CN110241091A - 都柏林沙门氏菌噬菌体d1-2及其在液蛋样品中的应用 - Google Patents

都柏林沙门氏菌噬菌体d1-2及其在液蛋样品中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种都柏林沙门氏菌噬菌体D1‑2及其在液蛋样品中的应用，该噬菌体为宽谱型且能够裂解沙门氏菌及其耐药菌株，经鉴定为有尾噬菌体目肌尾噬菌体科，噬菌体D1‑2在pH 3‑12，温度30‑60℃之间效价稳定。利用本发明提供的噬菌体可以有效控制液蛋样品中的耐药性肠炎沙门氏菌和鼠伤寒沙门氏菌，与抗生素和化学防腐剂相比较，具有特异性高、无残留和安全的特点。

Description

都柏林沙门氏菌噬菌体D1-2及其在液蛋样品中的应用
技术领域
本发明涉及食品安全领域，具体地指一种都柏林沙门氏菌噬菌体D1-2及其在液蛋样品中的应用。
背景技术
沙门氏菌(Salmonella)是一类常见的人畜共患致病菌，呈全球性分布，易引起胃肠炎、败血症、伤寒等感染性疾病，给人类和动物健康造成巨大威胁。在全世界已发现2600多种沙门氏菌血清型，其中都柏林沙门氏菌(S.Dublin)是一种人畜共患病的肠溶沙门氏菌血清型，CDC的肠道疾病监测系统(LED)显示，1968～2013年间，都柏林沙门氏菌感染3903例，国家抗微生物监测系统(NARMS)数据显示，都柏林肠杆菌血清型中的耐药菌株比例高于其他血清型。在全球各地爆发的沙门氏菌疫情中，肠炎沙门氏菌(S.Enteritidis)及鼠伤寒沙门氏菌(S.Typhimurium)是2种最为常见的血清型，在食品生物防控中有重要地位。根据欧洲食品安全局(EFSA)报道，2004～2011年欧洲地区，禽类及蛋类食品中检出率最高的血清型为肠炎沙门氏菌39.1％、婴儿沙门氏菌22.0％、鼠伤寒沙门氏菌8.6％；猪肉、牛肉类食品中检出率最高的血清型均为鼠伤寒沙门氏菌(54.8％和43.5％)；周晨清等人2010～2015年间从零售鸡肉类样品中分离的沙门氏菌中，肠炎沙门氏菌占60％，鼠伤寒沙门氏菌占30％。在我国细菌性食物中毒中70％～80％是因为食用了沙门氏菌污染的食品导致的，其中超过90％是畜禽产品；美国超过70％的人类沙门氏菌病是由于食用被污染的鸡，火鸡或鸡蛋，从1998年到2008年，约有145次沙门氏菌爆发与家禽有关，而117次爆发与鸡蛋有关，分别造成2580人和2938人生病。
近几十年来，由于抗生素广泛用于动物饲料和其他生产过程中，沙门氏菌的耐药性逐渐增强，沙门氏菌对人类和动物健康的威胁也不断增加。美国每年至少有200万人感染抗生素耐药菌，23000人因此死亡，相比于直接感染抗生素耐药菌，其引起的并发症能造成更多的死亡病例。2016年江苏省食源性疾病监测腹泻患者中沙门氏菌检出率为3.29％。其中主要的血清型为肠炎沙门氏菌(23.4％)和鼠伤寒沙门氏菌(15.1％)且沙门氏菌多重耐药率达64.7％，最多耐受8类抗菌药物。2011～2017年从深圳各地销售的生肉、生禽、水产品、豆制品等食品中分离得到468株沙门氏菌，其中89.3％自畜肉、生禽中检出，进行耐药性分析后发现沙门氏菌对18种抗生素均有不同程度的耐药性，对四环素和链霉素的耐药率可达64.6％和55.4％，且食源性沙门菌多重耐药情况严重，多重耐药菌株比例达31.5％，最多可对12种抗生素产生耐药性。因此利用其他抗菌剂对沙门氏菌进行控制对食品安全具有重要意义。
噬菌体是专一裂解细菌的病毒，分布广泛于环境中，也是人体微生物组的重要组成部分，具有高效、高特异性、易大量制备等特点，并且无色无味，不会影响食品本身的风味，是一种较为安全的高效杀菌剂。
发明内容
本发明的第一目的是在于提供了一种都柏林沙门氏菌噬菌体D1-2，其为宽谱型且能够裂解沙门氏菌耐菌株。都柏林沙门氏菌噬菌体D1-2作为一种对沙门氏菌具有强有效裂解作用的抑菌剂，它能够有效抑制肠炎沙门氏菌ATCC13076，SJTUF10978，SJTUF10984；鼠伤寒沙门氏菌ATCC14028，ATCC13311，ST-8；鸡白痢沙门氏菌CVCC534，C79-3；都柏林沙门氏菌3710，3723；乙型副伤寒沙门氏菌CMCC50094；鸭沙门氏菌ATCC9270；猪霍乱沙门氏菌ATCC10708；大肠杆菌T10，NCTC12900；22株沙门氏菌耐药菌株等37株细菌。
本发明的第二个目的是在于提供了一种都柏林沙门氏菌噬菌体D1-2在液蛋样品中的应用，利用本发明提供的噬菌体可以有效控制液蛋样品中的耐药性肠炎沙门氏菌和耐药性鼠伤寒沙门氏菌，与抗生素和化学防腐剂相比较，具有特异性高、无残留和安全的特点。
为了实现上述技术目的，本发明采用以下技术措施：
本发明提供了一种都柏林沙门氏菌噬菌体D1-2，所述噬菌体具有广谱性、能够裂解沙门氏菌耐药菌株，经鉴定，该噬菌体为有尾噬菌体目肌尾噬菌体科，其命名为都柏林沙门氏菌噬菌体(Salmonella dublin bacteriophage)D1-2，于2019年5月16日将该沙门氏菌噬菌体D1-2保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址为湖北省武汉市武汉大学，保藏编号为：CCTCC NO：M 2019360，保藏日期为：2019年5月16日。
上述噬菌体D1-2在pH 3-12，温度30-60℃之间效价稳定；噬菌体D1-2可裂解的菌株包括肠炎沙门氏菌ATCC13076，SJTUF10978，SJTUF10984；鼠伤寒沙门氏菌ATCC14028，ATCC13311，ST-8；鸡白痢沙门氏菌CVCC534，C79-3；都柏林沙门氏菌3710，3723；乙型副伤寒沙门氏菌CMCC50094；鸭沙门氏菌ATCC9270；猪霍乱沙门氏菌ATCC10708；大肠杆菌T10，NCTC12900；22株沙门氏菌耐药菌株。
本发明还提供了一种上述都柏林沙门氏菌噬菌体D1-2在制备预防沙门氏菌的杀菌剂中的应用。所述沙门氏菌为耐药性肠炎沙门氏菌或/和鼠伤寒沙门氏菌。
本发明还提供了一种上述都柏林沙门氏菌噬菌体D1-2在液蛋保鲜中的应用，用于抑制液蛋样品中的耐药性肠炎沙门氏菌或/和鼠伤寒沙门氏菌。
上述应用的方法：向液蛋中添加都柏林沙门氏菌噬菌体D1-2培养液，其中，都柏林沙门氏菌噬菌体D1-2的添加量为1000～10000PFU/mL。
作为优选方案所述应用的方法：向液蛋中添加都柏林沙门氏菌噬菌体D1-2，其中，都柏林沙门氏菌噬菌体D1-2为104PFU/mL。
上述都柏林沙门氏菌噬菌体D1-2在液蛋样品中抑菌效果的实验，其步骤是：
(1)将培养至对数期的肠炎沙门氏菌11561和鼠伤寒沙门氏菌SJTUF13277，用PBS缓冲液将其浓度调整为1×104CFU/mL。将实验分为十二组进行，分别取100μL菌液加入到9.8mL无菌的蛋黄、蛋清中，将六组蛋黄样品分别放置在25℃、4℃的培养箱中20min，让菌液充分适应该环境；将六组蛋清样品分别放置在25℃、4℃的培养箱中20min，让菌液充分适应该环境。
(2)在每个温度下的六组实验组中，四组为实验组：取100μL纯化的噬菌体D1-2液(效价分别为1×108PFU/mL、1×107PFU/mL)加入已加菌液的蛋黄、蛋清中，将其充分混匀；另两组为对照组：取100μL PBS缓冲液(pH7.2-7.4)加入已加菌液的蛋黄、蛋清中，将其充分混匀。
(3)将步骤(2)经过两种处理的蛋黄、蛋清静置于4℃、25℃培养箱中，分别于0、1、3、6、12、24h取出，按照GB-4789.4-2010(国标沙门氏菌检验方法)平板计数法检测蛋黄、蛋清中肠炎沙门氏菌的数量，进而计算噬菌体的抑菌效果。
本发明的有益效果在于：
1)经固体富集后的噬菌体原液效价高，在本发明中，噬菌体D1-2的效价≧1010PFU/mL。
(2)在不同的条件下，抑菌能力强。在本发明中，比较了噬菌体D1-2在MOI＝1000、MOI＝100、MOI＝10、MOI＝1、MOI＝0.1、MOI＝0.01的条件下对肠炎沙门氏菌和鼠伤寒沙门氏菌的抑菌作用，并发现在不同的MOI条件下均具有很好的抑菌效果。
(3)pH范围更广。本发明提供的噬菌体D1-2的pH稳定性(3～12)优于专利201010508259.9中的肠炎沙门氏菌噬菌体CCTCC No:M2010226的pH稳定性(5～10)、专利201080042733.1中的肠炎沙门氏菌噬菌体KCCM1 1030P 2019.08.14的pH稳定性(3～11)。
(4)宿主谱宽。本发明提供的噬菌体D1-2对35株沙门氏菌(包括22株沙门氏菌耐药菌株)以及大肠杆菌工程菌株T10和肠出血性大肠杆菌NCTC12900均具有较好的裂解效果。
(5)据统计，目前的专利对耐药性沙门氏菌的应用较少，本发明旨在提供一种新型的抑菌剂能够抑制液蛋样品中耐药性肠炎沙门氏菌和耐药性鼠伤寒沙门氏菌的生长。
附图说明
图1为沙门氏菌噬菌体D1-2的双层平板噬菌斑图；
图2为沙门氏菌噬菌体D1-2的电镜观察图；
图3为沙门氏菌噬菌体D1-2基因组的BLAST的颜色比例尺；
图4为沙门氏菌噬菌体D1-2的结构蛋白的分析的SDS-PAGE图谱；
图中，1：噬菌体D1-2结构蛋白；2：中分子量蛋白标准；
图5为沙门氏菌噬菌体D1-2的核酸的提取及鉴定的电泳图；
图中，M：15000bp DNA marker；1：噬菌体D1-2基因组经Hind III酶切；2：噬菌体D1-2基因组经EcoRⅤ酶切；3：噬菌体D1-2基因组；
图6A为沙门氏菌噬菌体D1-2在不同MOI值条件下对肠炎沙门氏菌11561裂菌能力结果图；
图6B为沙门氏菌噬菌体D1-2在不同MOI值条件下对鼠伤寒沙门氏菌SJTUF13277裂菌能力结果图；
图7为沙门氏菌噬菌体D1-2的一步生长曲线图；
图8为沙门氏菌噬菌体D1-2的pH稳定性结果图；
图9为沙门氏菌噬菌体D1-2的热稳定性结果图；
图10为沙门氏菌噬菌体D1-2在低温4℃及室温25℃对蛋清中肠炎沙门氏菌11561的控制效果图；
图中，*显著；**极其显著，P-value＜0.05
图11为沙门氏菌噬菌体D1-2在低温4℃及室温25℃对蛋黄中肠炎沙门氏菌11561的控制效果；
图中，*显著；**极其显著，P-value＜0.05；
图12为沙门氏菌噬菌体D1-2在低温4℃及室温25℃对蛋清中鼠伤寒沙门氏菌SJTUF13277的控制效果；
图中，*显著；**极其显著，P-value＜0.05；
图13为沙门氏菌噬菌体D1-2在低温4℃及室温25℃对蛋黄中鼠伤寒沙门氏菌SJTUF13277的控制效果；
图中，*显著；**极其显著，P-value＜0.05。
具体实施方式
为了更好地解释本发明，以下结合具体实施例进一步阐明本发明的主要内容，但本发明的内容不仅仅局限于以下实施例。
实施例1
沙门氏菌噬菌体D1-2的分离筛选方法，其步骤是：
(1)样品采集
污水样品分别来自湖北省武汉市某菜市场。
(2)沙门氏菌噬菌体的筛选
取污水样品10mL，用0.22μm微孔滤器过滤。分别放入装有20mL灭菌的LB肉汤培养基(该培养基的成分为：胰蛋白胨10.0g/L、酵母提取物5.0g/L、氯化钠10.0g/L、pH值7.3±0.2；该培养基的使用方法为：称取上述成分的LB肉汤培养基25.0g，加热搅拌溶解于1000mL蒸馏水中，分装于试管或其它合适的容器中，121℃高压灭菌20min备用)的50mL灭菌离心管中，另加入对数生长期(培养6h～8h)的宿主菌菌液5mL。37℃振荡培养12h～18h，使噬菌体增殖，其中，宿主菌为都柏林沙门氏菌3710。将上述培养液于50mL离心管中，以4℃下，8000r/min离心10min，取上清液用0.22μm的滤膜过滤。按照上述方法反复富集两次，即加入灭菌的LB肉汤培养基、加入对数生长期宿主菌菌液培养6～8h。
利用双层平板法，将宿主菌菌液与上层培养基混合后到入已倒好的下层平板中，待凝固后，滴加10μL样品滤液，晾干后37℃倒置培养过夜，观察有无噬菌斑。
将有噬菌斑的样品滤液进行梯度稀释，利用双层平板法，将宿主菌、样品稀释液和上层培养基混合倒入下层平板，铺匀，凝固后37℃倒置培养6h。
(3)噬菌体的扩增培养和纯化
在培养噬菌体原液的双层平板中挑取相对独立、大而边缘光滑的噬菌斑，接种于1mL LB肉汤培养基中，37℃、200r/min振荡培养12h～18h。4℃下，8000r/min离心10min，0.22μm滤膜过滤除菌，将噬菌体原液按从稀释倍数高向稀释倍数低的方向加入混有200μL菌液的上层培养基。重复上述步骤5次反复纯化噬菌体，直至得到大小较均一的噬菌斑，即为纯化的噬菌体，将该菌株编号为D1-2。并利用双层平板法测定所分离噬菌体的效价；经测定，该噬菌体D1-2的效价为7.8×1010PFU/mL。
(4)菌株鉴定
经纯化后的噬菌体D1-2头部呈正二十面体结构，头部直径长57.87nm，噬菌体含收缩性尾，尾长76.47nm，尾部直径16.41nm，经鉴定该噬菌体为有尾噬菌体目，肌尾噬菌体科。
(5)噬菌体的保藏
短期保存可将过滤得到的噬菌体悬液存放于4℃冰箱中；若长期保存将过滤得到的噬菌体悬液，加入灭菌甘油(终浓度为20％)，存放于-80℃冰箱。
该噬菌体D1-2其命名为都柏林沙门氏菌噬菌体(Salmonella dublinbacteriophage)D1-2，于2019年5月16日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址为湖北省武汉市武汉大学，保藏编号为CCTCC M 2019360。
沙门氏菌噬菌体D1-2形成的噬菌斑呈圆形透明状，直径1mm左右(培养12h)，边界清楚无晕环，头部呈正二十面体结构，头部直径长57.87nm，噬菌体含收缩性尾，尾长76.47nm，尾部直径16.41nm，属肌尾噬菌体科。
实施例2：都柏林沙门氏菌噬菌体D1-2宿主谱的测定
试验选择7种沙门氏菌标准菌株(肠炎沙门氏菌ATCC13076，SJTUF10978，SJTUF10984；鼠伤寒沙门氏菌ATCC14028，ATCC13311；鸡白痢沙门氏菌CVCC534；乙型副伤寒沙门氏菌CMCC50094和42种其他种属菌株(鼠伤寒沙门氏菌ST-8；鸭沙门氏菌ATCC9270；猪霍乱沙门氏菌ATCC10708；鸡白痢沙门氏菌C79-3；都柏林沙门氏菌3710、3720；大肠杆菌DH5α、BL21、T10、83715、F18ac、NCTC12900 CICC10662、CICC10664、CICC10669、CICC10667；单核细胞增生李斯特氏菌ATCC19114；金黄色葡萄球菌ATCC6538、ATCC29213和阿贡纳沙门氏菌耐药菌株17、19、21；鼠伤寒沙门氏菌耐药菌株30、36、114、172、206、10855、SJTUF13306、SJTUF 13277、SJTUF13336、SJTUF13337、SJTUF13350；肠炎沙门氏菌耐药菌株38、39、42、201、211、10960、11561、13500、13520)来做噬菌体D1-2的宿主谱分析，具体步骤如下：
分别培养上述菌株(7种沙门氏菌标准菌株和42种其他种属菌株)至对数期。取100μL对数期上述菌液，待上层琼脂(向100mL实施例1步骤(2)中的LB肉汤培养基中加入0.7g琼脂，121℃灭菌20min备用)温度降至38或39或40或41或42或43或44℃时，取3mL上层琼脂与上述菌液混匀，之后倒入15mL下层LB琼脂培养基(该培养基的成分为：胰蛋白胨10.0g/L、酵母提取物5.0g/L、氯化钠10.0g/L、琼脂10.0g/L、pH值7.3±0.2；该培养基的使用方法为：称取上述成分的LB琼脂培养基35.0g，加热搅拌溶解于1000mL蒸馏水中，分装于试管或其它合适的容器中，121℃高压灭菌20min备用)上；静置晾干约10min，待上层培养基凝固后，分别滴加5μL噬菌体原液(噬菌体原液的制备方法为：取都柏林沙门氏菌3710接种于3mL新鲜LB肉汤培养基中，37℃培养6h左右，取100μL上述菌液于10mL新鲜LB肉汤培养基中，再分别加入100μL，4℃保存的噬菌体D1-2，混匀后37℃振荡培养箱中培养12h～18h使噬菌体增殖；取5mL增殖液于离心管中，8000r/min离心15min去除细菌碎片，上清液用0.22μm滤膜过滤得噬菌体原液)，隔夜观察。
结果如表1所示，噬菌体可裂解多种不同血清型的沙门氏菌，表现出广谱性；而且沙门氏菌噬菌体D1-2可以裂解大肠杆菌工程菌株T10和肠出血性大肠杆菌NCTC12900，为今后沙门氏菌噬菌体D1-2的工业化生产提供安全的生产条件。
由于广谱抗生素的大量使用，导致沙门氏菌耐药菌株逐年增多，多重耐药沙门氏菌引起的食源性疾病严重危害人类健康和生命。沙门氏菌噬菌体D1-2能有效地裂解这些耐药菌株，不仅拓宽了噬菌体的宿主谱，还为杀灭耐药沙门氏菌提供了一种新杀菌剂。
表1都柏林沙门氏菌噬菌体D1-2宿主谱的测定
注：“+”表示噬菌体对细菌的裂解程度，“+”越多，表示裂解程度越高。“－”表示噬菌体对细菌无裂解能力。
实施例3都柏林沙门氏菌噬菌体D1-2的电镜观察
采用磷钨酸负染色法(Clokie and Kropinski 2009)，噬菌体悬液于4℃、40000r/min超速离心1h沉淀噬菌体颗粒，沉淀用0.1mol/L乙酸铵重悬，取噬菌体重悬液20μL和体积分数2％、pH＝7的磷钨酸20μL分别滴加在封口膜上。轻取铜网，先浸没于噬菌体液中10min之后用滤纸吸去多余液体。再将铜网置于磷钨酸染料中染色10min后吸去多余液体，自然晾干至完全干燥，制备好的铜网在透射电子显微镜下观察噬菌体形态，并用软件DigitalMicrograph Demo 3.9.1测量其大小。
结果如图2所示，经纯化后的沙门氏菌噬菌体D1-2头部呈正二十面体结构，头部直径长57.87nm，噬菌体含收缩性尾，尾长76.47nm，尾部直径16.41nm，属肌尾噬菌体科。
实施例4：都柏林沙门氏菌噬菌体D1-2基因组的提取与全基因组denovo测序
取1mL沙门氏菌噬菌体D1-2原液，加入脱氧核糖核酸酶DNaseⅠ(1mg/mL)20μL，核糖核酸酶RNaseA(10mg/mL)20μL，用小型涡旋仪涡旋2min，37℃温育40min；加入20μL 2mol/LZnCl2，37℃温育7min，离心，10000r/min，1min；弃上清，加入500μL TES buffer，吹吸后至澄清透明的状态，无白色颗粒物，65℃，15min(打散)，加入10μL蛋白酶k(20mg/mL)，用枪头轻轻吹吸，上下颠倒，50℃温育1h，每隔10min上下颠倒一下，此时溶液是澄清的。温育后冷却，加入60μL预冷的3mol/L CH3COOK提前放4℃，用醋酸调pH至5.2)，冰上放置15min，离心12000r/min，10min，4℃，取上清，加入600μL苯酚/氯仿/异戊醇(体积比为：25：24：1)，上下轻柔反复颠倒200次，离心12000r/min，10min，常温，取上层液体，加入1倍体积(约600μL)的异丙醇在-20℃沉淀DNA，上下颠倒后，有絮状物即是DNA，放置过夜。之后冷冻离心，4℃，12000r/min，10min，弃上清，加入1mL 70％(体积比)乙醇洗一次，吹吸，在12000r/min，10min离心，弃上清，再离心1min，管子要按同一个方向，用白枪头小心吸取剩余乙醇，放在37℃培养箱至少风干40min，再加20μL TE在常温下溶解DNA，静置30min。测序工作交于测序公司完成。
沙门氏菌噬菌体D1-2的全基因测序结果，由结果来看，噬菌体基因组为双链DNA，全长为86878bp。
在NCBI中通过BLAST进行全数据库比对，如图3所示，发现与Salmonella phageBPS17S6序列相似度最高，达到96％，判断属于同一种。
实施例4都柏林沙门氏菌噬菌体D1-2的结构蛋白分析
1.噬菌体颗粒的浓缩
参照《分子克隆实验指南》第三版中λ噬菌体颗粒提取方法并加以改进(J.萨姆布鲁克1996)，简述如下：
(1)500mL的LB培养基按照1:100加入新鲜培养至对数期的宿主菌液，37℃摇床振荡培养3h直至浑浊。
(2)加入5mL噬菌体悬液，37℃摇床振荡培养4h～6h至培养液由浑浊变至澄清。
(3)加入氯仿5mL，37℃摇床振荡培养30min。
(4)加入DNaseⅠ和RNase A至终浓度为1μg/mL，37℃水浴30min，消化宿主菌的DNA和RNA。
(5)向溶液中加入固体NaCl 29.2g(终浓度为1mol/L)，边加边缓慢搅拌使之溶解，冰浴1h后4℃、11000r/min离心10min，收集上清液。
(6)在上清中加入固体PEG 8000(按w/v为10％加入)沉淀噬菌体颗粒，使用磁力搅拌器使之溶解，转移至离心管中，放在4℃冰箱过夜沉淀。
(7)于4℃，11000r/min离心10min，回收沉降的噬菌体，去上清，将离心管倒置5min，以便使液体流下。
(8)将沉淀轻轻重悬于8mL TE缓冲液中，充分柔和的冲洗离心管壁。
(9)加入等体积的氯仿抽提噬菌体悬液中的PEG和细胞碎片3次，温和振荡30s，于4℃、3000r/min离心15min，分离有机相和亲水相，回收噬菌体颗粒的亲水相，用双层平板法检测浓缩好的噬菌体颗粒，4℃保存。
2.噬菌体结构蛋白的SDS-PAGE电泳
进行噬菌体结构蛋白的SDS-PAGE电泳(聚丙烯酰氨凝胶电泳)，具体实验步骤如下：
(1)安装好制胶玻璃板，检查是否漏水。
(2)在干净的小烧杯中制备12％分离胶，配方如下：
混匀，加入玻璃板中，并加入异丙醇压平液面，静置30min以上待其凝固后弃掉异丙醇。
(3)在干净的小烧杯中制备5％浓缩胶，配方如下：
混匀，加入到分离胶上层，插入梳子，静置20min以上待其凝固
(4)蛋白样品准备：浓缩好的噬菌体经4℃、40000r/min超速离心1h，使用新鲜配制的1倍上样缓冲液重悬沉淀下来的噬菌体颗粒，沸水浴5min，冷却至室温。
(5)上样：将凝胶板安装至电泳槽中，加入电泳缓冲液，小心拔出梳子，用移液枪点5μL中分子量蛋白marker，15μL蛋白样品。
(6)电泳：接通电源，电压设定80V，待样品电泳至分离胶界面时，调电压至120V，继续电泳至溴酚蓝指示剂达凝胶下缘，停止电泳。
(7)染色：小心取出凝胶夹板，用润湿的切胶刀取下凝胶，将凝胶置入盛有考马斯亮蓝染色液的玻璃平皿中，于圆周震荡摇床上室温染色3h左右。
(8)脱色：弃掉染色液，加入脱色液至浸没凝胶，每半小时换一次脱色液，直至凝胶背景变成白色，用凝胶扫描仪摄取图像。
结果如图4所示，沙门氏菌噬菌体D1-2在中分子蛋白质标准范围内，其中显现出明显的至少5条蛋白条带，含量最大的条带经Quantity One软件分析分子量大小为35kDa，说明35kDa所对应的蛋白在沙门氏菌噬菌体D1-2颗粒中所占的拷贝数最大。拷贝数最大的蛋白为最主要的结构蛋白即最可能为噬菌体的衣壳蛋白，但最终确定每一个结构蛋白还需经过质谱鉴定或经过完整的基因组注释。
实施例5都柏林沙门氏菌噬菌体D1-2核酸的提取及鉴定
(1)噬菌体悬液于4℃、40000r/min超速离心1h沉淀噬菌体颗粒。
(2)加入脱氧核糖核酸酶DNaseⅠ(1mg/mL)20μL,核糖核酸酶RNase A(10mg/mL)20μL，用小型涡旋仪涡旋2min，37℃温育40min。
(3)加入20μL 2mol/L ZnCl2，37℃温育7min。离心，4℃，10000r/min，1min；弃上清。
(4)加入500μL TES缓冲液，65℃吹吸15min至澄清透明，无白色颗粒物。
(5)加入10μL蛋白酶k(20mg/mL)，50℃温育1h，每隔10min上下颠倒一下。
(6)温育后冷却，加入60μL预冷的3mol/L CH3COOK(pH＝5.2)，冰浴15min。
(7)离心12000r/min，10min，4℃。取上清。等量苯酚:氯仿:异戊醇(25:24:1)抽提1次。
(8)离心12000r/min，10min，常温。取上层液体，1倍体积的异丙醇在-20℃沉淀DNA，放置过夜。
(9)离心，4℃，12000r/min，10min，弃上清。加入1mL 70％乙醇洗涤1次。12000r/min，10min离心，弃上清，37℃风干40min。
(10)用TE缓冲液溶解核酸沉淀，-20℃保存备用。
(11)核酸用HindⅢ和EcoR V核酸内切酶进行常规消化，消化产物于0.8％琼脂糖凝胶电泳进行鉴定。
结果如图5所示，沙门氏菌噬菌体D1-2核酸能被HindⅢ核酸内切酶酶切，根据酶切片段大小估算沙门氏菌噬菌体D1-2的基因组大小约为87kb。
实施例6都柏林沙门氏菌噬菌体D1-2裂菌能力的评价
(1)挑取肠炎沙门氏菌11561、鼠伤寒沙门氏菌SJTUF13277单菌落接种于10mL LB肉汤培养基中，150r/min、37℃摇床中培养8h。再按照1:100的比例转接到装有10mL LB肉汤培养基中，150r/min、37℃下振荡培养3h。培养液用梯度稀释涂平板法进行计数，备用。
细菌的数量(CFU/mL)＝单菌落个数×稀释梯度×10
(2)取沙门氏菌噬菌体D1-2原液(噬菌体D1-2原液的制备方法为：以沙门氏菌3710为宿主菌，用LB肉汤培养基对噬菌体D1-2进行增殖培养12h～18h；将培养好的噬菌体和宿主菌的混合液8000r/min离心15min，上清液用0.22μm的滤膜除去宿主菌，得到纯的噬菌体液，测效价，备用。)
噬菌体的效价(PFU/mL)＝噬菌斑个数×稀释倍数×10
(3)取对数期沙门氏菌菌液，连续十倍梯度稀释至105CFU/mL，取上述噬菌体液连续十倍梯度稀释至108PFU/mL、107PFU/mL、106PFU/mL、105PFU/mL、104PFU/mL、103PFU/mL，分别按照MOI＝1000、100、10、1、0.1、0.01加入对应的实验组，并加入100μL105CFU/mL的沙门氏菌菌液混匀；另设阳性对照组加入100μL 105CFU/mL菌液，100μL LB肉汤培养基；阴性对照组100μL 107PFU/mL噬菌体液，100μL LB肉汤培养基；酶标仪设定参数，λ＝600nm，T＝37℃，开机之后要预热30min，每隔1h测定OD600值的变化。利用软件GraphPad Prism 6作图得到裂解曲线图。
结果如图6的A所示，对于肠炎沙门氏菌11561，沙门氏菌噬菌体D1-2在MOI＝0.01，1，10时，在10h前细菌生长被完全抑制，之后OD600值开始有少量升高，在MOI＝0.1和MOI＝1000时，直至12h OD600值依然没有升高，细菌生长被完全抑制，在MOI＝100时，OD600值在4h时开始升高，在6h时最高，并且之后OD600值开始下降，8h后曲线趋于平稳。
如图6的B所示，对于鼠伤寒沙门氏菌SJTUF13277，沙门氏菌噬菌体D1-2在MOI＝10和MOI＝1000时，直至12h OD600值依然没有升高，细菌生长被完全抑制，在其他MOI时，细菌生长开始被完全抑制，9h时开始有少量上升。
实施例6：都柏林沙门氏菌噬菌体D1-2一步生长曲线的测定
按最佳MOI值(MOI＝0.1)将新鲜噬菌体液与宿主菌液各500μL，混匀，37℃温育20min后于4℃下，7000r/min离心2min，尽量弃去上清，用1mL LB培养基洗涤2次，弃上清，用预热的10mL LB培养基重悬。重悬液迅速置于37℃摇床中160r/min振荡培养，同时开始计时，在0min和每隔10min取样300μL，4℃、7000r/min离心30s，立刻吸取上清液100μL于900μLLB培养基中作梯度稀释。
按上述操作每间隔10min，取样选择合适的稀释梯度，测定噬菌体效价。
结果如图7所示，沙门氏菌噬菌体D1-2的潜伏期是10min；裂解期是110min；裂解量是104PFU/cell。
实施例7：都柏林沙门氏菌噬菌体D1-2的pH稳定性的测定
用HCl和NaOH调节LB肉汤培养基的pH值，在pH为2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13时，取900μL的LB肉汤培养基分装于无菌EP管中，置于37℃水浴锅中，待温度稳定后加入100μL噬菌体液(约108PFU/mL)，37℃水浴2h，待作用时间结束，根据预实验结果将样品做适当稀释后采用双层平板法测定噬菌体效价。
结果如图8所示，沙门氏菌噬菌体D1-2在pH值3～12时都可以保持较高活性，而且噬菌体活性波动较小，pH值在2或12时，噬菌体的活性基本降为0。
实施例8：沙门氏菌噬菌体D1-2的热稳定性的测定
各取1mL噬菌体液，稀释至107PFU/mL，并分装于2个1mL无菌离心管中，每管各1mL，将EP管分别置于30℃、40℃、50℃、60℃、70℃、80℃恒温水浴锅中，分别在30min、60min时从EP管中取100μL噬菌体液，先冷却至室温，之后用双层琼脂平板法测定噬菌体效价。
结果如图9所示，沙门氏菌噬菌体D1-2的初始效价为2.3×108PFU/mL，在30℃～50℃环境下效价保持稳定没有发生明显变化，在60℃～80℃环境下，保存30min时噬菌体效价分别下降了约0.90log10PFU/mL，2.17log10PFU/mL和4.64log10PFU/mL，而60min的效价下降速度明显变缓，与30min时相比分别下降了0.11log10PFU/mL，0.34log10PFU/mL和0.65log10PFU/mL，且在80℃保持60min依然具有一定活性。
实施例9：低温4℃及室温25℃条件下，沙门氏菌噬菌体D1-2以不同MOI值(MOI＝10000，MOI＝1000)加入蛋黄、蛋清中对肠炎沙门氏菌11561的抑菌效果实验
蛋黄、蛋清样品的制备：从超市购买鸡蛋，将鸡蛋用蒸馏水冲洗干净后用75％
的酒精进行消毒，再置于生化安全柜中紫外光照30min杀菌处理。每4个鸡蛋的蛋黄和蛋清分别混合在一起，盛装在组培瓶中，此时要将蛋黄、蛋清原液涂平板，证明原有的鸡蛋是无菌的。蛋清、蛋黄分别用消毒过的玻璃棒搅拌，直至挑起蛋液能均匀流下。
将培养至对数期的肠炎沙门氏菌11561，用PBS缓冲液将其浓度调整为1×105CFU/mL。将试验分为十二组进行，分别取100μL菌液加入到9.8mL无菌的蛋黄、蛋清中，将六组蛋黄样品分别放置在25℃、4℃的培养箱中20min，让菌液充分适应该环境；将六组蛋清样品分别放置在25℃、4℃的培养箱中20min，让菌液充分适应该环境。
在每个温度下的六组试验组中，四组为实验组：取100μL纯化的噬菌体D1-2液体(效价分别为1×109PFU/mL、1×108PFU/mL)加入已加宿主菌液的蛋黄、蛋清中，将其充分混匀；另两组为对照组：取100μL PBS缓冲液加入已加宿主菌液的蛋黄、蛋清中，将其充分混匀。
将以上经过两种处理的蛋黄、蛋清静置于4℃、25℃培养箱中，分别于0、1、3、6、12、24h取出，按照平板计数法检测蛋黄、蛋清中肠炎沙门氏菌的数量，从而检测噬菌体的抑菌效果。实验重复2次，每次设2次平行。
噬菌体的抑菌效率＝(对照组肠炎沙门氏菌数量-实验组肠炎沙门氏菌数量)÷对照组肠炎沙门氏菌数量×100％。
结果如图10、图11所示，对于肠炎沙门氏菌11561：在蛋清中，沙门氏菌噬菌体D1-2的抑菌效率最高可达99.98％，与对照组相比活菌数下降4.60log10CFU/mL。在蛋黄中，沙门氏菌噬菌体D1-2的抑菌效率最高高达99.95％，与试验组中的活菌数相比对照组下降了3.29log10CFU/mL。
实施例10：低温4℃及室温25℃条件下，沙门氏菌噬菌体D1-2以不同MOI值(MOI＝10000，MOI＝1000)加入蛋黄、蛋清中对鼠伤寒沙门氏菌SJTUF13277的抑菌效果实验
蛋黄、蛋清样品的制备同实施例9。
将培养至对数期的鼠伤寒沙门氏菌SJTUF13277，用PBS缓冲液将其浓度调整为1×105CFU/mL。将试验分为十二组进行，分别取100μL菌液加入到9.8mL无菌的蛋黄、蛋清中，将六组蛋黄样品分别放置在25℃、4℃的培养箱中20min，让菌液充分适应该环境；将六组蛋清样品分别放置在25℃、4℃的培养箱中20min，让菌液充分适应该环境。
在每个温度下的六组试验组中，四组为实验组：取100μL纯化的噬菌体D1-2液体(效价分别为1×109PFU/mL、1×108PFU/mL)加入已加宿主菌液的蛋黄、蛋清中，将其充分混匀；另两组为对照组：取100μL PBS缓冲液加入已加宿主菌液的蛋黄、蛋清中，将其充分混匀。
将以上经过两种处理的蛋黄、蛋清静置于4℃、25℃培养箱中，分别于0、1、3、6、12、24h取出，按照平板计数法检测蛋黄、蛋清中肠炎沙门氏菌的数量，从而检测噬菌体的抑菌效果。实验重复2次，每次设2次平行。
结果如图12、图13所示，对于鼠伤寒沙门氏菌SJTUF13277：在蛋清中，沙门氏菌噬菌体D1-2作用24h的抑菌效率可以达到97.42％，与试验组中的活菌数相比对照组下降了1.59log10CFU/mL。在蛋黄中，噬菌体D1-2的抑菌效率最高高达99.96％，与试验组中的活菌数相比对照组下降了3.34log10CFU/mL。
沙门氏菌噬菌体D1-2在12h对液蛋样品中肠炎沙门氏菌11561的抑菌效果如表2所示。
表2噬菌体D1-2在12h对液蛋中肠炎沙门氏菌11561的抑菌效果
注：“--”表示与对照组无显著性差异(P＜0.05)。
噬菌体D1-2在12h对液蛋样品中鼠伤寒沙门氏菌SJTUF13277的抑菌效果如表3所示。
表3噬菌体D1-2在12h对液蛋中鼠伤寒沙门氏菌SJTUF13277的抑菌效果
注：“--”表示与对照组无显著性差异(P＜0.05)。
其它未详细说明的部分均为现有技术。尽管上述实施例对本发明做出了详尽的描述，但它仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部实施例，人们还可以根据本实施例在不经创造性前提下获得其他实施例，这些实施例都属于本发明保护范围。

Claims (6)

1.一种都柏林沙门氏菌噬菌体D1-2，其特征在于：所述噬菌体具有广谱性、能够裂解沙门氏菌耐药菌株，其命名为都柏林沙门氏菌噬菌体(Salmonella dublin bacteriophage)D1-2，保藏编号为：CCTCC NO：M 2019360。
2.一种权利要求1所述都柏林沙门氏菌噬菌体D1-2在制备预防沙门氏菌的噬菌体制剂中的应用。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：所述沙门氏菌为肠炎沙门氏菌11561或/和鼠伤寒沙门氏菌SJTUF13277。
4.一种权利要求1所述都柏林沙门氏菌噬菌体D1-2在液蛋保鲜中的应用。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于：所述应用的方法：向液蛋中添加都柏林沙门氏菌噬菌体D1-2培养液，其中，都柏林沙门氏菌噬菌体D1-2的添加量为1000～10000PFU/mL。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于：所述都柏林沙门氏菌噬菌体D1-2的添加量为104PFU/mL。
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