液重悬沉淀下来的噬菌体颗粒，沸水浴5min，冷却至室温。
(5)上样：将凝胶板安装至电泳槽中，加入电泳缓冲液，小心拔出梳子，用移液枪点5μL中分子量蛋白marker，15μL蛋白样品。
(6)电泳：接通电源，电压设定80V，待样品电泳至分离胶界面时，调电压至120V，继续电泳至溴酚蓝指示剂达凝胶下缘，停止电泳。
(7)染色：小心取出凝胶夹板，用润湿的切胶刀取下凝胶，将凝胶置入盛有考马斯亮蓝染色液的玻璃平皿中，于圆周震荡摇床上室温染色3h左右。
(8)脱色：弃掉染色液，加入脱色液至浸没凝胶，每半小时换一次脱色液，直至凝胶背景变成白色，用凝胶扫描仪摄取图像。
结果如图4所示，沙门氏菌噬菌体Pu20在中分子蛋白质标准范围内，其中显现出明显的至少7条蛋白条带，含量最大的条带经 Quantity One软件分析分子量大小为37kDa，其中30kDa的含量最大，说明37kDa所对应的蛋白在沙门氏菌噬菌体Pu20颗粒中所占的拷贝数最大。拷贝数最大的蛋白为最主要的结构蛋白即最可能为噬菌体的衣壳蛋白，但最终确定每一个结构蛋白还需经过质谱鉴定或经过完整的基因组注释。
实施例5：鸡白痢沙门氏菌噬菌体Pu20核酸的提取及鉴定
(1)噬菌体悬液于4℃、40000r/min超速离心1h沉淀噬菌体颗粒。
(2)加入脱氧核糖核酸酶DNase Ⅰ(1mg/mL)20μL,核糖核酸酶RNase A(10mg/mL)20μL，用小型涡旋仪涡旋2min， 37℃温育40min。
(3)加入20μL 2mol/L ZnCl2，37℃温育7min。离心，4℃，10000r/min，1min；弃上清。
(4)加入500μL TES缓冲液，65℃吹吸15min至澄清透明，无白色颗粒物。
(5)加入10μL蛋白酶k(20mg/mL)，50℃温育1h，每隔10 min上下颠倒一下。
(6)温育后冷却，加入60μL预冷的3mol/L CH3COOK (pH＝5.2)，冰浴15min。
(7)离心12000r/min，10min，4℃。取上清。等量苯酚:氯仿: 异戊醇(25:24:1)抽提1次。
(8)离心12000r/min，10min，常温。取上层液体，1倍体积的异丙醇在-20℃沉淀DNA，放置过夜。
(9)离心，4℃，12000r/min，10min，弃上清。加入1mL 70％乙醇洗涤1次。12000r/min，10min离心，弃上清，37℃风干40min。
(10)用TE缓冲液溶解核酸沉淀，-20℃保存备用。
(11)核酸用HindⅢ和EcoR V核酸内切酶进行常规消化，消化产物于0.8％琼脂糖凝胶电泳进行鉴定。
结果如图5所示，沙门氏菌噬菌体Pu20核酸能被EocR V核酸内切酶酶切，根据酶切片段大小估算沙门氏菌噬菌体Pu20的基因组大小约为55kb。
实施例6：鸡白痢沙门氏菌噬菌体Pu20裂菌能力的评价
(1)挑取肠炎沙门氏菌11561、鼠伤寒沙门氏菌SJTUF13277 单菌落接种于10mL LB肉汤培养基中，150r/min、37℃摇床中培养8 h。再按照1:100的比例转接到装有10mL LB肉汤培养基中，150 r/min、37℃下振荡培养3h。培养液用梯度稀释涂平板法进行计数，备用。
细菌的数量(CFU/mL)＝单菌落个数×稀释梯度×10
(2)取沙门氏菌噬菌体Pu20原液(沙门氏菌噬菌体Pu20原液的制备方法为：以鸡白痢沙门氏菌CVCC534为宿主菌，用LB肉汤培养基对沙门氏菌噬菌体Pu20进行增殖培养12h～18h；将培养好的噬菌体和宿主菌的混合液8000r/min离心15min，上清液用0.22 μm的滤膜除去宿主菌，得到纯的噬菌体液，测效价，备用。)
噬菌体的效价(PFU/mL)＝噬菌斑个数×稀释倍数×10
(3)取对数期沙门氏菌菌液，连续十倍梯度稀释至105CFU/mL，取上述噬菌体液连续十倍梯度稀释至108PFU/mL、107PFU/mL、106 PFU/mL、105PFU/mL、104PFU/mL、103PFU/mL，分别按照 MOI＝1000、100、10、1、0.1、0.01加入对应的实验组，并加入100μL 105CFU/mL的沙门氏菌菌液混匀；另设阳性对照组加入100μL 105 CFU/mL菌液，100μL LB肉汤培养基；阴性对照组100μL 107 PFU/mL噬菌体液，100μL LB肉汤培养基；酶标仪设定参数，λ＝600nm，T＝37℃，开机之后要预热30min，每隔1h测定OD600值的变化。利用软件GraphPad Prism 6作图得到裂解曲线图。
结果如图5的A所示，对于肠炎沙门氏菌11561，沙门氏菌噬菌体Pu20在MOI＝1000时，细菌生长在8h前被完全抑制，之后曲线开始上升，在MOI＝0.01，10，100时，细菌生长基本被抑制，曲线呈先上升再下降后再回升的趋势，MOI＝0.1和MOI＝1时，有一定的抑菌效果，OD600值随着时间呈上升趋势。
如图5的B所示，对于鼠伤寒沙门氏菌SJTUF13277，沙门氏菌噬菌体Pu20在MOI＝0.01，0.1，1，10，100，1000时，前6h细菌生长被完全抑制，6h开始曲线随着时间呈上升趋势。
实施例6：鸡白痢沙门氏菌噬菌体Pu20一步生长曲线的测定
按最佳MOI值(MOI＝0.1)将新鲜噬菌体液与宿主菌液各500μL，混匀，37℃温育20min后于4℃下，7000r/min离心2min，尽量弃去上清，用1mL LB培养基洗涤2次，弃上清，用预热的10mL LB 培养基重悬。重悬液迅速置于37℃摇床中160r/min振荡培养，同时开始计时，在0min和每隔10min取样300μL，4℃、7000r/min离心30s，立刻吸取上清液100μL于900μLLB培养基中作梯度稀释。
按上述操作每间隔10min，取样选择合适的稀释梯度，测定噬菌体效价。
结果如图6所示，噬菌体Pu20的潜伏期是20min；裂解期是 180min；裂解量分别是34PFU/cell。
实施例7：鸡白痢沙门氏菌噬菌体Pu20的pH稳定性的测定
用HCl和NaOH调节LB肉汤培养基的pH值，在pH为2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13时，取900μL的LB肉汤培养基分装于无菌EP管中，置于37℃水浴锅中，待温度稳定后加入100μL噬菌体液(约108PFU/mL)，37℃水浴2h，待作用时间结束，根据预实验结果将样品做适当稀释后采用双层平板法测定噬菌体效价。
结果如图7所示，沙门氏菌噬菌体Pu20在pH值3～12时都可以保持较高活性，而且噬菌体活性波动较小，pH值在2或12时，噬菌体的活性基本降为0。
实施例8：鸡白痢沙门氏菌噬菌体Pu20的热稳定性的测定
各取1mL噬菌体液，稀释至107PFU/mL，并分装于2个1mL 无菌离心管中，每管各1mL，将EP管分别置于30℃、40℃、50℃、 60℃、70℃、80℃恒温水浴锅中，分别在30min、60min时从EP管中取100μL噬菌体液，先冷却至室温，之后用双层琼脂平板法测定噬菌体效价。
结果如图8所示，沙门氏菌噬菌体Pu20的初始效价为1.7×107 PFU/mL，在30℃环境下效价保持稳定没有发生明显变化，在40℃～60℃环境下，随温度升高噬菌体效价下降剧烈，0min～30min效价下降剧烈， 30min～60min下降速度放缓，70℃保存30min噬菌体完全失活。
实施例9：低温4℃及室温25℃条件下，沙门氏菌噬菌体Pu20 以不同MOI值(MOI＝10000，MOI＝1000)加入蛋黄、蛋清中对肠炎沙门氏菌11561的抑菌效果实验
蛋黄、蛋清样品的制备：从超市购买鸡蛋，将鸡蛋用蒸馏水冲洗干净后用75％的酒精进行消毒，再置于生化安全柜中紫外光照30min杀菌处理。每4 个鸡蛋的蛋黄和蛋清分别混合在一起，盛装在组培瓶中，此时要将蛋黄、蛋清原液涂平板，证明原有的鸡蛋是无菌的。蛋清、蛋黄分别用消毒过的玻璃棒搅拌，直至挑起蛋液能均匀流下。
将培养至对数期的肠炎沙门氏菌11561，用PBS缓冲液将其浓度调整为1×105CFU/mL。将试验分为十二组进行，分别取100μL菌液加入到9.8mL无菌的蛋黄、蛋清中，将六组蛋黄样品分别放置在 25℃、4℃的培养箱中20min，让菌液充分适应该环境；将六组蛋清样品分别放置在25℃、4℃的培养箱中20min，让菌液充分适应该环境。
在每个温度下的六组试验组中，四组为实验组：取100μL纯化的噬菌体Pu20液体(效价分别为1×109PFU/mL、1×108PFU/mL)加入已加宿主菌液的蛋黄、蛋清中，将其充分混匀；另两组为对照组：取100 μL PBS缓冲液加入已加宿主菌液的蛋黄、蛋清中，将其充分混匀。
将以上经过两种处理的蛋黄、蛋清静置于4℃、25℃培养箱中，分别于0、1、3、6、12、24h取出，按照平板计数法检测蛋黄、蛋清中肠炎沙门氏菌的数量，从而检测噬菌体的抑菌效果。实验重复2 次，每次设2次平行。
结果如图9、图10所示，对于肠炎沙门氏菌11561：在蛋清中，沙门氏菌噬菌体Pu20的抑菌效率最高可达92.40％，与对照组相比活菌数下降1.12log10CFU/mL。在蛋黄中，沙门氏菌噬菌体Pu20的抑菌效率最高可达86.38％，与试验组中的活菌数相比对照组下降了0.87 log10CFU/mL。
实施例10：低温4℃及室温25℃条件下，沙门氏菌噬菌体 Pu20以不同MOI值(MOI＝10000，MOI＝1000)加入蛋黄、蛋清中对鼠伤寒沙门氏菌SJTUF13277的抑菌效果实验
蛋黄、蛋清样品的制备同实施例9。
将培养至对数期的鼠伤寒沙门氏菌SJTUF13277，用PBS缓冲液将其浓度调整为1×105CFU/mL。将试验分为十二组进行，分别取100 μL菌液加入到9.8mL无菌的蛋黄、蛋清中，将六组蛋黄样品分别放置在25℃、4℃的培养箱中20min，让菌液充分适应该环境；将六组蛋清样品分别放置在25℃、4℃的培养箱中20min，让菌液充分适应该环境。
在每个温度下的六组试验组中，四组为实验组：取100μL纯化的噬菌体Pu20液体(效价分别为1×109PFU/mL、1×108PFU/mL)加入已加宿主菌液的蛋黄、蛋清中，将其充分混匀；另两组为对照组：取100 μL PBS缓冲液加入已加宿主菌液的蛋黄、蛋清中，将其充分混匀。
将以上经过两种处理的蛋黄、蛋清静置于4℃、25℃培养箱中，分别于0、1、3、6、12、24h取出，按照平板计数法检测蛋黄、蛋清中肠炎沙门氏菌的数量，从而检测噬菌体的抑菌效果。实验重复2 次，每次设2次平行。
结果如图11、图12所示，对于鼠伤寒沙门氏菌SJTUF13277：在蛋清中，沙门氏菌噬菌体Pu20在4℃，MOI＝10000下作用24h时对蛋清中的鼠伤寒沙门氏菌SJTUF13277的抑菌效率可以达到 100.00％，与试验组中的活菌数相比对照组下降了4.60log10CFU/mL。在蛋黄中，噬菌体Pu20的抑菌效率最高可达99.51％，与试验组中的活菌数相比对照组下降了2.32log10CFU/mL。
沙门氏菌噬菌体Pu20在12h对液蛋样品中肠炎沙门氏菌11561 的抑菌效果如表2所示。
表2噬菌体Pu20在12h对液蛋中肠炎沙门氏菌11561的抑菌效果
注：“--”表示与对照组无显著性差异(P＜0.05)。
沙门氏菌噬菌体Pu20在12h对液蛋样品中鼠伤寒沙门氏菌 SJTUF13277的抑菌效果如表3所示。表3噬菌体Pu20在12h对液蛋中鼠伤寒沙门氏菌SJTUF13277的抑菌效果
注：“--”表示与对照组无显著性差异(P＜0.05)。
其它未详细说明的部分均为现有技术。尽管上述实施例对本发明做出了详尽的描述，但它仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部实施例，人们还可以根据本实施例在不经创造性前提下获得其他实施例，这些实施例都属于本发明保护范围。

Claims (6)

1.一种鸡白痢沙门氏菌噬菌体Pu20，其特征在于：所述噬菌体具有广谱性、能够裂解沙门氏菌耐药菌株，其命名为鸡白痢沙门氏菌噬菌体(Salmonella pullorumbacteriophage)Pu20，保藏编号为：CCTCC NO：M 2019359。
2.一种权利要求1所述鸡白痢沙门氏菌噬菌体Pu20在制备预防沙门氏菌的噬菌体制剂中的应用。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：所述沙门氏菌为肠炎沙门氏菌11561或/和鼠伤寒沙门氏菌SJTUF13277。
4.一种权利要求1所述鸡白痢沙门氏菌噬菌体Pu20在液蛋保鲜中的应用。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于：所述应用的方法：向液蛋中添加鸡白痢沙门氏菌噬菌体Pu20培养液，其中，鸡白痢沙门氏菌噬菌体Pu20的添加量为1000～10000PFU/mL。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于：所述鸡白痢沙门氏菌噬菌体Pu20的添加量为104PFU/mL。
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