CN114395537A - 一种用于清理水产养殖现场底泥的噬菌体制剂及方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种用于清理水产养殖现场底泥的噬菌体制剂及方法。一种用于清理水产养殖现场底泥的噬菌体制剂，包含至少一种噬菌体。本发明清理水产养殖现场底泥的方法，包括：制备噬菌体制剂；以109pfu/mL的效价，将噬菌体制剂倒入养殖水池中。本发明提供的用于清理水产养殖现场底泥的噬菌体制剂及方法，加入该噬菌体制剂的水族箱中底泥产生量明显减少；噬菌体制剂能够特异性杀灭水产养殖常见病原菌，经噬菌体制剂作用后的底泥更容易清理；处理效果持久且明显，且对使用剂量不具有依赖性，不会破坏水体环境。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种用于清理水产养殖现场底泥的噬菌 体制剂及方法。
背景技术
近年来，水产养殖业由最初的粗放化养殖在快速的向高密度集约化转变，大 家对水产养殖环境的重视度日益提高，而水体环境的好坏与养殖池内的底泥息息 相关。底泥的来源整体上分为两个方向，一是外源沉降；二是内源生成。外源沉 降包括残饵、肥料、药物、生物体排泄物、外源水自带物等；内源生成主要是指 浮游动植物及藻类尸体等。因此，底泥可直接影响水产养殖的水质。底泥的危害 主要有4个方面：一是形成了低氧环境，塘底生物氧化分解消耗大量氧气，形成 “氧债”；二是促进了底部酸化，因为厌氧微生物的发酵，促进了底部酸化的现 状，这使得Ca、Mg、Fe、Mn等微量元素以不溶性盐的形式沉积于底泥难以释放， 同时底泥中锁住了一部分氮、磷、钾(0～5cm淤泥处含量很高)，导致水体营养 失衡，有益藻生长受抑制，蓝藻、甲藻等有害藻极易成为优势种；三是有害指标 升高，底部恶劣环境形成以后，会向水体逐渐释放一些有毒有害物质，这包括氨 氮、亚硝态氮、硫化氢、甲烷等，这些有毒有害物质会对养殖池内整个生态系统 形成危害，并且在浓度高的时候对养殖动物会产生毒害作用，不利于健康环境的 构建；四是滋生有害细菌，这对水产养殖动物是非常不利的。
目前底泥的常规处理方法主要有：过氧化物处理法；益生菌处理法；其他化 学试剂处理法等。过氧化物的方法虽然可以杀菌补充水体氧含量，但是杀菌不具 有针对性，容易杀死水体中的益生菌，且不能够有效减少养殖池中的底泥含量， 往往只是治标不治本，而化学试剂处理的方法极易带入重金属，对环境造成严重 破坏，且有些金属离子容易促进生物膜的生成，使有害病原菌不能清除。
发明内容
本发明的目的是提供一种用于生物处理水产养殖现场底泥的制剂及方法，本 发明采用噬菌体制剂来处理水产养殖的底泥，噬菌体在清除病原菌的同时可自我 增殖，存留时间长，并且能够对底泥进行物理分解，便于底泥的清除。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案是：一种用于清理水产养殖现场底 泥的噬菌体制剂，包含至少一种噬菌体。
进一步地，所述噬菌体为弧菌噬菌体、变形杆菌噬菌体中的任一种或者两种 的等比例复配。
进一步地，所述的弧菌噬菌体为溶藻弧菌噬菌体、副溶血弧菌噬菌体、哈维 弧菌噬菌体中的任一种或者几种的等比例复配。
进一步地，所述噬菌体制剂的效价为109pfu/mL。
本发明还提供一种清理水产养殖现场底泥的方法，包括：
制备噬菌体制剂；以109pfu/mL的效价，将噬菌体制剂倒入养殖水池中。
本发明提供的用于清理水产养殖现场底泥的噬菌体制剂及方法，加入该噬菌 体制剂的水族箱中底泥产生量明显减少；噬菌体制剂能够特异性杀灭水产养殖常 见病原菌，经噬菌体制剂作用后的底泥更容易清理；处理效果持久且明显，且对 使用剂量不具有依赖性，不会破坏水体环境。
具体实施方式
为了便于理解本发明，下面结合具体实施例，对本发明进行更详细的说明。 本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本说明书所描述的实施例。相反 地，提供这些实施例的目的是使对本发明公开内容的理解更加透彻全面。
实施例1噬菌体对水产养殖现场底泥的清理作用研究
(1)噬菌体制剂的制备
选取6种噬菌体进行噬菌体增殖，制备出效价在1010pfu/mL的液体噬菌体， 然后将噬菌体进行稀释，使最终效价保持在109pfu/mL。
表1 6种噬菌体
(2)生物被膜的清除作用
采用96孔板法制备成熟的生物被膜，用PBS清洗3次除去浮游的细菌，然 后分别加入200微升制备好的噬菌体，静止6小时后，通过结晶紫法测定生物被 膜的清除率，
结果如表2所示。
表2 6种噬菌体制剂对生物被膜的清除率
| 噬菌体 | 清除率 |
| RDP-VP-19001 | 43％ |
| RDP-VP-19010 | 30％ |
| RDP-VP-19012 | 34％ |
| RDP-VP-21007 | 41％ |
| RDP-SA-20018 | 39％ |
| RDP-EC-20123 | 0％ |
(3)将不同种类的噬菌体进行组合复配，测试其对生物被膜的清除作用
采用96孔板法制备成熟的生物被膜，用PBS清洗3次除去浮游的细菌，然 后，将排名前三的噬菌体按照表3的分组等比例进行复配，然后将复配好的噬菌 体分别加入200微升制备好的噬菌体混合液，静止6小时后，通过结晶紫法测定 生物被膜的清除率，结果如表4所示。
表3不同噬菌体组合复配分组
表4不同噬菌体组合复配对生物被膜的清除率
从表4可以看出，两种以上的噬菌体复配后，与单独一种噬菌体相比，其对 生物被膜的清除均有提高；其中，RDP-VP-19001、RDP-VP-21007、RDP-SA-20018 这3种噬菌体对生物被膜的多糖基质的酶解作用优于其他分组。
(4)噬菌体制剂对底泥的清除作用
分别将上述3种噬菌体的复配液和不能清除生物膜的噬菌体RDP-EC-20123 按照每升水体添加0.01ml、最终109pfu/mL的效价倒入养着虾的水族箱中，观察 水族箱中底泥的形成情况，并取50毫升水溶液离心去上清液后，称重，与不加 噬菌体的水族箱相比较。加入复配噬菌体的水族箱中底泥产生量明显减少。由此 可说明噬菌体通过酶解生物被膜的多糖基质进而对底泥的清理有一定的作用。并 且通过点板法，可观察出噬菌斑周围有晕圈，该噬菌体制剂确实可产生裂解酶。
实施例2体外杀菌实验(噬斑法)
将病原菌加入融化的半固琼脂中，铺双层平板，待半固琼脂凝固后，在平板 上滴加50微升噬菌体制剂(实施例1中分组4)，置37摄氏度培养箱中培养过 夜，培养过后的双层平板有明显的噬菌斑，证明该噬菌体制剂可杀灭病原菌。
实施例3水族箱模拟实验
准备8个水族箱，每个水族箱养相同数量的南美白对虾，然后8个水族箱分 为4组，每组做2个平行，一组为空白对照组，一组为噬菌体制剂组(实施例1 中分组4)，一组为过硫酸氢钾，一组为无裂解酶噬菌体组。按照每升水体添加 0.01ml、最终109pfu/mL的效价添加噬菌体，过硫酸氢钾组每升水体添加0.04g。 6小时后各取50毫升水样，将水样用滤纸去除水分，然后60摄氏度下烘干，称 量滤纸的质量，具体实验结果见表5。
表5噬菌体制剂对水族养殖箱底泥的清除实验结果
实施例4南美白对虾养殖现场实验(山东潍坊寒亭)
首先，在加入噬菌体制剂前先取50毫升养殖池中的水样，然后按照10万升 海水加入1升噬菌体制剂的比例加入噬菌体制剂(实施例1中分组4)，另一个 养殖池中加入过硫酸氢钾，按照1g加入10升水的比例添加，6小时后在同一地 方取样，每组取30毫升样品，用滤纸过滤后，置60摄氏度的条件下烘干，称量 滤纸的质量，具体实验结果见表6。
表6本发明噬菌体制剂对虾养殖现场底泥的清除实验结果
| 空白对照组 | 噬菌体组 | 过硫酸氢钾组 | |
| 过滤前/g | 2.12 | 2.02 | 2.09 |
| 过滤后/g | 2.35 | 2.17 | 2.33 |
| 底泥/g | 0.23 | 0.15 | 0.24 |
实施例5海参苗养殖现场(山东青岛即墨)
首先，在加入噬菌体前先取50毫升养殖池中的水样，然后按照10万升海水 加入1升噬菌体制剂的比例加入噬菌体制剂(实施例1中分组4)，另一个养殖 池中加入过硫酸氢钾，按照1g加入10升水的比例添加，6小时后在同一地方取 样，每组取30毫升样品，用滤纸过滤后，置60摄氏度的条件下烘干，称量滤纸 的质量，具体实验结果见表7。
表7本发明噬菌体制剂对海参苗养殖现场底泥的清除实验结果
| 空白对照组 | 噬菌体组 | 过硫酸氢钾组 | |
| 过滤前/g | 2.10 | 2.08 | 2.05 |
| 过滤后/g | 2.35 | 2.26 | 2.31 |
| 底泥/g | 0.25 | 0.18 | 0.26 |
Claims (5)
1.一种用于清理水产养殖现场底泥的噬菌体制剂，其特征在于：包含至少一种噬菌体。
2.根据权利要求1所述的用于清理水产养殖现场底泥的噬菌体制剂，其特征在于：所述噬菌体为弧菌噬菌体、变形杆菌噬菌体中的任一种或者两种的等比例复配。
3.根据权利要求2所述的用于清理水产养殖现场底泥的噬菌体制剂，其特征在于：所述的弧菌噬菌体为溶藻弧菌噬菌体、副溶血弧菌噬菌体、哈维弧菌噬菌体中的任一种或者几种的等比例复配。
4.根据权利要求3所述的用于清理水产养殖现场底泥的噬菌体制剂，其特征在于：所述噬菌体制剂的效价为109pfu/mL。
5.一种清理水产养殖现场底泥的方法，其特征在于：
制备如权利要求1-4任一项所述的噬菌体制剂；
以109pfu/mL的效价，将噬菌体制剂倒入养殖水池中。
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| CN (1) | CN114395537A (zh) |
Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102198265A (zh) * | 2011-03-22 | 2011-09-28 | 上海交通大学 | 应用噬菌体裂解酶降解猪链球菌生物被膜的方法 |
| CN104073469A (zh) * | 2014-05-20 | 2014-10-01 | 天津科技大学 | 裂解水产致病菌噬菌体的分离与筛选方法 |
| CN106282127A (zh) * | 2015-06-09 | 2017-01-04 | 菲吉乐科(南京)生物科技有限公司 | 新的噬菌体、其组合物以及它们的制备方法和应用 |
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-
2022
- 2022-01-17 CN CN202210051853.2A patent/CN114395537A/zh active Pending
Patent Citations (5)
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Non-Patent Citations (1)
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