CN117050954B - 一种宽谱沙门氏菌噬菌体vB-SenS-S1及包含该噬菌体的组合物 - Google Patents
一种宽谱沙门氏菌噬菌体vB-SenS-S1及包含该噬菌体的组合物 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提出了一种宽谱沙门氏菌噬菌体vB‑SenS‑S1，于2023年7月12日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCCM20231271。本发明还提供了包含该噬菌体vB‑SenS‑S1的组合物，包括噬菌体vB‑SenS‑S1和黏菌素，具有最佳杀菌效果时的黏菌素浓度为1/2MIC。综上，本发明的噬菌体vB‑SenS‑S1与黏菌素联合应用方案，能够降低黏菌素的MIC，提高沙门氏菌对黏菌素的敏感性，减少黏菌素的使用量，还提供噬菌体vB‑SenS‑S1在生肉消毒方面的应用方案，防控食品中耐药沙门氏菌的传播。
Description
技术领域
本发明涉及沙门氏菌噬菌体技术领域，尤其涉及一种宽谱沙门氏菌噬菌体vB-SenS-S1及包含该噬菌体的组合物。
背景技术
沙门氏菌属于革兰氏阴性肠杆菌，生长环境为需氧或兼性厌氧。由于沙门氏菌对营养要求不高，所以可在环境中广泛存在且存活时间较长。此外，在动物和人的肠道中也常见沙门氏菌存在。沙门氏菌是一种重要的人畜共患病原菌，也是常见的食源性致病菌之一。沙门氏菌可通过食物链传播，一般会在食品加工的过程中发生沙门氏菌的污染，也会粘附在一些物品表面进行传播。沙门氏菌在兽医临床上常导致鸡白痢、禽伤寒、禽副伤寒和猪副伤寒等严重影响生产经济价值的疾病。沙门氏菌在人临床上常导致呕吐、腹痛、腹泻和发烧等轻微症状，而严重的临床症状则是败血症。败血症非常少见，一般由其他基础性疾病引发，另外还有局部化脓性感染，可在身体的任何局部部位形成脓肿。沙门氏菌的感染途径较多，其中在屠宰过程中沙门氏菌有沿屠宰链从上游环节到成品鸡肉传播的趋势，并且在屠宰过程中存在环境和人员操作交叉污染的情况。养殖过程中被沙门氏菌感染的肉鸡活体是最初的污染源，而屠宰加工过程中肉鸡胴体的交叉污染是导致污染扩大的原因。食物在运输及加工过程中被沙门氏菌污染则有可能导致人的沙门氏菌病，在国内外，因沙门氏菌导致的人患病率和死亡率一直居高不下。由此可见，沙门氏菌不仅影响养殖业的发展，而且也会对人体健康构成相应威胁，所以对沙门氏菌进行防控显得尤为重要。
噬菌体是一种以细菌作为宿主的病毒，具有严格的宿主特异性，可以杀灭宿主细胞且不产生耐药性，其具有指数增殖、分布广泛、结构简单等优点。噬菌体不仅具有良好的杀菌作用，同时具有优良的生物安全性，对动物和人体无副作用或者仅产生非常轻微的副作用。噬菌体在食源性病原菌感染防治、控制病原菌的传播以及治疗耐药细菌感染等方面都取得了巨大的进展。在已经出现严重的多重耐药情况下，沙门氏菌作为一种重要的人畜共患和食源性致病菌，急需采用更高效的方法来防控沙门氏菌的感染。因此探究噬菌体与抗菌药联合应用或单独使用噬菌体杀灭病原菌对减抗替抗是有重要意义的。
多黏菌素类属于70多年以前发现的一类肽，有两种临床上可得到的多黏菌素，即多黏菌素B和黏菌素(多黏菌素E)。多黏菌素类被用于治疗革兰氏阴性菌感染，且被用作所有其它可利用的抗生素都无效的患者中的一类最后防线抗生素，因此，多黏菌素在实际使用过程中，非常广泛；但是，多黏菌素类抗生素具有非常严重的副作用，例如肾毒性，因此，需要开发提供与临床可用多黏菌素相似或更好功效的组合物，以降低多黏菌素类的肾毒性副作用。
公开号为CN104845940B的专利中公开了一种沙门氏菌噬菌体组合物及其制备方法，公开号为CN108359644B的专利中公开了一种宽谱沙门氏菌噬菌体及其应用，公开号为CN115612675A的专利中公开了一种沙门氏菌噬菌体nct1及其应用，但是上述专利技术中均没有公开噬菌体在生肉消毒中的应用及效果。
公开号为CN114940977A的专利中公开了一种鸭沙门氏菌噬菌体、其噬菌体组合物及其在防治鸭沙门氏菌感染的疾病中的应用，但是该技术中的噬菌体药物组合物，只是公开包括其他抑菌或杀菌活性成分，并没有具体公开是哪种抑菌或杀菌活性成分，也没有公开药物组合物中噬菌体与其他抑菌或杀菌活性成分的配比以及应用效果。公开号为CN106497888B的专利中公开了一种沙门氏菌噬菌体和噬菌体抗菌组合物及其应用，但是该技术中只是公开了可以将沙门氏菌噬菌体混合物用于抑制食品中沙门氏菌的污染，或制备用于抑制沙门氏菌的药物，至于如何制备药物、以及药物的效果均没有公开。
论文：噬菌体与抗生素联合应用控制多重耐药鲍曼不动杆菌的研究(中国抗生素杂志2018年10月第43卷第10期)中，公开了将噬菌体与多黏菌素B共同使用的研究，在图4中的结果显示，噬菌体与MIC浓度的多黏菌素B联合应用，没有明显的协同作用，且该研究是基于鲍曼不动杆菌进行的，而不是针对沙门氏菌进行的。
发明内容
有鉴于此，本发明提出了一种宽谱沙门氏菌噬菌体vB-SenS-S1及包含该噬菌体的组合物，找到噬菌体vB-SenS-S1与黏菌素联合应用的最佳配比，降低多黏菌素在实际使用过程中的毒副作用，为噬菌体vB-SenS-S1与黏菌素协同杀菌在临床治疗方面提供指导；同时提供噬菌体vB-SenS-S1在生肉消毒方面的应用方法，在食品消毒保护食品安全方面提供帮助。
本发明的技术方案是这样实现的：
一方面，本发明提供了一种宽谱沙门氏菌噬菌体vB-SenS-S1，噬菌体vB-SenS-S1的拉丁文学名：Salmonellaphage；该噬菌体为噬菌体vB-SenS-S1，已于2023年7月12日保藏于中国典型培养物保藏中心(简称：CCTCC，地址：湖北省武汉市武昌区八一路299号武汉大学)，保藏编号为CCTCCM20231271。
本发明中，噬菌体vB-SenS-S1的最佳感染复数为10-2。
本发明中，噬菌体vB-SenS-S1于4℃与-20℃条件下，在24h时，鸡肉中的沙门氏菌数量为0。
本发明中的噬菌体vB-SenS-S1取自猪场污水，宿主菌为S2044-1。
本发明中的噬菌体vB-SenS-S1对肠炎血清型沙门氏菌和鼠伤寒血清型沙门氏菌的裂解率分别为87.80％和79.25％。
另一方面，本发明还提供一种包含噬菌体vB-SenS-S1的组合物，包括噬菌体vB-SenS-S1和黏菌素。
在以上技术方案的基础上，优选的，包含噬菌体vB-SenS-S1的组合物中，具有最佳杀菌效果时的黏菌素浓度为1/2MIC，即黏菌素浓度为2μg/mL。
本发明中，包含噬菌体vB-SenS-S1的组合物中，黏菌素浓度为1/2MIC，提高沙门氏菌敏感性2倍以上。
本发明中，黏菌素浓度为1/2MIC时，噬菌体vB-SenS-S1的效价为9.23lg PFU/ml。
本发明的宽谱沙门氏菌噬菌体vB-SenS-S1及包含该噬菌体的组合物，相对于现有技术具有以下有益效果：
1、本发明的噬菌体vB-SenS-S1，裂解能力强，潜伏期短，爆发量高，对温度和酸碱耐受性强，无毒力基因及耐药基因，对肠炎血清型沙门氏菌和鼠伤寒血清型沙门氏菌的裂解率分别为87.80％和79.25％。
2、本发明提供一种噬菌体vB-SenS-S1与黏菌素联合应用方案，具有最佳杀菌效果时的黏菌素浓度为1/2MIC，噬菌体vB-SenS-S1与黏菌素联合应用提高了沙门氏菌对黏菌素的敏感性至少2倍以上，可降低治疗黏菌素耐药沙门氏菌感染时黏菌素的使用量。
3、本发明提供一种噬菌体在生肉消毒中的使用方法，在4℃与-20℃条件下噬菌体可在24h有效杀灭鸡肉中的沙门氏菌，在2-12h可明显降低沙门氏菌的数量。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明噬菌体vB-SenS-S1的菌落形态图；
图2为本发明噬菌体vB-SenS-S1的电镜形态学观察图；
图3为本发明噬菌体vB-SenS-S1的感染复数图；
图4为本发明噬菌体vB-SenS-S1的一步生长曲线图；
图5为本发明噬菌体vB-SenS-S1的酸碱耐受曲线图；
图6为本发明噬菌体vB-SenS-S1的热稳定性曲线图；
图7为本发明噬菌体vB-SenS-S1的紫外稳定性曲线图；
图8为本发明噬菌体vB-SenS-S1在4℃条件下的鸡肉消毒实验结果；
图9为本发明噬菌体vB-SenS-S1在-20℃条件下的鸡肉消毒实验结果；
图10为本发明抗菌药对噬菌体vB-SenS-S1效价影响；
图11为本发明噬菌体vB-SenS-S1与MIC黏菌素联合应用效果图；
图12为本发明噬菌体vB-SenS-S1与不同浓度黏菌素联合应用效果图；
图13为本发明噬菌体vB-SenS-S1与不同浓度黏菌素联合应用，噬菌体vB-SenS-S1的效价图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施方式，对本发明实施方式中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施方式仅仅是本发明一部分实施方式，而不是全部的实施方式。基于本发明中的实施方式，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施方式，都属于本发明保护的范围。一方面，针对沙门氏菌噬菌体vB-SenS-S1
实施例1沙门氏菌的分离鉴定
在青岛某大型连锁超市购买足量的生鸡肉样品，分别标记后放入一次性无菌样品袋，放入带有冷藏功能的泡沫盒并尽快运达实验室进行处理。
称取生肉样品25g，放入匀浆机，在匀浆机中加入225mL缓冲蛋白胨水，工作2min，转至离心管，37℃培养18-24h。
抽取120μL预增菌液加入已预加1mL亚硒酸盐胱氨酸增菌液(SC)的2mL离心管中，37℃培养18-24h。使用接种环蘸取菌液于XLT-4琼脂培养基上划线，37℃过夜培养后，观察菌落形态特征进行初步筛选。
选择外形特征为黑色圆形、表面光滑、边缘整齐的单菌落，使用接种环蘸取，在沙门氏菌显色培养基(二代)划线，37℃培养18-24h后观察菌落形态特征。
选择沙门氏菌显色培养基(二代)上，菌落形态特征符合沙门氏菌显色培养基(二代)说明书标准的单菌落，并再次划线接种至沙门氏菌显色培养基(二代)，于37℃培养18-24h后观察菌落形态特征。
通过16sRNA分子鉴定，确定为沙门氏菌。通过PCR技术鉴定沙门氏菌血清型。从超市生鸡肉中分离到一株沙门氏菌，命名为S2044-1，经PCR鉴定为S.Enteriditis血清型，对黏菌素、萘啶酸、多西环素、四环素、链霉素、氨苄西林等六种药物耐药。使用上述沙门氏菌S2044-1作为宿主菌。
实施例2沙门氏菌噬菌体的分离鉴定
(1)噬菌体vB-SenS-S1的筛选
本发明试验所用样品为2022年从山东省某猪场中采集的污水。采集的污水在4℃的条件下10000r/min高速离心10min后，使用0.22μm水系滤膜过滤，滤液放置4℃备用。
每份样品滤液分别取10mL与等体积的2×LB肉汤混合，分别按总体积1％的接种量接种全部新鲜宿主菌，混合均匀后置于培养箱37℃过夜培养。
培养液于4℃，10000rpm/min离心10min，吸取上清液经过0.22μm滤器过滤除菌。取滤液重复以上步骤，反复富集3次，获得噬菌体富集液。
取200μL宿主菌(沙门氏菌S2044-1)接种到10mLLB肉汤中，培养至对数期。取100μL对数期菌液，加入5mLLB半固体(50℃左右)，混匀后迅速倒入标记好的LB琼脂上，等待琼脂凝固后，每个噬菌体富集液各取3μL点滴在加入了宿主菌的琼脂表面；点样后将琼脂板置于37℃恒温培养箱过夜培养，得到形成噬菌斑的平板。
(2)噬菌体纯化
使用接种环扣取单个清晰透亮的噬菌斑置于1mLSM缓冲液中，4℃静置过夜等待噬菌体颗粒从琼脂上脱落。经0.22μm滤器过滤后取100μL滤液进行十倍稀释，分别取各个稀释梯度100μL稀释液与相应的对数期宿主菌液混匀，室温孵育10min使噬菌体完成吸附后，双层平板法培养噬菌斑。
上述双层平板法为：向噬菌体与宿主菌混合液中加入5mLLB半固体，混匀后迅速倒入标记好的LB琼脂上，等待琼脂凝固后37℃过夜培养。反复纯化至少五次以上直至出现形态大小及透明度一致的噬菌斑。
通过上述纯化过程，获得噬菌体vB-SenS-S1(参见图1)。
(3)噬菌体裂解率的测定
测定了噬菌体vB-SenS-S1针对130株沙门氏菌的裂解率。取100μL对数期菌液与5mLLB半固体(50℃左右)混匀后迅速倒入LB琼脂上，等待凝固后收起，标记好滴加噬菌体液的点位。
等待液滴干燥后放入37℃恒温培养箱过夜。次日记录每个细菌琼脂板标记点位的裂解情况(有无透亮噬菌斑)，进行统计分析，噬菌体的裂解率如表1所示。
表1噬菌体对不同血清型沙门氏菌裂解率(％)
(4)噬菌体的电镜形态学观察
在电镜专用的200目铜网上滴加20μL样品，吸附时间为10min，将铜网反盖在20μL2％磷钨酸负染液上，染色时间为5min，在室温的环境下，等待铜网干燥后使用40kv透射电子显微镜对噬菌体的形态进行观察。
在固体培养基上可以形成透亮噬菌斑，形态大小一致，边缘清晰规则。噬菌体具有头部和尾部等基础结构，其中头部为70nm左右的正二十面体，尾部为10nm*120nm结构(参见图2)，按照形态学分类属于尾噬菌体目，长尾噬菌体科。
(5)噬菌体最佳感染复数(MOI)的测定
将各个宿主菌浓度调整为108CFU·mL-1，设置8个感染复数比例分别为10，1，0.1，0.01，0.001，按照感染复数比例调整噬菌体效价为102-109PFU·mL-1。取各稀释梯度噬菌体100μL与相应宿主菌100μL混匀，LB肉汤定容至1mL，置于恒温摇床在37℃，180rpm/min条件下培养4h后测定噬菌体效价，效价最高的感染复数比例为最佳感染复数(MOI)。每组感染复数设置3个平行组，取平均值。
噬菌体vB-SenS-S1在5个感染复数中，感染复数为10-2时有最高的噬菌体效价，所以感染复数为10-2时即为噬菌体vB-SenS-S1的最佳感染复数(参见图3)。
(6)噬菌体一步生长曲线的测定
将噬菌体和培养至对数生长期的菌液，按照最佳MOI混合均匀后，室温孵育5min，吸取200μL后12000r/min离心1min，倒掉上清液，得到沉淀；使用5mLLB肉汤将上述沉淀重悬成为悬液后，在37℃，160r/min条件下震荡培养3h，同时计时，每次取样200μL，在0-1h期间每10min取样一次，1-2h每20min取样一次，2-3h每30min取样一次。所取样品在12000r/min条件下离心1min，取上清液进行10倍倍比稀释后，使用双层平板法测定噬菌体的效价，记录数据并绘制一步生长曲线。
噬菌体vB-SenS-S1的一步生长曲线结果显示，潜伏期在0-20min，爆发期为20-120min，120min以后是稳定期，vB-SenS-S1裂解量为52PFU/cell。噬菌体裂解量的计算公式为噬菌体裂解量(PFU·cell-1)＝裂解爆发期噬菌体效价/感染初期宿主菌浓度。噬菌体的一步生长曲线结果如图4所示。
(7)噬菌体pH稳定性测定
使用盐酸(1mol/L)和氢氧化钠(1mol/L)在SM缓冲液的基础上配制不同pH(pH＝2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13)值的溶液，移液枪移取100μL噬菌体液(已测定PFU)分别加入到不同pH的900μL溶液中，37℃恒温培养箱中培养3h，分别在1h，2h和3h采样一次，做10倍倍比稀释后采用双层平板法，37℃恒温培养箱中培养8h，测定噬菌体效价，试验重复3次，记录数据作出酸碱耐受曲线图。
噬菌体vB-SenS-S1经过2-13共12个pH梯度处理3h后，噬菌体在pH为2时，培养1h后，噬菌体被杀死，而pH为3和4时，对噬菌体有部分杀死效果，但不能完全杀死，可使噬菌体效价降低2.31-2.98lgPFU/mL，在pH为12和13时，随着时间的增加噬菌体被杀死的量逐渐增加，由此噬菌体的效价逐渐降低，最终在3h处理后噬菌体效价降低1.36-4.56lgPFU/mL，在其他pH(5-11)状态下处理1-3h，噬菌体效价的波动变化较小，保持稳定(参见图5)。
(8)噬菌体热稳定性测定
提前测定噬菌体PFU，各取500μL噬菌体增殖液于40℃、50℃、60℃、70℃、80℃水浴1h，在20min、40min、60min各取样100μL做10倍倍比稀释后采用双层平板法，37℃恒温培养箱中培养8h，测定噬菌体效价，试验重复3次，记录数据作出热稳定性曲线图。
噬菌体vB-SenS-S1在80℃处理20min后被杀死，在70℃条件下，随着时间的增加，噬菌体的效价逐渐降低，最终噬菌体效价降低5.52lgPFU/mL。而在40℃、50℃和60℃条件下处理60min并不会对噬菌体效价产生明显影响(参见图6)。
(9)噬菌体紫外稳定性测定
提前测定噬菌体PFU，取4mL噬菌体原液置于60mm培养皿中，开盖置于紫外灯40cm处连续照射60min，每10min取样100μL，做10倍倍比稀释后采用双层平板法，37℃恒温培养箱中培养8h，测定噬菌体效价，试验重复3次，做出紫外稳定性曲线图。
对噬菌体vB-SenS-S1的紫外稳定性进行测定，共检测1h，发现随处理时间的增加，噬菌体效价无明显波动(参见图7)。
(10)噬菌体基因组类型测定
使用噬菌体基因组提取盒(TaKaRa MiniBEST Plasmid Purification KitVer.4.0)提取噬菌体vB-SenS-SEC2的基因组。
取噬菌体基因组10μL以核酸酶DNA seⅠ进行消化处理，包含噬菌体基因组10μL、DEPC水3μL、10×DNA seⅠbuffer 5μL和DNA seⅠ 2μL。37℃水浴30min后加入2.5μL0.5mEDTA并80℃水浴2min，备用。
取噬菌体基因组10μL以核酸酶RNA seA进行消化处理，包含噬菌体基因组10μL和RNA seA(buffer10倍稀释)1μL，37℃水浴1h，备用。
取噬菌体基因组10μL以核酸酶Mang Bean Nuclease进行消化处理，包含噬菌体基因组10μL、buffer 5μL和Mang Bean Nuclease(无菌无酶水10倍稀释)3μL，37℃水浴10min，备用。
以0.8g琼脂糖与100mLTAE缓冲液混匀加热制备电泳胶块，配置SYBR Green Ⅰ(1000×)工作液，包含SYBR Green Ⅰ1μL、1×TAE(或者灭菌水)和6×loading Buffer 1mL。以4μL SYBR Green Ⅰ工作液与10μL核酸酶消化备用的噬菌体基因组充分混匀后静置5min，在1×TAE中上样，对照组与DL10000 Marker同样与SYBR Green Ⅰ工作液混匀静置5min，采用90V电泳40min方式跑胶，通过核酸凝胶成像仪观察电泳结果，确定噬菌体基因组的核酸类型为环状DNA双链。
(11)噬菌体基因组测序
噬菌体送至广东美格基因科技有限公司进行DNA单病毒样品二代测序文库构建，完成噬菌体的全基组测序及拼装。使用软件Soapnuke(v2.0.5)对测序的数据质量进行评估并去除低质量的数据；使用BWA(v0.7.17)软件，将cleanreads比对到沙门氏菌基因组，去除宿主菌的序列；使用组装软件Megahit(v1.1.2)软件对每个噬菌体的高质量reads进行组装获得contigs序列。测序得到的噬菌体基因组用BLASTN(https:// blast.ncbi.nlm.nih.gov)与NCBI中的沙门氏菌噬菌体基因组进行全序列比对。选取并下载相似性最高的噬菌体基因组，使用通过Mauve软件对本研究的噬菌体基因组与同源性最高的噬菌体进行基因组共线性分析，并绘制进化树。研究噬菌体基因组之间的关系，使用BRIG(BLAST Ring Image Generator)软件绘制噬菌体基因组圈图。根据噬菌体全基因组序列，在NCBI数据库下载了30个与本研究中噬菌体相似度＞91.54％，构建噬菌体系统进化发育树。有29个属于沙门氏菌噬菌体，1个是Jerseyvirus，发现噬菌体vB-SenS-S1和vB-SenS-SAL79L1的同源性高。
噬菌体vB-SenS-S1的基因组由43002bp的双链DNA组成，G+C含量为47.04％，编码65个ORF(开放阅读窗)(参见表2)。与结构与装配有关的有62kDa结构蛋白(ORF16)，噬菌体纤维蛋白(ORF19)，衣壳蛋白(ORF24)，噬菌体衣壳与支架(ORF25)，噬菌体推定DNA结合蛋白(ORF34)，噬菌体尾卷尺(ORF40)，噬菌体尾尖(ORF45)。与裂解有关的有噬菌体溶素(ORF5)。与合成与代谢有关的有噬菌体终止酶、大亚基(ORF15)，噬菌体DNA解旋酶(ORF48)，噬菌体相关归巢核酸内切酶(ORF49)，DNA聚合酶(ORF52)，噬菌体复制DNA解旋酶、repA(ORF57)(参见表3)。
根据噬菌体全基因组序列，分别制作基因组圈图，外圈为功能蛋白注释结果(图9)。
表2噬菌体vB-SenS-S1
表3噬菌体vB-SenS-S1开放阅读窗信息
综上可知，噬菌体为长尾噬菌体，环状DNA双链，具有良好的生物学特性，没有耐药或毒力基因，具有噬菌体溶素等蛋白。在固体培养基上可以形成透亮噬菌斑，形态大小一致，边缘清晰规则。
实施例3沙门氏菌噬菌体的消毒试验
选择噬菌体vB-SenS-S1进行噬菌体生肉消毒试验，宿主菌为S2044-1鸡肉源沙门氏菌。
将超市购买的新鲜鸡肉在75％酒精中浸泡30min，使用紫外灯照射取出的鸡肉样品，正反面各30min后确保无菌，使用无菌刀切成特定尺寸(直径1cm，厚度0.5cm)并置于无菌培养皿中，每3个样品置于一个培养皿中。
为了确保鸡肉样品无菌，随机取出一片处理过的鸡肉充分研磨后，用超声波清洗器处理获得匀浆样品，吸取100μL样品使用涂布棒均匀涂布，经过37℃恒温培养箱过夜培养，细菌计数法检测是否无菌，试验重复3次。经37℃恒温培养箱培养后的XLT-4培养皿上无沙门氏菌生长。
复活噬菌体，使用0.22μm水系滤膜过滤后，吸取100μL噬菌体滤液加入LB琼脂固体平板上，使用涂布棒均匀涂布，在37℃恒温培养箱中过夜培养，检验是否有细菌生长，试验平行重复3次。经37℃恒温培养箱培养后的LB琼脂固体平板上无细菌生长。
噬菌体鸡肉消毒试验：
鸡肉样本滴加沙门氏菌菌液(103CFU/mL)100μL，风干30min，滴加噬菌体液(108CFU/mL)100μL，风干30min。
空白对照组使用100μLSM缓冲液作为对照。
在4℃储存2h、6h、1d、2d、3d和-20℃储存2h、6h、1d、2d、3d、5d和7d后分别取出样本，加入装有1mLSM缓冲液的离心管中，充分研磨后，在超声波清洗器中处理5min，采用稀释法和平板涂布计数法测定鸡肉中沙门氏菌的数量，每组处理设置3个平行。
噬菌体鸡肉消毒试验结果：
在4℃与-20℃条件下，噬菌体可在24h时，有效杀灭鸡肉中的沙门氏菌，沙门氏菌的数量为0；在2-12h可明显降低沙门氏菌的数量(图8-9)。
在4℃条件下，2h、6h、12h和24h噬菌体组比空白组分别降低1.29lg CFU/mL、1.02lg CFU/mL、1.94lg CFU/mL和2.66lgCFU/mL。在-20℃条件下，2h、6h、12h和24h噬菌体组比空白组分别降低1.13lg CFU/mL、1.19lg CFU/mL、1.17lg CFU/mL和2.75lg CFU/mL。
本试验数据使用IBM SPSS 26软件进行分析，使用单因素ANOVA方法进行显著性分析。
另一方面，针对包含噬菌体vB-SenS-S1的组合物
实施例4准备实验
选择噬菌体vB-SenS-S1，宿主菌为S2044-1(实施例1中，从超市生鸡肉中分离到的沙门氏菌对包括黏菌素在内的6种抗菌药耐药)，抗菌药选择黏菌素(MIC(最小抑菌浓度)＝4μg/mL，参考欧盟药敏试验标准(European Committee on AntimicrobialSusceptibility Testing,EUCAST)采用微量肉汤稀释法进行药物敏感性试验并进行结果判读获得，且EUCAST中黏菌素的耐药折点为4μg/mL)。
沙门氏菌复活：将沙门氏菌冻存菌液与LB肉汤按照20∶1000的比例混匀，置于37℃恒温培养箱过夜培养。
噬菌体vB-SenS-S1复活：将噬菌体冻存液与沙门氏菌按照50∶50比例在LB肉汤中混匀，在160r/min的37℃摇床中培养3h，使用0.22μm滤膜过滤后，过滤液保存于4℃冰箱。
在进行噬菌体与抗菌药联合应用降低MIC试验前，为排除抗菌药对噬菌体活性的影响，先进行抗菌药影响噬菌体效价的试验。未过膜的噬菌体复活液测定初始的噬菌体效价，加入MIC浓度的抗菌药作为药物组，同时设置空白对照组，在37℃培养箱培养16h后，0.22μm滤膜过滤后梯度稀释，使用双层平板法测定噬菌体效价，试验重复3次，结果如图10所示，说明抗菌药基本不影响噬菌体效价。
实施例5包含噬菌体vB-SenS-S1的组合物验证实验
测定沙门氏菌菌株的CFU与沙门氏菌噬菌体的PFU后，以最佳感染复数为比例调节出适当的CFU与PFU。根据分组原则进行相应的菌液、噬菌体与药物的添加，固定最终各组离心管内液体量为8mL。
将各组离心管置于37℃培养箱内培养16h，在4h、8h、12h测定噬菌体组与噬菌体+抗菌药组的噬菌体效价，测定空白对照组、抗菌药组、噬菌体组、噬菌体+抗菌药组的细菌浓度。在16h时测定全部组的细菌浓度，测定噬菌体组和联合应用组的噬菌体效价，进行3次重复试验，根据数据分析噬菌体与抗菌药联合应用效果。
试验一共分为4个大组进行试验：①空白对照组；②噬菌体组；③抗菌药组；④噬菌体+抗菌药组。其中抗菌药组又分为MIC组、1/2MIC组、1/4MIC组、1/8MIC组；噬菌体+抗菌药组又分为噬菌体+MIC抗菌药组、噬菌体+1/2MIC抗菌药组、噬菌体+1/4MIC抗菌药组、噬菌体+1/8MIC抗菌药组。
则，噬菌体vB-SenS-S1与黏菌素联合应用试验按照上述原则可分为：①空白对照组；②噬菌体vB-SenS-S1组；③MIC黏菌素组；④1/2MIC黏菌素组；⑤1/4MIC黏菌素组；⑥1/8MIC黏菌素组；⑦噬菌体vB-SenS-S1+MIC黏菌素组；⑧噬菌体vB-SenS-S1+1/2MIC黏菌素组；⑨噬菌体vB-SenS-S1+1/4MIC黏菌素组；⑩噬菌体vB-SenS-S1+1/8MIC黏菌素组。
噬菌体vB-SenS-S1与黏菌素联合应用结果为(图中的抗生素即为黏菌素)：
③MIC黏菌素组和②噬菌体vB-SenS-S1组，在16h只能相对①空白对照组降低3.76lgCFU/mL、0.33lgCFU/mL。16h③MIC黏菌素组与①空白对照组细菌浓度差异显著(P＜0.05)，而16h②噬菌体vB-SenS-S1组与①空白对照组细菌浓度差异不显著(P＞0.05)。
16h⑦噬菌体vB-SenS-S1+MIC黏菌素组比①空白对照组降低8.48lg CFU/mL，且菌量为0即完全杀死细菌。16h⑦噬菌体vB-SenS-S1+MIC黏菌素组与①空白对照组、③MIC黏菌素组的细菌浓度差异显著(P＜0.05)。⑦噬菌体vB-SenS-S1+MIC黏菌素组在8-16h可以将细菌控制在检测不出的数量(参见图11)。这说明噬菌体vB-SenS-S1与黏菌素联合应用具有显著的协同作用，不仅仅是抑制细菌的生长，而可以完全清除细菌。
当黏菌素浓度降低至1/2MIC时，⑧噬菌体vB-SenS-S1+1/2MIC黏菌素组仍然比①空白对照组低8.48lgCFU/mL，且菌量为0即完全杀死细菌；⑧噬菌体vB-SenS-S1+1/2MIC黏菌素组与①空白对照组细菌浓度差异显著(P＜0.05)。当黏菌素浓度降低至1/4MIC时，⑨噬菌体vB-SenS-S1+1/4MIC黏菌素组只比①空白对照组低0.58lgCFU/mL，⑨噬菌体vB-SenS-S1+1/4MIC黏菌素组与①空白对照组、③MIC黏菌素组、②噬菌体vB-SenS-S1组细菌浓度差异不显著(P＞0.05)(图12)。因此，噬菌体vB-SenS-S1与黏菌素联合应用，具有最佳杀菌效果时的黏菌素浓度为1/2MIC，即2μg/mL；同时，黏菌素浓度为1/2MIC，说明提高了沙门氏菌敏感性至少2倍以上。
随着黏菌素MIC降低，各联合应用组(⑦噬菌体vB-SenS-S1+MIC黏菌素组；⑧噬菌体vB-SenS-S1+1/2MIC黏菌素组；⑨噬菌体vB-SenS-S1+1/4MIC黏菌素组；⑩噬菌体vB-SenS-S1+1/8MIC黏菌素组)中，噬菌体vB-SenS-S1的效价逐渐上升(图13)。黏菌素浓度为1/2MIC时，噬菌体vB-SenS-S1的效价为9.23lgPFU/ml。
以上所述仅为本发明的较佳实施方式而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (3)
1.一种宽谱沙门氏菌噬菌体vB-SenS-S1，其特征在于：所述噬菌体vB-SenS-S1于2023年7月12日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC M 20231271。
2.一种包含权利要求1所述的宽谱沙门氏菌噬菌体vB-SenS-S1的组合物，其特征在于：所述组合物包括噬菌体vB-SenS-S1和黏菌素。
3.一种如权利要求2所述的组合物，其特征在于：所述组合物中，具有最佳杀菌效果时的黏菌素浓度为1/2MIC，即黏菌素浓度为2μg/mL。
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