CN106282127A - 新的噬菌体、其组合物以及它们的制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及微生物领域，本发明提供了新的沙门氏菌噬菌体、其组合物、它们的制备方法和应用，本发明所述新的沙门氏菌噬菌体为肌尾噬菌体BP-66(Myoviridae sp.BP-66)、保藏编号CCTCC NO：M2015146，肌尾噬菌体BP-63(Myoviridae sp.BP-63)保藏编号CCTCC NO：M2015145，长尾噬菌体BP-12(Chilikevirus sp.BP-12)保藏编号CCTCC NO：M2015141。本发明所述新的噬菌体为严格的烈性噬菌体且对宿主菌具有高毒性，具有较广的宿主范围，低浓度下依然对宿主菌具有高毒性；所述噬菌体的DNA无法编码可能引起潜在健康风险的蛋白；于培养液中室温下稳定存活，4℃下超过6个月；而且在非致病性细菌宿主上可较好增殖；可实现大规模工业生产。本发明所述沙门氏菌噬菌体能为噬菌体疗法的应用提供优良的菌株资源。

Description

新的噬菌体、其组合物以及它们的制备方法和应用
技术领域
发明属于微生物技术领域，具体涉及新的沙门氏菌噬菌体性、其组合物以及它们的制备方法和应用。
背景技术
沙门氏菌被认为是目前世界范围内最重要的食源性致病菌之一，据资料统计，我国发生的食源性疾病，70％-80％是由沙门氏菌引起的。由于沙门氏菌血清型众多，在自然界分布广泛，可通过污染蛋类、肉类、奶类等食品导致人类食物中毒；家禽被沙门氏菌感染后出现禽伤寒、禽副伤寒、鸡白痢等疾病。沙门氏菌属目前有肠道沙门氏菌和邦戈尔沙门氏菌2个种。有资料报道，截止2007年底有2700种以上的血清型，分属46个O群，而我国检测到的血清型达290种以上。现今生产中抗生素的滥用使许多细菌出现了耐药性，而耐药菌株在临床病人中不断增多，特别是多耐药株，将严重地危及到感染病人的治疗效果。这使得沙门氏菌病原菌的防治面临严峻挑战。
噬菌体是一类细菌依赖性病毒，可以侵染细菌，并在菌体内繁殖使细菌裂解而杀灭细菌。噬菌体作为细菌的天然克星，在控制细菌感染方面有着突出的优越性。早在20世纪初，用噬菌体治疗细菌感染就取得过积极的效果。因其对于特异性宿主菌具有裂解作用，因此可考虑到将噬菌体作为一种抗细菌感染的制剂来使用。
李梦哲(宽谱沙门氏菌噬菌体STP4-a的发酵制备及其在蛋鸡体内的抑菌研究[D].中国海洋大学硕士学位论文，2014)发现沙门氏菌噬菌体STP4-a可识别沙门氏菌，其裂解率为80.04％；包红朵等(腐败希瓦氏菌噬菌体的性质和防腐应用研究[D].中国海洋大学硕士学位论文，2012.)发现沙门氏菌噬菌体PSA-6a可裂解5株沙门氏菌及1株大肠杆菌。
CN200980000314.9公开了新型噬菌体和包含所述噬菌体的抗菌组合物，以用于治疗和预防鸡沙门氏菌的传染病的治疗；CN201010508259.9公开了一株沙门氏菌噬菌体及其应用，以用于控制沙门氏菌对食品和器具的污染。
目前，如何丰富广谱性噬菌体资源，寻找强裂解性新的噬菌体是本技术领域对于沙门氏菌病原菌防治中急需解决的问题。而从污水中筛选烈性噬菌体是研发新型抑菌制剂以促进噬菌体疗法发展的一条有效途径。
发明内容
针对以上技术情况，本发明提供了新的沙门氏菌噬菌体、其组合物以及它们的制备方法和应用，本发明所述噬菌体为肌尾噬菌体BP-66(Myoviridae sp.BP-66)、肌尾噬菌体BP-63(Myoviridae sp.BP-63)或长尾噬菌体BP-12(Chilikevirus sp.BP-12)，
其中所述肌尾噬菌体BP-66(Myoviridae sp.BP-66)的保藏单位为中国典型培养物保藏中心，地址为湖北省武汉市武昌珞珈山武汉大学，邮编430072；保藏日期为2015年3月23日；保藏编号为CCTCC NO：M 2015146，
所述肌尾噬菌体BP-63(Myoviridae sp.BP-63)的保藏单位为中国典型培养物保藏中心，地址为湖北省武汉市武昌珞珈山武汉大学，邮编430072；保藏日期为2015年3月23日；保藏编号为CCTCC NO：M 2015145；
所述长尾噬菌体BP-12(Chilikevirus sp.BP-12)的保藏单位为中国典型培养物保藏中心，地址为湖北省武汉市武昌珞珈山武汉大学，邮编430072；保藏日期为2015年3月23日；保藏编号为CCTCC NO：M 2015141。
作为本发明实施方案之一，所述肌尾噬菌体BP-66具有SEQ ID NO：1的核苷酸序列；肌尾噬菌体BP-63具有SEQ ID NO：2的核苷酸序列；或长尾噬菌体BP-12具有SEQ ID NO：3的核苷酸序列。
经测序发现肌尾噬菌体BP-66与肌尾噬菌体BP-63具有相同的核苷酸序列，它们之间却具有不同的特性，例如包括但不限于：1、噬菌体之间的压力耐受性几乎相差两倍；2、在裂解谱测定中，对于DT193A这株细菌，肌尾噬菌体BP-66能裂解，但是肌尾噬菌体BP-63不能裂解；3、在同一浓度的裂解能力上，肌尾噬菌体BP-66的裂解能力更高。
本发明所述肌尾噬菌体BP-66、肌尾噬菌体BP-63、长尾噬菌体BP-12是从加拿大蒙特利尔污水处理厂中分离出的。其中，
肌尾噬菌体BP-66的生物学特征为：在电子显微镜下观察BP-66噬菌体形态发现，其为有尾噬菌体，无折叠，具有短收缩尾部与线性双链DNA(图4)，基于其独特的大小及形态，根据病毒分类国际委员会(ICTV)定义，该噬菌体被系统分类为肌尾噬菌体科(Myoviridae)。
肌尾噬菌体BP-63的生物学特征：在电子显微镜下观察BP-63噬菌体形态发现，其为有尾噬菌体，无折叠，具有短收缩尾部与线性双链DNA(图5)，基于其独特的大小及形态，根据病毒分类国际委员会(ICTV)定义，该噬菌体被系统分类为肌尾噬菌体科(Myoviridae)。
长尾噬菌体BP-12的生物学特征：在电子显微镜下观察BP-12噬菌体形态发现，其为有尾噬菌体，无折叠，具有长且无收缩尾部与线性双链DNA(图6)，基于其独特的大小及形态，根据病毒分类国际委员会(ICTV)定义，该噬菌体被系统分类为长尾噬菌体科(Siphoviridae)。
肌尾噬菌体BP-66全基因组序列大小为40kb(图7)。将序列与局部序列排比检索基本工具中现存的所有噬菌体序列进行比对。通过BLAST程序计算比对的显著差异。采用核酸比对程序(mega blast)搜索相似度较高的序列以及更多不相同的序列。结果表明，噬菌体BP-66与肌尾噬菌体科的相似度最高。结合形态特征和全基因组序列分析，噬菌体BP-66鉴定为肌尾噬菌体BP-66(Myoviridae sp.BP-66)。肌尾噬菌体BP-66(Myoviridae sp.BP-66)具有如SEQ ID NO：1的核苷酸序列。
肌尾噬菌体BP-63全基因组序列大小为40kb(图7)。将序列与局部序列排比检索基本工具中现存的所有噬菌体序列进行比对。通过BLAST程序计算比对的显著差异。采用核酸比对程序(mega blast)搜索相似度较高的序列以及更多不相同的序列。结果表明，BP-63噬菌体序列与可对比噬菌体序列相似度均较低，小于70％。依其形态特征可将BP-63噬菌体分类为肌尾噬菌体科(Myoviridae)，但序列比对结果显示其与已知噬菌体亲缘关系均较远，无法进行匹配。因此BP-63可鉴定为肌尾噬菌体BP-63(Myoviridae sp.BP-63)。肌尾噬菌体BP-63(Myoviridae sp.BP-63)具有SEQ ID NO：2的核苷酸序列。
长尾噬菌体BP-12全基因组序列大小为40kb(图7)。将序列与局部序列排比检索基本工具中现存的所有噬菌体序列进行比对。通过BLAST程序计算比对的显著差异。采用核酸比对程序(mega blast)搜索相似度较高的序列以及更多不相同的序列。结果表明，BP-12噬菌体与长尾噬菌体科Chilikevirus属的相似度最高。结合形态特征和全基因组序列分析，BP-12噬菌体鉴定为长尾噬菌体BP-12(Chilikevirus sp.BP-12)。所述长尾噬菌体BP-12(Chilikevirus BP-12)具有如SEQ ID NO：3的核苷酸序列。
本发明所述述肌尾噬菌体BP-66、肌尾噬菌体BP-63或长尾噬菌体BP-12不含毒力基因或不良基因，其中所述的不含毒力基因或不良基因是指不包括表6所记载的毒力基因或不良基因。
本发明所述肌尾噬菌体BP-66、肌尾噬菌体(Myoviridae)BP-63或长尾噬菌体BP-12不识别非致病性细菌；
作为实施方案之一，所述非治病性细菌包括肌尾噬菌体BP-63不可识别的57株非致病性细菌、肌尾噬菌体BP-66不可识别的56株非致病性细菌、或长尾噬菌体BP-12不可识别57株非致病性细菌，其中肌尾噬菌体BP-66、肌尾噬菌体BP-63和长尾噬菌体BP-12均不识别的非致病性细菌包括54株非致病性细菌；其中上述所述的非致病性细菌是指表9所具体记载的肌尾噬菌体BP-66、肌尾噬菌体BP-63或长尾噬菌体BP-12所不识别的非致病性细菌。
本发明所述肌尾噬菌体BP-66、肌尾噬菌体BP-63或长尾噬菌体BP-12不识别非宿主性致病性细菌。
作为本发明实施方案之一，所述非宿主性致病性细菌为184株非宿主性致病性细菌；以上所述非宿主性致病性细菌是指表10所记载的肌尾噬菌体BP-66、肌尾噬菌体BP-63或长尾噬菌体BP-12所不识别的非宿主性株致病性细菌。
作为本发明实施方案之一，本发明的另一目的在于提供了所述肌尾噬菌体BP-66、肌尾噬菌体BP-63或长尾噬菌体BP-12在裂解沙门氏菌范围中的应用。
作为本发明实施方案之一，所述的沙门氏菌包括肌尾噬菌体BP-63可裂解的35株血清型肠道沙门氏菌、肌尾噬菌体BP-66可裂解的38株血清型肠道沙门氏菌、或长尾噬菌体BP-12可裂解的22株血清型肠道沙门氏菌。其中，所述肌尾噬菌体BP-66、肌尾噬菌体BP-63和长尾噬菌体BP-12都可裂解的包括43血清型肠道沙门氏菌；其中以上所述的血清型肠道沙门氏菌是指表7所记载的肌尾噬菌体BP-66、肌尾噬菌体BP-63或长尾噬菌体BP-12可裂解的血清型肠道沙门氏菌株。
作为本发明实施方案之一，所述沙门氏菌还包括肌尾噬菌体BP-63可裂解的22株不同血清型肠道沙门氏菌、肌尾噬菌体BP-66可裂解的25株不同血清型肠道沙门氏菌、或长尾噬菌体BP-12可裂解的24株不同血清型肠道沙门氏菌；其中肌尾噬菌体BP-66、肌尾噬菌体BP-63和长尾噬菌体BP-12均可裂解的包括25株不同血清型肠道沙门氏菌；其中以上所述的不同血清型肠道沙门氏菌是指表8所示记载的肌尾噬菌体BP-66、肌尾噬菌体BP-63或长尾噬菌体BP-12可裂解的血清型肠道沙门氏菌。
作为本发明实施方案之一，所述肌尾噬菌体BP-66、肌尾噬菌体BP-63或长尾噬菌体BP-12的浓度为108PFU/ml、107PFU/ml、106PFU/ml、105PFU/ml。
作为实施方案之一，本发明还提供一种肌尾噬菌体BP-66、肌尾噬菌体BP-63或长尾噬菌体BP-12的制备方法，所述制备方法包括：
1-1)采集加拿大蒙特利尔污水处理厂水样离心取上清液，然后与LB液体培养基与处于对数期的沙门氏菌均匀混合，于37℃过夜培养，富集噬菌体；
1-2)将样本富集液离心，取上清液除菌得到含有噬菌体的滤液，取滤液与其宿主沙门氏菌菌液均匀混合，静置使其与细菌表面的受体充分结合；
1-3)将上述混合液加入半固体琼脂培养基中，混匀后立即铺于已凝固的固体琼脂平板上进行培养，形成噬菌斑后取噬菌斑，接种于液体培养基中，加入沙门氏菌菌液并混匀过夜培养，3500rpm离心10min取上清后以细菌滤膜过滤，采用双层平板法观察噬菌斑形态；
1-4)重复步骤3)的操作3-5次后，即可得形状和大小一致的噬菌斑，即得肌尾噬菌体BP-66、肌尾噬菌体BP-63或长尾噬菌体BP-12。其中，所述噬菌体为肌尾噬菌体BP-66、肌尾噬菌体BP-63或长尾噬菌体BP-12，其中肌尾噬菌体BP-66的保藏编号为CCTCC NO：M 2015146，肌尾噬菌体BP-63的保藏编号为CCTCC NO：M 2015145，长尾噬菌体BP-12保藏编号为CCTCC NO：M 2015141。
经过核苷酸测序，所述肌尾噬菌体BP-66具有SEQ ID NO：1的核苷酸序列；肌尾噬菌体BP-63具有SEQ ID NO：2的核苷酸序列；或长尾噬菌体BP-12具有SEQ ID NO：3的核苷酸序列。
其中所述肌尾噬菌体BP-66和肌尾噬菌体BP-63具有相同的核苷酸序列。
本发明进一步还提供一种肌尾噬菌体BP-66、肌尾噬菌体BP-63或长尾噬菌体BP-12的发酵方法，所述方法包括：2-1)取肌尾噬菌体BP-66、肌尾噬菌体BP-63或长尾噬菌体BP-12的菌落，接种到LB培养液中振荡得到宿主菌悬液；
2-2)将菌悬液稀释转接到LB培养液，振荡培养至对数前期并测定其菌悬液浓度；
2-3)调节噬菌体BP-66或BP-12的发酵初始pH值为6、噬菌体BP-63发酵初始pH值为2；
2-4)采用火焰接种法接种，向LB液体培养基中分别接入噬菌体和对数期宿主菌液并发酵，发酵过程中通入无菌空气，并加入消泡剂；
2-5)发酵结束后，将噬菌体与宿主菌的全部混合液取出并离心，上清液经真空抽气泵抽滤至无菌过滤器装置内，得到噬菌体发酵液并于4℃下保存，即得。
作为本发明实施方案之一，所述制备或发酵方法中，所述LB培养液或LB固体培养基的配方为：胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，氯化钠10g，蒸馏水1000ml，pH 7.0。
作为本发明实施方案之一，本发明还提供一种噬菌体的组合物，所述组合物含有肌尾噬菌体BP-66、肌尾噬菌体BP-63和长尾噬菌体BP-12中的任意两种或三种的组合物。
作为示例性的说明，如肌尾噬菌体BP-66和肌尾噬菌体BP-63的组合物、肌尾噬菌体BP-66和长尾噬菌体BP-12的组合物、肌尾噬菌体BP-63和长尾噬菌体BP-12的组合物，以及肌尾噬菌体BP-66、肌尾噬菌体BP-63和长尾噬菌体BP-12的组合物，它们的之间的比例关系可以由本领域技术人员结合本发明以及实际的应用领域以及本领域常识进行确定。
作为进一步的实施方案之一，所述噬菌体组合物包括含有肌尾噬菌体BP-66、肌尾噬菌体BP-63和长尾噬菌体BP-12；作为更进一步的实施方案之一，所述组合物中肌尾噬菌体BP-66、肌尾噬菌体BP-63和长尾噬菌体BP-12的生物量比为1∶1∶1。
本发明述肌尾噬菌体BP-66、肌尾噬菌体BP-63及长尾噬菌体BP-12在噬菌体效价、裂解沙门氏菌的最佳感染复数(MOI)、pH稳定性、温度及压力对噬菌体存活的影响、存活稳定性等方面具有如下的生理特性：具有较高的效价(参见表1)其中长尾噬菌体BP-12、肌尾噬菌体BP-63及BP-66感染肠道沙门氏菌的最佳MOI分别为0.00007、0.1及0.1；并具有高度亲和性及裂解能力的烈性噬菌体，可迅速裂解沙门氏菌(表2)；所述噬菌体BP-66在pH为6时生长活性所受影响最小，BP-63最适pH为2，BP-12则为6(表3)；对温度的热稳定性均相对较好，同时对压力的耐受性较好；适宜4℃低温存放。
而且肌尾噬菌体BP-66、BP-63及长尾噬菌体BP-12无毒力基因或不良基因；对沙门氏菌的裂解范围：供试噬菌体具有较宽的宿主范围，可识别除2270号菌株以外所有44株不同血清型的肠道沙门氏菌。而且在不同浓度下与沙门氏菌的互作，在低浓度下依然对宿主菌具有裂解性。
本发明所述肌尾噬菌体BP-66、BP-63及长尾噬菌体BP-12对非致病性细菌的裂解：仅与大肠杆菌有限的几株菌株(29株供试菌株中的3株)反应。更进一步地、所述长噬菌体BP-12及本发明所述肌尾噬菌体BP-66、BP-63及长尾噬菌体BP-12的组合物无法识别除1株苏云金芽孢杆菌及5株大肠杆菌外的其余非致病性细菌。
本发明肌尾噬菌体BP-66、BP-63及长尾噬菌体BP-12与非宿主性致病性细菌的互作，无法识别173株供试非宿主性致病性细菌中的任何一株。
本发明的所述肌尾噬菌体BP-66、BP-63及长尾噬菌体BP-12具有如下的优势：其为严格的烈性噬菌体且对宿主菌具有高毒性；具有较广的宿主范围且在低浓度下依然对宿主菌具有高毒性；其DNA无法编码可能引起潜在健康风险的蛋白；在非致病性细菌宿主上可较好增殖；可进行大规模发酵培养；其培养液可于室温下稳定存活，于4℃下可保存6个月。本发明未对供试噬菌体进行任何遗传修饰。因此，本发明肌尾噬菌体BP-66、BP-63及长尾噬菌体BP-12能为开发噬菌体疗法提供优良的菌株资源，并具有良好的应用开发前景。
现有技术中，李梦哲(2014)发现沙门氏菌噬菌体STP4-a仅识别沙门氏菌，其裂解率为80.04％；包红朵等(2011)发现沙门氏菌噬菌体PSA-6a可裂解5株沙门氏菌及1株大肠杆菌。本发明中3株沙门氏菌噬菌体鸡尾酒组合可裂解43株沙门氏菌，裂解率可达97.7％，且可识别1株苏云金芽孢杆菌及5株大肠杆菌，具有更强的裂解性及更宽的宿主谱。因此本发明具有更为优质的技术效果。
近年来，随着抗生素的滥用，细菌对其耐药性逐渐增强，尤其是病原菌耐药菌株的出现，对经济造成损失的同时也极大威胁着人类健康，克服细菌耐药性已成为目前的关注重点。本发明所述肌尾噬菌体BP-66、BP-63、以及长尾噬菌体BP-12或其组合物对细菌具有专一且较强的杀灭能力，本领域技术人员可以根据本发明的记载及本领域常识将本发明所述肌尾噬菌体BP-66、BP-63、以及长尾噬菌体BP-12或其组合物制备成应用于医疗，检测，消毒及食品防护等方面的各种产品加以工业应用。
本发明所述肌尾噬菌体BP-66、BP-63、以及长尾噬菌体BP-12或其组合物可以由本领域技术人员根据本发明的记载和本领域常识制备成应用于治疗或预防由沙门氏菌引起的感染性疾病的药剂或试剂。可被沙门氏菌感染的寄主包括人类、家畜(猪、牛、羊等)、家禽(鸡、鸭、鹅等)，以及各种兽类、鱼类、鼠类等。
本发明所述肌尾噬菌体BP-66、BP-63、以及长尾噬菌体BP-12或其组合物的产品形式可包括但不限于以载体携带、浓缩注射或药剂浸泡等形式施用于被防治的寄主体表、口部、直肠、胸膜内部等部位；作为实施方案之一，所述载体携带形式包括但不限于口服含水性载体、口服无水性载体、乳膏制剂等；浓缩注射形式包括但不限于疫苗注射、胸膜腔注射、经脉注射等；药剂浸泡形式包括但不限于气雾剂、漂洗剂等。
本发明所述肌尾噬菌体BP-66、BP-63及长尾噬菌体BP-12可选取一株或多株被制备成作为有效成分应用于沙门氏菌的快速检测试剂或试剂盒。其包括但不限于以试纸、试剂盒等形式对目标样本中的沙门氏菌进行检测，或对临床样本中的目标致病菌进行筛选，可有效确保检测的灵敏度。
本发明所述肌尾噬菌体BP-66、BP-63、以及长尾噬菌体BP-12或其组合物被制备常作为有效成分应用于环境消毒的各种产品，例如包括但不限于以液体浸泡、喷洒、与含水性载体联合使用等形式对配水系统、医疗设施、养殖业设施、公共及私人设施或其他环境表面进行消毒去污，可有效控制目标细菌的生长及活性。所述液体浸泡、喷洒形式包括但不限于洗涤剂、消毒剂、去污剂等；所述含水性载体包括但不限于磷酸盐缓冲液、LB培养基、氯游离水等。
本发明所述肌尾噬菌体BP-66、BP-63、及长尾噬菌体BP-12或其组合物还被制做成作为有效成分应用于食品防护的各种产品。本发明包括但不限于以液体浸泡、喷洒、与合成组分联合使用等形式对由沙门氏菌侵染所导致的食品腐坏进行预防，尤其适用于熟食或不宜灭菌的食品。所述液体浸泡、喷洒形式包括但不限于食品除菌剂、食品消毒剂、食品防腐剂等；本发明中合成组分包括但不限于苯甲酸、苯甲酸钠、山梨酸、山梨酸钾、丙酸钙等。
附图说明
图1是肌尾噬菌体BP-66噬菌体平板培养照片；
图2是肌尾噬菌体BP-63噬菌体平板培养照片；
图3是长尾噬菌体BP-12噬菌体平板培养照片；
图4是肌尾噬菌体BP-66噬菌体透射电子显微镜照片；
图5是肌尾噬菌体BP-63噬菌体透射电子显微镜照片；
图6是长尾噬菌体BP-12噬菌体透射电子显微镜照片；
图7是肌尾噬菌体BP-66、肌尾噬菌体BP-63及长尾噬菌体BP-12噬菌体基因组大小。
所述肌尾噬菌体BP-66(Myoviridae sp.BP-66)的保藏单位为中国典型培养物保藏中心，地址为湖北省武汉市武昌珞珈山武汉大学，邮编430072；保藏日期为2015年3月23日；保藏编号为CCTCC NO：M 2015146，
所述肌尾噬菌体BP-63(Myoviridae sp.BP-63)的保藏单位为中国典型培养物保藏中心，地址为湖北省武汉市武昌珞珈山武汉大学，邮编430072；保藏日期为2015年3月23日；保藏编号为CCTCC NO：M 2015145；
所述长尾噬菌体BP-12(Chilikevirus sp.BP-12)的保藏单位为中国典型培养物保藏中心，地址为湖北省武汉市武昌珞珈山武汉大学，邮编430072；保藏日期为2015年3月23日；保藏编号为CCTCC NO：M 2015141。
具体实施方式
以下实施例用于进一步阐述本发明，但不以任何的方式限制本发明的有效范围。
以下实例中，所涉及菌株代号均以本公司的命名方式编号。
以下实例中，LB液体培养基的配方为：胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，氯化钠10g，蒸馏水1000ml，pH 7.0。
LB固体培养基的配方为：胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，氯化钠10g，琼脂15g，蒸馏水1000ml，pH 7.0。
半固体琼脂培养基配方为：胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，氯化钠10g，琼脂7g，蒸馏水1000ml，pH 7.0。
SM液配方为：氯化钠8.5g，硫酸镁2g，1mol/L TrisHCl 50ml，明胶0.25g，蒸馏水1000ml。
肌尾噬菌体P-66、肌尾噬菌体BP-63和长尾噬菌体BP-12的组合物(1∶1∶1)均为按照实施例13的方法制备。
实施例1肌尾噬菌体BP-66、肌尾噬菌体BP-63及长尾噬菌体BP-12的分离纯化
采集加拿大蒙特利尔污水处理厂水样50ml，3500rpm离心10min后取9ml上清液，将其与1ml 10倍LB液体培养基及1ml处于对数期的沙门氏菌(108cfu/ml)均匀混合，于37℃过夜培养，富集噬菌体。将样本富集液3500rpm离心10min，取上清液过0.22μm的微孔滤膜除菌得到含有噬菌体的滤液。取滤液50μl与其宿主沙门氏菌菌液300μl均匀混合，静置15min使其与细菌表面的受体充分结合。将上述混合液加入4ml冷却至47℃的半固体琼脂培养基中，混匀后立即铺于已凝固的固体琼脂平板上，待琼脂凝固后于37℃倒置培养6-8h，观察噬菌斑生长情况。在形成噬菌斑的双层平板上，用无菌枪头挑取大而透亮的噬菌斑，接种于5ml LB液体培养基中，加入0.1ml沙门氏菌菌液并混匀，37℃过夜培养，3500rpm离心10min取上清后以细菌滤膜过滤，采用双层平板法观察噬菌斑形态。重复操作3-5次后，即可得形状和大小一致的噬菌斑。
自蒙特利尔污水中共分离得到3株沙门氏菌噬菌体，其分别为肌尾噬菌体BP-66、肌尾噬菌体BP-63或长尾噬菌体BP-12。BP-66与BP-63噬菌体在沙门氏菌菌苔上均产生单一的大而透明的圆形噬菌斑，直径为10mm(参见图1、图2)。BP-12噬菌体在沙门氏菌菌苔上产生单一的大而不透明的圆形噬菌斑，直径为11mm(参见图3)；BP-66噬菌体、BP-63噬菌体、BP-12噬菌体透射电子显微镜照片参见图4-6。
肌尾噬菌体BP-66(Myoviridae sp.BP-66)的保藏编号为CCTCC NO：M 2015146，肌尾噬菌体BP-63(Myoviridae sp.BP-63)的保藏编号为CCTCCNO：M 2015145，长尾噬菌体BP-12(Chilikevirus sp.BP-12)保藏编号为CCTCC NO：M 2015141。
经过核苷酸测序，所述肌尾噬菌体BP-66具有SEQ ID NO：1的核苷酸序列；肌尾噬菌体BP-63具有SEQ ID NO：2的核苷酸序列；或长尾噬菌体BP-12具有SEQ ID NO：3的核苷酸序列。图7是肌尾噬菌体BP-66、肌尾噬菌体BP-63及长尾噬菌体BP-12噬菌体基因组大小。
实施例2噬菌体BP-66、BP-63及BP-12效价的测定
用SM液做稀释液，将噬菌体BP-66、BP-63及BP-12原液分别10倍梯度稀释至107倍。分别取105、106及107稀释度的噬菌体培养液100μl与其宿主菌多重耐药性鼠伤寒沙门氏菌(ATCC 700408)菌液300μl均匀混合，静置15min使其与细菌表面的受体充分结合。将上述混合液加入4ml冷却至47℃的半固体琼脂培养基中，混匀后立即铺于已凝固的固体琼脂平板上，待琼脂凝固后于37℃倒置培养6-8h。每个稀释度需做三个平行样，计数时取此稀释度的三个平行样的平均数。其中，噬菌体效价(PFU/ml)＝平均噬菌斑数×稀释倍数×10
从表1可以得出，噬菌体BP-66、BP-63及BP-12培养12h后均具有108PFU/ml以上的效价。
表1 连续培养条件下噬菌体BP-66、BP-63及BP-12的效价
实施例3噬菌体BP-66、BP-63及BP-12对沙门氏菌最佳感染复数(MOI)的测定
挑取肠道沙门氏菌单个菌落，接种到盛有3ml LB培养液的试管中，37℃摇床中160rpm振荡培养12h，得到宿主菌悬液。将菌悬液以1∶100比例转接到10ml LB培养液，37℃160rpm振荡培养至对数前期。按照感染复数比例分别加入噬菌体BP-66、BP-63及BP-12纯培养液和宿主菌(MOI＝噬菌体数量/细菌数量)，加入LB液体培养基使各管总体积相同。在37℃摇床中160rpm振荡培养4h。培养完毕后10000g离心10min并收集上清，测定噬菌体效价。各点均作双份复管培养取平均值，以产生最高噬菌体效价的MOI为最佳感染复数。实验重复3次。
结果如表2所示，噬菌体BP-12效价达到最高(2x108PFU/ml)时，其MOI＝0.00007；噬菌体BP-63效价达到最高(7.7x109PFU/ml)时，其MOI＝0.1；噬菌体BP-66效价达到最高(1.4x108PFU/ml)时，其MOI＝0.1；因而可以确定噬菌体BP-12、BP-63及BP-66感染肠道沙门氏菌的最佳MOI分别为0.00007、0.1及0.1。
表2 不同感染复数下噬菌体BP-66、BP-63及BP-12的效价
实施例4噬菌体BP-66、BP-63及BP-12的pH稳定性试验
取无菌EP管分别加入不同pH(2、4、6、9)的LB培养基900μl后将上述EP管置于37℃的恒温水浴中，待温度平衡后加入100μl菌体纯培养液，恒温反应120min。待反应时间结束后将样品做适当稀释后采用双层平板法测定噬菌体效价。重复实验3次。
结果如表3所示，噬菌体BP-66在pH为6-9的范围内的效价相对较稳定，BP-63的pH范围为2-4，BP-12则为4-6。
表3 反应不同时间后噬菌体BP-66、BP-63及BP-12的pH值稳定性
a.BP-66的pH值稳定性(起始浓度：106PFU/ml)
b.BP-63的pH值稳定性(起始浓度：108PFU/ml)
c.BP-12的pH值稳定性(起始浓度：107PFU/ml)
注：ND：未测定。
实施例5噬菌体BP-66、BP-63及BP-12的热度及压力稳定性试验
各取100μl噬菌体纯培养液分装于无菌EP管中，分别于50℃、60℃、70℃、80℃、90℃水浴中作用5min；使用弗氏细胞压碎器使噬菌体置于极高压力条件下(1000psi)放置5min。作用时间结束后取出样品管并立即置于冰浴中冷却，经适当稀释后采用双层平板法测定噬菌体效价。实验重复3次。
结果如表4所示，BP-66最适存活温度为50℃，BP-63最适存活温度为60℃，而BP-12最适存活温度为60℃。3株噬菌体对温度的热稳定性相对较好，在60℃水浴作用下仍有较高的效价，但当水浴温度增加至70℃后，其效价难以检查，对温度的耐受性不高，不宜长时间在高温下作用。而供试噬菌体对压力耐受性均较好，在压力为1000psi时仍有较高效价。
表4 噬菌体BP-66、BP-63及BP-12于不同温度及压力下的效价
实施例6噬菌体BP-66、BP-63及BP-12的存活稳定性试验
各取1ml噬菌体BP-66、BP-63及BP-12的纯培养液分装于无菌EP管中，分别于4℃、25℃、37℃下放置，定期经适当稀释后采用双层平板法测定噬菌体效价。
结果如表5所示，4℃条件下噬菌体BP-66与BP-63可存放259d，且对宿主菌的侵染力均大于95％，BP-12则可存放161d；25℃下噬菌体BP-66与BP-63分别可于168d及126d内保持对宿主的高侵染性，而BP-12仅能维持14d；37℃下噬菌体BP-66与BP-63分别可在15d及37d内维持高侵染性，BP-12则仅可维持2d。说明3株供试噬菌体适宜4℃低温存放。
表5 噬菌体BP-66、BP-63及BP-12于不同保存温度下的存活稳定性
实施例7噬菌体BP-66、BP-63及BP-12的毒力基因或不良基因缺失检测试验
选取65种经鉴定源自病原细菌体内溶源性噬菌体的毒力基因(表6)，通过测定噬菌体BP-66、BP-63及BP-12的全基因组并对其进行生物信息学分析，以确定其是否含有上述毒力基因。
结果显示，3株供试噬菌体均不含有下列毒力基因。供试噬菌体无不良基因。
表6 病原细菌体内溶源性噬菌体的主要已知毒性基因
实施例8噬菌体BP-66、BP-63及BP-12对沙门氏菌裂解范围试验
采用点滴法来测定噬菌体的裂解谱。挑取44株不同血清型肠道沙门氏菌的单菌落分别接种于盛有3ml LB的试管中，160rpm培养8h，制得各株细菌菌液。取300μl菌悬液分别与半固体培养基混合铺于普通琼脂平板上，分别取5μl噬菌体培养液及含有BP-66、BP-63及BP-12(比例为1∶1∶1)的培养液滴于平板的不同位置上，加样时各噬菌体培养液间不可接触，以免影响试验结果。待自然风干后37℃培养6-8h，观察结果。试验重复三次。
结果如表7所示，BP-66、BP-63及BP-12具有较宽的宿主范围。BP-63可裂解35株血清型肠道沙门氏菌，BP-66可裂解38株，BP-12可裂解22株。更重要的是，含有BP-66、BP-63及BP-12的鸡尾酒(比例为1∶1∶1)可识别除2270号菌株以外的所有供试沙门氏菌。说明这些噬菌体具有较宽的宿主谱且在噬菌体治疗方面具有极大的应用潜力。
表7 BP-66、BP-63、BP-12的裂解谱测定结果
注：+++：完全裂解；++：大部分裂解；+：裂解；+/-：微弱裂解；-：未裂解
实施例9噬菌体BP-66、BP-63及BP-12在不同浓度下与沙门氏菌的互作试验
挑取25株不同血清型肠道沙门氏菌单菌落分别接种于盛有3ml LB的试管中，160rpm培养8h，制得各株细菌菌液。取300μl菌悬液分别与半固体培养基混合铺于普通琼脂平板上。用SM液做稀释液，将噬菌体BP-66、BP-63及BP-12原液分别调整浓度至108PFU/ml、107PFU/ml、106PFU/ml与105PFU/ml后，分别取5μl噬菌体培养液滴于平板的不同位置上，加样时各噬菌体培养液间不可接触，以免影响试验结果。待自然风干后37℃培养6-8h，观察结果。试验重复三次。
结果如表8所示，BP-66可裂解25株细菌，其在108与107PFU/ml浓度下对所有供试菌株均具有强裂解性；BP-63可裂解22株细菌，其在108PFU/ml浓度下对20株细菌菌株具有强裂解性，对2株细菌具有裂解性，对3株细菌无裂解性；BP-12可裂解24株细菌，其在108PFU/ml浓度下对19株细菌具有强裂解性，对5株细菌具有裂解性。
表8a-c 不同浓度下噬菌体BP-66、BP-63及BP-12的交互反应
8a.不同浓度下BP-66的交互反应
8b.不同浓度下BP-63的交互反应
8c.不同浓度下BP-12的交互反应
注：+++：完全裂解；++：大部分裂解；+：裂解；+/-：微弱裂解；-：未裂解
实施例10噬菌体BP-66、BP-63及BP-12对非致病性细菌的裂解试验
挑取包括芽孢杆菌属、大肠杆菌等在内的61株非致病性细菌单菌落分别接种于盛有3ml LB的试管中，160rpm培养8h，制得各株细菌菌液。取300μl菌悬液分别与半固体培养基混合铺于普通琼脂平板上。分别取5μl噬菌体培养液及含有BP-66、BP-63及BP-12(比例为1∶1∶1)的鸡尾酒组合培养液滴于平板的不同位置上，加样时各噬菌体培养液间不可接触，以免影响试验结果。待自然风干后37℃培养6-8h，观察结果。试验重复三次。
结果如表9所示，在本研究中，BP-66、BP-63及BP-12分别与30株供试大肠杆菌菌株中的5株、4株及3株反应，同时BP-12及鸡尾酒组合无法识别除1株苏云金芽孢杆菌及6株大肠杆菌外的其他非致病性细菌。即，BP-63对57株供试细菌无裂解性，BP-66对56株供试细菌无裂解性，BP-12对57株供试细菌无裂解性。这类交互反应对于噬菌体疗法的应用具有极大帮助。
表9 沙门氏菌噬菌体及鸡尾酒与61株非致病性细菌的交互反应
注：+++：完全裂解；++：大部分裂解；+：裂解；+/-：微弱裂解；-：未裂解
实施例11噬菌体BP-66、BP-63及BP-12与非宿主性致病性细菌的互作试验
挑取185株非宿主性致病性细菌单菌落分别接种于盛有3ml LB的试管中，160rpm培养8h，制得各株细菌菌液。取300μl菌悬液分别与半固体培养基混合铺于普通琼脂平板上。分别取5μl噬菌体培养液及含有BP-66、BP-63及BP-12(比例为1∶1∶1)的鸡尾酒组合培养液滴于平板的不同位置上，加样时各噬菌体培养液间不可接触，以免影响试验结果。待自然风干后37℃培养6-8h，观察结果。试验重复三次。
将噬菌体与非宿主性致病性细菌进行交互反应，结果显示，BP-66、BP-63及BP-12仅可识别185株供试非宿主性致病性细菌中的1株(表10)。
表10 沙门氏菌噬菌体及鸡尾酒与185株致病性细菌的交互反应
注：+++：完全裂解；++：大部分裂解；+：裂解；+/-：微弱裂解；-：未裂解
实施例12噬菌体BP-66、BP-63及BP-12的发酵制备
挑取肠道沙门氏菌单个菌落，接种到盛有3ml LB培养液的试管中，37℃摇床中160rpm振荡培养12h，得到宿主菌悬液。将菌悬液以1∶100比例转接到500ml LB培养液，37℃160rpm振荡培养至对数前期并测定其菌悬液浓度。沙门氏菌噬菌体BP-66、BP-63及BP-12发酵制备的体系为8L，发酵培养基为LB培养基。以3株噬菌体最适pH值为参数调节发酵培养基的初始pH值，其中噬菌体BP-66与BP-12的发酵初始pH值为6，噬菌体BP-63发酵初始pH值为2。采用火焰接种法接种，以其相应的最佳感染复数比例向发酵培养基中分别接入80ml的噬菌体(108PFU/ml)和对数期宿主菌液(109CFU/ml)。发酵过程中通入无菌空气，并加入3‰消泡剂，发酵制备时间为12h。自发酵开始起每2h自取样口取20ml噬菌体与宿主菌的混合液于无菌容器中，6000rpm离心15min，取上清液过0.22μm的微孔滤膜除菌得到含有噬菌体的滤液并测定其效价，方法参照实施例2。待发酵结束后，将噬菌体与宿主菌的全部混合液自取样口取出接入无菌容器中，6000rpm离心15min，取上清液经真空抽气泵抽滤至无菌过滤器装置内，得到噬菌体发酵液并于4℃下保存。
由表11可知，噬菌体BP-66与BP-12均于发酵6h时效价达最高，分别为4x1010PFU/ml与2.5x1010PFU/ml；噬菌体BP-63则于发酵8h时效价最高(3.5x1010PFU/ml)。其后3株噬菌体的效价虽有所下降，但整体数量级未发生变化，12h发酵结束后各噬菌体效价均由初始的108PFU/ml升高至1010PFU/ml，提高了2个数量级。因此，利用发酵法进行噬菌体的大规模工业制备是切实可行的。
表11 沙门氏菌噬菌体BP-66、BP-63及BP-12的发酵动态
实施例13噬菌体BP-66、BP-63及BP-12组合物的制备
分别取效价为1x108PFU/ml噬菌体BP-66、BP-63及BP-12的原液，将3株噬菌体等体积均匀混合于SM液中，制成BP-66、BP-63及BP-12的1∶1∶1的鸡尾酒组合。选取实施例8中3株噬菌体对44株不同血清型肠道沙门氏菌具有不同裂解能力的菌株，共33株，挑取其单菌落分别接种于盛有3ml LB的试管中，160rpm培养8h，制得各株细菌菌液。取300μl菌悬液分别与半固体培养基混合铺于普通琼脂平板上，分别取5μl噬菌体鸡尾酒组合的培养液滴于平板的不同位置上。待自然风干后37℃培养6-8h，观察结果。试验重复三次。
结果如表12所示，BP-66、BP-63及BP-12分别对该33株沙门氏菌具有不同的裂解能力，其中BP-63可裂解25株供试沙门氏，BP-66可裂解28株，BP-12可裂解12株。而3株噬菌体的鸡尾酒组合可识别所有供试沙门氏菌且将其被裂解能力最大化。说明噬菌体鸡尾酒组合可弥补噬菌体单一应用时宿主谱的局限性。
表12 噬菌体BP-66、BP-63及BP-12组合物的裂解谱测定结果

Claims (16)

1.新的噬菌体，其特征在于，所述噬菌体为肌尾噬菌体BP-66(Myoviridae sp.BP-66)、肌尾噬菌体BP-63(Myoviridae sp.BP-63)或长尾噬菌体BP-12(Chilikevirus sp.BP-12)，其中肌尾噬菌体BP-66的保藏编号为CCTCC NO：M 2015146，肌尾噬菌体BP-63的保藏编号为CCTCC NO：M 2015145，长尾噬菌体BP-12(Chilikevirus sp.BP-12)保藏编号为CCTCCNO：M 2015141。
2.根据权利要求1所述的噬菌体，其特征在于所述肌尾噬菌体BP-66(Myoviridae sp.BP-66)具有SEQ ID NO：1的核苷酸序列；肌尾噬菌体BP-63(Myoviridae sp.BP-63)具有SEQ ID NO：2的核苷酸序列；或长尾噬菌体BP-12(Chilikevirus sp.BP-12)具有SEQ ID NO：3的核苷酸序列。
3.根据权利要求1或2所述的噬菌体，其特征在于，所述肌尾噬菌体BP-66(Myoviridae sp.BP-66)、肌尾噬菌体BP-63(Myoviridae sp.BP-63)或长尾噬菌体BP-12(Chilikevirus sp.BP-12)不含毒力基因或不良基因。
4.根据权利要求1或2所述的噬菌体，其特征在于，所述肌尾噬菌体BP-66(Myoviridae sp.BP-66)、肌尾噬菌体BP-63(Myoviridae sp.BP-63)或长尾噬菌体BP-12(Chilikevirus sp.BP-12)不识别非致病性细菌。
5.根据权利要求4所述的噬菌体，其特征在于：所述非致病性细菌包括肌尾噬菌体BP-63(Myoviridae sp.BP-63)不可识别57株非致病性细菌、肌尾噬菌体BP-66(Myoviridae sp.BP-66)不可识别56株非致病性细菌、或长尾噬菌体BP-12(Chilikevirus sp.BP-12)不可识别57株非致病性细菌。
6.根据权利要求1或2所述的噬菌体，其特征在于，所述肌尾噬菌体BP-66(Myoviridae sp.BP-66)、肌尾噬菌体BP-63(Myoviridae sp.BP-63)或长尾噬菌体BP-12(Chilikevirus sp.BP-12)不识别非宿主性致病性细菌。
7.根据权利要求6所述的噬菌体，其特征在于，所述非宿主性致病细菌为184株致病性细菌。
8.权利要求1-7任一所述肌尾噬菌体BP-66(Myoviridae sp.BP-66)、肌尾噬菌体BP-63(Myoviridae sp.BP-63)或长尾噬菌体BP-12(Chilikevirussp.BP-12)在裂解沙门氏菌中的应用。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于：所述的沙门氏菌包括肌尾噬菌体BP-63(Myoviridae sp.BP-63)可裂解35株血清型沙门氏菌、肌尾噬菌体BP-66(Myoviridae sp.BP-66)可裂解的38株血清型沙门氏菌、或长尾噬菌体BP-12(Chilikevirus sp.BP-12)可裂解的22株血清型沙门氏菌。
10.根据权利要求8所述的应用，其特征在于：所述沙门氏菌包括肌尾噬菌体BP-63(Myoviridae sp.BP-63)可裂解的22株不同血清型肠道沙门氏菌、肌尾噬菌体BP-66(Myoviridae sp.BP-66)可裂解的25株不同血清型肠道沙门氏菌、或长尾噬菌体BP-12(Chilikevirus sp.BP-12)可裂解的24株不同血清型肠道沙门氏菌。
11.权利要求1所述肌尾噬菌体BP-66(Myoviridae sp.BP-66)、肌尾噬菌体BP-63(Myoviridae sp.BP-63)或长尾噬菌体BP-12(Chilikevirus sp.BP-12)的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括：
1-1)采集加拿大蒙特利尔污水处理厂水样离心取上清液，然后与LB液体培养基与处于对数期的沙门氏菌均匀混合，于37℃过夜培养，富集噬菌体；
1-2)将样本富集液离心，取上清液除菌得到含有噬菌体的滤液，取滤液与其宿主沙门氏菌菌液均匀混合，静置使其与细菌表面的受体充分结合；
1-3)将上述混合液加入半固体琼脂培养基中，混匀后立即铺于已凝固的固体琼脂平板上进行培养，形成噬菌斑后取噬菌斑，接种于液体培养基中，加入沙门氏菌菌液并混匀过夜培养，3500rpm离心10min取上清后以细菌滤膜过滤，采用双层平板法观察噬菌斑形态；
1-4)重复步骤3)的操作3-5次后，即可得形状和大小一致的噬菌斑，即得肌尾噬菌体BP-66(Myoviridae sp.BP-66)、肌尾噬菌体BP-63(Myoviridae sp.BP-63)或长尾噬菌体BP-12(Chilikevirus sp.BP-12)。
12.权利要求1所述的肌尾噬菌体BP-66(Myoviridae sp.BP-66)、肌尾噬菌体BP-63(Myoviridae sp.BP-63)或长尾噬菌体BP-12(Chilikevirus sp.BP-12)的发酵方法：
2-1)取肌尾噬菌体BP-66(Myoviridae sp.BP-66)、肌尾噬菌体BP-63(Myoviridae sp.BP-63)或长尾噬菌体BP-12(Chilikevirus sp.BP-12)的菌落，接种到LB培养液中振荡得到宿主菌悬液；
2-2)将菌悬液稀释转接到LB培养液，振荡培养至对数前期并测定其菌悬液浓度；
2-3)调节肌尾噬菌体BP-66或长尾噬菌体BP-12的发酵初始pH值为6、肌尾噬菌体BP-63发酵初始pH值为2；
2-4)采用火焰接种法接种，向发LB液体培养基中分别接入噬菌体和对数期宿主菌液并发酵，发酵过程中通入无菌空气，并加入消泡剂；
2-5)发酵结束后，将噬菌体与宿主菌的全部混合液取出并离心，上清液经真空抽气泵抽滤至无菌过滤器装置内，得到噬菌体发酵液并于4℃下保存，即得。
13.根据权利要求11或12所述的方法，其特征在于，所述LB培养液或LB固体培养基的配方为：胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，氯化钠10g，蒸馏水1000ml，pH 7.0。
14.一种噬菌体组合物，其特征在于，所述组合物含有肌尾噬菌体BP-66(Myoviridae sp.BP-66)、肌尾噬菌体BP-63(Myoviridae sp.BP-63)和长尾噬菌体BP-12(Chilikevirus sp.BP-12)中的任意两种或三种的组合物。
15.根据权利要求14所述的组合物，其特征在于，所述噬菌体组合物包括含有肌尾噬菌体BP-66(Myoviridae sp.BP-66)、肌尾噬菌体BP-63(Myoviridae sp.BP-63)和长尾噬菌体BP-12(Chilikevirus sp.BP-12)。
16.根据权利要求15所述的组合物，其特征在于，所述组合物中肌尾噬菌体BP-66(Myoviridae sp.BP-66)、肌尾噬菌体BP-63(Myoviridae sp.BP-63)和长尾噬菌体BP-12(Chilikevirus sp.BP-12)的生物量比为1∶1∶1。
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