CN102198265B - 应用噬菌体裂解酶降解猪链球菌生物被膜的方法 - Google Patents
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Abstract
一种生物技术领域的应用噬菌体裂解酶降解猪链球菌生物被膜的方法，采用表达菌BL21-lys表达分子量为55kDa的裂解酶LySMP，经过Ni柱纯化得到裂解酶，并在体外用该裂解酶降解利用细胞培养板培养得到的猪链球菌生物被膜。本发明在杀灭猪链球菌SS2-4和SS2-H的同时，也可以破坏生物被膜的结构以达到彻底清除生物被膜的作用。
Description
技术领域
本发明涉及的是一种生物技术领域的方法，具体是一种应用噬菌体裂解酶降解猪链球菌生物被膜的方法。
背景技术
猪链球菌病是一种人兽共患传染病，能导致仔猪患脑膜炎、败血症、关节炎、心内膜炎、肺炎和人的脑膜炎。猪链球菌2型流行最广，对猪的致病力也最强，给养猪业造成巨大的经济损失，在公共卫生方面，对相关从业人员的生命安全构成严重威胁。而更为严重的是，当猪链球菌形成生物被膜时，生物被膜会为细菌提供一种保护性生活方式，可能大大提高其致病性。细菌生物被膜是指由细菌自身产生的胞外多糖基质、脂蛋白、纤维蛋白等所包裹的细菌细胞的结构群落，其形如膜状，能够不可逆地附着于病灶的表面或医用器械内。细菌生物被膜的形成增强了细菌对各种因素的抵抗力，是引起许多持续性和慢性细菌感染的根源。生物被膜内的细菌几乎对所有的抗菌药物都表现出极强的耐受性，因此增加了治疗的难度。绝大多数细菌生长在各种物体表面的生物被膜中，某些猪链球菌也可以形成生物被膜。细菌生物被膜的存在对生物医学、食品加工等方面极为不利。在对猪链球菌生物被膜进行清除时，抗生素的清除效果并不明显，一方面是由于生物被膜对抗生素的进入产生了物理性阻碍，另一方面是由于抗菌药物的广泛应用使细菌耐药性增强。而裂解酶是由噬菌体基因组编码，能够水解细菌细胞壁的酶。噬菌体裂解酶像噬菌体一样仅攻击细菌，而不影响动物细胞，并具有较高的特异性，因此该酶不影响无害或有益的动物寄生菌。一般认为，裂解酶作用于细菌的速度极快，以致于细菌不会对该酶产生抗性。所以，裂解酶作为降解生物被膜的新型治疗方法具有一定的优势。本发明通过原核表达猪链球菌烈性噬菌体SMP的裂解基因，获得了纯化的有活性的裂解酶，在体外可对两株临床分离的猪链球菌所形成的生物被膜具有高效降解作用。
经过对现有技术的检索发现，Daniel Grenier，Louis Grignon，Marcelo Gottschalk在《TheVeterinary Journal》2009年第179卷第292-295页发表了“Characterisation of biofilm formationby a Streptococcus suis meningitis isolate”，文中提及，分离自患脑膜炎病猪的猪链球菌II型菌株95-8242可以形成结构致密的生物被膜，生物被膜中的猪链球菌95-8242对青霉素G和氨苄青霉素的耐药性远强于游离菌，常规药物难以降解猪链球菌生物被膜。王丽平、陆承平、唐家琪在《微生物学报》2004年第44卷第6期第794～799页发表了“32种抗菌药物对临床分离猪源链球菌的体外抗菌活性”，文中提及，一些猪场分离的猪链球菌对32种抗菌药物的耐药性的研究结果显示，临床分离菌株以耐药菌为主，且大都呈多重耐药，尤其对磺胺类药物、林可胺类、四环素类、大环内酯类、氨基甙类药物的耐药性最为严重，耐药不仅普遍，且多为高度耐药。综上所述，寻找治疗猪链球菌生物被膜的新方法显得尤为重要。
发明内容
本发明针对现有技术存在的上述不足，提供一种应用噬菌体裂解酶降解猪链球菌生物被膜的方法，本发明在杀灭猪链球菌SS2-4和SS2-H的同时，也可以破坏生物被膜的结构以达到彻底清除生物被膜的作用。
本发明是通过以下技术方案实现的，本发明采用表达菌BL21-lys表达分子量为55kDa的裂解酶LySMP，经过Ni柱纯化得到裂解酶，并在体外将该裂解酶降解利用细胞培养板培养得到的猪链球菌生物被膜。
所述的采用表达菌BL21-lys表达分子量为55kDa的裂解酶LySMP是指：选择过夜培养的含质粒pET-28a-lys的大肠杆菌BL21的阳性克隆体10mL接种于1L含有50μg/mLKan的LB培养基中，37℃210转/分振荡培养2-3h至OD6000.6～1.0，然后加入100mmol/L的IPTG 10mL至终浓度为1mmol/L，27℃170转/分振荡培养4h。
所述的纯化是指：
首先经IPTG诱导的表达菌1L用10mM PBS缓冲液洗涤一次后4700转/分离心30分钟，将沉淀溶于25mL预冷的裂解缓冲液，超声破碎。超声功率为400W，工作3s，间隔13s，40个循环。超声后，细菌悬浮物10000g离心，取上清。以8个柱体积的裂解缓冲液洗Ni2+柱(购自GE)；
用预冷的50mM磷酸钠缓冲液与5mM咪唑的混合液洗柱，然后用预冷的50mM磷酸钠缓冲液和20mM咪唑的混合液洗柱，最后用50mM磷酸钠缓冲液和250mM咪唑的混合溶液洗柱，收集的洗脱液，即为纯化的裂解酶。
所述的离心均在4℃环境下进行操作。
所述的裂解缓冲液为磷酸钠缓冲液，其浓度为50mM且pH值为8.0。
所述的裂解酶的蛋白浓度通过BCA蛋白浓度测定试剂盒(购自上海前尘生物)测定。
所述的生物被膜通过以下方式培养得到：
1)将培养好的猪链球菌20μL接种至每孔含有2mL THB培养基的24孔细胞培养板(购自CELLSTAR公司)中，盖上盖子置37℃恒温箱中培养3天。
所述的THB培养基中，每1L内加入酵母浸出物3g、胰蛋白胨20g、牛肉浸膏5g、葡萄糖2g、NaCl 10g、Na2CO3 2.5g、磷酸氢二钠1.0008g以及20mL小牛血清，并将该培养基的pH值调节至7.5。
2)3天后取出细胞培养板，用移液枪弃去游离培养基并用灭菌的PBS缓冲液洗涤两次以去除游离菌，即得到成熟的生物被膜。
所述的PBS缓冲液为pH7.2。
所述的降解通过以下方式测定：
1)测定裂解酶对生物被膜的裂解谱。将纯化的LySMP用elution buffer(250mM咪唑)稀释成200IU/mL，向含有生物被膜的培养板中每孔加入0.5mL蛋白稀释液，即100IU/孔。将培养板置于37℃培养箱中培养6h。培养完毕，取出培养板并弃去蛋白稀释液，用灭菌的PBS缓冲液(pH7.2)轻轻洗涤两次以去除游离菌。将仍然附着在细胞培养板上的被膜菌用500μL甲醇固定30分钟。弃去固定液待自然风干后，室温下用500μL 0.1％的结晶紫(购自国药集团)对生物被膜染色30分钟。染色完毕，弃去染色液，用自来水清洗两次以去除游离的染色液。将细胞培养板放置于70℃烘箱中烘干，取出后每孔加入500μL浓度为33％的乙酸溶液，置于摇床30分钟以释放生物被膜中的结晶紫。每孔取200μL释放液加入96孔酶标板中，测定其在600nm波长处的吸光度。据OD600值的大小确定生物被膜残留量，从而进一步确定LySMP的裂解谱。
2)测定裂解酶裂解生物被膜的量效关系。用elution buffer将纯化的LySMP稀释成50IU/mL、100IU/mL、200IU/mL、400IU/mL、800IU/mL。将不同浓度的LySMP各0.5mL加入到生物被膜上，即每孔分别加入25IU、50IU、100IU、200IU、400IU。37℃培养箱中用LySMP作用生物被膜6h后，用结晶紫染色法半定量测定生物被膜残留量。
3)测定裂解酶作用SS2-4生物被膜后的残留活菌数以评估裂解酶降解生物被膜的效果。根据MTT比色试验方法制作MTT比色试验标准曲线。经裂解酶LySMP作用1、2、4、6、8、12、18、24h的猪链球菌生物被膜用无菌PBS缓冲液(pH7.2)轻轻洗涤两次以去除游离菌。每孔1mL无菌PBS缓冲液重悬残留生物被膜。用移液器吸取细菌重悬液100μL，分别加入到96孔酶标板中，每个样液做3个复孔，同时用PBS缓冲液设阴性对照。然后向各孔分别加入20μL的MTT应用液(20mL PBS缓冲液中含100mg MTT，MTT购自sigma公司)，于37℃恒温培养箱放置2h后取出，向各孔分别加入100μL的DMSO(购自sigma公司)，用全自动酶标仪于570nm处测定OD值，测量前振动60s。根据MTT比色试验标准曲线计算残留活菌数。
所述的猪链球菌噬菌体SMP为本实验室分离、鉴定(Ma，Y.L.，Lu，C.P.，Isolationand identification of a bacteriophage capable of infecting Streptococcus suis type 2 strains.Veterinary Microbiology，2008，132：340-347，全基因组序列已提交GenBank，登录号EF116926。)，拥有自主知识产权。
所述的含质粒pET-28a-lys的大肠杆菌BL21(Wang.Y，Sun.J.H.，Lu.C.P.，PurifiedRecombinant Phage Lysin LySMP：An Extensive Spectrum of Lytic Activity for SwineStreptococci. Current of Microbiology.2009，58：609-615.)由本实验室建立。
所述的菌株S.suis SS2-4、S.suis SS2-H、S.suis SS2-9、S.suis zy05719和S.suis SS2-1(Wang.Y，Sun.J.H.，Lu.C.P.，Purified Recombinant Phage Lysin LySMP：An Extensive Spectrum ofLytic Activity for Swine Streptococcl. Current of Microbiology.2009，58：609-615)为本实验室分离、鉴定、保存菌株，马兽医链球菌亚种ATCC35246(范红结，陆承平，唐家琪.马链球菌兽疫亚种类M基因和猪链球菌2型mrp基因片段的融合表达及仔猪免疫试验，南京农业大学学报，2003，26(4)：78-81)为本实验室分离、鉴定或保存菌株。
与现有技术相比，本发明具有如下的有益效果：本发明通过原核表达猪链球菌烈性噬菌体SMP的裂解基因，获得纯化的有活性的裂解酶，可在体外对两株猪链球菌形成的生物被膜具有高效裂解作用。
通过将本发明分别比较抗生素、噬菌体与裂解酶对生物被膜的裂解作用发现：虽然很高浓度的氨苄青霉素钠和阿莫西林可以灭活5株猪链球菌的生物被膜菌，但几乎不能破坏生物被膜的结构；噬菌体SMP也不能破坏生物被膜结构，并且仅对2株猪链球菌的生物被膜菌有杀灭作用；但裂解酶在杀灭猪链球菌SS2-4和SS2-H的同时，也可以破坏生物被膜的结构以达到彻底清除生物被膜的作用。
附图说明
图1噬菌体裂解酶LySMP SDS-PAGE电泳图
图2为实施例中裂解酶裂解SS2-4生物被膜的量效关系示意图。
图3为实施例中裂解后残留活菌数示意图。
具体实施方式
下面对本发明的实施例作详细说明，本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。
实施例1
裂解酶对生物被膜的裂解谱：
步骤一，生物被膜的培养
将37℃摇床过夜的猪链球菌20μL接种至每孔含有2mL THB培养基(1L培养基中加入酵母浸出物3g、胰蛋白胨20g、牛肉浸膏5g、葡萄糖2g、NaCl 10g、Na2CO3 2.5g、磷酸氢二钠1.0008g、20mL小牛血清，调pH值至7.5)的24孔细胞培养板(购自CELLSTAR公司)中，盖置37℃恒温箱中培养3天。以只含THB培养基的孔作为对照孔。3天后取出细胞培养板，用移液器弃去游离培养基并用灭菌的PBS缓冲液(pH7.2)轻轻洗涤两次以去除游离菌，即得到成熟的生物被膜。
步骤二，噬菌体裂解酶LySMP的表达纯化
所述的原核表达采用的质粒是pET-28a(+)，表达的裂解酶分子约55kDa。
(1)选择过夜培养的阳性克隆(含质粒pET-28a-lys的大肠杆菌BL21)10mL接种于1L含有50μg/mLKan的LB培养基中，37℃210转/分振荡培养2-3h至OD6000.6～1.0。加入100mmol/L的IPTG(购自sigma公司)10mL至终浓度为1mmol/L，27℃170转/分振荡培养4h。
(2)LySMP蛋白的纯化。经IPTG诱导的表达菌1L用10mM PBS缓冲液(pH7.2)洗涤一次后4700转/分离心(4℃)30分钟，将沉淀溶于25mL预冷的裂解缓冲液(50mM磷酸钠缓冲液，pH8.0)，超声破碎。超声功率为400W，工作3s，间隔13s，40个循环。超声后，细菌悬浮物10000g离心，取上清。以8个柱体积的裂解缓冲液洗Ni2+柱(购自GE)。用预冷的洗涤缓冲液A(50mM磷酸钠缓冲液+5mM咪唑)洗柱。然后用预冷的洗涤缓冲液B(50mM磷酸钠缓冲液+20mM咪唑)洗柱。最后用溶出液elution buffer(50mM磷酸钠缓冲液+250mM咪唑)洗柱，收集的洗脱液，即为纯化的裂解酶。以BCA蛋白浓度测定试剂盒(购自上海前尘生物)测定蛋白浓度。
(2)SDS-PAGE电泳分析。配制12％的分离胶和5％的浓缩胶，纯化样品用上样缓冲液沸水煮4min，浓缩胶电压80V，分离胶电压136V，电泳4～5h，考马斯亮兰染色2h。脱色观察，在55kDa处有明显的条带出现。纯化蛋白电泳图见附图1。
SDS-PAGE胶配方如下：
步骤三，利用纯化的LySMP处理生物被膜
(1)将纯化的LySMP用elution buffer(250mM咪唑)稀释成200IU/mL，向含有生物被膜的培养板中每孔加入0.5mL蛋白稀释液，即100IU/孔。将培养板置于37℃培养箱中培养6h。
(2)结晶紫染色半定量测定生物被膜残留量。培养完毕，取出培养板并弃去蛋白稀释液，用灭菌的PBS缓冲液(pH7.2)轻轻洗涤两次以去除游离菌。将仍然附着在细胞培养板上的被膜菌用500μL甲醇固定30分钟。弃去固定液待自然风干后，室温下用500μL0.1％的结晶紫(购自国药集团)对生物被膜染色30分钟。染色完毕，弃去染色液，用自来水清洗两次以去除游离的染色液。将细胞培养板放置于70℃烘箱中烘干，取出后每孔加入500μL浓度为33％的乙酸溶液，置于摇床30分钟以释放生物被膜中的结晶紫。每孔取200μL释放液加入96孔酶标板中，测定其在600nm波长处的吸光度。据OD600值的大小确定生物被膜残留量，从而进一步确定LySMP的裂解谱。结果显示，裂解酶对猪链球菌SS2-4、SS2-H生物被膜有高效降解作用。见附表1。
表1裂解酶对各菌株生物被膜的降解作用结果
表中所列菌株来源可参阅以下文献：
1.Wang.Y，Sun.J.H.，Lu.C.P.，Purified Recombinant Phage Lysin LySMP：AnExtensive Spectrum of Lytic Activity for Swine Streptococci. Current of Microbiology.2009，58：609-615.
2.祝昊丹，顾宏伟，陆承平.体内表达新基因trag在猪链球菌的分布及其免疫反应性分析，微生物学报，2008，48(12)：1642-1648
3.范红结，陆承平，唐家琪.马链球菌兽疫亚种类M基因和猪链球菌2型mrp基因片段的融合表达及仔猪免疫试验，南京农业大学学报，2003，26(4)：78-81。
实施例2
裂解酶裂解生物被膜的量效关系：
步骤一，用elution buffer将纯化的LySMP稀释成50IU/mL、100IU/mL、200IU/mL、400IU/mL、800IU/mL。将不同浓度的LySMP各0.5mL加入到生物被膜上，即每孔分别加入25IU、50IU、100IU、200IU、400IU。
步骤二，37℃培养箱中用LySMP作用生物被膜6h后，用结晶紫染色法(同实施例1)半定量测定生物被膜残留量。
如图2所示，25IU的裂解酶对生物被膜几乎没有裂解作用。大于50IU时，裂解酶的裂解作用较强。
实施例3
裂解酶作用SS2-4生物被膜后的残留活菌数：
步骤一，根据MTT比色试验方法制作MTT比色试验标准曲线
步骤二，裂解酶LySMP作用1、2、4、6、8、12、18、24h的猪链球菌生物被膜用无菌PBS缓冲液(pH7.2)轻轻洗涤两次以去除游离菌。每孔1mL无菌PBS缓冲液重悬残留生物被膜。
步骤三，用移液器吸取细菌重悬液100μL，分别加入到96孔酶标板中，每个样液做3个复孔，同时用PBS缓冲液设阴性对照。然后向各孔分别加入20μL的MTT应用液(20mL PBS缓冲液中含100mg MTT，MTT购自sigma公司)，于37℃恒温培养箱放置2h后取出，向各孔分别加入100μL的DMSO(购自sigma公司)，用全自动酶标仪于570nm处测定OD值，测量前振动60s。
步骤四，根据MTT比色试验标准曲线计算残留活菌数。
如图3所示，裂解酶使SS2-4生物被膜活菌数大量减少，并在作用4h后减少幅度达到最大。
Claims (7)
1.一种应用噬菌体裂解酶降解猪链球菌生物被膜的方法，其特征在于，采用表达菌BL21-lys表达分子量为55kDa的裂解酶LySMP，经过Ni柱纯化得到裂解酶，并在体外用该裂解酶降解利用细胞培养板培养得到的猪链球菌生物被膜，
所述裂解酶对猪链球菌SS2-4、SS2-H生物被膜有高效降解作用，在杀灭猪链球菌SS2-4、SS2-H的同时，也可以破坏生物被膜的结构以达到彻底清除生物被膜的作用。
2.根据权利要求1所述的应用噬菌体裂解酶降解猪链球菌生物被膜的方法，其特征是，所述的采用表达菌BL21-lys表达分子量为55kDa的裂解酶LySMP是指：选择过夜培养的含质粒pET-28a-lys的大肠杆菌BL21的阳性克隆体10mL接种于1L含有50μg/mLKan的LB培养基中，37℃210转/分振荡培养2-3h至OD6000.6～1.0，然后加入100mmol/L的IPTG10mL至终浓度为1mmol/L，27℃170转/分振荡培养4h。
3.根据权利要求1所述的应用噬菌体裂解酶降解猪链球菌生物被膜的方法，其特征是，所述的纯化是指：首先经IPTG诱导的表达菌1L用10mM PBS缓冲液洗涤一次后4700转/分离心30分钟，将沉淀溶于25mL预冷的裂解缓冲液，超声破碎，超声功率为400W，工作3s，间隔13s，40个循环，超声后，细菌悬浮物10000g离心，取上清，以8个柱体积的裂解缓冲液洗Ni2+柱；然后用预冷的50mM磷酸钠缓冲液与5mM咪唑的混合液洗柱，然后用预冷的50mM磷酸钠缓冲液和20mM咪唑的混合液洗柱，最后用50mM磷酸钠缓冲液和250mM咪唑的混合溶出液洗柱，收集的洗脱液，即为纯化的裂解酶。
4.根据权利要求3所述的应用噬菌体裂解酶降解猪链球菌生物被膜的方法，其特征是，所述的离心均在4℃环境下进行操作。
5.根据权利要求3所述的应用噬菌体裂解酶降解猪链球菌生物被膜的方法，其特征是，所述的裂解缓冲液为磷酸钠缓冲液，其浓度为50mM且pH值为8.0。
6.根据权利要求1所述的应用噬菌体裂解酶降解猪链球菌生物被膜的方法，其特征是，所述的生物被膜通过以下方式培养得到：
1)将培养好的猪链球菌20μL接种至每孔含有2mL THB培养基的24孔细胞培养板中，盖上盖子置37℃恒温箱中培养3天；
2)3天后取出细胞培养板，用移液枪弃去游离培养基并用灭菌的PBS缓冲液洗涤两次以去除游离菌，即得到成熟的生物被膜。
7.根据权利要求6所述的应用噬菌体裂解酶降解猪链球菌生物被膜的方法，其特征是，所述的THB培养基中，每1L内加入酵母浸出物3g、胰蛋白胨20g、牛肉浸膏5g、葡萄糖2g、NaCl 10g、Na2CO32.5g、磷酸氢二钠1.0008g以及20mL小牛血清，并将该培养基的pH值调节至7.5。
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